CN105567714A - 一种重组牦牛溶菌酶及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种如SEQ？ID？NO：1所示的核苷酸序列，公开了包含该核苷酸序列的重组载体、重组菌，以及SEQ？ID？NO：1所示的核苷酸序列编码的重组牦牛溶菌酶。本发明还公开了利用本发明重组牦牛溶菌酶的方法。本发明重组牦牛溶菌酶的活性高，具有工业应用价值。

Description

一种重组牦牛溶菌酶及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种重组牦牛溶菌酶及其制备方法和用途。

背景技术

溶菌酶是一种碱性蛋白质，广泛分布于动物、植物和微生物中，并且在哺乳动物的血浆、气管、肠道、胃、肾和肝等组织细胞中均有所表达。其通过破坏肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，导致细胞壁结构改变，从而使细菌溶解。溶菌酶由于具有抗菌能力，并且无毒、副作用，可作为潜在的抗生素替代品运用于食品、生物工程、医疗、畜禽饲料等领域。从家畜疾病控制方面考虑，溶菌酶作为添加剂而使用于饲料工业及养殖业中的疾病防治，实现疾病防治的高效、无毒、无残留、无抗药性、无停药期，可实现对抗生素的部分替代。

我国是饲料生产大国，2013年全国工业饲料总产量近2亿吨。目前市场销售的主要是鸡蛋溶菌酶和微生物溶菌酶，在饲料中的添加200～250克溶菌酶可替代30％的氧化锌及30％的抗生素，市场潜力巨大。溶菌酶能有效控制仔猪腹泻，提高采食量、促进生长、消除氧化锌的副作用。已有试验表明在加氧化锌的基础上加200克溶菌酶，能完全消除氧化锌的后遗症。溶菌酶在治疗动物细菌性腹泻时可以完全替代抗生素。实验表明在治疗体重小于30公斤的仔猪腹泻时，用0.5克溶菌酶每头每天的治疗量，每天灌服2次，2～3天能基本治愈。溶菌酶还可用作为肠道用药、呼吸道用药、对兽药进行增效、用于伤口修复消毒消炎等方面。

但是，饲料工业中使用的溶菌酶不能抵抗胃液中的胃蛋白酶，并且在酸性的pH环境下活性受到抑制，同时也难以耐受饲料加工中的高温过程。因此，需要开发具备此性质的饲料用溶菌酶。

反刍动物的胃溶菌酶存在于复胃中，与来自其它动物的溶菌酶相比，该溶菌酶具有抗胃蛋白酶的特性，并且在酸性环境下活性更好。这些特性使其不需包埋就可进入肠道发挥作用，促进畜禽健康，加上该酶活性与目前市售溶菌酶活性相当，使该酶具备潜在的商业应用价值。

牦牛是青藏高原地区的珍贵稀有的草食家畜，牦牛溶菌酶具有抗酸、抗胃蛋白酶活性，但是直接从牦牛皱胃中提取的牦牛溶菌酶的量难以满足市场需求，采用基因工程的方式制备牦牛溶菌酶可以降低成本，然而，制备得到一种可以表达有活性的牦牛溶菌酶的重组菌并非易事，目前未见采用基因工程的方式制备牦牛溶菌酶的报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种重组牦牛溶菌酶。

本发明提供了一种如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。

还提供了一种重组载体，它包含SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。

其中，所述的重组载体是重组pPICZα质粒，即pPICZα-HYL质粒。

还提供了一种重组菌，它包含前述的重组载体。

其中，所述的重组菌为重组毕赤酵母。

还提供了一种溶菌酶，它由SEQIDNO：1所示的核苷酸序列编码。其中，它的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。

本发明还提供了一种制备前述溶菌酶的方法，其特征在于：包含如下步骤：

ⅰ、取前述重组菌，接种到BMGY培养基上培养，培养温度为28-30℃，pH为6.0，至OD₆₀₀＝2～6；

ⅱ、收集菌体，用BMMY培养基重悬至OD₆₀₀＝1，加入甲醇至浓度0.5％(v/v)进行诱导表达，之后每24小时添加一次甲醇，每次添加甲醇至浓度为0.5％(v/v)，诱导表达的培养温度为30℃，pH为6.0，诱导表达的时间为24～96h；

