CN101353630A - 一种获得高产量鹅型溶菌酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于遗传工程和蛋白质工程领域，具体涉及一种获得高产量鹅型溶菌酶的方法。本发明提供了一种获得高产量鹅型溶菌酶的方法，即将序列如SEQ ID NO.1所示的DNA序列装入真核表达载体，并在毕赤酵母中发酵表达。本发明对人鹅型溶菌酶的基因序列进行了改造，从而使溶菌酶发酵产量明显增加。利用本发明的制备方法获得溶菌酶，生产效率明显提高，成本降低，为大批量生产溶菌酶及其下游工业化应用奠定了基础。

Description

一种获得高产量鹅型溶菌酶的方法

技术领域

本发明属于遗传工程和蛋白质工程领域，具体涉及一种获得高产量鹅型溶菌酶的方法。

背景技术

溶菌酶是一种碱性球蛋白，全称为：1，4-β-N-溶菌酶或者：粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶。它能水解细菌细胞壁的肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1，4糖苷键，破坏肽聚糖支架，在细菌内部渗透压作用下导致细胞壁破裂，达到杀菌效果。

在临床上，溶菌酶对眼、耳、鼻、喉、口腔等的急、慢性炎症均有一定疗效，特别是对急性炎症如：急性咽炎、急性喉炎、急性中耳炎等效果明显。与抗生素联合使用，对于严重的急性炎症亦有一定疗效。在治疗皮肤病方面，溶菌酶亦有广泛用途，可用于治疗扁平疣、传染性软疣、寻常性疣、尖锐湿疣、带状疱疹等多种皮肤病。对于带状疱疹，内服溶菌酶即可。此外，溶菌酶可用于小儿或乳儿哮喘性支气管炎、呼吸道内膜肿胀等，能够使黏膜肿胀很快消除，使痰液变稀、呼吸通畅。溶菌酶亦可预防和治疗病毒性肝炎，尤其对输血后肝炎及急性肝炎的效果较为显著。在机体内溶菌酶还具有抗流感病毒的活性，其与胆酸盐酸盐的复合物能强烈抑制流感病毒和腺病毒的生长，并能防止疱疹性病毒感染。

迄今，国内尚无人溶菌酶的规模生产。各实验室使用的溶菌酶大多为进口产品，随着对溶菌酶的临床应用研究的深入，国内迫切需要质优价廉的溶菌酶供应。

发明内容

本发明目的是一种获得高产量鹅型溶菌酶的方法，使溶菌酶的产量稳定于较高水平，从而达到规模生产要求。

本发明提供了一种获得高产量鹅型溶菌酶的方法，即将序列如SEQ ID NO.1所示的DNA序列装入真核表达载体，并在毕赤酵母中发酵表达。

本发明中，所述的方法包括以下步骤：

(1)将转入溶菌酶DNA序列的毕赤酵母菌种置于培养基中发酵1-3天；

(2)在(1)的培养基中加入甲醇，继续培养1-5天；

(3)收集发酵产物，去菌体，即可。

本发明中，(2)中发酵时间为36-60小时。

本发明中，(2)中加入甲醇的量为每6-15小时添加甲醇2.5-30ml/L培养基。

本发明中，(3)中去菌体方法为离心、过滤或者超滤。

本发明中，离心条件为1500-5000rpm，3-15分钟，0-10℃。

本发明中，所用的真核表达载体可以是所有可以在毕赤酵母中表达蛋白的载体，例如，pPIC9K，pPICZαA，pPICZαT，等等。所用的毕赤酵母可以是gs115，GSM1168等。

本发明中，表达溶菌酶蛋白的毕赤酵母菌种可以采用基因工程将溶菌酶基因序列插入毕赤酵母的基因组而得。溶菌酶基因序列可以采用从适当的生物体组织细胞中提取或者人工合成而得。

本发明中，发酵培养基可以使用常规培养基。其中，该培养基中甘油含量为5-40ml/L，蛋白胨含量为10-50g/L。培养基中还可以加入酵母粉，酵母粉的含量为10-50g/L。培养基中还可以加入葡萄糖，葡萄糖的含量为10-40g/L。培养基中还可以加入磷酸盐，磷酸盐含量为0-0.05M/L。该培养基在pH值为7-8.5时效果较好。

本发明中，发酵温度可以采用常温。

本发明对人鹅型溶菌酶的基因序列进行了改造，从而使溶菌酶发酵产量明显增加。利用本发明的制备方法获得溶菌酶，生产效率明显提高，成本降低，为大批量生产溶菌酶及其下游工业化应用奠定了基础。

具体实施方式

发酵流程及产量计算

1.1菌种制备：按照《分子克隆》的方法，将序列如SEQ ID NO 1的DNA序列与酵母表达载体pPIC9K连接并转化毕赤酵母GSM1168，然后，涂布YPD平板固体培养基，置于30℃培养。

1.2种子培养：YPD平板固体培养基中48h后，挑取直径2mm菌落接种100ml优选培养基于1L三角瓶，以4层无菌纱布封口，进行摇瓶培养，温度28～30℃，震荡速度300rpm，36h后结束培养。

1.3发酵培养：将基础培养基6L装入15L发酵罐，115℃高压灭菌25min。接种1.5L二级种子培养液，培养16～24h耗尽培养液中甘油，。培甲醇诱导阶段共持续72h。重复培养两次。

