DK202300014Y3 - Proteinsammensætninger og konsumerbare produkter deraf - Google Patents

Proteinsammensætninger og konsumerbare produkter deraf Download PDF

Info

Publication number
DK202300014Y3
DK202300014Y3 DKBA202300014U DKBA202300014U DK202300014Y3 DK 202300014 Y3 DK202300014 Y3 DK 202300014Y3 DK BA202300014 U DKBA202300014 U DK BA202300014U DK BA202300014 U DKBA202300014 U DK BA202300014U DK 202300014 Y3 DK202300014 Y3 DK 202300014Y3
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
rovd
composition
protein
beverage
composition according
Prior art date
Application number
DKBA202300014U
Other languages
English (en)
Inventor
Mahadevan Kritika
Andrew Kreps Joel
Joshi Isha
Ayoughi Farnoosh
Zhong Weixi
Kshirsagar Harshal
Chapeaux Alexandre
Rutherford-Jenkins Wesley
Patnaik Ranjan
Douglas Ivey Frank
Original Assignee
Clara Foods Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Clara Foods Co filed Critical Clara Foods Co
Publication of DK202300014U1 publication Critical patent/DK202300014U1/da
Publication of DK202300014U9 publication Critical patent/DK202300014U9/da
Application granted granted Critical
Publication of DK202300014Y3 publication Critical patent/DK202300014Y3/da

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J1/00—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites
    • A23J1/18—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from yeasts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J1/00—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites
    • A23J1/08—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from eggs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C11/00—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions
    • A23C11/02—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions containing at least one non-milk component as source of fats or proteins
    • A23C11/06—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions containing at least one non-milk component as source of fats or proteins containing non-milk proteins
    • A23C11/065—Microbial proteins, inactivated yeast or animal proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J1/00—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites
    • A23J1/008—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
    • A23J3/04—Animal proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
    • A23J3/20—Proteins from microorganisms or unicellular algae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L15/00—Egg products; Preparation or treatment thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L15/00—Egg products; Preparation or treatment thereof
    • A23L15/35—Egg substitutes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L19/00—Products from fruits or vegetables; Preparation or treatment thereof
    • A23L19/03—Products from fruits or vegetables; Preparation or treatment thereof consisting of whole pieces or fragments without mashing the original pieces
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation
    • A23L2/52—Adding ingredients
    • A23L2/66—Proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L21/00—Marmalades, jams, jellies or the like; Products from apiculture; Preparation or treatment thereof
    • A23L21/10—Marmalades; Jams; Jellies; Other similar fruit or vegetable compositions; Simulated fruit products
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L27/00—Spices; Flavouring agents or condiments; Artificial sweetening agents; Table salts; Dietetic salt substitutes; Preparation or treatment thereof
    • A23L27/60—Salad dressings; Mayonnaise; Ketchup
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/195—Proteins from microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/40—Complete food formulations for specific consumer groups or specific purposes, e.g. infant formula
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/77—Ovalbumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C07K14/8135—Kazal type inhibitors, e.g. pancreatic secretory inhibitor, ovomucoid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2462—Lysozyme (3.2.1.17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/03—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with a oxygen as acceptor (1.1.3)
    • C12Y101/03013—Alcohol oxidase (1.1.3.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/0123—Kojibiose phosphorylase (2.4.1.230)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01232—Initiation-specific alpha-1,6-mannosyltransferase (2.4.1.232)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01017—Lysozyme (3.2.1.17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01096—Mannosyl-glycoprotein endo-beta-N-acetylglucosaminidase (3.2.1.96)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation
    • A23L2/52—Adding ingredients
    • A23L2/54—Mixing with gases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L23/00—Soups; Sauces; Preparation or treatment thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pediatric Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Dairy Products (AREA)
  • General Preparation And Processing Of Foods (AREA)

Abstract

Tilvejebragt heri er sammensætninger med forbedret proteinindhold, proteiner med høj opløselighed, proteinkombinationer og fremgangsmåder til fremstilling deraf.