ⅲ、离心，取上清，分离纯化，即得。

所述分离纯化步骤如下：

(1)含重组溶菌酶上清制备：在待分离溶液中，加入2倍体积的醋酸铵溶液，匀浆，离心，分离上清液和沉淀，再在沉淀中再加入醋酸铵溶液，醋酸铵溶液的加入量为沉淀量的2倍(v/w)，离心，合并含重组溶菌酶的上清液；其中，醋酸铵溶液的浓度为10mM；

(2)粗纯：调节含重组溶菌酶的上清液的pH至4，离心，取上清液，在沸水浴中加热2min，待温度降至室温，再调pH至5，离心，得上清，即为粗纯液；

(3)CM-SepharoseFF柱层析：采用浓度为10mM的醋酸铵溶液平衡CM-SepharoseFF柱，取步骤(2)的粗纯液上样，用浓度为10mM的醋酸铵洗脱杂蛋白，再用浓度为10mM～300mM的醋酸铵溶液线性梯度洗脱，根据洗脱图谱，收集第二个峰对应的溶液，即为层析液；

(4)SephadexG-75柱层析：采用浓度为0.2％(v/v)醋酸溶液平衡SephadexG-75柱，取步骤(3)的层析液上样，用浓度为0.2％(v/v)的醋酸溶液洗脱，根据洗脱图谱，收集最后一个峰对应的溶液，即得牦牛胃溶菌酶溶液；

(5)冻干，即可。

本发明还提供了前述溶菌酶在制备饲料添加剂或抗菌药物中的用途。

本发明构建了一种新的表达重组牦牛溶菌酶的毕赤酵母工程菌，该工程菌制备的重组牦牛溶菌酶的酶活高。采用本发明方法制备溶菌酶的方法简便，可工业生产，具有良好的市场应用前景。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1重组表达质粒pPICZα-HYL的双酶切鉴定。M:λ-EcoT14I；1:重组表达质粒pPICZα-HYL；2：重组表达质粒pPICZα-HYL的双酶切。

图2重组牦牛溶菌酶纯品的冻干品外观；

图3重组牦牛溶菌酶纯品的SDS-PAGE电泳图谱；

图4重组牦牛溶菌酶的抑菌实验。A和B表示发酵上清，C表示灭菌水。

具体实施方式

实验材料和试剂：

菌株、载体和培养基

毕赤酵母X33及载体pET32a(+)、pPICZαA商购获得，pMD19-TVector购于宝生物工程(大连)有限公司，大肠杆菌DH5α购于Novagen公司。

LB培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、和10g/LNaCl,pHof7-7.5.)加入氨苄青霉素(100μg/mL)或者Zeocin(25μg/mL)用于大肠杆菌菌株DH5α的培养。

YPD培养基(10g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖)加入Zeocin(100μg/mL)被用于选择毕赤酵母X33转化菌株。

BMGY培养基(20g/L胰蛋白胨、10g/L酵母提取物、3g/LK₂HPO₄,、11.8g/LKH₂PO₄、100mL/L10×YNB、1mL/L500×生物素and10mL/L甘油)和BMMY培养基(20g/L胰蛋白胨、10g/L酵母提取物、3g/LKH₂PO₄、11.8g/LKH₂PO₄、100mL/L10×YNB、1mL/L500×生物素以及5mL/L甲醇)。

试剂及工具酶

质粒提取小量试剂盒购于OmegaGenetics公司、2×TaqPCRMasterMix及DNA纯化回收试剂盒购于天根生化科技有限公司、溶菌酶检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所；ExTaqDNA聚合酶、限制性内切酶KpnI、BamHI、NotI、XhoI、SacI及T4DNALigase均购自宝生物工程(大连)有限公司。其它生物试剂为国产分析纯。

