CN115135168A - 酶组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了具有重组产生的酶促活性酶、增强的蛋白质含量的组合物及其制备方法。

Description

酶组合物及其制备方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年12月24日提交的美国临时专利申请序列号62/953,361的优先权。上述专利申请的全部内容通过引用并入本文。

背景技术

蛋白质是重要的饮食营养物。它们可以充当燃料来源和/或氨基酸(包括身体不能合成的必需氨基酸)的来源。健康成年人每日推荐的蛋白质摄入量是一个人总卡路里需求的10％至35％，并且当前大多数人的大部分蛋白质摄入量来自基于动物的来源。另外，运动员和健美运动员可能依赖补充蛋白质消耗来构建肌肉质量和提高表现。重组产生的蛋白质不含基于动物的来源，并且为消费者提供了替代性蛋白质资源。随着世界人口的增长以及碰巧全球食品需求增加，对替代性的可持续、非基于动物来源的饮食和补充蛋白质的需求尚未得到满足。

发明内容

本公开的方法和组合物提供了此尚未满足的需求。

在一些实施方案中，本文描述了包含重组食品防腐酶(rFPE)的消耗性组合物。在一些情况下，所述FPE可以是鹅型FPE(gFPE)。在一些情况下，所述组合物可以是半固体或凝胶组合物。

在一些实施方案中，所述消耗性组合物可以不含细菌杂质。

在一些实施方案中，所述gFPE包含与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述gFPE包含与SEQ ID NO:1具有至少97％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述gFPE包含与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述gFPE包含与SEQ ID NO:2具有至少97％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述gFPE包含与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述gFPE包含与SEQ ID NO:3具有至少97％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述gFPE包含与SEQ ID NO:4具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述gFPE包含与SEQ ID NO:4具有至少97％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述消耗性组合物可以是热处理的。在一些实施方案中，所述消耗性组合物具有比不包含gFPE的几乎相同的消耗性组合物更长的保质期。在一些实施方案中，所述消耗性组合物具有比包含鸡蛋清胞壁酸酶而非gFPE的几乎相同的消耗性组合物的保质期更长的保质期。在一些实施方案中，所述gFPE可以在毕赤酵母细胞中产生。

在一些实施方案中，本文描述了包含重组食品防腐酶(FPE)的组合物，其中所述FPE可以具有大于90,000shugar U/mg的活性。

在一些情况下，所述FPE可以具有大于150,000U/mg的Shugar单位。所述FPE可以具有大于200,000U/mg的Shugar单位。所述FPE可以具有大于250,000U/mg的Shugar单位。所述FPE可以具有大于300,000U/mg的Shugar单位。所述FPE可以具有大于350,000U/mg的Shugar单位。所述FPE可以具有大于400,000U/mg的Shugar单位。所述FPE可以具有大于450,000U/mg的Shugar单位。

所述重组FPE可以在毕赤酵母细胞中产生。

所述组合物可以是食品组合物。所述食品组合物可以包含一种或多种消耗性成分。所述食品组合物可以具有比不包含所述重组FPE的几乎相同的食品组合物更长的保质期。所述食品组合物可以具有比可以包含鸡蛋清胞壁酸酶而非所述重组FPE的几乎相同的产品的保质期更长的保质期。

所述组合物可以是包含rFPE的粉末组合物。

所述重组FPE可以包含与SEQ ID NO:1具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。

一个Shugar单位可以是在37℃、pH 7.0下消化藤黄微球菌(M.Luteus)细胞的悬浮液、从而导致溶液的吸光度以每分钟0.001的速率降低的酶的量。

与包含鸡蛋清胞壁酸酶的组合物相比，所述组合物可以是低变应原性的。

所述重组FPE可以具有与非重组FPE和/或包含与SEQ ID NO:1具有至少85％序列同一性的FPE相比相当的活性，但可以从天然来源中分离。

在一些实施方案中，本文描述了一种包含重组食品防腐酶(FPE)的消耗性组合物，其中所述FPE可以包含与SEQ ID NO:1具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。

所述消耗性组合物可以是食品组合物。所述食品组合物可以具有凝胶状质地或一致的质地。所述食品组合物可以呈烘焙产品的形式。所述食品组合物可以呈蛋清状产品的形式。所述FPE可以在巴斯德毕赤酵母细胞中重组产生。所述食品组合物可以呈液体形式。所述食品组合物可以呈固体形式。

所述食品组合物可以具有比可以包含鸡蛋清胞壁酸酶而非所述重组FPE的几乎相同的产品的保质期更长的保质期。

所述食品组合物可以具有按重量计至少0.1％FPE。所述食品组合物可以具有按重量计至多10％FPE。所述FPE在所述食品组合物中可以具有酶促活性。所述组合物可以是一种成分。所述食品组合物可以基本上不含微生物或细胞碎片。所述食品组合物可以是益生菌配制品。所述重组FPE的纯度可以是至少95％。

除所述重组FPE之外，所述食品组合物还可以包含一种或多种重组蛋白。所述重组FPE可以为所述食品产品提供凝胶固态性或增加的黏度。除所述重组FPE之外，所述食品组合物还可以包含多于一种重组蛋白。

在一些实施方案中，本文描述了制备消耗性组合物的方法，其包括以下步骤：提供重组产生的分离的食品防腐酶(FPE)，以及将所述重组产生的FPE与一种或多种消耗性成分组合。在一些情况下，所述FPE是鹅型FPE。

所述重组产的FPE可以具有与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

所述重组产生的FPE可以在酵母细胞中重组产生。所述酵母细胞可以是巴斯德毕赤酵母。

相对于缺少所述重组产生的FPE的几乎相同的消耗性组合物，所述重组生产的FPE增加所述消耗性组合物的保质期。

所述重组产生的FPE为所述消耗性组合物提供凝胶状质地。

所述消耗性组合物可以是可以供人/动物食用的食品产品。

在一些实施方案中，本文描述了产生黄原胶产品的方法，其包括以下步骤：将野油菜黄单胞菌(X.campestris)细胞提供到发酵培养基中；在45℃-60℃之间的温度和8-10之间的pH下用碱性蛋白酶对所述细胞进行热处理，从而产生包含细胞碎片的溶液；向包含细胞碎片的溶液添加可以重组产生的食品防腐酶(FPE)和/或包含与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重组产生的FPE，从而产生黄原胶溶液。所述方法还可以包括向所述黄原胶溶液添加异丙醇，从而使黄原胶沉淀；分离并干燥沉淀的黄原胶，从而获得黄原胶产品。

添加的FPE的量可以小于在其他方面相同的条件下产生等量所述黄原胶产品所需的鸡蛋清FPE的量。

产生黄原胶的方法还可以包括在产生包含细胞碎片的溶液之后调节所述组合物的pH的步骤。

在一些实施方案中，本文描述了食品防腐剂，其包含与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的重组产生的食品防腐酶(FPE)。

根据以下具体实施方式，本公开的另外的方面和优点对于本领域技术人员将容易地变得清楚，在以下具体实施方式中仅示出和描述了本公开的说明性实施方案。如将会理解的，本公开能够具有其他的和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各个明显的方面进行修改，所有这些都不背离本公开。因此，附图和说明书将在本质上被视为是说明性的而非限制性的。

附图说明

本发明的新颖特征在所附权利要求书中特别地阐述。将通过参考阐述了利用本发明原理的说明性实施方案的以下具体实施方式和附图(在本文中也称为“图”)获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在所述附图中：

图1A至图1E说明了重组食品防腐酶(rFPE)针对常见食品腐败细菌的杀菌活性。

图2A至图2E说明了rFPE在各种温度和浓度下的胶凝化。

图3说明了rFPE1(一种抗鸡胞壁酸酶抗体)对rFPE缺乏反应性。

具体实施方式

尽管已经在本文中示出和描述了本发明的各个实施方案，但是对于本领域技术人员而言将明显是，此类实施方案仅通过举例方式提供。在不偏离本发明的情况下，本领域技术人员可以想到多种变型、改变和替代。应理解，可以采用针对本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。

本公开涉及重组食品防腐酶(rFPE)，其相对于当前可商购获得的酶产品提供优异的特性。在食品工业中，将试剂添加到食品产品中以减少微生物导致的腐败。抗微生物食品防腐剂的常见实例包括诸如苯甲酸钠、苯甲酸、亚硝酸盐、亚硫酸盐、山梨酸钠和山梨酸钾等化合物。可替代地，具有抗微生物活性的酶可以添加到食品产品中；其优点是酶提供抗微生物活性，并且增加食品产品的蛋白质含量。本公开涉及rFPE，其具有抗微生物活性，增加蛋白质含量，并且还为食品产品提供有利的品质，例如增加固体或半固体食品产品的胶凝化和硬度或增加液体食品产品的黏度。如本文公开的，本公开的rFPE显示出相对于可商购获得的由于其在食品产品中的抗微生物活性而使用的酶意料之外的优异品质。

本文提供了包含食品防腐酶(FPE)的消耗性组合物。此类消耗性组合物可以用于食品产品、饮料产品、营养品、药物、化妆品或作为最终产品的成分。在本文的许多实施方案中，所述消耗性组合物呈液体形式或半固体形式(例如，凝胶)。优选地，此类组合物中的FPE是重组制备的，并且在本文中可以被称为重组FPE(rFPE)。

除非另外指示，否则术语FPE包括FPE和rFPE两者。本文的消耗性组合物中的FPE或rFPE以增加消耗性组合物的蛋白质含量并且还维持一种或多种额外特征诸如高澄清度、降低的浊度或基本感官中性的浓度提供。

在本文的任何消耗性组合物中使用rFPE允许非基于动物来源的蛋白质，同时维持消费者有利的感官性能。本文提供了此类组合物、其制备方法及其使用方法的各种实施方案。

本文提供了本公开的一些示例性实施方案。在一种情况下，可以在宿主细胞中重组产生食品防腐酶(FPE)，诸如g型FPE(gFPE)。所述宿主细胞可以是细菌或酵母或另一种真菌宿主细胞。gFPE可以由宿主细胞分泌并从培养基中收集和纯化。纯化的gFPE可以被冻干并且用作消耗性组合物中的成分。在一些情况下，可以向终端用户提供主要包含gFPE蛋白的冻干粉末组合物。终端用户可以使用gFPE作为食品组合物中的成分。在一种情况下，所述用户可以通过在50℃至120℃范围内的温度下进行热处理来产生包含gFPE的凝胶。可以打算或不打算使用作为消化酶的FPE作为抗微生物剂来产生凝胶。例如，如本文所述，gFPE具有在溶液中形成凝胶的意料之外的作用而无需额外的胶凝剂。因此，用户可以能够仅通过热处理使包含gFPE的组合物胶凝化。

