KR20240038049A - 정제된 단백질 조성물 및 제조 방법 - Google Patents

정제된 단백질 조성물 및 제조 방법 Download PDF

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애니켓 케일
란잔 파트나크
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클라라 푸드즈 컴퍼니
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Abstract

본 개시내용은 엑소폴리사카라이드 및 이취 성분을 포함하는 원치않는 부산물이 실질적으로 없는 재조합 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 정제 방법은 음이온 수지, 양이온 교환 수지, 응집제, 흡착제 및/또는 효소 처리를 수반한다.

Description

정제된 단백질 조성물 및 제조 방법
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2021년 7월 23일에 출원된 미국 가출원 제63/225,388호 및 2021년 7월 23일에 출원된 미국 가출원 제63/225,410호의 이익을 주장하며, 이들 각각의 내용은 그 전체가 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 정제된 단백질 조성물 및 제조 방법에 관한 것이다.
이상적으로, 소비가능한 재조합 단백질의 조성물은 원치않는 제조 성분, 오염 물질, 및 기타 미생물 성분 및 부산물이 없다. 일부 경우에, 재조합 미생물 세포는 측정가능한 양의 원치않는 부산물을 합성하며, 이들은 상업용 제품을 생산할 때 원하는 소비가능한 재조합 단백질로부터 단리되어야 한다. 이러한 원치않는 부산물이 실질적으로 없는 소비가능한 재조합 단백질을 생산할 충족되지 않은 요구가 여전히 남아 있다.
본 개시내용은 본원에 개시된 원치않는 부산물이 실질적으로 없는 소비가능한 재조합 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 양태는 소비가능한 조성물을 제조하는 방법이다. 이 방법은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 수득하는 단계로서, 재조합 세포 부산물은 엑소폴리사카라이드(EPS) 및 이취 성분을 포함하는 것인 단계; 복수의 재조합 세포 부산물로부터 재조합 단백질을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계로서, 가공 단계는 재조합 단백질에 가역적으로 부착되고 복수의 재조합 세포 부산물에 실질적으로 부착되지 않는 음이온 수지를 포함하는 것인 단계; 분리된 재조합 단백질을 수집하여 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물을 수득하는 단계; 및 단백질 생성물을 포함하는 소비가능한 조성물을 제제화하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 또 다른 양태는 소비가능한 조성물을 제조하는 방법이다. 이 방법은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 수득하는 단계로서, 재조합 세포 부산물은 엑소폴리사카라이드(EPS) 및 이취 성분을 포함하는 것인 단계; 복수의 재조합 세포 부산물로부터 재조합 단백질을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계로서, 가공 단계는 재조합 단백질에 가역적으로 부착되고 복수의 재조합 세포 부산물에 실질적으로 부착되지 않는 하나 이상의 양이온 교환 수지를 포함하는 것인 단계; 분리된 재조합 단백질을 수집하여 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물을 수득하는 단계; 및 단백질 생성물을 포함하는 소비가능한 조성물을 제제화하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 추가 양태는 소비가능한 조성물을 제조하는 방법이다. 이 방법은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 수득하는 단계로서, 재조합 세포 부산물은 엑소폴리사카라이드(EPS) 및 이취 성분을 포함하는 것인 단계; 복수의 재조합 세포 부산물로부터 재조합 단백질을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계로서, 가공 단계는 복수의 재조합 세포 부산물의 하나 이상의 성분에 가역적으로 부착되고 재조합 단백질에 실질적으로 부착되지 않는 응집제를 포함하는 것인 단계; 분리된 재조합 단백질을 수집하여 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물을 수득하는 단계; 및 단백질 생성물을 포함하는 소비가능한 조성물을 제제화하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 추가 양태는 소비가능한 조성물을 제조하는 방법이다. 이 방법은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 수득하는 단계로서, 재조합 세포 부산물은 엑소폴리사카라이드(EPS) 및 이취 성분을 포함하는 것인 단계; 복수의 재조합 세포 부산물로부터 재조합 단백질을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계로서, 가공 단계는 복수의 재조합 세포 부산물의 하나 이상의 성분에 가역적으로 부착되고 재조합 단백질에 실질적으로 부착되지 않는 흡착제를 포함하는 것인 단계; 분리된 재조합 단백질을 수집하여 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물을 수득하는 단계; 및 단백질 생성물을 포함하는 소비가능한 조성물을 제제화하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 소비가능한 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 방법은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 수득하는 단계로서, 재조합 세포 부산물은 엑소폴리사카라이드(EPS) 및 이취 성분을 포함하는 것인 단계; 복수의 재조합 세포 부산물로부터 재조합 단백질을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계로서, 가공 단계는 재조합 단백질을 소화시키거나 EPS를 소화시키는 효소를 포함하는 것인 단계; 분리된 재조합 단백질을 수집하여 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물을 수득하는 단계; 및 단백질 생성물을 포함하는 소비가능한 조성물을 제제화하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 임의의 본원에 개시된 방법에 의해 수득된 소비가능한 조성물을 제공한다.
추가적으로, 본원에 개시된 임의의 조성물 또는 방법은 임의의 본원에 개시된 조성물 또는 방법에 적용가능하다. 즉, 본원에 기재된 임의의 양태 또는 구현예는 본원에 개시된 바와 같은 임의의 다른 양태 또는 구현예와 조합될 수 있다.
본 발명의 신규한 특징들이 첨부된 청구범위에서 상세히 제시된다. 본 발명의 특징 및 이점은 본 발명의 원리가 이용되는 예시적인 구현예를 제시하는 하기 상세한 설명 및 이의 첨부 도면을 참조하여 더 잘 이해될 것이다:
도 1 내지 도 10은 본 개시내용의 단백질 생성물 또는 정제된 EPS를 생산하는 방법을 예시하는 흐름도이다.
도 11은 상기 나열된 전형적인 이온 교환 수지를 사용한 재조합 단백질의 분리를 보여주는 크로마토그램이다. 검은색 선은 단백질을 나타내는 280 nm에서의 흡광도 트레이스(trace)이다.
도 12는 예시적인 단백질의 정제를 위해 SP 400 수지를 사용하는 공정의 크로마토그램이다. n=3, 전도도를 나타내는 점선.
도 13은 예시적인 단백질의 정제를 위해 SP 400 및 세프라겐 S(Sepragen S) 수지의 조합(2.75:1.25 비율)을 사용하는 공정의 크로마토그램이다. n=3, 전도도를 나타내는 점선.
도 14a는 예시적인 단백질의 정제를 위해 음이온 교환 캅토 Q(Capto Q) 수지를 사용하는 공정에서의 분획의 크로마토그램이다. 처음 2개의 둥근 피크를 갖는 곡선은 단백질 용출(280 nm)을 나타내고, 각진 선은 공정에 사용된 용출 완충액 B를 나타내며, 곡선은 공정 동안 사용량을 나타내고, 마지막 피크를 갖는 곡선은 전도도를 나타낸다(예상대로, 전도도는 단백질 용출 동안 높고 CIP 용출 동안 매우 높음).
도 14b는 도 14a에 나타낸 분획의 SDS-PAGE 겔이다. 레인 2는 공급액이고, 레인 3은 통과액이며, 레인 4는 용출액이고, 레인 5는 제자리 세정(cleaning in place, CIP)이다.
도 15는 실시예 4의 연구로부터의 상층액의 흡수 스펙트럼을 보여주는 차트이다. 더 높은 pH는 전반적으로 더 높은 흡광도를 나타내었고, 이는 단백질이 pH 4보다 pH 6에서 더 안정적임을 보여준다. 그러나, 시험한 다양한 흡착제에 대해 pH 4.0에서, 벤토나이트 BE125가 가장 큰 흡광도 감소를 나타내었다. 350 nm에서, 상부로부터 하부로, 곡선은 렐리조브 SP400(Relizorb SP400); 필터 보조제 없음, pH4; 겹쳐진 EZ DE - 셀라이트 545(Celite 545) - 필터 보조제 없음, pH6; 겹쳐진 디아이온 HPA25L(DIAION HPA25L) - 탈아세틸화된 키토산 85%; 및 벤토나이트 BE125이다.
도 16은 실시예 4로부터 생성된 상층액의 EPS 분석을 보여주는 그래프이다.
도 17은 실시예 4로부터의 상층액의 관심있는 단백질 분석을 보여주는 그래프이다.
도 18은 대조군 및 다양한 재가공 방법을 비교한다. 오각형의 중심 코어를 둘러싸는 곡선은 가장 중립적이고 선호되는 단백질 생성물이다. 맛과 관련된 데이터(오각형의 오른쪽을 향함)의 경우, 가장 좋지 않은 것은 대조군이고, 그 다음은 열 및 진공이며; 그 다음은 이온 교환(IEX), 열, 및 진공이고; 그 다음은 에탄올이며; 가장 좋은 것은 이온 교환이었다. 외관과 관련된 데이터(상부)의 경우, 가장 좋지 않은 것은 열 및 진공이었으며, 그 다음은 대조군이었고, 그 다음은 IEX, 열, 및 진공이었으며; 그 다음은 이온 교환이었고; 가장 좋은 것은 에탄올이었다.
본 개시내용은 본원에 개시된 원치않는 부산물이 실질적으로 없는 소비가능한 재조합 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
재조합 단백질이 효모, 예컨대 피치아(Pichia)를 발효시킴으로써 생산될 때, 재조합 세포도 마찬가지로 재조합 세포 부산물을 생산한다는 것이 발견되었다. 예컨대, 재조합 세포 부산물이 엑소폴리사카라이드(EPS)인 경우, 재조합 세포 부산물 성분은 재조합 단백질과 거의 동일한 비율로 생산될 수 있다. 이는 생성된 단백질 생성물 또는 소비가능한 조성물 내의 재조합 단백질의 더 낮은 농도를 초래한다. 일부 경우에, 단백질 생성물 또는 소비가능한 조성물 내의 재조합 세포 부산물의 존재는 바람직하지 않은 맛을 가질 수 있다. 더욱이, 단백질 생성물 또는 소비가능한 조성물 내의 재조합 세포 부산물의 존재는 재조합 세포 부산물이 결여된 단백질 생성물 또는 소비가능한 조성물에 비해 상이한 특성, 예컨대 밀도, 점도, 겔화, 및 풍미를 가질 것이다. 따라서, 재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물, 예컨대 EPS 및/또는 이취 성분을 포함하는 조성물을 가공하여 재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 분리하는 방법이 필요하다.
수지 기반 정제
본 개시내용의 양태는 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물을 제조하는 방법이다. 이 방법은 재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 수득하는 단계; 재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계로서, 가공은 재조합 단백질에 가역적으로 부착되고 재조합 세포 부산물에 실질적으로 부착되지 않는 수지를 포함하는 것인 단계; 및 분리된 재조합 단백질을 수집하여 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물을 수득하는 단계를 포함한다. 이 방법에서, 재조합 세포 부산물은 엑소폴리사카라이드(EPS) 또는 이취 성분이다.
재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 생산하고, 재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 분리하는 예시적인 방법이 도 1에 나타나 있다. 이 양태의 방법은 발효 공정 동안 생산되는 임의의 세포외 생성물을 분리하는 데 사용될 수 있다. 재조합 세포 부산물(예컨대, EPS 또는 이취 성분) 분자는 본질적으로 이온성이 아니며 이온 교환 컬럼에서 통과할 것이다.
구현예에서, 수지는 음이온 교환기이거나 수지는 양이온 교환 수지이다. 일부 경우에, 양이온 교환기는 강한 양이온 교환 수지 또는 약한 양이온 교환 수지이다. 일부 구현예에서, 강한 양이온 교환 수지는 설포네이트형 수지이거나, 약한 양이온 교환 수지는 카르복시메틸형 수지이다.
단백질에 결합할 수 있는 임의의 상업적으로 이용가능한 수지가 사용될 수 있다.
본 개시내용의 양태는 소비가능한 조성물을 제조하는 방법이다. 이 방법은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 수득하는 단계로서, 재조합 세포 부산물은 엑소폴리사카라이드(EPS) 및 이취 성분을 포함하는 것인 단계; 복수의 재조합 세포 부산물로부터 재조합 단백질을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계로서, 가공 단계는 재조합 단백질에 가역적으로 부착되고 복수의 재조합 세포 부산물에 실질적으로 부착되지 않는 음이온 수지를 포함하는 것인 단계; 분리된 재조합 단백질을 수집하여 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물을 수득하는 단계; 및 단백질 생성물을 포함하는 소비가능한 조성물을 제제화하는 단계를 포함한다.
구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 세포 배양 배지이다.
일부 구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 분비한 재조합 세포를 포함하는 세포 배양 배지이다.
다양한 구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 분비한 재조합 세포가 결여되어 있다.
몇몇 구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 단백질의 등전점(pI)보다 큰 pH를 갖는다.
구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물의 pH는 재조합 단백질의 pI보다 큰 pH를 달성하도록 변형되지 않는다.
일부 구현예에서, 음이온 수지는 강한 음이온 교환 수지 또는 약한 음이온 교환 수지이다.
다양한 구현예에서, 음이온 수지는 캅토 Q(Capto Q) 수지, DEAE 유형 약한 음이온 교환기, 트리메틸 아미노에틸 기를 갖는 수지, 트리에틸 아미노에틸 기를 갖는 수지, 4차 아민 기를 갖는 수지 중 하나 이상이다.
몇몇 구현예에서, 음이온 수지는 크로마토그래피 시스템의 성분이다.
구현예에서, 크로마토그래피 시스템은 축상 유동 컬럼 또는 방사상 유동 컬럼 또는 원심분리 컬럼에 의하거나 또는 막 크로마토그래피 컬럼의 사용에 의한 배치 모드로 작동한다.
일부 구현예에서, 크로마토그래피 시스템은 복수의 컬럼을 병렬로 포함하는 연속 모드로 작동하며, 여기서 컬럼으로의 공급은 크로마토그래피 공정에서의 다양한 단계(예컨대, 평형화, 로딩, 용출, 및 세정)가 동시에 발생하도록 전환가능하다.
다양한 구현예에서, 연속 모드는 모사 이동층(SMB) 또는 이온 분리기(예컨대, ISEP®) 시스템을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 세포를 포함하는 소모된 바이오매스를 제거하기 위해 사전에 처리되고/되거나 작은 비단백질 분자를 제거하기 위해 사전에 처리된다.
구현예에서, 작은 비단백질 분자를 제거하기 위한 처리는 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 농축하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 작은 비단백질 분자를 제거하기 위한 처리는 정용여과 완충액을 포함한다.
다양한 구현예에서, 방법은 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물을 생산하기 위해 그 분리된 재조합 단백질의 농축 단계 및/또는 정용여과 처리를 추가로 포함한다.
몇몇 구현예에서, 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물은 추가로 열 처리 및/또는 건조된다.
구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물 및/또는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물은 추가로 열 처리 및/또는 건조된다.
일부 구현예에서, 열 처리는 재조합 단백질 및 이취 성분을 분리하고, 여기서 열은 이취 성분이 휘발되어 기체상 이취 성분이 제거될 수 있는 온도 및 지속시간으로 적용된다.
다양한 구현예에서, 열의 적용과 동시에 진공이 적용되고, 진공은 기체상 이취 성분의 제거를 촉진한다.
몇몇 구현예에서, 이취 성분은 산, 알코올, 알데하이드, 방향족, 에스테르, 또는 케톤이다.
구현예에서, 이취 성분은 (E)-2-노네날; 1-도데센; 1-헥산올, 2-에틸-; 1-헥센-3-온; 1-옥텐-3-온; 2,3-부탄디온; 2-부탄온; 2-메틸부탄알; 2-메틸프로판알; 2-프로판온; 2-운데칸온; 3-메틸부탄알; 아세트알데하이드; 벤젠 에탄올; 벤질 알코올; 부탄알, 3-메틸-; 클로로톨루엔; 노난산; p-크레졸; 또는 프로판산, 2-메틸-, 3-하이드록시-2,4,4-트리메틸펜틸 에스테르이다.
일부 구현예에서, 열 처리 동안 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물, 및/또는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물의 온도는 최대 80℃, 예컨대 약 50℃ 내지 약 60℃이다.
다양한 구현예에서, 방법은 열 처리 동안 교반을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 열 처리 및/또는 건조 단계는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 건조 단백질 생성물을 생산한다.
구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물 및/또는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물은 산화 단계, 예컨대 과산화수소의 첨가를 포함하는 산화 단계를 추가로 수행한다.
일부 구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물 내의 재조합 세포 부산물 대 재조합 단백질의 비율은 약 1:3 내지 약 3:1이다.
다양한 구현예에서, 단백질 생성물은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물에 비해 EPS의 양 및/또는 이취 성분의 양에서 적어도 25% 감소, 적어도 30% 감소, 적어도 35% 감소, 적어도 40% 감소, 적어도 45% 감소, 적어도 50% 감소, 적어도 55% 감소, 적어도 60% 감소, 적어도 65% 감소, 적어도 70% 감소, 적어도 75% 감소, 적어도 75% 감소, 적어도 80% 감소, 적어도 90% 감소, 또는 적어도 95% 감소를 갖는다.
몇몇 구현예에서, 단백질 생성물의 중량의 약 10% 미만이 재조합 세포 부산물을 포함한다.
구현예에서, 단백질 생성물의 중량의 약 5% 미만이 재조합 세포 부산물을 포함한다.
일부 구현예에서, 단백질 생성물의 중량의 약 5% 미만, 약 1% 미만, 약 0.1% 미만, 또는 약 0.01% 미만이 이취 성분을 포함한다.
다양한 구현예에서, 단백질 생성물 내의 이취 성분은 표준 소비자에게 사실상 감지될 수 없다.
몇몇 구현예에서, EPS는 일반적으로 크기 배제 크로마토그래피를 사용할 때 재조합 단백질로부터 분리될 수 없다.
구현예에서, EPS는 자연적으로 재조합 세포의 세포벽의 성분이다.
일부 구현예에서, EPS는 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 의해 특징지어지는 바와 같이 약 13 kDa 내지 약 27 kDa의 겉보기 크기를 갖는다.
다양한 구현예에서, EPS는 만노스를 포함한다.
몇몇 구현예에서, EPS는 N-아세틸글루코사민 및/또는 글루코스를 추가로 포함한다.
구현예에서, EPS는 질량 분석법과 함께 가스 크로마토그래피에 의해 분석될 때 약 91 몰% 만노스, 약 5 몰% N-아세틸글루코사민, 및 약 3 몰% 글루코스를 포함한다.
일부 구현예에서, EPS는 α(1,2)-연결된 분지 및/또는 α(1,3)-연결된 분지를 갖는 α(1,6)-연결된 백본을 포함한다.
다양한 구현예에서, EPS는 만난이다.
몇몇 구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 발현하는 재조합 세포는 진균 세포, 예컨대 사상 진균 또는 효모, 박테리아 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 또는 포유동물 세포로부터 선택된다.
구현예에서, 재조합 세포 유형은 아르술라 종(Arxula spp.), 아르술라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans), 클루이베로마이세스 종(Kluyveromyces spp.), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 코마가타엘라 파피이(Komagataella phaffii), 피치아 종(Pichia spp.), 피치아 안구스타(Pichia angusta), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 종(Saccharomyces spp.), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 종(Schizosaccharomyces spp.), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 야로위아 종(Yarrowia spp.), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 아가리쿠스 종(Agaricus spp.), 아가리쿠스 비스포루스(Agaricus bisporus), 아스퍼질러스 종(Aspergillus spp.), 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 콜레토트리쿰 종(Colletotrichum spp.), 콜레토트리쿰 글로에오스포리오데스(Colletotrichum gloeosporiodes), 엔도시아 종(Endothia spp.), 엔도시아 파라시티카(Endothia parasitica), 에세리키아 콜리(Escherichia coli), 푸사리움 종(Fusarium spp.), 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 푸사리움 솔라니(Fusarium solani), 무코르 종(Mucor spp.), 무코르 미에헤이(Mucor miehei), 무코르 푸실루스(Mucor pusillus), 마이셀리오프토라 종(Myceliophthora spp.), 마이셀리오프토라 써모필라(Myceliophthora thermophila), 뉴로스포라 종(Neurospora spp.), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 페니실리움 종(Penicillium spp.), 페니실리움 카멤버티(Penicillium camemberti), 페니실리움 카네센스(Penicillium canescens), 페니실리움 크리소제눔(Penicillium chrysogenum), 페니실리움(탈라로마이세스) 에머소니(Penicillium(Talaromyces) emersonii), 페니실리움 푸니쿨로 섬(Penicillium funiculo sum), 페니실리움 퍼푸로제눔(Penicillium purpurogenum), 페니실리움 로퀘포티(Penicillium roqueforti), 플레우로투스 종(Pleurotus spp.), 플레우로투스 오스트레아투스(Pleurotus ostreatus), 슈도모나스 종(Pseudomonas spp.), 리조무코르 종(Rhizomucor spp.), 리조무코르 미에헤이(Rhizomucor miehei), 리조무코르 푸실루스(Rhizomucor pusillus), 리조푸스 종(Rhizopus spp.), 리조푸스 아르히주스(Rhizopus arrhizus), 리조푸스 올리고스포루스(Rhizopus oligosporus), 리조푸스 오리자에(Rhizopus oryzae), 트리코더마 종(Trichoderma spp.), 트리코더마 알트로비리데(Trichoderma altroviride), 트리코더마 레에세이(Trichoderma reesei), 및 트리코더마 비레우스(Trichoderma vireus)로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 진균은 피치아 종이다.
다양한 구현예에서, 피치아 종은 코마가타엘라 파피이 또는 코마가타엘라 파스토리스이다.
몇몇 구현예에서, 재조합 단백질은 효소, 영양 단백질, 식품 성분, 또는 식품 첨가물이다.
구현예에서, 효소는 펩시노겐 또는 펩신이다.
일부 구현예에서, 단백질은 난백 단백질이다.
다양한 구현예에서, 난백 단백질은 난백알부민(OVA), 오보뮤코이드(OVD), 오보트랜스페린(OVT), 라이소자임(OVL), 오보뮤신, 오보글로불린 G2, 오보글로불린 G3, 오보억제제, 오보당단백질, 플라보단백질, 오보마크로글로불린, 오보스타틴, 시스타틴, 아비딘, 난백알부민 관련 단백질 X, 또는 난백알부민 관련 단백질 Y, 및 이들의 임의의 조합이다.
몇몇 구현예에서, 난백 단백질은 새, 예컨대 닭, 메추라기, 칠면조, 칠면조 독수리, 벌새, 오리, 타조, 거위, 갈매기, 뿔닭, 꿩, 또는 에뮤에서 자연적으로 생산된 난백 단백질과 적어도 80% 동일한(예컨대, 약 85%, 90%, 또는 95% 동일한) 서열을 갖는다.
구현예에서, 단백질 생성물을 포함하는 소비가능한 조성물은 식품, 음료 제품, 또는 식이 보충제를 포함한다.
일부 구현예에서, 식품은 제과제빵(예컨대, 케이크, 머핀, 쿠키, 빵, 베이글, 페이스트리, 도넛), 스크램블, 오믈렛, 키슈, 파스타, 국수, 크레페, 와플, 도우(dough), 배터(batter), 쿠키 도우, 미트로프, 미트볼, 햄버거, 동물 사료, 과일, 야채, 두부(tofu), 비지(bean curd), 치즈, 해산물, 고기, 아이스크림, 마요네즈, 커스터드, 푸딩, 수플레, 유제, 폼, 머랭, 프로스팅, 과자, 마시멜로, 마지팬, 수프, 조미료, 소스, 향신료, 유제품, 및 드레싱을 포함한다.
다양한 구현예에서, 음료 제품은 청량 음료, 플레이버 워터(flavored water), 주스, 스포츠 음료, 에너지 음료, 스무디, 쉐이크, 알코올 음료(예컨대, 와인, 사케, 맥주, 증류주), 칵테일, 리큐어, 탄산 음료, 카페인 음료, 커피, 코코아, 차, 에그노그, 및 유제 음료를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 식이 보충제는 종합 비타민, 훌 푸드(whole food) 보충제, 다이어트 보충제, 허브 보충제, 단백질 블렌드, 매스 게이너(mass gainer), 즉석 음료 단백질, 단백질 바, 단백질 쉐이크, 단백질 분말, 단백질 샷, 단백질 분리물, 에너지 바, 에너지 겔, 에너지 츄, 에너지 포뮬러(energy formula), 지구력 포뮬러(endurance formula), 에너지 보충제, 영양 보충제, 스포츠 영양 보충제, 유아용 조제분유(infant formula)(예컨대, 분말 또는 액체), 및 식사 대용품을 포함한다.
구현예에서, 복수의 재조합 세포 부산물로부터 재조합 단백질을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계는 i) 재조합 단백질에 가역적으로 부착되고 EPS에 실질적으로 부착되지 않는 하나 이상의 양이온 교환 수지, ii) 재조합 단백질 또는 EPS를 소화시키는 효소, iii) EPS에 가역적으로 부착되고 재조합 단백질에 실질적으로 부착되지 않는 흡착제, 및/또는 iv) EPS에 부착되고 재조합 단백질에 실질적으로 부착되지 않는 응집제 중 하나 이상을 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 임의의 상기 개시된 방법에 의해 수득된 소비가능한 조성물을 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 양태는 소비가능한 조성물을 제조하는 방법이다. 이 방법은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 수득하는 단계로서, 재조합 세포 부산물은 엑소폴리사카라이드(EPS) 및 이취 성분을 포함하는 것인 단계; 복수의 재조합 세포 부산물로부터 재조합 단백질을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계로서, 가공 단계는 재조합 단백질에 가역적으로 부착되고 복수의 재조합 세포 부산물에 실질적으로 부착되지 않는 하나 이상의 양이온 교환 수지를 포함하는 것인 단계; 분리된 재조합 단백질을 수집하여 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물을 수득하는 단계; 및 단백질 생성물을 포함하는 소비가능한 조성물을 제제화하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 양이온 교환 수지는 강한 양이온 교환 수지, 예컨대 설포프로필, 설포메틸 또는 설포네이트 유형 수지, 및/또는 약한 양이온 교환 수지, 예컨대 카르복시메틸 유형 수지를 포함한다.
다양한 구현예에서, 하나 이상의 양이온 교환 수지는 폴리 스티렌 디비닐 벤젠, 폴리 메타크릴레이트 또는 셀룰로스 또는 가교결합된 덱스트란 또는 가교결합된 아가로스 또는 친수성 중합체로 코팅된 무기 물질을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 하나 이상의 양이온 교환 수지는 약 50 μm 내지 약 200 μm의 입자 크기를 갖고/갖거나 약 50 내지 약 100 g 단백질/L 수지의 단백질 결합 용량을 갖는다.
구현예에서, 하나 이상의 양이온 교환 수지는 사이티바 캅토 S(Cytiva Capto S), HP20, 렐리조브 SP400(Relizorb SP400), 세프라겐 S(Sepragen S), SP20, 및/또는 미츠비시 렐리조브 EXE349(Mitsubishi Relizorb EXE349)를 포함한다.
일부 구현예에서, 가공 단계는 2종의 양이온 수지를 포함하며, 일부 경우에, 2종의 양이온 수지는 1:5 내지 5:1, 1:4 내지 4:1, 1:3 내지 3:1, 1:2 내지 2:1, 또는 1:1의 비율이다.
다양한 구현예에서, 2개의 수지는 SP400 및 세프라겐 S이며, 약 3:1, 예컨대 2.75:1.25의 비율이다.
몇몇 구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 분비한 재조합 세포가 결여되어 있다.
구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 단백질의 등전점(pI)보다 낮은 pH를 가지며, 이는 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물의 pH를 낮춤으로써 달성된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 양이온 수지는 크로마토그래피 시스템의 성분이고, 일부 경우에, 크로마토그래피 시스템은 축상 유동 컬럼 또는 방사상 유동 컬럼 또는 원심분리 컬럼에 의하거나 또는 막 크로마토그래피 컬럼의 사용에 의한 배치 모드로 작동한다.
다양한 구현예에서, 하나 이상의 양이온 수지는 크로마토그래피 시스템의 성분이고, 일부 경우에, 크로마토그래피 시스템은 복수의 컬럼을 병렬로 포함하는 연속 모드로 작동하며, 여기서 컬럼으로의 공급은 크로마토그래피 공정에서의 다양한 단계(예컨대, 평형화, 로딩, 용출, 및 세정)가 동시에 발생하도록 전환가능하다.
몇몇 구현예에서, 연속 모드는 모사 이동층(SMB) 또는 이온 분리기(예컨대, ISEP®) 시스템을 포함한다.
구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 세포를 포함하는 소모된 바이오매스를 제거하기 위해 사전에 처리되고/되거나 작은 비단백질 분자를 제거하기 위해 사전에 처리된다.
일부 구현예에서, 작은 비단백질 분자를 제거하기 위한 처리는 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 농축하는 단계를 포함한다.
다양한 구현예에서, 작은 비단백질 분자를 제거하기 위한 처리는 정용여과 완충액을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 방법은 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물을 생산하기 위해 그 분리된 재조합 단백질의 농축 단계 및/또는 정용여과 처리를 추가로 포함한다.
구현예에서, 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물은 추가로 열 처리 및/또는 건조된다.
일부 구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물 및/또는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물은 추가로 열 처리 및/또는 건조된다.
다양한 구현예에서, 열 처리는 재조합 단백질 및 이취 성분을 분리하고, 일부 경우에, 열은 이취 성분이 휘발되어 기체상 이취 성분이 제거될 수 있는 온도 및 지속시간으로 적용된다.
몇몇 구현예에서, 열의 적용과 동시에 진공이 적용되고, 진공은 기체상 이취 성분의 제거를 촉진한다.
구현예에서, 이취 성분은 산, 알코올, 알데하이드, 방향족, 에스테르, 또는 케톤이다.
일부 구현예에서, 이취 성분은 (E)-2-노네날; 1-도데센; 1-헥산올, 2-에틸-; 1-헥센-3-온; 1-옥텐-3-온; 2,3-부탄디온; 2-부탄온; 2-메틸부탄알; 2-메틸프로판알; 2-프로판온; 2-운데칸온; 3-메틸부탄알; 아세트알데하이드; 벤젠 에탄올; 벤질 알코올; 부탄알, 3-메틸-; 클로로톨루엔; 노난산; p-크레졸; 또는 프로판산, 2-메틸-, 3-하이드록시-2,4,4-트리메틸펜틸 에스테르이다.
다양한 구현예에서, 열 처리 동안 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물, 및/또는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물의 온도는 최대 80℃, 예컨대 약 50℃ 내지 약 60℃이다.