实施例1本发明重组蛋白的制备

1、重组表达

1.1基因克隆

a、合成重组目的基因：

以2条牦牛胃溶菌酶基因片段以及1条牦牛乳溶菌酶基因片段作为亲本基因，采用DNAShuffling技术获得一段新的DNA片段，序列如SEQIDNO：1所示，命名为HYL：

ATGACTGCTCTCATTATTCTGGGGCTTCCCCTCCTTTCTGTTGCTGTCCATGGGAAGAAATTTCAGAGGTGTGAGCTTGCCACAACTCTGAAGAAACTTGGATTGGATGGCTATCGAGGAGTCAGCCTGGCAAACTGGGTGTGTTTGGCCAGATGGGAAAGCAATTACAACACACGAGCTTCAAACTACAATCGTAGAGACAAAAGCCCTGATTATGGGATATTTCAAATCAATAGCCGCTGGTGGTGCAATGATGGCAAAACCCCAAAAGCAGTTAACGCCTGTCGTATACCCTGCATCGCTTTGCTGAAAGATGACCTCACTCAAGCTGTAGCATGTGCAAAGAACATTGTCAGTCATCAAGGAATTACAGCATGGGTGGCATGGAGAAAAAAAGTGTCAAAACCGAGATCTCAGGAGTTATGTTGA。

b、重组目的基因与pMD19-T载体的连接及转化、筛选：

合成上述序列，与pMD19-T进行连接，并转化DH5α感受态细胞，涂布于含X-Gal和IPTG的LB琼脂平板上，37℃倒置培养12-16小时，直至出现白色单菌落，构建突变体库。

连接步骤如下：

1)加入回收的目的DNA4.5μL、pMD19-T载体0.5μL，轻轻混匀；

2)加入SolutionI5μL，混匀，16℃反应1h。

3)将10μL连接产物全部加入100μLDH5α感受态细胞中，冰浴30min；

4)42℃水浴热激60s，立即冰浴2min；

5)加入890μLSOC培养基，置于37℃、200rpm/min振荡培养1h；

6)4000rpm离心5min，于超净工作台中吸取800μL上清，倒掉；

7)吹打混匀剩余200μL菌液，取100μL菌液均匀地涂布于含X-Gal和IPTG的LB琼脂平板培养基上培养，剩余100μL保存于4℃冰箱备用。37℃倒置培养12-16h，直至出现白色单菌落。

用灼烧过的接种环挑取白色单菌落于1.5mL含有100μg/mLAmp的LB液体培养基中，170rpm/min，37℃过夜振荡培养。以菌液为模板，用PCR方法对含有插入片段的克隆进行筛选。经菌液PCR检测为阳性克隆的菌株送深圳华大基因公司测序。

c、重组目的基因以及pPICZαA的质粒提取及双酶切

将测序比对后含有重组基因的菌株pMD19-T-HYL以及含有载体pPICZαA的菌株过夜培养，分别提取质粒。所得质粒同时用XhoI和NotI双酶切，试剂盒回收酶切后的载体和目的基因。

d、重组质粒pMD19-T-HYL和载体pPICZαA的连接、转化及筛选

回收的双酶切产物测浓度后，确定比例后用T4DNALigase进行连接，体系如下：

内容物	体积(μL)
		T4DNA Ligase	1
pPICZαA	1
		HYL	7
10×T4DNA Ligation Buffer	1

16℃连接过夜。连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布于含25μg/mLzeocin的LLB琼脂平板上，30℃倒置培养。待平板出长菌落后，挑取单克隆于LLB液体培养基中培养，做菌液PCR及双酶切鉴定。

e、重组质粒的线性化

将鉴定正确的菌株命名为pPICZα-HYL，保种并扩大培养提取质粒，用限制性内切酶SacI对所提质粒进行线性化，SacI线性化酶切体系如下：

内容物	体积(μL)
		pPICZα-HYL	6
SacI	2
		10×L buffer	4
ddH2O	28

每个体系酶切2μgpPICZα-HYL质粒DNA，共做5个体系。37℃酶切3h，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，进行回收，最后加30μLddH₂O溶解，保存于-20℃备用。