Description

DK 202300014 Y3
KRYDS-REFERENCE TIL RELATEREDE ANSØGNINGER
Nærværende ansøgninger kræver prioritet fra US provisorisk patentansøgning serie nr. 62/873,154, indleveret 11. juli 2019 og US provisorisk patentansøgning serie nr. 62/873,159, indleveret 11. juli 2019. Hele indholdet i ovennævnte patentansøgninger inkorporeres heri ved — henvisning.
SEKVENSLISTER
Nærværende ansøgning indeholder en sekvensliste, som er indleveret i ASCII format via EFS-
Web og som herved indkorporeres ved henvisning i sin helhed. Den nævnte ASCII kopi, dannet den 10. juli 2020, er benævnt 49160-714.601 ST25.txt og har en størrelse på 95.504 bytes.
BAGGRUND
— Proteiner er vigtige diætiske næringsmidler. De kan tjenes som brændstofkilde eller som en kilde for aminosyrer, inkl. de essentielle aminosyrer, som ikke kan syntetiseres af kroppen. Den daglige anbefalede indtagelse af protein for sunde voksne er 10% til 35% af en persons totale kaloriebehov og for nærværende er hovedparten af proteinindtagelse for de fleste mennesker fra animalsk baserede kilder. Yderligere kan atleter og bodybuildere ty til forøget proteinind- tagelse for opbygning af muskelmasse og for forbedring af ydelse. Med verdensbefolkningens vækst og den samtidige vækst i globalt fødevarebehov, er der et behov for at tilvejebringe alternative vedvarende, ikke-animalsk baserede kilder for proteiner som nyttige kilder til protein til daglig diæt, dieetisk supplement og sportsnæring.
RESUMÉ
Et aspekt ved nærværende offentliggørelse er en sammensætning omfattende et rekombinant ovomucoid protein (rOVD). Dette rOVD omfatter i det mindste én glycosyleret asparaginrest og dette rOVD er i det væsentlige uden N-forbundet mannosylation.
I nogle udførelsesformer omfatter hvert glycosyleret asparagin et enkelt N-acetylglucosamin. rOVD'et kan omfatte i det mindste tre glycosylerede asparaginrester. | nogle tilfælde er rOVD'et en sekreteret form af rOVD-proteinet. | forskellige udførelsesformer er sammensætningen et pulver. Sammensætningen kan have et proteinindhold på i det mindste 30% rOVD protein, i det — mindste 40% rOVD protein, i det mindste 50% rOVD protein, i det mindste 60% rOVD protein, i det mindste 70% rOVD protein, i det mindste 80% rOVD protein, i det mindste 85% rOVD protein, i det
, DK 202300014 Y3 mindste 90% rOVD protein eller i det mindste 95% rOVD protein på en vægt/vægtbasis og/eller en vægt pr. total volumen af sammensætningen basis. | nogle tilfælde er pulveret i stand til at blive opløst i en væske.
Et andet aspekt for nærværende offentliggørelse er en sammensætning omfattende et re- kombinant ovomucoid protein (rOVD). Sammensætningen er et pulver formuleret til human eller animalsk konsumering og sammensætningen har et proteinindhold på i det mindste 70% rOVD protein, i det mindste 80% rOVD protein, i det mindste 85% rOVD protein, i det mindste 90% rOVD protein eller i det mindste 95% rOVD protein på en vægt/vægt-basis og/eller en vægt pr. total volumen af sammensætningen basis.
Pulveret kan omfatte mindre end 15%, 12%, 10%, 8%, 6%, 5%, 3%, 2% eller 1% fugtighed på en vægt/vægt-basis og/eller en vægt pr. total volumen af sammensætningen basis. Pulveret kan omfatte mindre end 30%, 27%, 25%, 22%, 20%, 17%, 15%, 12%, 10%, 8%, 5%, 3% eller 1% frit — kulhydratindhold. | nogle udførelsesformer er pulveret i stand til at blive opløst i en væske. udførelsesformer omfatter en sammensætning én eller flere yderligere ingredienser valgt fra gruppen bestående af et smagsstof, et farvestof, et sødestof, en aminosyre, et protein, en syretilsætning, et konserveringsmiddel og aske. | nogle tilfælde omfatter sammensætningen — mindre end 5%, 4,5%, 4%, 3,5%, 3%, 2,5%, 2%, 1,5%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25% eller 0,1% aske.
Aminosyren kan være valgt blandt tryptophan, isoleucin, leucin og valin, eller en kombination deraf.
Et yderligere aspekt ved nærværende offentliggørelse er en sammensætning omfattende et rekombinant ovomucoid protein ((OVD). Sammensætningen foreligger i en fast form formuleret til human eller animalsk konsumering, hvor rOVD’et tilvejebringer proteinfortifikation for sammen- sætningen og i det mindste et yderligere træk valgt fra gruppen bestående af mundføling, tekstur, hårdhed, stabilitet overfor varmebehandling og stabilitet overfor pH.
I forskellige udførelsesformer omfatter rOVD'et i det mindste én asparaginrest forbundet med N- — acetylglucosamin og rOVD' et er i det væsentlige uden N-forbundet mannosylation. Koncentrationen af rOVD kan være større end omkring 5%, omkring 10%, omkring 15%, omkring 20% eller omkring 25% på en vægt/vægt-basis og/eller en vægt pr. total volumen af sammensætningen basis og/eller en vægt pr. total volumen af sammensætningen basis. | nogle tilfælde ændrer rOVD'et ikke i det væsentlige det synlige udseende eller mundfølingen af den faste konsumerbare sammensætning i
2 DK 202300014 Y3 sammenligning med en fast konsumerbar sammensætning som ikke indeholder rOVD; rOVD'et ændrer ikke væsentligt det synlige useende eller mundfølelsen af den faste konsumerbare sammensætning i sammenligning med en fast konsumerbar sammensætning, som indeholder valleprotein, soyaprotein eller ærteprotein med samme koncentration som rOVD' et; rOVD'et — påvirker ikke i væsentlig grad en sensorisk validering for lugt og/eller for smag, i sammenligning med en fast komsumerbar sammensætning, som ikke indeholder rOVD; og/eller rOVD'et påvirker ikke i væsentlig grad en sensorisk evaluering for lugt og/eller for smag i sammenligning med en sammenlignelig sammensætning, som indeholder valleprotein, soyaprotein eller ærteprotein med samme koncentration som rOVD et. | nogle udførelsesformer er den faste konsumerbare sam- — mensætning en snackbar, en proteinbar, en næringsbar, en energibar eller et proteinsupplement.
I nogle tilfælde omfatter den faste konsumerbare sammensætning én eller flere yderligere ingredienser valgt fra gruppen bestående af et smagsstof, et farvestof, et sødestof, en aminosyre, et protein en syretilsætning, et konserveringsmiddel og aske.
Ifølge ét aspekt tilvejebringer nærværende offentliggørelse en sammensætning omfattende et rekombinant ovomucoid protein (rOVD). Sammensætningen er en væske formuleret til human eller animalsk konsumering, hvor rOVD’et tilvejebringer proteinfortifikation for sammensætningen og i det mindste ét yderligere træk valgt fra gruppen bestående af opløselighed, mundfølelse, stabilitet overfor varmebehandling og stabilitet overfor pH.
I nogle tilfælde har sammensætningen et proteinindhold omfattende i det mindste 15% rOVD, i det mindste 20% rOVD protein, i det mindste 30% rOVD protein eller i det mindste 40% rOVD protein på en vægt/vætgt-basis og/eller en vægt pr. total volumen af sammensætningen basis.
Sammensætningen kan have et proteinindhold omfattende i det mindste 5% rOVD og hvori den flydende konsumerbare sammensætning er i det væsentlige optisk klar. | udførelsesformer har sammensætningen en optisk klarhed, som er større end en sammenlignelig sammensætning, som indeholder valleprotein, soyaprotein eller ærtetprotein med samme koncentration som rOVD'et. nogle tilfælde ændrer rOVD'et ikke i det væsentlige det synlige udseende eller mundfølelsen af den flydende konsumerbare sammensætning i sammenligning med en flydende konsumerbar — sammensætning som ikke indeholder rOVD; rOVD'et ændrer ikke i væsentlig grad det synlige udseende eller mundfølelsen af den flydende konsumerbare sammensætning i sammenligning med en sammenlignelig sammensætning, som indeholder valleprotein, soyaprotein eller ærteprotein med samme koncentration som rOVD'et; rOVD’et påvirker ikke i væsentlig grad en sensorisk evaluering for lugt og/eller smag i sammenligning med en flydende konsumerbar
, DK 202300014 Y3 sammensætning, som ikke indeholder rOVD; og/eller rOVD’et påvirker ikke i væsentlig grad en sensorisk evaluering for lugt og/eller smag i sammenligning med en sammenlignelig sammensætning, som indeholder valleprotein, soyaprotein eller ærteprotein med samme koncentration som rOVD’et. rOVD’et kan forblive i det væsentlige opløseligt efter at den flydende — konsumerbare sammensætning er opvarmet til en temperatur på imellem ca. 72°C og ca. 121°C. nogle tilfælde har rOVD’et en større opløselighed, optisk klarhed eller såvel opløselighed som optisk klarhed i væsken efterfølgende en varmebehandling end stabiliteten af valleprotein, soyaprotein eller ærteprotein ved samme koncentration som rOVD'et. | nogle udførelsesformer omfatter varmebehandlingen udsættelse af væsken for en temperatur på imellem ca. 72°C og ca. 121°C. rOVD'et kan have en opløselighed i væsken, som er større end opløseligheden for valleprotein, soyaprotein eller ærteprotein ved samme koncentration som rOVD-' et. | nogle tilfælde har den flydende konsumerbare sammensætning en pH imellem ca. 2,0 og ca. 8,0.
I nogle udførelsesformer kan en fast form formuleret til human eller animalsk konsumering eller en væske formuleret til human eller animalsk konsumering omfatte én eller flere yderligere ingredienser valgt fra gruppen bestående af et smagsstof, et farvestof, et sødestof, en aminosyre, et protein, en syretilsætning og et konserveringsmiddel. | forskellige udførelsesformer er aminosyren valgt blandt tryptophan, isoleucin, leucin og valin eller en kombination deraf. I nogle tilfælde er proteinet et lysozymprotein, eksempelvis et æggehvide lysozym (OVL). Forholdet > imellem rOVD og OVL kan være imellem omkring 60% rOVD:40% OVL og omkring 82% rOVD:18% OVL. Lysozymet kan være et rekombinant lysozymprotein. | nogle tilfælde tilvejebringer proteinet og/eller aminosyren en forbedret aminosyrebalance for den faste form eller væsken. udførelsesformer er en proteinfordøjelighedskorrigeret-aminosyrescore (PDCAAS) lig med eller større end omkring 0,75, eksempelvis større end eller lig med omkring 0,8, 0,85, 0,90, 0,95 eller — PDCAAS er omkring eller er lig med 1,0. Den flydende konsumerbare sammensætning kan omfatte rOVD og OVL og proteinerne er opløselige og sammensætningen er optisk klar.
I nogle tilfælde er den flydende konsumerbare sammensætning en drikkevare valgt fra gruppen bestående af en juice, en bouillon, en suppe, en sodavand, en softdrink, en smagstilsat vand, en — proteinvand, en fortificeret vand, en carboniseret vand, en næringsdrik, en energidrik, en sportsdrik, en restitueringsdrik, en opvarmet drik, en kaffe-baseret drik, en te-baseret drik, en plante-baseret mælk, en mælke-baseret drik, en ikke-mælke-baseret drik, en plante-baseret mild drik, barneformuleret drik, en måltidserstatningsdrik. I nogle udførelsesformer omfatter drikkevaren carbonering.
; DK 202300014 Y3
En flydende konsumerbar sammensætning kan være en sirup omfattende imellem 20% rOVD protein og i det mindste 60% rOVD protein på en vægt/vægt-basis og/eller en vægt pr. total volumen af sammensætningen basis.
I nogle tilfælde er den flydende konsumerbare sammensætning en emulsion, eksempelvis en sauce, en skysovs eller en salatdressing.
I et andet aspekt tilvejebringer nærværende offentliggørelse en sammensætning omfattende et — rekombinant ovomucoidprotein (rOVD). Sammensætningen foreligger i en halvfast form formuleret til human eller animalsk konsumering, hvori rOVD et tilvjebringer i det mindste ét yderligere træk valgt fra gruppen bestående af mundfølelse, tekstur, hårdhed, stabilitet overfor varmebehandling og stabilitet overfor pH. | forskellige udførelsesformer er den halvfaste konsumerbare sammensætning en gummi, bolsje, gelé, sirup, gel, et geleret præparat. | nogle tilfælde ændrer rOVD'et ikke i væsentlig grad det synlige udseende eller mundfølelsen af den halvfaste konsumerbare sammensætning i sammen- ligning med en halvfast konsumerbar sammensætning, som ikke indeholder rOVD; rOVD'et ændrer ikke i væsentlig grad det synlige udseende eller mundfølelsen af den halvfaste kon- sumerbare sammensætning i sammenligning med en halvfast konsumerbar sammensætning, som indeholder valleprotein, soyaprotein eller ærteprotein med samme koncentration som rOVD'et; rOVD'et påvirker ikke i væsentlig grad en sensorisk evaluering for lugt og/eller smag i sam- menligning med en halvfast konsumerbar sammensætning, som ikke indeholder rOVD; og/eller rOVD'et påvirker ikke i væsentlig grad en sensorisk evaluering for lugt og/eller smag i sammenligning med en sammenlignelig sammensætning, som indeholder valleprotein, soya- protein eller ærteprotein, med samme koncentration som rOVD’et. Den halvfaste konsumerbare sammensætning kan have en optisk klarhed, som er større end en sammenlignelig sammen- sætning, som indeholder valleprotein, soyaprotein eller ærteprotein med samme koncentration som rOVD’et.
Den halvfaste konsumerbare sammensætning kan omfatte én eller flere yderligere ingredienser valgt fra gruppen bestående af et smagsstof, et farvestof, et sødestof, en aminosyre, et protein, en syretilsætning og et konserveringsmiddel. Proteinet og/eller aminosyren kan tilvejebringe en forbedret aminosyrebalance for den halvfaste konsumerbare sammensætning. | nogle tilfælde er
DK 202300014 Y3 aminosyren valgt blandt tryptophan, isoleucin, leucin og valin eller en kombination deraf. I nogle udførelsesformer tilvejebringer proteinet og/eller aminosyren en forbedret aminosyrebalance for den halvfaste konsumerbare sammensætning. Proteinet og/eller aminosyren kan tilvejebringe en forbedret aminosyrebalance for den halvfaste konsumerbare sammensætning. | nogle tilfælde er 5 —&oaminosyren valgt blandt tryptophan, isoleucin, leucin og valin eller en kombination deraf. udførelsesformer er proteinet et lysozymprotein, eksempelvis er lysozymproteinet et æggehvidelysozym (OVL). Forholdet imellem rOVD og OVL kan være imellem omkring 60% rOVD:40% OVL og omkring 82% rOVD:18% OVL. Lysozymet kan være et rekombinant lysozymprotein. | forskellige udførelsesformer er en proteinfordøjelighedskorrigeret aminosyre- score (PDCAAS) lig med eller større end omkring 0,75, 0,8, 0,85, 0,90, 0,95 eller PDCAAS er omkring eller lig med 1,0.
I nogle tilfælde omfatter rOVD’et et rOVD, som er blevet eksponeret for et oxideringsmiddel eller et oxygen-genererende middel. | forskellige udførelsesformer er det oxygen-genererende middel — hydrogenperoxid, natriumpercarbonat, boblet oxygen, aktiveret chlordioxid eller ozon. nogle tilfælde omfatter rOVD’et en aminosyresekvens, som er naturligt fundet i en fugleart, eksempelvis kylling, vagtel, kalkun, kalkungrib, kolibri, and, struds, gås, måge, perlehøns, fasan eller emu og enhver kombination deraf. rOVD'et kan omfatte en aminosyresekvens ifølge én af SEQ ID No. 1-44 eller en amino- syresekvens, som har i det mindste 85% sekvensidentitet med én af SEQ ID No. 1-44. udførelsesformer er rOVD' et i det væsentlige en fuld-længde rOVD aminosyre-sekvens.
I nogle tilfælde tilvejebringer rOVD’et protein-fortifikation for sammensætningen. nogle udførelsesformer er rOVD'et produceret af en mikrobiel værtscelle, eksempelvis, i nogle tilfælde er værtscellen en gær, en filamentøs svamp eller en bakterie. Den mikrobielle værtscelle kan være en Pichia-art, en Saccharomyces-art, en Trichoderma-art, en Pseudomonas-art eller en
E. coli art. Den mikrobielle værtscelle kan være Pichia pastoris eller Komagataella phaffii.
Et andet aspekt er en konsumerbar sammensætning omfattende et rekombinant ovomucoid- protein (rOVD). rOVD-' et tilvejebringer proteinfortifikation for sammen-sætningen; hvori rOVD’et
, DK 202300014 Y3 tilvejebringer en opløselighed, som er sammenlignelig med eller højere end et naturligt ovomucoid- protein.
Et aspekt for nærværende offentliggørelse er en konsumerbar pulverprotein-sammensætning, som — omfatter et rekombinant ovomucoidprotein (rOVD). Protein-indholdet i sammensætningen er større end 70%; hvori sammensætningen omfatter mindre end 2% aske, mindre end 20% carbonhydrater og mindre end 1% fedt ved syrehydrolyse på en vægt/vægt-basis og/eller en vægt pr. total volumen af sammensætningen basis.
Et andet aspekt for nærværende offentliggørelse er en konsumerbar sammensætning omfattende et rekombinant ovomucoidprotein (rOVD). Sammensætningen har et proteinindhold omfattende i det mindste 15% rOVD protein på en vægt/vægt-basis og/eller en vægt pr. total volumen af sammensætningen basis.
Ved et aspekt tilvejebringer nærværende offentliggørelse en konsumerbar sammensætning omfattende et rekombinant ovomucoidprotein (rOVD). rOVD’et tilvejebringer proteinfortifikation for sammensætningen; hvori rOVD’et tilvejebringer en vandtilbageholdelseskapacitet, som er højere end for et naturligt ovomucoidprotein. — Endnu et yderligere aspekt for nærværende offentliggørelse er en drikkevaresammensætning omfattende et rekombinant ovomucoidprotein (rOVD) og i det mindste én konsumerbar væske, hvori rOVD’et er i det væsentlige opløseligt i sammensætningen, hvori drikkevaresammensæt- ningen er i det væsentlige optisk klar og hvori koncentrationen af rOVD er større end omkring 5% på en vægt/vægt-basis og/eller en vægt pr. total volumen af sammensætningen basis. Drikkevaren er valgt fra gruppen bestående af en juice, en bouillon, en suppe, en sodavand, en softdrik, en smagstilsat vand, en proteinvand, en fortificeret vand, en carboneret vand, en næringsdrik, en energidrik, en sportsdrik, en restitueringsdrik, en opvarmet drik, en kaffe-baseret drik, en te-baseret drik, en plante-baseret mælk, en mælke-baseret drik, en ikke-mælke-baseret drik, plante-baseret mild drik, børneformuleret drik, en måltidserstatningsdrik. Drikkevaren kan omfatte carbonering. et aspekt tilvejebringer nærværende offentliggørelse en fremgangsmåde til fremstilling af et konsumerbart fødevarepræparat. Fremgangsmåden omfatter trinnene med tilvejebringelse af et rekombinant OVD (rOVD) fremstillet af en mikrobiel vært; hvori rOVD’et omfatter N-forbundet glycosylering og hvori rOVD er i det væsentlige uden N-forbundet mannosylation; fremstilling af et
2 DK 202300014 Y3 præparat ved kombination eller blanding af rOVD’et med i det mindste én konsumerbar ingrediens; hvori FOVD' et tilvejebringer proteinfortifikation for sammensætningen og i det mindste ét yderligere træk valgt fra gruppen bestående af opløselighed, optisk klarhed, mundfølelse, tekstur, hårdhed, stabilitet overfor varmebehandling og stabilitet overfor pH.
I forskellige udførelsesformer omfatter rOVD'et én eller flere glycosylerede asparaginrester, hvori hver glycosyleret asparaginrest omfatter en enkelt N-acetylglucosamin. I nogle tilfælde foreligger rOVD' et i det konsumerbare fødevarepræparat med eller omkring 1%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 18%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40% på en vægt/vægt-basis og/eller en vægt pr. total volumen af præparatet basis.
Fremgangsmåden kan yderligere omfatte varmebehandling af præparatet, eksempelvis udsæt- telse af præparatet for en temperatur imellem omkring 72°C og omkring 121°C. Varmebehand- — lingen kan omfatte varmefyldning (hot fill), pasteurisering, retort, kogning, bagning, stegning eller grillning. I udførelsesformer har præparatet en pH imellem omkring 2 og omkring 6. nogle tilfælde omfatter fremgangsmåden yderligere udtryk af rOVD protein i den mikrobielle vært, eksempelvis en gær, en flamentøs svamp eller en bakterie. | nogle udførelsesformer er den mikrobielle vært en pichia art, en saccharomyces art, en Trichoderma art, en pseudomonas art eller en E. coli art. I nogle tilfælde er den mikrobielle vært Pichia pastoris eller Komagataella phaffii. nogle udførelsesformer omfatter fremgangsmåden yderligere udtrykt af et enzym i den — mikrobielle vært, som har en aktivitet for fjernelse af en glycan ved kløvning i en chitobiose kerne af høj mannose og hybrid-oligosaccharider på et N-forbundet glycoprotein. | forskellige udførel- sesformer omfatter enzymet EndoH, en OCH1-EndoH fusion eller et aktivt fragment af EndoH. nogle tilfælde sekreteres rOVD’et fra den mikrobielle vært og hvor fremgangsmåden yderligere omfatter isolering af det sekreterede rOVD før kombinering eller blanding af rOVD’et med i det — mindste én konsumerbar ingrediens.
Fremgangsmåden kan yderligere omfatte separering af det sekreterede rOVD fra den mikrobielle vært og eksponering af rOVD' et for et oxideringsmiddel eller et oxygen-genererende middel, eksempelvis hydrogenperoxid, natriumpercarbonat, aktiveret chlordioxid, boblet oxygen eller ozon.
o DK 202300014 Y3 nogle tilfælde omfatter fremgangsmåden yderligere tørring, pulverisering og/eller sprøjte-tørring af rOVD’et. | forskellige udførelsesformer er præparatet egnet til human konsumering og/eller til animalsk konsumering.
Et aspekt for nærværende offentliggørelse er en konsumerbar sammensætning fremstillet ved en fremgangsmåde som angivet heri.
Et andet aspekt for nærværende offentliggørelse er et rekombinant ovomucoid (rOVD) protein omfattende N-forbundet glysocylation, hvori den N-forbundne glycosylation omfatter N-acetyl- glucosamin og i det væsentlige er uden mannoserester. | nogle tilfælde omfatter rOVD'et yderligere O-forbundet glycosylation. | det mindste én asparaginrest af OVD'et er glycosyleret og har en enkelt N-acetylglucosaminrest. | udførel- sesformer har i det mindste tre asparaginrester af rOVD en enkelt N-acetylglucosaminrest. rOVD proteinet kan omfatte et rOVD, som er blevet eksponeret for et oxideringsmiddel eller et oxygen- genererende middel, eksempelvis hydrogenperoxid, natriumpercarbonat, boblet oxygen, aktiveret — chlordioxid eller ozon.
Endnu et yderligere aspekt er en sammensætning omfattende rOVD proteinet ifølge ethver heri offentliggjort aspekt eller udførelsesform. | nogle udførelsesformer foreligger sammensætningen i pulveriseret form og hvor proteinindholdet sammensætningen er omkring 70% eller større på en vægt/vægt-basis og/eller en vægt pr. total volumen af sammensætningen basis. | nogle tilfælde foreligger rOVD proteinet i sammensætningen med 80% eller mere på en vægt/vægt-basis og/eller en vægt pr. total volumen af sammensætningen basis. et aspekt tilvejebringer nærværende offentliggørelse en fremgangsmåde til fremstilling af et rOVD protein. Fremgangsmåden omfatter: fremstilling af rOVD protein i en eukaryotisk værtscelle, hvori rOVD proteinet sekreteres fra værtscellen og hvori værtscellen udtrykker et enzym, som har en aktivitet, som fjerner mannoserester fra N-acetylglucosaminforbindelser; separering af rOVD
0 DK 202300014 Y3 proteinet fra værtscellen; eksponering af rOVD proteinet for et oxideringsmiddel eller et oxygen- genererende middel; og separering af rOVD fra oxideringsmidlet eller det oxygen-genererende middel. | nogle udførelsesformer omfatter enzymet EndoH, en OCH1-EndoH fusion eller et aktivt fragment af EndoH. | nogle tilfælde omfatter oxideringsmidlet eller det oxygen-genererende middel hydrogenperoxid, natriumpercarbonat, boblet oxygen, aktiveret chlordioxid eller ozon. | nogle udførelsesformer er værtscellen en gær- eller svampecelle.
I nogle tilfælde er værtscellen en Pichia sp.
Ved enhver af de heri offentliggjorte fremgangsmåder eller sammensætninger kan rOVD’et være afledt fra en fugleart. | enhver af de heri offentliggjorte fremgangsmåder eller sammensætninger kan rOVD'et omfatte en aminosyresekvens af et kyllinge OVD, et gåse OVD protein, et kolibri OVD eller et kalkungrib
OVD. enhver af de heri offentliggjorte fremgangsmåder eller sammensætninger kan rOVD'et omfatte en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående af SEQ ID No. 1-44 og en aminosyresekvens med i det mindste 85% sekvensidentitet med SEQ ID No. 1-44.
Yderligere aspekter og fordele ved nærværende offentliggørelse vil fremgå umiddelbart for en fagmand indenfor dette område ud fra den efterfølgende detaljerede beskrivelse, hvor kun — illustrative udførelsesformer for nærværende offentliggørelse er vist og beskrevet. Som det vil forstås er nærværende offentliggørelse i stand til andre og afvigende udførelsesformer og dennes adskillige detaljer er i stand til modifikationer i forskellige nærliggende henseender, alle uden at afvige fra offentliggørelsen. Tegningerne og beskrivelsen skal anses for at være af illustrativ natur og ikke som begrænsende. Enhver beskrivelse heri vedrørende en specifik sammensætning og/eller fremgangsmåde gælder for og kan anvendes til enhver anden specifik sammensætning og/eller fremgangsmåde som offentliggjort heri. Yderligere er enhver sammensætning offentliggjort heri anvendelig for enhver heri offentliggjort fremgangsmåde. Med andre ord ethvert aspekt eller enhver udførelsesform beskrevet heri kan kombineres med et vilkårligt andet aspekt eller enhver anden udførelsesform som offentliggjort heri.
DK 202300014 Y3
INKORPORERING VED HENVISNING
Alle publikationer, patenter og patentansøgninger nævnt i denne specifikation er inkorporeret heri ved henvisning i samme grad som hvis hver individuel publikation, patent eller patentansøgning var specifikt og individuelt indikeret til at være inkorporeret ved henvisning. | det omfang publikationer og patenter eller patentansøgninger inkorporeret ved henvisning modsiger offentliggørelsen indeholdt i specifikationen tilsigtes specifikationen at erstatte og/eller arrangere over ethvert sådant modsigende materiale.
KORT BESKRIVELSE AF TEGNINGERNE
De nye træk ved frembringelsen er angivet med særpræg i de vedhæftede krav. En bedre forståelse af trækkene og fordelene ved nærværende frembringelse vil opnås ved henvisning til den efterfølgende detaljerede beskrivelse, som angiver illustrative udførelsesformer, hvori prin- — cipperne for frembringelsen udnyttes, og de vedhæftede tegninger (altså ”figur” og “FIG.” heri), hvor:
FIG. 1A illustrerer vektorkonstrukterne, som anvendes til ekspressionen af rOVD.
FIG. 1B illustrerer en sammenligning i glycosyleringsmønsteret for naturligt ovomucoid og et — rekombinant ovomucoid produceret i P. pastoris og i overensstemmelse med nærværende offentliggørelse. Vist er en mangel af den kompleks forgrenede glycosylering (inkl. en mangel på mannoserester) på det rekombinante ovomucoid, når dette produceres i en stamme af P. pastoris omfattende endoglycosidaser.
FIG. 1C illustrerer glycosyleringsmønstrene for det rekombinante OVD produceret af P. pastoris uden en endoglycosidasebehandling. rOVD produceret således har kompleks forgrenede glycosyleringsmønstre.
FIG. 1D sammenligner molekylvægten for naturligt OVD, naturligt OVD behandlet med endo- glycosidase og rekombinanate OVD prøver.
FIG. 2 illustrerer rOVD opløsningsegenskaber med 4,23% w/v rOVD.
FIG. 3 illustrerer rOVD opløsningsklarhed ved omkring pH 4 og omkring pH 6 med 30% w/v rOVD efter forskellige varmebehandlinger, målt under anvendelse af absorbans ved 600 nm.
FIG. 4 illustrerer rOVD opløsningsklarhed efter forskellige varmebehandlinger med 30%w/v rOVD i deioniseret vand.
FIG. 5A illustrerer rOVD opløsning (9% w/v) udseende ved pH 2,5, 4 og 6 efter forskellige — varmebehandlingsbetingelser.
2 DK 202300014 Y3
FIG. 5B er grafer, som viser absorbans af rOVD opløsning (9% w/v) ved 600 nm efter forskellige varmebehandlingsbetingelser ved pH 2,5, 4 og 6. | hvert datapar relaterer data i venstre søjler til rOVD og data i højre søjler relaterer til buffer.
FIG. 6A illustrerer rOVD opløselighed i forskellige drikkevarer.
FIG. 6B er en graf, som viser absorbans af rOVD opløsning ved 600 nm i forskellige drikkevarer. hvert datapar relaterer data i venstre søjler til drikkevarer og data i højre søjler relaterer til drikkevarer med rOVD.
FIG. 7 illustrerer, fra venstre til højre, en sammenligning af prøver ved rumtemperatur: OVL+OVD med OVD kontrol ved pH 2,5, 4, 6.
FIG. 8 illustrerer, fra venstre til højre, en sammenligning af pasteuriserede (72°C) prøver:
OVL+OVD med OVD kontrol ved pH 2,5, 4, 6.
FIG. 9 illustrerer, fra venstre til højre, en sammenligning af varmefyldning (Hot Fill) (85°C) prøver af OVL+OVD med OVD kontrol ved pH 2,5, 4, 6.
FIG. 10 illustrerer, fra venstre til højre, en sammenligning af retortede (121°C) prøver af OVL+OVD med OVD kontrol ved pH 2,5, 4, 6.
FIG. 11 illustrerer, fra venstre til højre, en sammenligning af pasteuriserede (72°C) prøver af OVL kontrol med OVD kontrol ved pH 2,5, 4, 6.
FIG. 12 illustrerer, fra venstre til højre, en sammenligning af varmefyldning (Hot Fill) (85°C) prøver af OVL kontrol med OVD kontrol ved pH 2,5, 4, 6.
FIG. 13 illustrerer, fra venstre til højre, en sammenligning af retortede (121°C) prøver af OVL kontrol med OVD kontrol ved pH 2,5, 4, 6.
FIG. 14 illustrerer, fra venstre til højre, en sammenligning af rOVL+rOVD og rOVD prøver ved rumtemperatur og efter forskellige varmebehandlinger ved pH 2,5, 4, 6.
FIG. 15A og FIG. 15B illustrerer sammenligninger af klarhed for valleisolat (WPI1 og WPI3, 9% — w/v) og rOVD opløsninger (9% w/v) ved pH 2,5, 4 og 6.
FIG. 16 illustrerer proteinvandprøver med 5% protein, fra venstre til højre, med valleproteinisolat (neutral), valleproteinisolat (sur), NOVD, rOVD, 4%, ærteprotein (sur) og soyaprotein.
FIG. 17A og FIG. 17B illustrerer prøver af orangejuice, fra venstre til højre, med 15% valleprotein, 15% nOVD, 15% rOVD, 20% rOVD, 30% rOVD eller (intet protein) kontrol hhv. FIG. 17A: opløsning ved tidspunktet O timer og FIG. 17B: efter 48 timers opbevaring ved 4 C.
FIG. 18A illustrerer geléprøver, fra venstre til højre, kontrol (uden proteinsupplement), suppleret med 20% rOVD, suppleret med 20% nOVD og suppleret med 20% valleprotein.
FIG. 18B illustrerer sammenligning af geléprøver med intet protein (kontrol), suppleret med 20% rOVD og suppleret med 20% valleprotein.
FIG. 18C til FIG. 18E illustrerer geléprøver suppleret med 20% valleprotein, suppleret med 16% gelatine og suppleret med 20% gelatine.
1 DK 202300014 Y3
FIG. 19A og FIG. 19B illustrerer rOVD-H og rOVD-T prøver opløst i vand ved forskellige koncentrationer.
FIG. 20 illustrerer sammenligningen i immunoreaktivitet for rOVD prøver, naturligt ovomucoid fra kyllingeæggehvide (NOVD) og deglycosyleret naturligt ovomucoid (NOVD + PNGaseF).
FIG. 21 indikerer farven af en rOVD opløsning uden (til venstre) og med (til højre) hydrogen- peroxidbehandling.
FIG. 22 illustrerer en sammenligning af filmdannelse under anvendelse af forskellige proteinprøver.
DETALJERET BESKRIVELSE
— Medens forskellige udførelsesformer for frembringelsen er vist og beskrevet heri, vil det være nærliggende for en fagmand indenfor området at sådanne udførelsesformer alene er tilvejebragt som eksempler. Adskillige variationer, ændringer og erstatninger kan forekomme for en fagmand indenfor området uden at afvige fra frembringelsen. Det bør forstås at forskellige alternativer for udførelsesformerne for frembringelsen som beskrevet heri kan anvendes.
Tilvejebragt heri er sammensætninger og fremgangsmåder til fremstilling af sammensætninger til ikke-animalsk baserede kilder for proteiner som nyttig kilde til konsumerbart protein til indtagelse af dyr, inkl. mennesker, såsom til daglig diæt, diætisk supplement, forbrugerfødevare og drikkevare og næringsmiddel.
Tilvejebragt heri er konsumerbare sammensætninger omfattende ovomucoid (OVD). Sådanne komsumerbare sammensætninger kan anvendes i et fødevareprodukt, drikkevareprodukt, nutra- ceutica, pharmaceutica, kosmetica eller som en ingrediens til et slutprodukt. | udførelsesformer heri foreligger den konsumerbare sammensætning i en væskeform eller en halvfast form. | ud- — førelsesformer heri er den konsumerbare sammensætning tilvejebragt i en pulverform; dette pulver kan anvendes til fremstilling af en flydende, fast eller halvfast konsumerbar sammensætning.
Fortrinsvis er OVD'et i sådanne konsumerbare sammensætninger fremstillet rekombinant, og kan betegnes til heri som et rekombinant OVD (rOVD). > Medmindre det på anden måde er indikeret, inkluderer udtrykket OVD såvel naturligt OVD (nOVD) og rOVD. nOVD eller rOVD i den konsumerbare sammensætning heri er tilvejebragt i koncentrationer, som både forøger proteinindholdet i den konsumerbare sammensætning og også opretholder ét eller flere yderligere karakteristika, såsom høj klarhed, høj opløselighed, reduceret turbiditet eller i det væsentlige sensorisk neutralitet.
1 DK 202300014 Y3
Anvendelsen af rOVD i enhver af de konsumerbare sammensætninger heri muliggør en ikke- animalsk baseret kilde for protein under tilvejebringelse af yderligere træk, såsom opløselighed, klarhed, hårdhed, tekstur, mundfølelse, kompatibilitet med varmebehandling, kompatibilitet med pH-områder og opretholdelse af en forbruger-favorabel sensorisk profil. Forskellige udførelses- former for sådanne sammensætninger, fremgangsmåder til fremstilling af disse og fremgangs- måder til anvendelse af disse er tilvejebragt heri. nogle udførelsesformer øger fremgangsmåderne til fremstilling af sammensætningen heri pro- teinindholdet for et konsumerbart produkt, og tilvejebringer også yderligere træk, såsom kom- — patibilitet med andre ingredienser (såsom eksempelvis kompatibilitet med gluten, vitaminer, mineraler og carbonering), farvning, lugt, smag og kompatibilitet med fødevarer og drikkevare- præparation og/eller opbevaringsbetingelser.
Naturligt ovomucoid (nOVD), såsom isoleret fra kyllinge eller andre fugleæg, har en meget — komplekst forgrenet form af glycosylation. Glycosylationsmønsteret omfatter N-forbundne glycan- strukturer, som N-acetylglucosaminenheder og N-forbundne mannoseenheder. Se eksempelvis
FIG. 1B (venstre søjle). I nogle tilfælde har rOVD’et til anvendelse i en heri offentliggjort konsu- merbar sammensætning og fremstillet under anvendelse af fremgangsmaderne beskrevet heri, et glycosylationsmønster, som er forskelligt fra glycosylationsmønsteret for nOVD. Eksempelvis, når rOVD fremstilles i en Pichia sp., kan proteinet være kraftigt glycosyleret. FIG. 1C illustrerer glyco- sylationsmønstrene for rOVD fremstillet af P. pastoris, som viser et kompleks forgrenet glycosylationsmønster. | nogle udførelsesformer for sammensætningerne og fremgangsmaderne heri behandles rOVD således, at glycosylationsmønsteret modificeres fra det for nOVD og også modificeres i sammenligning med rOVD fremstillet af en Pichia sp., uden en sådan behandling. — nogle tilfælde har rOVD ingen glycosylation. | andre tilfælde har rOVD reduceret glycosylation. nogle tilfælde er rOVD modificeret med N-acetylglucosamin ved én eller flere asparaginrester af proteinet og mangler eller er i det væsentlige uden N-forbundet mannosylation. Se eksempelvis
FIG. 1B (højre søjle). Ændringerne i glycosylation beskrevet heri kan føre til en forøgelse af opløseligheden og klarheden af rOVD i sammenligning med andre former for protein, såsom m— valleprotein, soyaprotein, ærteprotein og en nOVD. Modifikationerne i glycosylation af rOVD kan føre til en ændring i nitrogen til carbonforholdet for proteinet således, at ved reduktion eller fjernelse af i det væsentlige alle mannoseresterne, vil nitrogen til carbonforholdet forøges (såsom sammenlignet med nOVD eller rOVD fremstillet uden modifikationen af glycosylationsmønsteret).
DK 202300014 Y3
I nogle udførelsesformer er sammensætningen et konsumerbart fødevareprodukt. I nogle ud- førelsesformer er det konsumerbare fødevareprodukt et færdigt produkt. I nogle udførelsesformer er sammensætningen en ingrediens i et færdigt produkt, eksempelvis et pulver omfattende rOVD eller bestående essentielt af rOVD. 5
Som anvendt heri betegner udtrykket "konsumerbar fødevaresammensætning” en sammen- sætning, som omfatter et isoleret protein og kan konsumeres af et dyr, inkl., men ikke begrænset til mennesker og andre pattedyr. Konsumerbare fødevaresammensætninger omfatter føde- vareprodukter, drikkevareprodukter, diætiske supplementer, fødevareadditiver og nutraceutica, som ikke begrænsende eksempler.
Konsumerbare fødevaresammensætninger omfatter også sammensætninger som en ingrediens af en fødevare eller drikkevare eller et produkt indtaget som en del af en animalsk diæt. — Eftersom rOVD'et ifølge nærværende offentliggørelse ikke opnås fra en animalsk kilde, betragtes en konsumerbar sammensætning omfattende rOVD’et som vegetariansk og/eller vegansk.
Som anvendt heri betegner et "færdigt produkt” en konsumerbar fødevaresammensætning rettet mod eller egnet i sig selv som en fødevare eller drikkevare til animalsk konsumering. Som anvendt > heri betegner ingrediens” eller "komponent? ved reference til en konsumerbar føde- varesammensætning, en sammensætning, som anvendes med én eller flere andre ingredienser eller komponenter for fremstilling af et færdigt produkt.
Sammensætninger med rOVD — Tilvejebragt heri er konsumerbare fødevaresammensætninger og fremgangsmåder til fremstilling af sådanne sammensætninger, som forøger proteinindholdet i en konsumerbar fødevaresammen- sætning ved tilføjelsen af et rekombinant ovomucoid protein (rOVD). | nogle udførelsesformer tilføres rOVD til en konsumerbar fødevaresammensætning for at forøge proteinindholdet, såsom til tilføjet næring. | nogle udførelsesformer foreligger rOVD i den konsumerbare føde- varesammensætning med omring 1% og omkring 40% på en vægt pr. totalvægt (w/w) og/eller vægt pr. total volumen (w/v) af sammensætningen basis. Eksempelvis i en sammensætning på 100 ml, foreligger rOVD med 30 g og rOVD er således på en 30% koncentration. | nogle udførel- sesformer er koncentrationen af rOVD eller er omkring 1%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 18%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39% eller 40% på en w/w og/eller w/v af
6 DK 202300014 Y3 sammensætningen basis. | nogle udførelsesformer foreligger rOVD et ved en koncentration på eller omkring 1-5%, 5-10%, 10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-30% eller rOVD foreligger med en koncentration større end 5%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39% eller 40% w/w og/eller w/v.
Et konsumerbart produkt kan omfatte ét eller flere andre proteiner, såsom et ikke-OVD protein eller et ikke-rekombinant protein. rOVD’ et kan forøge mængden af proteinindhold i et konsumerbart produkt og/eller det kan også forøge opløseligheden for ét eller flere andre proteiner. Eksempelvis kan den konsumerbare sammensætning omfatte et valleprotein, et ærteprotein, et soyaprotein, et mandelprotein, et havreprotein, et hørfrøprotein, et vegetabilsk protein eller et æggehvideprotein. nogle tilfælde kan det ene eller flere andre proteiner omfatte OVD med en aminosyresekvens, som naturligt findes i en fugl eller et krybdyr. | nogle udførelsesformer øger sammensætningerne og fremgangsmåderne til fremstillingen af sammensætningerne proteinindholdet og tilvejebringer opløselighed for proteinet i sammen- sætningen såvel som opretholder eller i det væsentlige ikke reducerer klarheden for sammen- sætningen. | nogle udførelsesformer øger sammensætningerne og fremgangsmåderne til frem- stilling af sammensætningerne proteinindholdet og tilvejebringer opløselighed og opretholder — klarhed, medens de ikke i negativ grad påvirker stabiliteten eller én eller flere sensoriske kvaliteter for sammensætningen. nogle udførelsesformer øger de konsumerbare fødevaresammensætninger og fremgangsmåder til fremstilling af konsumerbare fødesammensætninger omfattende rOVD og rOVD'et, protein- — indholdeti den konsumerbare fødevaresammensætning og rOVD' et er i det væsentlige opløseligt i den konsumerbare fødevaresammensætning. Den konsumerbare fødevare-sammensætning kan være et færdigt produkt eller en ingrediens til fremstilling af et færdigt produkt, eksempelvis en pulverformet rOVD sammensætning. rOVD protein kan anvendes alene eller i kombination med andre komponenter for dannelse af en — sammensætning. | nogle udførelsesformer kan en sammensætning indeholde omkring eller i det mindste omkring 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% eller 99% protein, eksempelvis, rOVD, baseret på vægt pr. totalvægt (w/w) og/eller baseret på vægt pr. total volumen (w/v). | nogle tilfælde kan en sammensætning beskrevet heri
” DK 202300014 Y3 indeholde op til omkring 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% eller 99% protein, eksempelvis, rOVD baseret på w/w eller w/v.
I nogle udførelsesformer indeholder en sammensætning beskrevet heri total protein med en — koncentration på omkring eller i det mindste 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 13.2, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 eller 75 g total protein pr. 100 ml væske (eksempelvis vand). I nogle tilfælde indeholder en sammensætning beskrevet heri total protein med en koncentration på omkring eller i det mindste 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 13,2, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 eller 100 g total protein pr. 100 g sammensætning (eksempelvis pulver).
I nogle udførelsesformer indeholder en sammensætning beskrevet heri total protein med en koncentration på omkring eller i det mindste 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,7, 1,0, 1,2, 1,5, 1,7, 2,0, 2,2, 2,5, 2,7,3,0, 3,2, 3,5, 3,7, 4,0, 4,2, 4,5, 4,7 eller 5 g total protein pr. 100 ml væske (eksempelvis vand).