몇몇 구현예에서, 방법은 열 처리 동안 교반을 포함한다.
구현예에서, 열 처리 및/또는 건조 단계는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 건조 단백질 생성물을 생산한다.
일부 구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물 및/또는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물은 산화 단계, 예컨대 과산화수소의 첨가를 포함하는 산화 단계를 추가로 수행한다.
다양한 구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물 내의 재조합 세포 부산물 대 재조합 단백질의 비율은 약 1:3 내지 약 3:1이다.
몇몇 구현예에서, 단백질 생성물은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물에 비해 EPS의 양 및/또는 이취 성분의 양에서 적어도 25% 감소, 적어도 30% 감소, 적어도 35% 감소, 적어도 40% 감소, 적어도 45% 감소, 적어도 50% 감소, 적어도 55% 감소, 적어도 60% 감소, 적어도 65% 감소, 적어도 70% 감소, 적어도 75% 감소, 적어도 75% 감소, 적어도 80% 감소, 적어도 90% 감소, 또는 적어도 95% 감소를 갖는다.
구현예에서, 단백질 생성물의 중량의 약 10% 미만이 재조합 세포 부산물을 포함한다.
일부 구현예에서, 단백질 생성물의 중량의 약 5% 미만이 재조합 세포 부산물을 포함한다.
다양한 구현예에서, 단백질 생성물의 중량의 약 5% 미만, 약 1% 미만, 약 0.1% 미만, 또는 약 0.01% 미만이 이취 성분을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 단백질 생성물 내의 이취 성분은 표준 소비자에게 사실상 감지될 수 없다.
구현예에서, EPS는 일반적으로 크기 배제 크로마토그래피를 사용할 때 재조합 단백질로부터 분리될 수 없다.
일부 구현예에서, EPS는 자연적으로 재조합 세포의 세포벽의 성분이다.
다양한 구현예에서, EPS는 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 의해 특징지어지는 바와 같이 약 13 kDa 내지 약 27 kDa의 겉보기 크기를 갖는다.
몇몇 구현예에서, EPS는 만노스를 포함한다.
구현예에서, EPS는 N-아세틸글루코사민 및/또는 글루코스를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, EPS는 질량 분석법과 함께 가스 크로마토그래피에 의해 분석될 때 약 91 몰% 만노스, 약 5 몰% N-아세틸글루코사민, 및 약 3 몰% 글루코스를 포함한다.
다양한 구현예에서, EPS는 α(1,2)-연결된 분지 및/또는 α(1,3)-연결된 분지를 갖는 α(1,6)-연결된 백본을 포함한다.
몇몇 구현예에서, EPS는 만난이다.
구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 발현하는 재조합 세포는 진균 세포, 예컨대 사상 진균 또는 효모, 박테리아 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 또는 포유동물 세포로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 재조합 세포 유형은 아르술라 종, 아르술라 아데니니보란스, 클루이베로마이세스 종, 클루이베로마이세스 락티스, 코마가타엘라 파피이, 피치아 종, 피치아 안구스타, 피치아 파스토리스, 사카로마이세스 종, 사카로마이세스 세레비지애, 쉬조사카로마이세스 종, 쉬조사카로마이세스 폼베, 야로위아 종, 야로위아 리폴리티카, 아가리쿠스 종, 아가리쿠스 비스포루스, 아스퍼질러스 종, 아스퍼질러스 아와모리, 아스퍼질러스 푸미가투스, 아스퍼질러스 니둘란스, 아스퍼질러스 니거, 아스퍼질러스 오리자에, 바실러스 서브틸리스, 콜레토트리쿰 종, 콜레토트리쿰 글로에오스포리오데스, 엔도시아 종, 엔도시아 파라시티카, 에세리키아 콜리, 푸사리움 종, 푸사리움 그라미네아룸, 푸사리움 솔라니, 무코르 종, 무코르 미에헤이, 무코르 푸실루스, 마이셀리오프토라 종, 마이셀리오프토라 써모필라, 뉴로스포라 종, 뉴로스포라 크라사, 페니실리움 종, 페니실리움 카멤버티, 페니실리움 카네센스, 페니실리움 크리소제눔, 페니실리움(탈라로마이세스) 에머소니, 페니실리움 푸니쿨로 섬, 페니실리움 퍼푸로제눔, 페니실리움 로퀘포티, 플레우로투스 종, 플레우로투스 오스트레아투스, 슈도모나스 종, 리조무코르 종, 리조무코르 미에헤이, 리조무코르 푸실루스, 리조푸스 종, 리조푸스 아르히주스, 리조푸스 올리고스포루스, 리조푸스 오리자에, 트리코더마 종, 트리코더마 알트로비리데, 트리코더마 레에세이, 및 트리코더마 비레우스로부터 선택된다.
다양한 구현예에서, 진균은 피치아 종이다.
몇몇 구현예에서, 피치아 종은 코마가타엘라 파피이 또는 코마가타엘라 파스토리스이다.
구현예에서, 재조합 단백질은 효소, 영양 단백질, 식품 성분, 또는 식품 첨가물이다.
일부 구현예에서, 효소는 펩시노겐 또는 펩신이다.
다양한 구현예에서, 단백질은 난백 단백질이다.
몇몇 구현예에서, 난백 단백질은 난백알부민(OVA), 오보뮤코이드(OVD), 오보트랜스페린(OVT), 라이소자임(OVL), 오보뮤신, 오보글로불린 G2, 오보글로불린 G3, 오보억제제, 오보당단백질, 플라보단백질, 오보마크로글로불린, 오보스타틴, 시스타틴, 아비딘, 난백알부민 관련 단백질 X, 또는 난백알부민 관련 단백질 Y, 및 이들의 임의의 조합이다.
구현예에서, 난백 단백질은 새, 예컨대 닭, 메추라기, 칠면조, 칠면조 독수리, 벌새, 오리, 타조, 거위, 갈매기, 뿔닭, 꿩, 또는 에뮤에서 자연적으로 생산된 난백 단백질과 적어도 80% 동일한(예컨대, 약 85%, 90%, 또는 95% 동일한) 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 단백질 생성물을 포함하는 소비가능한 조성물은 식품, 음료 제품, 또는 식이 보충제를 포함한다.
다양한 구현예에서, 식품은 제과제빵(예컨대, 케이크, 머핀, 쿠키, 빵, 베이글, 페이스트리, 도넛), 스크램블, 오믈렛, 키슈, 파스타, 국수, 크레페, 와플, 도우, 배터, 쿠키 도우, 미트로프, 미트볼, 햄버거, 동물 사료, 과일, 야채, 두부, 비지, 치즈, 해산물, 고기, 아이스크림, 마요네즈, 커스터드, 푸딩, 수플레, 유제, 폼, 머랭, 프로스팅, 과자, 마시멜로, 마지팬, 수프, 조미료, 소스, 향신료, 유제품, 및 드레싱을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 음료 제품은 청량 음료, 플레이버 워터, 주스, 스포츠 음료, 에너지 음료, 스무디, 쉐이크, 알코올 음료(예컨대, 와인, 사케, 맥주, 증류주), 칵테일, 리큐어, 탄산 음료, 카페인 음료, 커피, 코코아, 차, 에그노그, 및 유제 음료를 포함한다.
구현예에서, 식이 보충제는 종합 비타민, 훌 푸드 보충제, 다이어트 보충제, 허브 보충제, 단백질 블렌드, 매스 게이너, 즉석 음료 단백질, 단백질 바, 단백질 쉐이크, 단백질 분말, 단백질 샷, 단백질 분리물, 에너지 바, 에너지 겔, 에너지 츄, 에너지 포뮬러, 지구력 포뮬러, 에너지 보충제, 영양 보충제, 스포츠 영양 보충제, 유아용 조제분유(예컨대, 분말 또는 액체), 및 식사 대용품을 포함한다.
일부 구현예에서, 복수의 재조합 세포 부산물로부터 재조합 단백질을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계는 i) 재조합 단백질에 가역적으로 부착되고 EPS에 실질적으로 부착되지 않는 음이온 수지, ii) 재조합 단백질 또는 EPS를 소화시키는 효소, iii) EPS에 가역적으로 부착되고 재조합 단백질에 실질적으로 부착되지 않는 흡착제, 및/또는 iv) EPS에 부착되고 재조합 단백질에 실질적으로 부착되지 않는 응집제 중 하나 이상을 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 임의의 상기 개시된 방법에 의해 수득된 소비가능한 조성물을 제공한다.
다양한 구현예에서, 수지는 크로마토그래피 시스템의 성분이다. 일부 경우에, 크로마토그래피 시스템은 축상 유동 컬럼 또는 방사상 유동 컬럼 또는 원심분리 컬럼에 의하거나 또는 막 크로마토그래피 컬럼의 사용에 의한 배치 모드로 작동하거나, 또는 크로마토그래피 시스템은 복수의 컬럼을 병렬로 포함하는 연속 모드로 작동하며, 여기서 컬럼으로의 공급은 크로마토그래피 공정에서의 다양한 단계(예컨대, 평형화, 로딩, 용출, 및 세정)가 동시에 발생하도록 전환가능하다. 다양한 경우에, 연속 모드는 모사 이동층(SMB) 또는 이온 분리기(예컨대, ISEP®) 시스템을 포함한다.
구현예에서, 재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 세포를 포함하는 소모된 바이오매스를 제거하기 위해 사전에 처리되고, 작은 비단백질 분자를 제거하기 위해 사전에 처리된다. 일부 경우에, 작은 비단백질 분자를 제거하기 위한 처리는 재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 농축하는 단계를 포함한다. 구현예에서, 작은 비단백질 분자를 제거하기 위한 처리는 정용여과 완충액을 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물을 생산하기 위해 그 분리된 재조합 단백질의 농축 단계 및/또는 정용여과 처리를 추가로 포함한다. 구현예에서, 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물은 추가로 열 처리 및/또는 건조된다.
양이온 교환 컬럼 SP400을 사용한 재조합 단백질의 정제를 보여주는 예시적인 크로마토그램이 도 11에 나타나 있다. 재조합 단백질은 용출 구역 1 및 2에서 용출된 컬럼에 결합된다(각각 8 및 11분에 시작). 보다 구체적으로, 용출 구역 2에서의 분획은 로딩 동안 결합되지 않은 피크(약 5분), 제자리 세정 동안 결합된 단백질 피크(CIP; 약 16분), 및 용출 구역 1에서의 다른 느슨하게 결합된 단백질(약 8분)로부터 분리된 관심있는 재조합 단백질이다.
일부 구현예에서, 도 1 또는 도 7에 나타낸 공정의 변형은 재조합 세포 부산물 불순물, 예컨대 EPS 또는 이취 성분과 함께 숙주 세포 단백질을 용출하기 위해 공급 적용 전 용출 완충액 1에서 컬럼을 평형화하는 것일 것이다.
도 1 또는 도 7에 나타낸 공정의 또 다른 변형에서, 농축 단계는 생략되고, 미세여과된 발효 상층액은 용출 1 완충액에서 평형화된 컬럼 상에 로딩되어, 컬럼 로딩 단계에서 재조합 세포 부산물(예컨대, EPS 또는 이취 성분), 작은 분자 불순물 및 숙주 세포 단백질을 분리한다.
단백질 분리 및 세포내 단백질 분리 공정은 문헌, 예컨대 US 10,857,483 및 US 9,821,249에 기재되어 있으며, 이들 각각의 내용은 그 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다.
소수성 용매 또는 양친매성 용매 기반 정제
본 개시내용의 양태는 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물을 제조하는 방법이다. 이 방법은 재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 수득하는 단계; 재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계; 분리된 재조합 단백질을 수집하여, 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물을 수득하는 단계를 포함한다. 이 방법에서, 재조합 세포 부산물은 이취 성분이다. 구현예에서, 조성물을 가공하는 단계는 재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 분리하는 소수성 용매 또는 양친매성 용매의 사용을 포함한다.
재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 생산하고, 재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 분리하는 예시적인 방법이 도 6에 나타나 있다.
구현예에서, 재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 세포의 발효에 의해 생산된다.
일부 구현예에서, 재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 세포를 포함하는 소모된 바이오매스를 제거하기 위해 사전에 처리된다.
다양한 구현예에서, 재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 작은 비단백질 분자를 제거하기 위해 사전에 처리된다. 일부 경우에, 작은 비단백질 분자를 제거하기 위한 처리는 정용여과 완충액을 포함한다. 작은 비단백질 분자를 제거하기 위한 처리는 재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 농축하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물을 생산하기 위해 그 분리된 재조합 단백질의 농축 단계 및/또는 정용여과 처리를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물은 추가로 열 처리 및/또는 건조된다. 열 처리 및/또는 건조 단계는 이취 성분의 양이 감소된 건조 단백질 생성물을 생산할 수 있다.
다양한 구현예에서, 이취 성분의 양이 감소된 단백질 생성물은 재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물에 비해 이취 성분 양의 적어도 50% 감소를 포함한다. 일부 경우에, 단백질 생성물은 재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물에 비해 이취 성분에서 적어도 75% 감소, 적어도 80% 감소, 적어도90% 감소, 또는 적어도 95% 감소를 갖는다.
구현예에서, 단백질 생성물의 중량의 약 5% 미만, 약 1% 미만, 약 0.1% 미만, 또는 약 0.01% 미만이 이취 성분을 포함한다. 일부 경우에, 단백질 생성물 내의 이취 성분은 표준 소비자에게 사실상 감지될 수 없다.
효소 기반 정제
일 양태에서, 본 개시내용은 소비가능한 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 방법은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 수득하는 단계로서, 재조합 세포 부산물은 엑소폴리사카라이드(EPS) 및 이취 성분을 포함하는 것인 단계; 복수의 재조합 세포 부산물로부터 재조합 단백질을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계로서, 가공 단계는 재조합 단백질을 소화시키거나 EPS를 소화시키는 효소를 포함하는 것인 단계; 분리된 재조합 단백질을 수집하여 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물을 수득하는 단계; 및 단백질 생성물을 포함하는 소비가능한 조성물을 제제화하는 단계를 포함한다.
구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 세포 배양 배지이다.
재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 생산하고, 재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 분리하는 예시적인 방법이 도 2 및 도 8에 나타나 있다. 이 양태의 방법은 발효 공정 동안 생산되는 임의의 세포외 생성물을 분리하는 데 사용될 수 있다.
구현예에서, 효소는 재조합 단백질을 소화시키거나 재조합 세포 부산물을 소화시킨다.
일부 구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 분비한 재조합 세포를 포함하는 세포 배양 배지이다.
다양한 구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 분비한 재조합 세포가 결여되어 있다.
몇몇 구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 단백질의 등전점(pI)보다 큰 pH를 갖는다.
구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물의 pH는 재조합 단백질의 pI보다 큰 pH를 달성하도록 변형되지 않는다.
일부 구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물의 pH는 재조합 단백질의 pI보다 큰 pH를 달성하도록 변형된다.
다양한 구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물의 pH는 약 6이다.
몇몇 구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 단백질의 등전점(pI)보다 낮은 pH를 갖는다.
구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물의 pH는 pH를 낮춤으로써 달성된다.
일부 구현예에서, 재조합 단백질을 소화시키는 효소는 펩신 또는 트립신이다.
다양한 구현예에서, 소화된 재조합 단백질은 한외여과 시스템, 예컨대 10 kDa 막을 갖는 한외여과 시스템을 통해 투과된다.
몇몇 구현예에서, EPS를 소화시키는 효소는 만나제, 셀룰라제, 또는 글루카나제이다.
구현예에서, 소화되지 않은 재조합 단백질은 한외여과 시스템, 예컨대 5 kDa 막을 갖는 한외여과 시스템에 의해 농축된다.
일부 구현예에서, 복수의 재조합 세포 부산물로부터 재조합 단백질을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계는 크로마토그래피 시스템을 추가로 포함한다.
다양한 구현예에서, 크로마토그래피 시스템은 축상 유동 컬럼 또는 방사상 유동 컬럼 또는 원심분리 컬럼에 의하거나 또는 막 크로마토그래피 컬럼의 사용에 의한 배치 모드로 작동한다.
몇몇 구현예에서, 크로마토그래피 시스템은 복수의 컬럼을 병렬로 포함하는 연속 모드로 작동하며, 여기서 컬럼으로의 공급은 크로마토그래피 공정에서의 다양한 단계(예컨대, 평형화, 로딩, 용출, 및 세정)가 동시에 발생하도록 전환가능하다.
구현예에서, 연속 모드는 모사 이동층(SMB) 또는 이온 분리기(예컨대, ISEP®) 시스템을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 세포를 포함하는 소모된 바이오매스를 제거하기 위해 사전에 처리되고/되거나 작은 비단백질 분자를 제거하기 위해 사전에 처리된다.
다양한 구현예에서, 작은 비단백질 분자를 제거하기 위한 처리는 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 농축하는 단계를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 작은 비단백질 분자를 제거하기 위한 처리는 정용여과 완충액을 포함한다.
구현예에서, 방법은 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물을 생산하기 위해 그 분리된 재조합 단백질의 농축 단계 및/또는 정용여과 처리를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물은 추가로 열 처리 및/또는 건조된다.
다양한 구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물 및/또는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물은 추가로 열 처리 및/또는 건조된다.
몇몇 구현예에서, 열 처리는 재조합 단백질 및 이취 성분을 분리하고, 일부 경우에, 열은 이취 성분이 휘발되어 기체상 이취 성분이 제거될 수 있는 온도 및 지속시간으로 적용된다.
구현예에서, 열의 적용과 동시에 진공이 적용되고, 진공은 기체상 이취 성분의 제거를 촉진한다.
일부 구현예에서, 이취 성분은 산, 알코올, 알데하이드, 방향족, 에스테르, 또는 케톤이다.
다양한 구현예에서, 이취 성분은 (E)-2-노네날; 1-도데센; 1-헥산올, 2-에틸-; 1-헥센-3-온; 1-옥텐-3-온; 2,3-부탄디온; 2-부탄온; 2-메틸부탄알; 2-메틸프로판알; 2-프로판온; 2-운데칸온; 3-메틸부탄알; 아세트알데하이드; 벤젠 에탄올; 벤질 알코올; 부탄알, 3-메틸-; 클로로톨루엔; 노난산; p-크레졸; 또는 프로판산, 2-메틸-, 3-하이드록시-2,4,4-트리메틸펜틸 에스테르이다.
몇몇 구현예에서, 열 처리 동안 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물, 및/또는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물의 온도는 최대 80℃, 예컨대 약 50℃ 내지 약 60℃이다.
구현예에서, 방법은 열 처리 동안 교반을 포함한다.
일부 구현예에서, 열 처리 및/또는 건조 단계는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 건조 단백질 생성물을 생산한다.
다양한 구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물 및/또는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물은 산화 단계를 추가로 수행한다.
몇몇 구현예에서, 산화 단계는 과산화수소의 첨가를 포함한다.
구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물 내의 재조합 세포 부산물 대 재조합 단백질의 비율은 약 1:3 내지 약 3:1이다.
일부 구현예에서, 단백질 생성물은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물에 비해 EPS의 양 및/또는 이취 성분의 양에서 적어도 25% 감소, 적어도 30% 감소, 적어도 35% 감소, 적어도 40% 감소, 적어도 45% 감소, 적어도 50% 감소, 적어도 55% 감소, 적어도 60% 감소, 적어도 65% 감소, 적어도 70% 감소, 적어도 75% 감소, 적어도 75% 감소, 적어도 80% 감소, 적어도 90% 감소, 또는 적어도 95% 감소를 갖는다.
다양한 구현예에서, 단백질 생성물의 중량의 약 10% 미만이 재조합 세포 부산물을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 단백질 생성물의 중량의 약 5% 미만이 재조합 세포 부산물을 포함한다.
구현예에서, 단백질 생성물의 중량의 약 5% 미만, 약 1% 미만, 약 0.1% 미만, 또는 약 0.01% 미만이 이취 성분을 포함한다.
일부 구현예에서, 단백질 생성물 내의 이취 성분은 표준 소비자에게 사실상 감지될 수 없다.
다양한 구현예에서, EPS는 일반적으로 크기 배제 크로마토그래피를 사용할 때 재조합 단백질로부터 분리될 수 없다.
몇몇 구현예에서, EPS는 자연적으로 재조합 세포의 세포벽의 성분이다.
구현예에서, EPS는 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 의해 특징지어지는 바와 같이 약 13 kDa 내지 약 27 kDa의 겉보기 크기를 갖는다.
일부 구현예에서, EPS는 만노스를 포함한다.
다양한 구현예에서, EPS는 N-아세틸글루코사민 및/또는 글루코스를 추가로 포함한다.
몇몇 구현예에서, EPS는 질량 분석법과 함께 가스 크로마토그래피에 의해 분석될 때 약 91 몰% 만노스, 약 5 몰% N-아세틸글루코사민, 및 약 3 몰% 글루코스를 포함한다.
구현예에서, EPS는 α(1,2)-연결된 분지 및/또는 α(1,3)-연결된 분지를 갖는 α(1,6)-연결된 백본을 포함한다.
일부 구현예에서, EPS는 만난이다.
다양한 구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 발현하는 재조합 세포는 진균 세포, 예컨대 사상 진균 또는 효모, 박테리아 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 또는 포유동물 세포로부터 선택된다.
몇몇 구현예에서, 재조합 세포 유형은 아르술라 종, 아르술라 아데니니보란스, 클루이베로마이세스 종, 클루이베로마이세스 락티스, 코마가타엘라 파피이, 피치아 종, 피치아 안구스타, 피치아 파스토리스, 사카로마이세스 종, 사카로마이세스 세레비지애, 쉬조사카로마이세스 종, 쉬조사카로마이세스 폼베, 야로위아 종, 야로위아 리폴리티카, 아가리쿠스 종, 아가리쿠스 비스포루스, 아스퍼질러스 종, 아스퍼질러스 아와모리, 아스퍼질러스 푸미가투스, 아스퍼질러스 니둘란스, 아스퍼질러스 니거, 아스퍼질러스 오리자에, 바실러스 서브틸리스, 콜레토트리쿰 종, 콜레토트리쿰 글로에오스포리오데스, 엔도시아 종, 엔도시아 파라시티카, 에세리키아 콜리, 푸사리움 종, 푸사리움 그라미네아룸, 푸사리움 솔라니, 무코르 종, 무코르 미에헤이, 무코르 푸실루스, 마이셀리오프토라 종, 마이셀리오프토라 써모필라, 뉴로스포라 종, 뉴로스포라 크라사, 페니실리움 종, 페니실리움 카멤버티, 페니실리움 카네센스, 페니실리움 크리소제눔, 페니실리움(탈라로마이세스) 에머소니, 페니실리움 푸니쿨로 섬, 페니실리움 퍼푸로제눔, 페니실리움 로퀘포티, 플레우로투스 종, 플레우로투스 오스트레아투스, 슈도모나스 종, 리조무코르 종, 리조무코르 미에헤이, 리조무코르 푸실루스, 리조푸스 종, 리조푸스 아르히주스, 리조푸스 올리고스포루스, 리조푸스 오리자에, 트리코더마 종, 트리코더마 알트로비리데, 트리코더마 레에세이, 및 트리코더마 비레우스로부터 선택된다.
구현예에서, 진균은 피치아 종이다.
일부 구현예에서, 피치아 종은 코마가타엘라 파피이 또는 코마가타엘라 파스토리스이다.
다양한 구현예에서, 재조합 단백질은 효소, 영양 단백질, 식품 성분, 또는 식품 첨가물이다.
몇몇 구현예에서, 효소는 펩시노겐 또는 펩신이다.
구현예에서, 단백질은 난백 단백질이다.
일부 구현예에서, 난백 단백질은 난백알부민(OVA), 오보뮤코이드(OVD), 오보트랜스페린(OVT), 라이소자임(OVL), 오보뮤신, 오보글로불린 G2, 오보글로불린 G3, 오보억제제, 오보당단백질, 플라보단백질, 오보마크로글로불린, 오보스타틴, 시스타틴, 아비딘, 난백알부민 관련 단백질 X, 또는 난백알부민 관련 단백질 Y, 및 이들의 임의의 조합이다.
다양한 구현예에서, 난백 단백질은 새, 예컨대 닭, 메추라기, 칠면조, 칠면조 독수리, 벌새, 오리, 타조, 거위, 갈매기, 뿔닭, 꿩, 또는 에뮤에서 자연적으로 생산된 난백 단백질과 적어도 80% 동일한(예컨대, 약 85%, 90%, 또는 95% 동일한) 서열을 갖는다.
몇몇 구현예에서, 단백질 생성물을 포함하는 소비가능한 조성물은 식품, 음료 제품, 또는 식이 보충제를 포함한다.
구현예에서, 식품은 제과제빵(예컨대, 케이크, 머핀, 쿠키, 빵, 베이글, 페이스트리, 도넛), 스크램블, 오믈렛, 키슈, 파스타, 국수, 크레페, 와플, 도우, 배터, 쿠키 도우, 미트로프, 미트볼, 햄버거, 동물 사료, 과일, 야채, 두부, 비지, 치즈, 해산물, 고기, 아이스크림, 마요네즈, 커스터드, 푸딩, 수플레, 유제, 폼, 머랭, 프로스팅, 과자, 마시멜로, 마지팬, 수프, 조미료, 소스, 향신료, 유제품, 및 드레싱을 포함한다.
일부 구현예에서, 음료 제품은 청량 음료, 플레이버 워터, 주스, 스포츠 음료, 에너지 음료, 스무디, 쉐이크, 알코올 음료(예컨대, 와인, 사케, 맥주, 증류주), 칵테일, 리큐어, 탄산 음료, 카페인 음료, 커피, 코코아, 차, 에그노그, 및 유제 음료를 포함한다.
다양한 구현예에서, 식이 보충제는 종합 비타민, 훌 푸드 보충제, 다이어트 보충제, 허브 보충제, 단백질 블렌드, 매스 게이너, 즉석 음료 단백질, 단백질 바, 단백질 쉐이크, 단백질 분말, 단백질 샷, 단백질 분리물, 에너지 바, 에너지 겔, 에너지 츄, 에너지 포뮬러, 지구력 포뮬러, 에너지 보충제, 영양 보충제, 스포츠 영양 보충제, 유아용 조제분유(예컨대, 분말 또는 액체), 및 식사 대용품을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 복수의 재조합 세포 부산물로부터 재조합 단백질을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계는 i) 재조합 단백질에 가역적으로 부착되고 EPS에 실질적으로 부착되지 않는 양이온 수지, ii) 재조합 단백질에 가역적으로 부착되고 EPS에 실질적으로 부착되지 않는 음이온 수지, iii) EPS에 부착되고 재조합 단백질에 실질적으로 부착되지 않는 응집제, 및/또는 iv) EPS에 부착되고 재조합 단백질에 실질적으로 부착되지 않는 흡착제 중 하나 이상을 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 임의의 상기 개시된 방법에 의해 수득된 소비가능한 조성물을 제공한다.
열 기반 정제
본 개시내용의 양태는 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물을 제조하는 방법이다. 이 방법은 재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 수득하는 단계; 재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계; 분리된 재조합 단백질을 수집하여, 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물을 수득하는 단계를 포함한다. 이 방법에서 재조합 세포 부산물은 이취 성분이다.
다양한 구현예에서, 조성물을 가공하는 단계는 재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 분리하는 열의 사용을 포함하며, 일부 경우에, 열은 재조합 세포 부산물이 휘발되고 기체상 재조합 세포 부산물이 제거가능한 온도 및 기간으로 적용된다.
재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 생산하고, 재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 분리하는 예시적인 방법이 도 6에 나타나 있다.
구현예에서, 조성물은 열이 적용되는 동안 교반될 수 있다.
일부 구현예에서, 열의 적용과 동시에 진공이 적용될 수 있다. 일부 경우에, 진공은 기체상 재조합 세포 부산물의 제거를 촉진한다.
다양한 경우에, 온도는 최대 80℃이다.
구현예에서, 재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 세포의 발효에 의해 생산되었다.
일부 구현예에서, 재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 세포를 포함하는 소모된 바이오매스를 제거하기 위해 사전에 처리된다.
다양한 구현예에서, 재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 작은 비단백질 분자를 제거하기 위해 사전에 처리된다. 일부 경우에, 작은 비단백질 분자를 제거하기 위한 처리는 정용여과 완충액을 포함한다. 작은 비단백질 분자를 제거하기 위한 처리는 재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 농축하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물을 생산하기 위해 그 분리된 재조합 단백질의 농축 단계 및/또는 정용여과 처리를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물은 추가로 열 처리 및/또는 건조된다. 열 처리 및/또는 건조 단계는 이취 성분의 양이 감소된 건조 단백질 생성물을 생산할 수 있다.
다양한 구현예에서, 이취 성분의 양이 감소된 단백질 생성물은 재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물에 비해 이취 성분 양에서 적어도 50% 감소를 포함한다. 일부 경우에, 단백질 생성물은 재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물에 비해 이취 성분에서 적어도 75% 감소, 적어도 80% 감소, 적어도90% 감소, 또는 적어도 95% 감소를 갖는다.
구현예에서, 단백질 생성물의 중량의 약 5% 미만, 약 1% 미만, 약 0.1% 미만, 또는 약 0.01% 미만이 이취 성분을 포함한다. 일부 경우에, 단백질 생성물 내의 이취 성분은 표준 소비자에게 사실상 감지될 수 없다.
흡착제 기반 정제
본 개시내용의 추가 양태는 소비가능한 조성물을 제조하는 방법이다. 이 방법은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 수득하는 단계로서, 재조합 세포 부산물은 엑소폴리사카라이드(EPS) 및 이취 성분을 포함하는 것인 단계; 복수의 재조합 세포 부산물로부터 재조합 단백질을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계로서, 가공 단계는 복수의 재조합 세포 부산물의 하나 이상의 성분에 가역적으로 부착되고 재조합 단백질에 실질적으로 부착되지 않는 흡착제를 포함하는 것인 단계; 분리된 재조합 단백질을 수집하여 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물을 수득하는 단계; 및 단백질 생성물을 포함하는 소비가능한 조성물을 제제화하는 단계를 포함한다.
재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 생산하고, 재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 분리하는 예시적인 방법이 도 3 또는 도 9에 나타나 있다. 이 양태의 방법은 발효 공정 동안 생산되는 임의의 세포외 생성물을 분리하는 데 사용될 수 있다.
구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 세포 배양 배지이다.
일부 구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 분비한 재조합 세포를 포함하는 세포 배양 배지이다.
다양한 구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 단백질의 등전점(pI)보다 큰 pH를 갖는다.
몇몇 구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물의 pH는 재조합 단백질의 pI보다 큰 pH를 달성하도록 변형되지 않는다.