操作步骤如下：

(1)柱平衡步骤：向吸附柱CB2中加入500μL平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

(2)估计酶切反应液的体积，向其中加入等倍体积的溶液PC，充分混匀；

(3)吸取步骤(2)中的溶液，转移到吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min，12000rpm离心1min，弃滤液，并将吸附柱放入收集管中；

(4)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，室温静置2-5min，12000rpm离心30s，弃滤液，并将吸附柱放入收集管中；

(5)重复步骤(4)；

(6)将吸附柱CB2放入收集管中，12000rpm离心2min，尽量去除漂洗液，将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干；

(7)将吸附柱置于新的1.5mLEP管中，在吸附膜中间位置悬空滴加25-30μL65℃预热的灭菌ddH₂O，室温静置2min,12000rpm离心2min，收集DNA于-20℃保存备用。

f、毕赤酵母X33感受态的制备及电转化

(1)于YPD平板上划线X33菌株，30℃倒置培养。

(2)待平板出长菌落后，挑取单克隆于10mLYPD液体培养基中，30℃摇床过夜。

(3)按1％接种量重新接种到100mLYPD液体培养基中，摇菌至OD600约为1.0-1.5，太高影响转化效率(30℃，220r/min)。

(4)5000rpm/min离心5min，将离心管倒置在吸水纸上，充分弃上清。

(5)加入100mL冰冷的无菌水，充分混匀，5000rpm离心5min，弃上清。

(6)再加入50mL无菌水洗一遍，5000rpm离心5min，弃上清。

(7)加10mL冰冷的1Msorbitol(山梨醇)洗一遍，5000rpm离心5min，弃上清。

(8)加入1mL1Msorbitol混匀，并分装为100μL每管，-80℃保存备用。

(9)取5-10μg已经线性化的质粒DNApPICZα-HYL，加入上述分装好的感受态细胞中，用枪头混匀或用手指弹匀，转至0.1cm冰预冷的电转化杯中。

(10)将电转化杯冰浴5min，设置电击参数，电压：1500v；时间:5ms，电击。

(11)电击完毕后，迅速加入1mL冰冷的1Msorbitol溶液，混匀；转至5mL的EP管中，30℃静止1h，然后加入1mLYPD，30℃、200rpm摇菌1h.

(12)取适量菌夜涂在YPDSZ平板上，30℃培养，直至单菌落出现。

(13)挑菌于YPDZ液体培养基中筛选，约16小时，即得基因包含目的基因片段的工程菌。

1.2重组酵母的诱导表达

(1)接种重组菌至25mLBMGY中，pH为6.0，28-30℃，250-300rpm，摇菌至OD600＝2-6；

(2)室温1500-3000g离心5min，收集细胞，去除上清，用BMMY重悬细胞至OD600＝1.0；

(3)将上述培养物加入新的三角培养瓶，加盖两层灭菌纱布，加入甲醇至终浓度为0.5％，在pH为6.0、28-30℃、250-300rpm条件下诱导表达，每24小时，加甲醇至终浓度为0.5％继续诱导。

(4)分别在诱导培养的第0h、12h、24h(1d)、36h、48h(2d)、60h、72h(3d)、84h、96h(4d)取1mL培养液至1.5mLEP管中，13000rpm/min离心3min，收集上清液。

(5)取20μL上清液用SDS-PAGE电泳进行检测。

1.3分离纯化

1.3.1醋酸铵沉淀

(1)取前述1.2节步骤(4)培养96h后的上清液7ml，向其中加入10mM醋酸铵(pH＝6)14ml。

(2)移入灭菌后的50ml离心管中，在4℃下进行离心(27,000×g，15分钟)。随后将离心后的上清液转移入新的50ml离心管中(保存于4℃)。

(3)将10mM醋酸铵(pH＝6)再次加入到含有沉淀的试管中(10mM醋酸铵：残渣＝2:1，二者的配比为体积质量比)，在4℃下离心(27,000×g，15分钟)。再将上清液转入新的离心管中(保存于4℃)。