I nogle tilfælde indeholder en sammensætning beskrevet heri total protein med en koncentration på omkring eller i det mindste 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,7, 1,0, 1,2, 1,5, 1,7, 2,0, 2,2, 2,5, 2,7, 3,0, 3,2, 3,5, 3,7, 4,0, 4,2, 4,5, 4,7 eller 5 g total protein pr. 100 g sammensætning (eksempelvis pulver). | nogle udførelsesformer er den rOVD konsumerbare sammensætning en væskesammensætning. sådanne tilfælde kan koncentrationen af rOVD i væskesammensætningen være imellem 0,1% og 40%. Koncentrationen af rOVD i væskesammensætningen kan være i det mindste 0,1%.
Koncentrationen af rOVD i væskesammensætningen kan være maksimalt 40%. Koncentrationen af rOVD i væskesammensætningen kan være fra 0,1 til 1%, 0,1% til 5%, 0,1% til 10%, 0,1% til 15%, 0,1% til 20%, 0,1% til 25%, 0,1% til 30%, 0,1% til 35%, 0,1% til 40%, 1% til 5%, 1% til 10%, 1% til 15%, 1% til 20%, 1% til 25%, 1% til 30%, 1% til 35%, 0,1% til 40%, 1% til 5%, 1% til 10%, 1% til 15%, 1% til 20%, 1% til 25%, 1% til 30%, 1% til 35%, 1% til 40%, 5% til 10%, 5% til 15%, 5% til 20%, 5% til 25%, 5% til 30%, 5% til 35%, 5% til 40%, 10% til 15%, 10% til 20%, 10% til 25%, 10% til 30%, 10% til 35%, 10% til 40%, 15% til 20%, 15% til 25%, 15% til 30%, 15% til 35%, 15% til 40%, 20% til 25%, 20% til 30%, 20% til 35%, 20% til 40%, 25% til 30%, 25% til 35%, 25% til 40%, 30% til 35%, 30% til 40% og 35% til 40% i vægt pr. totalt volumen (w/v). Koncentrationen af rOVD i væskesammensætningen kan være omkring 0,1% 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% eller 40% w/v. Koncentrationen af rOVD i væskesammensætningen kan være i det mindste 0,1% 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% eller 35% w/v. Koncentrationen af rOVD i
DK 202300014 Y3 væskesammensætningen kan være maksimalt 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% eller 40% wiv. nogle udførelsesformer er den rOVD konsumerbare sammensætning en fast sammensætning. — sådanne tilfælde kan koncentrationen af rOVD i den faste sammensætning være imellem 0,1% og 70%. Koncentrationen af rOVD i den faste sammensætning kan være i det mindste 0,1%.
Koncentrationen af rOVD i den faste sammensætningn kan være maksimalt 70%. Koncentrationen af rOVD i den faste sammensætning kan være 0,1% til 1%, 0,1% til 10%, 0,1% til 20%, 0,1% til 30%, 0,1% til 40%, 0,1% til 50%, 0,1% til 60%, 0,1% til 70%, 1% til 10%, 1% til 20%, 1% til 30%, 1% til 40%, 1% til 50%, 1% til 60%, 1% til 70%, 10% til 20%, 10% til 30%, 10% til 40%, 10% til 50%, 10% til 60%, 10% til 70%, 20% til 30%, 20% til 40%, 20% til 50%, 20% til 60%, 20% til 70%, 30% til 40%, 30% til 50%, 30% til 60%, 30% til 70%, 40% til 50%, 40% til 60%, 40% til 70%, 50% til 60%, 50% til 70% eller 60% til 70% vægt pr. total vægt (w/w) og/eller vægt pr. total volumen (w/v). Koncentrationen af rOVD i den faste sammensætning kan være 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% eller 70% w/w eller w/v. Koncentrationen af rOVD i den faste sammensætning kan være i det mindste 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% eller 60% w/w eller w/v.
Koncentrationen af rOVD i den faste sammensætning kan være maksimalt 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% eller 70% w/w eller w/v. | nogle udførelsesformer er den rOVD konsumerbare sammensætning en pulversammensætning. sådanne tilfælde kan koncentrationen af rOVD i pulver-sammensætningen være mellem 15% og 99% vægt pr. totalvægt (w/w) og/eller vægt pr. volumen (w/v). Koncentrationen af rOVD i pulversammensætningen kan være i det mindste 15% w/w eller w/v. | udførelsesformer kan koncentationen af rOVD i pulversammensætningen være maksimalt 99% w/w eller w/v.
Koncentration af rOVD i pulversammensætningen være 15% til 30%,15% til 45%, 15% til 60%, 15% til 75%, 15% til 80%,15% til 85%,15% til 90%,15% til 95%,15% til 99%, 30% til 45%, 30% til 60%, 30% til 75%, 30% til 80%, 30% til 85%, 30% til 95%, 30% til 99%, 45% til 60%, 45% til 75%, 45% til 80%, 45% til 85%, 45% til 90%, 45% til 95%, 45% til 99%, 60% til 75%, 60% til 80%, 60% til 85%, 60% til 90%, 60% til 95%, 60% til 99%, 75% til 80%, 75% til 80%, 75% til 85%, 75% til — 90%, 75% til 95%, 75% til 99%, 80% til 85%, 80% til 90%, 80% til 95%, 80% til 99%, 85% til 90%, 85% til 95%, 85% til 99%, 90% til 95%, 90% til 99% eller 95% til 99% w/w eller w/v. Koncentrationen af rOVD i pulversammensætningen kan være omkring 15%, 30%, 45%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% eller 99% w/w eller w/v. Koncentrationen af rOVD i pulversammensætningen kan være i det mindste 15%, 30%, 45%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90% eller 95% w/w eller w/v. Koncentrationen
9 DK 202300014 Y3 af rOVD i pulversammensætningen kan være maksimalt 30%, 45%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% eller 99% w/w eller w/v. nogle udførelsesformer er den rOVD konsumerbare sammensætning en koncentreret sirup- sammensætning. | sådanne tilfælde kan koncentrationen af rOVD i sirupsammen-sætningen være imellem 10% og 60% vægt pr. totalvægt (w/w) og/eller vægt pr. totalvolumen (w/v).
Koncentrationen af rOVD i siruppen kan være i det mindste 10% w/w eller w/v. Koncentrationen af rOVD i siruppen kan være maksimalt 60% w/w eller w/v. Koncentrationen af rOVD i siruppen kan være 10% til 20%, 10% til 30%, 10% til 40%, 10% til 50%, 10% til 60%, 20% til 30%, 20% til 40%, 20% til 50%, 20% til 60%, 30% til 40%, 30% til 50%, 30% til 60%, 40% til 50%, 40% til 60% eller 50% til 60% w/w eller w/v. Koncentrationen af rOVD i siruppen kan være omkring 10%, 20%, 30%, 40%, 50% eller 60% w/w eller w/v. Koncentrationen af rOVD i siruppen kan være mindst 10%, 20%, 30%, 40% eller 50% w/w eller w/v. Koncentrationen af rOVD i siruppen kan være maksimalt 20%, 30%, 40%, 50% eller 60% w/w eller w/v. Siruppen kan omfatte et vilkårligt — opløsningsmiddel, eksempelvis vand og juice.
Opløselighed og klarhed
Tilvejebragt heri, især, er sammensætninger af OVD, hvor OVD proteinet forbliver opløseligt i sammensætningen. | nogle udførelsesformer for enhver sammensætning beskrevet heri, er — proteinerne fuldt opløselige ved en proteinkoncentration imellem de laveste mængder af rOVD (eksempelvis 0,1 g eller mindre) og i stigende mængder op til og inkl. omkring 30 eller 40 g rOVD protein pr. 100 ml opløsning. I nogle udførelsesformer for enhver sammensætning beskrevet heri er proteinerne fuldt opløselige ved en koncentration på omkring 1, 2, 5, 7, 10, 12 eller 15 g, total
OVD protein pr. 100 ml volumen, eksempelvis ved formulering i en væske såsom vand. | nogle — udførelsesformer ifølge enhver sammensætning beskrevet heri, er proteinerne fuldt opløselige ved en koncentration på omkring 15, omkring 20, omkring 25, omkring 30 eller omkring 40 g total
OVD protein pr. 100 ml volumen, eksempelvis ved formulering i væske såsom vand. sammensætningerne heri kan OVD være naturligt OVD eller et rekombinant OVD. | nogle udførelsesformer er OVD et isoleret rekombinant protein. | nogle udførelsesformer er OVD et rOVD med modificeret glycosylation, såsom med én eller flere asparaginrester modificerede med
N-acetylglucosamin og i det væsentlige uden N-forbundet mannosylation.
Opløselighed af rOVD kan måles med forskellige teknikker inkl. visuel detektion og måling af absorbans af opløsningen ved en bølgelængde på 600 nm (OD600). I nogle udførelsesformer har — opløst proteinsammensætning beskrevet heri absorbans mindre end 1 (<1) som målt under
> DK 202300014 Y3 anvendelse af 600 nm bølgelængde. | nogle udførelsesformer har opløste rOVD sammensæt- ninger beskrevet heri en observeret målt transmittans ved 600 nm på mere end omkring 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller 99%. | nogle udførelsesformer vil tilføjelsen af
FOVD til en sammensætning ikke ændre eller kun lidt ændre OD600 målingen i sammenligning med sammensætningen uden rOVD. nogle udførelsesformer kan tilføjelsen af rOVD til en sammensætning forøge OD600 målingen i sammenligning med sammensætningen uden rOVD og forøgelsen er mindre end det der ville være blevet set med tilføjelsen af et andet protein, såsom valleprotein eller et naturligt OVD tilføjet til sammensætningen i samme mængde. nogle udførelsesformer har tilføjelsen af rOVD til en sammensætning en opløselighed, som er bedre end valleprotein eller naturligt OVD, ved sammenligning ved samme proteinkoncentration og under ækvivalente betingelser (såsom pH og temperaturbehandling). I nogle udførelsesformer — har tilføjelsen af rOVD til en sammensætning en opløselighed bedre end valleprotein eller naturligt
OVD ved sammenligning ved den samme proteinkoncentration og sammensætningen er en konsumerbar fødevaresammensætning såsom en ingrediens eller et færdigt produkt. “Klar” eller "klarhed”, som anvendt heri, betegner en manglende turbiditet. Klarhed kan evalueres ved en visuel observation, inkl. ved sammenligning med en opløsning, som ikke har noget protein inkluderet. Sådanne sammenligninger kan foretages maskinelt, af et individ eller af et panel af testere, eksempelvis testere, som er trænede indenfor området af detektering af klarhed. Klarhed af en opløsning kan testes af et panel på (i det mindste 3, 5, 7, 10 eller 12 individer) eller mennesker, som er fagmænd indenfor sådanne test. Fortrinsvis kan en hovedpart af testere være ude af stand til visuelt at differentiere rOVD sammensætningen fra en opløsning, som ikke indeholder noget protein eller et andet protein med samme koncentration.
I nogle udførelsesformer har rOVD sammensætningerne forbedret klarhed i sammenligning med sammensætninger med andre sammensætninger som har et andet protein med en ækvivalent — koncentration, såsom en sammensætning indeholdende ærteprotein, valleisolater eller valle- protein, naturlige æggehvideproteiner (eksempelvis nOVD), eller hel æggehvide. | nogle udførelsesformer kan i det mindste hovedparten eller flere af testerne være ude af stand til visuelt at differentiere rOVD’et tilføjet til en sammensætning fra en opløsning, som ikke indeholder noget protein.
1 DK 202300014 Y3
En klar opløsning kan være farvet eller kan være farveløs. | nogle udførelsesformer kan et opløst rOVD protein i en sammensætning have manglende farve som målt ved mindre end 0,15 absorbans ved bølgelængder imellem 350 nm og 850 nm. | nogle udførelsesformer kan et opløst rOVD protein i en sammensætning tilvejebringe en farve, såsom gul, grøn eller brun eller nuancer deraf til en konsumerbar fødevaresammensætning. | nogle tilfælde kan rOVD og/eller det opløste rOVD protein være behandlet med et oxiderende middel eller oxygen-genererende middel for at modificere farven af opløsningen til en lysere eller mindre intens farve. | nogle udførelsesformer er en sammensætning af rOVD i opløsning, såsom i en flydende konsumerbar fødevaresammensætning, essentielt klar ved en proteinkoncentration på imellem de laveste mængder af rOVD (eksempelvis 0,1 g) og i stigende mængder op til og inklusive omkring 30g rOVD protein pr. 100 ml opløsning. | nogle udførelsesformer er en sammensætning af rOVD i opløsning, såsom i en flydende konsumerbar fødevaresammensætning, essentielt klar ved en høj proteinkoncentration på omkring 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 eller 30 gram rOVD protein pr. 100 ml opløsning. | nogle udførelsesformer er en rOVD sammensætning essentielt klar med i det mindste omkring 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 eller 30 g totalt rOVD protein pr. 100 ml opløsning (eksempelvis såsom i 100 ml vand). nogle udførelsesformer har en rOVD sammensætning en klarhed, som er bedre end valleprotein, såsom valleprotein-isolat eller valleprotein-koncentrat, i sammenligning ved den samme proteinkoncentration og under ækvivalente betingelser (såsom pH og temperatur). | nogle udførelsesformer har en rOVD sammensætning en klarhed, som er bedre end valleprotein ved sammenligning ved samme proteinkoncentration og rOVD sammensætningen er en komponent af en konsumerbar fødevaresammensætning såsom et færdigt produkt eller en ingrediens i et færdigt produkt. nogleudførelsesformer har en rOVD sammensætning en klarhed, som er bedre end naturligt
OVD, (nOVD) ved sammenligning ved samme proteinkoncentration og under ækvivalente — betingelser (såsom pH og temperatur). I nogle udførelsesformer har en rOVD sammensætning en klarhed, som er bedre end en nOVD sammensætning ved sammenligning ved samme pro- teinkoncentration og rOVD sammensætningen er en komponent i en konsumerbar fødevare- sammensætning, såsom et færdigt produkt eller som en ingrediens i et færdigt produkt.
> DK 202300014 Y3 nogle udførelsesformer heri, har en sammensætning af rOVD både væsentlig opløselighed og er i det væsentlige klar ved koncentrationer ved i det mindste omkring 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 g eller mere end 30 g af totalt rOVD protein pr. 100 ml opløsning (såsom i 100 ml vand). nogle tilfælde forbliver rOVD opløseligt og klart i en konsumerbar sammensætning, når sam- mensætningen opvarmes til en temperatur større end 50°C, 60°C eller 70°C eller imellem 70°C og omkring 120°C, selv når rOVD er ved en koncentration på i det mindste 2%, 4%, 10%, 20, 30%, 40% eller 50% på en w/v basis. et tilfælde bestemmes klarhed af en konsumerbar sammensætning heri under anvendelse af absorbans af synligt lys, såsom ved måling af absorbans af opløsningen ved en bølgelængde på 600 nm (OD600). Fortrinsvis har en flydende eller delvis flydende konsumerbar sammensætning heri en absorbans, som er mindre end 1,2, 1,1, 1, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1, 0,09, 0,08, 0,07, 0,06, 0,05 eller 0,04, ved bestemmelse under anvendelse af synligt lys ved 600 nm. Andre frem- gangsmåder til måling af opløselighed inkl. eksaminering af opløselighed ved centrifugekon- centration efterfulgt af proteinkoncentrations-assays såsom Coomassie Plus (Bradford) Protein
Assay (Thermo Scientific) og Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay (Sigma-Aldrich). — |nogle tilfælde er klarhed af konsumerbare sammensætninger én, som ikke er væsentlig forskellig fra klarhed af opløsningen før tilføjelsen af rOVD. Eksempelvis vil en tilføjelse af rOVD til en opløsning (konsumerbar sammensætning) ikke ændre eller ikke i det væsentlige ændre (ænd- ringer på mindre end 0,03, 0,02, 0,01) OD600 målingen i sammenligning med sammensætningen uden rOVD.
Således kan en konsumerbar sammensætning omfattende rOVD have en klarhed mindre end 2 måling ved OD600 ved rumtemperatur, men en koncentration af rOVD på i det mindste eller omkring 10%, 15%, 20%, 25% eller 30% rOVD vægt pr. totalvægt (w/w) og/eller vægt pr. totalvolumen (w/v). Alternativt kan en opløsning omfattende rOVD ved en koncentration større end 10% w/w eller w/v have en klarhed, som er mindre end 2, 1,8, 1,6, 1,4, 1,2, 1, 0,8, 0,6, 0,4, 0,2, 0,1, 0,08, 0,06, 0,04 eller 0,02 som målt ved OD600 ved rumtemperatur. En i det væsentlige optisk klar opløsning kan betegne en opløsning, hvor OD600 målingen er mindre end eller lig med omkring 0,1. I nogle tilfælde har en i det væsentlige optisk klar opløsning en OD600 måling på mindre end 0,08, 0,06, 0,05 eller 0,02.
> DK 202300014 Y3 nogle udførelsesformer øger tilføjelsen af rOVD proteinkoncentrationen med i det mindste 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% eller 20% vægt pr. totalvægt (w/w) og/eller vægt pr. totalvolumen (w/v) uden at reducere klarhed eller — forøgelse af turbiditet med mere end 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% eller 10% w/w eller w/v af opløsningen i sammenligning med opløsningen før indførelsen af rOVD’et. nogle udførelsesformer kan rOVD protein tilføjes i en mængde, (såsom en procentdel af total vægt eller volumen af den konsumerbare fødevaresammensætning), som er større end det der — kunne tilføjes med andre proteinkilder, som anvendes i spiselige produkter, såsom valleproteiner (såsom valleprotein-isolat (WPI) og valleprotein-koncentrat (WPC)), alle udførelsesformer for ærte- protein, soyaprotein, hele æg eller æggehvideprotein (eksempelvis naturligt OVD), under stadig opretholdelse af opløseligheden og klarhedsegenskaberne for sammensætningen.
Sensorisk neutralitet og forbedret sensorisk appel.
I nogle udførelsesformer tilvejebringer, ud over det forøgede proteinnæringsindhold, tilføjelsen af rOVD til en konsumerbar fødevaresammensætning, sensorisk neutralitet eller en forbedret sensorisk appel i sammenligning med andre proteiner i sådanne sammensætninger. Som anvendt heri betegner "sensorisk neutralitet” fraværet af en stærk eller distinktiv smag, lugt eller — kombinationer af smag og lugt samt tekstur, mundfølelse, eftersmag og farve. Et sensorisk panel, såsom ét beskrevet i Kemp et al. 2009 kan anvendes af et panel af trænede analysatorer.
Sensorisk neutralitet kan tilvejebringe en forbedret sensorisk appel for en smagsdommer, såsom en tester af fødevarer, eller en forbruger, når en konsumerbar fødevaresammensætning indehol- dende rOVD med en anden lignende sammensætning, som har et andet protein, såsom — valleprotein, ærteprotein, soyaprotein, hele æg eller æggehvideprotein med samme koncentration. nogle udførelsesformer er rOVD, når det tilføjes til en konsumerbar fødevaresammensætning, i det væsentlige lugtfri, såsom målt af et trænet sensorisk panel, i sammenligning med forskellige opløsninger med en anden proteinkomponent foreliggende i en tilsvarende koncentration som den rOVD holdige opløsning, eksempelvis som i sammenligningen er valle, soya, kollagen, ærte, æggehvide faste isolater og/eller naturligt OVD. | nogle udførelsesformer for rOVD sammensæt- ningerne beskrevet heri er sådanne sammensætninger essentielt lugtfrie ved en protein- koncentration imellem omkring 5-10%, 10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-30% eller større end 30% rOVD veegt pr. totalvægt (w/w) og/eller vægt pr. totalvolumen (w/v) eller en proteinkoncentration
> DK 202300014 Y3 på omkring 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 eller mere end 30 g totalt rOVD protein pr. 100 ml opløsning (eksempelvis pr. 100 ml vand). nogle udførelsesformer giver tilføjelsen af rOVD til en konsumerbar fødevaresammensætning — også en neutral smag ud over egenskaberne såsom forøget protein-næringsindhold, opløselighed, klarhed og/eller lugtfrihed. En neutral smag kan måles eksempelvis af et trænet sensorisk panel i sammenligning med opløsninger indeholdende et andet protein foreliggende i en tilsvarende koncentration som rOVD'et, eksempelvis valle, soya, kollagen, ærte, hele æg og æggehvide- faststofisolater (inkl. naturligt OVD). nogle udførelsesformer giver tilføjelsen af rOVD en reduktion i en bestemt lugt og/eller smag, som er associeret med andre proteiner, som anvendes til supplering. Eksempelvis har tilføjelsen af rOVD en mindre "æggelignende” lugt eller smag i sammenligning med tilføjelsen af hele æg, fraktioneret æg eller æggehvide til en konsumerbar fødevaresammensætning. | nogle udførel- — sesformer har tilføjelsen af rOVD en mindre metallisk lugt eller smag i sammenligning med andre proteinkilder. nogle udførelsesformer har tilføjelsen af rOVD en forbedret mundfølelse i sammenligning med tilføjelsen af andre proteinkilder. Eksempelvis er tilføjelsen af rOVD mindre kornformet eller har — mindre udfældninger eller faste stoffer i sammenligning med andre proteinkilder.
I nogle udførelsesformer har tilføjelsen af rOVD en forbedret tekstur, eksempelvis i sammenligning med andre tilgængelige supplerende proteinkilder. | nogle udførelsesformer har tilføjelsen af rOVD en forbedret eller applerende farve eller visuel appel i sammenligning med andre tilgængelige supplerende proteinkilder. Eksempelvis kan tilføjelsen af rOVD opretholde klarheden af en væske (såsom en carboneret drik, proteinvand, sportsdrik) og tilvejebringe visuel appel for forbrugeren.
En konsumerbar sammensætning med rOVD kan også have en forbedret sensorisk appel i — sammenligning med sammensætningen uden rOVD eller med et andet protein foreliggende i en tilsvarende koncentration som rOVD’et. En sådan forbedret sensorisk appel kan relatere til smag og/eller lugt. Smag og lugt kan måles, eksempelvis, af et trænet sensorisk panel. | nogle tilfælde sammenligner et sensorisk panel en konsumerbar sammensætning med rOVD med en uden dette eller med et andet protein i en tilsvarende mængde.
> DK 202300014 Y3
Som beskrevet heri kan en konsumerbar sammensætning heri foreligge i væskeform. En væskeform kan være et mellemprodukt, såsom opløselig rOVD opløsning. | nogle tilfælde kan en væskeform være et slutprodukt, såsom en drikkevare omfattende rOVD. Eksempler på forskellige — typer af drikkevarer påtænkt heri omfatter: juice, en sodavand, en softdrik, en smagstilsat vand, en proteinvand, en fortificeret vand, en carboneret vand, en næringsdrik, en energidrik, en sportsdrik, en restitueringsdrik, en opvarmet drik, en kaffebaseret drik, en tebaseret drik, en plantebaseret mælk, en mælke-baseret drik, en ikke-mælke-baseret drik, plante-baseret mild drik, barneformuleret drik og en måltidserstatningsdrik.
Ikke-begrænsende eksempler på juicedrikke omfatter Odwalla®, Naked® og MinuteMaid®.
Ikke-begrænsende eksempler på sodavandsdrikke omfatter: Coca-Cola®, Pepsi®, Sprite® og 7Up®. lkke-begreensende eksempler pa restitueringsdrikke omfatter Gatorade™, Pedialyte®,
Powerade® og Propel®.
Ikke-begraensende eksempler på en energidrik omfatter Red Bull™, Monster™, Full Throttle®, > AMPO, Rockstar®, BangTM, ReignTM, NOS®, Venom® og energishots såsom 5-Hour Energy'M.
Andre eksempler på slutprodukter på flydende form omfatter bouillon, suppe og flydende fødevarer.
En flydende form kan være en kold drik, en varm drik eller en rumtemperaturdrik.
En vilkårlig af de flydende former heri kan være carboneret. Carbonering kan opnås under anvendelse af en vilkårlig sikker gas, såsom kuldioxid. | en udførelsesform er en konsumerbar sammensætning sprudlende vand (såsom San
PellegrinoTM) og har imellem 0,5 og 30% w/w eller w/v rOVD. Et sådant produkt har en OD600 på mindre end 0,2, fortrinsvis mindre end 0,15, medens den forbliver i det væsentlige farveløs, lugtløs og smagløs.
6 DK 202300014 Y3 en udførelsesform er en konsumerbar sammensætning en sodadrik (såsom Diet CokeTM,
PepsiTM, CokeTM) og har imellem 0,5 og 30% w/w eller w/v rOVD. Et sådant produkt fastholder en sensorisk profil (smag, duft, lugt og klarhed), som er sammenlignelig med sammensætningen uden tilføjelsen af rOVD.
I nogle udførelsesformer foreligger en konsumerbar sammensætning i en halvfast form. Eksempler på halvfaste konsumerbare sammensætninger omfatter: en gelé, et bolsje, en bouillon, en suppe, en sirup, et gelatineholdigt produkt, et gelereret produkt og et gummiprodukt eller en kombination deraf.
Kompatibilitet med yderligere ingredienser
Tilvejebragt heri er sammensætninger med rOVD, hvor rOVD et er kompatibelt med én eller flere yderligere ingredienser, som anvendes ved fremstilling af en konsumerbar fødevaresammen- sætning, inkl. et færdigt produkt. En sådan kompatibilitet tilvejebringer fortifikation af proteinindhold for den konsumerbare fødevaresammensætning, under opretholdelse af én eller flere ønskede egenskaber for den konsumerbare fødevaresammensætning.
I nogle udførelsesformer er rOVD kompatibelt med glutenholdige ingredienser. Eksempelvis kan rOVD tilføjes med en glutenholdig ingrediens for opnåelse af proteinfortifikation og opretholdelse af glutenstruktur, som er nødvendig for ingrediensen og/eller det færdige produkt. Eksempelvis kan rOVD anvendes som en ingrediens for fremstillingen af proteinfortificerede bagte varer, et brød, en småkage, en kiks, en biscuit, et frossent mejeriprodukt, et frossent ”mejerilignende” pro- dukt, et tilberedt måltid, et kødprodukt, et kødfrit produkt, en burger, en patty, et proteinsupplement, en snackbar, en proteinbar, en næringsbar, en energibar, en dessert, en salatdressing, et > æggepenslingsprodukt eller et ”ægge-lignende” produkt, konditorkager, kager og nudler. | det færdige produkt påvirker rOVD'et ikke i væsentlige grad glutenstrukturen eller har væsentligt reduceret påvirkning af glutenstrukturen i sammenligning med andre proteinkilder.
I nogle udførelsesformer er rOVD kompatibelt med glutenfrie ingredienser. Eksempelvis kan rOVD tilføjes til en glutenfri ingrediens-blanding for opnåelse af proteinfortifikation og tilvejebringelse af — struktur og/eller tekstur for det færdige produkt. Glutenfrie ingredienser og færdige produkter omfatter sådanne kornarter og stivelser (ris, majs, durra og andre kornprodukter), rodknolde, såsom kartofler, og bælgfrugter og bælgplanter, såsom kikærter og linser. Eksempelvis kan rOVD anvendes som en ingrediens til fremstillingen af protein-fortificerede glutenfrie produkter inkl. bagte varer, et brød, en småkage, en kiks, en biscuit, et frossent mejeriprodukt, et frossent ”mejeri- — lignende” produkt, et tilberedt måltid, et kødprodukt, et kødløst produkt, en burger, en patty, et
> DK 202300014 Y3 proteinsupplement, en snackbar, en proteinbar, en næringsbar, en energibar, en dessert eller et ”ægge-lignende” produkt, konditorkager, kager og nudler. nogle udførelsesformer er rOVD kompatibelt med salte, således at rOVD protein ikke udfældes fra opløsningen. Eksempelvis, til anvendelse i fødevarer og drikkevarer såsom proteinsmoothies, veganmælk og frugtjuice fortificeret med rOVD, forbliver proteinet i det væsentlige i opløsning.
Tilføjelse af rOVD udfælder ikke i vitamin/mineral fortificeret miljø såsom foreliggende med frugtjuice og juicelignende produkter og rOVD tilvejebringer forøget proteinindhold og næring. rOVD kombinationer med en anden kilde for aminosyrer
I nogle udførelsesformer tilføjes rOVD til en konsumerbar fødevaresammensætning og en anden kilde for aminosyrer tilføjes, således at kombinationen har et forøget proteinindhold og til- vejebringer en ønsket mængde eller balance for aminosyreindhold. | nogle udførelsesformer er den anden kilde for aminosyrer et andet protein (enten et naturligt protein eller et rekombinant protein). I nogle udførelsesformer er den anden kilde for aminosyrer tilvejebragt ved tilføjelse af én eller flere frie aminosyrer. nogle udførelsesformer tilføjes rOVD til en konsumerbar fødevaresammensætning og et andet protein tilføjes, således, at kombinationen har et forøget proteinindhold og tilvejebringer en ønsket > mængde eller balance af aminosyreindhold. | nogle udførelsesformer er det andet protein et rekombinant protein. I nogle udførelsesformer er det andet protein et naturligt protein, eksempelvis isoleret fra dets naturlige kilde.
Proteinindholdet i sammensætninger kan måles ved forskellige fremgangsmåder såsom protein- — fordøjeligheds-korrigeret aminosyrescore (PDCAAS) fremgangsmåden. PDCAAS refererer til en fremgangsmåde til måling af proteinværdien i human næring. Fremgangsmåden er baseret på sammenligning af koncentrationen af den første begrænsende essentielle aminosyre i test- proteinet med koncentrationen af denne aminosyre i et reference (score) mønster. Fremgangs- måden sammenligner aminosyreprofilen for det specifikke fødevareprotein imod en standard- — aminosyreprofil hvor den højst mulige score er 1,0, sådan 1,0 score betyder at det specifikke fødevareprotein pr. proteinenhed tilvejebringer 100% eller mere af de uundværlige aminosyrer, som kræves til human næring (se eksempelvis FAO/WHO/UNU Expert Consultation 1985).
Formlen til beregning af PDCAAS procentdelen er: (mg af begrænsende aminosyre i 1 g af — testprotein/mg af samme aminosyre i 1 g af referenceprotein) x fækal sand fordøjelighedsprocent.
De DK 202300014 Y3
PDCAAS scorer over 1,0 trunkeres til 1,0. Aminosyrescore (ikke korrigeret eller trunkeret) kan overskride 1,0. nogle udførelsesformer forøger kombinationen af rOVD og et andet protein proteinholdet og — tilvejebringer en PDCAAS på mere end omkring 0,75. | nogle udførelsesformer tilvejebringer kombinationen et PDCAAS på eller omkring 0,75, 0,76, 0,77, 0,78, 0,79, 0,80, 0,81, 0,82, 0,83, 0,84, 0,85, 0,86, 0,87. 0,88, 0,89, 0,90, 0,91, 0,92, 0,93, 0,94, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98, 0,99 eller 1,0. nogle udførelsesformer tilvejebringer kombinationen et PDCAAS på større end eller lig med omkring 0,75, 0,76, 0,77, 0,78, 0,79, 0,80, 0,81, 0,82, 0,83, 0,84, 0,85, 0,86, 0,87. 0,88, 0,89, 0,90, 0,91, 0,92, 0,93, 0,94 eller 0,95. I nogle udførelsesformer tilvejebringer kombinationen et PDCAAS på eller omkring 1,0.
I nogle udførelsesformer er forholdet mellem rOVD og det andet protein valgt til at tilvejebringe et
PDCAAS på i det mindste omkring 0,75 og hvor kombinationen af rOVD og det andet protein — forbliver opløseligt i den konsumerbare fødevaresammensætning. | nogle udførelsesformer af en heri offentliggjort kombination af rOVD og et andet protein foreligger rOVD i kombination ved eller omkring 95%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71% eller 70% vægt pr. totalvægt (w/w) og/eller vægt pr. total volumen (w/v). I nogle udførelsesformer for en heri offentliggjort kombination af rOVD og et andet protein — foreligger rOVD i kombination ved eller omkring 69%, 78%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, 60%, 59%, 58%, 57%, 56%, 55%, 54%, 53%, 52%, 51%eller 50% w/w eller w/v. I nogle udførelsesformer for kombinationen af rOVD og det andet protein, foreligger rOVD i kombinationen i en procentdel af total protein ved eller i det mindste omkring 60%, 65%, 70%, 75%, 80% eller større end 80% w/w eller w/v. I nogle udførelsesformer for en heri offentliggjort kombination af rOVD og et andet protein foreligger det andet protein i kombination ved en højere procentdel, således at rOVD tilvejebringes i en mindre mængde end det andet protein. nogle udførelsesformer vælges et andet protein baseret på dets aminosyresammensæstning. nogle udførelsesformer tilvejebringer et andet protein tryptophan til sammensætningen. | nogle — udførelsesformer tilvejebringer et andet proteintryptophan således, at kombinationen med rOVD har et tryptophanindhold på i det mindste omkring 1,7 g pr. 100 g total protein.
I nogle udførelsesformer er det andet protein lysozym. I nogle udførelsesformer af det andet protein æggehvide-lysozym. | nogle udførelsesformer er det andet protein et rekombinant æggehvide- — lysozym (rOVL).
> DK 202300014 Y3 rOVD et og rOVL et kan bearbejdes eller blandes sammen før blanding med en vilkårlig anden fødevareingrediens eller konsumerbart fødevareprodukt. Alternativt kan enten rOVD eller rOVL bearbejdes eller blandes individuelt, enten samtidigt eller separat, med en vilkårlig anden > fødevareingrediens eller konsumerbart fødevareprodukt. | udførelsesformer udtrykker en enkelt transformeret celle såvel rOVL som rOVD. nogle udførelsesformer er det andet protein rOVL og kombinationen af rOVD og rOVL til- vejebringer proteinfortifikation medens de forbliver opløselige i sammensætningen og tilvejebringer et PDCAAS på omkring 1,0. Forholdet mellem rOVD og rOVL kan være imellem omkring 60% rOVD:40% rOVL til omkring 82% rOVD:18% rOVL, eller imellem omkring 75% rOVD:25% rOVL til omkring 82% rOVD:18% rOVL vægt pr. totalvægt (w/w) og/eller vægt pr. totalvolumen (w/v).
Naturligt OVD har et PDCAAS på omtrent 0,02. Tilføjelse af rOVL til rOVD forøger amino- — syrescoren og PDCAAS for kombinationen. Som et eksempel resulterer en 78,3% rOVD og 21,7% rOVL blanding i en aminosyrescore på 0,86 og en PDCAAS på 0,79. Med forholdet mellem rOVD til rOVL fra omkring 78,3% rOVD + 21,7% rOVL til omkring 60% rOVD + 40% rOVL tilvejebringer et område mellem 0,86 og 1,06 aminosyrescore. | disse eksempelvise om- råder forbliver kombinationen af rOVD og rOVL opløselig. nogle udførelsesform omfatter en konsumerbar sammensætning en proteinblanding af rOVD og rOVL. | nogle tilfælde har en sammensætning omfattende en blanding af rOVD og rOVL omkring 20% til 99% rOVD og 1-20% rOVL. I nogle eksempler kan koncentrationen af rOVD i en proteinblanding af rOVD og rOVL være i det mindste 20%. Koncentrationen af rOVD i en — proteinblanding af rOVD og rOVL kan være maksimalt 99%. Koncentrationen af rOVD i en proteinblanding af rOVD og rOVL kan være omkring 20% til 30%, 20% til 40%, 20% til 50%, 20% til 60%, 20% til 70%, 20% til 80%, 20% til 90%, 20% til 99%, 30% til 40%, 30% til 50%, 30% til 60%, 30% til 70%, 30% til 80%, 30% til 90%, 30% til 99%, 40% til 50%, 40% til 60%, 40% til 70%, 40% til 80%, 40% til 90%, 40% til 99%, 50% til 60%, 50% til 70%, 50% til 80%, 50% til 90%, 50% til 99%, 60% til 70%, 60% til 80%, 60% til 90%, 60% til 99%, 70% til 80%, 70% til 90%, 70% til 99%, 80% til 90%, 80% til 99% eller 90% til 99% vægt pr. totalvægt (w/w) og/eller vægt pr. totalvolumen (w/v). Koncentrationen af rOVD i en proteinblanding af rOVD og rOVL kan være omkring 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% eller 99% w/w eller w/v.
Koncentrationen af rOVL i en proteinblanding af rOVD og rOVL kan være 1% til 20%. — Koncentrationen af rOVL i en proteinblanding af rOVD og rOVL kan være i det mindste 1%.
20 DK 202300014 Y3
Koncentrationen af rOVL i en proteinblanding af rOVD og rOVL kan være maksimalt 20%.
Koncentrationen af rOVL i en proteinblanding af rOVD og rOVL kan være 1% til 5%, 1% til 10%, 1% til 15%, 1% til 20%, 5% til 10%, 5% til 15%, 5% til 20%, 10% til 15%, 10% til 20% eller 15% til 20% w/w eller w/v. Koncentrationen af rOVL i en proteinblanding af rOVD og rOVL kan være —>— omkring 1%, 5%, 10%, 15% eller 20% w/w eller w/v.
I nogle udførelsesformer tilvejebringer rOVD og det andet protein et PDCAAS svarende til andre proteinkilder såsom valleprotein og valleprotein-isolat og rOVD og det andet protein tilvejebringer i det mindste ét træk forbedret i sammenligning med den anden proteinkilde omfattende — opløselighed, klarhed, sensorisk neutralitet eller forbedret smag og/eller duft, forbedret mund- følelse og kompatibilitet med en yderligere ingrediens. | nogle udførelsesformer tilvejebringer rOVD og det andet protein et PDCAAS svarende til andre proteinkilder og tilvejebringer forbedret opløselighed og klarhed ved fødevaretilberednings- og bearbejdningsbetingelser, såsom pH, opvarmning og carbonering. nogle udførelsesformer er den anden kilde for aminosyrer tilføjet med rOVD én eller flere frie aminosyrer. | nogle udførelsesformer kan rOVD kombineres med frie aminosyrer såsom tryptophan, isoleucin, leucin og valin for selektivt at forøge PDCAAS. | nogle udførelsesformer tilvejebringer tilføjelsen af én eller flere frie aminosyrer en aminosyrebalance svarende til tilføjelsen — afetandet protein, såsom tilsvarende til PDCAAS, som opnås ved tilføjelsen af rOVL. Eksempelvis kan én eller flere af følgende tilføjes med rOVD: tryptophan = 1,7 g/100 g prøve, isoleucin = 2,03 g/100 g prøve, leucin = 4,55 g/100 g prøve, valin = 4,94 g/100 g prøve.
Opvarmningsbetingelser og pH for sammensætninger | nogle udførelsesformer omfatter de konsumerbare fødevaresammensætninger og fremgangs- måder til fremstilling af sammensætninger et bestemt pH område og i hvilket område rOVD'et forbliver opløseligt i sammensætningen. | nogle udførelsesformer er pH imellem omkring 1,0 og omkring 8,0. I nogle udførelsesformer er pH imellem omkring 2,0 og omkring 6,0, 6,5 eller 7,0. nogle udførelsesformer er pH imellem omkring 2,0 til omkring 2,5, omkring 2,5 til omkring 3,0 til — omkring 2,5 til omkring 3,5, omkring 3,5 til omkring 4,0, omkring 2,5 til omkring 4,5, omkring 2,0 til omkring 4,0, omkring 4,0 til omkring 6,0, omkring 2,0 til omkring 6,0, omkring 4,0 til omkring 6,5 eller omkring 2,0 til omkring 6,5. I nogle udførelsesformer er pH mindre end 2,0 eller lig med 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5 eller større end 4,5. Ved sådanne pH eller pH områder forbliver rOVD opløseligt i den — konsumerbare fødevaresammensætning, når rOVD er en ingrediens til et færdigt produkt
31 DK 202300014 Y3 (eksempelvis som en pulverform til anvendelse i et færdigt produkt) eller i et færdigt produkt som sådan. Ved en sådan pH eller et sådan pH område forbliver rOVD opløseligt i den konsumerbare fødevaresammensætning uden at påvirke teksturen eller kornetheden af sammensætningen. halvfaste og faste fødevarer muliggør opløseligheden af rOVD proteinfortifikation uden ulemper for de funktionelle og sensoriske egenskaber for fødevareproduktet. Eksempelvis tilvejebringer tilføjelsen af rOVD fortifikation og opretholder sensorisk appel såsom god mundfølelse og manglende kornethed. | nogle udførelsesformer tilvejebringer tilføjelsen af rOVD fortifikation, opretholder opløselighed og tilvejebringer som sådant muligheden for at rOVD blandes med andre ingredienser.
I nogle udførelsesformer omfatter de konsumerbare fødevaresammensætninger og fremgangs- måder til fremstilling af sådanne sammensætninger en opvarmningsbetingelse. Eksempelvis kan en konsumerbar fødevaresammensætning være opvarmet (eksempelvis stegt, kogt eller bagt) eller den kan være en varm drikkevare, såsom en lun eller varm drik, en suppe eller en bouillon. — nogle tilfælde kan en komsumerbar fødevaresammensætning have et varmetrin som en del af tilberedningen eller sterilisationsprocessen for fremstilling af en ingrediens eller et færdigt produkt.
Eksempelvis kan et opvarmningstrin omfatte pasteurisering, varmfyldning (hot fill) og/eller retorting. | nogle udførelsesformer omfatter opvarmningstrinnet opvarmning til en temperatur imellem omkring 72°C og omkring 121°C. Eksempelvis kan et opvarmningstrin være en pasteu- — risering, hvor sammensætningen opvarmes til 72°C i 1 minut og derefter afkøles og opbevares, inkl. opbevaring ved rumtemperatur eller nedkølet. For varmfyldning (hot fill), kan en sammen- sætning opvarmes til 85°C til 95°C, såsom i 30 sekunder og derefter placeres ved rumtemperatur.
Retorting kan omfatte opvarmning til 121°C under tryk, såsom opvarmning i 15 minutter ved 19 psi og derefter opbevaring ved rumtemperatur.
Tilberedning af en konsumerbar sammensætning kan også omfatte ét eller flere opvarmningstrin.
Et opvarmningstrin kan omfatte pasteurisering, varmfyldning (hot fill) og/eller retorting. I nogle udførelsesformer omfatter opvarmningstrinnet opvarmning til en temperatur på imellem omkring 70°C og omkring 150°C. et eksempel udføres et pasteuriserings-opvarmningstrin ved temperaturer liggende imellem 70°C og 100°C. et eksempel udføres et varmefyldning (hot fill) opvarmningstrin ved omkring 90°C til omkring 97°C.
2 DK 202300014 Y3 et eksempel udføres retorting ved omkring 100°C til omkring 140°C.
Retortingen kan udføres i omkring 10 eller flere minutter og ved omkring eller ved i det mindste 12 psi.
| nogle udførelsesformer tilvejebringer de konsumerbare fødevaresammensætninger og frem- gangsmåder til fremstilling af sådanne sammensætninger med rOVD en større proteinopløselighed eller en større proteinopløselighed og forbedret klarhed ved pH områder og/eller med opvarmning sammenligning med sammensætninger indeholdende et andet protein, såsom valleprotein, soyaprotein, ærteprotein, helægsprotein (eksempelvis naturligt OVD), eller hel-æggehvideprotein ved samme koncentration. nogle tilfælde tilvejebringer rOVD proteinopløselighed i en konsumerbar fødevaresammensæt- ning ved en pH imellem omkring 2 og omkring 6 ved rOVD koncentrationer med koncentrationer på omkring 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 g eller mere en 30 g af total rOVD protein pr. 100 ml opløsning (eksempelvis såsom i 100 ml vand) eller med en procentdel på omkring 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 procent baseret på en vægt pr. total sammensætningsvolumen. | nogle tilfælde tilvejebringer rOVD proteinopløselighed og klarhed i en konsumerbar fødevaresammensætning ved en pH imellem omkring 2 og omkring 6 ved rOVD koncentrationer på omkring 9, 10, 11, 12,
13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 g eller mere end 30 g af totalt rOVD protein pr. 100 ml opløsning (eksempelvis såsom i 100 ml vand) eller ved en procentdel på omkring 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 procent baseret på en vægt pr. total sammensætningsvolumen.
| nogle tilfælde tilvejebringer rOVD proteinopløselighed i en konsumerbar fødevaresammen- sætning, når sammensætningen opvarmes til en temperatur imellem 72°C og omkring 121°C ved rOVD koncentrationer med koncentrationer på omkring 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 g eller mere en 30 g af totalt rOVD protein pr. 100 ml opløsning (eksempelvis såsom i 100 ml vand) eller en procentdel på omkring 9, 10, 11, 12, 13,
14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 procent baseret på en vægt pr. total sammensætningsvolumen. | nogle tilfælde tilvejebringer rOVD proteinopløselighed og klar- hed i en konsumerbar fødevaresammensætning, når sammensætningen opvarmes til en temperatur imellem 72°C og omkring 121°C ved rOVD koncentrationer med koncentrationer på omkring 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 g eller mere ende 30 g af totalt rOVD protein pr. 100 ml opløsning (eksempelvis såsom i 100 ml vand)