在另一种情况下，用户可以使用gFPE作为包含其他胶凝剂(诸如植物纤维、其他蛋白质、粘合剂等)的消耗性组合物中的一种成分。

食品产品/消耗性组合物可以包含低至0.05％gFPE w/w或高至30％gFPE w/w。较低的量可以增加液体消耗性组合物的黏度，而较高的量可以将消耗性组合物转化成固态或半固态。

在另一种情况下，用户可以使用gFPE降解微生物细胞壁以形成胶状物质，诸如黄原胶。然后可以将黄原胶添加到食品组合物中。

在一个实例中，具有SEQ ID NO:1的rFPE(rFPE1)可以在酵母宿主细胞中重组产生。rFPE1可以由宿主细胞分泌并从培养肉汤中收集和分离。它还可以被纯化和冻干。然后，rFPE1可以用于提供功能，诸如由于其抗微生物活性而提供更长的保质期，或者由于其在消耗性组合物中的低热胶凝化性能而提供胶凝化。除提供功能特性之外，rFPE1还可以增加组合物的营养含量。

食品防腐酶

FPE可以包括能够通过切割肽聚糖的N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1,4-糖苷键而有效水解细菌细胞壁的肽聚糖的酶。在一些情况下，FPE可以是胞壁酸酶。在一些情况下，FPE可以是溶菌酶。在一些情况下，FPE可以是鹅型溶菌酶，并且可以被称为“gFPE”。

在一些情况下，FPE可以是具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的酶或其酶促活性片段，或具有与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的酶。FPE可以是具有SEQID NO:2的氨基酸序列的酶或其酶促活性片段，或具有与SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的酶。FPE可以是具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的酶或其酶促活性片段，或具有与SEQ ID NO:3具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的酶。FPE可以是具有SEQID NO:4的氨基酸序列的酶或其酶促活性片段，或具有与SEQ ID NO:4具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的酶。rFPE，例如“本文所述的rFPE”，具有SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4中的任一个或其酶促活性片段或具有与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4中的任一个具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的酶，在本文中可以被称为gFPE。

重组FPE诸如gFPE的酶比活性可以高于从天然来源分离的天然胞壁酸酶(即，非重组胞壁酸酶)或鸡胞壁酸酶的酶比活性。FPE的酶比活性可以使用常规测定来测量，诸如测量包含微生物诸如溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)的溶液的吸光度损失的Shugar测定。一个Shugar单位可以被定义为在溶壁微球菌的溶液中破坏细胞壁的结构完整性、从而导致在25℃下吸光度每分钟降低0.0001的酶量。

本文所述的rFPE，例如gFPE的酶比活性可以是至少35,000Shugar单位/mg(U/mg)。rFPE，诸如gFPE的比活性可以是至少50,000Shugar U/mg、60,000Shugar U/mg、70,000Shugar U/mg、80,000Shugar U/mg、90,000Shugar U/mg、100,000Shugar U/mg、110,000Shugar U/mg、120,000Shugar U/mg、130,000Shugar U/mg、140,000Shugar U/mg、150,000Shugar U/mg、170,000Shugar U/mg、200,000Shugar U/mg、220,000Shugar U/mg、250,000Shugar U/mg、270,000Shugar U/mg、300,000Shugar U/mg、350,000Shugar U/mg、400,000Shugar U/mg、450,000Shugar U/mg、500,000Shugar U/mg、550,000Shugar U/mg、600,000Shugar U/mg或700,000Shugar U/mg。

rFPE，诸如gFPE的比活性可以是35,000U/mg至600,000U/mg蛋白质。rFPE，诸如gFPE的比活性可以是35,000U/mg至50,000U/mg、35,000U/mg至75,000U/mg、35,000U/mg至100,000U/mg、35,000U/mg至150,000U/mg、35,000U/mg至175,000U/mg、35,000U/mg至200,000U/mg、35,000U/mg至250,000U/mg、35,000U/mg至300,000U/mg、35,000U/mg至500,000U/mg、35,000U/mg至600,000U/mg、50,000U/mg至75,000U/mg、50,000U/mg至100,000U/mg、50,000U/mg至150,000U/mg、50,000U/mg至175,000U/mg、50,000U/mg至200,000U/mg、50,000U/mg至250,000U/mg、50,000U/mg至300,000U/mg、50,000U/mg至500,000U/mg、50,000U/mg至600,000U/mg、75,000U/mg至100,000U/mg、75,000U/mg至150,000U/mg、75,000U/mg至175,000U/mg、75,000U/mg至200,000U/mg、75,000U/mg至250,000U/mg、75,000U/mg至300,000U/mg、75,000U/mg至500,000U/mg、75,000U/mg至600,000U/mg、100,000U/mg至150,000U/mg、100,000U/mg至175,000U/mg、100,000U/mg至200,000U/mg、100,000U/mg至250,000U/mg、100,000U/mg至300,000U/mg、100,000U/mg至500,000U/mg、100,000U/mg至600,000U/mg、150,000U/mg至175,000U/mg、150,000U/mg至200,000U/mg、150,000U/mg至250,000U/mg、150,000U/mg至300,000U/mg、150,000U/mg至500,000U/mg、150,000U/mg至600,000U/mg、175,000U/mg至200,000U/mg、175,000U/mg至250,000U/mg、175,000U/mg至300,000U/mg、175,000U/mg至500,000U/mg、175,000U/mg至600,000U/mg、200,000U/mg至250,000U/mg、200,000U/mg至300,000U/mg、200,000U/mg至500,000U/mg、200,000U/mg至600,000U/mg、250,000U/mg至300,000U/mg、250,000U/mg至500,000U/mg、250,000U/mg至600,000U/mg、300,000U/mg至500,000U/mg、300,000U/mg至600,000U/mg或500,000U/mg至600,000U/mg蛋白质。rFPE，诸如gFPE的比活性可以是至多50,000U/mg、75,000U/mg、100,000U/mg、150,000U/mg、175,000U/mg、200,000U/mg、250,000U/mg、300,000U/mg、500,000U/mg或600,000U/mg蛋白质。

rFPE，诸如gFPE的比活性可以与从天然来源诸如蛋清分离的胞壁酸酶的比活性相当或更高。rFPE，诸如gFPE的比活性可以与从蛋清分离或重组产生的鸡胞壁酸酶的比活性相当或更高。

本文所述的rFPE，诸如gFPE可以具有抗微生物活性。重组产生的FPE，诸如gFPE/rFPE1的抗微生物活性可以与可商购获得的胞壁酸酶和/或非重组胞壁酸酶的抗微生物活性相当或更高。gFPE的抗微生物活性可以与鸡胞壁酸酶的抗微生物活性相当或更高。

由于本文所述的gFPE的高比活性，包含gFPE的食品产品可以具有与在没有gFPE的情况下制备的食品产品的保质期相当或更长的保质期。包含gFPE的食品产品的保质期可以与使用可商购获得的胞壁酸酶和/或非重组胞壁酸酶制备的食品产品的保质期相当或更长。

与从天然来源分离的胞壁酸酶相比，本文所述的gFPE在重组产生时可以是低变应原性的。在一些情况下，与鸡胞壁酸酶相比，rFPE1可以是低变应原性的。

消耗性组合物

本文公开的消耗性组合物包括包含FPE、优选地rFPE或gFPE，基本上由其组成或由其组成的产品。除rFPE1之外，消耗性组合物还可以包含天然分离的FPE1或gFPE。

本文公开的消耗性组合物可以具有约0.5％至约25％的rFPE浓度。本文公开的消耗性组合物可以具有约0.5％至约1％、约0.5％至约2％、约0.5％至约5％、约0.5％至约7％、约0.5％至约10％、约0.5％至约15％、约0.5％至约20％、约0.5％至约25％、约1％至约2％、约1％至约5％、约1％至约7％、约1％至约10％、约1％至约15％、约1％至约20％、约1％至约25％、约2％至约5％、约2％至约7％、约2％至约10％、约2％至约15％、约2％至约20％、约2％至约25％、约5％至约7％、约5％至约10％、约5％至约15％、约5％至约20％、约5％至约25％、约7％至约10％、约7％至约15％、约7％至约20％、约7％至约25％、约10％至约15％、约10％至约20％、约10％至约25％、约15％至约20％、约15％至约25％或约20％至约25％的rFPE浓度。本文公开的消耗性组合物可以具有约0.5％、约1％、约2％、约5％、约7％、约10％、约15％、约20％或约25％的rFPE浓度。本文公开的消耗性组合物可以具有至少约0.5％、约1％、约2％、约5％、约7％、约10％、约15％或约20％的rFPE浓度。本文公开的消耗性组合物可以具有至多约1％、约2％、约5％、约7％、约10％、约15％、约20％或约25％的rFPE浓度。

消耗性产品可以包含一种或多种其他蛋白质，诸如非FPE蛋白或非重组蛋白。rFPE可以增加消耗性产品中蛋白质含量的量。例如，消耗性组合物可以包含乳清蛋白、豌豆蛋白、大豆蛋白、杏仁蛋白、燕麦蛋白、亚麻籽蛋白、植物蛋白或蛋清蛋白。在一些情况下，一种或多种其他蛋白质可以包含来自禽类、鱼类、两栖动物或爬行动物来源的rFPE。

消耗性组合物可以是最终产品或成品的成分。FPE组合物可以是一种成分，其然后与其他成分混合以制备用于终端用户的最终产品。最终产品或成品是可供终端用户食用或使用的产品。成品可以是加工产品，诸如加工食品或加工饮料。消耗性组合物的非限制性实例包括食品产品、饮料产品、饮食补充剂、食品添加剂、营养品、保健产品和化妆品。