1.4发酵液处理：发酵结束，用低温高速离心机(5000rpm，4℃，10min)离心发酵液，收集上清液，加入叠氮钠至0.02％浓度，4℃保存。

在进行一次纯化后，可从250ml发酵液上清中纯化到7.0mg的溶菌酶蛋白，而发酵液上清的溶菌酶蛋白总活性减少50％，因此推断，250ml发酵液上清中约含14mg的溶菌酶蛋白，每升发酵液中含56mg左右的溶菌酶蛋白。而在相同培养条件下，用人鹅型溶菌酶发酵得到的产量大约在3-5mg/L左右。

序列表

<110>复旦大学

<120>一种获得高产量鹅型溶菌酶的方法

<130>33

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>489

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(489)

<223>

<400>1

tct tac cca ttc tcc cac tct atg aag cca cac ttg cac cca aga ttg     48

Ser Tyr Pro Phe Ser His Ser Met Lys Pro His Leu His Pro Arg Leu

1               5                   10                  15

tac cac ggt tgt tac ggt gac att atg acc atg aag acc tct ggt gct     96

Tyr His Gly Cys Tyr Gly Asp Ile Met Thr Met Lys Thr Ser Gly Ala

            20                  25                  30

act tgt gac cca aac tct gtt atg aac tgt ggt att aga ggt tct gag    144

Thr Cys Asp Pro Asn Ser Val Met Asn Cys Gly Ile Arg Gly Ser Glu

        35                  40                  45

atg ttc gct gag atg gac ttg aga gct att aag cca tac caa act ttg    192

Met Phe Ala Glu Met Asp Leu Arg Ala Ile Lys Pro Tyr Gln Thr Leu

    50                  55                  60

att aag gag gtt ggt caa aga cac tgt gtt gac cct gct gtt att gct    240

Ile Lys Glu Val Gly Gln Arg His Cys Val Asp Pro Ala Val Ile Ala

65                   70                  75                  80

gct atc atc tct aga gag tcc cac ggt ggt tct gtc ttg caa gac ggt    288

Ala Ile Ile Ser Arg Glu Ser His Gly Gly Ser Val Leu Gln Asp Gly

                85                  90                  95

tgg gac cac aga ggt ttg aag ttc ggt ttg atg caa ttg gac aag caa    336

Trp Asp His Arg Gly Leu Lys Phe Gly Leu Met Gln Leu Asp Lys Gln

            100                 105                 110

acc tac cac cct gtt ggt gct tgg gac tct aag gag cac ttg tct caa    384

Thr Tyr His Pro Val Gly Ala Trp Asp Ser Lys Glu His Leu Ser Gln

        115                 120                 125

gct act ggt att ttg act gag aga atc aag gct atc caa aag aag ttc    432

Ala Thr Gly Ile Leu Thr Glu Arg Ile Lys Ala Ile Gln Lys Lys Phe

    130                 135                 140

cct act tgg tct gtt gct caa cac ttg aag ggt aga ttg tac tct gag    480

Pro Thr Trp Ser Val Ala Gln His Leu Lys Gly Arg Leu Tyr Ser Glu

145                 150                 155                 160

tac ttc gtt                                                        489

Tyr Phe Val

<210>2

<211>163

<212>PRT

<213>Eastern equine encephalomyelitis virus

<400>2

Ser Tyr Pro Phe Ser His Ser Met Lys Pro His Leu His Pro Arg Leu

1               5                   10                  15

Tyr His Gly Cys Tyr Gly Asp Ile Met Thr Met Lys Thr Ser Gly Ala

            20                  25                  30

Thr Cys Asp Pro Asn Ser Val Met Asn Cys Gly Ile Arg Gly Ser Glu

        35                  40                  45

Met Phe Ala Glu Met Asp Leu Arg Ala Ile Lys Pro Tyr Gln Thr Leu

    50                  55                  60

Ile Lys Glu Val Gly Gln Arg His Cys Val Asp Pro Ala Val Ile Ala

65                  70                  75                  80

Ala Ile Ile Ser Arg Glu Ser His Gly Gly Ser Val Leu Gln Asp Gly

                85                  90                  95

Trp Asp His Arg Gly Leu Lys Phe Gly Leu Met Gln Leu Asp Lys Gln

100                 105                 110

Thr Tyr His Pro Val Gly Ala Trp Asp Ser Lys Glu His Leu Ser Gln

        115                 120                 125

Ala Thr Gly Ile Leu Thr Glu Arg Ile Lys Ala Ile Gln Lys Lys Phe

    130                 135                 140

Pro Thr Trp Ser Val Ala Gln His Leu Lys Gly Arg Leu Tyr Ser Glu

145                 150                 155                 160

Tyr Phe Val

Claims (6)

1.一种获得高产量鹅型溶菌酶的方法，其特征在于，将序列如SEQ ID NO.1所示的DNA序列装入真核表达载体，并在毕赤酵母中发酵表达。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将转入溶菌酶DNA序列的毕赤酵母菌种置于培养基中发酵1-3天；

(2)在(1)的培养基中加入甲醇，继续培养1-5天；

(3)收集发酵产物，去菌体，即可。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(2)中发酵时间为36-60小时。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(2)中加入甲醇的量为每6-15小时添加甲醇2.5-30ml/L培养基。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(3)中去菌体方法为离心、过滤或者超滤。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，离心条件为1500-5000rpm，3-15分钟，0-10℃。