23 DK 202300014 Y3 eller en procentdel på omkring 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 procent baseret på en vægt pr. total sammensætningsvolumen. nogle tilfælde tilvejebringer rOVD proteinopløselighed i en konsumerbar fødevaresammen- — sætning, når sammensætningen opvarmes til en temperatur imellem omkring 72°C og omkring 121°C og hvor sammensætningen har en pH imellem omkring 2 og omkring 4 eller en pH omkring 2 til omkring 6 ved rOVD koncentrationer med koncentrationer på omkring 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 g eller mere end 30 g total rOVD protein pr. 100 ml opløsning (eksempelvis såsom i 100 ml vand) eller ved en procentdel på — omkring 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 procent baseret på en vægt pr. total sammensætningsvolumen. | nogle tilfælde tilvejebringer rOVD proteinopløselighed og klarhed i en konsumerbar fødevaresammensætning, nar sammensætningen opvarmes til en temperatur imellem omkring 72°C og omkring 121°C og hvor sammensætningen har en pH imellem omkring 2 og omkring 4 eller en pH omkring 2 til omkring 6 ved rOVD koncentrationer med koncentrationer på omkring 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 g eller mere end 30 g total rOVD protein pr. 100 ml af opløsning (eksempelvis såsom i 100 ml vand) eller en procentdel på omkring 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 procent baseret på en vægt pr. total sammensætningsvolumen.
Konsumerbare fødevaresammensætninger
Konsumerbare fødevaresammensætninger beskrevet heri omfatter fødevareprodukter, drikke- vareprodukter, diætiske supplementer, fødevareadditiver og nutraceutica som ikke begrænsende eksempler, og omfatter også sammensætninger som en ingrediens i en fødevare eller drikkevare eller et produkt, som indtages som en del af en dyrediæt. | nogle udførelsesformer er en kon- sumerbar fødevaresammensæstning et færdigt produkt, såsom en fødevare eller drikkevare til dyr- eindtagelse eller til human indtagelse, et diætisk supplement eller et nutraceutisk produkt. nogle udførelsesformer er et færdigt produkt en drikkevare, som indeholder rOVD, og eventuelt et andet protein, såsom rOVL. Drikkevaren kan være en klar drikkevare og kan vælges blandt en juice, en sodavand, en softdrik, en smagstilsat vand, en ikke-smagstilsat vand, en fortificeret vand, en carboneret vand, en næringsdrik, en energidrik, en sportsdrik, en restitueringsdrik, en opvarmet drik, en kaffe-baseret drik, en te-baseret drik, en kakao-baseret drik, en smoothie, en milk shake, kokosnøddevand, øl, vin, alkoholisk drik, nøddemælk, juice-baseret drikkevare, mejeribaserede
24 DK 202300014 Y3 drikkevarer og en plante-baseret mælk. Mange af de forskellige drikkevarer har en pH, som er imellem omkring 2 og omkring 7, og rOVD og/eller rOVD og et andet proteinkombination forbliver opløselig i sådanne drikkevarer. | nogle udførelsesformer er drikkevaren en opvarmet drikkevare.
I nogle udførelsesformer er drikkevaren en kold drikkevare eller en drikkevare, som serveres eller —> lagres ved rumtemperatur. | nogle udførelsesformer indeholder drikkevaren alkohol fra 3 til 40% vægt pr. totalvægt (w/w) og/eller vægt pr. totalvolumen (w/v). nogle udførelsesformer er drikkevaren carboneret. Carboneringen kan tilvejebringes af, eksem- pelvis, kuldioxid, kulsyre, natriumbicarbonat og kaliumbicarbonat. En sammensætning beskrevet — heri kan carboneres. | nogle tilfælde har en sammensætning beskrevet heri omkring eller i det mindste omkring 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 eller 4 volumener kuldioxidgas foreliggende pr. volumen af drikkevare. | nogle tilfælde har en sammensætning beskrevet heri op til 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, eller 4 volumener af kuldioxidgas foreliggende pr. volumen drikkevare. | nogle tilfælde har en sammensætning — beskrevet heri omkring 0,1 volumen til omkring 4 volumener eller omkring 1,5 volumener til 3,5 volumener kuldioxidgas foreliggende pr. volumen drikkevare.
I nogle udførelsesformer kan en proteinsammensætning omfatte kuldioxid og hvor mængden af kuldioxid tilføjet til den opløselige proteinsammensætning kan være i et forhold imellem 0,01 g og > 4,4gi355 ml eller den gasformige kuldioxid kan være imellem 0,02 volumener og 5 volumener for hvert 1 volumen af opløselig proteinsammensaetning, og hvor drikkevaren kan have et pH område imellem omkring 2 og omkring 6 eller omkring 2 og omkring 4. | nogle udførelsesformer har en carboneret drikkevare en pH imellem 1,0 og 6,0 eller omkring 1,0 og omkring 4 eller imellem omkring 1,6 og omkring 3,4. nogle udførelsesformer omfatter drikkevaretilberedningen et opvarmningstrin, såsom varmfyld- ning (hot fill) pasteurisering eller retorting og rOVD i drikkevaren forbliver opløselig under og efterfølgende opvarmningstrinnet. I nogle udførelsesformer ændrer tilføjelsen af rOVD til drikke- varen ikke i væsentlig grad det synlige udseende, lugt, smag eller mundfølelse for drikkevaren i > sammenligning med en drikkevare, som ikke indeholder sammensætningen. | nogle udførel- sesformer er tilføjelsen af rOVD til drikkevaren sensorisk neutral og tilvejebringer en forbedret sensorisk appel i sammenligning med andre proteiner, når disse tilføjes til drikkevaren med samme koncentration, såsom valleprotein, soyaprotein, ærteprotein, æggehvideproteiner eller helæggeproteiner. | nogle udførelsesformer omfatter drikkevare-tilberedningen også et andet pro-
35 DK 202300014 Y3 tein, såsom rOVL, og kombinationen af rOVD og det andet protein forbliver opløseligt under og efterfølgende opvarmningstrinnet.
I nogle udførelsesformer er et færdigt produkt et fødevareprodukt indeholdende rOVD. Fødevare- — produktet kan være en gelé, et bolsje, en bouillon, en suppe, et gelatineholdigt produkt, et geleret produkt og et gummiprodukt. Yderligere eksempler på kategorier af fødevareprodukter, hvori rOVD kan tilføjes, omfatter saucer, dressinger, smagsstoffer. rOVD kan også tilføjes til krydderblandinger og krydderier. rOVD kan også anvendes til belægning og panering. rOVD kan også anvendes til at forøge proteinindholdet i snacks såsom frugt og vegetabilsk baserede snacks. rOVD kan anvendes som en æggepensling til at fremme vedhæftning af frø eller korn til en bagt vare og/eller til at forbedre det visuelle udseende, såsom bruning af den bagte vare. nogle udførelsesformer heri er en konsumerbar fødevaresammensætning indeholdende rOVD en sammensætning, som anvendes som en ingrediens sammen med én eller flere andre ingredienser eller komponenter til tilvejebringelse af et færdigt produkt. Eksempelvis kan rOVD blandes med vand eller anden væske og derefter anvendes denne blanding som en ingrediens til at fremstille en drikkevare, et fødevareprodukt, diætisk supplement eller nutraceuticum. | nogle tilfælde blandes rOVD med andre ingredienser, såsom andre væsker (eksempelvis nøddemælk, frugtjuice, vegetabilske ekstrakter eller carbonerede opløsninger). Denne opløsning kan være en ingrediens, som derefter blandes med andre ingredienser for fremstilling af et slutprodukt til en slutbruger; eksempelvis kan opløsningen være en sirup, som indeholder koncentreret rOVD. Et — slut eller færdigt produkt er ét, som er klar til indtagelse af en slutbruger. Det færdige produkt kan være et bearbejdet produkt, såsom en bearbejdet fødevare eller en bearbejdet drik. I nogle tilfælde tilvejebringes rOVD i en separat beholder til at blive blandet i slutproduktet af slutbrugeren. | nogle tilfælde blandes rOVD med andre ingredienser, såsom geleringsmidler, for fremstilling af slik, gummiprodukter, gelerede produkter (såsom JelloTM) eller sportsgeler.
Under eller efter fremstillingen af et konsumerbart fødevareprodukt, som indeholder rOVD kan formuleres som en væske, faststof, sirup eller pulver. En sammensætning kan køles, fryses, opbevares varmt, opbevares ved rumtemperatur eller holdes ved en opvarmet temperatur. Frem- stilling af fødevareproduktet kan omfatte et opvarmningstrin eller fødevareproduktet opbevares
26 DK 202300014 Y3 eller serveres ved en opvarmet temperatur, og rOVD forbliver opløseligt i fødevareproduktet under og efterfølgende opvarmningstrinnet. I nogle tilfælde kan fødevareproduktet have en pH, som er imellem omkring 2 og omkring 6, og rOVD forbliver opløseligt i fødevareproduktet. —> Eksempler på flydende konsumerbare sammensætninger eller drikkevarer omfatter: en sodavand, en vitamindrik, en protein-shake, en måltidserstatnings-shake, en juice, en forfriskningsdrik, en mælkebaseret drik eller en ikke-mejeri-baseret drik, smagstilsat vand, en carboneret drik, kaffe, kaffeineret drik, te, blomster-baseret drik, øl, spiritus og sportsdrik.
En vilkårlig af de flydende eller halvflydende konsumerbare sammensætninger heri kan dannes ved blanding af et pulverformet rOVD i en opløsning. Opløsningen kan være slutproduktet eller en mellemopløsning, som derefter yderligere modificeres for fremstilling af et slutprodukt.
Eksempler på opløsningsmidler, som kan anvendes til at fremstille en rOVD opløsning, omfatter — postevand, carboneret vand, alkohol, juice og vilkårlige andre kommerciellt tilgængelige drikke- varer inkl. de, som er beskrevet mere detaljeret heri.
En fremgangsmåde til generering af en konsumerbar sammensætning omfattende rOVD kan omfatte blanding af rOVD med et opløsningsmiddel og, eventuelt, én eller flere andre kom- — ponenter. Blandingen kan udføres ved en vilkårlig konventionelt anvendt blandefremgangsmåde inkl. morter og pastil, mekanisk formaler, blending, homogeniseringsproces eller en lydbehand- lingsproces.
Mængden af rOVD tilført til opløsningen kan være én, som genererer en rOVD koncentration som beskrevet heri (enten i slutproduktet eller et mellemprodukt).
Fortrinsvis resulterer tilføjelsen af rOVD til opløsningen i at det meste eller næsten alt rOVD opløses i opløsningen ved rumtemperatur. | et tilfælde bestemmes opløselighed baseret på klarheden eller graden af manglende turbiditet.
De konsumerbare sammensætninger heri kan også underkastes et opvarmningstrin. Et sådant trin kan modificere eller øge opløseligheden for rOVD'et. Eksempelvis blev det fundet at udførelse af et opvarmningstrin i processen med fremstilling af et produkt såsom retorting, hot filling eller pasteurisering kan øge opløseligheden og følgelig klarheden af en rOVD opløsning heri.
+ DK 202300014 Y3
Fremstilling af et konsumerbart fødevareprodukt, som indeholder rOVD kan omfatte bear- bejdningstrinnene, eksempelvis frysning, køling, opvarmning, bagning, ristning, stegning, kog- ning, blanchering, emballering, dåseemballering, blegning, berigelse, tørring, presning, forma- ling, blanding, par kogning, kogning, kontrol, marinering, skæring, skiveskæring, terninge- — skæring, knusning, oprivning, hakning, rystning, korndannelse, spiralisesring, rulning, juice presning, sigtning, filtrering, æltning, whiskning, omrøring, piskning, findeling, stopning, pilning, frøfjernelse, røgning, hærdning, saltning, konservering, pickling, fermentering, homogenisering, pasteurisering, sterilisering, bestråling, koldplasmabearbejdning, højtryksbearbejdning, puls- elektriskfelt-bearbejdning, mikrobølgeassisteret termisk sterilisation, stabilisering, blanding, — purering, fortificering, raffinering, hydrogenering, ældning, forlængning af opbevaringstid eller tilføjelse af enzymer.
Fremstilling af et konsumerbart fødevareprodukt indeholdende rOVD kan omfatte tørring og/eller koncentrering. I nogle tilfælde danner tørring et tørt, dehydreret koncentreret og/eller fast protein eller sammensætning. Nogle ikke-begrænsende eksempler på tørringsfremgangsmåder omfatter termisk tørring, fordampning (eksempelvis ved hjælp af vakuum eller luft), destillation, kogning, opvarmning i en ovn, vakuumtørring, spraytørring, frysetørring og lyofilisation, eller en vilkårlig kombination deraf. > Fremstilling af et konsumerbart fødevareprodukt indeholdende rOVD kan omfatte fortynding og/eller hydrering. | nogle tilfælde kan fortyndingen omfatte tilføjelse af en væske, som kan være vand eller en anden væskeform. Eksempelvis kan en sammensætning fortyndes (eksempelvis fra 20% vand til 99,9% vand). I et andet eksempel kan en tørsammensætning hydreres (eksempelvis fra et tørt faststof til 99,9% vand). nogle udførelsesformer er den konsumerbare fødevaresammensætning, som indeholder rOVD, på pulverform og når pulversammensætningen formuleres til en opløsning er rOVD et i det væsentlige fuldt opløseligt. I nogle udførelsesformer, når pulversammensætningen formuleres til en opløsning, er rOVD et i det væsentlige fuldt opløseligt og opløsningen er i det væsentlige klar. | nogle udførelsesformer, når den pulverformede sammensætning formuleres til en opløsning, er rOVD et i det væsentlige fuldt opløseligt, opløsningen er i det væsentlige klar og opløsningen er essentielt sensorisk neutral eller har en forbedret sensorisk appel i sammenligning med opløsninger fremstillede med andre pulverformede proteiner såsom valleprotein, soyaprotein, ærteprotein, æggehvideprotein eller helæggge protein. | nogle udførelsesformer er den
28 DK 202300014 Y3 pulverformede sammensætning opløst i vand, hvor koncentrationen af rOVD er eller er omkring 1%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39% eller 40% baseret på vægt pr. totalvægt (w/w) og/eller vægt pr. totalvolumen (w/v) af sammensætningen.
I nogle udførelsesformer for de konsumerbare fødevaresammensætninger beskrevet heri er sammensætningen essentielt fri for animalsk-afledte komponenter, valleprotein, caseinat, fedt, lactose, hydrolyseret lactose, soyaprotein, kollagen, hydrolyseret kollagen eller gelatin, eller en — vilkårlig kombination deraf. En sammensætning beskrevet heri kan være essentielt fri for kolesterol, glucose, fedt, mættet fedt, transfedt eller en vilkårlig kombination deraf. | nogle tilfælde omfatter en sammensætning beskrevet heri mindre end 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% eller 0,5% fedt baseret på tørvægt. | nogle udførelsesformer kan sammensætningen være fedtholdig (eksempelvis såsom en mayonnaise) og en sådan sammensætning kan omfatte op til omkring — 60% fedt eller en reduceret fedtsammensætning (eksempelvis reduceret fedtmayonnaise) og en sådan sammensætning kan omfatte mindre procentdele fedt. En sammensætning, som er fri for animalsk-afledte komponenter kan betragtes som vegetariansk og/eller vegansk.
I nogle udførelsesformer omfatter en rOVD pulversammensætning mindre end 5% aske. Udtrykket aske” er et indenfor teknikken kendt udtryk og repræsenterer uorganiske stoffer såsom én eller flere ioner, elementer, mineraler og/eller forbindelser. | nogle tilfælde omfatter rOVD pulversammensætningen mindre end 5%, 4,5%, 4%, 3,5%, 3%, 2,5%, 2%, 1,5%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25% eller 0,1% aske vægt pr. totalvægt (w/w) og/eller vægt pr. totalvolumen (w/v). nogle udførelsesformer kan fugtindholdet i en rOVD pulversammensætning være mindre end 15%. rOVD pulversammensætningen kan have mindre end 15%, 12%, 10%, 8%, 6%, 5%, 3%, 2% eller 1% fugt vægt pr. totalvægt (w/w) og/eller vægt pr. totalvolumen (w/v). I nogle udførelsesformer kan crbonhydrat-indholdet i en rOVD pulversammensætning være mindre end 30%. rOVD pulversammensætningn kan have mindre end 30%, 27%, 25%, 22%, 20%, 17%, 15%, 12%, 10%, 8%, 5%, 3% eller 1% carbonhydrat-indhold w/w eller w/v.
I nogle tilfælde kan proteinindholdet i en rOVD pulversammensætning være 30% til 99% vægt pr. totalvægt (w/w) og/eller vægt pr. totalvolumen (w/v). I nogle tilfælde kan proteinindholdet i en rOVD pulversammensætning være i det mindste 30% w/w eller w/v. I nogle tilfælde kan proteinindholdet i en rOVD pulversammensætning være maksimalt 99% w/w eller w/v. | nogle tilfælde kan — proteinindholdet i en rOVD pulversammensætning være 30% til 40%, 30% til 50%, 30% til 60%,
29 DK 202300014 Y3 30% til 70%, 30% til 75%, 30% til 80%, 30% til 85%, 30% til 90%, 30% til 95%, 30% til 99%, 40% til 50%, 40% til 60%, 40% til 70%, 40% til 75%, 40% til 80%, 40% til 85%, 40% til 90%, 40% til 95%, 40% til 99%, 50% til 60%, 50% til 70%, 50% til 75%, 50% til 80%, 50% til 85%, 50% til 90%, 50% til 95%, 50% til 99%, 60% til 70%, 60% til 75%, 60% til 80%, 60% til 85%, 60% til 90%, 60% til 95%, 60% til 99%, 70% til 90%, 70% til 95%, 70% til 99%, 75% til 80%, 75% til 90%, 75% til 95%, 75% til 99%, 80% til 85%, 80% til 90%, 80% til 95%, 80% til 99%, 85% til 90%, 85% til 95%, 85% til 99%, 90% til 95%, 90% til 99% eller 95% til 99% w/w eller w/v. | nogle tilfælde kan proteinindholdet i en rOVD pulversammensætning være omkring 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% eller 99% w/w eller w/v. I nogle tilfælde kan proteinindholdet i en rOVD pulversammensætning være mindst 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 5%, 80%, 85%, 90% eller 95% w/w eller w/v. | nogle tilfælde kan proteinindholdet i en rOVD pulversammensætning være kan være maksimalt 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% eller 99% w/w eller w/v.
Yderligere komponenter i sammensætninger
De konsumerbare fødevaresammensætninger indeholdende rOVD offentliggjort heri og frem- gangsmåder til fremstilling af sådanne sammensætninger kan inkludere tilføjelse eller blanding af rOVD'et med én eller flere ingredienser. Eksempelvis kan fødevareadditiver tilføjes i eller blandes med sammensætningerne. Fødevareadditiver kan tilføre volumen og/eller masse til en sammen- sætning. Et fødevareadditiv kan forbedre funktionel ydelse og/eller fysiske egenskaber. Eksem- pelvis kan et fødevareadditiv forhindre gelering eller forøget viskositet på grund af lipiddelen af lipoproteiner ved fryse-optøningscyklusen. Et antikagedannelsesmiddel kan tilføjes for at tilveje- bringe en fritflydende sammensætning. Carbonhydrater kan tilføjes for at øge modstandsevne mod varmebeskadigelse, eksempelvis mindre protein-denaturering under tørring, og forbedre stabilitet og strømningsevne for tørrede sammensætninger. Fødevareadditiver inkluderer, men er ikke begrænset til, fødevarefarvestoffer, pH justeringsmidler, naturlige smagsstoffer, kunstige smagsstoffer, smagsfremmere, portionsmarkører, fødevaresyre, fyldmateriale, antikagedannel- sesmiddel (eksempelvis natriumsilico-aluminat), antigroningsmiddel (eksempelvis citronsyre), fødevarestabilisatorer, skumstabilisatorer eller bindingsmidler, antioxidanter, syreregulerende midler, klumpningsmiddel, farvetilbageholdelsesmiddel, piskningsmiddel (eksempelvis ester-type- — bindingsmiddel, triethylcitrat, natriumlaurylsulfat), emulgatorer (eksempelvis lecithin), fugtbeva- rende middel, fortykkelsesmiddel, excipient, fast diluent, salte, næringsmidler, sødemidler, glaseringsmiddel, konserveringsmiddel, vitaminer, diætiske elementer, carbonhydrater, polyoler, gummier, stivelser, mel, olie eller klid.
DK 202300014 Y3 40
Fødevarefarvning omfatter, men er ikke begrænset til, FD&C Yellow #5, FD&C Yellow #6, FD&C
Red #40, FD&C Red #3, FD&C Blue No. 1, FD&C Blue No. 2, FD&C Green No. 3, carotenoider (eksempelvis saffran, B-caroten), anthocyaniner, annatto, betanin, sommerfugleærte, karamel- farve, chlorophyllin, hyldebærsaft, lycopen, carmin, pandan, paprika, gurkemeje, curcuminoider, — quinolingul, carmoisin, Ponceau 4R, Patent Blue V og Green S.
Ingredienser til pH justering omfatter, men er ikke begrænset til, trisbuffer, kallumphosphat, na- triumhydroxid, kaliumhydroxid, citronsyre, natriumcitrat, natriumbicarbonat og saltsyre. — Salte inkluderer, men er ikke begrænset til, syresalte, alkalisalte, organiske salte, uorganiske salte, phosphater, chloridsalte, natriumsalte, natriumchlorid, kaliumsalte, kaliumchlorid, magne- siumsalte, magnesiumchlorid, magnesiumperchlorat, calciumsalte, calciumchlorid, ammonium- chlorid, jernsalte, jernchlorider, zinksalte og zinkchlorid. — Næringsmidler omfatter, men er ikke begrænset til, makronæringsmidler, mikronæringsmidler, essentielle næringsmidler, ikke-essentielle næringsmidler, diætisk fiber, aminosyre, essentielle fedtsyre, omega-3 fedtsyrer og konjugeret linolsyre.
Sødestoffer omfatter, men er ikke begrænset til, sukkererstatning, kunstigt sødemiddel, ace- sulfam-kalium, advantam, alitam, aspartam, natriumcyclamat, dulcin, glucin, neohesperidin-di- hydrochalcon, neotam, P-4000, saccharin, aspartam-acesulfamsalt, sucralose, brazzein, cur- culin, glycyrrhizin, glycerol, inulin, mogrosid, mabinlin, malto-oligosaccharid, mannitol, miraculin, monatin, monellin, osladin, pentadin, stevia, trilobatin og thaumatin. > Carbonhydrater inkluderer, men er ikke begrænset til, sukker, sucrose, glucose, fructose, galac- tose, lactose, maltose, mannose, allulose, tagatose, xylose, arabinose, højfructose-majssirup, maltose-majssirup, majssirup. (eksempelvis glucose-fri majssirup), sialinsyre, monosaccharider, disaccharider og polysaccharider (eksempelvis polydextrose, maltodextrin).
Polyoler inkluderer, men er ikke begrænset til xylitol, maltitol, erythritol, sorbitol, threitol, arabitol, hydrogenerede stivelseshydrolysater, isomalt, lactitol, mannitol og galactitol (dulcitol).
Gummier inkluderer, men er ikke begrænset til, gummi arabicum, gellangummi, guargummi,
Johannesbrød gummi, acaciagummi, cellulosegummi og xanthangummi.
aA DK 202300014 Y3
Vitaminer inkluderer, men er ikke begrænset til, niacin, riboflavin, pantothensyre, thiamin, folinsyre, vitamin A, vitamin B6, vitamin B12, vitamin D, vitamin E, lutein, zeaxanthin, cholin, inositol og biotin.
Diætiske elementer inkluderer, men er ikke begrænset til, calcium, Jern, magnesium, phosphor, kalium, natrium, zink, kobber, mangan, selen, chlor, iod, svovl, cobolt, molybdæn, nikkel og brom.
Emballering
En af fordelene ved de konsumerbare sammensætninger offentliggjort heri er, at de tillader enklere — emballering. | ét tilfælde kan en konsumerbar væskesammensætning offentliggjort heri emballeres i en klar beholder idet den manglende turbiditet i sammensætningen resulterer i et mere konsumer- appellerende produkt.
En konsumerbar sammensætning kan køles, fryses, opbevares varmt, opbevares ved rumtem- — peratur eller fastholdes ved en opvarmet temperatur.
En rOVD sammensætning kan emballeres som et pulver, en koncentreret sirup, et konsumer- bart fødevareprodukt, en drikkevare, en klar-til-brug fødevare, en ingrediens eller et færdigt produkt.
Rekombinant OVD og OVL en vilkårlig sammensætning beskrevet heri kan proteinet være rekombinant udtrykt i en værtscelle. Det rekombinante protein kan være OVD, et første ikke-rekombinant protein (eksem- pelvis OVD) og et andet rekombinant protein, såsom lysozym (eksempelvis rOVL), eller OVD og i det mindste et andet protein kan begge være rekombinant producerede (eksempelvis rOVD og rOVL). rOVD eller rOVL kan have en aminosyresekvens fra en vilkarlig art. Eksempelvis kan et rOVD have en aminosyresekvens af OVD, som er naturlig for en fugl (fuglebaseret) eller et krybdyr eller naebdyr og et rOVL kan have en aminosyresekvens af OVL, som er naturlig for en fugl eller et krybdyr eller næbdyr. Et rOVD og/eller rOVL med en aminosyresekvens fra et fugle OVD og/eller OVL kan vælges fra gruppen bestående: fjerkræ, fugl, vandfugl, fuglevildt, kylling, vagtel, kalkun, kalkungrib, kollibri, and, struds, gås, måge, perlehøns, fasan, emu og en vilkårlig kombination deraf. Et rOVD og/eller rOVL kan have en aminosyresekvens, som er naturlig for en enkelt art, såsom Gallus gallus
4 DK 202300014 Y3 domesticus. Alternativt, kan et rOVD og/eller rOVL have en aminosyresekvens, som er naturlig for to eller flere arter og som sådan være en hybrid.
Eksempler på OVD og OVL aminosyresekvenser, som er påtænkt heri, er vist i tabel 1 nedenfor som SEQ ID NO: 1-44 hhv. 45-51.
DK 202300014 Y3 43
Tabel 1: Sekvenser
Sekvens- SEKVENSER beskrivelse
Ovomucoid SEQ ID [AEVDCSRFPNATDKEGKDVLVYCNKDLRPICGTDGVTYTNDCLLCAYSIEFGT (kanonisk) NO: 1 |NISKEHDGECKETVPMNCSSYANTTSEDGKVMVLCNRAFNPVCGTDGVTYD moden kylling NECLLCAHKVEQGASVDKRHDGGCRKELAAVSVDCSEYPKPDCTAEDRPLC
OVD GSDNKTYGNKCNFCNAVVESNGTLTLSHFGKC
Ovomucoid variant | SEQ ID [AEVDCSRFPNATDMEGKDVLVCNKDLRPICGTDGVTYTNDCLLCAYSVEFGT af SEQ ID 1 NO: 2 |NISKEHDGECKETVPMNCSSYANTTSEDGKVMVLCNRAFNPVCGTDGVTYD
NECLLCAHKVEQGASVDKRHDGGCRKELAAVSVDCSEYPKPDCTAEDRPLC
GSDNKTYGNKCNFCNAVVESNGTLTLSHFGKC
G162M F167A SEQ ID [AEVDCSRFPNATDMEGKDVLVCNKDLRPICGTDGVTYTNDCLLCAYSVEFGT
Ovomucoid variant | NO: 3 [NISKEHDGECKETVPMNCSSYANTTSEDGKVMVLCNRAFNPYCGTDGVTYD af kylling OVD i NECLLCAHKVEQGASVDKRHDGGCRKELAAVSVDCSEYPKPDCTAEDRPLC genbank GSDNKTYMNKCNACNAVVESNGTLTLSHFGKC
Ovomucoid SEQ ID MAMAGVFVLFSFVLCGFLPDAAFGAEVDCSRFPNATDKEGKDVILVCNKDLR isoform 1 NO: 4 |PICGTDGVTYTNDCLLCAYSIEFGTNISKEHDGECKETVPMNCSSYANTTSED forløber fuld GKVMVLCNRAFNPVCGTDGVTYDNECLLCAHKVEQGASVDKRHDGGCRKE længde LAAVSVDCSEYPKPDCTAEDRPLCGSDNKTYGNKCNFCNAVVESNGTLTLSH
FGKC
Ovomucoid SEQ ID MAMAGVFVLFSFVLCGFLPDAVFGAEVDCSRFPNATDMEGKDVLVCNKDLR [Gallus gallus] NO: 5 |PICGTDGVTYTNDCLLCAYSVEFGTNISKEHDGECKETVPMNCSSYANTTSED
GKVMVLCNRAFNPVCGTDGVTYDNECLLCAHKVEQGASVDKRHDGGCRKE
LAAVSVDCSEYPKPDCTAEDRPLCGSDNKTYGNKCNFCNAVVESNGTLTLSH
FGKC
Ovomucoid isoform| SEQ ID |IMMAMAGVFVLFSFVLCGFLPDAAFGAEVDCSRFPNATDKEGKDVLVCNKDLR 2 forløber NO: 6 |PICGTDGVTYTNDCLLCAYSIEFGTNISKEHDGECKETVPMNCSSYANTTSED [Gallus gallus] GKVMVLCNRAFNPVCGTDGVTYDNECLLCAHKVEQGASVDKRHDGGCRKE
LAAVDCSEYPKPDCTAEDRPLCGSDNKTYGNKCNFCNAVVESNGTLTLSHFG
KC
Ovomucoid SEQ ID [AEVDCSRFPNATDKEGKDVLVCNKDLRPICGTDGVYTYNNECLLCAYSIEFGT [Gallus gallus] NO: 7 |NISKEHDGECKETVPMNCSSYANTTSEDGKVMVLCNRAFNPVCGTDGVTYD
NECLLCAHKVEQGASVDKRHDGECRKELAAVSVDCSEYPKPDCTAEDRPLC
GSDNKTYGNKCNFCNAVVESNGTLTLSHFGKC
Ovomucoid SEQ ID MAMAGVFVLFSFALCGFLPDAAFGVEVDCSRFPNATNEEGKDVLVCTEDLRP [Numida NO: 8 |[ICGTDGVTYSNDCLLCAYNIEYGTNISKEHDGECREAVPVDCSRYPNMTSEEG meleagris] KVLILCNKAFNPVCGTDGVTYDNECLLCAHNVEQGTSVGKKHDGECRKELA
AVDCSEYPKPACTMEYRPLCGSDNKTYDNKCNFCNAVVESNGTLTLSHFGK C
FORUDSAGT: SEQ ID MQTITWRQPQGDHLRSRAPAATCRAGQYLTMAMAGIFVLFSFALCGFLPDAA
Ovomucoid NO: 9 |FGVEVDCSRFPNTTNEEGKDVLVCTEDLRPICGTDGVTHSECLLCAYNIEYGT isoform X1 NISKEHDGECREAVPMDCSRYPNTTNEEGKVMILCNKALNPVCGTDGVTYD [Meleagris NECVLCAHNLEQGTSVGKKHDGGCRKELAAVSVDCSEYPKPACTLEYRPLC gallopavo] GSDNKTYGNKCNFCNAVVESNGTLTLSHFGKC
Ovomucoid SEQ ID VEVDCSRFPNTTNEEGKDVLVCTEDLRPICGTDGVTHSECLLCAYNIEYGTNIS [Meleagris NO: 10 KEHDGECREAVPMDCSRYPNTTSEEGKVMILCNKALNPVYCGTDGVTYDNEC gallopavo] VLCAHNLEQGTSVGKKHDGECRKELAAVSVDCSEYPKPACTLEYRPLCGSDN
KTYGNKCNFCNAVVESNGTLTLSHFGKC
DK 202300014 Y3 44
FORUDSAGT: SEQ ID MQTITWRQPQGDHLRSRAPAATCRAGQYLTMAMAGIFVLFSFALCGFLPDAA
Ovomucoid NO: 11 FGVEVDCSRFPNTTNEEGKDVLVYCTEDLRPICGTDGVTHSECLLCAYNIEYGT isoform X2 NISKEHDGECREAVPMDCSRYPNTTNEEGKVMILCNKALNPVCGTDGVTYD [Meleagris NECVLCAHNLEQGTSVGKKHDGGCRKELAAVDCSEYPKPACTLEYRPLCGS gallopavo] DNKTYGNKCNFCNAVVESNGTLTLSHFGKC
Ovomucoid SEQ ID EYGTNISIKHNGECKETVPMDCSRYANMTNEEGKVYMMPCDRTYNPVCGTDG [Bambusicola NO: 12 |VTYDNECQLCAHNVEQGTSVDKKHDGVCGKELAAVSVDCSEYPKPECTAEE horacicus] RPICGSDNKTYGNKCNFCNAVVYVQP
Ovomucoid SEQ ID VDCSRFPNTTNEEGKDVLACTKELHPICGTDGVTYSNECLLCYYNIEYGTNIS [Callipepla NO: 13 |KEHDGECTEAVPVDCSRYPNTTSEEGKVLIPCNRDFNPVCGSDGVTYENECLL squamata] CAHNVEQGTSVGKKHDGGCRKEFAAVSVDCSEYPKPDCTLEYRPLCGSDNK
ITYASKCNFCNAVVIWEQEKNTRHHASHSVFFISARLVC
Ovomucoid SEQ ID |[MLPLGLREYGTNTSKEHDGECTEAVPVDCSRYPNTTSEEGKVRILCKKDINPV [Colinus NO: 14 |CGTDGVTYDNECLLCSHSVGQGASIDKKHDGGCRKEFAAVSVDCSEYPKPAC virginianus] MSEYRPLCGSDNKTYVNKCNFCNAVWVYVQPWLHSRCRLPPTGTSFLGSEGRE
TSLLTSRATDLQVAGCTAISAMEATRAAALLGLVLLSSFCELSHLCFSQASCD
VYRLSGSRNLACPRIFQPVCGTDNVTYPNECSLCRQMLRSRAVYKKHDGRCV
KVDCTGYMRATGGLGTACSQQYSPLYATNGVIYSNKCTFCSAVANGEDIDLL
AVKYPEEESWISVSPTPWRMLSAGA
Ovomucoid-lign. SEQ ID MSWWGIKPALERPSQEQSTSGQPVDSGSTSTTTMAGIFVLLSLVLCCFPDAAF isoform X2 [Anser | NO: 15 | GVEVDCSRFPNTTNEEGKEVLLCTKDLSPICGTDGVTYSNECLLCAYNIEYGT cygnoides NISKDHDGECKEAVPVDCSTYPNMTNEEGKVMLVCNKMFSPVCGTDGVTYD domesticus] NECMLCAHNVEQGTSVGKKYDGKCKKEVATVDCSDYPKPACTVEYMPLCG
SDNKTYDNKCNFCNAVVDSNGTLTLSHFGKC
Ovomucoid-lign. SEQ ID MSSQNQLHRRRRPLPGGQDLNKYYWPHCTSDRFSWLLHVTAEQFRHCVCIY isoform X1 [Anser | NO: 16 LQPALERPSQEQSTSGQPVDSGSTSTTTMAGIFVLLSLVLCCFPDAAFGVEVDC cygnoides SRFPNTTNEEGKEVLLCTKDLSPICGTDGVTYSNECLLCAYNIEYGTNISKDHD domesticus] GECKEAVPVDCSTYPNMTNEEGKVMLVCNKMFSPVCGTDGVTYDNECMLC
AHNVEQGTSVGKKYDGKCKKEVATVDCSDYPKPACTVEYMPLCGSDNKTY
DNKCNFCNAVVDSNGTLTLSHFGKC
Ovomucoid SEQ ID VEVDCSRFPNTTNEEGKDEVVCPDELRLICGTDGVTYNHECMLCFYNKEYGT [Coturnix NO: 17 INISKEQDGECGETVPMDCSRYPNTTSEDGKVTILCTKDFSFVCGTDGVTYDNE japonica] CMLCAHNVVQGTSVGKKHDGECRKELAAVSVDCSEYPKPACPKDYRPVCGS
DNKTYSNKCNFCNAVVESNGTLTLNHFGKC
Ovomucoid SEQ ID MAMAGVFLLFSFALCGFLPDAAFGVEVDCSRFPNTTNEEGKDEVVCPDELRLI [Coturnix NO: 18 ICGTDGVTYNHECMLCFYNKEYGTNISKEQDGECGETVPMDCSRYPNTTSED japonica] GKVTILCTKDFSFVCGTDGVTYDNECMLCAHNIVQGTSVGKKHDGECRKEL
AAVSVDCSEYPKPACPKDYRPVCGSDNKTYSNKCNFCNAVVESNGTLTLNHF
GKC
Ovomucoid [Anas | SEQ ID |MMAGVFVLLSLVLCCFPDAAFGVEVDCSRFPNTTNEEGKDVLLCTKELSPVCG platyrhynchos] NO: 19 [TDGVTYSNECLLCAYNIEYGTNISKDHDGECKEAVPADCSMYPNMTNEEGK
MTLLCNKMFSPVCGTDGVTYDNECMLCAHNVEQGTSVGKKYDGKCKKEVA
TVDCSGYPKPACTMEYMPLCGSDNKTYGNKCNFCNAVVDSNGTLTLSHFGE C
Ovomucoid, SEQ ID |QVDCSRFPNTTNEEGKEVLLCTKELSPVCGTDGVTYSNECLLCAYNIEYGTNI partiel [Anas NO: 20 |SKDHDGECKEAVPADCSMYPNMTNEEGKMTLLCNKMFSPVCGTDGVTYDN platyrhynchos] ECMLCAHNVEQGTSVGKKYDGKCKKEVATVSVDCSGYPKPACTMEYMPLC
GSDNKTYGNKCNFCNAVV
Ovomucoid-lign. SEQ ID [MTMPGAFVVLSFVLCCFPDATFGVEVDCSTYPNTTNEEGKEVLVCSKILSPIC [Tyto alba] NO: 21 |(GTDGVTYSNECLLCANNIEYGTNISKYHDGECKEFVPVNCSRYPNTTNEEGK
VMLICNKDLSPVCGTDGVTYDNECLLCAHNLEPGTSVGKKYDGECKKEIATV
DCSDYPKPVCSLESMPLCGSDNKTYSNKCNFCNAVVDSNETLTLSHFGKC
Ovomucoid SEQ ID [MTMAGVFVLLSFALCCFPDAAFGVEVDCSTYPNTTNEEGKEVLVCTKILSPIC [Balearica NO: 22 |(GTDGVTYSNECLLCAYNIEYGTNVSKDHDGECKEVVPVDCSRYPNSTNEEGK regulorum VVMLCSKDLNPVCGTDGVTYDNECVLCAHNVESGTSVGKKYDGECKKETA gibbericeps] TVDCSDYPKPACTLEYMPFCGSDSKTYSNKCNFCNAVVDSNGTLTLSHFGKC
DK 202300014 Y3 45
Kalkungrib SEQ ID |MMTTAGVFVLLSFALCSFPDAAFGVEVDCSTYPNTTNEEGKEVLVCTKILSPI [Cathartes NO: 23 CGTDGVTYSNECLLCAYNIEYGTNVSKDHDGECKEFVPVDCSRYPNTTNEDG aura] OVD KVVLLCNKDLSPICGTDGVTYDNECLLCARNLEPGTSVGKKYDGECKKEIAT (naturlig VDCSDYPKPVCSLEYMPLCGSDSKTYSNKCNFCNAVVDSNGTLTLSHFGKC sekvens) naturlig er med fed skrift
Ovomucoid-lign. SEQ ID MTTAGVFVLLSFTLCSFPDAAFGVEVDCSPYPNTTNEEGKEVLVCNKILSPICG [Cuculus canorus] | NO: 24 |[TDGVTYSNECLLCAYNLEYGTNISKDYDGECKEVAPVDCSRHPNTTNEEGKV
ELLCNKDLNPICGTNGVTYDNECLLCARNLESGTSIGKKYDGECKKEIATVDC
SDYPKPVCTLEEMPLCGSDNKTYGNKCNFCNAVVDSNGTLTLSHFGKC
Ovomucoid SEQ ID MTTAVVFVLLSFALCCFPDAAFGVEVDCSTYPNSTNEEGKDVLVCPKILGPIC [Antrostomus NO: 25 |GTDGVTYSNECLLCAYNIQYGTNVSKDHDGECKEIVPVDCSRYPNTTNEEGK carolinensis] VVFLCNKNFDPVCGTDGDTYDNECMLCARSLEPGTTVGKKHDGECKREIAT
VDCSDYPKPTCSAEDMPLCGSDSKTYSNKCNFCNAVVDSNGTLTLSRFGKC
Ovomucoid SEQ ID |MTMTGVFVLLSFAICCFPDAAFGVEVDCSTYPNTTNEEGKEVLVCTKILSPICG [Cariama cristata] | NO: 26 [TDGVTYSNECLLCAYNIEYGTNVSKDHDGECKEVVPVYDCSKYPNTTNEEGKY
VLLCSKDLSPVCGTDGVTYDNECLLCARNLEPGSSVGKKYDGECKKEIATIDC
SDYPKPVCSLEYMPLCGSDSKTYDNKCNFCNAVVDSNGTLTLSHFGKC
Ovomucoid-lign. SEQ ID MTTAGVFVLLSFVLCCFPDAVFGVEVDCSTYPNTTNEEGKEVLVCTKILSPIC isoform X2 NO: 27 |GTDGVTYSNECLLCAYNIEYGTNVSKDHDGECKEVVPVNCSRYPNTTNEEGK [Pygoscelis VVLRCSKDLSPVCGTDGVTYDNECLMCARNLEPGAVVGKNYDGECKKEIAT adeliae] VDCSDYPKPVCSLEYMPLCGSDSKTYSNKCNFCNAVVDSNGTLTLSHFGKC
Ovomucoid-lign. SEQ ID |MTTAGVFVLLSIALCCFPDAAFGVEVDCSAYSNTTSEEGKEVLSCTKILSPICG [Nipponia nippon] | NO: 28 [TDGVTYSNECLLCAYNIEYGTNISKDHDGECKEVVSVDCSRYPNTTNEEGKA
VLLCNKDLSPVCGTDGVTYDNECLLCAHNLEPGTSVGKKYDGACKKEIATV
DCSDYPKPVCTLEYLPLCGSDSKTYSNKCDFCNAVVDSNGTLTLSHFGKC
Ovomucoid-lign. SEQ ID MTTAGVFVLLSFALCCFPDAAFGVEVDCSTYPNTTNEEGKEVLVCTKILSPIC [Phaethon NO: 29 |GTDGTTYSNECLLCAYNIEYGTNVSKDHDGECKVVPVDCSKYPNTTNEDGK lepturus] VVLLCNKALSPICGTDRVTYDNECLMCAHNLEPGTSVGKKHDGECQKEVAT
VDCSDYPKPVCSLEYMPLCGSDGKTYSNKCNFCNAVVNSNGTLTLSHFEKC
Ovomucoid-lign. SEQ ID |IMTTAGVFVLLSFVLCCFFPDAAFGVEVDCSTYPNTTNEEGKEVLVCAKILSPV isoform X1 NO: 30 |ICGTDGVTYSNECLLCAHNIENGTNVGKDHDGKCKEAVPVDCSRYPNTTDEE [Melopsittacus GKVVLLCNKDVSPVCGTDGVTYDNECLLCAHNLEAGTSVDKKNDSECKTED undulatus] TTLAAVSVDCSDYPKPVCTLEYLPLCGSDNKTYSNKCRFCNAVVDSNGTLTL
SRFGKC
Ovomucoid SEQ ID MTTAGVFVLLSFALCCSPDAAFGVEVDCSTYPNTTNEEGKEVLACTKILSPIC [Podiceps NO: 31 |GTDGVTYSNECLLCAYNMEYGTNVSKDHDGKCKEVVPVDCSRYPNTTNEEG cristatus] KVVLLCNKDLSPVCGTDGVTYDNECLLCARNLEPGASVGKKYDGECKKEIA
TVDCSDYPKPVCSLEHMPLCGSDSKTYSNKCTFCNAVVDSNGTLTLSHFGKC
Ovomucoid-lign. SEQ ID MTTAGVFVLLSFALCCFPDAAFGVEVDCSTYPNTTNEEGREVLVCTKILSPIC [Fulmarus NO: 32 |GTDGVTYSNECLLCAYNIEYGTNVSKDHDGECKEVAPVGCSRYPNTTNEEGK glacialis] VVLLCNKDLSPVCGTDGVTYDNECLLCARHLEPGTSVGKKYDGECKKEIATV
DCSDYPKPVCSLEYMPLCGSDSKTYSNKCNFCNAVLDSNGTLTLSHFGKC
Ovomucoid SEQ ID MTTAGVFVLLSFALCCFPDAVFGVEVDCSTYPNTTNEEGKEVLVCTKILSPIC [Aptenodytes NO: 33 |GTDGVTYSNECLLCAYNIEYGTNVSKDHDGECKEVVPVDCSRYPNTTNEEGK forsteri] VVLRCNKDLSPVCGTDGVTYDNECLMCARNLEPGAIVGKKYDGECKKEIAT
VDCSDYPKPVCSLEYMPLCGSDSKTYSNKCNFCNAVVDSNGTLILSHFGKC
Ovomucoid-lign. SEQ ID MTTAGVFVLLSFVLCCFPDAVFGVEVDCSTYPNTTNEEGKEVLVCTKILSPIC isoform X1 NO: 34 |GTDGVTYSNECLLCAYNIEYGTNVSKDHDGECKEVVPVDCSRYPNTTNEEGK [Pygoscelis VVLRCSKDLSPVCGTDGVTYDNECLMCARNLEPGAVVGKNYDGECKKEIAT adeliae] VDCSDYPKPVCSLEYMPLCGSDSKTYSNKCNFCNAVVDSNGTLTLSHFGKC
Ovomucoid SEQ ID [MSSQNQLPSRCRPLPGSQDLNKYYQPHCTGDRFCWLFYVTVEQFRHCICIYLQ isoform X1 NO: 35 |LALERPSHEQSGQPADSRNTSTMTTAGVFVLLSFALCCFPDAVFGVEVDCSTY [Aptenodytes PNTTNEEGKEVLVCTKILSPICGTDGVTYSNECLLCAYNIEYGTNVSKDHDGE forsteri] CKEVVPVDCSRYPNTTNEEGKVVLRCNKDLSPVCGTDGVTYDNECLMCARN
LEPGAIVGKKYDGECKKEIATVDCSDYPKPVCSLEYMPLCGSDSKTYSNKCN
FCNAVVDSNGTLILSHFGKC
DK 202300014 Y3 46
Ovomucoid, SEQ ID MTTAVVFVLLSFALCCFPDAAFGVEVDCSTYPNSTNEEGKDVLVCPKILGPIC partiel NO: 36 |GTDGVTYSNECLLCAYNIQYGTNVSKDHDGECKEIVPVDCSRYPNTTNEEGK [Antrostomus VVFLCNKNFDPVCGTDGDTYDNECMLCARSLEPGTTVGKKHDGECKREIAT carolinensis] VDCSDYPKPTCSAEDMPLCGSDSKTYSNKCNFCNAVV
FOVD som SEQ ID [EAEAAEVDCSRFPNATDKEGKDVLVCNKDLRPICGTDGVTYTNDCLLCAYSI udtrykt i NO: 37 [EFGTNISKEHDGECKETVPMNCSSYANTTSEDGKVMVLCNRAFNPVCGTDGV pichia sekreteret |TYDNECLLCAHKVEQGASVDKRHDGGCRKELAAVSVDCSEYPKPDCTAEDR form 1 PLCGSDNKTYGNKCNFCNAVVESNGTLTLSHFGKC
FOVD som SEQ ID EEGVSLEKREAEAAEVDCSRFPNATDKEGKDVLVCNKDLRPICGTDGVTYTN udtrykt i NO: 38 |IDCLLCAYSIEFGTNISKEHDGECKETVPMNCSSYANTTSEDGKVMVLCNRAF pichia sekreteret NPVCGTDGVTYDNECLLCAHKVEQGASVDKRHDGGCRKELAAVSVDCSEYP form 2 KPDCTAEDRPLCGSDNKTYGNKCNFCNAVVESNGTLTLSHFGKC rovD [gallus] SEQ ID MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVA kodningssekvens,| NO: 39 VLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAAEVDCSRFPNATDK som indeholder EGKDVLVCNKDLRPICGTDGVTYTNDCLLCAYSIEFGTNISKEHDGECKETVP en alpha parrings- MNCSSYANTTSEDGKVMVLCNRAFNPVCGTDGVTYDNECLLCAHKVEQGA signalsekvens SVDKRHDGGCRKELAAVSVDCSEYPKPDCTAEDRPLCGSDNKTYGNKCNFC (fed skrift) som NAVVESNGTLTLSHFGKC udtrykt i pichia
Kalkungrib SEQ ID MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVA
OVD kodnings- NO: 40 VLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAVEVDCSTYPNTTNE sekvens, som EGKEVLVCTKILSPICGTDGVTYSNECLLCAYNIEYGTNVSKDHDGECKEFVP indeholder VDCSRYPNTTNEDGKVVLLCNKDLSPICGTDGVTYDNECLLCARNLEPGTSV sekretionssignaler GKKYDGECKKEIATVDCSDYPKPVCSLEYMPLCGSDSKTYSNKCNFCNAVV som udtrykt i DSNGTLTLSHFGKC pichia fed skrift er en alpha- parringsfaktor- signalsekvens
Kalkungrib SEQ ID IEAEAVEVDCSTYPNTTNEEGKEVLVCTKILSPICGTDGVTYSNECLLCAYNIE
OVD i sekreteret | NO: 41 |YGTNVSKDHDGECKEFVPVDCSRYPNTTNEDGKVVLLCNKDLSPICGTDGVT
Form udtrykt i DNECLLCARNLEPGTSVGKKYDGECKKEIATVDCSDYPKPVCSLEYMPLCG
Pichia SDSKTYSNKCNFCNAVVDSNGTLTLSHFGKC
Kollibri OVD SEQ ID MTMAGVFVLLSFILCCFPDTAFGVEVDCSIYPNTTSEEGKEVLVCTETLSPIC (naturlig sekvens)| NO: 42 |GSDGVTYNNECQLCAYNVEYGTNVSKDHDGECKEIVPVDCSRYPNTTEEGR fed skrift er den VVMLCNKALSPVCGTDGVTYDNECLLCARNLESGTSVGKKFDGECKKEIAT naturlige signal- VDCTDYPKPVCSLDYMPLCGSDSKTYSNKCNFCNAVMDSNGTLTLNHFGKC sekvens
Kollibri OVD SEQ ID MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVA kodningssekvens | NO: 43 VLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLDKREAEAVEVDCSIYPNTTSEE som udtrykt i GKEVLVCTETLSPICGSDGVTYNNECQLCAYNVEYGTNVSKDHDGECKEIVP
Pichia fed skrift VDCSRYPNTTEEGRVVMLCNKALSPVCGTDGVTYDNECLLCARNLESGTSV er en alpha- GKKFDGECKKEIATVDCTDYPKPVCSLDYMPLCGSDSKTYSNKCNFCNAVM parringsfaktor- DSNGTLTLNHFGKC signal- sekvens
Kollibri OVD SEQ ID EAEAVEVDCSIYPNTTSEEGKEVLVCTETLSPICGSDGVTYNNECQLCAYNVE i sekreteret form | NO: 44 |YGTNVSKDHDGECKEIVPVDCSRYPNTTEEGRVVMLCNKALSPVCGTDGVT fra Pichia DNECLLCARNLESGTSVGKKFDGECKKEIATVDCTDYPKPVCSLDYMPLCG
SDSKTYSNKCNFCNAVMDSNGTLTLNHFGKC rOVL som eks- SEQ ID |MMRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVA primeret i pichia | NO: 45 VLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLDKREAEAKVFGRCELAAAMK fed skrift er en RHGLDNYRGYSLGNWVCAAKFESNFNTQATNRNTDGSTDYGILQINSRWWC alpha-parrings- NDGRTPGSRNLCNIPCSALLSSDITASVNCAKKIVSDGNGMNAWVAWRNRCK faktorsignal- GTDVQAWIRGCRL sekvens
DK 202300014 Y3 47 rOVL som fundet SEQ ID EAEAKVFGRCELAAAMKRHGLDNYRGYSLGNWVCAAKFESNFNTQATNRN efter sekretion fra NO: 46 [TDGSTDYGILQINSRWWCNDGRTPGSRNLCNIPCSALLSSDITASVNCAKKIVS
Pichia DGNGMNAWVAWRNRCKGTDVQAWIRGCRL
Lysozym (OVL) SEQ ID [KVFGRCELAAAMKRHGLDNYRGYSLGNVWCAAKFESNFNTQATNRNTDGS fra Gallus gallus NO: 47 |[TDYGILQINSRWWCNDGRTPGSRNLCNIPCSALLSSDITASVNCAKKIVSDGN (uden GMNAWVAWRNRCKGTDVQAWIRGCRL signalsekvens)
Lysozym SEQ ID |KVFGRCELAAAMKRHGLDNYRGYSLGNWVCVAKFESNFNTQATNRNTDGS
NO: 48 [TDYGILQINSRWWCNDGRTPGSRNLCNIPCSALLSSDITASVNCAKKIVSDGN
GMSAWVAWRNRCKGTDVQAWIRGCRL
Lysozym C SEQ ID [KVFERCELARTLKRLGMDGYRGISLANWMCLAKWESGYNTRATNYNAGDR (Human) NO: 49 |STDYGIFQINSRYWCNDGKTPGAVNACHLSCSALLQDNIADAVACAKRVVRD
PQGIRAWVAWRNRCQNRDVRQYVQGCGV
Lysozyme C SEQ ID KVFERCELARTLKKLGLDGYKGVSLANWLCLTKWESSYNTKATNYNPSSEST (Bos taurus) NO: 50 |[DYGIFQINSKWWCNDGKTPNAVDGCHVSCRELMENDIAKAVACAKHIVSEQ
GITAWVAWKSHCRDHDVSSYVEGCTL
Lysozym (OVL) SEQ ID MRSLLILVLCFLPLAALGKVFGRCELAAAMKRHGLDNYRGYSLGNWVCAA fra Gallus gallus NO: 51 |[KFESNFNTQATNRNTDGSTDYGILQINSRWWCNDGRTPGSRNLCNIPCSALLS naturligt sekretions- SDITASVNCAKKIVSDGNGMNAWVAWRNRCKGTDVQAWIRGCRL signal er fed skrift
OCH1:EndoH SEQ ID MAKADGSLLYYNPHNPPRRYYFYMAIFAVSVICVLYGPSQQLSSPKIDASAPA fusionsprotein NO: 52 |PVKQGPTSVAYVEVNNNSMLNVGKYTLADGGGNAFDVAVIFAANINYDTGT
KTAYLHFNENVQRVLDNAVTQIRPLQQQGIKVLLSVLGNHQGAGFANFPSQQ
AASAFAKQLSDAVAKYGLDGVDFDDEYAEYGNNGTAQPNDSSFVHLVTALR
ANMPDKIISLYNIGPAASRLSYGGVDVSDKFDYAWNPYYGTWQVPGIALPKA
QLSPAAVEIGRTSRSTVADLARRTVDEGYGVYLTYNLDGGDRTADVSAFTRE
LYGSEAVRTP
Et rOVD eller rOVL kan inkludere yderligere sekvenser. Ekspression af rOVD og rOVL i en værtscelle, eksempelvis en Pichia art, en Saccharomyces art, en Trichoderma art, en Pseudomonas art, kan føre til en tilføjelse af peptider til OVD- eller OVL-sekvensen som en del af post-transkriptonale eller post-translationale modifikationer. Sådanne peptider kan eventuelt ikke være en del af de naturlige OVD- eller OVL-sekvenser.
Eksempelvis kan udryk af en OVD-sekvens i en Pichia art, såsom Komagataella phaffii og Komagataella pastoris, føre til tilføjelse af et peptid ved N-terminus eller C-terminus.
I nogle tilfælde bliver et tetrapeptid EAEA (SEQ ID NO: 53) tilføjet til N-terminus af OVD sekvensen ved udtryk i en værtscelle. | nogle udførelsesformer inkluderer rOVD eller rOVL eller begge aminosyrerne EAEA ved N-terminus. En OVD eller OVL proteinsekvens kan inkludere en signalsekvens, såsom til at dirigere sekretion fra en værtscelle. | nogle tilfælde kan signalsekvensen være en naturlig signalsekvens. | nogle tilfælde kan en signalsekvens være en heterolog signalsekvens. Eksempelvis kan en alpha-parringsfaktor-signalsekvens være fusioneret til en OVD- eller OVL-sekvens for udtryk og sekretion i en gærcelle, såsom en Pichia sp. | nogle tilfælde fjernes
DK 202300014 Y3 48 signalsekvensen som helhed eller delvis når proteinet, såsom et rOVD eller rOVL, sekreteres fra værtscellen.
Et rOVD og/eller rOVL kan være en ikke-naturligt forekommende variant af et OVD og/eller OVL. En sådan variant kan omfatte én eller flere aminosyreindsætninger, deletioner eller substitutioner i forhold til en naturlig OVD- eller naturlig OVL-sekvens.
En sådan rOVD variant kan have i det mindste 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% eller 99% sekvensidentitet med SEQ ID NO: 1-44. En rOVL variant kan have i det mindste 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% eller 99% sekvensidentitet med SEQ ID NO: 45-51. Udtrykket "sekvensidentitett” som anvendt heri i forbindelse med aminosyresekvenser er defineret som procentdelen af amino- syrerester i en kandidatsekvens, som er identiske med aminosyreresterne i en valgt sekvens, efter opretning af sekvenserne og indføring af mellemrum, hvis dette er nødvendigt, for at opnå den maksimale procentvise sekvensidentitet, og ikke ved betragtning af nogen konservative substitutioner som en del af sekvensidentiteten.
Opretning med henblik på at bestemme procent aminosyresekvensidentitet kan opnås på forskellige måder, som er indenfor det fagmandsmæssige område, eksempelvis under anvendelse af den offentligt tilgængelige computersoftware såsom BLAST,
BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 eller Megalign (DNASTAR) software. En fagmand indenfor området kan bestemme passende parametre for måling af opretning, inkl. enhver algoritme, som er nødvendig for at opnå maksimal opretning over den fulde længde af de sekvenser, som sammenlignes. | nogle udførelsesformer er en variant én, som tilvejebringer yderligere træk, såsom reduceret allergenicitet. Eksempelvis kan et rOVD omfatte G162M og/eller F167A (såsom SEQ ID NO: 3) i forhold til en vildtype OVD sekvens SEQ ID NO: 2 og have reduceret allergenicitet i sammenligning med vildtype OVD sekvensen.
Afhængigt af værtsorganismen, som anvendes til at udtrykke rOVD og/eller rOVL, kan rOVD og/eller rOVL have et glycosylations-, acetylations- eller phosphoryla- tionsmønster, som afviger fra vildtype OVD (eksempelvis naturligt OVD) eller vildtype