1.3.2样品粗纯化

(1)向步骤1.3.1处理得到的上清液中滴加冰醋酸，调整混合液pH至4。然后在4℃下以27,000×g的速度离心15分钟。随后将上清液转移入新的离心管中。

(2)将离心后的上清液放入100℃水中，水浴2分钟。随后取出使其温度降至室温。

(3)将氨水逐滴加入上清液中，调整pH至5。然后在4℃下以27,000×g的速度离心15分钟。再将上清液转移入新的离心管中，并将其保存于4℃。

1.3.3CM-SepharoseFF柱层析

(1)将CMSepheroseFF安装于Bio-Rad蛋白质纯化仪上，并用平衡液(10mM醋酸铵)对预装柱进行平衡。

(2)用0.20μm过滤器对样品上清液进行过滤，并将过滤后的2ml上清液加入层析系统中。

(3)用平衡液(pH＝5.8的10mM醋酸铵)以1ml/min的流速冲洗系统，洗脱杂蛋白。

(4)在层析系统中加入洗脱液10mM醋酸铵，逐步增加到300mM醋酸铵(pH＝8)，以1ml/min的流速对CM-SepharoseFF离子交换柱进行线性梯度洗脱(梯度：0-100％洗脱缓冲液，20CV)，并根据洗脱图收集含有胃溶菌酶的溶液，并将其保存于4℃。

1.3.4SephadexG-75柱层析

(1)称取5～6g凝胶干粉，加入10倍体积的洗脱液后，置于100℃的水浴锅中水浴2小时。中途手动缓慢搅拌。如发现细小凝胶碎片，待凝胶沉淀后，去除上清，重复几次直到凝胶溶液中无凝胶碎片为止。

(2)将层析柱垂直安装在室内，并向其注入1/5柱体积的洗脱液，用以排除层析柱底的空气。随后沿玻棒缓慢加入凝胶浆。待装柱完成后打开柱底出口，同时将层析柱与Bio-Rad蛋白质纯化仪相连，再用洗脱液对其过夜平衡。

(3)将1ml溶菌酶溶液缓慢加入到凝胶表面(尽量避免冲击凝胶，造成凝胶表面的不平整，从而影响分离效果)，随后打开层析柱出口。待溶菌酶溶液进入胶体后，在凝胶表面缓慢滴加1ml洗脱液(0.2％醋酸)，然后用0.2ml/min流速的洗脱液(0.2％醋酸)对层析柱进行洗脱。

(4)根据洗脱图，收集溶菌酶的溶液，并用冻干机对样品进行冻干处理，即得本发明重组牦牛溶菌酶纯品(处理后的样品保存于-20℃)。

冻干程序如下：把需要冻干的含重组牦牛胃溶菌酶的液加入玻瓶瓶中，使蒸发表面尽量大而厚度尽量薄；然后放入与TelstarNQEST-85型冻干仪器冻干箱尺寸相适应的金属盘内。

表1重组溶菌酶冻干程序如下：

步骤	时间(小时、分钟)	真空度(mBar)	温度(架子温度)
				第一步	3分钟	0.00	0.0℃
第二步	1小时30分钟	0.00	0.0℃
				第三步	3小时	0.00	10.00℃
第四步	3小时30分钟	0.00	25.00℃
				第五步	3小时30分钟	0.00	30.00℃