구현예에서, 흡착제는 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 분비하는 재조합 세포를 포함하는 배양 배지에 첨가된다.
일부 구현예에서, 흡착제가 복수의 재조합 세포 부산물의 하나 이상의 성분에 부착되는 경우, 흡착제는 재조합 단백질로부터 분리된다.
다양한 구현예에서, 흡착제가 복수의 재조합 세포 부산물의 하나 이상의 성분에 부착되는 경우, 여과기, 여과 장치, 및/또는 원심분리를 이용하여 재조합 단백질로부터 단리된다.
몇몇 구현예에서, 방법은 배양 배지에 흡착제를 다시 보충하는 단계를 추가로 포함한다.
구현예에서, 흡착제는 재조합 세포를 포함하는 소모된 바이오매스의 제거와 동시에 바이오매스 분리 공급 탱크 및 복수의 재조합 세포 부산물의 하나 이상의 성분에 제공된다.
일부 구현예에서, 흡착제는 재조합 세포를 포함하는 소모된 바이오매스의 제거 후에 제공된다.
다양한 구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 분비한 재조합 세포가 결여되어 있다.
몇몇 구현예에서, 흡착제는 수지 및/또는 소수성 흡착제, 예컨대 메타크릴레이트 또는 실리카 백본을 포함하는 소수성 흡착제를 포함하거나 DEAE 유형 약한 음이온 교환기이다.
구현예에서, 흡착제는 다우 앰버라이트 SD2(Dow Amberlite SD2), 미츠비시 디아이온 HP20(Mitsubishi Diaion HP20), 셀라이트 545(Celite 545), 벤토나이트 BE125(Bentonite BE125), 디아이온 HPA25L(DIAION HPA25L), 탈아세틸화된 키토산 85%, EZ DE, 초순수 규조토, 또는 렐리조브 SP400(Relizorb SP400)이다.
일부 구현예에서, 흡착제는, 예컨대 컬럼 내에 제공되고, 축상 유동 컬럼 또는 방사상 유동 컬럼 또는 원심분리 컬럼에 의하거나 또는 막 크로마토그래피 컬럼의 사용에 의한 배치 모드로 작동된다.
다양한 구현예에서, 복수의 재조합 세포 부산물로부터 재조합 단백질을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계는 크로마토그래피 시스템을 추가로 포함한다.
몇몇 구현예에서, 크로마토그래피 시스템은 축상 유동 컬럼 또는 방사상 유동 컬럼 또는 원심분리 컬럼에 의하거나 또는 막 크로마토그래피 컬럼의 사용에 의한 배치 모드로 작동하거나, 또는 크로마토그래피 시스템은 복수의 컬럼을 병렬로 포함하는 연속 모드로 작동하며, 여기서 컬럼으로의 공급은 크로마토그래피 공정에서의 다양한 단계(예컨대, 평형화, 로딩, 용출, 및 세정)가 동시에 발생하도록 전환가능하다.
구현예에서, 연속 모드는 모사 이동층(SMB) 또는 이온 분리기(예컨대, ISEP®) 시스템을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 세포를 포함하는 소모된 바이오매스를 제거하기 위해 사전에 처리되고/되거나 작은 비단백질 분자를 제거하기 위해 사전에 처리된다.
다양한 구현예에서, 작은 비단백질 분자를 제거하기 위한 처리는 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 농축하는 단계를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 작은 비단백질 분자를 제거하기 위한 처리는 정용여과 완충액을 포함한다.
구현예에서, 방법은 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물을 생산하기 위해 그 분리된 재조합 단백질의 농축 단계 및/또는 정용여과 처리를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물은 추가로 열 처리 및/또는 건조된다.
다양한 구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물 및/또는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물은 추가로 열 처리 및/또는 건조된다.
몇몇 구현예에서, 열 처리는 재조합 단백질 및 이취 성분을 분리하고, 일부 경우에, 열은 이취 성분이 휘발되어 기체상 이취 성분이 제거될 수 있는 온도 및 지속시간으로 적용된다.
구현예에서, 열의 적용과 동시에 진공이 적용되고, 진공은 기체상 이취 성분의 제거를 촉진한다.
일부 구현예에서, 이취 성분은 산, 알코올, 알데하이드, 방향족, 에스테르, 또는 케톤이다.
다양한 구현예에서, 이취 성분은 (E)-2-노네날; 1-도데센; 1-헥산올, 2-에틸-; 1-헥센-3-온; 1-옥텐-3-온; 2,3-부탄디온; 2-부탄온; 2-메틸부탄알; 2-메틸프로판알; 2-프로판온; 2-운데칸온; 3-메틸부탄알; 아세트알데하이드; 벤젠 에탄올; 벤질 알코올; 부탄알, 3-메틸-; 클로로톨루엔; 노난산; p-크레졸; 또는 프로판산, 2-메틸-, 3-하이드록시-2,4,4-트리메틸펜틸 에스테르이다.
몇몇 구현예에서, 열 처리 동안 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물, 및/또는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물의 온도는 최대 80℃, 예컨대 약 50℃ 내지 약 60℃이다.
구현예에서, 방법은 열 처리 동안 교반을 포함한다.
일부 구현예에서, 열 처리 및/또는 건조 단계는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 건조 단백질 생성물을 생산한다.
다양한 구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물 및/또는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물은 산화 단계를 추가로 수행한다.
몇몇 구현예에서, 산화 단계는 과산화수소의 첨가를 포함한다.
구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물 내의 재조합 세포 부산물 대 재조합 단백질의 비율은 약 1:3 내지 약 3:1이다.
일부 구현예에서, 단백질 생성물은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물에 비해 EPS의 양 및/또는 이취 성분의 양에서 적어도 25% 감소, 적어도 30% 감소, 적어도 35% 감소, 적어도 40% 감소, 적어도 45% 감소, 적어도 50% 감소, 적어도 55% 감소, 적어도 60% 감소, 적어도 65% 감소, 적어도 70% 감소, 적어도 75% 감소, 적어도 75% 감소, 적어도 80% 감소, 적어도 90% 감소, 또는 적어도 95% 감소를 갖는다.
다양한 구현예에서, 단백질 생성물의 중량의 약 10% 미만이 재조합 세포 부산물을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 단백질 생성물의 중량의 약 5% 미만이 재조합 세포 부산물을 포함한다.
구현예에서, 단백질 생성물의 중량의 약 5% 미만, 약 1% 미만, 약 0.1% 미만, 또는 약 0.01% 미만이 이취 성분을 포함한다.
일부 구현예에서, 단백질 생성물 내의 이취 성분은 표준 소비자에게 사실상 감지될 수 없다.
다양한 구현예에서, EPS는 일반적으로 크기 배제 크로마토그래피를 사용할 때 재조합 단백질로부터 분리될 수 없다.
몇몇 구현예에서, EPS는 자연적으로 재조합 세포의 세포벽의 성분이다.
구현예에서, EPS는 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 의해 특징지어지는 바와 같이 약 13 kDa 내지 약 27 kDa의 겉보기 크기를 갖는다.
일부 구현예에서, EPS는 만노스를 포함한다.
다양한 구현예에서, EPS는 N-아세틸글루코사민 및/또는 글루코스를 추가로 포함한다.
몇몇 구현예에서, EPS는 질량 분석법과 함께 가스 크로마토그래피에 의해 분석될 때 약 91 몰% 만노스, 약 5 몰% N-아세틸글루코사민, 및 약 3 몰% 글루코스를 포함한다.
구현예에서, EPS는 α(1,2)-연결된 분지 및/또는 α(1,3)-연결된 분지를 갖는 α(1,6)-연결된 백본을 포함한다.
일부 구현예에서, EPS는 만난이다.
다양한 구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 발현하는 재조합 세포는 진균 세포, 예컨대 사상 진균 또는 효모, 박테리아 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 또는 포유동물 세포로부터 선택된다.
몇몇 구현예에서, 재조합 세포 유형은 아르술라 종, 아르술라 아데니니보란스, 클루이베로마이세스 종, 클루이베로마이세스 락티스, 코마가타엘라 파피이, 피치아 종, 피치아 안구스타, 피치아 파스토리스, 사카로마이세스 종, 사카로마이세스 세레비지애, 쉬조사카로마이세스 종, 쉬조사카로마이세스 폼베, 야로위아 종, 야로위아 리폴리티카, 아가리쿠스 종, 아가리쿠스 비스포루스, 아스퍼질러스 종, 아스퍼질러스 아와모리, 아스퍼질러스 푸미가투스, 아스퍼질러스 니둘란스, 아스퍼질러스 니거, 아스퍼질러스 오리자에, 바실러스 서브틸리스, 콜레토트리쿰 종, 콜레토트리쿰 글로에오스포리오데스, 엔도시아 종, 엔도시아 파라시티카, 에세리키아 콜리, 푸사리움 종, 푸사리움 그라미네아룸, 푸사리움 솔라니, 무코르 종, 무코르 미에헤이, 무코르 푸실루스, 마이셀리오프토라 종, 마이셀리오프토라 써모필라, 뉴로스포라 종, 뉴로스포라 크라사, 페니실리움 종, 페니실리움 카멤버티, 페니실리움 카네센스, 페니실리움 크리소제눔, 페니실리움(탈라로마이세스) 에머소니, 페니실리움 푸니쿨로 섬, 페니실리움 퍼푸로제눔, 페니실리움 로퀘포티, 플레우로투스 종, 플레우로투스 오스트레아투스, 슈도모나스 종, 리조무코르 종, 리조무코르 미에헤이, 리조무코르 푸실루스, 리조푸스 종, 리조푸스 아르히주스, 리조푸스 올리고스포루스, 리조푸스 오리자에, 트리코더마 종, 트리코더마 알트로비리데, 트리코더마 레에세이, 및 트리코더마 비레우스로부터 선택된다.
구현예에서, 진균은 피치아 종이다.
일부 구현예에서, 피치아 종은 코마가타엘라 파피이 또는 코마가타엘라 파스토리스이다.
다양한 구현예에서, 재조합 단백질은 효소, 영양 단백질, 식품 성분, 또는 식품 첨가물이다.
몇몇 구현예에서, 효소는 펩시노겐 또는 펩신이다.
구현예에서, 단백질은 난백 단백질이다.
일부 구현예에서, 난백 단백질은 난백알부민(OVA), 오보뮤코이드(OVD), 오보트랜스페린(OVT), 라이소자임(OVL), 오보뮤신, 오보글로불린 G2, 오보글로불린 G3, 오보억제제, 오보당단백질, 플라보단백질, 오보마크로글로불린, 오보스타틴, 시스타틴, 아비딘, 난백알부민 관련 단백질 X, 또는 난백알부민 관련 단백질 Y, 및 이들의 임의의 조합이다.
다양한 구현예에서, 난백 단백질은 새, 예컨대 닭, 메추라기, 칠면조, 칠면조 독수리, 벌새, 오리, 타조, 거위, 갈매기, 뿔닭, 꿩, 또는 에뮤에서 자연적으로 생산된 난백 단백질과 적어도 80% 동일한(예컨대, 약 85%, 90%, 또는 95% 동일한) 서열을 갖는다.
몇몇 구현예에서, 단백질 생성물을 포함하는 소비가능한 조성물은 식품, 음료 제품, 또는 식이 보충제를 포함한다.
구현예에서, 식품은 제과제빵(예컨대, 케이크, 머핀, 쿠키, 빵, 베이글, 페이스트리, 도넛), 스크램블, 오믈렛, 키슈, 파스타, 국수, 크레페, 와플, 도우, 배터, 쿠키 도우, 미트로프, 미트볼, 햄버거, 동물 사료, 과일, 야채, 두부, 비지, 치즈, 해산물, 고기, 아이스크림, 마요네즈, 커스터드, 푸딩, 수플레, 유제, 폼, 머랭, 프로스팅, 과자, 마시멜로, 마지팬, 수프, 조미료, 소스, 향신료, 유제품, 및 드레싱을 포함한다.
일부 구현예에서, 음료 제품은 청량 음료, 플레이버 워터, 주스, 스포츠 음료, 에너지 음료, 스무디, 쉐이크, 알코올 음료(예컨대, 와인, 사케, 맥주, 증류주), 칵테일, 리큐어, 탄산 음료, 카페인 음료, 커피, 코코아, 차, 에그노그, 및 유제 음료를 포함한다.
다양한 구현예에서, 식이 보충제는 종합 비타민, 훌 푸드 보충제, 다이어트 보충제, 허브 보충제, 단백질 블렌드, 매스 게이너, 즉석 음료 단백질, 단백질 바, 단백질 쉐이크, 단백질 분말, 단백질 샷, 단백질 분리물, 에너지 바, 에너지 겔, 에너지 츄, 에너지 포뮬러, 지구력 포뮬러, 에너지 보충제, 영양 보충제, 스포츠 영양 보충제, 유아용 조제분유(예컨대, 분말 또는 액체), 및 식사 대용품을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 복수의 재조합 세포 부산물로부터 재조합 단백질을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계는 i) 재조합 단백질에 가역적으로 부착되고 EPS에 실질적으로 부착되지 않는 양이온 수지, ii) 재조합 단백질에 가역적으로 부착되고 EPS에 실질적으로 부착되지 않는 음이온 수지, iii) 재조합 단백질 또는 EPS를 소화시키는 효소, 및/또는 iv) EPS에 부착되고 재조합 단백질에 실질적으로 부착되지 않는 응집제 중 하나 이상을 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 임의의 상기 개시된 방법에 의해 수득된 소비가능한 조성물을 제공한다.
구현예에서, 흡착제가 재조합 세포 부산물에 가역적으로 부착된 후, 흡착제는 발효 배지로부터 분리된다. 일부 경우에, 흡착제는 스트레이너 또는 기타 여과 장치를 사용하여 분리된다. 다양한 경우에, 발효 배지에는 다시 흡착제가 보충된다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 임의의 상기 개시된 방법에 의해 수득된 소비가능한 조성물을 제공한다.
응집제 기반 정제
본 개시내용의 추가 양태는 소비가능한 조성물을 제조하는 방법이다. 이 방법은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 수득하는 단계로서, 재조합 세포 부산물은 엑소폴리사카라이드(EPS) 및 이취 성분을 포함하는 것인 단계; 복수의 재조합 세포 부산물로부터 재조합 단백질을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계로서, 가공 단계는 복수의 재조합 세포 부산물의 하나 이상의 성분에 가역적으로 부착되고 재조합 단백질에 실질적으로 부착되지 않는 응집제를 포함하는 것인 단계; 분리된 재조합 단백질을 수집하여 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물을 수득하는 단계; 및 단백질 생성물을 포함하는 소비가능한 조성물을 제제화하는 단계를 포함한다.
재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 생산하고, 재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 분리하는 예시적인 방법이 도 4 또는 도 10에 나타나 있다. 이 양태의 방법은 발효 공정 동안 생산되는 임의의 세포외 생성물을 분리하는 데 사용될 수 있다.
구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 세포 배양 배지이다.
일부 구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 분비한 재조합 세포를 포함하는 세포 배양 배지이다.
다양한 구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 단백질의 등전점(pI)보다 큰 pH를 갖는다.
몇몇 구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물의 pH는 재조합 단백질의 pI보다 큰 pH를 달성하도록 변형되지 않는다.
구현예에서, 응집제는 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 분비하는 재조합 세포를 포함하는 배양 배지에 첨가된다.
일부 구현예에서, 응집제가 복수의 재조합 세포 부산물의 하나 이상의 성분에 부착되면, 응집제는 재조합 단백질로부터 분리된다.
다양한 구현예에서, 응집제는, 복수의 재조합 세포 부산물의 하나 이상의 성분에 부착되는 경우, 스트레이너, 여과 장치, 및/또는 원심분리를 이용하여 재조합 단백질로부터 단리된다.
몇몇 구현예에서, 방법은 배양 배지에 다시 응집제를 보충하는 단계를 추가로 포함한다.
구현예에서, 응집제는 재조합 세포를 포함하는 소모된 바이오매스의 제거와 동시에 바이오매스 분리 공급 탱크 및 복수의 재조합 세포 부산물의 하나 이상의 성분에 제공된다.
일부 구현예에서, 응집제는 재조합 세포를 포함하는 소모된 바이오매스의 제거 후에 제공된다.
다양한 구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 분비한 재조합 세포가 결여되어 있다.
몇몇 구현예에서, 응집제는 음이온 응집제 또는 중성 응집제이다.
구현예에서, 응집제는 트람플록 108(Tramfloc 108), 트람플록 109, 트람플록 110, 트람플록 111 또는 트람플록 120, 마그나플록 333(Magnafloc 333), 마그나플록 355, 또는 구스머 디버간(Gusmer Divergan), 듀폰 폴리옥스(Dupont Polyox), 셀라이트 545(Celite 545), 벤토나이트 BE125(Bentonite BE125), 디아이온 HPA25L(DIAION HPA25L), 탈아세틸화된 키토산 85%, EZ DE, 초순수 규조토, 또는 렐리조브 SP400(Relizorb SP400)이다.
일부 구현예에서, 응집제는 컬럼 내에 제공된다.
다양한 구현예에서, 복수의 재조합 세포 부산물로부터 재조합 단백질을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계는 크로마토그래피 시스템을 추가로 포함한다.
몇몇 구현예에서, 크로마토그래피 시스템은 축상 유동 컬럼 또는 방사상 유동 컬럼 또는 원심분리 컬럼에 의하거나 또는 막 크로마토그래피 컬럼의 사용에 의한 배치 모드로 작동하거나, 또는 크로마토그래피 시스템은 복수의 컬럼을 병렬로 포함하는 연속 모드로 작동하며, 여기서 컬럼으로의 공급은 크로마토그래피 공정에서의 다양한 단계(예컨대, 평형화, 로딩, 용출, 및 세정)가 동시에 발생하도록 전환가능하다.
구현예에서, 연속 모드는 모사 이동층(SMB) 또는 이온 분리기(예컨대, ISEP®) 시스템을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 세포를 포함하는 소모된 바이오매스를 제거하기 위해 사전에 처리되고/되거나 작은 비단백질 분자를 제거하기 위해 사전에 처리된다.
다양한 구현예에서, 작은 비단백질 분자를 제거하기 위한 처리는 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 농축하는 단계를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 작은 비단백질 분자를 제거하기 위한 처리는 정용여과 완충액을 포함한다.
구현예에서, 방법은 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물을 생산하기 위해 그 분리된 재조합 단백질의 농축 단계 및/또는 정용여과 처리를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물은 추가로 열 처리 및/또는 건조된다.
다양한 구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물 및/또는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물은 추가로 열 처리 및/또는 건조된다.
몇몇 구현예에서, 열 처리는 재조합 단백질 및 이취 성분을 분리하고, 일부 경우에, 열은 이취 성분이 휘발되어 기체상 이취 성분이 제거될 수 있는 온도 및 지속시간으로 적용된다.
구현예에서, 열의 적용과 동시에 진공이 적용되고, 진공은 기체상 이취 성분의 제거를 촉진한다.
일부 구현예에서, 이취 성분은 산, 알코올, 알데하이드, 방향족, 에스테르, 또는 케톤이다.
다양한 구현예에서, 이취 성분은 (E)-2-노네날; 1-도데센; 1-헥산올, 2-에틸-; 1-헥센-3-온; 1-옥텐-3-온; 2,3-부탄디온; 2-부탄온; 2-메틸부탄알; 2-메틸프로판알; 2-프로판온; 2-운데칸온; 3-메틸부탄알; 아세트알데하이드; 벤젠 에탄올; 벤질 알코올; 부탄알, 3-메틸-; 클로로톨루엔; 노난산; p-크레졸; 또는 프로판산, 2-메틸-, 3-하이드록시-2,4,4-트리메틸펜틸 에스테르이다.
몇몇 구현예에서, 열 처리 동안 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물, 및/또는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물의 온도는 최대 80℃, 예컨대 약 50℃ 내지 약 60℃이다.
구현예에서, 방법은 열 처리 동안 교반을 포함한다.
일부 구현예에서, 열 처리 및/또는 건조 단계는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 건조 단백질 생성물을 생산한다.
다양한 구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물 및/또는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물은 산화 단계를 추가로 수행한다.
몇몇 구현예에서, 산화 단계는 과산화수소의 첨가를 포함한다.
구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물 내의 재조합 세포 부산물 대 재조합 단백질의 비율은 약 1:3 내지 약 3:1이다.
일부 구현예에서, 단백질 생성물은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물에 비해 EPS의 양 및/또는 이취 성분의 양에서 적어도 25% 감소, 적어도 30% 감소, 적어도 35% 감소, 적어도 40% 감소, 적어도 45% 감소, 적어도 50% 감소, 적어도 55% 감소, 적어도 60% 감소, 적어도 65% 감소, 적어도 70% 감소, 적어도 75% 감소, 적어도 75% 감소, 적어도 80% 감소, 적어도 90% 감소, 또는 적어도 95% 감소를 갖는다.
다양한 구현예에서, 단백질 생성물의 중량의 약 10% 미만이 재조합 세포 부산물을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 단백질 생성물의 중량의 약 5% 미만이 재조합 세포 부산물을 포함한다.
구현예에서, 단백질 생성물의 중량의 약 5% 미만, 약 1% 미만, 약 0.1% 미만, 또는 약 0.01% 미만이 이취 성분을 포함한다.
일부 구현예에서, 단백질 생성물 내의 이취 성분은 표준 소비자에게 사실상 감지될 수 없다.
다양한 구현예에서, EPS는 일반적으로 크기 배제 크로마토그래피를 사용할 때 재조합 단백질로부터 분리될 수 없다.
몇몇 구현예에서, EPS는 자연적으로 재조합 세포의 세포벽의 성분이다.
구현예에서, EPS는 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 의해 특징지어지는 바와 같이 약 13 kDa 내지 약 27 kDa의 겉보기 크기를 갖는다.
일부 구현예에서, EPS는 만노스를 포함한다.
다양한 구현예에서, EPS는 N-아세틸글루코사민 및/또는 글루코스를 추가로 포함한다.
몇몇 구현예에서, EPS는 질량 분석법과 함께 가스 크로마토그래피에 의해 분석될 때 약 91 몰% 만노스, 약 5 몰% N-아세틸글루코사민, 및 약 3 몰% 글루코스를 포함한다.
구현예에서, EPS는 α(1,2)-연결된 분지 및/또는 α(1,3)-연결된 분지를 갖는 α(1,6)-연결된 백본을 포함한다.
일부 구현예에서, EPS는 만난이다.
다양한 구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 발현하는 재조합 세포는 진균 세포, 예컨대 사상 진균 또는 효모, 박테리아 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 또는 포유동물 세포로부터 선택된다.
몇몇 구현예에서, 재조합 세포 유형은 아르술라 종, 아르술라 아데니니보란스, 클루이베로마이세스 종, 클루이베로마이세스 락티스, 코마가타엘라 파피이, 피치아 종, 피치아 안구스타, 피치아 파스토리스, 사카로마이세스 종, 사카로마이세스 세레비지애, 쉬조사카로마이세스 종, 쉬조사카로마이세스 폼베, 야로위아 종, 야로위아 리폴리티카, 아가리쿠스 종, 아가리쿠스 비스포루스, 아스퍼질러스 종, 아스퍼질러스 아와모리, 아스퍼질러스 푸미가투스, 아스퍼질러스 니둘란스, 아스퍼질러스 니거, 아스퍼질러스 오리자에, 바실러스 서브틸리스, 콜레토트리쿰 종, 콜레토트리쿰 글로에오스포리오데스, 엔도시아 종, 엔도시아 파라시티카, 에세리키아 콜리, 푸사리움 종, 푸사리움 그라미네아룸, 푸사리움 솔라니, 무코르 종, 무코르 미에헤이, 무코르 푸실루스, 마이셀리오프토라 종, 마이셀리오프토라 써모필라, 뉴로스포라 종, 뉴로스포라 크라사, 페니실리움 종, 페니실리움 카멤버티, 페니실리움 카네센스, 페니실리움 크리소제눔, 페니실리움(탈라로마이세스) 에머소니, 페니실리움 푸니쿨로 섬, 페니실리움 퍼푸로제눔, 페니실리움 로퀘포티, 플레우로투스 종, 플레우로투스 오스트레아투스, 슈도모나스 종, 리조무코르 종, 리조무코르 미에헤이, 리조무코르 푸실루스, 리조푸스 종, 리조푸스 아르히주스, 리조푸스 올리고스포루스, 리조푸스 오리자에, 트리코더마 종, 트리코더마 알트로비리데, 트리코더마 레에세이, 및 트리코더마 비레우스로부터 선택된다.
구현예에서, 진균은 피치아 종이다.
일부 구현예에서, 피치아 종은 코마가타엘라 파피이 또는 코마가타엘라 파스토리스이다.
다양한 구현예에서, 재조합 단백질은 효소, 영양 단백질, 식품 성분, 또는 식품 첨가물이다.
몇몇 구현예에서, 효소는 펩시노겐 또는 펩신이다.
구현예에서, 단백질은 난백 단백질이다.
일부 구현예에서, 난백 단백질은 난백알부민(OVA), 오보뮤코이드(OVD), 오보트랜스페린(OVT), 라이소자임(OVL), 오보뮤신, 오보글로불린 G2, 오보글로불린 G3, 오보억제제, 오보당단백질, 플라보단백질, 오보마크로글로불린, 오보스타틴, 시스타틴, 아비딘, 난백알부민 관련 단백질 X, 또는 난백알부민 관련 단백질 Y, 및 이들의 임의의 조합이다.
다양한 구현예에서, 난백 단백질은 새, 예컨대 닭, 메추라기, 칠면조, 칠면조 독수리, 벌새, 오리, 타조, 거위, 갈매기, 뿔닭, 꿩, 또는 에뮤에서 자연적으로 생산된 난백 단백질과 적어도 80% 동일한(예컨대, 약 85%, 90%, 또는 95% 동일한) 서열을 갖는다.
몇몇 구현예에서, 단백질 생성물을 포함하는 소비가능한 조성물은 식품, 음료 제품, 또는 식이 보충제를 포함한다.
구현예에서, 식품은 제과제빵(예컨대, 케이크, 머핀, 쿠키, 빵, 베이글, 페이스트리, 도넛), 스크램블, 오믈렛, 키슈, 파스타, 국수, 크레페, 와플, 도우, 배터, 쿠키 도우, 미트로프, 미트볼, 햄버거, 동물 사료, 과일, 야채, 두부, 비지, 치즈, 해산물, 고기, 아이스크림, 마요네즈, 커스터드, 푸딩, 수플레, 유제, 폼, 머랭, 프로스팅, 과자, 마시멜로, 마지팬, 수프, 조미료, 소스, 향신료, 유제품, 및 드레싱을 포함한다.
일부 구현예에서, 음료 제품은 청량 음료, 플레이버 워터, 주스, 스포츠 음료, 에너지 음료, 스무디, 쉐이크, 알코올 음료(예컨대, 와인, 사케, 맥주, 증류주), 칵테일, 리큐어, 탄산 음료, 카페인 음료, 커피, 코코아, 차, 에그노그, 및 유제 음료를 포함한다.
다양한 구현예에서, 식이 보충제는 종합 비타민, 훌 푸드 보충제, 다이어트 보충제, 허브 보충제, 단백질 블렌드, 매스 게이너, 즉석 음료 단백질, 단백질 바, 단백질 쉐이크, 단백질 분말, 단백질 샷, 단백질 분리물, 에너지 바, 에너지 겔, 에너지 츄, 에너지 포뮬러, 지구력 포뮬러, 에너지 보충제, 영양 보충제, 스포츠 영양 보충제, 유아용 조제분유(예컨대, 분말 또는 액체), 및 식사 대용품을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 복수의 재조합 세포 부산물로부터 재조합 단백질을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계는 i) 재조합 단백질에 가역적으로 부착되고 EPS에 실질적으로 부착되지 않는 양이온 수지, ii) 재조합 단백질에 가역적으로 부착되고 EPS에 실질적으로 부착되지 않는 음이온 수지, iii) 재조합 단백질 또는 EPS를 소화시키는 효소, 및/또는 iv) EPS에 가역적으로 부착되고 재조합 단백질에 실질적으로 부착되지 않는 흡착제 중 하나 이상을 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 임의의 상기 개시된 방법에 의해 수득된 소비가능한 조성물을 제공한다.
단백질 생성물 및 단백질 함유 소비가능한 조성물
본 개시내용의 또 다른 양태는 임의의 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 단백질 생성물이다.
본 개시내용의 또 다른 양태는 임의의 본원에 개시된 단백질 생성물을 포함하는 소비가능한 조성물이다.
일 양태에서, 본 개시내용은 식품에 사용하기 위한 본원에 개시된 소비가능한 조성물을 제공한다.
구현예에서, 소비가능한 조성물은 적어도 하나의 소비가능한 성분을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 소비가능한 성분은 용매, 예컨대, 물, 탄산수, 알코올, 주스, 및 임의의 기타 시판되는 음료이다.
구현예에서, 단백질 생성물을 포함하고 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 소비가능한 조성물은 재조합 세포 부산물의 양이 감소되지 않은 동등한 소비가능한 조성물에 비해 하나 이상의 상이한 특성을 갖는다.
구현예에서, 특성은 밀도, 점도, 겔 경도, 씹힘성, 폼 용량, 폼 안정성, 용해도, 투명도, 질감, 폼 발생, 휘핑, 시핑(seeping), 겔화, 정화, 응고, 코팅, 결정화 제어, 건조, 식용 포장 필름, 마감, 풍미, 강화, 동결성, 광택, 습윤성, 절연, 보습, 식감, pH 안정성, 단백질 강화, 농후화, 저장 수명 연장, 구조감, 연화, 질감, 증점화, 수-결합성, 오일-결합성, 갈변, 유화, 질소: 탄소 비율 및/또는 항균 활성을 포함한다. 일부 경우에, 상이한 특성은 특성의 바람직한 증가를 포함하거나, 또는 상이한 특성은 특성의 바람직한 감소를 포함한다.
본 개시내용의 양태는 소비가능한 조성물을 제조하는 방법이다. 이 방법은 재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 수득하는 단계로서, 재조합 세포 부산물은 엑소폴리사카라이드(EPS) 또는 이취 성분인 단계; 재조합 단백질 및 EPS 또는 이취 성분을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계; 분리된 재조합 단백질을 수집하여 EPS 함량이 감소된 단백질 생성물을 수득하고/하거나 분리된 EPS를 수집하여 재조합 단백질의 양이 감소된 EPS 생성물을 수득하는 단계; 및 단백질 생성물 또는 EPS 생성물을 포함하는 소비가능한 조성물을 제제화하는 단계를 포함한다. 이 방법에서 가공 단계는 i) 재조합 단백질에 가역적으로 부착되고 EPS에 실질적으로 부착되지 않는 수지, ii) 재조합 단백질 또는 EPS를 소화시키는 효소, iii) EPS에 가역적으로 부착되고 재조합 단백질에 실질적으로 부착되지 않는 흡착제, 및/또는 iv) EPS에 부착되고 재조합 단백질에 실질적으로 부착되지 않는 응집제를 포함한다.