OVL (eksempelvis naturligt OVL). Eksempelvis kan rOVD og/eller rOVL heri være
DK 202300014 Y3 49 glycosyleret, acetyleret eller phosphoryleret eller ikke. Et rOVD og/eller rOVL kan have et fugle, ikke-fugle, mikrobielt, ikke-mikrobielt mammalt eller ikke-mammalt glycosyle- rings-, acetylerings- eller phosphorylerings-mønster.
Et rOVD og/eller rOVL er rekombinant udtrykt i en værtscelle. Som anvendt heri betegner en "vært" eller “vaertscelle” en vilkårlig protein-producerende vært, som er valgt eller genetisk modificeret til at producere et ønsket produkt. Eksempler på værter inkluderer svampe, såsom filamentøse svampe, såvel som bakterier, gær, planter, in- sekter og mammale celler. En værtscelle kan være Arxula spp., Arxula adeninivorans,
Kluyveromyces spp., Kluyveromyces lactis, Komagataella phaffii, Pichia spp., Pichia angusta, Pichia pastoris, Saccharomyces spp., Saccharomyces cerevisiae,
Schizosaccharomyces spp., Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia spp., Yarrowia lipolytica, Agaricus spp., Agaricus bisporus, Aspergillus spp., Aspergillus awamori,
Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae,
Bacillus subtilis, Colletotrichum spp., Colletotrichum gloeosporiodes, Endothia spp.,
Endothia parasitica, Escherichia coli, Fusarium spp., Fusarium graminearum, Fusarium solani, Mucor spp., Mucor miehei, Mucor pusillus, Myceliophthora spp., Myceliophthora thermophila, Neurospora spp., Neurospora crassa, Penicillium spp., Penicillium camemberti, Penicillium canescens, Penicillium chrysogenum, Penicillium (Talaromyces) emersonii, Penicillium funiculo sum, Penicillium purpurogenum,
Penicillium roqueforti, Pleurotus spp., Pleurotus ostreatus, Rhizomucor spp.,
Rhizomucor miehei, Rhizomucor pusillus, Rhizopus spp., Rhizopus arrhizus, Rhizopus oligosporus, Rhizopus oryzae, Trichoderma spp., Trichoderma altroviride, Trichoderma reesei eller Trichoderma vireus. En veertscelle kan være en organisme, som er godkendt som generelt anset som sikker af U.S. Food and Drug Administration.
Et rekombinant protein kan udtrykkes rekombinant i gær, flamentøse svampe eller en bakterie. | nogle udførelsesformer bliver rekombinant protein rekombinant udtrykt i en
Pichia art (Komagataella phaffii og Komagataella pastoris), en Saccharomyces art, en
Trichoderma art, en Trichoderma art, en Pseudomonas art eller en E. coli art.
En værtscelle kan transformeres til at inkludere én eller flere ekspressionskassetter.
Som eksempler kan en værtscelle transformeres til at udtrykke én ekspressions-
DK 202300014 Y3 50 kassette, to ekspressionskassetter, tre ekspressionskassetter eller flere ekspresions- kassetter. nogle tilfælde kan rOVD og/eller rOVL deglycosyleres eller modificeres i sin glyco- sylering (eksempelvis kemisk, enzymatisk via endoglucanaser (såsom EndoH), endo- glycosidaser, mannosidaser (såsom alpha-1,2 mannosidase), PNGase F, O-Glyco- sidase, OCH1, neuraminidase, f3, 1-4 galactosidase, f3-N-acetylglucosaminidaser, etc.), deacetyleret (eksempelvis proteindeacetylase, histondeacetylase, sirtuin), eller dephosphoryleret (eksempelvis syrephosphatase, lambdaproteinphosphatase, kalve- intestinal phosphatase, alkalisk phosphatase). Deglycosylering, deacetylering eller dephosphorylering kan fremstille et protein, som er mere ensartet eller er i stand til at producere sammensætninger med mindre variation.
Nærværende offentliggørelse påtænker at modificere glycosylering af rekombinant OVD for at ændre eller fremme én eller flere funktionelle egenskaber for proteinet og/eller dets produktion. En værtscelle kan omfatte heterologe enzymer, som modificerer glycosyleringsmønsteret for ovomucoid. | nogle tilfælde kan ét eller flere enzymer anvendes til at modificere glycosyleringen af rOVD protein. Enzymerne, som anvendes til at modificere glycosylering af rOVD kan være et enzym eller et fusionsprotein, som omfatter et enzym eller et aktivt fragment af et enzym, eksempelvis EndoH, eller en fusion af OCH1 til EndoH (såsom tilvejebragt for Golgi tilbageholdelse af EndoH enzymet) kan tilvejebringes i en værtscelle.
Naturligt ovomucoid (NOVD), såsom isoleret fra et kyllinge eller andet fugleæg, har en højt kompleks forgrenet form af glycosylering. Glycosyleringsmønsteret omfatter N- forbundne glycanstrukturer såsom N-acetylglucosaminenheder og N-forbundne mannoseenheder. Se eksempelvis FIG. 1B (venstre søjle). I nogle tilfælde har rOVD, til anvendelse i en heri offentliggjort konsumerbar sammensætning og fremstillet under anvendelse af fremgangsmaderne beskrevet heri, et glycosyleringsmønster, som er forskelligt fra glycosyleringsmønsteret for nOVD. Eksempelvis, når rOVD produceres i en Pichia sp., kan proteinet være højt glycosyleret. FIG. 1C illustrerer glycosyle- ringsmønstre for rOVD fremstillet af P. pastoris, som viser et komplekst forgrenet glycosyleringsmønster. | nogle udførelsesformer for sammensætningerne og frem-
DK 202300014 Y3 51 gangsmåderne heri, behandles rOVD således, at glycosyleringsmønsteret modificeres fra det for nOVD og også modificeres i sammenligning med rOVD produceret af en
Pichia sp., uden en sådan behandling. | nogle tilfælde har rOVD ikke nogen glyco- sylering. | andre tilfælde har rOVD reduceret glycosylering. I nogle tilfælde modificeres rOVD med N-acetylglucosamin ved én eller flere asparaginrester på proteinet og mangler eller er i det væsentlige uden N-forbundet mannosylering. Se eksempelvis FIG. 1B (højre søjle). Ændringerne i glycosylering beskrevet heri kan føre til en forøgelse af opløseligheden og klarheden af rOVD i sammenligning med andre former for protein, såsom valleproteiner, soyaproteiner, ærteproteiner og nOVD.
I nogle tilfælde kan et enzym, som anvendes til modificering af glycosylering, trans- formeres ind i en værtscelle. | nogle tilfælde kan enzymet, som anvendes til at modificere glycosylering, transformeres ind i samme værtscelle som producerer rOVD. | nogle tilfælde kan enzymet tilvejebringes transient til værtscellen, såsom ved et inducerbart ekspressionssystem. | nogle tilfælde, når en værtscelle udtrykkeret system, som anvendes til at modificere glycosylering, sekreteres det rekombinante protein (eksempelvis rOVD og rOVL) fra værtscellen i den modificerede tilstand. et eksempel omfatter en værtscelle, som producerer OVD, en fusion af EndoH og
OCHH1 enzymer. Et eksempel på OCH1-EndoH proteinsekvens er tilvejebragt som SEQ
ID No: 52. | sådanne tilfælde omfatter et rOVD produceret af værtscellen et glycosyleringsmønster, som er væsentligt forskellig fra et rOVD, som er produceret i en værtscelle uden sådanne enzymer. rOVD produceret i sådanne tilfælde er også væsentligt forskelligt i sammenligning med naturligt OVD (eksempelvis produceret af et kyllinge eller andet fugleæg). FIG. 1B viser en sammenligning af nOVD (med mannoserester) og rOVD glycosyleringsmønstre, hvor rOVD blev behandlet med EndoH og omfatter en N-acetylglucosaminrest ved asparaginet men ingen mannoserester. FIG. 1C viser glycosyleringsmønstreret for rOVD produceret i en værtscelle såsom P. pastoris og hvor rOVD ikke blev behandlet med EndoH og har både N- acetylglucosaminrester og kæderne af N-forbundne mannoserester. Modifikation af glycosyleringen af rOVD kan tilvejebringe næringsmæssige foredele for rOVD, såsom et højere nitrogen til carbonforhold og kan tilvejebringe klarhed og opløselighed for proteinet. | nogle tilfælde udføres modifikationen af glycosyleringen af rOVD i værts-
DK 202300014 Y3 52 cellen, som producerer rOVD, før rOVD sekreteres fra værtscellen og/eller før isolation af rOVD. | nogle tilfælde foretages modifikationen af glycosyleringen af rOVD efter dettes sekretion og/eller efter isolering af rOVD fra værtscellen.
Molekylvægten af rOVD kan være forskellig i sammenligning med nOVD. Molekylvægten af proteinet kan være mindre end molekylvægten af nOVD eller mindre end rOVD produceret af værtscellen, hvor glycosyleringen af rOVD ikke er modificeret. udførelsesformer kan molekylvægten af et rOVD være imellem 20kDa og 40kDa. | nogle tilfælde har et rOVD med modificeret glycosylering en anden molekylvægt, såsom i sammenligning med et naturligt OVD (som produceret af en fugleværtart) eller i sammenligning med en værtscelle, som glycosylerer rOVD, såsom hvor rOVD omfatter
N-forbundet mannosylering. | nogle tilfælde er molekylvægten af rOVD større end molekylvægten af rOVD et, som er fuldstændig uden post-translationale modifikationer eller et rOVD, som mangler alle former for N-forbundet glycosylering.
Ekspression af et rOVD eller rOVL kan tilvejebringes af en ekspressionsvektor, et plasmid, en nucleinsyre integreret i værtsgenomet eller andre foranstaltninger.
Eksempelvis kan en vektor til ekspression inkludere: (a) et promotorelement, (b) et enkelt peptid, (c) en heterolog OVD eller OVL sekvens, og (d) et terminatorelement.
Ekspressionsvektorer, som kan anvendes til ekspression af OVD og OVL inkluderer de, som indeholder en ekspressionskassette med elementerne (a), (b), (c) og (d). I nogle udførelsesformer behøver signalpeptidet (c) ikke at være inkluderet i vektoren. Generelt er ekspressionskassetten udformet til at mediere transkriptionen af transgenet, når den erintegreret i genomet i en beslægtet værtsorganisme.
For at hjælpe med amplifikationen af vektoren før transformation i mikroorganismen, kan en replikationsstart (e) være indeholdt i vektoren (såsom PUC ORIC og PUC (DNA2.0)). For at hjælpe med selektionen af mikroorganismer, som er stabilt transformerede med ekspressionsvektoren, kan vektoren også inkludere en selektions- markør (f), såsom URA3 gen og Zeocin resistansgen (ZeoR). Ekspressionsvektoren kan også indeholde en restriktionsenzymposition (g), som tillader linearisering af ekspressionsvektoren før transformation ind i værtsorganismen for at fremme
DK 202300014 Y3 53 ekspressionsvektorens stabile integration i værtsgenomet. I nogle udførelsesformer kan ekspressionsvektoren indeholder et vilkårligt undersæt af elementerne (b), (e), (f) og (9), inkl. ikke nogen af elementerne (b), (e), (f) og (9). Andre ekspressionselementer og vektorelementer, som er kendte for en fagmand indenfor området, kan anvendes i kombination eller substitueret for elementerne beskrevet heri.
Eksempler på promotorelementer (a) kan inkludere, men er ikke begrænset til, en konstitutiv promotor, inducerbar promotor og hybridpromotor. Promotorer inkluderer, men er ikke begrænsede til, acu-5, adh1+, alkoholdehydrogenase (ADH1, ADH2,
ADH4), AHSB4m, AINV, alcA, a-amylase, alternativ oxidase (AOD), alkoholoxidase (AOX1), alkoholoxidase 2 (AOX2), AXDH, B2, CaMV, cellobiohydrolase | (cbh1), ccg-1, cDNA1, cellulært filamentpolypeptid (cfp), cpc-2, ctrd+, CUP1, dihydroxy- acetonesyntase (DAS), enolase (ENO, ENO1), formaldehyddehydrogenase (FLD1),
FMD, formatdehydrogenase (FMDH), G1, G6, GAA, GAL1, GAL2, GAL3, GAL4, GALS,
GALG, GAL7, GAL8, GAL9, GAL10, GCW14, gdhA, gla-1, a-glucoamylase (glaA), glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (gpdA, GAP, GAPDH), phospho- glyceratmutase (GPM1), glycerolkinase (GUT1), HSP82, invl+, isocitratlyase (ICL1), acetohydroxysyre-isomeroreduktase (ILV5), KAR2, KEX2, f3-galactosidase (lac4),
LEU2, melO, MET3, methanoloxidase (MOX), nmt1, NSP, pcbC, PET9, peroxin 8 (PEXB8), phosphoglyceratkinase (PGK, PGK1), pho1, PHO5, PHO89, phosphati- dylinositolsyntase (PIS1), PYK1, pyruvatkinase (pki1), RPS7, sorbitoldehydrogenase (SDH), 3-phosphoserin-aminotransferase (SER1), SSA4, SV40, TEF, transla- tionsforlængelsesfaktor 1 alpha (TEF1), THI11, homoserinkinase (THR1), tpi, TPS1, triosephosphat-isomerase (TPI1), XRP2, YPT1, en sekvens eller en subsekvens valgt blandt SEQ ID No: 121 til 132 og enhver kombination deraf. Illustrative inducerbare promotorer inkluderer methanol-inducerede promotorer, eksempelvis DAS1 og pPEX11.
Et signalpeptid (b), også kendt som en signalsekvens, målrettet signal, lokalise- ringssignal, lokaliseringssekvens, signalpeptid, transitpeptid, ledersekvens eller lederpeptid, kan understøtte sekretion af et protein eller polynucleotid. Ekstracellulær sekretion af et rekombinant eller heterologt udtrykt protein fra en værtscelle kan fremme proteinoprensning. Et signalpeptid kan afledes af en forløber (eksempelvis
DK 202300014 Y3 54 præpropeptid, præprotein) for et protein. Signalpeptider kan afledes fra en forløber for et protein, som er et andet end signalpeptiderne i naturligt OVD og/eller OVL.
En vilkårlig nucleinsyresekvens, som koder for OVD og/eller OVL kan anvendes som (c). Fortrinsvis er sådanne sekvenser codonoptimerede for værtscellen.
Eksempler på transkriptionale terminatorelementer inkluderer, men er ikke begrænset til, acu-5, adh1+, alkoholdehydrogenase (ADH1, ADH2, ADH4), AHSB4m, AINV, alcA, a-amylase, alternativ oxidase (AOD), alkoholoxidase | (AOX1), alkoholoxidase 2 (AOX2), AXDH, B2, CaMV, cellobiohydrolase | (cbh1), ccg-1, cDNA1, cellulært filamentpolypeptid (cfp), cpc-2, ctr4+, CUP1, dihydroxyacetonesyntase (DAS), enolase (ENO, ENO1), formaldehyddehydrogenase (FLD1), FMD, formatdehydrogenase (FMDH), G1, G6, GAA, GAL1, GAL2, GAL3, GAL4, GAL5, GAL6, GAL7, GALS, GAL9,
GAL10, GCW14, gdhA, gla-1, a-glucoamylase (glaA), glyceraldehyd-3- phosphatdehydrogenase (gpdA, GAP, GAPDH), phosphoglyceratmutase (GPM1), glycerolkinase (GUT1), HSP82, invl+, isocitratlyase (ICL1), acetohydroxysyre- isomeroreduktase (ILV5), KAR2, KEX2, f3-galactosidase (lac4), LEU2, melO, MET3, methanoloxidase (MOX), nmt1, NSP, pcbC, PET9, peroxin 8 (PEXS8), phosphoglyceratkinase (PGK, PGK1), pho1, PHOS, PHO89, phos- phatidylinositolsyntase (PIS1), PYK1, pyruvatkinase (pki1), RPS7, sorbitoldehydro- genase (SDH), 3-phosphoserinaminotransferase (SER1), SSA4, SV40, TEF, transla- tionsforlængelsesfaktor 1 alpha (TEF1), THI11, homoserinkinase (THR1), tpi, TPS1, triosephosphatisomerase (TPI1), XRP2, YPT1, og enhver kombination deraf.
Eksempler på selekterbare markører (f) kan inkludere, men er ikke begrænset til: et antibiotisk resistensgen (eksempelvis zeocin, ampicillin, blasticidin, kanamycin, nurseothricin, chloramphenicol, tetracyclin, triclosan, ganciclovir, og vilkårlige kom- binationer deraf), en auxotrofisk markør (eksempelvis ade1, arg4, his4, ura3, met2, og en vilkårlig kombination deraf). et eksempel kan en vektor til udtryk i Pichia sp. inkludere en AOX1 promotor funk- tionsmæssigt forbundet med et signalpeptid (alpha-parringsfaktor), som er fusioneret i rammen med en nucleinsyresekvens, som koder for OVD og/eller OVL, og et
DK 202300014 Y3 55 terminatorelement (AOX1 terminator) umiddelbart nedstrøms for nucleinsyresekvensen, som koder for OVD og/eller OVL. et andet eksempel er en vektor omfattende en DAS1 promotor funktionsmæssigt forbundet med et signalpeptid (alpha-parringsfaktor), som er fusioneret i ramme med en nucleinsyresekvens, som koder for OVD og/eller OVL og et terminatorelement (AOX1 terminator) umiddelbart nedstrøms for OVD og/eller OVL.
Et rekombinant protein beskrevet heri kan sekreteres fra den ene eller flere værtsceller. | nogle udførelsesformer sekreteres rOVD og/eller rOVL protein fra værtscellen. Det sekreterede rOVD og/eller rOVL kan isoleres og oprenses ved fremgangsmåder såsom centrifugering, fraktionering, filtrering, affinitetsoprensning og andre fremgangsmåder til separering af proteiner fra celler, væske og faststofmedie-komponenter og andre cellulære produkter og biprodukter. | nogle udførelsesformer produceres rOVD og/eller rOVL i en Pichia Sp. og sekreteres fra værtscellerne i kulturmediet. Det sekreterede rOVD og/eller rOVL separeres derefter fra andre mediekomponenter for videre anvendelse.
I nogle tilfælde kan adskillige vektorer omfattende OVD transfekteres ind i én eller flere værtsceller. En værtscelle kan omfatte mere end én kopi af OVD. En enkelt værtscelle kan omfatte 2, 3, 4, 5, 6, 7, ,8 ,9 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 eller 20 kopier af
OVD. En enkelt værtscelle kan omfatte én eller flere vektorer for udtrykket af OVD. En enkelt værtscelle kan omfatte 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 eller 10 vektorer for OVDudtryk. Hver vektor i værtscellen kan drive udtrykketaf OVD under anvendelse af den samme promotor. Alternativt kan forskellige promotorer anvendes i forskellige vektorer for OVD udtryk.
De komsumerbare produkter og rOVD og/eller rOVL sammensætninger heri kan være essentielt frie for enhver mikrobiel celle eller mikrobielle celleforureninger. Eksempelvis kan rOVD og/eller rOVL isoleres fra en kultur omfattende mikrobiel vækst. rOVD kan behandles kemisk eller enzymatisk før det oprenses til anvendelse i en konsumerbar sammensætning. Sådanne behandlinger kan foretages for at reducere urenheder i en rOVD proteinsammensætning. Sådanne behandlinger kan udføres for at
DK 202300014 Y3 56 forbedre de sensoriske attributer for rOVD proteinsammensætningen. Behandlinger kan omfatte, men er ikke begrænsede til, oprensningstrin, filtrering, kemiske behandlinger og enzymatiske behandlinger. |nogle tilfælde kan rOVD protein og sammensætninger indeholdende rOVD protein, inkl. former af rOVD med modificeret glycosylering (eksempelvis sådanne former med N- acetylglucosamin men uden N-forbundne mannoserester) behandles med oxiderings- middel eller et oxygengenererende middel for at modificere komponenter i rOVD sammensætningen, såsom urenheder. Oxideringsmidlet eller oxygengenereringsmidlet kan omfatte hydrogenperoxid, natriumpercarbonat, aktiveret chlordioxid, boblet oxygen eller ozon. Behandlingen kan forbedre opløseligheden og klarheden af en rOVD sammensætning. Behandlingen kan reducere lugten af en rOVD sammensætning.
Behandlingen kan neutralisere farven af en rOVD sammensætning; eksempelvis kan rOVD sammensætningen miste farve efter en behandling, eksempelvis til en mindre intens/lysere farve. | udførelsesformer kan farven ændres fra grønlig til gullig og/eller fra gullig til essentielt farveløs. nogle eksempler kan rOVD behandles med et oxideringsmiddel eller et oxygen- genererende middel, eksempelvis hydrogenperoxid eller natriumpercarbonat, før det oprenses til anvendelse i en konsumerbar sammensætning. Et kulturmedie omfattende sekreteret eller isoleret rOVD kan behandles med et oxygen-genererende middel, eksempelvis hydrogenperoxid eller natriumpercarbonat. Under anvendelse af hydrogenperoxid som et eksempel, kan en hydrogenperoxidbehandling efterfølges af ét eller flere vasketrin og/eller filtreringstrin for at fjerne hydrogenperoxid fra de resulterende rOVD sammensætninger. Sådanne trin kan udføres efterfølgende behand- linger med andre oxygengenererende midler, eksempelvis natriumpercarbonat. | nogle tilfælde kan koncentrationen af hydrogenperoxid, som anvendes til behandling af rOVD, være fra 1 til 20%. Koncentrationen af hydrogenoperoxid, som anvendes til behandling af rOVD, kan være i det mindste 1%. Koncentration af hydrogenperoxid, som anvendes til behandling af rOVD kan være maksimalt 20%. Koncentrationen af hydrogenperoxid, som anvendes til behandling af rOVD kan være 1% til 2%, 1% til 5%, 1% til 7%, 1% til 10%, 1% til 12%, 1% til 15%, 1% til 17%, 1% til 20%, 2% til 5%, 2% til 7%, 2% til 10%, 2% til 12%, 2% til 15%, 2% til 17%, 2% til 20%, 5% til 7%, 5% til 10%, 5% til 12%, 5%
DK 202300014 Y3 57 til 15%, 5% til 17%, 5% til 20%, 7% til 10%, 7% til 12%, 7% til 15%, 7% til 17%, 7% til 20%, 10% til 12%, 10% til 15%, 10% til 17%, 10% til 20%, 12% til 15%, 12% til 17%, 12% til 20%, 15% til 17%, 15% til 20% eller 17% til 20% vægt pr. totalvægt (w/w) og/eller vægt pr. totalvolumen (w/v). Koncentrationen af hydrogenperoxid, som anvendes til behandling af rOVD kan være omkring 1%, 2%, 5%, 7%, 10%, 12%, 15%, 17% eller 20% wiw eller w/v. Koncentrationen af hydrogenperoxid, som anvendes til behandling af rOVD kan være i det mindste 1%, 2%, 5%, 7%, 10%, 12%, 15% eller 17% w/w eller w/v. Koncentrationen af hydrogenperoxid, som anvendes til behandling af rOVD kan være maksimalt 2%, 5%, 7%, 10%, 12%, 15%, 17% eller 20% w/w eller w/v. rOVD kan behandles med hydrogenperoxid for en begrænset tidsvarighed. Eksempelvis kan rOVD eksponeres for hydrogenperoxid i i det mindste 1 time, 2 timer, 3 timer, 5 timer, 7 timer, 10 timer, 12 timer, 15 timer, 17 timer, 20 timer, 22 timer, 24 timer, 26 timer, 28 timer, 30 timer, 34 timer, 36 timer, 40 timer, 44 timer eller 48 timer. Hydrogenperoxid kan tilføjes til rOVD kulturmediet under hele dyrkningsprocessen. rOVD kan behandles med hydrogenperoxid ved en pH på omkring 3 til 6. rOVD kan behandles med hydrogenperoxid ved en pH på omkring 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4,1, 4,2, 44, 46, 4,8, 5, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8 eller 6. rOVD kan behandles med hydrogenperoxid ved en pH på idet mindste 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4,1, 4,2, 4,4, 4,6, 4,8, 5, 5,2, 5,4, 5,6 elle 5,8. rOVD kan behandles med hydrogenperoxid ved en pH på maksimalt 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4,1, 4,2, 4,4, 4,6, 4,8, 5, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8 eller 6. rOVD kan filtreres før behandling med et oxygengenererende middel. | nogle tilfælde kan rOVD filtreres før og efter behandling med et oxygengenererende middel.
DEFINITIONER
Terminologien, som anvendes heri, er med henblik på alene at beskrive specifikke situationer og er ikke beregnet til at være begrænsende.
Som anvendt heri, medmindre der er indikeret noget andet, er udtrykkene “én”, "ét", og “den” og “det” tilsigtet at inkludere flertalsformerne såvel som entalsformerne, medmindre sammenhængen klart indikerer noget andet.
DK 202300014 Y3 58
Udtrykkene "omfatter”, "omfattende”, "indeholder", "indeholdende”, "inkluderende”, "inkluderer”, “har”, "'havende”, “med”, eller varianter deraf, som er anvendt i enten nær- værende offentliggørelse og/eller i kravene, er tilsigtet til at være inkluderende på en måde svarende til udtrykket ”omfattende”.
Udtrykket "omkring" eller "omtrent" betyder indenfor en acceptabel fejlmargen for den specifikke værdi, som bestemt af en fagmand indenfor området, hvilket vil afhænge tildel af hvorledes værdien måles eller bestemmes, eksempelvis begrænsende for målesystemet. Eksempelvis “omkring” kan betyde 10% større end eller mindre end den indikerede værdi. | et andet eksempel kan “omkring” betyde indenfor én eller mere end én standardafvigelse, pr. praksis i den givne værdi. Hvor bestemte værdier beskrives i ansøgningen og kravene, medmindre andet angives, bør udtrykket "omkring” antages at betyde en acceptabel fejlmargen for den bestemte værdi.
Udtrykket “i det væsentlige” menes at være en betydelig udstrækning, for det meste; eller essentielt. Med andre ord udtrykket i det væsentlige kan betyde næsten eksakt for den ønskede attribut eller en smule afvigende fra den eksakte attribut. I det væsentlige kan være ikke-adskillelig fra den ønskede attribut. I det væsentlige kan være skelnelig fra den ønskede attribut men forskellen er ubetydelig eller negligerbar.
Et vilkårlig aspekt eller udførelsesform beskrevet heri kan kombineres med et vilkårlig andet aspekt eller udførelsesform som offentliggjort heri.
EKSEMPLER
De følgende eksempler gives med henblik på at illustrere forskellige udførelsesformer for frembringelsen og er ikke ment til at begrænse nærværende frembringelse på nogen måde. Nærværende eksempler, sammen med fremgangsmåderne beskrevet heri, er for nærværende repræsentative for foretrukne udførelsesformer, er eksempelvise og er ikke tilsigtede som begrænsninger for området for frembringelsen. Ændringer deri og andre anvendelser, som er indeholdt indenfor ånden for frembringelsen som defineret af området for kravene, vil fremgå for en fagmand indenfor området.
Eksempel 1: Ekspressionskonstrukter, transformation, proteinoprensning og bearbejdning
To ekspressionskonstrukter blev dannet for udtrykaf OVD (SEQ ID NO: 1) i Pichia pastoris. Det første konstrukt omfattede alkoholoxidat 1 (AOX1) promotoren. En OVD kodningssekvens blev fusioneret i ramme med alpha-parringsfaktorsignalsekvensen
DK 202300014 Y3 59 nedstrøms for promotorsekvensen. En transkriptional terminator fra AOX1 genet blev placeret nedstrøms for OVD sekvensen. Ekspressionskonstruktet blev anbragt i en
Kpas-URA 3 vektor.
Etandet ekspressionskonstrukt blev dannet indeholdende methanol-inducerbar DAS1 promotoren (ATCC No. 28485) opstrøms for alpha-parringsfaktorsignalsekvensen fusioneret i ramme med en nucleinsyresekvens, som koder for den samme OVD proteinsekvens som i det første ekspressionskonstrukt. En transkriptional terminator fra
AOX1 genet blev placeret nedstrøms for OVD sekvensen.
I begge ekspressionskonstrukter var OVD sekvensen den fra kylling (Gallus gallus) som har aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 1.
Begge ekspressionskonstrukter blev transformerede i Pichia pastoris. Successfuld integration af de to konstrukter blev bekræftet ved genomsekvensering.
Fermentering: Rekombinant OVD (rOVD) fra hvert ekspressionkonstrukt blev pro- duceret i en bioreaktor ved omgivelsesbetingelser. En startkultur for fermenterings- processen begyndte med inokulering af rysteflasker med flydende vækstbouillon. De inokulerede rysteflasker blev holdt i en ryster hvorefter de dannede Pichia pastoris blev overført til en produktionsskala reaktor.
Kulturen voksede ved 30°C ved en indstillet pH og opløst oxygen (DO). Kulturen blev født med en carbonkilde.
Sekreteret rOVD blev oprenset ved at separere celler fra den flydende vækstbouillon, under udførelse af adskillige filtreringstrin, udførelse af chromatografi anvendelse og tørring af slutproteinproduktet for tilvejebringelse af rent rOVD pulver.
DK 202300014 Y3 60
Eksempel 2: Ekspressionskonstrukt, transformation, proteinoprensning og bearbejdning
Tre ekspressionskonstrukter blev dannet for udtrykaf en moden form af OVD (SEQ ID
NO: 1) i Pichia pastoris. Det første konstrukt omfattede AOX1 promotoren. En OVD kodningssekvens blev fusioneret i ramme med alpha-parringsfaktorsignalsekvensen nedstrøms for promotorsekvensen (SEQ ID NO: 39). En transkriptional termintor fra
AOX1 genet blev placeret nedstrøms for OVD sekvensen. Værtscellerne havde elleve kopier af OVD, hvoraf ti var i det hybride promotorsystem, hvor fem var drevet af en afkortet pAOX1. Den ellevte kopi var drevet af en fuld-størrelse pAOX1 promotor.
Et andet ekspressionskonstrukt blev dannet indeholdende en nucleinsyre, som koder for P. pastoris transkriptionsfaktor HAC1 under styring af en streng methanol-inducerbar promotor. En transkriptional terminator fra AOX1 genet blev placeret nedstrøms for
HAC1 sekvensen.
Et tredie ekspressionskonstrukt blev dannet, som koder for et fusionsprotein. Kon- struktet omfatter en nucleinsyre, som koder for de første 48 rester af Pichia OCH1 protein fusioneret til en katalytisk aktiv version af Streptomyces coelicoflavus EndoH (SEQ ID NO: 52) og under en streng methanol-inducerbar promotor pPEX11. En transkriptional terminator fra AOX1 genet blev placeret nedstrøms for EndoH-OCH1 fusionsproteinsekvensen.
P. pastoris stammen blev modificeret til at fjerne cytoplasmiske dræber plasmider og derefter yderligere modificeret til at have en deletion i AOX1 genet. Denne deletion genererede en methanol-udnyttelsesslow (mutS) phenotype, som reducerer stammens evne til at konsumere methanol. Denne basisstamme blev transformeret med de tre ekspressionskonstrukter.
Lineære kassetter af methanol-inducerbar promotor: ScPrePro (Saccharomyces pre-prosekvens)::ovomucoid::AOX1term; linære kassetter af mehtnaol-inducerbar promotor::HAC1::AOX1term; og en lineær kassette af methanol-inducerbar pro- motor::EndoH-OCH1::AOX1term blev introduceret i basis P. pastoris stammen under anvendelse af standard-elektroporationsfremgangsmader. FIG. 1A illustrerer vektorkonstrukterne, som blev anvendt til ekspressionen af rOVD.
DK 202300014 Y3 61
Fermentering: Rekombinant OVD fra hvert ekspressionskonstrukt blev produceret i en bioreaktor ved omgivelsesbetingelser. En startkultur for fermenteringsprocessen begyndte med inokuleringen af rysteflasker med flydende vækstbouillon. De inoku- lerede rysteflasker blev holdt i en ryster hvorefter de dyrkede P. pastoris blev overført til en produktionsskala reaktor.
Kulturen blev dyrket ved 30°C ved en indstillet pH og opløst oxygen (DO). Kulturen blev født med en carbonkilde.
For at ekspandere en produktion bliver en rOVD P. pastoris startkultur fjernet fra cryo- opbevaring og optøet til rumtemperatur. Indholdet i de optøede startkulturbeholdere anvendes til at inokulere flydende startkulturmedie i flasker, forsynede med baffel, som blev dyrket ved 30°C i rysteinkubatorer. Disse startkulturflasker overføres derefter og dyrkes i en serie større og større startkulturfermentatorer (antal varierer afhængigt af skalaen), som indeholder et basalt saltmedie, spormetaller og glucose. Temperaturen i startkulturreaktorerne styres ved 30°C, pH ved 5 og DO ved 30%. pH fastholdes ved at tilføre ammoniumhydroxid, som også virker som en nitrogenkilde. Så snart tilstrækkelig cellemasse er nået inokuleres de dyrkede rOVD P. pastoris i en pro- duktionsskala reaktor indeholdende basalt saltmedie, spormetaller og glucose. Som i startkulturbeholderne styres kulturen også ved 30°C, pH 5 og 30% DO under hele processen. pH opretholdes igen ved at tilføre ammoniumhydroxid. Under start- portionsglucosefasen lades kulturen konsummere alt glucose og efterfølgende pro- duceret ethanol. Såsnart målcelledensiteten er opnået og glucose og methanol- koncentrationer bekræftes til at være nul, initieres den glucose fødte-portions- vækstfase. | denne fase tilføres glucose indtil kulturen når en målcelledensitet. Glucose tilføres med en begrænsende hastighed for at forhindre ethanol i at opbygges under tilstedeværelse af ikke-nul-glucosekoncentrationer. I slutinduktionsfasen bliver kulturen co-født glucose og methanol, som inducerer den til at producere rOVD. Glucose tilføres med en mængde til at producere en ønsket vækstrate, medens methanol tilføres for at opretholde methanolkoncentrationen ved 1% for at sikre at ekspressionen konsistent induceres. Regelmæssige prøver udtages under hele fermenteringsprocessen for analyse for specifikke procesparametre (eksempelvis celledensitet, glucose/methanolkoncentrationer, produkttiter og kvalitet). Efter en tildelt mængde af fermenteringstid opsamles sekreteret rOVD og overføres til nedstrøms bearbejdning.
DK 202300014 Y3 62 rOVD produkterne blev oprenset ved separering af celler fra den flydende vækst- bouillon, under udførelse af multiple filtreringstrin, udførelse af chromatografi og/eller tørring af slutproteinproduktet for produktion af rent rOVD pulver.
Post-translation-modifikation fra OCH1-EndoH fusionsproteinet resulterede i fjernelsen af alpha faktor præ-pro-sekvensen. N-terminalsekvenseringsresultater viste upræcis kløvning af N-terminal prosekvensen af Pichia værtens post-transkriptionsmaskine- rifusionering og yderligere fire aminosyrerestter (hovedpart) eller 6 aminosyrerester (mindre part) til N-terminus af den producerede rOVD (SEQ ID NO: 37) eller (SEQ ID
NO: 38), i sammenligning med aminosyresekvensen for modent OVD (SEQ ID NO: 1).
Molekylvægten af rOVD fra Pichia blev sammenlignet imod naturlig kyllinge- ovomucoid (nOVD) under anvendelse af SDS-PAGE. rOVD' et viste en forskel i migration. For at vurdere om forskellen i gelmigration skyldtes differential post- translational glycosylering, blev deglycosyleret naturligt ovomucoid behandlet med
PNGase F, et enzym, som specifikt deglycosylerer proteiner (BioLabs 2020), og sammenlignet med rOVD prøven. Det deglycosylerede naturlige ovomucoid (NOVD + PNGaseF) udviste samme båndmønstre og molekylvægt som tre rOVD prøver som testet (FIG. 1D). Forskellen i glycosylering tilskrives virkningen af OCH1-EndoH i
Pichia stammen således, at rOVD kun har kerne N-acetylglucosaminenheden forbundet med Asn resten i stedet for den kompleks forgrenede glucosylering (som inkluderer mannose) i nOVD fra kyllingeæggehvide (FIG. 1B og FIG. 1C).
Massespektrometrianalyse af rOVD eksprimeret i Pichia uden EndoH er vist til at have otte forskellige N-glycanstrukturer (FIG. 1C). Strukturerne inkluderer Man9 GIcNAc2,
Man9 GlcNAc2 Hex, Man9 GlcNAc2Hex2, Man9 GIcNAc2Hex3, Man9 GlcNAc2Hex4,
Man9 GlcNAc2 Hex5,v Man9 GlcNAc2Hex6 og Man9 GIcNAc2 Hex7. Tabel 2 viser procentdelen af N-forbundne glycaner på rOVD prøven produceret uden endo- glycosidase-behandling.
DK 202300014 Y3 63
Tabel 2: N-forbundne glycaner fra prøve detekteret ved MALDI TOF/TOF MS.
Permethyleret Beskrivelse af strukturer masse (m/z)' 2396,2 Man9 GIcNAc2 2600,3 Man9 GIcNAc2 Hex 2804,4 Man9 GlcNAc2 Hex2 3008,5 Man9 GIcNAc2 Hex3 3212,6 Man9 GIcNAc2 Hex4 3416,7 Man9 GIcNAc2 Hex5 3620,8 Man9 GIcNAc2 Hex6 3824,9 Man9 GIcNAc2 Hex7
Eksempel 3: Opløselighed og klarhedstestning ved varierende rOVD kon- centrationer
Lyofiliseret rOVD (fra eksempel 2) blev blandet i vandig opløsning (destilleret vand) ved forskellige koncentrationer og pH'er. Klarhed og opløselighed af rOVD opløsningerne blev derefter evalueret visuelt (eksempelvis for turbiditet, præcipitat, viscositet og farve) samt ved måling af absorbans ved 600 nm.
FIG. 2 viser absorbansen ved 600 nm for deioniseret vand sammenlignet med ab- sorbansen ved 600 nm af en opløsning omfattende rOVD i deioniseret vand ved en proteinkoncentration på 4,23% w/v. FOVD opløsningen havde en pH på 4,11. Det deioniserede vand havde en absorbans på 0,037 (OD600). Opløsningen med 4,23% w/v rOVD havde en absorbans på 0,047, en forøgelse på 27%. Fotoet i FIG. 2 af rOVD opløsningen afslører en klar og farveløs opløsning uden udfældning og uden synlige viskositetsændringer i udseende og visuel strømning af væske.
Eksempel 4: Opløslighed og klarhedstestning ved forskellige temperaturer
De vandige 30% rOVD (w/v) prøver fra eksempel 3, ved pH 4,06 eller pH 6,3 blev inkuberede ved rumtemperatur og underkastet tre varmebehandlinger: pasteurisering, varmfyldning (hot fill) og retorting. Klarheden og opløseligheden for rOVD blev derefter evalueret visuelt (eksempelvis for turbiditet, udfældning, viskositet og farve) og ved måling af absorbans ved 600 nm.
Varmebehandlinger af hver prøve blev udført som følger:
DK 202300014 Y3 64
For pasteurisering blev prøverne opvarmet til 72°C i 1 minut og derefter placeret i et isbad i 10 minutter. Efterfølgende isbadet blev prøverne placerede ved rumtemperatur og derefter evaluerede for opløselighed og klarhed.
For varmfyldning (hot fill) blev prøverne opvarmede til 85°C i 30 sekunder og derefter placerede ved rumtemperatur for evaluering af opløselighed og klarhed.
For retorting blev prøverne opvarmede til 121°C i 15 minutter ved 19 psi og derefter opbevaret ved rumtemperatur for evaluering af opløselighed og klarhed.
FIG. 3 viser resultaterne for pH, absorbans og klarhed af en rOVD opløsning omfattende 30% rOVD i deioniseret vand. rOVD' et var overraskende opløseligt i deioniseret vand ved 30% (w/v baseret på proteinmængde) ved enten pH 4,06 eller pH 6,3. Fotoene af rOVD opløsningerne ved såvel pH 4,06 som 6,3 synes klare, lysegrønne og viskøse, men mindre således under ”forbearbejdnings” betingelser, som var før en varmebehandling. Det kan konkluderes ud fra FIG. 3, at rOVD kan forblive opløseligt i både sure (pH ~4,0) og let sure (pH -6) opløsninger ved en kon- centration af rOVD på 30% w/v. Mere specifikt havde 30% rOVD opløsningen ved pH 4,06 en OD600 på 0,101 efter pasteurisering og en OD600 på 0,104 efter varmefyldning (hot filling). Ved den mindre sure pH på 6,3 var OD600 for 30% rOVD opløsningen efter pasteuriseringen 0,089 og efter varmefyldning (hot filling) 0,094.
Som sådan syntes der at være større klarhed og opløselighed for rOVD ved højere pH værdier.
FIG. 4 viser fotoene fra pH 4,06 eksperimenterne fra FIG. 3. Det kan konkluderes ud fra
FIG. 4, at rOVD overraskende kan forblive i opløsning efterfølgende varmepåvirkning. 30% wiv.
Eksempel 5: Opløselighed og klarhedstestning ved varierende temperaturer og pH
Lyofiliseret rOVD (fra eksempel 2) blev blandet i vandig opløsning (destilleret vand) ved koncentrationer på 9% (w/v). Natriumcitratbuffer (0, 1M) blev anvendt til at justere pH for opløsningerne til pH'er på 2,5, 4 eller 6 som vist i tabel 3 nedenfor:
DK 202300014 Y3 65 . Natriumcitrat FOVD
Citronsyre (ml) DI vand (ml) | pH æ | 68 | w [25] Shi 6 | a | 9 || wy
Tabel 3: Sammensætning af citratbufferen ved pH 2,5, 4 eller 6
Efterfølgende pH justering blev separate vandige rOVD prøver ved hver pH inkuberede ved rumtemperatur og underkastet tre typer af varmebehandling: pasteurisering, varmefyldning (hot fill) og retorting (som beskrevet nedenfor). Klarheden og opløseligheden af rOVD blev derefter evalueret visuelt (eksempelvis for turbiditet, udfældning, viskositet og farve) og ved måling af absorbans ved 600 nm.
Varmebehandlingerne på hver prøve blev eksekveret som følger:
For pasteurisering blev prøverne opvarmede til 72°C i 1 minut og derefter placerede i et isbad i 10 minutter. Efterfølgende isbadet blev prøverne placerede ved rumtemperatur og derefter evalueret for opløselighed og klarhed.
For varmefyldning (hot fill) blev prøverne opvarmede til 85°C i 30 sekunder og derefter placerede ved rumtemperatur for evaluering af opløselighed og klarhed.
For retorting blev prøverne opvarmede til 121°C i 15 minutter ved 19 psi og derefter fastholdt ved rumtemperatur for evaluering af opløselighed og klarhed.
Resultaterne af visuel inspektion og OD600 målinger af prøverne er tilvejebragt i FIG. 5A og FIG. 5B.
Billeder af prøverne er vist i FIG. 5A. Virkningen af forskellige opvarmningsbehandlinger på absorbans (600 nm) af rOVD oløsning og buffer.
Tilføjelsen af rOVD blev fundet at forøge absorbansen af bufferopløsningen.
Absorbansen af rOVD opløsningen forblev den samme efterfølgende pasteurisering og varmefyldning (hot fill) (ingen signifikant forskel imellem pH 2,5 og pH 4).
Absorbansen blev reduceret efterfølgende retorting. Det var overraskende at, ved forskellige pH'er, forblev rOVD opløsningen klar selv efter opvarmningsbehandlinger med pasteurisering og varmefyldning (hot fill). En undtagelse var at rOVD opløsningen
DK 202300014 Y3 66 koagulerede ved retorting betingelser ved pH 4 eller pH 6. Disse resultater indikerer at rOVD ifølge nærværende offentliggørelse forbliver opløseligt i opløsning ved forskellige sure pH'er før og efter anvendelse af varme.
Eksempel 6: Opløselighed og klarhed af rOVD i kommercielt-tilgængelige drikkevarer
Baseret på carboneringsniveauer offentliggjort i litteraturen (Tabel 4 nedenfor), blev San
Pellegrino& udvalgt til at repræsentere en lavcarboniseret drikkevare, medens Diet
Coke™ blev valgt som en drikkevare med højere carboneringsniveau. Gatorade™ og
Red Bull™ repræsenterede kategorien (ikke-carboneret) energidrik. Pedialyte& blev valgt til at studere virkningen af elektrolytter i en drikkevare på rOVD opløselighed.
Tabel 4: Carboneringsniveauer for forskellige kommercielt tilgængelige drikke- varer.
Lyofiliseret rOVD blev blandet i forskellige drikkeopløsninger i et område af koncen- trationer på 30 til 50% (% udtrykt som vægt protein/volumen). Overraskende var rOVD ifølge nærværende offentliggørelse opløseligt ved 30% w/v i Pedialyte&, San
Pellegrino®, Diet Coke™ og Gatorade™. | Red Bull™ var opløselighed ved 26% w/v protein. Ved højere koncentrationer (eksempelvis >30%) havde rOVD opløselighed ved nogle koncentrationer, men blev fulgt af et fald i klarhed og en forøgelse af viskositet.
Ved endnu højere koncentrationer (eksempelvis nærmende sig 50% w/v), var rOVD ikke længere opløseligt og i nogle eksempler blev det ikke vædet ved placering i drikkevareopløsningen. Resultater er vist i tabellerne nedenfor for koncentrationer 30% og højere (26% for Redbull™). En markant farveændring blev set med tilføjet rOVD for drikkevarer, som er farveløse, medens for farvede drikkevare (eksempelvis Diet Coke™) blev lidt eller ingen farveændring observeret med rOVD tilføjelse.
BE | rer | |e (%) Visuel inspektion Pellegrino& | Pellegrino& med rOVD
DK 202300014 Y3 67 50 Proteinpulver blev ikke helt vædet, dannede ikke en opløsning 40 Proteinpulver blev fuldstændigt vædet. Dannede en tyk, bleg- grøn sirup-lignende blanding 35 Viskøs suspension, blegbrun sirup-lignende
Tabel 5: Opløselighedsstudie for rOVD i San Pellegring®
Proteinkoncentration Visuel inspektion pH af Diet pH af Diet (9) | Coke® Coke® med base FOVD 50 | Proteinpulver blev fuldstændigt vædet.
Dannede ikke en opløsning 40 Proteinpulver blev fuldstændigt vædet. i Dannede en tyk, blegbrun sirup-lignende blanding 35 Viskøs suspension, blegbrun sirup- lignende
Tabel 6: Opløselighedstudie for rOVD i Diet Coke&
Proteinkoncentration Visuel inspektion PH af pH af (1%) | Gatorade™ Gatorade™ med rOvD 50 Proteinpulver blev ikke vædet ret meget.
Dannede ikke en opløsning 40 Proteinpulver blev ikke fuldstændigt i vædet. Dannede en tyk, bleggud sirup- lignende blanding 35 i Viskøs suspension, bleggul sirup- fignende 30 Klar opløsning, bleggulfgrøn, 2.78 37 viskøs
Tabel 7: Opløselighedsstudie for rOVD i Gatorade'" {Thirst Quencher lemon-lime)
Proteinkoncentration Visuel inspektion pH af pH af Red (%) Red Buli™ med
Buli™ FOVD
DK 202300014 Y3 68 50 \Proteinputver blev ikke vædet ret meget.