冻干结束后，将干粉状的溶菌酶装入玻璃瓶中，加塞封口，防重新吸收空气中的水份。

2、测定

2.1溶菌酶活力的测定用南京建成生物研究所的溶菌酶检测试剂盒检测溶菌酶活性：

(1)比浊法测定原理

在一定浓度的浑浊菌液中，由于溶菌酶能水解细菌细胞壁上肽聚糖使细菌裂解而浓度降低，透光度增强，故可以根据透光度变化来推测溶菌酶的含量^[42]。

(2)试剂的配制

1)贮备菌液的配制

取5mg/支的菌粉1支，倒入匀浆管中，加菌粉溶剂1mL，轻轻缓慢上下旋转研磨3min(切勿溅出)，即为贮备菌液，将其取出后置2-8℃冰箱密封保存一周左右。

2)应用菌液的配制

按贮备菌液：菌粉溶剂＝1:19进行配制，需多少配多少。剩下的应用菌液2-8℃可保存一周左右。最好是现用现配，用时摇匀。

3)标准品的配制

①标准品贮备液的配制

每支准确加蒸馏水1.0mL配成2mg/mL的标准品贮备液。2-8℃可保存7-10天。

②标准品应用液的配制

临用时按标准品贮备液：蒸馏水＝1:799比例稀释成2.5μg/mL(即200U/mL)的标准品应用液，需多少配多少。2-8℃可保存7-10天。

(3)操作步骤

由于本实验样本量较多且澄清，故选用空白对照法测定溶菌酶活性。按表1配制相应反应液：

表1溶菌酶检测操作表

将反应液混匀，于37℃准确水浴15min，然后立即取出置于冰水浴中3min，再逐管取出倒入比色皿中，在530nm处以蒸馏水调透光度100％，比色，测定各管透光度T₁₅(即37℃水浴15min后的透光度值)。

(4)计算

溶菌酶含量＝(UT₁₅-OT₁₅)/(ST₁₅-OT₁₅)×200U/mL×稀释倍数

注：OT₁₅为水浴15min后的空白管透光度，UT₁₅为水浴15min后测定管的透光度，ST₁₅为水浴15min后标准管的透光度。

2.2用抑菌环法进行抗菌实验。

将100μL培养至对数生长期金黄色葡萄球菌培养液加入到15mLLB固体培养基中，在42℃混匀，然后倾倒在琼脂底层上，待凝固后，放入牛津杯A、B、C，将1.2节步骤(4)培养96小时后的上清400μL和200μL分别加入到A与B中，C中加入400μL灭菌水做对照，以ddH₂O为阴性对照，37℃过夜培养，测定抑菌环。

2.3SDS-PAGE电泳

(1)SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶制备，见下表：

SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶

(2)吸取10μl酶溶液于PCR管中，加入2μl5×SDS-PAGELoadingbuffer，并将混合液置于100℃水中，水浴15分钟。

(3)将制备好的凝胶放入电泳槽中，然后向凝胶中加入混合液。用80v电压将混合液电泳至浓缩胶与分离胶分界线处，再调整电压为120v直至电泳结束。

(4)将电泳胶移入盛有考马斯亮蓝染色液的器皿中，再置于摇床中缓慢震荡4小时左右(在染色过程中用保鲜膜封闭容器口)。

(5)弃去染液，用水将凝胶漂洗数次，再加入考马斯亮蓝脱色液，置于摇床中缓慢震荡过夜，直至蛋白条带出现(在脱色过程中用保鲜膜封闭容器口)。

3、测定结果

3.1重组基因真核表达质粒pPICZα-HYL的双酶切鉴定

将重组基因HYL和pPICZαA连接产物转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆于LLB(25μg/mLzeocin)液体培养基中培养，并提取质粒，结果如图1泳道1所示；对质粒作XhoI和NotI双酶切鉴定，结果如图1泳道2所示：分别可见约3.6kb和430bp的两条DNA亮带，表明已成功构建重组表达质粒pPICZα-HYL。