재조합 세포 부산물을 수집하는 방법
임의의 본원에 개시된 양태 또는 구현예에서, 방법은 분리된 재조합 세포 부산물을 수집하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에, 방법은 분리된 재조합 세포 부산물을 농축 및/또는 정제하여 재조합 단백질의 양이 감소된 EPS 생성물을 수득하는 단계를 추가로 포함한다.
재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 생산하고, 재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 분리하는 예시적인 방법이 도 5에 나타나 있다. 이 양태의 방법은 발효 공정 동안 생산되는 임의의 세포외 생성물을 수집하는 데 사용될 수 있다.
일 양태에서, 본 개시내용은 임의의 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 엑소폴리사카라이드(EPS) 생성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 임의의 본원에 개시된 엑소폴리사카라이드(EPS) 생성물을 포함하는 소비가능한 조성물을 제공한다.
구현예에서, 소비가능한 조성물은 적어도 하나의 소비가능한 성분을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 소비가능한 조성물은 식품으로 사용하기 위한 것이다.
다양한 구현예에서, EPS는 소비자에게 영양 보충을 제공한다.
구현예에서, EPS는 소비자의 소화관 세포에 대한 병원체의 결합을 방지함으로써 소비자의 위장관 건강을 개선한다.
일부 구현예에서, EPS는 유리한 장내 미생물군집을 촉진함으로써 소비자의 위장관 건강을 개선한다.
본 개시내용의 양태는 소비가능한 조성물을 제조하는 방법이다. 이 방법은 재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 수득하는 단계로서, 재조합 세포 부산물은 엑소폴리사카라이드(EPS)인 단계; 재조합 단백질 및 EPS를 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계; 분리된 재조합 단백질을 수집하여 EPS의 양이 감소된 단백질 생성물을 수득하고/하거나 분리된 EPS를 수집하여 재조합 단백질의 양이 감소된 EPS 생성물을 수득하는 단계; 및 단백질 생성물 또는 EPS 생성물을 포함하는 소비가능한 조성물을 제제화하는 단계를 포함한다. 이 방법에서 가공 단계는 i) 재조합 단백질에 가역적으로 부착되고 EPS에 실질적으로 부착되지 않는 수지, ii) 재조합 단백질 또는 EPS를 소화시키는 효소, iii) EPS에 가역적으로 부착되고 재조합 단백질에 실질적으로 부착되지 않는 흡착제, 및/또는 iv) EPS에 부착되고 재조합 단백질에 실질적으로 부착되지 않는 응집제를 포함한다.
본 개시내용의 방법의 특징
구현예에서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물 내의 재조합 세포 부산물 대 재조합 단백질의 비율은 약 1:3 내지 약 3:1이다. 일부 경우에, 비율은 약 1:1이다.
일부 구현예에서, 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물은 재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물에 비해 재조합 세포 부산물 양에서 적어도 50% 감소를 포함한다. 일부 경우에, 단백질 생성물은 재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물에 비해 재조합 세포 부산물 양에서 적어도 75% 감소, 적어도 80% 감소, 적어도 90% 감소, 또는 적어도 95% 감소를 갖는다.
다양한 구현예에서, 단백질 생성물의 중량의 약 10% 미만이 재조합 세포 부산물을 포함한다. 일부 경우에, 단백질 생성물의 중량의 약 5% 미만이 재조합 세포 부산물을 포함한다.
구현예에서, EPS 또는 이취 성분은 일반적으로 크기 배제 크로마토그래피를 사용할 때 재조합 단백질로부터 분리될 수 없다.
일부 구현예에서, EPS 또는 이취 성분은 자연적으로 재조합 세포의 세포벽의 성분이다. 일부 경우에, 재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물에 존재하는 EPS 또는 이취 성분은 재조합 세포의 세포벽에 통합되기보다는 재조합 세포로부터 분비된다.
다양한 구현예에서, EPS는 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 의해 특징지어지는 바와 같이 약 13 kDa 내지 약 27 kDa의 겉보기 크기를 갖는다.
구현예에서, EPS는 만노스를 포함한다. 일부 경우에, EPS는 N-아세틸글루코사민 및/또는 글루코스를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, EPS는 질량 분석법과 함께 가스 크로마토그래피에 의해 분석될 때 약 91 몰% 만노스, 약 5 몰% N-아세틸글루코사민, 및 약 3 몰% 글루코스를 포함한다. EPS는 pb 결합 컬럼을 사용한 방법을 사용하여 정량화될 수 있다. 분석용 HyperREZ XP Pb++ 컬럼(8 um, 300 x 7.7 mm, Thermofisher Sci.)이 측정에 사용될 수 있으며, 이는 0.6 mL/분의 유속으로 작동되는 UltiMate 3000 시스템(Thermofisher Sci.)에서 물로 용출되고 굴절률 검출기로 모니터링된다.
다양한 구현예에서, EPS는 α(1,2)-연결된 분지 및/또는 α(1,3)-연결된 분지를 갖는 α(1,6)-연결된 백본을 포함한다.
구현예에서, EPS는 만난이다.
일부 구현예에서, 재조합 세포는 EPS를 발현 및/또는 분비하는 세포이고, 진균 세포, 예컨대 사상 진균 또는 효모, 박테리아 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 또는 포유동물 세포로부터 선택된다.
다양한 구현예에서, 재조합 세포 유형은 아르술라 종, 아르술라 아데니니보란스, 클루이베로마이세스 종, 클루이베로마이세스 락티스, 코마가타엘라 파피이, 피치아 종, 피치아 안구스타, 피치아 파스토리스, 사카로마이세스 종, 사카로마이세스 세레비지애, 쉬조사카로마이세스 종, 쉬조사카로마이세스 폼베, 야로위아 종, 야로위아 리폴리티카, 아가리쿠스 종, 아가리쿠스 비스포루스, 아스퍼질러스 종, 아스퍼질러스 아와모리, 아스퍼질러스 푸미가투스, 아스퍼질러스 니둘란스, 아스퍼질러스 니거, 아스퍼질러스 오리자에, 바실러스 서브틸리스, 콜레토트리쿰 종, 콜레토트리쿰 글로에오스포리오데스, 엔도시아 종, 엔도시아 파라시티카, 에세리키아 콜리, 푸사리움 종, 푸사리움 그라미네아룸, 푸사리움 솔라니, 무코르 종, 무코르 미에헤이, 무코르 푸실루스, 마이셀리오프토라 종, 마이셀리오프토라 써모필라, 뉴로스포라 종, 뉴로스포라 크라사, 페니실리움 종, 페니실리움 카멤버티, 페니실리움 카네센스, 페니실리움 크리소제눔, 페니실리움(탈라로마이세스) 에머소니, 페니실리움 푸니쿨로 섬, 페니실리움 퍼푸로제눔, 페니실리움 로퀘포티, 플레우로투스 종, 플레우로투스 오스트레아투스, 슈도모나스 종, 리조무코르 종, 리조무코르 미에헤이, 리조무코르 푸실루스, 리조푸스 종, 리조푸스 아르히주스, 리조푸스 올리고스포루스, 리조푸스 오리자에, 트리코더마 종, 트리코더마 알트로비리데, 트리코더마 레에세이, 및 트리코더마 비레우스로부터 선택된다. 일부 경우에, 진균은 피치아 종이다. 일부 경우에, 피치아 종은 코마가타엘라 파피이 또는 코마가타엘라 파스토리스이다.
구현예에서, 재조합 단백질은 효소, 영양 단백질, 식품 성분, 또는 식품 첨가물이다. 일부 경우에, 효소는 펩시노겐 또는 펩신이다.
일부 구현예에서, 단백질은 난백 단백질이다. 달걀은 전 세계적으로 거의 필수적인 식품 성분이다. 달걀 및 달걀 성분에 대한 거대한 시장이 있다. 달걀은 높은 단백질과 기능식품 함량을 제공하며 우유와 조합시 완전 식품으로 간주되어 왔다. 그러나, 달걀은 제한된 저장 수명을 가지며, 감염성 병원균을 가져오기 쉽다. 전 세계 사람들, 특히 어린이들은 음식 알레르기 진단을 받았거나 달걀을 섭취하는 것을 억제하는 식이 제한을 갖는다. 또한, 달걀의 산업적 규모 생산의 생산성을 개선하는 것은 닭을 사육하기 위한 비인간적인 조건 외에도 성장 호르몬의 사용을 도입한다. 현재 달걀 대체품들은 큰 한계가 있다. 어떤 제품도 그 적용을 폼 발생뿐만 아니라 겔화로 확장하지 않는다. 패키지 내의 제품 조성물은 시간이 지남에 따라 불안정하다.
일부 경우에, 난백 단백질은 난백알부민(OVA), 오보뮤코이드(OVD), 오보트랜스페린(OVT), 라이소자임(OVL), 오보뮤신, 오보글로불린 G2, 오보글로불린 G3, 오보억제제, 오보당단백질, 플라보단백질, 오보마크로글로불린, 오보스타틴, 시스타틴, 아비딘, 난백알부민 관련 단백질 X, 또는 난백알부민 관련 단백질 Y, 및 이들의 임의의 조합이다. 다양한 경우에, 난백 단백질은 OVA, OVD, OVT, 또는 OVL이다. 일부 경우에, 난백 단백질은 새, 예컨대 닭, 메추라기, 칠면조, 칠면조 독수리, 벌새, 오리, 타조, 거위, 갈매기, 뿔닭, 꿩, 또는 에뮤에서 자연적으로 생산된 난백 단백질과 적어도 80% 동일한(예컨대, 약 85%, 90%, 또는 95% 동일한) 서열을 갖는다.
본원에 개시된 임의의 조성물 또는 방법은 임의의 본원에 개시된 조성물 또는 방법에 적용가능하다. 즉, 본원에 기재된 임의의 양태 또는 구현예는 본원에 개시된 바와 같은 임의의 다른 양태 또는 구현예와 조합될 수 있다.
정의
용어 "약" 및 "대략"은 당업자에 의해 결정된 바와 같은 특정 값에 대한 허용가능한 오차 범위 내를 의미하며, 이는 값이 측정 또는 결정되는 방법, 예컨대 측정 시스템의 한계에 일부 좌우될 것이다. 예를 들어, "약"은 당업계의 관행에 따라 1 이상의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 20%, 최대 15%, 최대 10%, 최대 5%, 또는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 공정과 관련하여, 상기 용어는 값의 10배 이내, 바람직하게는 5배 이내, 및 더욱 바람직하게는 2배 이내를 의미할 수 있다. 특정 값이 출원 및 청구범위에 기재되어 있는 경우, 달리 명시되지 않는 한, 특정 값에 대해 허용가능한 오차 범위 내를 의미하는 용어 "약"이 추정되어야 한다.
서열 동일성, 예컨대 백분율 상보성을 평가하기 위한 서열 동일성은, 비제한적으로 니들만-분쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘(예컨대, 선택적으로 기본 설정을 갖는, ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html에서 World Wide Web에서 이용가능한 EMBOSS Needle 정렬기 참조), BLAST 알고리즘(예컨대, 선택적으로 기본 설정을 갖는, blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi에서 이용가능한 BLAST 정렬 도구 참조), 및 스미스-워터만(Smith-Waterman) 알고리즘(예컨대, 선택적으로 기본 설정을 갖는, ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.htrnl에서 World Wide Web에서 이용가능한 EMBOSS Water 정렬기 참조)을 포함하는 임의의 적합한 정렬 알고리즘에 의해 측정될 수 있다. 최적의 정렬은 기본 매개변수를 포함하여 선택된 알고리즘의 임의의 적합한 매개변수를 사용하여 평가될 수 있다.
용어 "새"는 가축화된 새 및 가축화되지 않은 새 모두, 예컨대 야생동물 등을 포함한다. 새는, 비제한적으로 가금류, 물새, 사냥감 새, 평흉류(ratite)(예컨대, 날지 못하는 새), 닭(Gallus domesticus), 메추라기, 칠면조, 오리, 타조(Struthio camelus), 소말리아 타조(Struthio molybdophanes), 거위, 갈매기, 뿔닭, 꿩, 에뮤(Dromaius novaehollandiae), 아메리카 레아(Rhea americana), 다윈 레아(Rhea pennata), 및 키위새를 포함한다. 생체 내에서 수득되거나 시험관 내에서 배양된 생물학적 엔티티의 조직, 세포 및 이들의 자손이 또한 포괄된다. 새는 알을 낳을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "소비가능한 조성물" 또는 "소비가능한 제품"은 재조합 단백질을 포함하는 조성물 또는 제품 또는 재조합 단백질 및 기타 성분을 포함하는 조성물을 지칭하며, 소비될 수 있다(예컨대, 먹거나, 씹거나, 마시거나, 맛보거나, 섭취하거나, 또는 삼킴으로써). 소비가능한 제품은, 비제한적인 예로서 식품, 음료 제품, 식이 보충제, 식품 첨가물, 의약품, 및 위생 제품을 포함한다. 식품은, 비제한적으로 제과제빵(예컨대, 케이크, 머핀, 쿠키, 빵, 베이글, 페이스트리, 도넛), 스크램블, 오믈렛, 키슈, 파스타, 국수, 크레페, 와플, 도우, 배터, 쿠키 도우, 미트로프, 미트볼, 햄버거, 동물 사료, 과일, 야채, 두부, 비지, 치즈, 해산물, 고기, 아이스크림, 마요네즈, 커스터드, 푸딩, 수플레, 유제, 폼, 머랭, 프로스팅, 과자, 마시멜로, 마지팬, 수프, 조미료, 소스, 향신료, 유제품, 및 드레싱을 포함한다. 음료 제품은, 비제한적으로 청량 음료, 플레이버 워터, 주스, 스포츠 음료, 에너지 음료, 스무디, 쉐이크, 알코올 음료(예컨대, 와인, 사케, 맥주, 증류주), 칵테일, 리큐어, 탄산 음료, 카페인 음료, 커피, 코코아, 차, 에그노그, 및 유제 음료를 포함한다. 식이 보충제는 종합 비타민, 훌 푸드 보충제, 다이어트 보충제, 허브 보충제, 단백질 블렌드, 매스 게이너, 즉석 음료 단백질, 단백질 바, 단백질 쉐이크, 단백질 분말, 단백질 샷, 단백질 분리물, 에너지 바, 에너지 겔, 에너지 츄, 에너지 포뮬러, 지구력 포뮬러, 에너지 보충제, 영양 보충제, 스포츠 영양 보충제, 유아용 조제분유(예컨대, 분말 또는 액체), 및 식사 대용품을 포함한다. 소비가능한 제품 또는 소비가능한 조성물의 소비자는 길들여진 동물(예컨대, 가축) 및 인간을 포함한 임의의 동물이다.
가공된 소비가능한 제품을 형성하기 위해 소비가능한 제품을 가공하는 단계는, 비제한적으로 냉동, 냉각, 가열, 베이킹, 로스팅, 브로일링(broiling), 보일링, 블랜칭(blanching), 포장, 캐닝(canning), 표백, 농축, 건조, 압착, 분쇄(grinding), 혼합, 파쿠킹(parcooking), 조리, 프루핑(proofing), 마리네이팅(marinating), 컷팅, 슬라이싱, 다이싱, 크러싱, 쉐딩(shredding), 초핑(chopping), 세이킹(shaking), 코어링(coring), 스파이얼링(spiralizing), 롤링, 주싱(juicing), 스트레닝(straining), 여과, 니딩(kneading), 위스킹(whisking), 비팅(beating), 휘핑, 그레이팅(grating), 스터핑(stuffing), 필링(peeling), 씨 제거(deceeding), 훈제(smoking), 경화, 염장, 보존, 절임(pickling), 발효, 균질화, 저온살균, 살균, 안정화, 블렌딩, 퓨레화, 강화, 정제, 수소화, 숙성, 저장 수명 연장, 또는 효소 첨가를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "용매"는 조성물 또는 조성물의 하나 이상의 성분, 예컨대 단백질과 혼합되거나 용해하기 위해 사용될 수 있는 액체를 지칭한다. 용매의 비제한적인 예는 물, 에탄올, 및 이소프로판올을 포함한다. 용매는 마실 수 있다. 용매는 물일 수 있다. 물의 비제한적인 예는 정제수, 증류수, 이중 증류수, 탈이온수, 증류된 탈이온수, 식수, 우물물, 수돗물, 샘물, 병에 든 생수, 탄산수, 광천수, 플레이버 워터, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 용매는 둘 이상의 구별되는 용매의 조합일 수 있다.
추가 구현예:
구현예 1. 소비가능한 조성물을 제조하는 방법으로서,
재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 수득하는 단계로서, 재조합 세포 부산물은 엑소폴리사카라이드(EPS) 및 이취 성분을 포함하는 것인 단계;
복수의 재조합 세포 부산물로부터 재조합 단백질을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계로서, 가공 단계는 재조합 단백질에 가역적으로 부착되고 복수의 재조합 세포 부산물에 실질적으로 부착되지 않는 음이온 수지를 포함하는 것인 단계;
분리된 재조합 단백질을 수집하여 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물을 수득하는 단계; 및
단백질 생성물을 포함하는 소비가능한 조성물을 제제화하는 단계
를 포함하는, 소비가능한 조성물을 제조하는 방법.
구현예 2. 구현예 1에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 세포 배양 배지인 방법.
구현예 3. 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 분비한 재조합 세포를 포함하는 세포 배양 배지인 방법.
구현예 4. 구현예 1에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 분비한 재조합 세포가 결여되어 있는 것인 방법.
구현예 5. 구현예 1 내지 4 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 단백질의 등전점(pI)보다 큰 pH를 갖는 것인 방법.
구현예 6. 구현예 5에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물의 pH는 재조합 단백질의 pI보다 큰 pH를 달성하도록 변형되지 않는 것인 방법.
구현예 7. 구현예 1 내지 6 중 어느 한 구현예에 있어서, 음이온 수지는 강한 음이온 교환 수지 또는 약한 음이온 교환 수지인 방법.
구현예 8. 구현예 1 내지 7 중 어느 한 구현예에 있어서, 음이온 수지는 캅토 Q(Capto Q) 수지, DEAE 유형 약한 음이온 교환기, 트리메틸 아미노에틸 기를 갖는 수지, 트리에틸 아미노에틸 기를 갖는 수지, 4차 아민 기를 갖는 수지 중 하나 이상인 방법.
구현예 9. 구현예 1 내지 8 중 어느 한 구현예에 있어서, 음이온 수지는 크로마토그래피 시스템의 성분인 방법.
구현예 10. 구현예 9에 있어서, 크로마토그래피 시스템은 축상 유동 컬럼 또는 방사상 유동 컬럼 또는 원심분리 컬럼에 의하거나 또는 막 크로마토그래피 컬럼의 사용에 의한 배치 모드로 작동하는 것인 방법.
구현예 11. 구현예 9에 있어서, 크로마토그래피 시스템은 복수의 컬럼을 병렬로 포함하는 연속 모드로 작동하며, 여기서 컬럼으로의 공급은 크로마토그래피 공정에서의 다양한 단계(예컨대, 평형화, 로딩, 용출, 및 세정)가 동시에 발생하도록 전환가능한 것인 방법.
구현예 12. 구현예 11에 있어서, 연속 모드는 모사 이동층(SMB) 또는 이온 분리기(예컨대, ISEP®) 시스템을 포함하는 것인 방법.
구현예 13. 구현예 4 내지 12 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 세포를 포함하는 소모된 바이오매스를 제거하기 위해 사전에 처리되고/되거나 작은 비단백질 분자를 제거하기 위해 사전에 처리된 것인 방법.
구현예 14. 구현예 13에 있어서, 작은 비단백질 분자를 제거하기 위한 처리는 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 농축하는 단계를 포함하는 것인 방법.
구현예 15. 구현예 13 또는 구현예 14에 있어서, 작은 비단백질 분자를 제거하기 위한 처리는 정용여과 완충액을 포함하는 것인 방법.
구현예 16. 구현예 1 내지 15 중 어느 한 구현예에 있어서, 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물을 생산하기 위해 그 분리된 재조합 단백질의 농축 단계 및/또는 정용여과 처리를 추가로 포함하는 방법.
구현예 17. 구현예 16에 있어서, 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물은 추가로 열 처리 및/또는 건조되는 것인 방법.
구현예 18. 구현예 1 내지 15 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물 및/또는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물은 추가로 열 처리 및/또는 건조되는 것인 방법.
구현예 19. 구현예 17 또는 구현예 18에 있어서, 열 처리는 재조합 단백질 및 이취 성분을 분리하고, 여기서 열은 이취 성분이 휘발되어 기체상 이취 성분이 제거될 수 있는 온도 및 지속 시간으로 적용되는 것인 방법.
구현예 20. 구현예 19에 있어서, 열의 적용과 동시에 진공이 적용되고, 진공은 기체상 이취 성분의 제거를 촉진하는 것인 방법.
구현예 21. 구현예 1 내지 20 중 어느 한 구현예에 있어서, 이취 성분은 산, 알코올, 알데하이드, 방향족, 에스테르, 또는 케톤인 방법.
구현예 22. 구현예 1 내지 21 중 어느 한 구현예에 있어서, 이취 성분은 (E)-2-노네날; 1-도데센; 1-헥산올, 2-에틸-; 1-헥센-3-온; 1-옥텐-3-온; 2,3-부탄디온; 2-부탄온; 2-메틸부탄알; 2-메틸프로판알; 2-프로판온; 2-운데칸온; 3-메틸부탄알; 아세트알데하이드; 벤젠 에탄올; 벤질 알코올; 부탄알, 3-메틸-; 클로로톨루엔; 노난산; p-크레졸; 또는 프로판산, 2-메틸-, 3-하이드록시-2,4,4-트리메틸펜틸 에스테르인 방법.
구현예 23. 구현예 17 내지 22 중 어느 한 구현예에 있어서, 열 처리 동안 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물, 및/또는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물의 온도는 최대 80℃, 예컨대 약 50℃ 내지 약 60℃인 방법.
구현예 24. 구현예 17 내지 23 중 어느 한 구현예에 있어서, 방법은 열 처리 동안 교반을 포함하는 것인 방법.
구현예 25. 구현예 17 내지 24 중 어느 한 구현예에 있어서, 열 처리 및/또는 건조 단계는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 건조 단백질 생성물을 생산하는 것인 방법.
구현예 26. 구현예 1 내지 25 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물 및/또는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물은 산화 단계, 예컨대 과산화수소의 첨가를 포함하는 산화 단계를 추가로 수행하는 것인 방법.
구현예 27. 구현예 1 내지 26 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물 내의 재조합 세포 부산물 대 재조합 단백질의 비율은 약 1:3 내지 약 3:1인 방법.
구현예 28. 구현예 27에 있어서, 단백질 생성물은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물에 비해 EPS의 양 및/또는 이취 성분의 양에서 적어도 25% 감소, 적어도 30% 감소, 적어도 35% 감소, 적어도 40% 감소, 적어도 45% 감소, 적어도 50% 감소, 적어도 55% 감소, 적어도 60% 감소, 적어도 65% 감소, 적어도 70% 감소, 적어도 75% 감소, 적어도 75% 감소, 적어도 80% 감소, 적어도 90% 감소, 또는 적어도 95% 감소를 갖는 것인 방법.
구현예 29. 구현예 28에 있어서, 단백질 생성물의 중량의 약 10% 미만이 재조합 세포 부산물을 포함하는 것인 방법.
구현예 30. 구현예 1 내지 29 중 어느 한 구현예에 있어서, 단백질 생성물의 중량의 약 5% 미만이 재조합 세포 부산물을 포함하는 것인 방법.
구현예 31. 구현예 1 내지 30 중 어느 한 구현예에 있어서, 단백질 생성물의 중량의 약 5% 미만, 약 1% 미만, 약 0.1% 미만, 또는 약 0.01% 미만이 이취 성분을 포함하는 것인 방법.
구현예 32. 구현예 1 내지 31 중 어느 한 구현예에 있어서, 단백질 생성물 내의 이취 성분은 표준 소비자에게 사실상 감지될 수 없는 것인 방법.
구현예 33. 구현예 1 내지 32 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 일반적으로 크기 배제 크로마토그래피를 사용할 때 재조합 단백질로부터 분리될 수 없는 것인 방법.
구현예 34. 구현예 1 내지 33 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 자연적으로 재조합 세포의 세포벽의 성분인 방법.
구현예 35. 구현예 1 내지 34 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 의해 특징지어지는 바와 같이 약 13 kDa 내지 약 27 kDa의 겉보기 크기를 갖는 것인 방법.
구현예 36. 구현예 1 내지 35 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 만노스를 포함하는 것인 방법.
구현예 37. 구현예 1 내지 36 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 N-아세틸글루코사민 및/또는 글루코스를 추가로 포함하는 것인 방법.
구현예 38. 구현예 1 내지 37 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 질량 분석법과 함께 가스 크로마토그래피에 의해 분석될 때 약 91 몰% 만노스, 약 5 몰% N-아세틸글루코사민, 및 약 3 몰% 글루코스를 포함하는 것인 방법.
구현예 39. 구현예 1 내지 38 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 α(1,2)-연결된 분지 및/또는 α(1,3)-연결된 분지를 갖는 α(1,6)-연결된 백본을 포함하는 것인 방법.
구현예 40. 구현예 1 내지 39 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 만난인 방법.
구현예 41. 구현예 1 내지 40 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 발현하는 재조합 세포는 진균 세포, 예컨대 사상 진균 또는 효모, 박테리아 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 또는 포유동물 세포로부터 선택되는 것인 방법.
구현예 42. 구현예 1 내지 41 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 세포 유형은 아르술라 종(Arxula spp.), 아르술라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans), 클루이베로마이세스 종(Kluyveromyces spp.), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 코마가타엘라 파피이(Komagataella phaffii), 피치아 종(Pichia spp.), 피치아 안구스타(Pichia angusta), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 종(Saccharomyces spp.), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 종(Schizosaccharomyces spp.), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 야로위아 종(Yarrowia spp.), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 아가리쿠스 종(Agaricus spp.), 아가리쿠스 비스포루스(Agaricus bisporus), 아스퍼질러스 종(Aspergillus spp.), 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 콜레토트리쿰 종(Colletotrichum spp.), 콜레토트리쿰 글로에오스포리오데스(Colletotrichum gloeosporiodes), 엔도시아 종(Endothia spp.), 엔도시아 파라시티카(Endothia parasitica), 에세리키아 콜리(Escherichia coli), 푸사리움 종(Fusarium spp.), 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 푸사리움 솔라니(Fusarium solani), 무코르 종(Mucor spp.), 무코르 미에헤이(Mucor miehei), 무코르 푸실루스(Mucor pusillus), 마이셀리오프토라 종(Myceliophthora spp.), 마이셀리오프토라 써모필라(Myceliophthora thermophila), 뉴로스포라 종(Neurospora spp.), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 페니실리움 종(Penicillium spp.), 페니실리움 카멤버티(Penicillium camemberti), 페니실리움 카네센스(Penicillium canescens), 페니실리움 크리소제눔(Penicillium chrysogenum), 페니실리움(탈라로마이세스) 에머소니(Penicillium(Talaromyces) emersonii), 페니실리움 푸니쿨로 섬(Penicillium funiculo sum), 페니실리움 퍼푸로제눔(Penicillium purpurogenum), 페니실리움 로퀘포티(Penicillium roqueforti), 플레우로투스 종(Pleurotus spp.), 플레우로투스 오스트레아투스(Pleurotus ostreatus), 슈도모나스 종(Pseudomonas spp.), 리조무코르 종(Rhizomucor spp.), 리조무코르 미에헤이(Rhizomucor miehei), 리조무코르 푸실루스(Rhizomucor pusillus), 리조푸스 종(Rhizopus spp.), 리조푸스 아르히주스(Rhizopus arrhizus), 리조푸스 올리고스포루스(Rhizopus oligosporus), 리조푸스 오리자에(Rhizopus oryzae), 트리코더마 종(Trichoderma spp.), 트리코더마 알트로비리데(Trichoderma altroviride), 트리코더마 레에세이(Trichoderma reesei), 및 트리코더마 비레우스(Trichoderma vireus)로부터 선택되는 것인 방법.
구현예 43. 구현예 41 또는 구현예 42에 있어서, 진균은 피치아 종인 방법.
구현예 44. 구현예 43에 있어서, 피치아 종은 코마가타엘라 파피이 또는 코마가타엘라 파스토리스인 방법.
구현예 45. 구현예 1 내지 44 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 단백질은 효소, 영양 단백질, 식품 성분, 또는 식품 첨가물인 방법.
구현예 46. 구현예 45에 있어서, 효소는 펩시노겐 또는 펩신인 방법.
구현예 47. 구현예 45에 있어서, 단백질은 난백 단백질인 방법.
구현예 48. 구현예 47에 있어서, 난백 단백질은 난백알부민(OVA), 오보뮤코이드(OVD), 오보트랜스페린(OVT), 라이소자임(OVL), 오보뮤신, 오보글로불린 G2, 오보글로불린 G3, 오보억제제, 오보당단백질, 플라보단백질, 오보마크로글로불린, 오보스타틴, 시스타틴, 아비딘, 난백알부민 관련 단백질 X, 또는 난백알부민 관련 단백질 Y, 및 이들의 임의의 조합인 방법.
구현예 49. 구현예 47 또는 구현예 48에 있어서, 난백 단백질은 새, 예컨대 닭, 메추라기, 칠면조, 칠면조 독수리, 벌새, 오리, 타조, 거위, 갈매기, 뿔닭, 꿩, 또는 에뮤에서 자연적으로 생산된 난백 단백질과 적어도 80% 동일한(예컨대, 약 85%, 90%, 또는 95% 동일한) 서열을 갖는 것인 방법.
구현예 50. 구현예 1 내지 49 중 어느 한 구현예에 있어서, 단백질 생성물을 포함하는 소비가능한 조성물은 식품, 음료 제품, 또는 식이 보충제를 포함하는 것인 방법.