Dannede ikke en opløsning 40 | Proteinpulver blev ikke fuldstændigt vædet. Dannede en tyk, off white sirup- lignende blanding 35 | Meget viskøs suspension, off white sirup-lignende 30 | Meget viskøs turbid bleggrøn opløsning
Tabel 8: Opløseligsstudie for FOVD i Red Bulf™
Proteinkoncentration Visuel inspektion pH af pH af (%) Pedialyte® Pedialyte® med rOVD 50 i Proteinpulver blev ikke fuldstændigt vædet. Dannede ikke en opløsning 40 i Proteinpulver blev fuldstændigt vædet. \Dannede en tyk, off white sirup-lignende blanding 35 Viskøs suspension, blegbrun sirup- lignende
Tabel 9: Opløselighedsstudie for FOVD i Pedialyte&
Billeder af staridrikkevarerne (ingen rOVD) og 30% rOVD opløsningerne (26% for
RedBull™) er vist i FIG. 8A. Absorbansresultster for rOVD opløsninger er vist i graferne I
FIG. 6B. rOVD opløsningerne ved 30% wiv (26% wiv for RedBull™) blev evaluerede under anvendelse af absorbans ved 600 nm. Ædring | pH efter rOVD tilføjelse var afhængig af dnikkevaresammensætningen og startbasis pH.
Eksempel 7: Produktion af rekombinant OVL protein i Pichia
En rekombinant lysozym {rOVL) stamme blev fremstillet ved transformering af Pichia arten Komagataelia phaffil med en ekspressionskassette indeholdende OVL følge SEQ iD NO: 45 udtryklunder styring af en methanol-inducerbar promotor. OVL 13 kodningssekvensen kodede for det modne OVL protein fusioneret til kodningssek- vensen for alpha faktor pre-pro sekretionssignalet fra Saccharomyces cerevisiae. rOVL stammen sekreteret rOVL ved dyrkning i medier indeholdende methanol. Bouillonen indeholdende rOVL rekombinant protein blev centrifugeret for fjernelse af celler og den resulterende supernatant blev bearbejdet tilsvarende som den for rOVD, som beskrevet ovenfor.
DK 202300014 Y3 69
Eksempel 8: OVD og OVL kombinationer dette eksempel blev opløsninger fremstillet indeholdende 2,5% (w/v) FOVL og nOVD ved 9% (w/v). Den resulterende proteinblanding indeholdt 21,7% rOVL og 78,3% nOVD. rOVL+OVD blandingen blev derefter varmebehandlet under følgende betingelser:
Pasteurisering: 72°C i 1 minut efterfulgt af 10 minutter i et isbad.
Varmefyldning (hot fill): 85°C i 30 sekunder.
Retorting: 121°C i 15 minutter ved 19 psi.
En kontrol OVD prøve fastholdt ved rumtemperatur blev anvendt til at efterligne aseptiske bearbejdningsbetingelser. Natriumcitratbuffer (0,1 M) blev anvendt til at justere pH for testopløsningerne som beskrevet i tabel 10.
Citronsyre (ml) Natriumcitrat (ml) | DI vand (ml) il 92 | 9% | 50 | 25 6 | 4 1% | 6
Tabel 10: Sammensætning af citratbuffer ved pH 2,5, 4 og 6.
Som vist i FIG. 7 til FIG. 10 og tabel 11, når OVL+OVD blandingen blev varmebe- handlet med pasteurisering, varmefyldning (hot fill) eller retorting. Klarhed/opløselighed for rOVL+OVD blandingen som målt ved absorbans ved 600 nm, forblev upåvirket ved pH 2,5 i sammenligning med OVD kontrolprøver efterladt ved rumtemperatur. Ved pH 4 beholdt FOVL+OVD blandingen sin klarhed/opløselighed, når den blev pasteuriseret eller varmefyldt (hot filled). Retorting-betingelser producerede turbiditet som målt ved forøget optisk densitet (tabel 11). Varmebehandling ved pH 6 resulterede i tab af klarhed for alle prøver. [ws TW | rene | ern | we
DK 202300014 Y3 70
Pm | re | | er 1 rr | øm | me * prøver i hver undertabel som har samme bogstaver er statistisk indbyrdes lignende (p>0,05)
Tabel 11: Absorbans af prøver indeholdende rOVL og naturligt OVD ved 600 nm
Som vist i FIG. 11 til FIG. 13 og tabel 12 havde naturlige OVL (nOVL) prøver en tilsvarende virkning på OVD som set med den rekombinante OVL (rOVL). Ved pH 2,5 blev klarheden/opløseligheden af nOVL+OVD opløsninger fastholdt når den blev varmebehandlet ved alle tre betingelser (pasteurisering, varmefyldning (hot fill) eller retorting). nOVL+OVD opløsningerne opretholdt deres klarhed ved pH 4, med turbiditetudvikling alene under retortbetingelser. pH 6 var ikke egnet til opretholdelse af klarhed efter varmbehandling.
La | fm | fe | ør | em
DK 202300014 Y3 71
PE eg | ae [pe Two [re [Ferm * prøver i hver undertabel som har samme bogstaver er statistisk indbyrdes lignende (p>0,05)
Tabel 12: Absorbans for prøver indeholdende kommercielt naturligt OVL (NOVL) og naturligt OVD (nOVD) ved 600 nm.
Tilføjelsen af rOVL til OVD i en prøve ved rumtemperaturer eller varmebehandlet forøgede proteinindhold i prøven uden at påvirke klarheden eller opløseligheden af prøven. Således øger tilføjelsen rOVL til OVD til en drikkevare proteinindholdet i drikkevaren uden at påvirke klarhed eller opløselighed, sensorisk kvalitet (udseende, lugt, smag og mundfølelse) hhv. ved rumtemperatur eller efter varmebehandling.
Prøver blev lavet indeholdende rekombinant OVD ifølge nærværende offentliggørelse (rOVD) ved 9% (w/v) og 2,5% (w/v) rOVL. Den resulterende proteinblanding indeholdt 78,3% rOVD og 21,7% rOVL. FIG. 14 sammenligner opløsninger ved rumtemperatur og efter forskellige varmebehandlinger ved pH 2,5, 4 og 6: rOVL+rOVD med rOVD kontrol. pH25 Rumtemperatu Hot Fill Retorting rOVD+rOVL 0,063 AB* 0,066 A 0,061 B 0,061 B 0,062 B 0,061 B 0,062 B 0,056 C pH4 [Rumtemperatur| Pasteuriering | Hot Fill Retorting rOVD+rOVL 0,065 B* 0,109 A 0,066 B | Hvidt koagulat 0,062 B 0,060 B 0,061 B | Hvidt koagulat pH6 Rumtemperatu Hot Fill Retorting
DK 202300014 Y3 72 * prøver i hver undertabel som har samme bogstaver er statistisk indbyrdes lignende (p>0,05)
Tabel 13: Absorbans af prøver indeholdende rOVL og rOVD ved 600 nm.
Eksempel 9: Sammenligning med valleproteinopløsninger
For at sammenligne resultater fra rOVD med et alternativt protein (valle), blev rOVD eller valleproteiner opløst i vand med en koncentration på 9% (w/v). Fire kommercielt tilgængelige valleprotein-isolater (WP1, WP2, WP3 og WP4) blev sammenlignet med rOVD ifølge nærværende offentliggørelse. pH blev målt med en Hanna Lab pH probe for hver prøve og absorbansen blev målt med SpectroMax ved 600 nm bølgelængde.
Resultaterne er vist i tabel 14. Udseendet blev evalueret ved visuel inspektion; duften blev evalueret ved snifningstest; og smagen blev evalueret ved smagning under anvendelse af et panel på 3 trænede personer. we | we | we | wee | ro om | He Joe | oe [fe opløsning 3,15 6,53 3,92 6,13 5,05 [GET soon [veer | osusse | ommcom | UT 600 nm 0,039 + 0,001 | 0,423 +0,123 | 0,344 £0,038 0,792 + 0,016 0,000 skyet, gul klar, ere Joe] po JT | re | | er mejeriduft ko/gede skur mæ keduft ingen duft saltagtig, plastsmag, let syrlig, neutral smag, ingen let proteinsmag mæ kesyre-noter| ubehagelig duft negativ syrlighed, mælkelignende
PÆLE
Tabel 14: Opløsningskarakteristika for valleproteinopløsninger (WPI) i sammenlig- ning med rOVD opløsninger.
Valleproteinisolater (WPI 1 og WPI 3) blev ved en koncentration på 9 g pr. 100 ml destilleret vand, justeret til pH 2, 4 eller 6. Sammenlignende resultater imellem valleproteinopløsninger (WPI 1 og WPI 3) og rOVD opløsninger ved pH 2, 4 og 6 er vist i FIG. 15A og FIG. 15B. rOVD opløsningerne har væsentlig højere opløsningsklarhed i sammenligning med valleproteinopløsninger ved samme koncentrationer.
DK 202300014 Y3 73
Eksempel 10: Sammenligning af klarhed af forskellige proteinvandopløs- ninger i dette sksempel blev opløselighed af rekombinant ovomucoid rOVD) protein ifølge nærværende offentliggørelse sammenlignet med andre proteiner.
Passende mængder af sure valleproleinisolater (WP1 med 90% wiw protein og WP2 med 92 7% wiw protein), nOVD - 85% proteinindhold, rOVD — 85.8% proteinindhold, ærteprotein - 90% prateinindhold; og soyaprotein - 90% proteinindhold, blev blandet {under anvendelse af vortex} med vand for dannelse af 5% proøteinopløsninger. 40
Ærte-
WP1 WP2 | . Soya- protein {neutral} {sur} novD | rovo protein {sur} (5%) — ll 55 54 59 | 58 56 56 54,4 94,6 34,1 | 94,2 94,4 84.4
Tabel 15: List over ingredienser og deres proportioner.
FIG. 18 viser eksempler på de forskellige proteinopløsninger. 13 100 ul af hver proteinopiøsning blev fordelt | en fladbundet, klar 98 brønd plade i tre kopier {som vist | tabel 15). Absorbansen af hver prøve blev målt ved 800 nm med en pladeadapter på Spectramax. Resultater er vist i tabet 16.
Vatte-protein | Valla-ørotein isclarat isclerat {sur} {neutral}
Ærta- protein Soya- nOVD FOVD {SUf} retain Vand
Tabel 16. Absorbansresultater for skellige proteinopløsninger.
Eksempel 11: Sammenligning af suspensionsstabilitet af proteinforstærkede opløsninger dette eksempel blev egnetheden til forstærkning af orangejuice (med tilføjet calcium og vitamin D) med rOVD bestemt.
DK 202300014 Y3 74
Orangejuice (uden pulp; med 350 mg calcium og 2,5 mcg vitamin D pr. serverings- størrelse på 8 fluid oz) blev proteinforstærket under anvendelse nOVD, valleprotein eller rOVD (86% proteinindhold). Prøverne blev behandlet som følger. Protein af interesse blev tilføjet ved forskellige mængder til 10 g orangejuice og blandet indtil fuldstændigt opløst for tilvejebringelse af forstærket orangejuice. pH for den oprindelige orangejuice uden proteinforstærkning (som kontrolprøve) blev målt og betragtet som et mål pH. pH for forstærkede orangejuiceprøver blev justeret under anvendelse af 1 M citronsyre og/eller bagesoda til at være tæt på mål pH. Proteinopløselighed og/eller udfældning blev observeret i alle prøver før en varmebehandling. En varmebehandling på 70°C i 1 minut blev anvendt for tilstrækkeligt at reducere den mikrobielle belastning i orangejuice.
Derefter blev prøverne straks afkølet til 4°C i 10 minutter.
Den fysiske og suspensionsstabilitet for prøverne blev evalueret straks efter varme- processen (FIG. 17A) og efter 48 timers opbevaring ved 4°C (FIG. 17B).
Suspensionsstabiliteten for orangejuice forstærket med 15% nOVD eller 15% rOVD blev fundet at være tilsvarende som kontrollen, som ikke inkluderede nogen proteinforstærkning. Efter 48 timer havde orangejuice forstærket med 15% valleprotein dannet en smule gel, således blev en separation ikke observeret i denne prøve. rOVD ved en højere koncentration (30%) udfældede ikke og var fuldstændigt opløselig i orangejuicen, selv under tilstedeværelse af 0,25 mcg vitamin D og 35 mg calcium. rOVD blev også fundet at være varmestabil og dannede ikke nogen gel under pasteurisering. Udtrykt ved udseende, blev ingen signifikant forskel observeret imellem kontrollen og orangejuicen forstærket med 15% nOVD eller med rOVD ved to niveauer: 15% eller 20%.
Eksempel 12: Sammenligning af suspensionsstabilitet af proteinforstærket gelé | dette eksempel blev egnetheden for forstærkning af gelé med rOVD evalueret.
JelloTM gelé blev anvendt til proteinforstærkning under anvendelse af nOVD (80% protein), rOVD (8693% protein), ikke smagstilsat valleisolatproteiner (87,5-92,7% protein), ikke smagstilsat gelatine (92% protein). Prøverne blev fremstillede som følger:
DK 202300014 Y3 75
Kontrolgelé-fremgangsmåde: varmt vand blev tilføjet til geléblandingspulveret og omrørt i 2 minutter indtil det var fuldstændigt opløst. Koldt vand blev herefter tilføjet for at fylde 2 cm i 1 oz kopper, forsynet med låg og derefter kølet.
Forstærket geléfremgangsmade: varmt vand blev tilføjet til geléblandingspulveret og omrørt i 2 minutter indtil det var fuldstændigt opløst. Koldt vand blev gradvist tilføjet til proteinpulveret og langsomt omrørt for opløsning. Den opløste geléopløsning blev overført til proteinblandingen og blandet fuldstændigt. 2 cm i 1 oz kopper blev fyldt, forsynet med låg og derefter afkølet.
Proteingeléformuleringer: liste over ingredienser og deres proportioner anvendt i kontrollen og andre eksperimentelle geléprøver, med specifikt protein af interesse, er vist nedenfor i tabel 17. [em | mm [næ] orm me] pæl
Tabel 17: Liste over ingredienser (+ mængder af ingredienser justeret baseret på % protein w/w indhold). Teksturerne for geléprøverne blev målt under anvendelse af Brookfield CT3 tekstur analysator (tabel 18). Fra hver geléprøve blev der foretaget tre afleesninger. Geléer blev centralt placerede under testproben og komprimerede til en afstand på 5 mm ifølge testindstillingerne nedenfor. Vedhæftning (også kendt som klæbrighed) målte den energi, som krævedes for at adskille tiltrækningskræfterne imellem overfladen af geléen og overfladen af proben (hvilket ligner klæbrigheden på en tunge, tand og/eller en gane). Hårdheden er den kraft, som kræves for at komprimere geléen for at opnå en given deformation.
DK 202300014 Y3 76
Hårdhed (g) og vedhæftning (mj) pis [gm
Tabel 18: Teksturanalysator testindstillinger
Udtrykt ved vedhæftning blev der ikke observeret nogen statistisk signifikant forskel imellem gelé forstærket med 20% nOVD og kontrollen. På den anden side var vedhæftningsværdier for gelé med 20% valle og rOVD proteiner signifikant lavere (tabel 19).
Vedhæftning (mj) 0,09+0,03a 0,03 + 0,005 c 0,08 + 0,01 ab | 0,04 £0,02 bc
Tabel 19: Teksturanalyseresultater. "Middelværdi + Standardafvigelse; geléprøver indeholdende forskellige bogstaver for en given kvantitativ parameter (eksempelvis hårdhed) er statistisk forskellige fra hinanden ved p < 0,05.
Gelé forstærket med 20% valle, nOVD eller rOVD var signifikant mindre hårde end kontrolgeléen.
Ingen signifikant forskel blev observeret imellem klarheden af kontrolgeléen og gelé forstærket med 20% rOVD (p<0,05). Gelé forstærket med valleisolat-protein var opak og uklar (FIG. 18A og FIG. 18B).
Teksturen af JelloTM forstærket med 20% valleprotein var meget blød og ikke sammenlignelig med kontrollen (FIG. 18C).
Teksturen af JelloTM med enten 16% eller 20% hydrolyseret gelatine var gummiagtig med kraftigt tilbagespring og modstand mod deformation. | dette eksperiment var opdeling af prøverne ikke mulig, eftersom geléen hærdedes meget hurtigt ved rum- temperatur. (FIG. 18D og FIG. 18E).
Eksempel 13: Test af rekombinant OVD fra forskellige arter
DK 202300014 Y3 77 dette eksempel blev egenskaber for rOVD med aminosyresekvenser fra ikke-kyllinge, fuglearter evaluerede.
To ekspressionskonstrukter blev dannet for udtryk af to ikke-kyllinge rOVD (SEQ ID
NO: 40, kaldt rOVD-T (kalkungrib) og SEQ ID NO: 43, kaldt rOVD-H (kolibri) i det følgende) i Pichia pastoris og udtrykt i, oprenset og bearbejdet tilsvarende som eksempel 2. Lyofiliserede rOVD prøver blev blandet i vandige opløsninger (destilleret vand) ved forskellige koncentrationer og pH'er. Klarhed og opløselighed for rOVD opløsningerne blev derefter evalueret visuelt (eksempelvis for turbiditet, udfældning, viskositet og farve) samt ved måling af absorbans ved 600 nm.
FIG. 19A viser protein-vand-prøver omfattende rOVD-H i deioniseret vand ved pro- teinkoncentrationer på 4,23%, 10%, 20% eller 30% w/v. Opløsningerne havde en pH på 4,15. Ligesom kyllinge rOVD fra de tidligere eksempler, viser FIG. 19A en klar og farveløs opløsning uden udfældning og uden nogen synlige viskositetsændringer i udseende og visuel strømning af væske for opløsninger omfattende op til 20% rOVD-H.
FIG. 19B viser protein-vand-prøver omfattende rOVD-T i deioniseret vand ved pro- teinkoncentrationer på 4,23%, 10% eller 20% w/v. Opløsningerne havde en pH på 3,69.
Ligesom kyllinge rOVD i de tidligere eksempler, viser FIG 19B en klar opløsning uden udfældning og uden synlige viskositetsændringer i udseende og visuel strømning af væske for opløsninger omfattende op til 10% rOVD-T. Ved 20% blev proteinet ikke fuldt opløst.
Prøverne blev inkuberede ved rumtemperatur og underkastet tre typer af varme- behandling: pasteurisering, varmefyldning (hot fill) eller retorting som i eksempel 4 eller eksempel 5. Klarheden og opløseligheden for de forskellige rOVD'er blev derefter evalueret visuelt (eksempelvis for turbiditet, udfældning, viskositet og farve) samt ved måling af absorbans ved 600 nm. Tabel 20 viser resultaterne for pH, absorbans og klarhed af rOVD opløsning omfattende 4,23% rOVD-H eller rOVD-T opløsninger i buffer eller vand. Data i "før-bearbejdning” søjlen blev målt før enhver varmebehandling. Det var overraskende, at ved forskellige pH'er forblev rOVD opløsningerne klare selv efter ekstrem opvarmning såsom pasteurisering, varmefyldning (hot fill) eller retort. Disse resultater indikerer at rOVD prøver forbliver opløselige i opløsning ved forskellige sure pH'er, før og efter anvendelse af varme.
DK 202300014 Y3 78
Disse data viser at de favorable egenskaber offentliggjort ovenfor for den rekombinante kyllinge OVD (se eksempel 2) også kan opnås med andre rekombinante OVD'er.
OD før ved
RT
OD efter OD efter
Prøve p pasteurisering hot fill OD efter autoklave/retort b
UC PA BT Lon | om 3,5-3,9
Tabel 20: Opløselighed og klarhedsstudie for rOVD-H og rOVD-T
Eksempel 14: Sammenligning af kvægtrypsin-inhibitorisk aktivitet rOVD som fremstillet i eksempel 2 blev anvendt i dette eksempel. Trypsin-inhibi- tionsaktiviteten blev sammenlignet imellem naturligt OVD (nOVD) og rekombinant OVD (rOVD) i en standardassay (AACC #22-40,01) under anvendelse af kvægtrypsin. En sammenligning mellem rOVD og nOVD er vist i tabel 21. En trypsinenhed er arbitrært defineret som en forøgelse på 0,01 absorbansenhed ved 410 nm pr. 10 ml reaktionsblanding under betingelserne for assayet. Trypsininhibitor-aktivitet udtrykkes ved trypsin-inhibitorenheder (TIU). Tre forskellige portioner af rOVD (prøverne 1-3) blev sammenlignet med et naturligt kyllinge ovomucoid.
Trypsin-inhibitionsaktivitet
Naturligt kyllinge Ovomucoid 13721 TlU/g
Tabel 21: Sammenligning af trypsin-inhibitions-aktivitet
Eksempel 15: Sammenligning af in vitro fordøjelighed
DK 202300014 Y3 79 in vitro fordøjeligheden af rOVD prøver blev målt under anvendelse af proteinfordøjeligheds-assayproceduren (Megazyme, Medallion Labs). En sammenligning mellem rOVD prøver og nOVD er vist i tabel 22. Dataene demonstrerer ækvivalent in vitro fordøjelighed imellem naturligt ovomucoid og rOVD.
Tabel 22: Sammenligning af in vitro fordøjelighed
Eksempel 16: Ovomucoid specifikationer
Baseret på karakteriseringen af de producerede rOVD sammensætninger og egenskaber for naturligt kyllinge-ovomucoid, blev produktspecifikationer (tabel 23) og kvalitetskontrol-specifikationer (tabel 24) konstruerede for et rOVD ifølge nærværende offentliggørelse.
Proteinprocenter blev målt undere anvendelse af AOAC 2006. Se Protein (crude) in animal feed, combustion method, 990.03. /n: Official methods of analysis of AOAC
International. 18th ed. Gaithersburg: ASA-SSA Inc. og AOAC 2006. Proximate Analysis and Calculations Crude Protein Meat and Meat Products Including Pet Foods - item 80.
In: Official methods of analysis Association of Analytical Communities, Gaithersburg,
MD, 17th edition, Reference data: Method 992.15 (39.1.16); NFNAP; NITR; NT.
Fugtprocenter blev malt under anvendelse af Association of Official Analytical Chemists. 1995. In Official Methods of Analysis.
Carbohydratprocenter blev malt under anvendelse af fremgangsmader beskrevet i J
AOAC Int. 2012 Sep-Oct; 95(5):1392-7.
Fedt ved syrehydrolyse blev malt under anvendelse af AOAC International. 2012.
Official Method Fat (crude) or ether extraction in pet food. Gravimetric method, 954.02.
In: Official Methods of Analysis of AOAC International, 19th ed., AOAC International,
Gaithersburg, MD, USA, 2012.
Standardpladetælling blev målt under anvendelse af AOAC International. 2005. Aerobic plate count in foods, dry rehydratable film, method 990.12. AOAC International, 17th ed.
Gaithersburg, MD. Gær- og svampetællinger blev målt under anvendelse af AOAC
Official Method 997.02. Yeast and Mold Counts in Foods Dry Rehydratable Film Method (PetrifiimTM Method) First Action 1997 Final Action 2000. Salmonella blev målt under anvendelse af AOAC International. 2005. Salmonella in selected foods, BAX automated system, method 2003.09. /n Official methods of analysis of AOAC International, 17th ed., AOAC International, Gaithersburg, MD. Total coliform blev malt under anvendelse af AOAC International. 2005. E. coli count in foods, dry rehydratable film, method 991.14. In: Official methods of analysis of AOAC International, 17th ed. AOAC
International, Gaithersburg, MD.
Fysiske egenskaber Specifikation
Opløselighed Opløseligt i vand
Kemiske egenskaber (i pulver som det er) Specifikation Fremgangsmåde
Protein > 75% AOAC 990,032 AOAC 992,15
Fugtighed Maximum 10,0% AOAC 925,092
Carbonhydrat Maximum 20%
Fedt ved syrehydrolyse AOAC 954,024
ICP-AES”
Mikrobielle egenskaber (i pulver som det er) Specifikation Fremgangsmade
Standardpladetælling < 10000 CFU/g AOAC 990,12%
Salmonella Ikke-detekteret / 25 g AOAC 2003,098
Totale coliforme <30 CFU/g AOAC 991,14?
Tabel 23: Specifikation af ovomucoid produceret ved P. pastoris DFB-003
Analyseparameter Specifikation SOL19303 SOL19317 SOL19351
DK 202300014 Y3 81 føomnmee sa | HOT 7 pe ew [ee [ew [wee
Escherichia Coli Ikke-detekteret / | Ikke-detekteret |Ikke-detekteret Ikke-detekteret 0 em fra produkt mg prøve produkt mg prøve * Grænse for detektering for kildeorganisme = 11 CFU/mg prøve % Grænse for detektering for kodende DNA = 10 femtogram
Tabel 24: Kvalitetskontrolresultater for tre portioner af ovomucoid produceret af
P. pastoris DFB-003
Eksempel 17: Fravær af produktionsorganismer og DNA i rOVD præpara- tioner rOVD pulver blev pladeudlagt på PGA plader og hvis prøver viste kolonier, blev disse genstrøget og analyseret ved PCR for tilstedeværelse af Pichia organismen. Denne procedure blev anvendt på tre portioner af rOVD pulver fremstillet af den rekombinante stamme. Ingen fremstillingsorganismer blev detekteret i nogen af portionerne (tabel 24).
PCR analyse blev anvendt til at bekræfte at ingen kodningsstykker af rekombinant DNA var til stede i rOVD præparationen, under anvendelse af primere for rOVD kassetten.
OVD plasmid DNA blev anvendt som en positiv kontrol, som producerede et 570 bp bånd svarende til OVD PCR produktet. Dette bånd var fraværende i alle tre rOVD pulverportioner, som blev testet.
DK 202300014 Y3 82
Eksempel 18: Sammenligning immunoreaktivitet
Western Blot sammenligninger blev udført på tre rOVD portioner under anvendelse af primært anti-ovomucoid antistof fra kanin (NBP1-74676 Novus) med en 1:2500 fortynding. Det sekundære antistof, som blev anvendt, var gedeanti-kanin 1gG kon- jugeret til alkalisk phosphatase (AP ab97048 Abcam). Molekylvægt-markør-præ- paration, som blev anvendt, var fra Bio Rad (161-0394). Sammenligningen viste samme immunoreaktivitet for rOVD prøver, naturligt ovomucoid fra kyllinge-æggehvide (NOVD) og deglycosyleret naturligt ovomucoid (NOVD + PNGaseF) (FIG. 20).
Eksempel 19: Fermentering og oprensning af rOVD
En rOVD P. pastoris grundstamme blev fjernet fra cryo-opbevaring og optøet til rumtemperatur. Indholdet af de optøede grundstamme-beholdere blev anvendt til at inokulere flydende kulturmedie i den primære fermenteringsenhed og dyrket ved procestemperatur indtil målcelle-densitet blev nået. Derefter blev de dyrkede rOVD P. pastoris overført til en produktions-skala reaktor. Kulturen blev dyrket i produktions- bioreaktoren ved målfermenteringsbetingelser og født med en serie substrater.
Fermenteringen blev analyseret for kulturrenhed på adskillige tidspunkter under pro- cessen.
Den rekombinante OVD blev oprenset ved at separere cellerne fra det flydende medie ved centrifugering, efterfulgt af mikrofiltrering. Fermenteringsbouillon blev først bragt til pH 3 og fortyndet med DI vand. Celler blev fjernet under anvendelse af spandecentrifugering. Den opsamlede supernatant blev bragt til pH 7 under anvendelse af natriumhydroxid og en 0,2 tm filtrering blev udført efterfulgt af diafiltrering med fem volumener af de-ioniseret vand. Permeaterne fra 0,2 tm blev justeret til pH 5 og derefter koncentreret via 5 kDa TFF membran. 5 kDa retentatet blev udfældet under anvendelse af 65% mætnings-ammoniumsulfat. Efter salttilføjelse blev pH justeret til pH 4-4,1 med phosphorsyre. Blandingen blev inkuberet med omrøring ved rumtemperatur over natten.
Den næste dag blev udfældninger spundet ned under anvendelse af spande- centrifugering. rOVD udfældningerne blev opløst i DI vand og pH justeret til 5 under an- vendelse af natriumhydroxid. rOVD opløsningen blev derefter diafiltreret og derefter blev retentatet ført igennem 0,2 tm flaskefiltre.
En spraytørrer blev anvendt til at dehydrere rOVD opløsningen til rOVD pulver.
Eksempel 20: Hydrogenperoxid-behandling under rOVD oprensning
DK 202300014 Y3 83
Flydende rOVD blev koncentreret til 50-60 g/l under anvendelse af en 5 kDa TFF membran. rOVD opløsningen blev ført igennem et 0,2 tm filter for fjernelse af mikrober.
Hydrogenperoxid og oxygen-genererende middel i en mængde svarende til 10% volumen af opløsningen blev langsomt tilført til rOVD opløsningen under omrøring.
Blandingen blev inkuberet med omrøring og overvåget for at sikre farveændring fra en mørk grøn-brun farve før behandling til en bleg-gul farve efter behandling. Efter 1,5 time, blev diafiltrering udført via 5 kDa TFF membran med 5 volumener DI vand. rOVD i 5 kDa diafiltreringsretentatet blev udfældet under anvendelse af ammoniumsulfat ved 65% saltmætning ved rumtemperatur. Efter tilføjelse af salt blev pH justeret til pH 4-4,1 med phosphorsyre. Blandingen blev inkuberet med omrøring over natten for dannelse af udfældninger. Den næste dag blev udfældningerne spundet ned under anvendelse af spandecentrifugering. Udfældningerne blev fjernet, opløst i deioniseret vand og pH justeret til 5 under anvendelse af natriumhydroxid. Fem kDa TFF membraner blev renset og diafiltrering blev udført under anvendelse af volumener af DI vand indtil et retentat med en ledningsevne på mindre end 2,0 mS blev opnået. Retentatet blev ført igennem 0,2 tm flaskefiltre. Den filtrerede rOVD opløsning blev derefter spraytørret og opbevaret.
Eksempel 21: Genbearbejdet rOVD behandlet med hydrogenperoxid.
OVD pulver blev opløst i deioniseret vand til 50-60 g/l og filtreret igennem et hulfiber 0,2 tm tangentielstrømningsfilter, derefter igennem et 0,2 tm flaskefilter. Hydrogenperoxid i en mængde for tilvejebringelse af en 10% opløsning blev langsomt omrørt i rOVD opløsningen og inkuberet i 30 minutter. Den behandlede opløsning blev vasket igennem en 5 kDa membran under anvendelse af 5 volumener DI vand.
Ammoniumsulfat blev langsomt tilført til retentatopløsningen og pH ændredes til imellem 4 og 4,1 under anvendelse af phosphorsyre. Efter inkubering over natten med medium omrøring blev opløsningen centrifugeret og supernatanter fjernet. Udfældninger blev opsamlet, opløst i DI vand og bragt til pH 5 under anvendelse af natriumhydroxid.
Proteinopløsningen blev afsaltet med en 5 kDa membran og filtreret igennem et 0,2 um flaskefilter. Derefter blev proteinopløsningen spraytørret for fremstilling af rOVD pulver.
Eksempel 22: Sensorisk afprøvning og resultater rOVD prøven og den H202 genbearbejdede prøve kaldt RE-RC blev analyseret for deres sensoriske egenskaber for at bestemme virkningen af hydrogenperoxid-behand- ling.
DK 202300014 Y3 84
En opløsning af hver tørprøve blev præpareret med deioniseret vand ved 4,23% w/v koncentration. Begge prøver blev præsenteret for panelisterne i samme session, monadisk. Trænede panelister (n=6) evaluerede begge prøver udtrykt ved deres udseende, lugt, smag, mundfølelse og eftersmag. For hver kategori beskrev panelisterne de opfattede attributter og evaluerede derefter hvert attribut s intensitet (Kemp ef a/. 2009) under anvendelse af intensitets- eller evalueringsskalaen (tabel 25).
Tabel 26 viser at den hydrogenperoxid-behandlede prøve var lysere i farve og havde en renere sensorisk profil, med færre sensoriske attributter i sammenligning med kontrolprøven.
UDSEENDE UDSEENDE (farveintensitet) LUGT, SMAG, EFTERSMAG & (klarhed) MUNDFØLELSE (Intensitetsevaluering for "individuelle rn 3 = mild/moderat 3 = moderat intensitet 3 = moderat nm | Te | Tes
Tabel 25: Attributintensitets evalueringsskala
DK 202300014 Y3 85
Navn RE-RC blande (sedimenter synlige) klar (0), meget skummende mild nødddeagtig (2) po | som (2,5), mild gæragtig (2)
De | Hø
Tabel 26: Sensoriske evalueringsresultater
Eksempel 23: H202 behandlet rOVD testet for opløselighed og klarhed
Opløselighed og klarhed for kontrol og hydrogenperoxid-behandlede prøveopløsninger (ved 4,23% w/v) blev målt udtrykt ved optisk densitet (A600) under anvendelse af spektrofotometer. Lavere absorbansværdi ved (ved 600 nm bølgelængde) indikerer højere klarhed og op løselighed af prøveopløsningen.
Den hydrogenperoxid-behandlede prøve havde lavere absorbans (tabel 27) og en blegere farve i sammenligning med kontrollen. Dette indikerede at behandlingen resulterede i et forbedret udseende, udtrykt ved mindre intens farve og klar opløsning.
Disse træk er illustrerede i FIG. 21. [ow] re
Table 27: Absorbans (ved 600 nm) af prøveopløsninger (4,23% w/v)
Eksempel 24: Proteinbar fremstilling og test for hårdhed og sensorisk sympati
Homogene blandinger af hakkede dadler, hakkede nøddder (mandler og valnødder) og kakao blev kombineret med et proteinpulver af interesse, som vist i tabel 28. Mængden af dadler og nødder blev reduceret i formuleringer, som inkluderede proteinpulvere som det ses i tabel 29. Dadel:nødder-forholdet blev holdt på et konstant 4,6 niveau.
Æggehvideproteinpulver og nOVD blev præpareret ved inkluderingsniveauer på 2, 8, 16 eller 23% medens rOVD blev præpareret i inklusionsniveauer på 2, 4, 8, 12 eller 16%. (tabel 28 til tabel 31).
DK 202300014 Y3 86
Halvdelen af hver blanding blev bagt i ovn ved 350 grader F i ti minutter. Den anden halv af hver blanding blev testet som en ikke-bagt blanding.
Tabel 28: Liste over ingredienser og deres proportioner anvendt i kontrolformulering
Tabel 29: Liste over ingredienser og deres proportioner, anvendt i æggehvide- proteinformuleringer — Tabel 30: Liste over ingredienser og deres proportioner anvendt i nOVD formuleringer
DK 202300014 Y3 87
Tabel 31: Liste over ingredienser og deres proportioner anvendt i rOVD formuleringer
Eksempel 25: Proteinbar hardhed/teksturtest
De teksturelle egenskaber for de bagte og ikke-bagte proteinbarer som fremstillet i eksempel 25, blev målt under anvendelse af en CT3 Brookfield Texture Analyzer (1500 g lastcelle). En tre-punkts bøjningstest blev anvendt til at knække, bøje og måle hårdheden af proteinbarerne. En prøve for hvert protein-inkluderingsniveau blev analyseret. Testparametrene, som blev anvendt, er vist i tabel 32.
Hardhedsresultaterne for de bagte proteinbarer blev meget højere end hårdheds- resultaterne for den ikke-bagte version. Indenfor de ikke-bagte proteinbarer, resulterede 8% inklusion for alle proteinpulvere i modsvarende hårdhedsværdier. Hårdhedsprofilen for alle ikke-bagte proteinbarer steg gradvis når protein-inkluderingsniveauerne steg.
Hårdhedsværdier ved 18% og 23% protein-inkludering var også sammenlignelige for =æggehvide-protein, naturligt OVD og rOVD. Se tabel 33 og tabel 34.
Æggehvide-protein kunne inkluderes op til 32% proteinniveauer. Et maksimum på 23% protein-kluderingsniveauer i en proteinbar blev observeret for naturligt og FOVD. Højere proteinkoncentrationer var ude af stand til at blive inkorporeret i en proteinbar form.
Hårdhedsværdierne for nOVD ved 8% inkluderingsniveau var langt lavere end æggehvideprotein og rOVD. Imidlertid blev modsvarende hårdhedsværdier obser- verede for alle proteinbar prøver ved et inklusionsniveau på 16% og 23%. De bagte proteinbarer med naturligt og rOVD udviste en porøs krumme og hård ydre skal for højere inklusionsniveauer på 16% og 23%. Generelt var 8% proteinpulver- inklusionsniveau det mest ønskelige (højere palatabilitets og tekstur attributter) på tværs af alle proteinpulvere.
DK 202300014 Y3 88
Tabel 32: Testparametre anvendt for tre-punkts bøjningstest for måling af hårdhed under anvendelse af en CT3 Brookfield Texture Analyzer
Kontrol 8% 12% 18% | 23% 32%
LE LL
Æggehvide- 86,33 186,2 | 386,6 | 299,2 | 434,6 393,6
Hr
Tabel 33: Testresultater for ikke-bagte proteinbar prøver (ej am mA] wm
Æggehvide- 1193 1525,2| 1490 | 15444 | 1506,6 1534,2
ÆRA
Tabel 34: Testresultater for ikke-bagte proteinbar prøver
Eksempel 26: Proteinbar sensorisk test
Prøver fremstillede som beskrevet i eksempel 26 blev evaluerede for kvalitets- beskrivelser af trænede in-house panelister.
DK 202300014 Y3 89
Kvalitets-attributterne, som blev testet, inkluderede udseende, lugt, smag/aroma, mundfølelse/tekstur og generel sympati på en ni-punkt skala fra 1: usympatisk ekstremt, 2: usympatisk meget, 3: usympatisk moderat, 4: usympatisk let, 5: hverken sympatisk eller usympatisk, 6: sympatisk let, 7: sympatisk moderat, 8: sympatisk meget og 9: sympatisk ekstrem.
NET bagt)
Attribut sympati Kontrol | Æggehvide- | nOVD | rOVD | Kontrol | Æggehvide- | nOVD rovD protein protein ie | 0 |e [oe [eso] vs [oes we | oo | oe Je fefe| 7 [a]
Comers | ell 1 feumnsoned 8 |e fj ele] + fuel fell Let [oe]
Tabel 35: Sensoriske sympatiresultater for 8% proteinbar prøver
For kontrol ikke-bagt prøve bemærkede panelister at den havde et godt udseende, let blød tekstur/bid men generel god smag og ikke nogen ubehagelig eftersmag. For de bagte versioner, kunne panelisterne lide alle tre attributter for prøven på den højeste score og gav den en perfekt score.
For de ikke-bagte (8%) protein-barer gav panelisterne følgende kommentar: ægge- hvide-proteinbar smagte som tootsie roll, den var sød og sammenhængende, men havde en tør mundfølelse; den naturlige OVD bar var mindre klæbrig i sammenligning med kontrollen, men havde en kraftig OVD lignende, metallisk og sur smag og med en tør mundfølelse; og rOVD baren havde ikke nogen syrlighed, var en smule mindre sød, men var sammenhængende og havde en behagelig eftersmag.
For de bagte (8%) proteinbarer gav panelisterne følgende kommentarer: æggehvide- proteinbaren var en smule syrlig, havde en kikse/ristet kornlignende smag og eftersmag; den naturlige OVD bar var hårdere og klæbrig i sammenligning med kontrollen og var
DK 202300014 Y3 90 mere palaterbar; og rOVD baren manglede syrlighed, var sej og klæbrig, hvilket panelisterne kunne lide.
Ikke-bagt 16% Proteininklusion Bagt 16% Proteininklusion (ikke-bagt) (bagt)
Attribut sympati Kontrol |Aggehvide| nOVD | rOVD | Kontrol jÆggehvided nOVD rovD -protein protein [ee [eee Te == [ee pele Te
LE LT mæ [er ge LEFRERE
Tabel 36: Sensoriske sympatiresultater for 10%proteinbar prøver
For de bagte (16%) proteinbarer gav panelisterne følgende kommentarer: æggehvide- proteinbaren smagte ristet og grødagtig, var hvidlignende og havde en pulveragtig mundfølelse; nOVD baren var meget hård og besværlig at bide, lignede et hårdt brød, havde en kraftig sur smag som efterlod en brændende følelse; rOVD baren havde dæmpet sødhed, en melet og en ristet aroma, uden syrlighed eller eftersmag og den var klæbrig, men hård.
Generelt klarede rOVD barerne sig bedre end nOVD barer og sammenligneligt med æggehvide-proteinprøver i test beskrevet i eksempel 25 til eksempel 27. Et maksimum på 23% protein inkludering for nOVD og rOVD syntes muligt, medens æggehvide- proteinprøver var i stand til at gå så højt som 32% inklusionsniveauer. 8% barer blev dømt som de bedste inklusionsniveauer for alle proteinbarerne.
Tolv procent rOVD barer havde en smule syrlighed i de ikke-bagte barer, men ingen syrlighed blev opfattet i de bagte barer. De bagte barer var seje, klæbrige og hårde.
DK 202300014 Y3 91
Eksempel 27: rOVD salatdressing
En salatdressing blev fremstillet under anvendelse af en L5M-A homogenisator (Silverson) ved omgivelsestemperatur. Emulsionerne blev fremstillede ved dispergering af proteinpulver og salt i den vandige fase (vand og eddike) og omrøring ved 2000 rpm i 5 minutter, under anvendelse af General Purpose
Disintegrating Head. Efter blanding blev canolaolie tilføjet på en kontrolleret måde og homogeniseret ved 6000 rpm i 15 minutter, under anvendelse af Square Hole High
Shear Screen for fremstilling af en stabil olie-i-vand-emulsion.
Alle emulsionsprøver blev overført til glasrør, forseglede med en plastikhætte og opbevaret ved 4 'C i 7 dage. Stabiliteterne for prøverne blev evaluerede ved visuel overvågning af højden af den synlige serumseparation ved bundfasen med opbevaringstiden. Fysisk stabilitet blev overvåget indtil ingen visuel faseseparation forekom. Stabiliteten af emulsionen blev udtryktsom: %serum = (Ht/HO)*100. HO repræsenterer startemulsionshøjden og højden af synligt serumseparationslag (Ht).
Liste over ingredienser og deres proportioner anvendt i kontrol og andre salatdressingprøver med specifikt protein af interesse blev vist (tabel 37). — Tabel 37: Liste over ingredienser.
Tabel 38 viser emulsionsstabiliteten af dressingerne med opbevaringstid. Såvel nOVD som rOVD prøver viste bedre emulgerbarhed-stabilitet i sammenligning med kontrolprøven, som blev underkastet faseseparation i løbet af den første dag med opbevaring ved 4°C. Efter dag 2 udviste prøver indeholdende nOVD og rOVD ikke
DK 202300014 Y3 92 megen ændring i emulsionsfase-separationen. Højere værdier indikerer lavere emul- sionsstabilitet. [wes Tw ew ow [| wow [we ew |e
I IC CC
1 ml æ|Ll ew |e [wow [we ew |e
I IC we | wr
Tabel 38. Resultatter af emulsionsstabilitet
Example 28: rOVD æggepenslingsformulering
Filmformulerings- og glansformuleringsfunktionalitet af rOVD blev evalueret ved en brødanvendelse. Bageinstruktioner:
DK 202300014 Y3 93 a. i en lille beholder, sammenbland gær og sukker og tilføj varmt vand (85-95 F).
Lad det stå i 5 minutter b. tilføj vandet i en blandeskål c. ibland mel langsomt (30 sekunder) indtil en fast dej dannes (bland i 2 minutter på hastighed 3) d. ælt dej (foldning 7 gange) på en let melet plade i 30 sekunder, tilføj små strøninger af mel alene efter behov e. placer dej i en smurt skål. Vend dejen i skålen således, at dejoversiden også er en smule smurt. Dæk og lad den hæve i 45 minutter ved 80 F hævetemperatur (1. hævning) f. vend dejen ud på en melet plade og ælt luften ud (fold 7 gange) g. form til minibrød og placer i en smurt miniform h. dæk og lad hæve i 30 minutter ved rumtemperatur (anden hævning) i. påfør passende pensling ovenpå dejkuglerne ved et 3% niveau (i tilfælde af sesamfrøpåføring, påfør 10 sesamfrø på hver dejkugle over penslingen) j. bag ved 250 F i 8 minutter eller indtil den er gyldenbrun (skift placering af brødet ved 4 minutter for at opnå en jævn bagning på alle prøver) k. 3% pensling af total brøddej vægt blev tilført ovenpå. 25 g prøver hver især blev anvendt (total ægge-pensling = 0,75 9).
I. for prøver med helæg og kommerciel æggepenslingssubstitut, 0,75 g af hver prøve blev påført på dejoverfladen.
Formuleringerne anvendt for protein af interesse er vist i tabel 39: [me
Filmdannende 9,33 8,79
Some
Tabel 39: Liste over ingredienser og deres proportioner anvendt i ægge-penslings- formulering:
Fastholdelse af sesamfrø: Fastholdelse af eventuel topping på kage, brød, bagels eller anden bagt vare er en vigtig faktor for æggepensling. Sesamfrø blev anvendt til at evaluere bindingsfunktionen for hvert filmdannende middel efter bagning. 10 sesamfrø
DK 202300014 Y3 94 blev påført hver dejkugle efter påføringen af pensling og før bagning. Fastholdelse af disse sesamfrø blev beregnet baseret på mængden af frø, som vedhæftede brødet efter bagning.
Følgende resultater blev opnået:
Prøver Negativ kontroll ommerciet Helæg Æggehvide- rovD
CTE substitut niveau
Tabel 40: Tilbageholdelsesniveauer for sesamfrø
Kontrolprøven uden æggepensling havde ikke nogen bindende egenskab for sesamfrøene og nul sesamfrø blev tilbageholdt på overfladen efter bagning. Imidlertid var alle andre filmdannende midler i stand til at tilbageholde alle 10 frø efter bagning, hvilket foreslår en 100% tilbageholdelsesevaluering for toppings.
Kolorimetrisk assay: Individuelle prøvebilleder blev analyserede for farvedata i RGB spekteret under anvendelse af Colorgrab applikationen (Loomatix). Prøveværdier blev genereret under anvendelse af et 2x2 cm tværsnit taget fra midten af brødoverfladen.
RGB data blev derefter konverteret til et CIELAB system under anvendelse af online software www. colormine. org. CIELAB modellen er et farverumssystem, som udtrykker farve i 3 værdier: L* for lysheden fra sort (0) til hvid (100), a* fra grøn (-) til rød (+), b* fra blå (=) til gul (+). oe bs pe
Kommerciel ægge-
Tabel 42: CIELAB resultater for brød efter bagning rOVD og æggehvide-proteinprøver havde en lysere L* værdi, hvilket foreslår højere lyshed eller luminans. Kontrol (ingen ægge-pensling), kommerciel ægge-penslingssub-
DK 202300014 Y3 95 stitut og æggehvide-proteinprøver havde en lav at værdi hvilket foreslår lavere rødhed eller brunhed i sammenligning med helæg og rOVD prøver.
Helæg-pensling og rOVD prøver havde også modsvarende b* værdier, hvilket forslår modsvarende gule nuancer i sammenligning med de øvrige prøver.
Visuel inspektion: Kontrolprøven så bleg ud, rynket og havde ikke nogen glans. Prøven med æggepensling havde god bruning, større glans og en glat overflade. Den bagte glansprøve havde en glat overflade med en let bemærkelig glans. Æggehvide- proteinpulver-prøve sammen med rOVD prøve havde en god glans og bruning. rOVD fungerede godt som et filmdannende og glansdannende middel. Alle sesam- frøene forblev på overfladen efter bruning, hvilket foreslår gode filmdannende og bindingskapabiliteter. Den visuelle inspektion og farveværdier foreslog god glansdan- nelse og bruning i sammenligning med andre prøver (FIG. 22).