本文公开的消耗性组合物可以是液体或半固体。所述消耗性组合物可以具有凝胶状质地。本文公开的任何液体或半固体消耗性组合物可以通过将粉末状rFPE混合到溶液中来产生。所述溶液可以是最终产品或中间体溶液，然后将其进一步改性以产生最终产品。

液体消耗性组合物或饮料的实例包括：苏打水、维生素饮料、蛋白质奶昔、代餐奶昔、果汁、提神饮料、基于奶的饮料或基于非乳制品的饮料、加味水、碳酸饮料、咖啡、含咖啡因的饮料、茶、啤酒、酒和运动饮料。在液体消耗性组合物中，rFPE为液体组合物提供增加的黏度。

澄清度也可以通过缺乏半透明度来确定。缺乏半透明度的材料也可能具有乳白色或不透明的外观。具有rFPE的消耗性组合物可能缺乏乳白色、白色或不透明的外观。

与没有rFPE或具有与rFPE相等浓度存在的不同酶的组合物相比，具有rFPE的消耗性组合物还可以具有改善的感官吸引力。

如本文所述，消耗性组合物可以呈液体形式。液体形式可以是中间体产品，诸如可溶性rFPE溶液。在一些情况下，液体形式可以是最终产品，诸如包含rFPE的饮料。本文设想的不同类型饮料的实例包括：果汁、苏打水、软饮料、加味水、蛋白质水、强化水、碳酸水、营养饮料、能量饮料、运动饮料、恢复饮料、加热饮料、基于咖啡的饮料、基于茶的饮料、基于植物的奶、基于奶的饮料、非乳制品、基于植物的奶饮料、婴儿配方饮料、酒精饮料和代餐饮料。

在一些实施方案中，消耗性食品组合物可以呈半固体形式。食品产品可以是果冻、糖果、肉汤、汤、含明胶产品、胶凝化产品和胶质产品。可以在其中添加rFPE的额外示例性食品产品类别包括酱汁、调料和调味品。

在一些实施方案中，消耗性食品组合物可以呈固体形式。所述组合物可以是烘焙制品、面包、含麸质产品、无麸质产品、酱汁、调料、调味品、香料共混物、佐料混合物、包衣、面包屑、水果零食、蔬菜零食、冷冻乳制品、冷冻“乳制品状”产品、预制餐、肉产品、无肉产品、汉堡、肉饼、蛋白质补充剂、营养棒、甜点或“蛋状”产品。

在一些实施方案中，消耗性食品组合物和制备此类组合物的方法包括加热条件。例如，消耗性食品组合物可以是加热的饮料或热饮料，诸如温热或热饮料、汤或肉汤。在一些情况下，消耗性食品组合物可以具有用于产生成分或成品的加热步骤。其他实例包括平底锅煎炸和烘焙。

在本文的一些实施方案中，含有gFPE的消耗性食品组合物是用作与其他一种或多种成分或组分一起的成分以产生成品的组合物。例如，gFPE可以与水或其他液体混合，并且然后将此混合物用作产生饮料、食品产品、饮食补充剂或营养品的成分。在一些情况下，gFPE与其他成分混合，诸如其他液体(例如，坚果奶、果汁、植物提取物或碳酸溶液。此溶液可以是一种成分，其然后与其他成分混合以制备用于终端用户的最终产品；例如，所述溶液可以是含有浓缩gFPE的糖浆。最终产品或成品是可供终端用户食用的产品。成品可以是加工产品，诸如加工食品或加工饮料。在一些情况下，gFPE在单独容器中提供以由终端用户混合到最终产品中。在一些情况下，gFPE与其他成分，诸如胶凝剂混合以制备糖果、胶质产品、胶凝化产品(诸如Jello^TM)或运动凝胶。

在制备含有gFPE的消耗性食品产品期间或之后，可以将其配制为液体、固体、糖浆或粉末。组合物可以冷藏、冷冻、温热储存、室温储存或保持在加热温度下。食品产品的制备可以包括加热步骤，或者食品产品在加热温度下储存或供应。

液体消耗性组合物或饮料的实例包括：苏打水、维生素饮料、蛋白质奶昔、代餐奶昔、果汁、提神饮料、基于奶的饮料或基于非乳制品的饮料、加味水、碳酸饮料、咖啡、含咖啡因的饮料、茶、花卉饮料、啤酒、酒和运动饮料。

本文的任何液体或半固体消耗性组合物可以通过将粉末状gFPE混合到溶液中来产生。所述溶液可以是最终产品或中间体溶液，然后将其进一步改性以产生最终产品。

可以用于制备gFPE溶液的溶剂的实例包括静水、碳酸水、酒、果汁和任何其他可商购获得的饮料，包括本文更详细描述的那些。

生成包含gFPE的消耗性组合物的方法可以包括将gFPE与溶剂和任选地一种或多种其他组分混合。混合可以通过任何常规使用的混合方法进行，包括研钵和研杵、机械研磨机、共混、均化过程或超声处理过程。

添加到溶液中的gFPE的量可以是生成如本文所衍生的gFPE浓度的量(在最终产品或中间体产品中)。

优选地，将gFPE添加到溶液中导致大部分或几乎所有的gFPE在室温下溶解到溶液中。在一种情况下，溶解度基于澄清度或缺乏浊度程度来确定。

本文的消耗性组合物也可经受加热步骤。这种步骤可以改变或增加gFPE的溶解度。例如，发现在制备产品的过程中进行加热步骤，诸如干馏、热灌装或巴氏杀菌可以增加本文的gFPE溶液的溶解度并因此增加澄清度。

包含gFPE的消耗性食品产品的制备可以包括干燥和/或浓缩。在一些情况下，干燥形成干燥的、脱水的、浓缩的和/或固体蛋白质或组合物。干燥方法的一些非限制性实例包括热干燥、蒸发(例如，通过真空或空气)、蒸馏、煮沸、在烘箱中加热、真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥和冻干或其任何组合。

包含gFPE的消耗性食品产品的制备可以包括稀释和/或水合。在一些情况下，稀释可以包括添加液体，所述液体可以是水或另一种液体形式。例如，可以稀释组合物(例如，20％水至99.9％水)。在另一个实例中，可以使干燥组合物水合(例如，干燥固体至99.9％水)。

在一些实施方案中，含有gFPE的消耗性食品组合物呈粉末形式，并且在将粉末状组合物配制成溶液时，gFPE是基本上完全可溶的。在一些实施方案中，在将粉末状组合物配制成溶液时，gFPE是基本上完全可溶的并且溶液是基本上澄清的。在一些实施方案中，在将粉末状组合物配制成溶液时，gFPE是基本上完全可溶的，溶液是基本上澄清的并且与用其他粉末状蛋白质诸如乳清蛋白、大豆蛋白、豌豆蛋白、蛋清蛋白或全蛋蛋白制成的溶液相比，所述溶液是基本上感官中性的或具有改善的感官吸引力。在一些实施方案中，粉末状组合物溶解在水中，其中gFPE的浓度是或是约1％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％或40％重量/组合物总重量(w/w)和/或重量/组合物总体积(w/v)。

在本文所述的消耗性食品组合物的一些实施方案中，所述组合物基本上不含动物衍生组分、乳清蛋白、酪蛋白酸、脂肪、乳糖、水解乳糖、大豆蛋白、胶原蛋白、水解胶原蛋白或明胶或其任何组合。本文所述的组合物可以基本上不含胆固醇、葡萄糖、脂肪、饱和脂肪、反式脂肪或其任何组合。在一些情况下，本文所述的组合物包含按干重计小于10％、5％、4％、3％、2％、1％或0.5％的脂肪。在一些实施方案中，所述组合物可以是含脂肪的(例如像蛋黄酱)，并且这种组合物可以包含高达约60％的脂肪或减脂组合物(例如，减脂蛋黄酱)并且这种组合物可以包含较少百分比的脂肪。不含动物衍生组分的组合物可以被视为素食和/或严格素食。

在一些实施方案中，gFPE粉末组合物包含小于5％的灰分。术语“灰分”是本领域已知的术语并且代表无机物，诸如一种或多种离子、元素、矿物质和/或化合物。在一些情况下，gFPE粉末组合物包含小于5％、4.5％、4％、3.5％、3％、2.5％、2％、1.5％、1％、0.75％、0.5％、0.25％或0.1％的灰分重量/总重量(w/w)和/或重量/总体积(w/v)。

在一些实施方案中，gFPE粉末组合物的水分含量可以小于15％。gFPE粉末组合物可以具有小于15％、12％、10％、8％、6％、5％、3％、2％或1％的水分重量/总重量(w/w)和/或重量/总体积(w/v)。在一些实施方案中，gFPE粉末组合物的碳水化合物含量可以小于30％。gFPE粉末组合物可以具有小于30％、27％、25％、22％、20％、17％、15％、12％、10％、8％、5％、3％或1％w/w或w/v的碳水化合物含量。

在一些情况下，gFPE粉末组合物的蛋白质含量可以是30％至99％重量/总重量(w/w)和/或重量/总体积(w/v)。在一些情况下，gFPE粉末组合物的蛋白质含量可以是至少30％w/w或w/v。在一些情况下，gFPE粉末组合物的蛋白质含量可以是至多99％w/w或w/v。在一些情况下，gFPE粉末组合物的蛋白质含量可以是30％至40％、30％至50％、30％至60％、30％至70％、30％至75％、30％至80％、30％至85％、30％至90％、30％至95％、30％至99％、40％至50％、40％至60％、40％至70％、40％至75％、40％至80％、40％至85％、40％至90％、40％至95％、40％至99％、50％至60％、50％至70％、50％至75％、50％至80％、50％至85％、50％至90％、50％至95％、50％至99％、60％至70％、60％至75％、60％至80％、60％至85％、60％至90％、60％至95％、60％至99％、70％至75％、70％至80％、70％至85％、70％至90％、70％至95％、70％至99％、75％至80％、75％至85％、75％至90％、75％至95％、75％至99％、80％至85％、80％至90％、80％至95％、80％至99％、85％至90％、85％至95％、85％至99％、90％至95％、90％至99％或95％至99％w/w或w/v。在一些情况下，gFPE粉末组合物的蛋白质含量可以是约30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％w/w或w/v。在一些情况下，gFPE粉末组合物的蛋白质含量可以是至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％w/w或w/v。在一些情况下，gFPE粉末组合物的蛋白质含量可以是至多40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％w/w或w/v。

rFPE的胶凝化

在一些实施方案中，本文所述的FPE可以形成半固体组合物。在一些情况下，半固体组合物可以在本文所述的FPE的热处理后产生。gFPE可以为食品产品提供胶凝化。gFPE可以用于降解或消化某些微生物诸如细菌的细胞壁肽聚糖以形成凝胶。在一些情况下，gFPE可以能够在不降解或消化微生物细胞壁的情况下形成凝胶。在一些情况下，gFPE热处理后形成的凝胶组合物可能不包含任何微生物杂质。在一些情况下，FPE诸如gFPE热处理后形成的凝胶组合物可能不包含任何细菌杂质。在一些情况下，gFPE热处理后形成的凝胶组合物可能不包含任何其他胶凝剂或粘合剂。在一些情况下，与鸡胞壁酸酶提供的胶凝化相比，gFPE可以为组合物提供改善的胶凝化。