구현예 51. 구현예 50에 있어서, 식품은 제과제빵(예컨대, 케이크, 머핀, 쿠키, 빵, 베이글, 페이스트리, 도넛), 스크램블, 오믈렛, 키슈, 파스타, 국수, 크레페, 와플, 도우, 배터, 쿠키 도우, 미트로프, 미트볼, 햄버거, 동물 사료, 과일, 야채, 두부, 비지, 치즈, 해산물, 고기, 아이스크림, 마요네즈, 커스터드, 푸딩, 수플레, 유제, 폼, 머랭, 프로스팅, 과자, 마시멜로, 마지팬, 수프, 조미료, 소스, 향신료, 유제품, 및 드레싱을 포함하는 것인 방법.
구현예 52. 구현예 50에 있어서, 음료 제품은 청량 음료, 플레이버 워터, 주스, 스포츠 음료, 에너지 음료, 스무디, 쉐이크, 알코올 음료(예컨대, 와인, 사케, 맥주, 증류주), 칵테일, 리큐어, 탄산 음료, 카페인 음료, 커피, 코코아, 차, 에그노그, 및 유제 음료를 포함하는 것인 방법.
구현예 53. 구현예 50에 있어서, 식이 보충제는 종합 비타민, 훌 푸드 보충제, 다이어트 보충제, 허브 보충제, 단백질 블렌드, 매스 게이너, 즉석 음료 단백질, 단백질 바, 단백질 쉐이크, 단백질 분말, 단백질 샷, 단백질 분리물, 에너지 바, 에너지 겔, 에너지 츄, 에너지 포뮬러, 지구력 포뮬러, 에너지 보충제, 영양 보충제, 스포츠 영양 보충제, 유아용 조제분유(예컨대, 분말 또는 액체), 및 식사 대용품을 포함하는 것인 방법.
구현예 54. 구현예 1 내지 53 중 어느 한 구현예에 있어서, 복수의 재조합 세포 부산물로부터 재조합 단백질을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계는 i) 재조합 단백질에 가역적으로 부착되고 EPS에 실질적으로 부착되지 않는 하나 이상의 양이온 교환 수지, ii) 재조합 단백질 또는 EPS를 소화시키는 효소, iii) EPS에 가역적으로 부착되고 재조합 단백질에 실질적으로 부착되지 않는 흡착제, 및/또는 iv) EPS에 부착되고 재조합 단백질에 실질적으로 부착되지 않는 응집제 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것인 방법.
구현예 55. 구현예 1 내지 54 중 어느 한 구현예의 방법에 의해 수득된 소비가능한 조성물.
구현예 56. 소비가능한 조성물을 제조하는 방법으로서,
재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 수득하는 단계로서, 재조합 세포 부산물은 엑소폴리사카라이드(EPS) 및 이취 성분을 포함하는 것인 단계;
복수의 재조합 세포 부산물로부터 재조합 단백질을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계로서, 가공 단계는 재조합 단백질에 가역적으로 부착되고 복수의 재조합 세포 부산물에 실질적으로 부착되지 않는 하나 이상의 양이온 교환 수지를 포함하는 것인 단계;
분리된 재조합 단백질을 수집하여 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물을 수득하는 단계; 및
단백질 생성물을 포함하는 소비가능한 조성물을 제제화하는 단계
를 포함하는, 소비가능한 조성물을 제조하는 방법.
구현예 57. 구현예 56에 있어서, 하나 이상의 양이온 교환 수지는 강한 양이온 교환 수지, 예컨대 설포프로필, 설포메틸 또는 설포네이트 유형 수지, 및/또는 약한 양이온 교환 수지, 예컨대 카르복시메틸 유형 수지를 포함하는 것인 방법.
구현예 58. 구현예 56 또는 구현예 57에 있어서, 하나 이상의 양이온 교환 수지는 폴리 스티렌 디비닐 벤젠, 폴리 메타크릴레이트 또는 셀룰로스 또는 가교결합된 덱스트란 또는 가교결합된 아가로스 또는 친수성 중합체로 코팅된 무기 물질을 포함하는 것인 방법.
구현예 59. 구현예 56 내지 58 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 양이온 교환 수지는 약 50 μm 내지 약 200 μm의 입자 크기를 갖고/갖거나 약 50 내지 약 100 g 단백질/L 수지의 단백질 결합 용량을 갖는 것인 방법.
구현예 60. 구현예 56 내지 59 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 양이온 교환 수지는 사이티바 캅토 S(Cytiva Capto S), HP20, 렐리조브 SP400(Relizorb SP400), 세프라겐 S(Sepragen S), SP20, 및/또는 미츠비시 렐리조브 EXE349(Mitsubishi Relizorb EXE349)를 포함하는 것인 방법.
구현예 61. 구현예 56 내지 60 중 어느 한 구현예에 있어서, 가공 단계는 2종의 양이온 수지를 포함하며, 2종의 양이온 수지는 1:5 내지 5:1, 1:4 내지 4:1, 1:3 내지 3:1, 1:2 내지 2:1, 또는 1:1의 비율인 방법.
구현예 62. 구현예 61에 있어서, 2개의 수지는 SP400 및 세프라겐 S이며, 약 3:1, 예컨대 2.75:1.25의 비율인 방법.
구현예 63. 구현예 56 내지 62 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 분비한 재조합 세포가 결여되어 있는 것인 방법.
구현예 64. 구현예 56 내지 63 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 단백질의 등전점(pI)보다 낮은 pH를 가지며, 이는 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물의 pH를 낮춤으로써 달성되는 것인 방법.
구현예 65. 구현예 56 내지 64 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 양이온 수지는 크로마토그래피 시스템의 성분이고, 크로마토그래피 시스템은 축상 유동 컬럼 또는 방사상 유동 컬럼 또는 원심분리 컬럼에 의하거나 또는 막 크로마토그래피 컬럼의 사용에 의한 배치 모드로 작동하는 것인 방법.
구현예 66. 구현예 56 내지 64 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 양이온 수지는 크로마토그래피 시스템의 성분이고, 크로마토그래피 시스템은 복수의 컬럼을 병렬로 포함하는 연속 모드로 작동하며, 여기서 컬럼으로의 공급은 크로마토그래피 공정에서의 다양한 단계(예컨대, 평형화, 로딩, 용출, 및 세정)가 동시에 발생하도록 전환가능한 것인 방법.
구현예 67. 구현예 66에 있어서, 연속 모드는 모사 이동층(SMB) 또는 이온 분리기(예컨대, ISEP®) 시스템을 포함하는 것인 방법.
구현예 68. 구현예 62 내지 67 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 세포를 포함하는 소모된 바이오매스를 제거하기 위해 사전에 처리되고/되거나 작은 비단백질 분자를 제거하기 위해 사전에 처리된 것인 방법.
구현예 69. 구현예 68에 있어서, 작은 비단백질 분자를 제거하기 위한 처리는 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 농축하는 단계를 포함하는 것인 방법.
구현예 70. 구현예 68 또는 구현예 69에 있어서, 작은 비단백질 분자를 제거하기 위한 처리는 정용여과 완충액을 포함하는 것인 방법.
구현예 71. 구현예 56 내지 70 중 어느 한 구현예에 있어서, 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물을 생산하기 위해 그 분리된 재조합 단백질의 농축 단계 및/또는 정용여과 처리를 추가로 포함하는 방법.
구현예 72. 구현예 71에 있어서, 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물은 추가로 열 처리 및/또는 건조되는 것인 방법.
구현예 73. 구현예 56 내지 70 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물 및/또는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물은 추가로 열 처리 및/또는 건조되는 것인 방법.
구현예 74. 구현예 72 또는 구현예 73에 있어서, 열 처리는 재조합 단백질 및 이취 성분을 분리하고, 여기서 열은 이취 성분이 휘발되어 기체상 이취 성분이 제거될 수 있는 온도 및 지속시간으로 적용되는 것인 방법.
구현예 75. 구현예 74에 있어서, 열의 적용과 동시에 진공이 적용되고, 진공은 기체상 이취 성분의 제거를 촉진하는 것인 방법.
구현예 76. 구현예 56 내지 75 중 어느 한 구현예에 있어서, 이취 성분은 산, 알코올, 알데하이드, 방향족, 에스테르, 또는 케톤인 방법.
구현예 77. 구현예 56 내지 76 중 어느 한 구현예에 있어서, 이취 성분은 (E)-2-노넨알; 1-도데센; 1-헥산올, 2-에틸-; 1-헥센-3-온; 1-옥텐-3-온; 2,3-부탄디온; 2-부탄온; 2-메틸부탄알; 2-메틸프로판알; 2-프로판온; 2-운데칸온; 3-메틸부탄알; 아세트알데하이드; 벤젠 에탄올; 벤질 알코올; 부탄알, 3-메틸-; 클로로톨루엔; 노난산; p-크레졸; 또는 프로판산, 2-메틸-, 3-하이드록시-2,4,4-트리메틸펜틸 에스테르인 방법.
구현예 78. 구현예 72 내지 77 중 어느 한 구현예에 있어서, 열 처리 동안 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물, 및/또는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물의 온도는 최대 80℃, 예컨대 약 50℃ 내지 약 60℃인 방법.
구현예 79. 구현예 72 내지 78 중 어느 한 구현예에 있어서, 방법은 열 처리 동안 교반을 포함하는 것인 방법.
구현예 80. 구현예 72 내지 79 중 어느 한 구현예에 있어서, 열 처리 및/또는 건조 단계는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 건조 단백질 생성물을 생산하는 것인 방법.
구현예 81. 구현예 56 내지 80 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물 및/또는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물은 산화 단계, 예컨대 과산화수소의 첨가를 포함하는 산화 단계를 추가로 수행하는 것인 방법.
구현예 82. 구현예 56 내지 81 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물 내의 재조합 세포 부산물 대 재조합 단백질의 비율은 약 1:3 내지 약 3:1인 방법.
구현예 83. 구현예 82에 있어서, 단백질 생성물은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물에 비해 EPS의 양 및/또는 이취 성분의 양에서 적어도 25% 감소, 적어도 30% 감소, 적어도 35% 감소, 적어도 40% 감소, 적어도 45% 감소, 적어도 50% 감소, 적어도 55% 감소, 적어도 60% 감소, 적어도 65% 감소, 적어도 70% 감소, 적어도 75% 감소, 적어도 75% 감소, 적어도 80% 감소, 적어도 90% 감소, 또는 적어도 95% 감소를 갖는 것인 방법.
구현예 84. 구현예 83에 있어서, 단백질 생성물의 중량의 약 10% 미만이 재조합 세포 부산물을 포함하는 것인 방법.
구현예 85. 구현예 56 내지 84 중 어느 한 구현예에 있어서, 단백질 생성물의 중량의 약 5% 미만이 재조합 세포 부산물을 포함하는 것인 방법.
구현예 86. 구현예 56 내지 85 중 어느 한 구현예에 있어서, 단백질 생성물의 중량의 약 5% 미만, 약 1% 미만, 약 0.1% 미만, 또는 약 0.01% 미만이 이취 성분을 포함하는 것인 방법.
구현예 87. 구현예 56 내지 86 중 어느 한 구현예에 있어서, 단백질 생성물 내의 이취 성분은 표준 소비자에게 사실상 감지될 수 없는 것인 방법.
구현예 88. 구현예 56 내지 87 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 일반적으로 크기 배제 크로마토그래피를 사용할 때 재조합 단백질로부터 분리될 수 없는 것인 방법.
구현예 89. 구현예 56 내지 88 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 자연적으로 재조합 세포의 세포벽의 성분인 방법.
구현예 90. 구현예 56 내지 89 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 의해 특징지어지는 바와 같이 약 13 kDa 내지 약 27 kDa의 겉보기 크기를 갖는 것인 방법.
구현예 91. 구현예 56 내지 90 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 만노스를 포함하는 것인 방법.
구현예 92. 구현예 56 내지 91 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 N-아세틸글루코사민 및/또는 글루코스를 추가로 포함하는 것인 방법.
구현예 93. 구현예 56 내지 92 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 질량 분석법과 함께 가스 크로마토그래피에 의해 분석될 때 약 91 몰% 만노스, 약 5 몰% N-아세틸글루코사민, 및 약 3 몰% 글루코스를 포함하는 것인 방법.
구현예 94. 구현예 56 내지 93 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 α(1,2)-연결된 분지 및/또는 α(1,3)-연결된 분지를 갖는 α(1,6)-연결된 백본을 포함하는 것인 방법.
구현예 95. 구현예 56 내지 94 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 만난인 방법.
구현예 96. 구현예 56 내지 95 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 발현하는 재조합 세포는 진균 세포, 예컨대 사상 진균 또는 효모, 박테리아 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 또는 포유동물 세포로부터 선택되는 것인 방법.
구현예 97. 구현예 56 내지 96 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 세포 유형은 아르술라 종, 아르술라 아데니니보란스, 클루이베로마이세스 종, 클루이베로마이세스 락티스, 코마가타엘라 파피이, 피치아 종, 피치아 안구스타, 피치아 파스토리스, 사카로마이세스 종, 사카로마이세스 세레비지애, 쉬조사카로마이세스 종, 쉬조사카로마이세스 폼베, 야로위아 종, 야로위아 리폴리티카, 아가리쿠스 종, 아가리쿠스 비스포루스, 아스퍼질러스 종, 아스퍼질러스 아와모리, 아스퍼질러스 푸미가투스, 아스퍼질러스 니둘란스, 아스퍼질러스 니거, 아스퍼질러스 오리자에, 바실러스 서브틸리스, 콜레토트리쿰 종, 콜레토트리쿰 글로에오스포리오데스, 엔도시아 종, 엔도시아 파라시티카, 에세리키아 콜리, 푸사리움 종, 푸사리움 그라미네아룸, 푸사리움 솔라니, 무코르 종, 무코르 미에헤이, 무코르 푸실루스, 마이셀리오프토라 종, 마이셀리오프토라 써모필라, 뉴로스포라 종, 뉴로스포라 크라사, 페니실리움 종, 페니실리움 카멤버티, 페니실리움 카네센스, 페니실리움 크리소제눔, 페니실리움(탈라로마이세스) 에머소니, 페니실리움 푸니쿨로 섬, 페니실리움 퍼푸로제눔, 페니실리움 로퀘포티, 플레우로투스 종, 플레우로투스 오스트레아투스, 슈도모나스 종, 리조무코르 종, 리조무코르 미에헤이, 리조무코르 푸실루스, 리조푸스 종, 리조푸스 아르히주스, 리조푸스 올리고스포루스, 리조푸스 오리자에, 트리코더마 종, 트리코더마 알트로비리데, 트리코더마 레에세이, 및 트리코더마 비레우스로부터 선택되는 것인 방법.
구현예 98. 구현예 96 또는 구현예 97에 있어서, 진균은 피치아 종인 방법.
구현예 99. 구현예 98에 있어서, 피치아 종은 코마가타엘라 파피이 또는 코마가타엘라 파스토리스인 방법.
구현예 100. 구현예 56 내지 99 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 단백질은 효소, 영양 단백질, 식품 성분, 또는 식품 첨가물인 방법.
구현예 101. 구현예 100에 있어서, 효소는 펩시노겐 또는 펩신인 방법.
구현예 102. 구현예 100에 있어서, 단백질은 난백 단백질인 방법.
구현예 103. 구현예 102에 있어서, 난백 단백질은 난백알부민(OVA), 오보뮤코이드(OVD), 오보트랜스페린(OVT), 라이소자임(OVL), 오보뮤신, 오보글로불린 G2, 오보글로불린 G3, 오보억제제, 오보당단백질, 플라보단백질, 오보마크로글로불린, 오보스타틴, 시스타틴, 아비딘, 난백알부민 관련 단백질 X, 또는 난백알부민 관련 단백질 Y, 및 이들의 임의의 조합인 방법.
구현예 104. 구현예 102 또는 구현예 103에 있어서, 난백 단백질은 새, 예컨대 닭, 메추라기, 칠면조, 칠면조 독수리, 벌새, 오리, 타조, 거위, 갈매기, 뿔닭, 꿩, 또는 에뮤에서 자연적으로 생산된 난백 단백질과 적어도 80% 동일한(예컨대, 약 85%, 90%, 또는 95% 동일한) 서열을 갖는 것인 방법.
구현예 105. 구현예 56 내지 104 중 어느 한 구현예에 있어서, 단백질 생성물을 포함하는 소비가능한 조성물은 식품, 음료 제품, 또는 식이 보충제를 포함하는 것인 방법.
구현예 106. 구현예 105에 있어서, 식품은 제과제빵(예컨대, 케이크, 머핀, 쿠키, 빵, 베이글, 페이스트리, 도넛), 스크램블, 오믈렛, 키슈, 파스타, 국수, 크레페, 와플, 도우, 배터, 쿠키 도우, 미트로프, 미트볼, 햄버거, 동물 사료, 과일, 야채, 두부, 비지, 치즈, 해산물, 고기, 아이스크림, 마요네즈, 커스터드, 푸딩, 수플레, 유제, 폼, 머랭, 프로스팅, 과자, 마시멜로, 마지팬, 수프, 조미료, 소스, 향신료, 유제품, 및 드레싱을 포함하는 것인 방법.
구현예 107. 구현예 105에 있어서, 음료 제품은 청량 음료, 플레이버 워터, 주스, 스포츠 음료, 에너지 음료, 스무디, 쉐이크, 알코올 음료(예컨대, 와인, 사케, 맥주, 증류주), 칵테일, 리큐어, 탄산 음료, 카페인 음료, 커피, 코코아, 차, 에그노그, 및 유제 음료를 포함하는 것인 방법.
구현예 108. 구현예 105에 있어서, 식이 보충제는 종합 비타민, 훌 푸드 보충제, 다이어트 보충제, 허브 보충제, 단백질 블렌드, 매스 게이너, 즉석 음료 단백질, 단백질 바, 단백질 쉐이크, 단백질 분말, 단백질 샷, 단백질 분리물, 에너지 바, 에너지 겔, 에너지 츄, 에너지 포뮬러, 지구력 포뮬러, 에너지 보충제, 영양 보충제, 스포츠 영양 보충제, 유아용 조제분유(예컨대, 분말 또는 액체), 및 식사 대용품을 포함하는 것인 방법.
구현예 109. 구현예 56 내지 108 중 어느 한 구현예에 있어서, 복수의 재조합 세포 부산물로부터 재조합 단백질을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계는 i) 재조합 단백질에 가역적으로 부착되고 EPS에 실질적으로 부착되지 않는 음이온 수지, ii) 재조합 단백질 또는 EPS를 소화시키는 효소, iii) EPS에 가역적으로 부착되고 재조합 단백질에 실질적으로 부착되지 않는 흡착제, 및/또는 iv) EPS에 부착되고 재조합 단백질에 실질적으로 부착되지 않는 응집제 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것인 방법.
구현예 110. 구현예 56 내지 109 중 어느 한 구현예의 방법에 의해 수득된 소비가능한 조성물.
구현예 111. 소비가능한 조성물을 제조하는 방법으로서,
재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 수득하는 단계로서, 재조합 세포 부산물은 엑소폴리사카라이드(EPS) 및 이취 성분을 포함하는 것인 단계;
복수의 재조합 세포 부산물로부터 재조합 단백질을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계로서, 가공 단계는 복수의 재조합 세포 부산물의 하나 이상의 성분에 가역적으로 부착되고 재조합 단백질에 실질적으로 부착되지 않는 응집제를 포함하는 것인 단계;
분리된 재조합 단백질을 수집하여 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물을 수득하는 단계; 및
단백질 생성물을 포함하는 소비가능한 조성물을 제제화하는 단계
를 포함하는, 소비가능한 조성물을 제조하는 방법.
구현예 112. 구현예 111에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 세포 배양 배지인 방법.
구현예 113. 구현예 111 또는 구현예 112에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 분비한 재조합 세포를 포함하는 세포 배양 배지인 방법.
구현예 114. 구현예 111 내지 113 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 단백질의 등전점(pI)보다 큰 pH를 갖는 것인 방법.
구현예 115. 구현예 114에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물의 pH는 재조합 단백질의 pI보다 큰 pH를 달성하도록 변형되지 않는 것인 방법.
구현예 116. 구현예 111 내지 115 중 어느 한 구현예에 있어서, 응집제는 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 분비하는 재조합 세포를 포함하는 배양 배지에 첨가되는 것인 방법.
구현예 117. 구현예 111 내지 116 중 어느 한 구현예에 있어서, 응집제가 복수의 재조합 세포 부산물의 하나 이상의 성분에 부착되는 경우, 응집제는 재조합 단백질로부터 분리되는 것인 방법.
구현예 118. 구현예 117에 있어서, 응집제는, 복수의 재조합 세포 부산물의 하나 이상의 성분에 부착되는 경우, 스트레이너, 여과 장치로, 및/또는 원심분리에 의해 재조합 단백질로부터 단리되는 것인 방법.
구현예 119. 구현예 118에 있어서, 배양 배지에 응집제를 다시 보충하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
구현예 120. 구현예 111 내지 119 중 어느 한 구현예에 있어서, 응집제는 재조합 세포를 포함하는 소모된 바이오매스의 제거와 동시에 바이오매스 분리 공급 탱크 및 복수의 재조합 세포 부산물의 하나 이상의 성분에 제공되는 것인 방법.
구현예 121. 구현예 111 내지 119 중 어느 한 구현예에 있어서, 응집제는 재조합 세포를 포함하는 소모된 바이오매스의 제거 후에 제공되는 것인 방법.
구현예 122. 구현예 121에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 분비한 재조합 세포가 결여되어 있는 것인 방법.
구현예 123. 구현예 111 내지 122 중 어느 한 구현예에 있어서, 응집제는 음이온성 응집제 또는 중성 응집제인 방법.
구현예 124. 구현예 111 내지 123 중 어느 한 구현예에 있어서, 응집제는 트람플록 108(Tramfloc 108), 트람플록 109, 트람플록 110, 트람플록 111 또는 트람플록 120, 마그나플록 333(Magnafloc 333), 마그나플록 355, 또는 구스머 디버간(Gusmer Divergan), 듀폰 폴리옥스(Dupont Polyox), 셀라이트 545(Celite 545), 벤토나이트 BE125(Bentonite BE125), 디아이온 HPA25L(DIAION HPA25L), 탈아세틸화된 키토산 85%, EZ DE, 초순수 규조토, 또는 렐리조브 SP400(Relizorb SP400)인 방법.
구현예 125. 구현예 111 내지 124 중 어느 한 구현예에 있어서, 응집제는 컬럼 내에 제공되는 것인 방법.
구현예 126. 구현예 111 내지 125 중 어느 한 구현예에 있어서, 복수의 재조합 세포 부산물로부터 재조합 단백질을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는단계는 크로마토그래피 시스템을 추가로 포함하는 것인 방법.
구현예 127. 구현예 126에 있어서, 크로마토그래피 시스템은 축상 유동 컬럼 또는 방사상 유동 컬럼 또는 원심분리 컬럼에 의하거나 또는 막 크로마토그래피 컬럼의 사용에 의한 배치 모드로 작동하거나, 또는 크로마토그래피 시스템은 복수의 컬럼을 병렬로 포함하는 연속 모드로 작동하며, 여기서 컬럼으로의 공급은 크로마토그래피 공정에서의 다양한 단계(예컨대, 평형화, 로딩, 용출, 및 세정)가 동시에 발생하도록 전환가능한 것인 방법.
구현예 128. 구현예 127에 있어서, 연속 모드는 모사 이동층(SMB) 또는 이온 분리기(예컨대, ISEP®) 시스템을 포함하는 것인 방법.
구현예 129. 구현예 121 내지 128 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 세포를 포함하는 소모된 바이오매스를 제거하기 위해 사전에 처리되고/되거나 작은 비단백질 분자를 제거하기 위해 사전에 처리된 것인 방법.
구현예 130. 구현예 129에 있어서, 작은 비단백질 분자를 제거하기 위한 처리는 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 농축하는 단계를 포함하는 것인 방법.
구현예 131. 구현예 129 또는 구현예 130에 있어서, 작은 비단백질 분자를 제거하기 위한 처리는 정용여과 완충액을 포함하는 것인 방법.
구현예 132. 구현예 111 내지 131 중 어느 한 구현예에 있어서, 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물을 생산하기 위해 그 분리된 재조합 단백질의 농축 단계 및/또는 정용여과 처리를 추가로 포함하는 방법.
구현예 133. 구현예 132에 있어서, 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물은 추가로 열 처리 및/또는 건조되는 것인 방법.
구현예 134. 구현예 111 내지 131 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물 및/또는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물은 추가로 열 처리 및/또는 건조되는 것인 방법.
구현예 135. 구현예 133 또는 구현예 134에 있어서, 열 처리는 재조합 단백질 및 이취 성분을 분리하고, 여기서 열은 이취 성분이 휘발되어 기체상 이취 성분이 제거될 수 있는 온도 및 지속시간으로 적용되는 것인 방법.
구현예 136. 구현예 135에 있어서, 열의 적용과 동시에 진공이 적용되고, 진공은 기체상 이취 성분의 제거를 촉진하는 것인 방법.
구현예 137. 구현예 111 내지 136 중 어느 한 구현예에 있어서, 이취 성분은 산, 알코올, 알데하이드, 방향족, 에스테르, 또는 케톤인 방법.
구현예 138. 구현예 111 내지 137 중 어느 한 구현예에 있어서, 이취 성분은 (E)-2-노넨알; 1-도데센; 1-헥산올, 2-에틸-; 1-헥센-3-온; 1-옥텐-3-온; 2,3-부탄디온; 2-부탄온; 2-메틸부탄알; 2-메틸프로판알; 2-프로판온; 2-운데칸온; 3-메틸부탄알; 아세트알데하이드; 벤젠 에탄올; 벤질 알코올; 부탄알, 3-메틸-; 클로로톨루엔; 노난산; p-크레졸; 또는 프로판산, 2-메틸-, 3-하이드록시-2,4,4-트리메틸펜틸 에스테르인 방법.
구현예 139. 구현예 133 내지 138 중 어느 한 구현예에 있어서, 열 처리 동안 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물, 및/또는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물의 온도는 최대 80℃, 예컨대 약 50℃ 내지 약 60℃인 방법.
구현예 140. 구현예 133 내지 139 중 어느 한 구현예에 있어서, 방법은 열 처리 동안 교반을 포함하는 것인 방법.
구현예 141. 구현예 133 내지 140 중 어느 한 구현예에 있어서, 열 처리 및/또는 건조 단계는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 건조 단백질 생성물을 생산하는 것인 방법.
구현예 142. 구현예 111 내지 141 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물 및/또는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물은 산화 단계를 추가로 수행하는 것인 방법.
143. 구현예 142에 있어서, 산화 단계는 과산화수소의 첨가를 포함하는 것인 방법.
구현예 144. 구현예 111 내지 143 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물 내의 재조합 세포 부산물 대 재조합 단백질의 비율은 약 1:3 내지 약 3:1인 방법.
구현예 145. 구현예 144에 있어서, 단백질 생성물은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물에 비해 EPS의 양 및/또는 이취 성분의 양에서 적어도 25% 감소, 적어도 30% 감소, 적어도 35% 감소, 적어도 40% 감소, 적어도 45% 감소, 적어도 50% 감소, 적어도 55% 감소, 적어도 60% 감소, 적어도 65% 감소, 적어도 70% 감소, 적어도 75% 감소, 적어도 75% 감소, 적어도 80% 감소, 적어도 90% 감소, 또는 적어도 95% 감소를 갖는 것인 방법.
구현예 146. 구현예 145에 있어서, 단백질 생성물의 중량의 약 10% 미만이 재조합 세포 부산물을 포함하는 것인 방법.
구현예 147. 구현예 111 내지 146 중 어느 한 구현예에 있어서, 단백질 생성물의 중량의 약 5% 미만이 재조합 세포 부산물을 포함하는 것인 방법.
구현예 148. 구현예 111 내지 147 중 어느 한 구현예에 있어서, 단백질 생성물의 중량의 약 5% 미만, 약 1% 미만, 약 0.1% 미만, 또는 약 0.01% 미만이 이취 성분을 포함하는 것인 방법.
구현예 149. 구현예 111 내지 148 중 어느 한 구현예에 있어서, 단백질 생성물 내의 이취 성분은 표준 소비자에게 사실상 감지될 수 없는 것인 방법.
구현예 150. 구현예 111 내지 149 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 일반적으로 크기 배제 크로마토그래피를 사용할 때 재조합 단백질로부터 분리될 수 없는 것인 방법.
구현예 151. 구현예 111 내지 150 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 자연적으로 재조합 세포의 세포벽의 성분인 방법.
구현예 152. 구현예 111 내지 151 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 의해 특징지어지는 바와 같이 약 13 kDa 내지 약 27 kDa의 겉보기 크기를 갖는 것인 방법.
구현예 153. 구현예 111 내지 152 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 만노스를 포함하는 것인 방법.
구현예 154. 구현예 111 내지 153 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 N-아세틸글루코사민 및/또는 글루코스를 추가로 포함하는 것인 방법.
구현예 155. 구현예 111 내지 154 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 질량 분석법과 함께 가스 크로마토그래피에 의해 분석될 때 약 91 몰% 만노스, 약 5 몰% N-아세틸글루코사민, 및 약 3 몰% 글루코스를 포함하는 것인 방법.
구현예 156. 구현예 111 내지 155 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 α(1,2)-연결된 분지 및/또는 α(1,3)-연결된 분지를 갖는 α(1,6)-연결된 백본을 포함하는 것인 방법.
구현예 157. 구현예 111 내지 156 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 만난인 방법.
구현예 158. 구현예 111 내지 157 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 발현하는 재조합 세포는 진균 세포, 예컨대 사상균 또는 효모, 박테리아 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 또는 포유류 세포로부터 선택되는 것인 방법.
구현예 159. 구현예 111 내지 158 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 세포 유형은 아르술라 종, 아르술라 아데니니보란스, 클루이베로마이세스 종, 클루이베로마이세스 락티스, 코마가타엘라 파피이, 피치아 종, 피치아 안구스타, 피치아 파스토리스, 사카로마이세스 종, 사카로마이세스 세레비지애, 쉬조사카로마이세스 종, 쉬조사카로마이세스 폼베, 야로위아 종, 야로위아 리폴리티카, 아가리쿠스 종, 아가리쿠스 비스포루스, 아스퍼질러스 종, 아스퍼질러스 아와모리, 아스퍼질러스 푸미가투스, 아스퍼질러스 니둘란스, 아스퍼질러스 니거, 아스퍼질러스 오리자에, 바실러스 서브틸리스, 콜레토트리쿰 종, 콜레토트리쿰 글로에오스포리오데스, 엔도시아 종, 엔도시아 파라시티카, 에세리키아 콜리, 푸사리움 종, 푸사리움 그라미네아룸, 푸사리움 솔라니, 무코르 종, 무코르 미에헤이, 무코르 푸실루스, 마이셀리오프토라 종, 마이셀리오프토라 써모필라, 뉴로스포라 종, 뉴로스포라 크라사, 페니실리움 종, 페니실리움 카멤버티, 페니실리움 카네센스, 페니실리움 크리소제눔, 페니실리움(탈라로마이세스) 에머소니, 페니실리움 푸니쿨로 섬, 페니실리움 퍼푸로제눔, 페니실리움 로퀘포티, 플레우로투스 종, 플레우로투스 오스트레아투스, 슈도모나스 종, 리조무코르 종, 리조무코르 미에헤이, 리조무코르 푸실루스, 리조푸스 종, 리조푸스 아르히주스, 리조푸스 올리고스포루스, 리조푸스 오리자에, 트리코더마 종, 트리코더마 알트로비리데, 트리코더마 레에세이, 및 트리코더마 비레우스로부터 선택되는 것인 방법.