Claims (80)

DK 202300014 Y3 96 BRUGSMODELKRAV
1. Sammensætning omfattende et rekombinant ovomucoid protein (rOVD), hvor rOVD'et omfatter i det mindste én glycosyleret asparaginrest og rOVD’et er i det væsentlige uden N-forbundet mannosylation.
2. Sammensætning ifølge krav 1, hvor hvert glycosyleret asparagin omfatter en enkelt N-acetylglucosamin.
3. Sammensætning ifølge krav 1 eller 2, hvor rOVD'et omfatter i det mindste tre glycosylerede asparaginrester.
4. Sammensætning ifølge ethvert af kravene 1 til 3, hvor sammensætningen er et pulver.
5. Sammensætning ifølge krav 4, hvor sammensætningen har et proteinindhold på i det mindste 70% rOVD protein på en vægt/vægtbasis og/eller en vægt pr. total volumen af sammensætningen basis.
6. Sammensætning ifølge krav 4 eller 5, hvor sammensætningen har et proteinindhold på i det mindste 80% rOVD protein på en vægt/vægtbasis og/eller en vægt pr. total volumen af sammensætningen basis.
7. Sammensætning ifølge ethvert af kravene 4 til 6, hvor sammensætningen har et proteinindhold på i det mindste 85% rOVD protein på en vægt/vægtbasis og/eller en vægt pr. total volumen af sammensætningen basis.
8. Sammensætning ifølge ethvert af kravene 4 til 7, hvor sammensætningen har et proteinindhold på i det mindste 90% rOVD protein pa en vægt/vægtbasis — og/eller en vægt pr. total volumen af sammensætningen basis.
DK 202300014 Y3 97
9. Sammensætning ifølge ethvert af kravene 4 til 8, hvor sammensætningen har et proteinindhold på i det mindste 95% rOVD protein på en vægt/vægtbasis og/eller en vægt pr. total volumen af sammensætningen basis.
10. Sammensætning ifølge ethvert af kravene 4 til 9, hvor pulveret omfatter mindre end 10% fugt på en vægt/vægtbasis og/eller en vægt pr. total volumen af sammensætningen basis.
11. Sammensætning ifølge ethvert af kravene 4 til 10, hvor pulveret omfatter mindre end 8% fugt på en vægt/vægtbasis og/eller en vægt pr. total volumen af sammensætningen basis.
12. Sammensætning ifølge krav 4 til 11, hvor pulveret omfatter mindre end 6% fugt på en vægt/vægtbasis og/eller en vægt pr. total volumen af — sammensætningen basis.
13. Sammensætning ifølge ethvert af kravene 4 til 12, hvor pulveret omfatter mindre end 5% fugt på en vægt/vægtbasis og/eller en vægt pr. total volumen af sammensætningen basis.
14. Sammensætning ifølge ethvert af kravene 4 til 13, hvor pulveret omfatter mindre end 3% fugt på en vægt/vægtbasis og/eller en vægt pr. total volumen af sammensætningen basis.
15. Sammensætning ifølge ethvert af kravene 4-14, hvor pulveret omfatter mindre end 2% fugt på en vægt/vægtbasis og/eller en vægt pr. total volumen af sammensætningen basis.
16. Sammensætning ifølge ethvert af kravene 4 til 15, hvor pulveret omfatter mindre end 1% fugt på en vægt/vægtbasis og/eller en vægt pr. total volumen af sammensætningen basis.
DK 202300014 Y3 98
17. Sammensætning ifølge krav 4, hvor pulverets sammensætning er af væsentlig optisk klarhed i en vandopløsning omfattende omkring 10% rOVD på en vægt/vægtbasis og/eller en vægt pr. total volumen af vandopløsning.
18. Sammensætning ifølge krav 4, hvor pulverets sammensætning er af væsentlig optisk klarhed i en vandopløsning omfattende omkring 20% rOVD på en vægt/vægtbasis og/eller en vægt pr. total volumen af vandopløsning.
19. Sammensætning ifølge krav 4, hvor pulverets sammensætning er af væsentlig optisk klarhed i en vandopløsning omfattende omkring 30% rOVD på en vægt/vægtbasis og/eller en vægt pr. total volumen af vandopløsning.
20. Sammensætning ifølge ethvert af kravene 1 til 19, hvor sammensætningen omfatter mindre end 5% aske på en vægt/vægtbasis.
21. Sammensætning ifølge krav 1, hvor rOVD er et kyllinge rOVD.
22. Sammensætning ifølge krav 1, hvor rOVD er et kalkungrib rOVD.
23. Sammensætning ifølge krav 1, hvor rOVD er et kolibri rOVD.
24. Sammensætning ifølge krav 1, hvor rOVD er et gåse rOVD.
25. Sammensætning ifølge krav 1, hvor rOVD er udtrykt i en mikrobiel — organisme.
26. Sammensætning ifølge krav 25, hvor rOVD er udtrykt i en Pichia art.
27. Sammensætning ifølge krav 25, hvor rOVD er udtrykt i en Saccharomyces art
28. Sammensætning ifølge krav 25, hvor rOVD er udtrykt i en Trichoderma art.
DK 202300014 Y3 99
29. Sammensætning ifølge krav 25, hvor rOVD er udtrykt i en Pseudomonas art.
30. Sammensætning ifølge krav 25, hvor rOVD er udtrykt i en Aspergillus art.
231. Sammensætning ifølge krav 25, hvor FOVD er udtrykt i en E. Coli art.
32. Sammensætning ifølge krav 1, hvor sammensætningen er en fast konsumerbar sammensætning.
233. Sammensætning ifølge krav 32, hvor rOVD'et ikke i det væsentlige ændrer det synlige udseende af den faste konsumerbare sammensætning Ii sammenligning med en fast konsumerbar sammensætning som ikke indeholder rOVD.
234. Sammensætning ifølge krav 32, hvor rOVD’et ikke i det væsentlige ændrer mundfølelsen af den faste konsumerbare sammensætning i sammenligning med en fast konsumerbar sammensætning som ikke indeholder rOVD.
35. Sammensætning ifølge krav 32, hvor sammensætningen omfatter i det mindste 0,1% vægt pr. total volumen rOVD.
36. Sammensætning ifølge krav 32, hvor sammensætningen omfatter højest 10% vægt pr. total volumen rOVD.
237. Sammensætning ifølge krav 32, hvor sammensætningen omfatter mindre end 20% vægt pr. total volumen rOVD.
38. Sammensætning ifølge krav 32, hvor sammensætningen omfatter mindre end 30% vægt pr. total volumen rOVD.
39. Drikkevaresammensætning omfattende et rekombinant ovomucoid protein (rOVD) og i det mindste én konsumerbar væske, hvor rOVD'et er i det væsentlige opløseligt i sammensætningen, hvor rOVD’et er i det væsentlige optisk klar i en
DK 202300014 Y3 100 vandopløsning omfattende mere end omkring 10% rOVD på en vægt/vægtbasis og/eller en vægt pr. total volumen af vandopløsning.
40. Drikkevaresammenseetning ifølge krav 39, hvor rOVD'et danner en klar — opløsning ved en koncentration af fra omkring 26% til omkring 30% vægt pr. total volumen i vandopløsningen ved en pH fra omkring 2,5 til omkring 6 ved stuetemperatur.
41. Drikkevaresammensætning ifølge krav 39 eller krav 40, hvor — drikkevaresammensætningen omfattende rOVD'et påviser i det væsentlige højere opløsningsklarhed i sammenligning med en valleproteinopløsning ved en sammenlignelig koncentration (vægt pr. total volumen) i en vandopløsning.
42. Drikkevaresammensætning ifølge krav 41, hvor drikkevaresammen- sætningen og valleproteinopløsningen har en pH på omkring 2 til omkring 6.
43. Drikkevaresammensætning ifølge krav 42, hvor drikkevaresammen- sætningen og valleproteinopløsningen har samme temperatur.
44. Drikkevaresammensætning ifølge krav 43, hvor drikkevaresammen- sætningen har en pH på mellem omkring 2,0 og 6,0.
45. Drikkevaresammensætning ifølge ethvert af kravene 39 til 44, hvor rOVD’et omfatter i det mindste én glycosylerede asparaginrest.
46. Drikkevaresammensætning ifølge ethvert af kravene 39 til 45, hvor rOVD’et er i det væsentlige uden N-forbundet mannosylation.
47. Drikkevaresammensæstning ifølge krav 39, hvor rOVD er et kyllinge rOVD.
48. Drikkevaresammensæstning ifølge krav 39, hvor rOVD er et kalkungrib rOVD.
49. Drikkevaresammensæstning ifølge krav 39, hvori rOVD er et kolibri rOVD.
DK 202300014 Y3 101
50. Drikkevaresammensæstning ifølge krav 39, hvor rOVD er et gåse rOVD.
51. Drikkevaresammensætning ifølge krav 39, hvor rOVD'et er udtrykt i en — mikrobiel organisme.
52. Drikkevaresammensætning ifølge krav 39, hvor rOVD'et er udtrykt i en Pichia art.
583. Drikkevaresammenseetning ifølge krav 39, hvor rOVD'et er udtrykt i en Saccharomyces art.
54. Drikkevaresammensætning ifølge krav 39, hvor rOVD'et er udtrykt i en Trichoderma art.
55. Drikkevaresammensætning ifølge krav 39, hvor rOVD'et er udtrykt i en Pseudomonas art.
56. Drikkevaresammensæstning ifølge krav 39, hvor rOVD'et er udtrykt i en Aspergillus art.
57. Drikkevaresammenseetning ifølge krav 39, hvor rOVD'et er udtrykt i en E. Coli art.
58. Drikkevaresammensætning ifølge krav 39, hvor drikkevaresammen- sætningen omfatter i det mindste 0,1% vægt pr. total volumen rOVD.
59. Drikkevaresammensætning ifølge krav 39, hvor drikkevaresammen- sætningen omfatter højest 10% vægt pr. total volumen rOVD.
60. Drikkevaresammensætning ifølge krav 39, hvor drikkevaresammen- sætningen omfatter mindre end 20% vægt pr. total volumen rOVD.
DK 202300014 Y3 102
61. Drikkevaresammensætning ifølge krav 39, hvor drikkevaresammen- sætningen omfatter mindre end 30% vægt pr. total volumen rOVD.
62. Drikkevaresammensætning ifølge krav 39, hvor drikkevaresammen- sætningen er en kold drik.
63. Drikkevaresammensætning ifølge krav 39, hvor drikkevaresammen- sætningen er en opvarmet drik.
64. Drikkevaresammensætning ifølge krav 39, hvor drikkevaresammen- sætningen er en stuetempereret drik.
65. Drikkevaresammensætning ifølge krav 39, hvor rOVDet Ii drikkevaresammensætningen forbliver i det væsentlige opløselig efter — varmebehandling til en temperatur på imellem omkring 72°C og omkring 121°C.
66. Drikkevaresammensæstning ifølge krav 65, hvor varmebehandlingen omfatter varmefyldning (hot fill).
67. Drikkevaresammensætning ifølge krav 65, hvor varmebehandlingen omfatter pasteurisering.
68. Drikkevaresammensæstning ifølge krav 65, hvor varmebehandlingen omfatter retort.
69. Drikkevaresammensætning ifølge krav 39, hvor drikkevaresammen- sætningen er en drikkevare valgt fra en bouillon, en suppe, en sodavand, en softdrink, en smagstilsat vand, en proteinvand, en fortificeret vand, en næringsdrik, en energidrik, en sportsdrik, en restitueringsdrik, en opvarmet drink, en kaffebaseret drik og en tebaseret drik
DK 202300014 Y3 103
70. Drikkevaresammensætning ifølge krav 39, hvor drikkevaresammen- sætningen er en drikkevare valgt fra en plantebaseret mælk, en mælkebaseret drik og en plantebaseret mælkedrik
71. Drikkevaresammensætning ifølge krav 39, hvor drikkevaresammen- sætningen er en ikke-meelkebaseret drik.
72. Drikkevaresammensætning ifølge krav 71, hvor drikkevaresammen- sætningen er en juicebaseret drik.
73. Drikkevaresammensætning ifølge krav 39, hvor drikkevaresammen- sætningen er en modermælkserstatningsdrik.
74. Drikkevaresammensætning ifølge krav 39, hvor drikkevaresammen- — sætningen er en måltidserstatningsdrik.
75. Drikkevaresammensætning ifølge krav 39, omfatter yderligere et sekundært protein, hvor rOVD og det sekundære protein sammen tilvejebringer en protein- fordøjeligheds-korrigeret aminosyrescore (PDCAAS) større end omkring 0,85.
76. Drikkevaresammensætning ifølge krav 75, hvor det sekundære protein omfatter et æggehvide-lysozym (OVL).
77. Drikkevaresammensæstning ifølge krav 76, hvor forholdet mellem rOVD og > OVL er imellem omkring 60% rOVD:40% OVL og omkring 82% rOVD:18% OVL.
78. Drikkevaresammensæstning ifølge krav 39, hvor rOVD'et ikke i det væsentlige ændrer det synlige udseende eller mundfølelse af drikkevaresammensætningen sammenligning med en drikkevaresammen-sætning som indeholder — valleprotein med samme koncentration som rOVD' et.
79. Drikkevaresammensæstning ifølge krav 39, hvor rOVD'et ikke i det væsentlige ændrer det synlige udseende eller mundfølelse af drikkevaresammensætningen
DK 202300014 Y3 104 sammenligning med en drikkevaresammen-sætning som indeholder sojaprotein med samme koncentration som rOVD' et.
80. Drikkevaresammensæstning ifølge krav 39, hvor rOVD'et ikke i det væsentlige =D ændrer det synlige udseende eller mundfølelse af drikkevaresammensætningen sammenligning med en drikkevaresammen-sætning som indeholder ærteprotein med samme koncentration som rOVD' et.
DKBA202300014U 2019-07-11 2023-04-05 Proteinsammensætninger og konsumerbare produkter deraf DK202300014Y3 (da)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962873154P 2019-07-11 2019-07-11
US201962873159P 2019-07-11 2019-07-11