在一些情况下，gFPE在50℃至130℃范围内的温度下进行热处理后形成凝胶。在一些情况下，gFPE在50℃至130℃范围内的温度下、在低至0.05％的w/w蛋白质浓度下进行热处理后形成凝胶。在一些情况下，gFPE在50℃至130℃范围内的温度下、在低至0.05％的w/w蛋白质浓度下、在不存在其他胶凝剂的情况下进行热处理后形成凝胶。

在一些情况下，gFPE可以在50℃至130℃的温度下进行热处理后胶凝。在一些情况下，gFPE可以在至少50℃的温度下进行热处理后胶凝。在一些情况下，gFPE可以在至多130℃的温度下进行热处理后胶凝。在一些情况下，gFPE可以在以下温度下进行热处理后胶凝：50℃至60℃、50℃至70℃、50℃至75℃、50℃至80℃、50℃至90℃、50℃至95℃、50℃至100℃、50℃至110℃、50℃至120℃、50℃至130℃、60℃至70℃、60℃至75℃、60℃至80℃、60℃至90℃、60℃至95℃、60℃至100℃、60℃至110℃、60℃至120℃、60℃至130℃、70℃至75℃、70℃至80℃、70℃至90℃、70℃至95℃、70℃至100℃、70℃至110℃、70℃至120℃、70℃至130℃、75℃至80℃、75℃至90℃、75℃至95℃、75℃至100℃、75℃至110℃、75℃至120℃、75℃至130℃、80℃至90℃、80℃至95℃、80℃至100℃、80℃至110℃、80℃至120℃、80℃至130℃、90℃至95℃、90℃至100℃、90℃至110℃、90℃至120℃、90℃至130℃、95℃至100℃、95℃至110℃、95℃至120℃、95℃至130℃、100℃至110℃、100℃至120℃、100℃至130℃、110℃至120℃、110℃至130℃或120℃至130℃。在一些情况下，gFPE可以在50℃、60℃、70℃、75℃、80℃、90℃、95℃、100℃、110℃、120℃或130℃的温度下进行热处理后胶凝。在一些情况下，gFPE可以在至少50℃、60℃、70℃、75℃、80℃、90℃、95℃、100℃、110℃或120℃的温度下进行热处理后胶凝。在一些情况下，gFPE可以在至多60℃、70℃、75℃、80℃、90℃、95℃、100℃、110℃、120℃或130℃的温度下进行热处理后胶凝。

在一些情况下，gFPE可以形成浓度为0.05％至30％w/w的凝胶。在一些情况下，gFPE可以形成浓度为至少0.05％w/w的凝胶。在一些情况下，gFPE可以形成浓度为至多30％w/w的凝胶。在一些情况下，gFPE可以形成浓度为以下的凝胶：0.05％至1％、0.05％至2％、0.05％至5％、0.05％至8％、0.05％至10％、0.05％至15％、0.05％至20％、0.05％至25％、0.05％至30％、1％至2％、1％至5％、1％至8％、1％至10％、1％至15％、1％至20％、1％至25％、1％至30％、2％至5％、2％至8％、2％至10％、2％至15％、2％至20％、2％至25％、2％至30％、5％至8％、5％至10％、5％至15％、5％至20％、5％至25％、5％至30％、8％至10％、8％至15％、8％至20％、8％至25％、8％至30％、10％至15％、10％至20％、10％至25％、10％至30％、15％至20％、15％至25％、15％至30％、20％至25％、20％至30％或25％至30％w/w。在一些情况下，gFPE可以形成浓度为0.05％、1％、2％、5％、8％、10％、15％、20％、25％或30％w/w的凝胶。在一些情况下，gFPE可以形成浓度为至少0.05％、1％、2％、5％、8％、10％、15％、20％或25％w/w的凝胶。在一些情况下，gFPE可以形成浓度为至多1％、2％、5％、8％、10％、15％、20％、25％或30％w/w的凝胶。

在一些情况下，gFPE可以形成低浓度，诸如0.05％至2％w/w浓度的凝胶。在一些情况下，gFPE可以形成浓度为至少0.05％w/w的凝胶。在一些情况下，gFPE可以形成浓度为至多2％w/w的凝胶。在一些情况下，gFPE可以形成浓度为以下的凝胶：0.05％至0.06％、0.05％至0.125％、0.05％至0.25％、0.05％至0.5％、0.05％至1％、0.05％至1.5％、0.05％至2％、0.06％至0.125％、0.06％至0.25％、0.06％至0.5％、0.06％至1％、0.06％至1.5％、0.06％至2％、0.125％至0.25％、0.125％至0.5％、0.125％至1％、0.125％至1.5％、0.125％至2％、0.25％至0.5％、0.25％至1％、0.25％至1.5％、0.25％至2％、0.5％至1％、0.5％至1.5％、0.5％至2％、1％至1.5％、1％至2％或1.5％至2％w/w。在一些情况下，gFPE可以形成浓度为0.05％、0.06％、0.125％、0.25％、0.5％、1％、1.5％或2％w/w的凝胶。在一些情况下，gFPE可以形成浓度为至少0.05％、0.06％、0.125％、0.25％、0.5％、1％或1.5％w/w的凝胶。在一些情况下，gFPE可以形成浓度为至多0.05％、0.06％、0.125％、0.25％、0.5％、1％、1.5％或2％w/w的凝胶。

半固体或凝胶消耗性组合物诸如食品可以包含0.05％至25％gFPEw/w。半固体或凝胶消耗性组合物诸如食品可以包含至少0.05％gFPEw/w。半固体或凝胶消耗性组合物诸如食品可以包含至多25％gFPEw/w。半固体或凝胶消耗性组合物诸如食品可以包含0.05％至0.1％、0.05％至1％、0.05％至2％、0.05％至5％、0.05％至10％、0.05％至15％、0.05％至20％、0.05％至25％、0.1％至1％、0.1％至2％、0.1％至5％、0.1％至10％、0.1％至15％、0.1％至20％、0.1％至25％、1％至2％、1％至5％、1％至10％、1％至15％、1％至20％、1％至25％、2％至5％、2％至10％、2％至15％、2％至20％、2％至25％、5％至10％、5％至15％、5％至20％、5％至25％、10％至15％、10％至20％、10％至25％、15％至20％、15％至25％或20％至25％gFPEw/w。半固体或凝胶消耗性组合物诸如食品可以包含0.05％、0.1％、1％、2％、5％、10％、15％、20％或25％gFPEw/w。

包含gFPE的组合物的凝胶强度可以大于含有c型溶菌酶或鸡胞壁酸酶的组合物的凝胶强度。在一些情况下，gFPE组合物具有相对于含有鸡胞壁酸酶或c型溶菌酶的组合物约或至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％的凝胶强度。在一些情况下，gFPE组合物具有相对于含有鸡胞壁酸酶或c型溶菌酶的组合物高达50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％的凝胶强度。

包含gFPE的液体组合物的黏度可以大于包含c型溶菌酶或鸡胞壁酸酶的组合物的黏度。在一些情况下，液体gFPE组合物具有相对于含有鸡胞壁酸酶或c型溶菌酶的组合物约或至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％的黏度。在一些情况下，液体gFPE组合物具有相对于含有鸡胞壁酸酶或c型溶菌酶的组合物高达50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％的黏度。

gFPE/FPE1在胶产生中的用途

gFPE可以用于产生澄清的严格素食凝胶并且用作作为食品产品中的成分使用的胶。例如，gFPE可以用于制备细菌多糖，诸如黄原胶、结冷胶或定优胶(diutan gum)。使用gFPE产生的含胶溶液的透光率可以高于使用常规使用的胞壁酸酶诸如鸡胞壁酸酶产生的胶的透光率，从而使得使用gFPE形成的凝胶的澄清度增加。使用gFPE产生的含胶溶液的澄清度可以高于使用常规使用的胞壁酸酶诸如鸡胞壁酸酶产生的胶的澄清度。

由于本文所述的rFPE的活性意料之外地高，因此本文所述的胶和凝胶的产生可能需要比使用从天然来源分离的胞壁酸酶或鸡胞壁酸酶时所需的更少的酶。在一些情况下，产生胶或凝胶所需的量或酶单位可以是使用天然获得的胞壁酸酶诸如鸡胞壁酸酶产生相同的胶或凝胶所需的量或酶单位的1/2、1/3、1/5、1/7或1/10。

如本文所述的胶和凝胶可以通过消化细菌培养物来产生。发酵后，细菌培养物可以在高温和碱性条件下用碱性蛋白酶处理。可以首先在室温或25℃与37℃之间的温度下培养细菌。对于胶产生，细菌培养物的温度可以增加至约45℃、约47℃、约50℃、约52℃、约55℃、约57℃、约60℃、约65℃或约75℃。

细菌培养物也可以用具有高pH的碱性蛋白酶处理。细菌培养物可以用pH为约8、约8.5、约9、约9.5、约10、约10.5或约11的碱性蛋白酶处理。使用碱性蛋白酶对细菌培养物进行蛋白水解后，可以用FPE，诸如gFPE进行处理。