구현예 160. 구현예 158 또는 구현예 159에 있어서, 진균은 피치아 종인 방법.
구현예 161. 구현예 160에 있어서, 피치아 종은 코마가타엘라 파피이 또는 코마가타엘라 파스토리스인 방법.
구현예 162. 구현예 111 내지 161 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 단백질은 효소, 영양 단백질, 식품 성분, 또는 식품 첨가물인 방법.
구현예 163. 구현예 162에 있어서, 효소는 펩시노겐 또는 펩신인 방법.
구현예 164. 구현예 163에 있어서, 단백질은 난백 단백질인 방법.
구현예 165. 구현예 164에 있어서, 난백 단백질은 난백알부민(OVA), 오보뮤코이드(OVD), 오보트랜스페린(OVT), 라이소자임(OVL), 오보뮤신, 오보글로불린 G2, 오보글로불린 G3, 오보억제제, 오보당단백질, 플라보단백질, 오보마크로글로불린, 오보스타틴, 시스타틴, 아비딘, 난백알부민 관련 단백질 X, 또는 난백알부민 관련 단백질 Y, 및 이들의 임의의 조합인 방법.
구현예 166. 구현예 164 또는 구현예 165에 있어서, 난백 단백질은 새, 예컨대 닭, 메추라기, 칠면조, 칠면조 독수리, 벌새, 오리, 타조, 거위, 갈매기, 뿔닭, 꿩, 또는 에뮤에서 자연적으로 생산된 난백 단백질과 적어도 80% 동일한(예컨대, 약 85%, 90%, 또는 95% 동일한) 서열을 갖는 것인 방법.
구현예 167. 구현예 111 내지 166 중 어느 한 구현예에 있어서, 단백질 생성물을 포함하는 소비가능한 조성물은 식품, 음료 제품, 또는 식이 보충제를 포함하는 것인 방법.
구현예 168. 구현예 167에 있어서, 식품은 제과제빵(예컨대, 케이크, 머핀, 쿠키, 빵, 베이글, 페이스트리, 도넛), 스크램블, 오믈렛, 키슈, 파스타, 국수, 크레페, 와플, 도우, 배터, 쿠키 도우, 미트로프, 미트볼, 햄버거, 동물 사료, 과일, 야채, 두부, 비지, 치즈, 해산물, 고기, 아이스크림, 마요네즈, 커스터드, 푸딩, 수플레, 유제, 폼, 머랭, 프로스팅, 과자, 마시멜로, 마지팬, 수프, 조미료, 소스, 향신료, 유제품, 및 드레싱을 포함하는 것인 방법.
구현예 169. 구현예 167에 있어서, 음료 제품은 청량 음료, 플레이버 워터, 주스, 스포츠 음료, 에너지 음료, 스무디, 쉐이크, 알코올 음료(예컨대, 와인, 사케, 맥주, 증류주), 칵테일, 리큐어, 탄산 음료, 카페인 음료, 커피, 코코아, 차, 에그노그, 및 유제 음료를 포함하는 것인 방법.
구현예 170. 구현예 167에 있어서, 식이 보충제는 종합 비타민, 훌 푸드 보충제, 다이어트 보충제, 허브 보충제, 단백질 블렌드, 매스 게이너, 즉석 음료 단백질, 단백질 바, 단백질 쉐이크, 단백질 분말, 단백질 샷, 단백질 분리물, 에너지 바, 에너지 겔, 에너지 츄, 에너지 포뮬러, 지구력 포뮬러, 에너지 보충제, 영양 보충제, 스포츠 영양 보충제, 유아용 조제분유(예컨대, 분말 또는 액체), 및 식사 대용품을 포함하는 것인 방법.
구현예 171. 구현예 111 내지 170 중 어느 한 구현예에 있어서, 복수의 재조합 세포 부산물로부터 재조합 단백질을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계는 i) 재조합 단백질에 가역적으로 부착되고 EPS에 실질적으로 부착되지 않는 양이온 수지, ii) 재조합 단백질에 가역적으로 부착되고 EPS에 실질적으로 부착되지 않는 음이온 수지, iii) 재조합 단백질 또는 EPS를 소화시키는 효소, 및/또는 iv) EPS에 가역적으로 부착되고 재조합 단백질에 실질적으로 부착되지 않는 흡착제 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것인 방법.
구현예 172. 구현예 111 내지 171 중 어느 한 구현예의 방법에 의해 수득된 소비가능한 조성물.
구현예 173. 소비가능한 조성물을 제조하는 방법으로서,
재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 수득하는 단계로서, 재조합 세포 부산물은 엑소폴리사카라이드(EPS) 및 이취 성분을 포함하는 것인 단계;
복수의 재조합 세포 부산물로부터 재조합 단백질을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계로서, 가공 단계는 복수의 재조합 세포 부산물의 하나 이상의 성분에 가역적으로 부착되고 재조합 단백질에 실질적으로 부착되지 않는 흡착제를 포함하는 것인 단계;
분리된 재조합 단백질을 수집하여 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물을 수득하는 단계; 및
단백질 생성물을 포함하는 소비가능한 조성물을 제제화하는 단계
를 포함하는, 소비가능한 조성물을 제조하는 방법.
구현예 174. 구현예 173에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 세포 배양 배지인 방법.
구현예 175. 구현예 173 또는 구현예 174에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 분비한 재조합 세포를 포함하는 세포 배양 배지인 방법.
구현예 176. 구현예 173 내지 175 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 단백질의 등전점(pI)보다 큰 pH를 갖는 것인 방법.
구현예 177. 구현예 176에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물의 pH는 재조합 단백질의 pI보다 큰 pH를 달성하도록 변형되지 않는 것인 방법.
구현예 178. 구현예 173 내지 177 중 어느 한 구현예에 있어서, 흡착제는 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 분비하는 재조합 세포를 포함하는 배양 배지에 첨가되는 것인 방법.
구현예 179. 구현예 173 내지 178 중 어느 한 구현예에 있어서, 흡착제가 복수의 재조합 세포 부산물의 하나 이상의 성분에 부착되는 경우, 흡착제는 재조합 단백질로부터 분리되는 것인 방법.
구현예 180. 구현예 179에 있어서, 흡착제는, 복수의 재조합 세포 부산물의 하나 이상의 성분에 부착되는 경우, 스트레이너, 여과 장치로, 및/또는 원심분리에 의해 재조합 단백질로부터 단리되는 것인 방법.
구현예 181. 구현예 180에 있어서, 배양 배지에 흡착제를 다시 보충하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
구현예 182. 구현예 173 내지 181 중 어느 한 구현예에 있어서, 흡착제는 재조합 세포를 포함하는 소모된 바이오매스의 제거와 동시에 바이오매스 분리 공급 탱크 및 복수의 재조합 세포 부산물의 하나 이상의 성분에 제공되는 것인 방법.
구현예 183. 구현예 173 내지 181 중 어느 한 구현예에 있어서, 흡착제는 재조합 세포를 포함하는 소모된 바이오매스의 제거 후에 제공되는 것인 방법.
구현예 184. 구현예 183에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 분비한 재조합 세포가 결여되어 있는 것인 방법.
구현예 185. 구현예 173 내지 184 중 어느 한 구현예에 있어서, 흡착제는 수지 및/또는 소수성 흡착제, 예컨대 메타크릴레이트 또는 실리카 백본을 포함하는 소수성 흡착제를 포함하거나 DEAE 유형 약한 음이온 교환기인 방법.
구현예 186. 구현예 173 내지 185 중 어느 한 구현예에 있어서, 흡착제는 다우 앰버라이트 SD2(Dow Amberlite SD2), 미츠비시 디아이온 HP20(Mitsubishi Diaion HP20), 셀라이트 545(Celite 545), 벤토나이트 BE125(Bentonite BE125), 디아이온 HPA25L(DIAION HPA25L), 탈아세틸화된 키토산 85%, EZ DE, 초순수 규조토, 또는 렐리조브 SP400(Relizorb SP400)인 방법.
구현예 187. 구현예 173 내지 186 중 어느 한 구현예에 있어서, 흡착제는, 예컨대 컬럼 내에 제공되고, 축상 유동 컬럼 또는 방사상 유동 컬럼 또는 원심분리 컬럼에 의하거나 또는 막 크로마토그래피 컬럼의 사용에 의한 배치 모드로 작동되는 것인 방법.
구현예 188. 구현예 173 내지 187 중 어느 한 구현예에 있어서, 복수의 재조합 세포 부산물로부터 재조합 단백질을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계는 크로마토그래피 시스템을 추가로 포함하는 것인 방법.
구현예 189. 구현예 188에 있어서, 크로마토그래피 시스템은 축상 유동 컬럼 또는 방사상 유동 컬럼 또는 원심분리 컬럼에 의하거나 또는 막 크로마토그래피 컬럼의 사용에 의한 배치 모드로 작동하거나, 또는 크로마토그래피 시스템은 복수의 컬럼을 병렬로 포함하는 연속 모드로 작동하며, 여기서 컬럼으로의 공급은 크로마토그래피 공정에서의 다양한 단계(예컨대, 평형화, 로딩, 용출, 및 세정)가 동시에 발생하도록 전환가능한 것인 방법.
구현예 190. 구현예 189에 있어서, 연속 모드는 모사 이동층(SMB) 또는 이온 분리기(예컨대, ISEP®) 시스템을 포함하는 것인 방법.
구현예 191. 구현예 183 내지 190 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 세포를 포함하는 소모된 바이오매스를 제거하기 위해 사전에 처리되고/되거나 작은 비단백질 분자를 제거하기 위해 사전에 처리된 것인 방법.
구현예 192. 구현예 191에 있어서, 작은 비단백질 분자를 제거하기 위한 처리는 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 농축하는 단계를 포함하는 것인 방법.
구현예 193. 구현예 191 또는 구현예 192에 있어서, 작은 비단백질 분자를 제거하기 위한 처리는 정용여과 완충액을 포함하는 것인 방법.
구현예 194. 구현예 173 내지 193 중 어느 한 구현예에 있어서, 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물을 생산하기 위해 그 분리된 재조합 단백질의 농축 단계 및/또는 정용여과 처리를 추가로 포함하는 방법.
구현예 195. 구현예 194에 있어서, 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물은 추가로 열 처리 및/또는 건조되는 것인 방법.
구현예 196. 구현예 173 내지 193 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물 및/또는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물은 추가로 열 처리 및/또는 건조되는 것인 방법.
구현예 197. 구현예 195 또는 구현예 196에 있어서, 열 처리는 재조합 단백질 및 이취 성분을 분리하고, 여기서 열은 이취 성분이 휘발되어 기체상 이취 성분이 제거될 수 있는 온도 및 지속시간으로 적용되는 것인 방법.
구현예 198. 구현예 197에 있어서, 열의 적용과 동시에 진공이 적용되고, 진공은 기체상 이취 성분의 제거를 촉진하는 것인 방법.
구현예 199. 구현예 173 내지 198 중 어느 한 구현예에 있어서, 이취 성분은 산, 알코올, 알데하이드, 방향족, 에스테르, 또는 케톤인 방법.
구현예 200. 구현예 173 내지 199 중 어느 한 구현예에 있어서, 이취 성분은 (E)-2-노넨알; 1-도데센; 1-헥산올, 2-에틸-; 1-헥센-3-온; 1-옥텐-3-온; 2,3-부탄디온; 2-부탄온; 2-메틸부탄알; 2-메틸프로판알; 2-프로판온; 2-운데칸온; 3-메틸부탄알; 아세트알데하이드; 벤젠 에탄올; 벤질 알코올; 부탄알, 3-메틸-; 클로로톨루엔; 노난산; p-크레졸; 또는 프로판산, 2-메틸-, 3-하이드록시-2,4,4-트리메틸펜틸 에스테르인 방법.
구현예 201. 구현예 195 내지 200 중 어느 한 구현예에 있어서, 열 처리 동안 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물, 및/또는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물의 온도는 최대 80℃, 예컨대 약 50℃ 내지 약 60℃인 방법.
구현예 202. 구현예 195 내지 201 중 어느 한 구현예에 있어서, 방법은 열 처리 동안 교반을 포함하는 것인 방법.
구현예 203. 구현예 195 내지 202 중 어느 한 구현예에 있어서, 열 처리 및/또는 건조 단계는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 건조 단백질 생성물을 생산하는 것인 방법.
구현예 204. 구현예 173 내지 203 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물 및/또는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물은 산화 단계를 추가로 수행하는 것인 방법.
구현예 205. 구현예 204에 있어서, 산화 단계는 과산화수소의 첨가를 포함하는 것인 방법.
구현예 206. 구현예 173 내지 205 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물 내의 재조합 세포 부산물 대 재조합 단백질의 비율은 약 1:3 내지 약 3:1인 방법.
구현예 207. 구현예 206에 있어서, 단백질 생성물은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물에 비해 EPS의 양 및/또는 이취 성분의 양에서 적어도 25% 감소, 적어도 30% 감소, 적어도 35% 감소, 적어도 40% 감소, 적어도 45% 감소, 적어도 50% 감소, 적어도 55% 감소, 적어도 60% 감소, 적어도 65% 감소, 적어도 70% 감소, 적어도 75% 감소, 적어도 75% 감소, 적어도 80% 감소, 적어도 90% 감소, 또는 적어도 95% 감소를 갖는 것인 방법.
구현예 208. 구현예 207에 있어서, 단백질 생성물의 중량의 약 10% 미만이 재조합 세포 부산물을 포함하는 것인 방법.
구현예 209. 구현예 173 내지 208 중 어느 한 구현예에 있어서, 단백질 생성물의 중량의 약 5% 미만이 재조합 세포 부산물을 포함하는 것인 방법.
구현예 210. 구현예 173 내지 209 중 어느 한 구현예에 있어서, 단백질 생성물의 중량의 약 5% 미만, 약 1% 미만, 약 0.1% 미만, 또는 약 0.01% 미만이 이취 성분을 포함하는 것인 방법.
구현예 211. 구현예 173 내지 210 중 어느 한 구현예에 있어서, 단백질 생성물 내의 이취 성분은 표준 소비자에게 사실상 감지될 수 없는 것인 방법.
구현예 212. 구현예 173 내지 211 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 일반적으로 크기 배제 크로마토그래피를 사용할 때 재조합 단백질로부터 분리될 수 없는 것인 방법.
구현예 213. 구현예 173 내지 212 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 자연적으로 재조합 세포의 세포벽의 성분인 방법.
구현예 214. 구현예 173 내지 213 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 의해 특징지어지는 바와 같이 약 13 kDa 내지 약 27 kDa의 겉보기 크기를 갖는 것인 방법.
구현예 215. 구현예 173 내지 214 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 만노스를 포함하는 것인 방법.
구현예 216. 구현예 173 내지 215 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 N-아세틸글루코사민 및/또는 글루코스를 추가로 포함하는 것인 방법.
구현예 217. 구현예 173 내지 216 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 질량 분석법과 함께 가스 크로마토그래피에 의해 분석될 때 약 91 몰% 만노스, 약 5 몰% N-아세틸글루코사민, 및 약 3 몰% 글루코스를 포함하는 것인 방법.
구현예 218. 구현예 173 내지 217 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 α(1,2)-연결된 분지 및/또는 α(1,3)-연결된 분지를 갖는 α(1,6)-연결된 백본을 포함하는 것인 방법.
구현예 219. 구현예 173 내지 218 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 만난인 방법.
구현예 220. 구현예 173 내지 219 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 발현하는 재조합 세포는 진균 세포, 예컨대 사상 진균 또는 효모, 박테리아 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 또는 포유동물 세포로부터 선택되는 것인 방법.
구현예 221. 구현예 173 내지 220 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 세포 유형은 아르술라 종, 아르술라 아데니니보란스, 클루이베로마이세스 종, 클루이베로마이세스 락티스, 코마가타엘라 파피이, 피치아 종, 피치아 안구스타, 피치아 파스토리스, 사카로마이세스 종, 사카로마이세스 세레비지애, 쉬조사카로마이세스 종, 쉬조사카로마이세스 폼베, 야로위아 종, 야로위아 리폴리티카, 아가리쿠스 종, 아가리쿠스 비스포루스, 아스퍼질러스 종, 아스퍼질러스 아와모리, 아스퍼질러스 푸미가투스, 아스퍼질러스 니둘란스, 아스퍼질러스 니거, 아스퍼질러스 오리자에, 바실러스 서브틸리스, 콜레토트리쿰 종, 콜레토트리쿰 글로에오스포리오데스, 엔도시아 종, 엔도시아 파라시티카, 에세리키아 콜리, 푸사리움 종, 푸사리움 그라미네아룸, 푸사리움 솔라니, 무코르 종, 무코르 미에헤이, 무코르 푸실루스, 마이셀리오프토라 종, 마이셀리오프토라 써모필라, 뉴로스포라 종, 뉴로스포라 크라사, 페니실리움 종, 페니실리움 카멤버티, 페니실리움 카네센스, 페니실리움 크리소제눔, 페니실리움(탈라로마이세스) 에머소니, 페니실리움 푸니쿨로 섬, 페니실리움 퍼푸로제눔, 페니실리움 로퀘포티, 플레우로투스 종, 플레우로투스 오스트레아투스, 슈도모나스 종, 리조무코르 종, 리조무코르 미에헤이, 리조무코르 푸실루스, 리조푸스 종, 리조푸스 아르히주스, 리조푸스 올리고스포루스, 리조푸스 오리자에, 트리코더마 종, 트리코더마 알트로비리데, 트리코더마 레에세이, 및 트리코더마 비레우스로부터 선택되는 것인 방법.
구현예 222. 구현예 220 또는 구현예 221에 있어서, 진균은 피치아 종인 방법.
구현예 223. 구현예 222에 있어서, 피치아 종은 코마가타엘라 파피이 또는 코마가타엘라 파스토리스인 방법.
구현예 224. 구현예 173 내지 223 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 단백질은 효소, 영양 단백질, 식품 성분, 또는 식품 첨가물인 방법.
구현예 225. 구현예 224에 있어서, 효소는 펩시노겐 또는 펩신인 방법.
구현예 226. 구현예 225에 있어서, 단백질은 난백 단백질인 방법.
구현예 227. 구현예 226에 있어서, 난백 단백질은 난백알부민(OVA), 오보뮤코이드(OVD), 오보트랜스페린(OVT), 라이소자임(OVL), 오보뮤신, 오보글로불린 G2, 오보글로불린 G3, 오보억제제, 오보당단백질, 플라보단백질, 오보마크로글로불린, 오보스타틴, 시스타틴, 아비딘, 난백알부민 관련 단백질 X, 또는 난백알부민 관련 단백질 Y, 및 이들의 임의의 조합인 방법.
구현예 228. 구현예 226 또는 구현예 227에 있어서, 난백 단백질은 새, 예컨대 닭, 메추라기, 칠면조, 칠면조 독수리, 벌새, 오리, 타조, 거위, 갈매기, 뿔닭, 꿩, 또는 에뮤에서 자연적으로 생산된 난백 단백질과 적어도 80% 동일한(예컨대, 약 85%, 90%, 또는 95% 동일한) 서열을 갖는 것인 방법.
구현예 229. 구현예 173 내지 228 중 어느 한 구현예에 있어서, 단백질 생성물을 포함하는 소비가능한 조성물은 식품, 음료 제품 또는 식이 보충제를 포함하는 것인 방법.
구현예 230. 구현예 229에 있어서, 식품은 제과제빵(예컨대, 케이크, 머핀, 쿠키, 빵, 베이글, 페이스트리, 도넛), 스크램블, 오믈렛, 키슈, 파스타, 국수, 크레페, 와플, 도우, 배터, 쿠키 도우, 미트로프, 미트볼, 햄버거, 동물 사료, 과일, 야채, 두부, 비지, 치즈, 해산물, 고기, 아이스크림, 마요네즈, 커스터드, 푸딩, 수플레, 유제, 폼, 머랭, 프로스팅, 과자, 마시멜로, 마지팬, 수프, 조미료, 소스, 향신료, 유제품, 및 드레싱을 포함하는 것인 방법.
구현예 231. 구현예 229에 있어서, 음료 제품은 청량 음료, 플레이버 워터, 주스, 스포츠 음료, 에너지 음료, 스무디, 쉐이크, 알코올 음료(예컨대, 와인, 사케, 맥주, 증류주), 칵테일, 리큐어, 탄산 음료, 카페인 음료, 커피, 코코아, 차, 에그노그, 및 유제 음료를 포함하는 것인 방법.
구현예 232. 구현예 229에 있어서, 식이 보충제는 종합 비타민, 훌 푸드 보충제, 다이어트 보충제, 허브 보충제, 단백질 블렌드, 매스 게이너, 즉석 음료 단백질, 단백질 바, 단백질 쉐이크, 단백질 분말, 단백질 샷, 단백질 분리물, 에너지 바, 에너지 겔, 에너지 츄, 에너지 포뮬러, 지구력 포뮬러, 에너지 보충제, 영양 보충제, 스포츠 영양 보충제, 유아용 조제분유(예컨대, 분말 또는 액체), 및 식사 대용품을 포함하는 것인 방법.
구현예 233. 구현예 173 내지 232 중 어느 한 구현예에 있어서, 복수의 재조합 세포 부산물로부터 재조합 단백질을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계는 i) 재조합 단백질에 가역적으로 부착되고 EPS에 실질적으로 부착되지 않는 양이온 수지, ii) 재조합 단백질에 가역적으로 부착되고 EPS에 실질적으로 부착되지 않는 음이온 수지, iii) 재조합 단백질 또는 EPS를 소화시키는 효소, 및/또는 iv) EPS에 부착되고 재조합 단백질에 실질적으로 부착되지 않는 응집제 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것인 방법.
구현예 234. 구현예 173 내지 233 중 어느 한 구현예의 방법에 의해 수득된 소비가능한 조성물.
구현예 235. 소비가능한 조성물을 제조하는 방법으로서,
재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 수득하는 단계로서, 재조합 세포 부산물은 엑소폴리사카라이드(EPS) 및 이취 성분을 포함하는 것인 단계;
복수의 재조합 세포 부산물로부터 재조합 단백질을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계로서, 가공 단계는 재조합 단백질을 소화시키거나 EPS를 소화시키는 효소를 포함하는 것인 단계;
분리된 재조합 단백질을 수집하여 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물을 수득하는 단계; 및
단백질 생성물을 포함하는 소비가능한 조성물을 제제화하는 단계
를 포함하는, 소비가능한 조성물을 제조하는 방법.
구현예 236. 구현예 235에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 세포 배양 배지인 방법.
구현예 237. 구현예 235 또는 구현예 236에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 분비한 재조합 세포를 포함하는 세포 배양 배지인 방법.
구현예 238. 구현예 235에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 분비한 재조합 세포가 결여되어 있는 것인 방법.
구현예 239. 구현예 235 내지 238 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 단백질의 등전점(pI)보다 큰 pH를 갖는 것인 방법.
구현예 240. 구현예 239에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물의 pH는 재조합 단백질의 pI보다 큰 pH를 달성하도록 변형되지 않는 것인 방법.
구현예 241. 구현예 239에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물의 pH는 재조합 단백질의 pI보다 큰 pH를 달성하도록 변형되는 것인 방법.
구현예 242. 구현예 240에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물의 pH는 약 6인 방법.
구현예 243. 구현예 235 내지 238 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 단백질의 등전점(pI)보다 낮은 pH를 갖는 것인 방법.
구현예 244. 구현예 243에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물의 pH는 pH를 낮춤으로써 달성되는 것인 방법.
구현예 245. 구현예 235 내지 244 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 단백질을 소화시키는 효소는 펩신 또는 트립신인 방법.
구현예 246. 구현예 245에 있어서, 소화된 재조합 단백질은 10 kDa 막을 갖는 한외여과 시스템을 통해 투과되는 것인 방법.
구현예 247. 구현예 235 내지 244 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS를 소화시키는 효소는 만나제, 셀룰라제, 또는 글루카나제인 방법.
구현예 248. 구현예 247에 있어서, 소화되지 않은 재조합 단백질은 5 kDa 막을 갖는 한외여과 시스템에 의해 농축되는 것인 방법.
구현예 249. 구현예 235 내지 248 중 어느 한 구현예에 있어서, 복수의 재조합 세포 부산물로부터 재조합 단백질을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계는 크로마토그래피 시스템을 추가로 포함하는 것인 방법.
구현예 250. 구현예 249에 있어서, 크로마토그래피 시스템은 축상 유동 컬럼 또는 방사상 유동 컬럼 또는 원심분리 컬럼에 의하거나 또는 막 크로마토그래피 컬럼의 사용에 의한 배치 모드로 작동하는 것인 방법.
구현예 251. 구현예 249에 있어서, 크로마토그래피 시스템은 복수의 컬럼을 병렬로 포함하는 연속 모드로 작동하며, 여기서 컬럼으로의 공급은 크로마토그래피 공정에서의 다양한 단계(예컨대, 평형화, 로딩, 용출, 및 세정)가 동시에 발생하도록 전환가능한 것인 방법.
구현예 252. 구현예 251에 있어서, 연속 모드는 모사 이동층(SMB) 또는 이온 분리기(예컨대, ISEP®) 시스템을 포함하는 것인 방법.
구현예 253. 구현예 245 내지 252 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 세포를 포함하는 소모된 바이오매스를 제거하기 위해 사전에 처리되고/되거나 작은 비단백질 분자를 제거하기 위해 사전에 처리된 것인 방법.
구현예 254. 구현예 253에 있어서, 작은 비단백질 분자를 제거하기 위한 처리는 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 농축하는 단계를 포함하는 것인 방법.
구현예 255. 구현예 253 또는 구현예 254에 있어서, 작은 비단백질 분자를 제거하기 위한 처리는 정용여과 완충액을 포함하는 것인 방법.
구현예 256. 구현예 235 내지 255 중 어느 한 구현예에 있어서, 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물을 생산하기 위해 그 분리된 재조합 단백질의 농축 단계 및/또는 정용여과 처리를 추가로 포함하는 방법.
구현예 257. 구현예 256에 있어서, 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물은 추가로 열 처리 및/또는 건조되는 것인 방법.
구현예 258. 구현예 235 내지 255 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물 및/또는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물은 추가로 열 처리 및/또는 건조되는 것인 방법.
구현예 259. 구현예 257 또는 구현예 258에 있어서, 열 처리는 재조합 단백질 및 이취 성분을 분리하고, 여기서 열은 이취 성분이 휘발되어 기체상 이취 성분이 제거될 수 있는 온도 및 지속시간으로 적용되는 것인 방법.
구현예 260. 구현예 259에 있어서, 열의 적용과 동시에 진공이 적용되고, 진공은 기체상 이취 성분의 제거를 촉진하는 것인 방법.
구현예 261. 구현예 235 내지 260 중 어느 한 구현예에 있어서, 이취 성분은 산, 알코올, 알데하이드, 방향족, 에스테르, 또는 케톤인 방법.
구현예 262. 구현예 235 내지 261 중 어느 한 구현예에 있어서, 이취 성분은 (E)-2-노네날; 1-도데센; 1-헥산올, 2-에틸-; 1-헥센-3-온; 1-옥텐-3-온; 2,3-부탄디온; 2-부탄온; 2-메틸부탄알; 2-메틸프로판알; 2-프로판온; 2-운데칸온; 3-메틸부탄알; 아세트알데하이드; 벤젠 에탄올; 벤질 알코올; 부탄알, 3-메틸-; 클로로톨루엔; 노난산; p-크레졸; 또는 프로판산, 2-메틸-, 3-하이드록시-2,4,4-트리메틸펜틸 에스테르인 방법.
구현예 263. 구현예 257 내지 262 중 어느 한 구현예에 있어서, 열 처리 동안 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물, 및/또는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물의 온도는 최대 80℃, 예컨대 약 50℃ 내지 약 60℃인 방법.
구현예 264. 구현예 257 내지 263 중 어느 한 구현예에 있어서, 방법은 열 처리 동안 교반을 포함하는 것인 방법.
구현예 265. 구현예 257 내지 264 중 어느 한 구현예에 있어서, 열 처리 및/또는 건조 단계는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 건조 단백질 생성물을 생산하는 것인 방법.
구현예 266. 구현예 235 내지 265 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물 및/또는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물은 산화 단계를 추가로 수행하는 것인 방법.
구현예 267. 구현예 266에 있어서, 산화 단계는 과산화수소의 첨가를 포함하는 것인 방법.
구현예 268. 구현예 235 내지 267 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물 내의 재조합 세포 부산물 대 재조합 단백질의 비율은 약 1:3 내지 약 3:1인 방법.
구현예 269. 구현예 268에 있어서, 단백질 생성물은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물에 비해 EPS의 양 및/또는 이취 성분의 양에서 적어도 25% 감소, 적어도 30% 감소, 적어도 35% 감소, 적어도 40% 감소, 적어도 45% 감소, 적어도 50% 감소, 적어도 55% 감소, 적어도 60% 감소, 적어도 65% 감소, 적어도 70% 감소, 적어도 75% 감소, 적어도 75% 감소, 적어도 80% 감소, 적어도 90% 감소, 또는 적어도 95% 감소를 갖는 것인 방법.
구현예 270. 구현예 269에 있어서, 단백질 생성물의 중량의 약 10% 미만이 재조합 세포 부산물을 포함하는 것인 방법.
구현예 271. 구현예 235 내지 270 중 어느 한 구현예에 있어서, 단백질 생성물의 중량의 약 5% 미만이 재조합 세포 부산물을 포함하는 것인 방법.
구현예 272. 구현예 235 내지 271 중 어느 한 구현예에 있어서, 단백질 생성물의 중량의 약 5% 미만, 약 1% 미만, 약 0.1% 미만, 또는 약 0.01% 미만이 이취 성분을 포함하는 것인 방법.