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DK202300014U1 DK202300014U1 (da) 2023-06-06
DK202300014U9 DK202300014U9 (da) 2023-06-06
DK202300014Y3 true DK202300014Y3 (da) 2023-07-03

Family

ID=74115272

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DKBA202300014U DK202300014Y3 (da) 2019-07-11 2023-04-05 Proteinsammensætninger og konsumerbare produkter deraf

Country Status (4)

Country Link
DE (1) DE202020005913U1 (da)
DK (1) DK202300014Y3 (da)
FI (1) FI13395Y1 (da)
WO (1) WO2021007565A1 (da)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3997118A4 (en) 2019-07-11 2023-07-19 Clara Foods Co. PROTEIN COMPOSITIONS AND CONSUMABLE PRODUCTS THEREOF
CA3191387A1 (en) 2020-09-30 2022-04-07 Nobell Foods, Inc. Recombinant milk proteins and food compositions comprising the same
US10947552B1 (en) 2020-09-30 2021-03-16 Alpine Roads, Inc. Recombinant fusion proteins for producing milk proteins in plants
KR20240038049A (ko) 2021-07-23 2024-03-22 클라라 푸드즈 컴퍼니 정제된 단백질 조성물 및 제조 방법
CN113896778B (zh) * 2021-09-27 2024-06-07 华南理工大学 一种改性麦糟蛋白及其制备方法与应用
WO2023122770A1 (en) * 2021-12-23 2023-06-29 Clara Foods Co. Protein compositions and consumable products thereof
WO2023154467A1 (en) * 2022-02-11 2023-08-17 Clara Foods Co. Protein compositions and consumable products thereof
WO2023192957A1 (en) * 2022-04-01 2023-10-05 Clara Foods Co. Recombinant protein recovery methods

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003056914A1 (en) * 2001-12-27 2003-07-17 Glycofi, Inc. Methods to engineer mammalian-type carbohydrate structures
KR101698200B1 (ko) * 2013-08-22 2017-02-02 한국식품연구원 저항원성 식품 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 저항원성 식품
EP3217807A4 (en) * 2014-11-11 2018-09-12 Clara Foods Co. Methods and compositions for egg white protein production
WO2016160655A1 (en) * 2015-03-27 2016-10-06 Kedar Challakere Synthetic avian-free egg white substitute and uses thereof
CN112888315A (zh) * 2018-08-21 2021-06-01 克莱拉食品公司 微生物中的蛋白质糖基化的修饰

Also Published As

Publication number Publication date
DK202300014U1 (da) 2023-06-06
WO2021007565A1 (en) 2021-01-14
FI13395Y1 (fi) 2023-06-06
DE202020005913U1 (de) 2023-07-04
DK202300014U9 (da) 2023-06-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK202300014Y3 (da) Proteinsammensætninger og konsumerbare produkter deraf
US11800887B2 (en) Protein compositions and consumable products thereof
US20230329294A1 (en) Protein compositions and consumable products thereof
US20220039443A1 (en) Non-animal based protein sources with functional properties
US20230086338A1 (en) Compositions for preparing animal-free egg-like products
US20230192811A1 (en) Non-animal based protein sources with functional properties
US20240225073A1 (en) Protein compositions and consumable products thereof
WO2023122770A1 (en) Protein compositions and consumable products thereof
US20240206509A1 (en) Protein compositions and consumable products thereof
WO2023192957A1 (en) Recombinant protein recovery methods

Legal Events

Date Code Title Description
UAT Utility model published

Effective date: 20230405

UME Utility model registered

Effective date: 20230703