在用gFPE进行处理之前，可以修改培养物的pH。gFPE处理可以在中性pH下进行。gFPE处理可以在约5.5、约6、约6.5、约7、约7.5或约8的pH下进行。

在用gFPE进行处理之前，也可以修改培养物的温度。gFPE处理可以在约30℃、约32℃、约35℃、约37℃或约40℃的温度下进行。

gFPE与培养物用于产生胶诸如黄原胶的反应可以使用醇终止。异丙醇可以用于终止gFPE与细菌培养物的反应。还设想了可以终止反应的其他醇或溶液。然后可以从培养物中提取、例如沉淀由这种反应产生的胶。

由此类反应产生的胶可以在食用之前进一步处理。例如，所述胶可以在食用之前进行热处理或干燥。

包装

本文公开的消耗性组合物的益处之一是它们允许更简单的包装。在一种情况下，消耗性组合物可以包装在透明容器中，因为组合物缺乏浊度使得产品对消费者更具吸引力。

消耗性组合物可以冷藏、冷冻、温热储存、室温储存或保持在加热温度下。

重组FPE

rFPE可以具有来自任何物种的氨基酸序列。例如，rFPE可以具有来自鸟类、鱼类、两栖动物或爬行动物的FPE的氨基酸序列。具有来自禽类的氨基酸序列的rFPE可以选自：家禽、飞禽、水禽、猎鸟、鸡、鹌鹑、火鸡、鸭、鸵鸟、鹅、海鸥、珍珠鸡、雉鸡、鸸鹋及其任何组合。rFPE可以具有衍生自单一物种，诸如雁属灰雁(Anser anser anser)或原鸡属家鸡(Gallusgallus domesticus)的氨基酸序列。可替代地，rFPE可以具有衍生自两个或更多个物种的氨基酸序列，并且因此是杂合物。

rFPE可以是FPE的非天然存在的变体。这种变体可以包含一个或多个相对于天然FPE序列的氨基酸插入、缺失或取代。

这种变体可以与SEQ ID NO:1-4中的任一个具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。优选地，变体可以与SEQ ID NO:1-4中的任一个具有至少90％或更高序列同一性。在一些情况下，优选变体可以与SEQ ID NO:1-4中的任一个具有至少95％序列同一性。在一些情况下，优选变体可以与SEQ ID NO:1-4中的任一个具有至少97％序列同一性。如本文所用，在氨基酸序列的语境中，术语“序列同一性”被定义为在比对序列并且必要时引入间隔物以实现最大序列同一性百分比，并且不考虑任何保守性取代作为序列同一性的一部分之后，候选序列中与所选序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域熟知的多种方式来实现，例如，使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括为了在被比较的序列的全长上实现最大比对所需要的任何算法。

在一些实施方案中，变体是赋予额外的特征，诸如降低的变应原性的变体。

根据用于表达rFPE的宿主生物体，rFPE可以具有不同于野生型FPE的糖基化、乙酰化或磷酸化模式。例如，rFPE可以是或可以不是糖基化的、乙酰化的或磷酸化的。rFPE可以具有禽类、非禽类、微生物、非微生物、哺乳动物或非哺乳动物的糖基化、乙酰化或磷酸化模式。

在一些情况下，rFPE可以是去糖基化的(例如，化学、酶促、Endo-H、PNGase F、O-糖苷酶、神经氨酸酶、β1-4半乳糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡糖苷酶)、去乙酰化的(例如，蛋白质去乙酰化酶、组蛋白去乙酰化酶、去乙酰化酶(sirtuin))或去磷酸化的(例如，酸性磷酸酶、λ蛋白磷酸酶、牛小肠磷酸酶、碱性磷酸酶)。去糖基化、去乙酰化或去磷酸化可以产生更均一或能够产生具有更少变化的组合物的蛋白质。

rFPE在宿主细胞中重组表达。如本文所用，“宿主”或“宿主细胞”在此代表被选择来或进行基因修饰以产生所需产物的任何蛋白质产生宿主。示例性宿主包括真菌诸如丝状真菌以及细菌、酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞。宿主细胞可以是阿克苏酵母属的种(Arxula spp.)，食腺嘌呤阿克苏酵母(Arxula adeninivorans)；克鲁维酵母属，乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、法夫驹形氏酵母(Komagataella phaffii)；毕赤酵母属的种(Pichia spp.)，安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)；酿酒酵母属的种(Saccharomyces spp.)，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)；裂殖酵母属的种(Schizosaccharomyces spp.)，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；耶氏酵母属的种(Yarrowia spp.)，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)；蘑菇属的种(Agaricus spp.)，双孢蘑菇(Agaricus bisporus)；曲霉属的种(Aspergillus spp.)，泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；炭疽菌属的种(Colletotrichum spp.)，胶胞炭疽菌(Colletotrichum gloeosporiodes)；内座壳属的种(Endothia spp.)，寄生内座壳(Endothia parasitica)、大肠肝菌(Escherichia coli)；镰胞属的种(Fusarium spp.)，禾本科镰胞(Fusarium graminearum)、腐皮镰胞(Fusariumsolani)；毛霉属的种(Mucor spp.)，米赫毛霉(Mucor miehei)、微小毛霉(Mucorpusillus)；毁丝霉属的种(Myceliophthora spp.)，嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)；脉胞菌属的种(Neurospora spp.)，粗糙脉胞菌(Neurospora crassa)；青霉属的种(Penicillium spp.)，沙门柏干酪青霉(Penicillium camemberti)、变灰青霉(Penicillium canescens)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、埃默森青霉(篮状菌)(Penicillium (Talaromyces)emersonii)、绳状青霉(Penicillium funiculo sum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、罗克福尔青霉(Penicillium roqueforti)；侧耳属的种(Pleurotus spp.)，糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)；根毛霉属的种(Rhizomucorspp.)，米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)；根霉属的种(Rhizopus spp.)，少根根霉(Rhizopus arrhizus)、少孢根霉(Rhizopus oligosporus)、米根霉(Rhizopus oryzae)；木霉属的种(Trichoderma spp.)，深绿木霉(Trichodermaaltroviride)、瑞氏木霉(Trichoderma reesei)或绿木霉(Trichoderma vireus)。宿主细胞可以是被美国食品药品监督管理局批准为通常安全的生物体。

rFPE蛋白可以在酵母、丝状真菌或细菌中重组表达。在一些实施方案中，rFPE蛋白在毕赤酵母属物种(法夫驹形氏酵母和巴斯德驹形氏酵母(Komagataella pastoris))、酵母属物种、木霉属物种、假单胞菌属物种或大肠杆菌物种中重组表达。

rFPE在宿主细胞，例如毕赤酵母属物种、酵母属物种、木霉属物种、假单胞菌属物种中的表达可以使得将肽作为转录后或翻译后修饰的一部分添加到FPE序列中。此类肽可以不是天然FPE序列的一部分。例如，在毕赤酵母属物种诸如法夫驹形氏酵母和巴斯德驹形氏酵母中表达FPE序列可以使得在N末端或C末端处添加肽。在一些情况下，四肽EAEA在宿主细胞中表达时被添加到FPE的N末端。

rFPE的表达可以通过表达载体、质粒、整合到宿主基因组中的核酸或其他方式来提供。例如，用于表达的载体可以包含：(a)启动子元件，(b)信号肽，(c)异源FPE序列，和(d)终止子元件。

可以用于表达FPE的表达载体包括含有具有元件(a)、(b)、(c)和(d)的表达盒的那些。在一些实施方案中，信号肽(c)不需要包含在载体中。通常，表达盒被设计为在整合到同源宿主微生物的基因组中时介导转基因的转录。

为了在转化到宿主微生物之前帮助载体的扩增，复制起点(e)可以包含在载体中(诸如PUC_ORIC和PUC(DNA2.0))。为了帮助选择用表达载体稳定转化的微生物，载体还可以包含选择标记物(f)，诸如URA3基因和吉欧霉素(Zeocin)抗性基因(ZeoR)。表达载体还可以含有限制性酶切位点(g)，其允许表达载体在转化到宿主微生物中之前线性化，以促进表达载体稳定整合到宿主基因组中。在一些实施方案中，表达载体可以包含元件(b)、(e)、(f)和(g)的任何子集，不包括元件(b)、(e)、(f)和(g)中的任一个。本领域技术人员已知的其他表达元件和载体元件可以组合使用或替代本文所述的元件。

示例性启动子元件(a)可以包括但不限于组成型启动子、诱导型启动子和杂合启动子。启动子包括但不限于acu-5、adh1+、醇脱氢酶(ADH1、ADH2、ADH4)、AHSB4m、AINV、alcA、α-淀粉酶、替代氧化酶(AOD)、醇氧化酶I(AOX1)、醇氧化酶2(AOX2)、AXDH、B2、CaMV、纤维二糖水解酶I(cbh1)、ccg-1、cDNA1、细胞丝多肽(cfp)、cpc-2、ctr4+、CUP1、二羟基丙酮合酶(DAS)、烯醇酶(ENO、ENO1)、甲醛脱氢酶(FLD1)、FMD、甲酸脱氢酶(FMDH)、G1、G6、GAA、GAL1、GAL2、GAL3、GAL4、GAL5、GAL6、GAL7、GAL8、GAL9、GAL10、GCW14、gdhA、gla-1、α-葡糖淀粉酶(glaA)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(gpdA、GAP、GAPDH)、磷酸甘油酸变位酶(GPM1)、甘油激酶(GUT1)、HSP82、invl+、异柠檬酸裂合酶(ICL1)、乙酰羟酸异构还原酶(ILV5)、KAR2、KEX2、β-半乳糖苷酶(lac4)、LEU2、melO、MET3、甲醇氧化酶(MOX)、nmt1、NSP、pcbC、PET9、过氧化物酶体蛋白质8(peroxin 8，PEX8)、磷酸甘油酸酯激酶(PGK、PGK1)、pho1、PHO5、PHO89、磷脂酰肌醇合酶(PIS1)、PYK1、丙酮酸激酶(pki1)、RPS7、山梨醇脱氢酶(SDH)、3-磷酸丝氨酸氨基转移酶(SER1)、SSA4、SV40、TEF、翻译延伸因子1α(TEF1)、THI11、同型丝氨酸激酶(THR1)、tpi、TPS1、丙糖磷酸异构酶(TPI1)、XRP2、YPT1及其任何组合。