实验结果说明，本发明成功构建得到了包含目的基因片段的重组表达质粒pPICZα-HYL。

3.2SDS-PAGE分析

冻干后的重组牦牛胃溶菌酶成品为白色粉末状(如图2)。

纯化后的蛋白电泳图如图3所示，经电泳检测发现，凝胶中只显示一条蛋白带，表明分离纯化所获得的样品已得到纯化。

实验结果说明，本发明分离得到了纯品重组牦牛溶菌酶。

同时，本发明重组牦牛溶菌酶的氨基酸序列，如SEQIDNO：2所示：

3.3重组菌表达产物的酶活性分析结果

对表达产物上清液进行蛋白质浓度测定及溶菌酶活性检测。结果表明，表达得到的重组牦牛溶菌酶粗制品的比活最高为667.72U/mg，纯化后的重组牦牛溶菌酶比活为1123.105U/mg。

3.4组牦牛溶菌酶的抑菌结果

如图4所示，B组和C组牛津杯周围的细菌生长良好，未被抑制，而A组则产生抑菌圈。

实验结果说明，本发明重组牦牛溶菌酶可以有效抑制金黄色葡萄球菌的生长，可用于制备饲料添加剂和抗菌药物。

综上，本发明用DNAShuffing技术将3个来自牦牛的溶菌酶基因序列进行了重组，成功地制备得到了表达溶菌酶的重组基因片段，并进一步制备得到了含该基因片段的毕赤酵母工程菌，该工程菌表达得到的重组牦牛溶菌酶可溶，活性高，具有良好的工业应用前景。

Claims (10)

1.一种如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。

2.一种重组载体，其特征在于：包含SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述的重组载体是重组pPICZαA质粒。

4.一种重组菌，其特征在于：它包含权利要求2或者3所述的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述的重组菌为重组毕赤酵母。

6.一种溶菌酶，其特征在于：它由SEQIDNO：1所示的核苷酸序列编码。

7.根据权利要求6所述的溶菌酶，其特征在于：它的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。

8.一种制备权利要求6或7所述溶菌酶的方法，其特征在于：包含如下步骤：

ⅰ、取权利要求4或者5所述的重组菌，接种到BMGY培养基上培养，培养温度为28-30℃，pH为6.0，至OD₆₀₀＝2～6；

ⅱ、收集菌体，用BMMY培养基重悬至OD₆₀₀＝1，加入甲醇至浓度0.5％(v/v)进行诱导表达，之后每24小时添加一次甲醇，每次添加甲醇至浓度为0.5％(v/v)，诱导表达的培养温度为30℃，pH为6.0，诱导表达的时间为24～96h；

ⅲ、离心，取上清，分离纯化，即得。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤ⅲ中，所述分离纯化步骤如下：

(1)含重组溶菌酶上清制备：在待分离溶液中，加入2倍体积的醋酸铵溶液，匀浆，离心，分离上清液和沉淀，再在沉淀中再加入醋酸铵溶液，醋酸铵溶液的加入量为沉淀量的2倍(v/w)，离心，合并上清液，即为含重组溶菌酶的上清液；其中，醋酸铵溶液的浓度为10mM；

(2)粗纯：调节含重组溶菌酶的上清液的pH至4，离心，取上清液，在沸水浴中加热2min，待温度降至室温，再调pH至5，离心，得上清，即为粗纯液；

(3)CM-SepharoseFF柱层析：采用浓度为10mM的醋酸铵溶液平衡CM-SepharoseFF柱，取步骤(2)的粗纯液上样，用浓度为10mM的醋酸铵洗脱杂蛋白，再用浓度为10mM～300mM的醋酸铵溶液线性梯度洗脱，根据洗脱图谱，收集第二个峰对应的溶液，即为层析液；

(4)SephadexG-75柱层析：采用浓度为0.2％(v/v)醋酸溶液平衡SephadexG-75柱，取步骤(3)的层析液上样，用浓度为0.2％(v/v)的醋酸溶液洗脱，根据洗脱图谱，收集最后一个峰对应的溶液，即得牦牛胃溶菌酶溶液；

(5)冻干，即可。

10.权利要求6或7所述的溶菌酶在制备饲料添加剂或抗菌药物中的用途。