구현예 273. 구현예 235 내지 272 중 어느 한 구현예에 있어서, 단백질 생성물 내의 이취 성분은 표준 소비자에게 사실상 감지될 수 없는 것인 방법.
구현예 274. 구현예 235 내지 273 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 일반적으로 크기 배제 크로마토그래피를 사용할 때 재조합 단백질로부터 분리될 수 없는 것인 방법.
구현예 275. 구현예 235 내지 274 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 자연적으로 재조합 세포의 세포벽의 성분인 방법.
구현예 276. 구현예 235 내지 275 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 의해 특징지어지는 바와 같이 약 13 kDa 내지 약 27 kDa의 겉보기 크기를 갖는 것인 방법.
구현예 277. 구현예 235 내지 276 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 만노스를 포함하는 것인 방법.
구현예 278. 구현예 235 내지 277 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 N-아세틸글루코사민 및/또는 글루코스를 추가로 포함하는 것인 방법.
구현예 279. 구현예 235 내지 278 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 질량 분석법과 함께 가스 크로마토그래피에 의해 분석될 때 약 91 몰% 만노스, 약 5 몰% N-아세틸글루코사민, 및 약 3 몰% 글루코스를 포함하는 것인 방법.
구현예 280. 구현예 235 내지 279 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 α(1,2)-연결된 분지 및/또는 α(1,3)-연결된 분지를 갖는 α(1,6)-연결된 백본을 포함하는 것인 방법.
구현예 281. 구현예 235 내지 280 중 어느 한 구현예에 있어서, EPS는 만난인 방법.
구현예 282. 구현예 235 내지 281 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 발현하는 재조합 세포는 진균 세포, 예컨대 사상 진균 또는 효모, 박테리아 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 또는 포유동물 세포로부터 선택되는 것인 방법.
구현예 283. 구현예 235 내지 282 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 세포 유형은 아르술라 종, 아르술라 아데니니보란스, 클루이베로마이세스 종, 클루이베로마이세스 락티스, 코마가타엘라 파피이, 피치아 종, 피치아 안구스타, 피치아 파스토리스, 사카로마이세스 종, 사카로마이세스 세레비지애, 쉬조사카로마이세스 종, 쉬조사카로마이세스 폼베, 야로위아 종, 야로위아 리폴리티카, 아가리쿠스 종, 아가리쿠스 비스포루스, 아스퍼질러스 종, 아스퍼질러스 아와모리, 아스퍼질러스 푸미가투스, 아스퍼질러스 니둘란스, 아스퍼질러스 니거, 아스퍼질러스 오리자에, 바실러스 서브틸리스, 콜레토트리쿰 종, 콜레토트리쿰 글로에오스포리오데스, 엔도시아 종, 엔도시아 파라시티카, 에세리키아 콜리, 푸사리움 종, 푸사리움 그라미네아룸, 푸사리움 솔라니, 무코르 종, 무코르 미에헤이, 무코르 푸실루스, 마이셀리오프토라 종, 마이셀리오프토라 써모필라, 뉴로스포라 종, 뉴로스포라 크라사, 페니실리움 종, 페니실리움 카멤버티, 페니실리움 카네센스, 페니실리움 크리소제눔, 페니실리움(탈라로마이세스) 에머소니, 페니실리움 푸니쿨로 섬, 페니실리움 퍼푸로제눔, 페니실리움 로퀘포티, 플레우로투스 종, 플레우로투스 오스트레아투스, 슈도모나스 종, 리조무코르 종, 리조무코르 미에헤이, 리조무코르 푸실루스, 리조푸스 종, 리조푸스 아르히주스, 리조푸스 올리고스포루스, 리조푸스 오리자에, 트리코더마 종, 트리코더마 알트로비리데, 트리코더마 레에세이, 및 트리코더마 비레우스로부터 선택되는 것인 방법.
구현예 284. 구현예 282 또는 구현예 283에 있어서, 진균은 피치아 종인 방법.
구현예 285. 구현예 284에 있어서, 피치아 종은 코마가타엘라 파피이 또는 코마가타엘라 파스토리스인 방법.
구현예 286. 구현예 235 내지 285 중 어느 한 구현예에 있어서, 재조합 단백질은 효소, 영양 단백질, 식품 성분, 또는 식품 첨가물인 방법.
구현예 287. 구현예 286에 있어서, 효소는 펩시노겐 또는 펩신인 방법.
구현예 288. 구현예 287에 있어서, 단백질은 난백 단백질인 방법.
구현예 289. 구현예 288에 있어서, 난백 단백질은 난백알부민(OVA), 오보뮤코이드(OVD), 오보트랜스페린(OVT), 라이소자임(OVL), 오보뮤신, 오보글로불린 G2, 오보글로불린 G3, 오보억제제, 오보당단백질, 플라보단백질, 오보마크로글로불린, 오보스타틴, 시스타틴, 아비딘, 난백알부민 관련 단백질 X, 또는 난백알부민 관련 단백질 Y, 및 이들의 임의의 조합인 방법.
구현예 290. 구현예 288 또는 구현예 289에 있어서, 난백 단백질은 새, 예컨대 닭, 메추라기, 칠면조, 칠면조 독수리, 벌새, 오리, 타조, 거위, 갈매기, 뿔닭, 꿩, 또는 에뮤에서 자연적으로 생산된 난백 단백질과 적어도 80% 동일한(예컨대, 약 85%, 90%, 또는 95% 동일한) 서열을 갖는 것인 방법.
구현예 291. 구현예 235 내지 290 중 어느 한 구현예에 있어서, 단백질 생성물을 포함하는 소비가능한 조성물은 식품, 음료 제품, 또는 식이 보충제를 포함하는 것인 방법.
구현예 292. 구현예 291에 있어서, 식품은 제과제빵(예컨대, 케이크, 머핀, 쿠키, 빵, 베이글, 페이스트리, 도넛), 스크램블, 오믈렛, 키슈, 파스타, 국수, 크레페, 와플, 도우, 배터, 쿠키 도우, 미트로프, 미트볼, 햄버거, 동물 사료, 과일, 야채, 두부, 비지, 치즈, 해산물, 고기, 아이스크림, 마요네즈, 커스터드, 푸딩, 수플레, 유제, 폼, 머랭, 프로스팅, 과자, 마시멜로, 마지팬, 수프, 조미료, 소스, 향신료, 유제품, 및 드레싱을 포함하는 것인 방법.
구현예 293. 구현예 291에 있어서, 음료 제품은 청량 음료, 플레이버 워터, 주스, 스포츠 음료, 에너지 음료, 스무디, 쉐이크, 알코올 음료(예컨대, 와인, 사케, 맥주, 증류주), 칵테일, 리큐어, 탄산 음료, 카페인 음료, 커피, 코코아, 차, 에그노그, 및 유제 음료를 포함하는 것인 방법.
구현예 294. 구현예 291에 있어서, 식이 보충제는 종합 비타민, 훌 푸드 보충제, 다이어트 보충제, 허브 보충제, 단백질 블렌드, 매스 게이너, 즉석 음료 단백질, 단백질 바, 단백질 쉐이크, 단백질 분말, 단백질 샷, 단백질 분리물, 에너지 바, 에너지 겔, 에너지 츄, 에너지 포뮬러, 지구력 포뮬러, 에너지 보충제, 영양 보충제, 스포츠 영양 보충제, 유아용 조제분유(예컨대, 분말 또는 액체), 및 식사 대용품을 포함하는 것인 방법.
구현예 295. 구현예 235 내지 294 중 어느 한 구현예에 있어서, 복수의 재조합 세포 부산물로부터 재조합 단백질을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계는 i) 재조합 단백질에 가역적으로 부착되고 EPS에 실질적으로 부착되지 않는 양이온 수지, ii) 재조합 단백질에 가역적으로 부착되고 EPS에 실질적으로 부착되지 않는 음이온 수지, iii) EPS에 부착되고 재조합 단백질에 실질적으로 부착되지 않는 응집제, 및/또는 iv) EPS에 부착되고 재조합 단백질에 실질적으로 부착되지 않는 흡착제 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것인 방법.
구현예 296. 구현예 235 내지 295 중 어느 한 구현예의 방법에 의해 수득된 소비가능한 조성물.
추가적으로, 본원에 기술된 상기 구현예는 상기 개시된 바와 같은 임의의 다른 구현예와 조합될 수 있다.
실시예
실시예 1: 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물을 제조하기 위한 수지의 용도
본 개시내용의 방법(예컨대, 도 1에 나타낸 바와 같음)을 사용하여 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물을 제조하였다. 본 실시예에서, 재조합 난백 단백질을 사용하였다.
표 1(하기)은 재조합 세포 부산물의 양을 감소시키기 위한 수지 기반(예컨대, 크로마토그래피) 정제 공정의 사용 전 및 후의 재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 포함하는 전형적인 조성물을 보여준다.
표 1:. 정제 단계 전 및 후의 농축된 단백질의 물리화학적 특성의 비교.
정제된 단백질을 추가로 사용하여 상업용 난백과 유사한 독특한 겔화 특성을 입증하여 달걀 기반 레시피에서 달걀을 대체하는 제제를 가능하게 하였다.
하기 표 2는 추가로 다양한 기능적 특성에 대한 농축된 조성물(재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 포함함) 및 정제된 단백질 생성물(재조합 세포 부산물의 양이 감소됨)의 비교를 보여주며 하기 표에 나타나 있는 바와 같다.
표 2: 정제 단계 전 및 후의 농축된 단백질의 기능적 특성의 비교.
특히, 재조합 세포 부산물(예컨대, EPS)를 제거하는 것은 예시적인 소비가능한 조성물/관련 식품의 겔 경도 및 씹힘성을 감소시켰다.
하기 표 3은 추가로 다양한 기능적 특성에 대한 농축된 조성물(재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 포함함) 및 상업적으로 이용가능한 달걀 대체물의 기능적 특성의 비교를 보여준다.
표 3: 농축된 조성물(재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 포함함)과 상업용 난백 단백질의 기능적 특성의 비교
놀랍게도, 농축된 조성물(재조합 단백질 및 재조합 세포 부산물을 포함함)의 겔화 특징이 난백 분말과 동등함이 발견되었고, 이는 불순물이 겔화에 상당히 기여한다는 것을 나타낸다. 또한, 표 2에는 폼 발생 특성 및 폼 유지 특성이 나타나 있다. 따라서, 높은 폼 적용을 위해, 소비가능한 조성물 내의 재조합 세포 부산물의 양을 구체적으로 조절하는 것이 바람직할 수 있다.
정제된 재조합 난백알부민 단백질 생성물을 다양한 양의 재조합 세포 부산물(예컨대, EPS 또는 이취 성분)과 조합하여 제품 특성의 변화를 결정하였다.
설포프로필, 설포메틸, 설포네이트를 갖는 수지가 이 방법에 사용될 수 있다. 백본은 전형적으로 50-200 um 사이의 전형적인 입자 크기를 갖는 메타크릴레이트 또는 셀룰로스와 같은 비단백질 결합 물질이다. 리간드 밀도는 50-100 g 단백질/L 수지의 단백질 결합 용량을 수용할 것이다.
실시예 2: 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물을 제조하기 위한 수지의 또 다른 용도
본 개시내용의 또 다른 방법(예컨대, 도 1 또는 도 7에 나타낸 바와 같음)을 사용하여 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물을 제조하였다. 본 실시예에서, 재조합 난백 단백질을 사용하였다.
역사적인 필립스 페트롤레움(Phillips Petroleum) 균주 NRRL Y-11430으로부터 유래된 피치아 파스토리스 균주를 예시적인 단백질, 여기서는 오보뮤코이드, 및 강력한 메탄올 유도성 프로모터를 발현하는 형질전환을 이용하여 비메탄올 활용(mutM) 표현형을 생성하도록 설계하였다. 복합 탄수화물을 여과가능한 크기로 감소시킬 표면 디스플레이 효소를 첨가함으로써 이들 형질전환체 균주를 더 변형시켰다. 시퀀싱은 이 균주가 어떠한 항생제 마커나 원핵생물 벡터 복제 원점 서열을 함유하지 않았음을 확인시켜 주었다.
생성된 균주를 약 pH 5의 고밀도 성장 조건에서 발효 조건에서 성장시켰다. 발효 조건 하에서 약 36시간의 성장 후, pH를 약 pH 6으로 상승시켰고, 배양물에 메탄올을 첨가함으로써 예시적인 단백질의 발현을 유도하였다. 발효 브로쓰를 원심분리하여(벤치 원심분리기 - Avant J18 로터 베크만 쿨터(Bechman Coulter) 사용) 세포를 제거하였다. 이후, 0.2 μm 중공사 막 여과를 사용하여 상층액을 여과하여 숙주 단백질 및 세포 잔해물을 제거하였다. 그 다음, 단백질 용액을 5 kDa 한외여과막을 사용하여 30 g/L 초과의 단백질로 농축하고 광범위하게 정용여과하여 대부분의 유기 및 무기 불순물을 제거하였다. 생성된 단백질 농축물을 시트레이트를 사용하여 pH 3.5로 조정하고 크로마토그래피 컬럼에 로딩하였다. 이 컬럼에 양이온 교환 수지(SP400, Mitsubishi Chemicals, Japan)를 충진하였다. 크로마토그래피 단계를 AKTA 익스플로러 900(GE Healthcare Life Sciences) 및 유니콘(Unicorn) 인터페이스 소프트웨어(버전 5.11)를 사용하여 약 22℃에서 하향 흐름 모드로 수행하였다. 크로마토그래피 방법은 일반적으로 평형화 단계, 로딩(통과) 단계, 결합되지 않은 단백질을 제거하는 세척 단계, 생성물을 제거하는 용출 단계, 제자리 세정(Cleaning In Place, CIP) 단계 및 재생 단계로 구성되었다. 각 단계에서의 용출의 컬럼 부피 및 사용된 완충액이 하기 표 4에 나타나 있다.
표 4: 전형적인 공정에 필요한 완충액 및 컬럼 부피의 목록.
용출 프로파일이 도 12에 나타나 있다.
본 실시예 및 다른 실시예에서, 하기 용어가 사용된다. "평형화"는 컬럼을 미리 로딩하는 것이고, "통과액"은 UF 정용여과된 농축물이 컬럼을 통과할 때 컬럼을 지나가는 물질이며 겔에서 레인 3으로 나타나 있으며, 최소 생성물 손실이고, "용출물"은 관심있는 단백질 농후 분획이며(예컨대, 도 14의 겔에서, 레인 4에서) 크로마토그램에서 가장 큰 피크이고, "CIP"는 세정 용액 용출이다.
대안적인 방법에서, 컬럼은 2.75:1.25의 비율의 2종의 수지인 SP400(Mitsubishi Chemicals, Japan) 및 세프라겐 S(Sepragen, California)의 독특한 혼합물로 충진된다. 완충액 조성 및 컬럼 부피는 표 4에 나타낸 바와 같이 유지된다. 용출 프로파일이 도 13에 나타나 있다.
설포프로필, 설포메틸, 설포네이트를 갖는 수지가 이 방법에 사용될 수 있다. 백본은 전형적으로 50-200 um 사이의 전형적인 입자 크기를 갖는 메타크릴레이트 또는 셀룰로스와 같은 비단백질 결합 물질이다. 리간드 밀도는 50-100 g 단백질/L 수지의 단백질 결합 용량을 수용할 것이다.
실시예 3: 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물을 제조하기 위한 음이온 수지
실시예 2에서, 컬럼에 양이온 수지를 충진하였다. 본 실시예에서, 컬럼에 음이온 교환 캅토 Q(Capto Q) 수지(Cytiva Chemicals)를 충진한다. 완충액 조성 및 컬럼 부피는 표 5에 나타낸 바와 같이 유지된다. 공급물은 여기에서 pH 변형되지 않으며, 이는 공정을 크게 단순화시킨다는 점에 유의한다. 공급물은 여기에서 pH 변형되지 않으며, 이는 공정을 크게 단순화시킨다는 점에 유의한다.
표 5: 전형적인 공정에 필요한 완충액 및 컬럼 부피의 목록.
용출 프로파일이 도 14a에 나타나 있으며, 단백질 분획을 보여주는 겔이 도 14b에 나타나 있다.
트리메틸 아미노에틸, 트리에틸 아미노에틸, 4차 아민기를 갖는 수지가 본 실시예에 기술된 방법에 사용될 수 있다.
실시예 4: 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물을 제조하기 위한 흡착제 또는 응집제의 용도
상기 실시예 3에 따라 제조된 단백질 농축물을 다수의 흡착제 및 응집제를 이용하여 추가로 시험하였다. 절차는 하기와 같았다: 0.05 g의 시험 흡착제 또는 응집제를 50 mL 팔콘 튜브에서 칭량하였다. 시험 흡착제 또는 응집제에 5 mL의 단백질 농축물을 첨가하였다. 그 다음, 튜브를 롤러 진탕기에 1시간 동안 둔 다음, 3214 g에서 30분 동안 원심분리하였다. 그 다음, 상층액을 흡광도, 단백질 및 EPS에 대해 시험하였다. 각 물질을 반복 시험하였다. 시험된 흡착제 및 응집제의 목록은 하기와 같다. 대조군(pH 6), 대조군(pH 4), 셀라이트 545, 벤토나이트 BE125, 디아이온 HPA25L, 탈아세틸화된 키토산 85%, EZ DE(규조토), 초순수 규조토, 렐리조브 SP400(pH 4). 본 연구에 대한 흡광도 스펙트럼이 도 15에 나타나 있다. 특히, 렐리조브는 pH 4.0에서 불순물보다는 단백질과 결합하기 때문에 효과가 없었다. 더 높은 pH에서 이 수지는 전부 용출시킬 것으로 예상된다.
추가 데이터가 도 16 및 도 17에 나타나 있다. 이들 도면은 대조군(검은색)과 비교하여 HPA25L 및 키토산이 더 많은 EPS를 흡착하고 단백질은 거의 흡착하지 않는 반면, pH 4에서 SP 400은 단백질을 흡착하고 EPS는 흡착하지 않는다는 것을 보여준다. 규조토(DE)는 단백질 및 EPS를 차이 없이 흡착한다.
실시예 5: EPS 추출하기 위한 응집제의 용도
피치아 파스토리스 균주를 약 pH 5의 고밀도 성장 조건에서 발효 조건에서 성장시킨다. 발효 조건 하에서 약 36시간의 성장 후, pH를 약 pH 6으로 상승시키고, 배양물에 메탄올을 첨가하여 관심있는 단백질의 발현을 유도한다. 발효 말기에, 응집제를 10-100 mg/L의 농도로 브로쓰에 첨가한다. 브로쓰를 혼합하고 실온 또는 4℃에서 6시간 동안 유지시켜 배지 내의 글루코스의 완전한 활용 및 응집제의 기능을 허용한다. 응고제는 이 시점에 첨가될 수 있다. 발효 브로쓰를 원심분리하여(벤치 원심분리기 - Avant J18 로터 베크만 쿨터 사용), 세포 및 EPS 유사 화합물을 제거한다. 이후, 0.2 μm 중공사막 여과를 사용하여 상층액을 여과하여 숙주 단백질 및 세포 잔해물을 제거한다. 그 다음, 단백질 용액을 5 kDa 한외여과막을 사용하여 30 g/L 초과의 단백질로 농축하고 광범위하게 정용여과하여 대부분의 유기 및 무기 불순물을 제거한다. 생성된 혼합물을 건조 전에 최종 미생물 감소 단계를 위해 미세여과하거나 열 처리한다. 이 방법의 단계가 도 4 또는 도 10에 예시되어 있다.
실시예 6: EPS를 소화시키기 위한 효소의 용도
피치아 파스토리스 균주를 약 pH 5의 고밀도 성장 조건에서 발효 조건에서 성장시킨다. 발효 조건 하에서 약 36시간의 성장 후, pH를 약 pH 6으로 상승시키고, 배양물에 메탄올을 첨가하여 관심있는 단백질의 발현을 유도한다. 이 시점에 글루카나제와 같은 EPS 분해 효소를 반응기에 첨가한다. 이들은 시스템 내에서 분비되기 때문에, 이것은 EPS 분자를 분해할 것이다. 최종 발효 브로쓰를 원심분리하여(벤치 원심분리기 - Avant J18 로터 베크만 쿨터 사용), 세포를 제거한다. 이후, 0.2 μm 중공사막 여과를 사용하여 상층액을 여과하여 숙주 단백질 및 세포 잔해물을 제거한다. 그 다음, 단백질 용액을 5 kDa 한외여과막을 사용하여 30 g/L 초과의 단백질로 농축하고 광범위하게 정용여과하여 대부분의 유기 및 무기 불순물을 제거한다. EPS 분해 효소를 원심분리기에서 및/또는 MF 단계에서 바이오매스와 함께 제거한다. 생성된 혼합물을 건조 전에 최종 미생물 감소 단계를 위해 미세여과하거나 열 처리한다. 이 방법의 단계가 도 2 또는 도 8에 예시되어 있다.
실시예 7: EPS를 추출하기 위한 흡착제의 용도
피치아 파스토리스 균주를 약 pH 5의 고밀도 성장 조건에서 발효 조건에서 성장시킨다. 발효 조건 하에서 약 36시간의 성장 후, pH를 약 pH 6으로 상승시키고, 배양물에 메탄올을 첨가함으로써 관심있는 단백질의 발현을 유도한다. 발효 말기에, 브로쓰를 혼합하고 실온 또는 4℃에서 6시간 동안 유지하여 배지 내의 글루코스의 완전한 활용을 허용한다. 발효 브로쓰를 원심분리하여(벤치 원심분리기 - Avant J18 로터 베크만 쿨터 사용), 세포를 제거한다. 그 다음, 원심분리기로부터의 농축물을 흡착제로 미리 코팅된 필터에 통과시켜 EPS 유사 화합물을 제거한다. 필터가 사용되면, 흡착제를 물에 현탁시키고 필터 위를 통과시켜 필터 위에 균일한 층을 생성한다. 이후, 필터 위에서 농축물을 통과시킨다. 이는 또한 동일한 흡착제로 충진된 컬럼을 사용하여 수행될 수 있다. 이 단계 후에, 0.2 μm 중공사막 여과를 사용하여 상층액을 여과하여 숙주 단백질 및 세포 잔해물을 제거한다. 그 다음, 단백질 용액을 5 kDa 한외여과막을 사용하여 30 g/L 초과의 단백질로 농축하고 광범위하게 정용여과하여 대부분의 유기 및 무기 불순물을 제거한다. 생성된 혼합물을 건조 전에 최종 미생물 감소 단계를 위해 미세여과하거나 열 처리한다. 이 방법의 단계가 도 3 또는 도 9에 예시되어 있다.
실시예 8: 바람직하지 않은 특징의 제거
그 다음, 실시예 2에 기술된 방법에서 수득된 단백질 농축물을 농축물 용액 중 약 40% w/v 농도에 도달하도록 황산암모늄을 첨가하여 침전시켰다. 그 다음, 침전물을 원심분리하여(벤치 원심분리기 - Avant J18 로터, 베크만 쿨터 사용), 단백질을 제거했다. 그 다음, 단백질을 탈이온수를 사용하여 10% w/v 용액으로 재현탁시켰다. 그 다음, 이 용액을 탈이온수를 사용하여 1 mS/cm 미만의 최종 전도도까지 정용여과한다. 그 다음, 정용여과된 단백질을 0.2 μm 막을 통해 미세여과하고 동결건조한다. 이들 단백질은 "소규모 제제"로 지칭된다.
대규모 발효를 위해, 발효 말기에, 브로쓰를 8℃로 냉각시켜 효모의 대사를 늦추었다. 원심분리 전에, 브로쓰를 희석하여 25% v/v의 충진된 세포 부피에 도달시켰다. 그 다음, 효소 세포를 원심분리에 의해 제거하고, 상층액을 보관하여 다음 단계로 옮겼다. 이 단계는 발효 완료 8시간 이내에 완료되며 냉각이 완료되기 전에 시작할 수 있다. 이 목적을 위해, 충분히 큰 표면적 및 견고한 능력을 가진 적절한 디스크 스택 원심분리기를 사용한다. 양호한 분리를 나타내는 상층액의 벌크 OD600 측정값은 바람직하게는 <0.9 AU이다. 0.2 μm 여과를 통한 추가 정화를 위해 농축물을 수집하였다. 0.2 μm 여과는 농축 및 정용여과 단계 모두에서 접선 흐름 모드로 실행될 것이다. 농축 단계 동안, 잔류물 부피는 약 6-9X 감소한다. 더 높은 수율을 달성하기 위해, 잔류물을 10 정용부피의 물로 연속적으로 정용여과한다. 0.2 μm TFF로부터의 투과물을 그의 초기 부피로부터 약 50 g/L 단백질 농도로 6-8배 농축한다. 최종 잔류물은 진한 녹색이었다. 그 다음, 이 잔류물을 6-8 DV의 탈이온수로 정용여과하였다. 그 다음, 정용여과된 잔류물을 0.2 μm MF 필터를 사용하여 멸균 여과하고, 약 165℃의 입구 온도 및 80℃를 초과하지 않는 출구 온도로 분무 건조한다. 막은 단백질 적용을 위해 설계된 친수성 폴리에틸렌 설폰일 수 있다. 온도를 공정 전반에 걸쳐 온도를 10℃로 유지시켰다. 이들 단백질은 "대규모 제제"로 지칭된다.
상기 공정은 건조 전에 진한 녹색 용액을 초래한다. 이를 탈색 및 탈취시키기 위해, 산화 단계가 활용될 수 있다. 정용여과 전 잔류물의 pH를 85% v/v 인산을 사용하여 4로 감소시켰다. 그 다음, 35% v/v 과산화수소를 천천히 첨가하여 최종 용액을 3% v/v 과산화수소 혼합물로 포화시켰다. 그 다음, 혼합물을 폼이 나오는 것을 방지하기 위해 천천히 혼합하면서 탱크에 6시간 동안 두었다. 그 다음, 농축된 수산화나트륨에 이어 정용여과, 멸균 여과 및 건조를 사용하여 pH를 다시 6으로 변경하였다. 이들 단백질 샘플은 "실시예 A" 샘플로 지칭된다.
발효의 말기 및 실시예 A의 공정의 말기로부터의 샘플을 GC-MS를 사용하여 분석하였다. 관찰된 두드러진 풍미 및 냄새 화합물이 하기 표 6에 나열되어 있다:
표 6: 발효 말기 및 정제에 두드러진 풍미/냄새를 유발하는 화합물의 목록.
소규모 제제 및 대규모 제제로부터 생성된 단백질 잔류물을 pH에 대해 조정하고 크로마토그래피 컬럼에 로딩하였다. 이 컬럼에 양이온 교환 수지(SP400, Mitsubishi Chemicals, Japan)를 충진하였다. 크로마토그래피 단계를 AKTA 익스플로러 900(GE Healthcare Life Sciences) 및 유니콘 인터페이스 소프트웨어(버전 5.11)를 사용하여 약 22℃에서 하향 흐름 모드로 수행하였다. 크로마토그래피 방법은 일반적으로 평형화 단계, 로딩(통과) 단계, 결합되지 않은 단백질을 제거하는 세척 단계, 생성물을 제거하는 용출 단계, 제자리 세정(Cleaning In Place, CIP) 단계 및 재생 단계로 구성되었다. 각 단계에서 용출의 컬럼 부피 및 사용된 완충액이 상기 표 4에 나타나 있으며, 용출 프로파일이 도 12에 나타나 있다.
그 다음, 컬럼으로부터의 이 용출 분획을 농축하고 정용여과하여 용출 완충액 염을 제거한다. 그 다음, 이 흐름을 0.2 μm 막을 사용하여 미세여과하고 건조한다. 이들 샘플은 "실시예 B" 샘플로 지칭된다.
그 다음, 산화된 샘플 및 비산화된 샘플을 극성 Stabilwax-DA 컬럼을 사용하여 GC-MS로 시험하였다. 사용된 샘플 준비는 SPME였으며, 분석은 MS 데이터뿐만 아니라 인간 후각 냄새 시험으로 구성되었다. 소규모 단백질 제제에 대한 결과는 하기 표 7을 참조한다.
표 7: 산화 및 크로마토그래피 방법을 이용한, 실험실 설정(소규모 제제)에서 생성된 샘플에 대한 GC MS 데이터.
대규모 단백질 제제에 대한 결과는 하기 표 8을 참조한다.
표 8 산화 및 크로마토그래피 방법을 이용한, 실험실 설정(소규모 준비)에서 생성된 샘플에 대한 GC MS 데이터.
표 7에 나열된 대부분의 화합물은 실시예 A 샘플을 실시예 B 샘플과 비교할 때 감소된다. 이는 대규모 제제에 대한 표 8에서 훨씬 더 명확하다.
상기 생성된 실시예 B 샘플을 다양한 처리를 사용하여 추가로 재가공하여 감각 특징의 개선을 확인하였다. 시험된 처리는 하기와 같았다:
에탄올 세척: 분무 건조된 단백질 분말을 10%v/v 에탄올 용액에 재현탁하여 50 g/L의 고형분 농도에 도달시켰다. 용액을 자기 교반기를 사용하여 주변 온도에서 1시간 동안 교반한 다음, 5 kDa 막에서 4-5 DV의 탈이온수로 정용여과하였다. 잔류물을 멸균 여과하고 건조시켰다.
이온 교환(IEX): 분무 건조된 단백질 분말을 탈이온수에 재현탁하여 50 g/L의 고형분 농도에 도달시켰다. 실시예 5에 기술된 공정을 이 단백질 용액에 대해 반복하였다.
열 및 진공: 분무 건조된 단백질 분말을 탈이온수에 재현탁하여 50 g/L의 고형분 농도에 도달시켰다. 그 다음, 단백질 용액을 50-58℃로 가열하고 저진공(75-150 torr) 하에서 1시간 동안 유지시켰다. 그 다음, 용액을 멸균 여과하고 건조시켰다.
IEX, 열 및 진공: 이는 다양한 정제 방법을 조합하는 직교 접근법이었다. 실시예 5의 생성물을 탈이온수에 재현탁시켜 50 g/L의 고형물 농도에 도달시켰다. 그 다음, 단백질 용액을 50-58℃로 가열하고 저진공(75-150 torr) 하에서 1시간 동안 유지시켰다. 그 다음, 용액을 멸균 여과하고 건조시켰다.