信号肽(b)，也被称为信号序列、靶向信号、定位信号、定位序列、信号肽、转运肽、前导序列或前导肽，可以支持蛋白质或多核苷酸的分泌。从宿主细胞细胞外分泌重组或异源表达的蛋白质可以促进蛋白质纯化。信号肽可以衍生自蛋白质的前体(例如，前肽、前蛋白)。信号肽可以衍生自天然FPE中信号肽以外的蛋白质前体。

任何编码FPE的核酸序列都可以用作(c)。优选地，这种序列针对细胞进行密码子优化。

示例性转录终止子元件包括但不限于acu-5、adh1+、醇脱氢酶(ADH1、ADH2、ADH4)、AHSB4m、AINV、alcA、α-淀粉酶、替代氧化酶(AOD)、醇氧化酶I(AOX1)、醇氧化酶2(AOX2)、AXDH、B2、CaMV、纤维二糖水解酶I(cbh1)、ccg-1、cDNA1、细胞丝多肽(cfp)、cpc-2、ctr4+、CUP1、二羟基丙酮合酶(DAS)、烯醇酶(ENO、ENO1)、甲醛脱氢酶(FLD1)、FMD、甲酸脱氢酶(FMDH)、G1、G6、GAA、GAL1、GAL2、GAL3、GAL4、GAL5、GAL6、GAL7、GAL8、GAL9、GAL10、GCW14、gdhA、gla-1、α-葡糖淀粉酶(glaA)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(gpdA、GAP、GAPDH)、磷酸甘油酸变位酶(GPM1)、甘油激酶(GUT1)、HSP82、invl+、异柠檬酸裂合酶(ICL1)、乙酰羟酸异构还原酶(ILV5)、KAR2、KEX2、β-半乳糖苷酶(lac4)、LEU2、melO、MET3、甲醇氧化酶(MOX)、nmt1、NSP、pcbC、PET9、过氧化物酶体蛋白质8(PEX8)、磷酸甘油酸酯激酶(PGK、PGK1)、pho1、PHO5、PHO89、磷脂酰肌醇合酶(PIS1)、PYK1、丙酮酸激酶(pki1)、RPS7、山梨醇脱氢酶(SDH)、3-磷酸丝氨酸氨基转移酶(SER1)、SSA4、SV40、TEF、翻译延伸因子1α(TEF1)、THI11、同型丝氨酸激酶(THR1)、tpi、TPS1、丙糖磷酸异构酶(TPI1)、XRP2、YPT1及其任何组合。

示例性可选择标记物(f)可以包括但不限于：抗生素抗性基因(例如，吉欧霉素、氨苄西林、杀稻瘟菌素、卡那霉素、nurseothricin、氯霉素、四环素、三氯生、更昔洛韦及其任何组合)、营养缺陷型标记物(例如，ade1、arg4、his4、ura3、met2及其任何组合)。

在一个实例中，用于在毕赤酵母属的种中表达的载体可以包含与编码FPE的核酸序列框内融合的信号肽(α交配因子)可操作地连接的AOX1启动子，和紧邻编码FPE的核酸序列下游的终止子元件(AOX1终止子)。

在另一个实例中，包含DAS1启动子的载体与编码FPE的核酸序列框内融合的信号肽(α交配因子)和紧邻FPE下游的终止子元件(AOX1终止子)可操作地连接。

本文所述的重组蛋白可以从一种或多种宿主细胞中分泌。在一些实施方案中，rFPE从宿主细胞中分泌。分泌的rFPE可以通过诸如离心、分级、过滤、亲和纯化的方法以及用于从细胞、液体和固体培养基组分以及其他细胞产物和副产物中分离蛋白质的其他方法来分离和纯化。在一些实施方案中，rFPE在毕赤酵母属物种中产生，并且从宿主细胞分泌到培养基中。然后将分泌的rFPE与其他培养基组分分离以进一步使用。

消耗性产品和rFPE可以基本上没有任何微生物生长。例如，rFPE可以从包含微生物生长的培养物中分离。可替代地，rFPE组合物可以包含微生物生长，例如，在益生菌配制品的情况下。在一些情况下，益生菌组合物包含rFPE。益生菌组合物可以包含产生rFPE的微生物。

表1：序列

实施例

实施例1：表达构建体、转化、蛋白质纯化和加工

为了在巴斯德毕赤酵母中重组表达具有SEQ ID NO:1的成熟形式的g型食品防腐酶(rFPE1)，产生了六种表达构建体。构建体包含AOX1、Pex11、DAS1、FLD1、FGH1和FDH1启动子。rFPE1编码序列(编码SEQ ID NO:1)与启动子序列下游的α交配因子信号序列框内融合。来自AOX1基因的转录终止子位于rFPE1序列的下游。

对巴斯德毕赤酵母菌株进行修饰以去除细胞质杀伤质粒，并且然后进一步修饰以具有AOX1基因中的缺失。此缺失生成甲醇利用缓慢(mutS)的表型，其降低菌株消耗甲醇作为能源的能力。用六种表达构建体之一转染巴斯德毕赤酵母细胞。

发酵：将用六种rFPE1表达构建体之一转染的细胞在环境条件下在单独的生物反应器中生长。发酵过程的种子培养以用液体生长肉汤接种摇瓶开始。

将培养物在30℃下，在设定的pH和溶解氧(DO)下生长。为培养物进料碳源。

为了扩大生产，将rFPE1巴斯德毕赤酵母种子菌株从低温储存中取出并解冻至室温。将解冻的种子小瓶的内容物用于接种在三角烧瓶(baffled flask)中的液体种子培养基，所述三角烧瓶在30℃下在摇动培养箱中生长。然后将这些种子烧瓶转移并在一系列越来越大的种子发酵罐(数量根据规模而变化)中生长，这些发酵罐含有基础盐培养基、痕量金属和葡萄糖。种子反应器的温度控制在30℃下，pH为5并且DO为30％。通过进料还充当氮源的氢氧化氨来维持pH。一旦达到足够的细胞质量，将生长的rFPE1巴斯德毕赤酵母接种在含有基础盐培养基、痕量金属和葡萄糖的生产规模的反应器中。与种子罐中一样，在整个过程中，培养物也控制在30℃、pH 5和30％DO下。再次通过进料氢氧化氨维持pH。在初始批次葡萄糖阶段期间，使培养物消耗所有葡萄糖和随后产生的乙醇。一旦实现目标细胞密度并确认葡萄糖和乙醇浓度为零，则开始葡萄糖进料分批生长阶段。在此阶段中，进料葡萄糖，直至培养物达到目标细胞密度。葡萄糖以有限的速率进料，以防止乙醇在非零葡萄糖浓度存在的情况下积聚。在最终诱导阶段中，为培养物同时进料葡萄糖和甲醇，从而诱导其产生rFPE1。葡萄糖以一定量进料以产生所需的生长速率，同时进料甲醇以将甲醇浓度维持在1％以确保持续诱导表达。在整个发酵过程中定期取样，用于分析特定工艺参数(例如，细胞密度、葡萄糖/甲醇浓度、产物滴度和质量)。经过指定量的发酵时间之后，收集分泌的rFPE1并转移用于下游加工。

通过从液体生长肉汤中分离细胞、对液体生长肉汤进行多个过滤步骤、进行色谱法和/或干燥最终蛋白质产物以产生分离的重组rFPE1粉末来纯化rFPE1产物。

实施例2：rFPE1相对于鸡胞壁酸酶的比活性

制备在10ml磷酸钾缓冲液(KPI 50mM，pH在6.2与6.6之间)中0.05％或5mg的冻干藤黄微球菌(溶壁微球菌)的初始悬浮液浓度，并通过倒置(30秒)混合以悬浮。使溶液静置大约15-20min以适当地使细胞重新水合。然后确定细胞悬浮液的A450吸光度在0.6-0.7之间。在进行测定之前，将细胞悬浮液添加到微孔板中，将温度调节至25℃。如以下表2所示，在此测定中观察到rFPE1制剂(来自实施例1)的比活性比鸡胞壁酸酶的比活性高几乎一个数量级。

表2：比活性结果

实施例3：黄原胶

进行功能测定，以确定rFPE1是否可以在由野油菜黄单胞菌产生黄原胶中代替鸡胞壁酸酶(Lysovin)。由细胞培养物产生细菌多糖(包括黄原胶、结冷胶和定优胶)有若干种酶促工业方法。

将细菌培养物在碱性条件(pH 10)下于55℃加热杀死，然后使用碱性蛋白酶(枯草芽孢杆菌蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶)进行蛋白水解/溶解。蛋白水解后，将制剂缓冲至中性pH(例如，pH 6.5-7.5)，并且在25℃使用约30ppm(百万分之一)的浓度用胞壁酸酶进行酶处理。对于黄原胶，通过使用1.6x重量的99％异丙醇萃取固体胶来终止反应。然后将胶残余物干燥，在水中重悬浮至所需的最终％(w/v)，并且通过测量通过样品的透光率(％T；或600nm处的澄清度)来评估它们的品质。使用各种酶浓度的rFPE1(来自实施例1)或鸡胞壁酸酶来产生黄原胶。透光率结果在表3中示出。

表3：黄原胶制剂的透光率

实施例4：抗微生物活性

蛋清胞壁酸酶由于其细菌细胞壁降解活性，是一种直接添加到食品和饮料产品中的常见防腐剂/抗菌剂，因为它被认证为公认安全的(GRAS)。因此，在菌落形成单位(CFU)测定中测试rFPE1(来自实施例1)，以确定它是否可以杀死酒类酒球菌(Oenococcus oeni，葡萄酒、啤酒和果汁污染物)、有害片球菌(Pediococcus damnosus，啤酒和葡萄酒腐败)、藤黄微球菌(食品腐败)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis，用于啤酒制造的有益细菌)和野油菜黄单胞菌(黄原胶产生)的活培养物(约2x10⁷个细胞/ml)。这些实验的结果在图1A至图1E中示出。

对于此实验，将细菌培养物在其各自优选的培养基中生长，并且然后使用水调节至1.0的最终OD₆₀₀。然后将细胞悬浮液与500ppm rFPE1(最终浓度)或仅水(对照)混合，并且使其在室温(25℃)下温育1h，之后进行细胞稀释和铺板(参见下文)。图1A至图1E中示出了，rFPE1提供针对酒类酒球菌、有害片球菌和藤黄微球菌细胞的显著杀菌活性，然而rFPE对于有益细菌短乳杆菌的活力没有明显影响。虽然在黄原胶产生期间，rFPE1不常用于杀死活野油菜黄单胞菌细胞，但是500ppm下的rFPE1被证明在处理之后在统计学上控制这种细菌物种的生长达至多48小时(参见图1E)。因此，这些结果证明了，rFPE1的杀菌/抑菌活性可以替代其中当前使用鸡蛋清胞壁酸酶的任何食品或饮料应用。

在另一个实验中，测量了rFPE1和鸡胞壁酸酶的最小抑制浓度。此测定的两次不同重复的结果在以下表4和表5中示出。

表4：初始实验中的最小抑制浓度

表5：后续实验中的最小抑制浓度

实施例5：rFPE1的胶凝化

重组产生具有SEQ ID NO:1的FPE1(rFPE1)，如实施例1中详述。在1X PBS(pH 7.4)中制备20％rFPE1溶液。将29mg rFPE1粉末重悬浮在145μl 1XPBS中。将包含此溶液的管放入100℃的沸水浴中，持续几秒。图2A示出了沸腾之前和沸腾之后的溶液。如图2A所示，rFPE1几乎瞬间形成凝胶。

将100μl溶液的20％rFPE1溶液在管中在55℃、60℃、65℃、70℃或75℃下加热10分钟，接着置于冰中并在4℃下储存。将20％浓度的重组鸡c型溶菌酶(cOVL)的对比溶液也在相同温度下加热。结果在图2B中示出。如图2B所示，rFPE1在60℃开始的温度下胶凝化，而cOVL即使在75℃下也不胶凝。图2C示出了具有凹痕和干净边缘的胶凝化rFPE1。

在75℃下处理15分钟，接着在冰上储存后，还测量了rFPE1溶液在0.063％至15％范围内的不同浓度下的胶凝化。rFPE1能够在低至0.063％的浓度下胶凝化，在所述浓度下它形成离散的凝胶颗粒。在较高浓度下，rFPE1形成凝乳状结构并在15％浓度下形成结构化凝胶颗粒。

此实施例中描述的温度下的胶凝化在溶菌酶蛋白中是相对未知的，并且因此是意料之外的。这些结果显示，rFPE1(由于其低热胶凝化性能(玻璃化转变温度))可以用作复杂蛋白质-蛋白质或蛋白质-碳水化合物食品组合物或食品产品中蛋白质胶凝化和抗微生物特性的成核剂。

实施例6：rFPE1的免疫反应性

在lysovin、可商购获得的c型OVL和rFPE1上测试了针对cOVL或rFPE1的抗体的交叉反应性。使用抗cOVL或抗FPE1一抗对rFPE1、Lysovin、cOVL和稀释的鹅蛋清进行SDS-PAGE。泳道1-8用1:3000稀释度的抗cOVL抗体处理，而泳道9-16用1:10,000稀释度的抗rFPE1抗体处理。

表5：SDS-Page的泳道

如图3所示，左侧蛋白质印迹显示抗cOVL抗体与lysovin(MW为约13kD)结合。在右侧凝胶中，抗rFPE1抗体与纯化的rFPE1(MW为约20kD)结合。结果显示，针对鸡蛋清溶菌酶蛋白(一种已知的食品过敏原)的可商购获得的抗体不识别重组或天然鹅蛋清溶菌酶。

尽管已经在本文中示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员而言将明显是，此类实施方案仅通过举例方式提供。本发明并不旨在受本说明书内提供的具体实施例的限制。虽然已经参考上述说明书描述了本发明，但本文的实施方案的描述和说明并不意味着以限制的意义来解释。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到多种变型、改变和替代。此外，应理解，本发明的所有方面不限于本文中所述的取决于各种条件和变量的具体的描绘、配置或相对比例。应理解，本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案可以用于实施本发明。因此，设想本发明还应覆盖任何这种替代方案、修改、变型或等同方案。所附权利要求意在界定本发明的范围并且意在由此覆盖处于这些权利要求的范围内的方法和结构及它们的等同方案。

序列表

<110> 克莱拉食品公司

<120> 酶组合物及其制备方法

<130> 49160-718.601

<150> US62/953,361

<151> 2019-12-24

<160> 4

<170> PatentIn版本 3.5

<210> 1

<211> 185

<212> PRT

<213> 雁属灰雁

<400> 1

Arg Thr Asp Cys Tyr Gly Asn Val Asn Arg Ile Asp Thr Thr Gly Ala

1 5 10 15

Ser Cys Lys Thr Ala Lys Pro Glu Gly Leu Ser Tyr Cys Gly Val Ser

20 25 30

Ala Ser Lys Lys Ile Ala Glu Arg Asp Leu Gln Ala Met Asp Arg Tyr

35 40 45

Lys Thr Ile Ile Lys Lys Val Gly Glu Lys Leu Cys Val Glu Pro Ala

50 55 60

Val Ile Ala Gly Ile Ile Ser Arg Glu Ser His Ala Gly Lys Val Leu

65 70 75 80

Lys Asn Gly Trp Gly Asp Arg Gly Asn Gly Phe Gly Leu Met Gln Val

85 90 95

Asp Lys Arg Ser His Lys Pro Gln Gly Thr Trp Asn Gly Glu Val His

100 105 110

Ile Thr Gln Gly Thr Thr Ile Leu Ile Asn Phe Ile Lys Thr Ile Gln

115 120 125

Lys Lys Phe Pro Ser Trp Thr Lys Asp Gln Gln Leu Lys Gly Gly Ile

130 135 140

Ser Ala Tyr Asn Ala Gly Ala Gly Asn Val Arg Ser Tyr Ala Arg Met

145 150 155 160

Asp Ile Gly Thr Thr His Asp Asp Tyr Ala Asn Asp Val Val Ala Arg

165 170 175

Ala Gln Tyr Tyr Lys Gln His Gly Tyr

180 185

<210> 2

<211> 184

<212> PRT

<213> 墨西哥钝口螈

<400> 2

Ser Gly Cys Tyr Gly Asn Ile Met Asp Val Pro Thr Thr Gly Ala Ser

1 5 10 15

Cys Leu Thr Ala Ser Gln Asp Asn Leu Pro Tyr Cys Gly Val Ala Ala

20 25 30

Ser Gln Gln Met Ala Ala Thr Asp Leu Pro Asp Met Asn Gln Tyr Lys

35 40 45

Glu Lys Ile Leu Ala Val Ala Gln Asn Leu Cys Met Asp Gly Ala Val

50 55 60

Ile Ala Gly Ile Ile Ser Arg Glu Ser Arg Ala Gly Ala Val Leu Gln

65 70 75 80

Asn Gly Trp Gly Asp Asn Gly His Ala Phe Gly Leu Met Gln Ile Asp

85 90 95

Ile Arg Trp His Ser Ile Glu Gly Ala Trp Asn Ser Gln Glu Asn Ile

100 105 110

Asn Glu Gly Thr Gly Ile Leu Ile Asn Met Ile Val Ala Ile Ser Asp

115 120 125

Lys Phe Pro Ser Trp Ser Val Asn Asp Asn Leu Lys Gly Gly Ile Ala

130 135 140

Ala Tyr Asn Ala Gly Pro Gly Asn Ile Tyr Ser Tyr Ser Gln Val Asp

145 150 155 160

Gln Tyr Thr Thr Asp Gly Asp Tyr Ser Asn Asp Val Val Ala Arg Ala

165 170 175

Gln Tyr Tyr Lys Thr Gln Gly Tyr

180

<210> 3

<211> 266

<212> PRT

<213> 墨西哥钝口螈

<400> 3

Phe Arg Tyr Ala Ile Leu Ala Arg Glu Glu Glu Pro Arg Val Arg Arg

1 5 10 15

Ala Ala Leu Val Asp Lys Pro Arg Val Glu Ile Ala Asp Val Leu Ile

20 25 30

Ser Thr Phe Thr Glu Ser Gly Val Ile Glu Val Val Leu Gln Ala Leu

35 40 45

Arg Glu Ile Gly Cys Asn Asp Leu Arg Glu Arg Phe Ala Lys Asp Thr

50 55 60

Ser Glu Gly Ser Pro Thr Ser Ala Ser Lys Tyr Gly Asp Ile Met Lys

65 70 75 80

Val Glu Thr Thr Gly Ala Ser Met Gln Thr Ala Gln Gln Asp Tyr Leu

85 90 95

Asp Phe Ser Gly Ala Arg Ala Ser His Ala Met Ala Glu Thr Asp Leu

100 105 110

Ile Glu Met Asn Asn Tyr Lys Ser Val Ile Lys Asn Ala Ala Gly Lys

115 120 125

Lys Gly Val Asp Pro Ala Leu Ile Ala Ala Met Ile Ser Arg Ser Cys

130 135 140

Arg Ala Gly Lys Thr Leu Ser Gly Gly Trp Gly Cys Trp Asp Glu Lys

145 150 155 160

Arg Gln Lys Tyr Asn Thr Tyr Gly Leu Met Gln Ile Asp Val Asn Pro

165 170 175

Lys Gly Gly Gly His Thr Pro Lys Gly Ser Trp Asp Ser Glu Glu His

180 185 190

Leu Cys Gln Ala Ile Asp Ile Leu Ile Arg Phe Ile Thr Arg Ile Arg

195 200 205

Gln Lys Tyr Pro Gln Trp Ser Lys Glu Glu Gln Leu Lys Gly Gly Ile

210 215 220

Ala Ala Tyr Asn Ala Gly Asp Gly Asn Ile Gly Pro Gly Lys Asp Val

225 230 235 240

Asp Ser Lys Thr Thr Asn Gly Asp Tyr Ala Asn Asp Ile Val Ala Arg

245 250 255

Ala Gln Trp Tyr Lys Ser Asn Gly Gly Phe

260 265

<210> 4

<211> 120

<212> PRT

<213> 冰岛海扇蛤

<400> 4

Ala His Asn Phe Ala Thr Gly Ile Val Pro Gln Ser Cys Leu Glu Cys

1 5 10 15

Ile Cys Lys Thr Glu Ser Gly Cys Arg Ala Ile Gly Cys Lys Phe Asp

20 25 30

Val Tyr Ser Asp Ser Cys Gly Tyr Phe Gln Leu Lys Gln Ala Tyr Trp

35 40 45

Glu Asp Cys Gly Arg Pro Gly Gly Ser Leu Thr Ser Cys Ala Asp Asp

50 55 60

Ile His Cys Ser Ser Gln Cys Val Gln His Tyr Met Ser Arg Tyr Ile

65 70 75 80

Gly His Thr Ser Cys Ser Arg Thr Cys Glu Ser Tyr Ala Arg Leu His

85 90 95

Asn Gly Gly Pro His Gly Cys Glu His Gly Ser Thr Leu Gly Tyr Trp

100 105 110

Gly His Val Gln Gly His Gly Cys

115 120

Claims (66)