물 중의 6% w/v 용액의 외관, 식감 및 뒷맛에 기초하여 이들 샘플에 대해 수행된 감각 분석을 도 18에서 분석하였다. 산화되지 않은 제제의 이온 교환 공정은 재가공된 대조군의 최상의 버전을 산출하였다. 그래프의 중앙은 물의 감각 프로파일을 나타낸다.
참조에 의한 포함
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 각 개별 간행물, 특허, 또는 특허 출원이 참조로 통합되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 참조로 본원에 포함된다. 참조로 포함된 간행물 및 특허 또는 특허 출원이 명세서에 포함된 개시내용과 모순되는 경우, 명세서가 임의의 이러한 모순되는 자료를 대체하고/하거나 이보다 우선하는 것으로 의도된다.

Claims (113)

  1. 소비가능한 조성물을 제조하는 방법으로서,
    재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 수득하는 단계로서, 재조합 세포 부산물은 엑소폴리사카라이드(EPS) 및 이취 성분을 포함하는 것인 단계;
    복수의 재조합 세포 부산물로부터 재조합 단백질을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계로서, 가공 단계는 재조합 단백질에 가역적으로 부착되고 복수의 재조합 세포 부산물에 실질적으로 부착되지 않는 음이온 수지를 포함하는 것인 단계;
    분리된 재조합 단백질을 수집하여 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물을 수득하는 단계; 및
    단백질 생성물을 포함하는 소비가능한 조성물을 제제화하는 단계
    를 포함하는, 소비가능한 조성물을 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 세포 배양 배지인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 분비한 재조합 세포를 포함하는 세포 배양 배지인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 분비한 재조합 세포가 결여되어 있는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 단백질의 등전점(pI)보다 큰 pH를 갖는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물의 pH는 재조합 단백질의 pI보다 큰 pH를 달성하도록 변형되지 않는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 음이온 수지는 강한 음이온 교환 수지 또는 약한 음이온 교환 수지인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 음이온 수지는 캅토 Q(Capto Q) 수지, DEAE 유형 약한 음이온 교환기, 트리메틸 아미노에틸 기를 갖는 수지, 트리에틸 아미노에틸 기를 갖는 수지, 4차 아민 기를 갖는 수지 중 하나 이상인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 음이온 수지는 크로마토그래피 시스템의 성분인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 크로마토그래피 시스템은 축상 유동 컬럼 또는 방사상 유동 컬럼 또는 원심분리 컬럼에 의하거나 또는 막 크로마토그래피 컬럼의 사용에 의한 배치 모드로 작동하는 것인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 크로마토그래피 시스템은 복수의 컬럼을 병렬로 포함하는 연속 모드로 작동하며, 여기서 컬럼으로의 공급은 크로마토그래피 공정에서의 다양한 단계(예컨대, 평형화, 로딩, 용출, 및 세정)가 동시에 발생하도록 전환가능한 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 연속 모드는 모사 이동층(SMB) 또는 이온 분리기(예컨대, ISEP®) 시스템을 포함하는 것인 방법.
  13. 제4항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 세포를 포함하는 소모된 바이오매스를 제거하기 위해 사전에 처리되고/되거나 작은 비단백질 분자를 제거하기 위해 사전에 처리되는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 작은 비단백질 분자를 제거하기 위한 처리는 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 농축하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 작은 비단백질 분자를 제거하기 위한 처리는 정용여과 완충액을 포함하는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물을 생산하기 위해 그 분리된 재조합 단백질의 농축 단계 및/또는 정용여과 처리를 추가로 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물은 추가로 열 처리 및/또는 건조되는 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물 및/또는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물은 추가로 열 처리 및/또는 건조되는 것인 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 열 처리는 재조합 단백질 및 이취 성분을 분리하고, 여기서 열은 이취 성분이 휘발되어 기체상 이취 성분이 제거될 수 있는 온도 및 지속시간으로 적용되는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 열의 적용과 동시에 진공이 적용되고, 진공은 기체상 이취 성분의 제거를 촉진하는 것인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 이취 성분은 산, 알코올, 알데하이드, 방향족, 에스테르, 또는 케톤인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 이취 성분은 (E)-2-노네날; 1-도데센; 1-헥산올, 2-에틸-; 1-헥센-3-온; 1-옥텐-3-온; 2,3-부탄디온; 2-부탄온; 2-메틸부탄알; 2-메틸프로판알; 2-프로판온; 2-운데칸온; 3-메틸부탄알; 아세트알데하이드; 벤젠 에탄올; 벤질 알코올; 부탄알, 3-메틸-; 클로로톨루엔; 노난산; p-크레졸; 또는 프로판산, 2-메틸-, 3-하이드록시-2,4,4-트리메틸펜틸 에스테르인 방법.
  23. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 열 처리 동안 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물, 및/또는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물의 온도는 최대 80℃, 예컨대 약 50℃ 내지 약 60℃인 방법.
  24. 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 열 처리 동안 교반을 포함하는 것인 방법.
  25. 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 열 처리 및/또는 건조 단계는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 건조 단백질 생성물을 생산하는 것인 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물 및/또는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물은 산화 단계, 예컨대 과산화수소의 첨가를 포함하는 산화 단계를 추가로 수행하는 것인 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물 내의 재조합 세포 부산물 대 재조합 단백질의 비율은 약 1:3 내지 약 3:1인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 단백질 생성물은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물에 비해 EPS의 양 및/또는 이취 성분의 양에서 적어도 25% 감소, 적어도 30% 감소, 적어도 35% 감소, 적어도 40% 감소, 적어도 45% 감소, 적어도 50% 감소, 적어도 55% 감소, 적어도 60% 감소, 적어도 65% 감소, 적어도 70% 감소, 적어도 75% 감소, 적어도 75% 감소, 적어도 80% 감소, 적어도 90% 감소, 또는 적어도 95% 감소를 갖는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 단백질 생성물의 중량의 약 10% 미만이 재조합 세포 부산물을 포함하는 것인 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 생성물의 중량의 약 5% 미만이 재조합 세포 부산물을 포함하는 것인 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 생성물의 중량의 약 5% 미만, 약 1% 미만, 약 0.1% 미만, 또는 약 0.01% 미만이 이취 성분을 포함하는 것인 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 생성물 내의 이취 성분은 표준 소비자에게 사실상 감지될 수 없는 것인 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, EPS는 일반적으로 크기 배제 크로마토그래피를 사용할 때 재조합 단백질로부터 분리될 수 없는 것인 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, EPS는 자연적으로 재조합 세포의 세포벽의 성분인 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, EPS는 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 의해 특징지어지는 바와 같이 약 13 kDa 내지 약 27 kDa의 겉보기 크기를 갖는 것인 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, EPS는 만노스를 포함하는 것인 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, EPS는 N-아세틸글루코사민 및/또는 글루코스를 추가로 포함하는 것인 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, EPS는 질량 분석법과 함께 가스 크로마토그래피에 의해 분석될 때 약 91 몰% 만노스, 약 5 몰% N-아세틸글루코사민, 및 약 3 몰% 글루코스를 포함하는 것인 방법.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, EPS는 α(1,2)-연결된 분지 및/또는 α(1,3)-연결된 분지를 갖는 α(1,6)-연결된 백본을 포함하는 것인 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, EPS는 만난인 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 발현하는 재조합 세포는 진균 세포, 예컨대 사상 진균 또는 효모, 박테리아 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 또는 포유동물 세포로부터 선택되는 것인 방법.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 세포 유형은 아르술라 종(Arxula spp.), 아르술라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans), 클루이베로마이세스 종(Kluyveromyces spp.), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 코마가타엘라 파피이(Komagataella phaffii), 피치아 종(Pichia spp.), 피치아 안구스타(Pichia angusta), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 종(Saccharomyces spp.), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 종(Schizosaccharomyces spp.), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 야로위아 종(Yarrowia spp.), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 아가리쿠스 종(Agaricus spp.), 아가리쿠스 비스포루스(Agaricus bisporus), 아스퍼질러스 종(Aspergillus spp.), 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 콜레토트리쿰 종(Colletotrichum spp.), 콜레토트리쿰 글로에오스포리오데스(Colletotrichum gloeosporiodes), 엔도시아 종(Endothia spp.), 엔도시아 파라시티카(Endothia parasitica), 에세리키아 콜리(Escherichia coli), 푸사리움 종(Fusarium spp.), 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 푸사리움 솔라니(Fusarium solani), 무코르 종(Mucor spp.), 무코르 미에헤이(Mucor miehei), 무코르 푸실루스(Mucor pusillus), 마이셀리오프토라 종(Myceliophthora spp.), 마이셀리오프토라 써모필라(Myceliophthora thermophila), 뉴로스포라 종(Neurospora spp.), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 페니실리움 종(Penicillium spp.), 페니실리움 카멤버티(Penicillium camemberti), 페니실리움 카네센스(Penicillium canescens), 페니실리움 크리소제눔(Penicillium chrysogenum), 페니실리움(탈라로마이세스) 에머소니(Penicillium(Talaromyces) emersonii), 페니실리움 푸니쿨로 섬(Penicillium funiculo sum), 페니실리움 퍼푸로제눔(Penicillium purpurogenum), 페니실리움 로퀘포티(Penicillium roqueforti), 플레우로투스 종(Pleurotus spp.), 플레우로투스 오스트레아투스(Pleurotus ostreatus), 슈도모나스 종(Pseudomonas spp.), 리조무코르 종(Rhizomucor spp.), 리조무코르 미에헤이(Rhizomucor miehei), 리조무코르 푸실루스(Rhizomucor pusillus), 리조푸스 종(Rhizopus spp.), 리조푸스 아르히주스(Rhizopus arrhizus), 리조푸스 올리고스포루스(Rhizopus oligosporus), 리조푸스 오리자에(Rhizopus oryzae), 트리코더마 종(Trichoderma spp.), 트리코더마 알트로비리데(Trichoderma altroviride), 트리코더마 레에세이(Trichoderma reesei), 및 트리코더마 비레우스(Trichoderma vireus)로부터 선택되는 것인 방법.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 진균은 피치아 종인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 피치아 종은 코마가타엘라 파피이 또는 코마가타엘라 파스토리스인 방법.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 단백질은 효소, 영양 단백질, 식품 성분, 또는 식품 첨가물인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 효소는 펩시노겐 또는 펩신인 방법.
  47. 제45항에 있어서, 단백질은 난백 단백질인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 난백 단백질은 난백알부민(OVA), 오보뮤코이드(OVD), 오보트랜스페린(OVT), 라이소자임(OVL), 오보뮤신, 오보글로불린 G2, 오보글로불린 G3, 오보억제제, 오보당단백질, 플라보단백질, 오보마크로글로불린, 오보스타틴, 시스타틴, 아비딘, 난백알부민 관련 단백질 X, 또는 난백알부민 관련 단백질 Y, 및 이들의 임의의 조합인 방법.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 난백 단백질은 새, 예컨대 닭, 메추라기, 칠면조, 칠면조 독수리, 벌새, 오리, 타조, 거위, 갈매기, 뿔닭, 꿩, 또는 에뮤에서 자연적으로 생산된 난백 단백질과 적어도 80% 동일한(예컨대, 약 85%, 90%, 또는 95% 동일한) 서열을 갖는 것인 방법.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 생성물을 포함하는 소비가능한 조성물은 식품, 음료 제품, 또는 식이 보충제를 포함하는 것인 방법.
  51. 제50항에 있어서, 식품은 제과제빵(예컨대, 케이크, 머핀, 쿠키, 빵, 베이글, 페이스트리, 도넛), 스크램블, 오믈렛, 키슈, 파스타, 국수, 크레페, 와플, 도우(dough), 배터(batter), 쿠키 도우, 미트로프, 미트볼, 햄버거, 동물 사료, 과일, 야채, 두부(tofu), 비지(bean curd), 치즈, 해산물, 고기, 아이스크림, 마요네즈, 커스터드, 푸딩, 수플레, 유제, 폼, 머랭, 프로스팅, 과자, 마시멜로, 마지팬, 수프, 조미료, 소스, 향신료, 유제품, 및 드레싱을 포함하는 것인 방법.
  52. 제50항에 있어서, 음료 제품은 청량 음료, 플레이버 워터(flavored water), 주스, 스포츠 음료, 에너지 음료, 스무디, 쉐이크, 알코올 음료(예컨대, 와인, 사케, 맥주, 증류주), 칵테일, 리큐어, 탄산 음료, 카페인 음료, 커피, 코코아, 차, 에그노그, 및 유제 음료를 포함하는 것인 방법.
  53. 제50항에 있어서, 식이 보충제는 종합 비타민, 훌 푸드 보충제, 다이어트 보충제, 허브 보충제, 단백질 블렌드, 매스 게이너(mass gainer), 즉석 음료 단백질, 단백질 바, 단백질 쉐이크, 단백질 분말, 단백질 샷, 단백질 분리물, 에너지 바, 에너지 겔, 에너지 츄, 에너지 포뮬러(energy formula), 지구력 포뮬러(endurance formula), 에너지 보충제, 영양 보충제, 스포츠 영양 보충제, 유아용 조제분유(infant formula)(예컨대, 분말 또는 액체), 및 식사 대용품을 포함하는 것인 방법.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 재조합 세포 부산물로부터 재조합 단백질을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계는 i) 재조합 단백질에 가역적으로 부착되고 EPS에 실질적으로 부착되지 않는 하나 이상의 양이온 교환 수지, ii) 재조합 단백질 또는 EPS를 소화시키는 효소, iii) EPS에 가역적으로 부착되고 재조합 단백질에 실질적으로 부착되지 않는 흡착제, 및/또는 iv) EPS에 부착되고 재조합 단백질에 실질적으로 부착되지 않는 응집제 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것인 방법.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득된 소비가능한 조성물.
  56. 소비가능한 조성물을 제조하는 방법으로서,
    재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 수득하는 단계로서, 재조합 세포 부산물은 엑소폴리사카라이드(EPS) 및 이취 성분을 포함하는 것인 단계;
    복수의 재조합 세포 부산물로부터 재조합 단백질을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계로서, 가공 단계는 재조합 단백질에 가역적으로 부착되고 복수의 재조합 세포 부산물에 실질적으로 부착되지 않는 하나 이상의 양이온 교환 수지를 포함하는 것인 단계;
    분리된 재조합 단백질을 수집하여 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물을 수득하는 단계; 및
    단백질 생성물을 포함하는 소비가능한 조성물을 제제화하는 단계
    를 포함하는, 소비가능한 조성물을 제조하는 방법.
  57. 제56항에 있어서, 하나 이상의 양이온 교환 수지는 강한 양이온 교환 수지, 예컨대 설포프로필, 설포메틸 또는 설포네이트 유형 수지, 및/또는 약한 양이온 교환 수지, 예컨대 카르복시메틸 유형 수지를 포함하는 것인 방법.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 하나 이상의 양이온 교환 수지는 폴리 스티렌 디비닐 벤젠, 폴리 메타크릴레이트 또는 셀룰로스 또는 가교결합된 덱스트란 또는 가교결합된 아가로스 또는 친수성 중합체로 코팅된 무기 물질을 포함하는 것인 방법.
  59. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 양이온 교환 수지는 약 50 μm 내지 약 200 μm의 입자 크기를 갖고/갖거나 약 50 내지 약 100 g 단백질/L 수지의 단백질 결합 용량을 갖는 것인 방법.
  60. 제56항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 양이온 교환 수지는 사이티바 캅토 S(Cytiva Capto S), HP20, 렐리조브 SP400(Relizorb SP400), 세프라겐 S(Sepragen S), SP20, 및/또는 미츠비시 렐리조브 EXE349(Mitsubishi Relizorb EXE349)를 포함하는 것인 방법.
  61. 제56항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 가공 단계는 2종의 양이온 수지를 포함하며, 2종의 양이온 수지는 1:5 내지 5:1, 1:4 내지 4:1, 1:3 내지 3:1, 1:2 내지 2:1, 또는 1:1의 비율인 방법.
  62. 제61항에 있어서, 2개의 수지는 SP400 및 세프라겐 S이며, 약 3:1, 예컨대 2.75:1.25의 비율인 방법.
  63. 제56항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 분비한 재조합 세포가 결여되어 있는 것인 방법.
  64. 제56항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 단백질의 등전점(pI)보다 낮은 pH를 가지며, 이는 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물의 pH를 낮춤으로써 달성되는 것인 방법.
  65. 제56항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 양이온 수지는 크로마토그래피 시스템의 성분이고, 크로마토그래피 시스템은 축상 유동 컬럼 또는 방사상 유동 컬럼 또는 원심분리 컬럼에 의하거나 또는 막 크로마토그래피 컬럼의 사용에 의한 배치 모드로 작동하는 것인 방법.
  66. 제56항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 양이온 수지는 크로마토그래피 시스템의 성분이고, 크로마토그래피 시스템은 복수의 컬럼을 병렬로 포함하는 연속 모드로 작동하며, 여기서 컬럼으로의 공급은 크로마토그래피 공정에서의 다양한 단계(예컨대, 평형화, 로딩, 용출, 및 세정)가 동시에 발생하도록 전환가능한 것인 방법.
  67. 제66항에 있어서, 연속 모드는 모사 이동층(SMB) 또는 이온 분리기(예컨대, ISEP®) 시스템을 포함하는 것인 방법.
  68. 제62항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물은 재조합 세포를 포함하는 소모된 바이오매스를 제거하기 위해 사전에 처리되고/되거나 작은 비단백질 분자를 제거하기 위해 사전에 처리되는 것인 방법.
  69. 제68항에 있어서, 작은 비단백질 분자를 제거하기 위한 처리는 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 농축하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  70. 제68항 또는 제69항에 있어서, 작은 비단백질 분자를 제거하기 위한 처리는 정용여과 완충액을 포함하는 것인 방법.
  71. 제56항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물을 생산하기 위해 그 분리된 재조합 단백질의 농축 단계 및/또는 정용여과 처리를 추가로 포함하는 방법.
  72. 제71항에 있어서, 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물은 추가로 열 처리 및/또는 건조되는 것인 방법.
  73. 제56항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물 및/또는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물은 추가로 열 처리 및/또는 건조되는 것인 방법.
  74. 제72항 또는 제73항에 있어서, 열 처리는 재조합 단백질 및 이취 성분을 분리하고, 여기서 열은 이취 성분이 휘발되어 기체상 이취 성분이 제거될 수 있는 온도 및 지속시간으로 적용되는 것인 방법.
  75. 제74항에 있어서, 열의 적용과 동시에 진공이 적용되고, 진공은 기체상 이취 성분의 제거를 촉진하는 것인 방법.
  76. 제56항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 이취 성분은 산, 알코올, 알데하이드, 방향족, 에스테르, 또는 케톤인 방법.
  77. 제56항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 이취 성분은 (E)-2-노넨알; 1-도데센; 1-헥산올, 2-에틸-; 1-헥센-3-온; 1-옥텐-3-온; 2,3-부탄디온; 2-부탄온; 2-메틸부탄알; 2-메틸프로판알; 2-프로판온; 2-운데칸온; 3-메틸부탄알; 아세트알데하이드; 벤젠 에탄올; 벤질 알코올; 부탄알, 3-메틸-; 클로로톨루엔; 노난산; p-크레졸; 또는 프로판산, 2-메틸-, 3-하이드록시-2,4,4-트리메틸펜틸 에스테르인 방법.
  78. 제72항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 열 처리 동안 바람직한 pH 및/또는 이온 조건을 갖는 단백질 함유 조성물, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물, 및/또는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물의 온도는 최대 80℃, 예컨대 약 50℃ 내지 약 60℃인 방법.
  79. 제72항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 열 처리 동안 교반을 포함하는 것인 방법.
  80. 제72항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 열 처리 및/또는 건조 단계는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 건조 단백질 생성물을 생산하는 것인 방법.
  81. 제56항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물 및/또는 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물은 산화 단계, 예컨대 과산화수소의 첨가를 포함하는 산화 단계를 추가로 수행하는 것인 방법.
  82. 제56항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물 내의 재조합 세포 부산물 대 재조합 단백질의 비율은 약 1:3 내지 약 3:1인 방법.
  83. 제82항에 있어서, 단백질 생성물은 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물에 비해 EPS의 양 및/또는 이취 성분의 양에서 적어도 25% 감소, 적어도 30% 감소, 적어도 35% 감소, 적어도 40% 감소, 적어도 45% 감소, 적어도 50% 감소, 적어도 55% 감소, 적어도 60% 감소, 적어도 65% 감소, 적어도 70% 감소, 적어도 75% 감소, 적어도 75% 감소, 적어도 80% 감소, 적어도 90% 감소, 또는 적어도 95% 감소를 갖는 것인 방법.
  84. 제83항에 있어서, 단백질 생성물의 중량의 약 10% 미만이 재조합 세포 부산물을 포함하는 것인 방법.
  85. 제56항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 생성물의 중량의 약 5% 미만이 재조합 세포 부산물을 포함하는 것인 방법.
  86. 제56항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 생성물의 중량의 약 5% 미만, 약 1% 미만, 약 0.1% 미만, 또는 약 0.01% 미만이 이취 성분을 포함하는 것인 방법.
  87. 제56항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 생성물 내의 이취 성분은 표준 소비자에게 사실상 감지될 수 없는 것인 방법.
  88. 제56항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, EPS는 일반적으로 크기 배제 크로마토그래피를 사용할 때 재조합 단백질로부터 분리될 수 없는 것인 방법.
  89. 제56항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, EPS는 자연적으로 재조합 세포의 세포벽의 성분인 방법.
  90. 제56항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, EPS는 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 의해 특징지어지는 바와 같이 약 13 kDa 내지 약 27 kDa의 겉보기 크기를 갖는 것인 방법.
  91. 제56항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, EPS는 만노스를 포함하는 것인 방법.
  92. 제56항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, EPS는 N-아세틸글루코사민 및/또는 글루코스를 추가로 포함하는 것인 방법.
  93. 제56항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, EPS는 질량 분석법과 함께 가스 크로마토그래피에 의해 분석될 때 약 91 몰% 만노스, 약 5 몰% N-아세틸글루코사민, 및 약 3 몰% 글루코스를 포함하는 것인 방법.
  94. 제56항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, EPS는 α(1,2)-연결된 분지 및/또는 α(1,3)-연결된 분지를 갖는 α(1,6)-연결된 백본을 포함하는 것인 방법.
  95. 제56항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, EPS는 만난인 방법.
  96. 제56항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 발현하는 재조합 세포는 진균 세포, 예컨대 사상 진균 또는 효모, 박테리아 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 또는 포유동물 세포로부터 선택되는 것인 방법.
  97. 제56항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 세포 유형은 아르술라 종, 아르술라 아데니니보란스, 클루이베로마이세스 종, 클루이베로마이세스 락티스, 코마가타엘라 파피이, 피치아 종, 피치아 안구스타, 피치아 파스토리스, 사카로마이세스 종, 사카로마이세스 세레비지애, 쉬조사카로마이세스 종, 쉬조사카로마이세스 폼베, 야로위아 종, 야로위아 리폴리티카, 아가리쿠스 종, 아가리쿠스 비스포루스, 아스퍼질러스 종, 아스퍼질러스 아와모리, 아스퍼질러스 푸미가투스, 아스퍼질러스 니둘란스, 아스퍼질러스 니거, 아스퍼질러스 오리자에, 바실러스 서브틸리스, 콜레토트리쿰 종, 콜레토트리쿰 글로에오스포리오데스, 엔도시아 종, 엔도시아 파라시티카, 에세리키아 콜리, 푸사리움 종, 푸사리움 그라미네아룸, 푸사리움 솔라니, 무코르 종, 무코르 미에헤이, 무코르 푸실루스, 마이셀리오프토라 종, 마이셀리오프토라 써모필라, 뉴로스포라 종, 뉴로스포라 크라사, 페니실리움 종, 페니실리움 카멤버티, 페니실리움 카네센스, 페니실리움 크리소제눔, 페니실리움(탈라로마이세스) 에머소니, 페니실리움 푸니쿨로 섬, 페니실리움 퍼푸로제눔, 페니실리움 로퀘포티, 플레우로투스 종, 플레우로투스 오스트레아투스, 슈도모나스 종, 리조무코르 종, 리조무코르 미에헤이, 리조무코르 푸실루스, 리조푸스 종, 리조푸스 아르히주스, 리조푸스 올리고스포루스, 리조푸스 오리자에, 트리코더마 종, 트리코더마 알트로비리데, 트리코더마 레에세이, 및 트리코더마 비레우스로부터 선택되는 것인 방법.
  98. 제96항 또는 제97항에 있어서, 진균은 피치아 종인 방법.
  99. 제98항에 있어서, 피치아 종은 코마가타엘라 파피이 또는 코마가타엘라 파스토리스인 방법.
  100. 제56항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 단백질은 효소, 영양 단백질, 식품 성분, 또는 식품 첨가물인 방법.
  101. 제100항에 있어서, 효소는 펩시노겐 또는 펩신인 방법.
  102. 제100항에 있어서, 단백질은 난백 단백질인 방법.
  103. 제102항에 있어서, 난백 단백질은 난백알부민(OVA), 오보뮤코이드(OVD), 오보트랜스페린(OVT), 라이소자임(OVL), 오보뮤신, 오보글로불린 G2, 오보글로불린 G3, 오보억제제, 오보당단백질, 플라보단백질, 오보마크로글로불린, 오보스타틴, 시스타틴, 아비딘, 난백알부민 관련 단백질 X, 또는 난백알부민 관련 단백질 Y, 및 이들의 임의의 조합인 방법.
  104. 제102항 또는 제103항에 있어서, 난백 단백질은 새, 예컨대 닭, 메추라기, 칠면조, 칠면조 독수리, 벌새, 오리, 타조, 거위, 갈매기, 뿔닭, 꿩, 또는 에뮤에서 자연적으로 생산된 난백 단백질과 적어도 80% 동일한(예컨대, 약 85%, 90%, 또는 95% 동일한) 서열을 갖는 것인 방법.
  105. 제56항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 생성물을 포함하는 소비가능한 조성물은 식품, 음료 제품, 또는 식이 보충제를 포함하는 것인 방법.
  106. 제105항에 있어서, 식품은 제과제빵(예컨대, 케이크, 머핀, 쿠키, 빵, 베이글, 페이스트리, 도넛), 스크램블, 오믈렛, 키슈, 파스타, 국수, 크레페, 와플, 도우, 배터, 쿠키 도우, 미트로프, 미트볼, 햄버거, 동물 사료, 과일, 야채, 두부, 비지, 치즈, 해산물, 고기, 아이스크림, 마요네즈, 커스터드, 푸딩, 수플레, 유제, 폼, 머랭, 프로스팅, 과자, 마시멜로, 마지팬, 수프, 조미료, 소스, 향신료, 유제품, 및 드레싱을 포함하는 것인 방법.
  107. 제105항에 있어서, 음료 제품은 청량 음료, 플레이버 워터, 주스, 스포츠 음료, 에너지 음료, 스무디, 쉐이크, 알코올 음료(예컨대, 와인, 사케, 맥주, 증류주), 칵테일, 리큐어, 탄산 음료, 카페인 음료, 커피, 코코아, 차, 에그노그, 및 유제 음료를 포함하는 것인 방법.
  108. 제105항에 있어서, 식이 보충제는 종합 비타민, 훌 푸드 보충제, 다이어트 보충제, 허브 보충제, 단백질 블렌드, 매스 게이너, 즉석 음료 단백질, 단백질 바, 단백질 쉐이크, 단백질 분말, 단백질 샷, 단백질 분리물, 에너지 바, 에너지 겔, 에너지 츄, 에너지 포뮬러, 지구력 포뮬러, 에너지 보충제, 영양 보충제, 스포츠 영양 보충제, 유아용 조제분유(예컨대, 분말 또는 액체), 및 식사 대용품을 포함하는 것인 방법.
  109. 제56항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 재조합 세포 부산물로부터 재조합 단백질을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계는 i) 재조합 단백질에 가역적으로 부착되고 EPS에 실질적으로 부착되지 않는 음이온 수지, ii) 재조합 단백질 또는 EPS를 소화시키는 효소, iii) EPS에 가역적으로 부착되고 재조합 단백질에 실질적으로 부착되지 않는 흡착제, 및/또는 iv) EPS에 부착되고 재조합 단백질에 실질적으로 부착되지 않는 응집제 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것인 방법.
  110. 제56항 내지 제109항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득된 소비가능한 조성물.
  111. 소비가능한 조성물을 제조하는 방법으로서,
    재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 수득하는 단계로서, 재조합 세포 부산물은 엑소폴리사카라이드(EPS) 및 이취 성분을 포함하는 것인 단계;
    복수의 재조합 세포 부산물로부터 재조합 단백질을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계로서, 가공 단계는 복수의 재조합 세포 부산물의 하나 이상의 성분에 가역적으로 부착되고 재조합 단백질에 실질적으로 부착되지 않는 응집제를 포함하는 것인 단계;
    분리된 재조합 단백질을 수집하여 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물을 수득하는 단계; 및
    단백질 생성물을 포함하는 소비가능한 조성물을 제제화하는 단계
    를 포함하는, 소비가능한 조성물을 제조하는 방법.
  112. 소비가능한 조성물을 제조하는 방법으로서,
    재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 수득하는 단계로서, 재조합 세포 부산물은 엑소폴리사카라이드(EPS) 및 이취 성분을 포함하는 것인 단계;
    복수의 재조합 세포 부산물로부터 재조합 단백질을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계로서, 가공 단계는 복수의 재조합 세포 부산물의 하나 이상의 성분에 가역적으로 부착되고 재조합 단백질에 실질적으로 부착되지 않는 흡착제를 포함하는 것인 단계;
    분리된 재조합 단백질을 수집하여 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물을 수득하는 단계; 및
    단백질 생성물을 포함하는 소비가능한 조성물을 제제화하는 단계
    를 포함하는, 소비가능한 조성물을 제조하는 방법.
  113. 소비가능한 조성물을 제조하는 방법으로서,
    재조합 단백질 및 복수의 재조합 세포 부산물을 포함하는 조성물을 수득하는 단계로서, 재조합 세포 부산물은 엑소폴리사카라이드(EPS) 및 이취 성분을 포함하는 것인 단계;
    복수의 재조합 세포 부산물로부터 재조합 단백질을 분리하는 조건 하에서 조성물을 가공하는 단계로서, 가공 단계는 재조합 단백질을 소화시키거나 EPS를 소화시키는 효소를 포함하는 것인 단계;
    분리된 재조합 단백질을 수집하여 복수의 재조합 세포 부산물의 양이 감소된 단백질 생성물을 수득하는 단계; 및
    단백질 생성물을 포함하는 소비가능한 조성물을 제제화하는 단계
    를 포함하는, 소비가능한 조성물을 제조하는 방법.
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