1.一种包含重组食品防腐酶(rFPE)的消耗性组合物，其中所述FPE是鹅型溶菌酶(gFPE)；其中所述组合物是半固体或凝胶组合物。

2.如权利要求1所述的消耗性组合物，其中所述消耗性组合物不含细菌杂质。

3.如权利要求1所述的消耗性组合物，其中所述gFPE包含与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性的氨基酸序列。

4.如权利要求1所述的消耗性组合物，其中所述gFPE包含与SEQ ID NO:1具有至少97％同一性的氨基酸序列。

5.如权利要求1所述的消耗性组合物，其中所述gFPE包含与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的氨基酸序列。

6.如权利要求1所述的消耗性组合物，其中所述gFPE包含与SEQ ID NO:2具有至少97％同一性的氨基酸序列。

7.如权利要求1所述的消耗性组合物，其中所述gFPE包含与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性的氨基酸序列。

8.如权利要求1所述的消耗性组合物，其中所述gFPE包含与SEQ ID NO:3具有至少97％同一性的氨基酸序列。

9.如权利要求1所述的消耗性组合物，其中所述gFPE包含与SEQ ID NO:4具有至少95％同一性的氨基酸序列。

10.如权利要求1所述的消耗性组合物，其中所述gFPE包含与SEQ ID NO:4具有至少97％同一性的氨基酸序列。

11.如前述权利要求中任一项所述的消耗性组合物，其中所述消耗性组合物是热处理的。

12.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述消耗性组合物具有比不包含所述gFPE的几乎相同的消耗性组合物更长的保质期。

13.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述消耗性组合物具有比包含鸡蛋清胞壁酸酶而非所述gFPE的几乎相同的消耗性组合物的保质期更长的保质期。

14.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述gFPE在毕赤酵母细胞中产生。

15.一种包含重组食品防腐酶(rFPE)的组合物，其中所述rFPE具有大于约90,000Shugar U/mg的活性。

16.如权利要求15所述的组合物，其中所述rFPE具有大于约150,000Shugar U/mg的活性。

17.如权利要求15或权利要求16所述的组合物，其中所述rFPE在巴斯德毕赤酵母细胞中产生。

18.如权利要求15至17中任一项所述的组合物，其中所述组合物是食品组合物。

19.如权利要求18所述的组合物，其中所述食品组合物包含一种或多种消耗性成分。

20.如权利要求18或权利要求19所述的组合物，其中所述食品组合物具有比不包含所述rFPE的几乎相同的食品组合物更长的保质期。

21.如权利要求18-20中任一项所述的组合物，其中所述食品组合物具有比包含鸡蛋清胞壁酸酶而非所述rFPE的几乎相同的产品的保质期更长的保质期。

22.如权利要求15-21中任一项所述的组合物，其中所述组合物是包含rFPE的粉末组合物。

23.如权利要求15-22中任一项所述的组合物，其中所述rFPE包含与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性的氨基酸序列。

24.如权利要求15-22中任一项所述的组合物，其中所述rFPE包含与SEQ ID NO:1具有至少97％同一性的氨基酸序列。

25.如权利要求15-22中任一项所述的组合物，其中所述rFPE包含与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的氨基酸序列。

26.如权利要求15-22中任一项所述的组合物，其中所述rFPE包含与SEQ ID NO:2具有至少97％同一性的氨基酸序列。

27.如权利要求15-22中任一项所述的组合物，其中所述rFPE包含与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性的氨基酸序列。

28.如权利要求15-22中任一项所述的组合物，其中所述rFPE包含与SEQ ID NO:3具有至少97％同一性的氨基酸序列。

29.如权利要求15-22中任一项所述的组合物，其中所述rFPE包含与SEQ ID NO:4具有至少95％同一性的氨基酸序列。

30.如权利要求15-22中任一项所述的组合物，其中所述rFPE包含与SEQ ID NO:4具有至少97％同一性的氨基酸序列。

31.如权利要求15-22中任一项所述的组合物，其中与包含鸡蛋清胞壁酸酶的几乎相同的组合物相比，所述组合物是低变应原性的。

32.如权利要求15-22中任一项所述的组合物，其中与非重组FPE和/或鸡胞壁酸酶相比，所述rFPE具有更高的活性。

33.如权利要求15-22中任一项所述的组合物，其中所述rFPE具有大于约200,000Shugar U/mg的活性。

34.如权利要求15-22中任一项所述的组合物，其中所述rFPE具有大于约300,000Shugar U/mg的活性。

35.如权利要求15-22中任一项所述的组合物，其中所述rFPE具有大于约450,000Shugar U/mg的Shugar单位的活性。

36.如权利要求15-22中任一项所述的组合物，其中一个Shugar单位是在37℃、pH 7.0下消化藤黄微球菌细胞的悬浮液、从而导致溶液的吸光度以每分钟0.001的速率降低的酶的量。

37.一种包含重组食品防腐酶(rFPE)的消耗性组合物，其中所述FPE包含与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性的氨基酸序列。

38.如权利要求37所述的消耗性组合物，其中所述消耗性组合物是食品组合物。

39.如权利要求37或权利要求38所述的消耗性组合物，其中所述食品组合物具有凝胶状质地或一致的质地。

40.如权利要求37或权利要求38所述的消耗性组合物，其中所述食品组合物呈烘焙产品的形式。

41.如权利要求37至40中任一项所述的消耗性组合物，其中所述食品组合物呈蛋清状产品的形式。

42.如权利要求37或权利要求38所述的消耗性组合物，其中所述食品组合物呈液体形式。

43.如权利要求37或权利要求38所述的消耗性组合物，其中所述食品组合物呈固体形式。

44.如权利要求37至43中任一项所述的组合物，其中所述组合物具有比包含鸡蛋清胞壁酸酶而非所述rFPE的几乎相同的组合物的保质期更长或相当的保质期。

45.如权利要求37至44中任一项所述的消耗性组合物，其中所述食品组合物具有按重量计至少0.05％的rFPE。

46.如权利要求37至45中任一项所述的消耗性组合物，其中所述食品组合物具有按重量计至多10％的rFPE。

47.如权利要求37至46中任一项所述的消耗性组合物，其中所述消耗性组合物是一种成分。

48.如权利要求37至47中任一项所述的消耗性组合物，其中所述食品组合物基本上不含微生物或细菌细胞碎片。

49.如权利要求37至48中任一项所述的消耗性组合物，其中所述食品组合物是益生菌配制品。

50.如权利要求37至49中任一项所述的消耗性组合物，其中所述rFPE的纯度是至少80％。

51.如权利要求37至50中任一项所述的消耗性组合物，其中除所述rFPE之外，所述食品组合物还包含多于一种重组蛋白。

52.如权利要求37至51中任一项所述的消耗性组合物，其中所述rFPE为所述食品产品提供凝胶固态性或增加的黏度。

53.如权利要求37至52中任一项所述的消耗性组合物，其中所述食品组合物不包含所述rFPE以外的胶凝剂。

54.如权利要求37至53中任一项所述的消耗性组合物，其中所述rFPE在巴斯德毕赤酵母细胞中重组产生。

55.一种制备消耗性组合物的方法，其包括以下步骤：

a.提供重组产生的分离的食品防腐酶(FPE)，其中所述FPE是鹅型FPE(gFPE)；

b.将所述重组产生的FPE与一种或多种消耗性成分组合。

56.如权利要求55所述的方法，其中所述重组产生的gFPE具有与SEQ ID NO:1-4中的一个具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

57.如权利要求55或权利要求56所述的方法，其中所述重组产生的gFPE在酵母细胞中重组产生。

58.如权利要求57所述的方法，其中所述酵母细胞是巴斯德毕赤酵母。

59.如权利要求55至58中任一项所述的方法，其中相对于缺乏所述重组产生的gFPE或包含鸡蛋清胞壁酸酶而非所述FPE的几乎相同的消耗性组合物，所述重组产生的gFPE增加所述消耗性组合物的保质期。

60.如权利要求55至59中任一项所述的方法，其中所述重组产生的gFPE为所述消耗性组合物提供凝胶状质地或增加所述消耗性组合物的黏度。

61.如权利要求55至60中任一项所述的方法，其中所述消耗性组合物是可供人/动物食用的食品产品。

62.一种产生分离的黄原胶产品的方法，其包括以下步骤：

a.将野油菜黄单胞菌细胞提供到发酵培养基中；

b.在45℃-60℃之间的温度和8-10之间的pH下用碱性蛋白酶对所述细胞进行热处理，从而产生包含细胞碎片的溶液；

c.向包含细胞碎片的溶液添加重组产生的食品防腐酶(FPE)和/或包含与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性的氨基酸序列的重组产生的FPE，从而产生黄原胶溶液；

d.向所述黄原胶溶液添加醇，从而使黄原胶沉淀；以及

e.分离并干燥所述沉淀的黄原胶，从而获得分离的黄原胶产品。

63.如权利要求62所述的方法，其中添加的所述FPE的量小于在其他方面相同的条件下产生等量所述黄原胶产品所需的鸡蛋清FPE的量。

64.如权利要求62或权利要求63所述的方法，其还包括在产生包含细胞碎片的溶液之后调节所述组合物的pH的步骤。

65.一种制备消耗性组合物的方法，其包括将根据如权利要求62至64中任一项所述的方法产生的黄原胶产品与一种或多种额外成分组合以形成所述消耗性组合物。

66.一种食品防腐剂，其包含与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性的重组产生的食品防腐酶(FPE)。

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