CN109068680A - 功能性绿豆衍生的组合物 - Google Patents

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S.马哈德万
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J.普卢克斯
B.罗施
徐萌
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Abstract

本发明提供了生成绿豆蛋白分离物的方法，所述绿豆蛋白分离物具有用于广泛食品应用的高功能性。在一些实施方案，生成所述分离物的方法包含选自以下一个或多个步骤：(a)从水溶液，例如pH值在约6.5‑10.0之间的水溶液中从绿豆蛋白来源中提取一种或多种绿豆蛋白；(b)使用以下两种方法中的至少一种从所述提取物中纯化蛋白：(i)在接近富含球蛋白级分的所述等电点的pH值，例如约5.0‑6.0之间的pH值下，从所述提取物中使蛋白沉淀；和/或(ii)使用过滤法(例如微滤法、超滤法或离子交换色谱法)从所述提取物中分级分离和浓缩蛋白；和(c)回收纯化的蛋白分离物。

Description

功能性绿豆衍生的组合物
1.技术领域
本发明涉及绿豆衍生的组合物，生成此类组合物的方法，以及由此类组合物衍生的食品。
2.发明背景
用于提取豆类蛋白分离物和浓缩物的常规方法和过程包括碱提取以及酸沉淀或超滤法(湿法)和空气分级法(干法)。通过所述这些方法生成的豆类蛋白组合物的质量直接取决于用于制备它们的操作条件。酸性、碱性或中性提取方法的应用直接影响功能特性，例如所得蛋白组合物的胶凝、发泡或乳化性质，这使得所得蛋白组合物不适合某些应用。因此，可能需改性所述蛋白组合物，以便在食品应用背景下赋予所需的性质。
基于植物的蛋白质如大豆和豌豆，作为动物蛋白替代物的使用已引起越来越多的关注，因为消费者在寻求替代传统的基于动物的产品，然而，复制功能特性同时去除异味仍然是需要解决的挑战。
因此，需要一种用于生成纯化的植物蛋白分离物的方法和组合物，所述纯化的植物蛋白分离物具有一种或多种所需的功能特性，包括复制适用于各种应用的一种或多种所需的感官特性。本发明公开了解决现有技术局限性的方法。
3.发明概要
本发明描述了生成纯化的绿豆蛋白分离物的方法和组合物。在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包含至少60重量％的绿豆蛋白含量。在一些实施方案，球蛋白型蛋白含量占所述分离物中的所述绿豆蛋白的至少50重量％。在一些实施方案，所述球蛋白型蛋白是一种与绿豆(Vigna radiata)的8S球蛋白/β伴大豆球蛋白具有至少50％同一性的蛋白质。
在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包括相对于所述绿豆蛋白的未经改性的来源，降低的氧化酶活性。在一些实施方案，绿豆蛋白分离物包括与所述绿豆蛋白的所述未经改性的来源不同的一种或多种调节的感官特性。
本发明还提供了生成绿豆蛋白分离物的方法，所述绿豆蛋白分离物具有用于广泛食品应用的高功能性。在一些实施方案，用于生成所述分离物的方法包含选自以下的一个或多个步骤：
(a)在水溶液中从绿豆蛋白来源中提取一种或多种绿豆蛋白。在一些实施方案，所述提取是在约6.5-10.0之间的pH值下进行。
(b)使用以下两种方法中的至少一种从所述提取物中纯化蛋白：
(i)在接近富含球蛋白级分的所述等电点的pH值，例如约5.0-6.0之间的pH值下，从所述提取物中沉淀蛋白；和/或
(ii)使用过滤法(例如微滤法、超滤法或离子交换色谱法)从所述提取物中分级分离和浓缩蛋白。
(c)回收纯化的蛋白分离物。
在具体实施方案中，所述提取是在约7.0+/-0.2的pH值下进行。在具体实施方案，绿豆蛋白的所述等电沉淀是在pH 5.6+/-0.2下进行。在其他具体实施方案中，绿豆蛋白的所述等电沉淀是在pH 6.0+/-0.2下进行。
本发明还公开了从绿豆蛋白来源生成可食用绿豆蛋白分离物的方法，所述方法包含：将所述绿豆蛋白来源进行分级分离过程以获得富含蛋白质的级分，其中至少50重量％的所述富含蛋白质级分包含一种或多种球蛋白型蛋白或由一种或多种球蛋白型蛋白组成；在所述可食用的绿豆蛋白分离物中减少至少一种杂质，所述至少一种杂质与变味或异味相关；和纯化所述富含蛋白质级分，以得到所述可食用的绿豆蛋白分离物，其中：至少60重量％的所述可食用蛋白分离物是绿豆蛋白，所述可食用蛋白分离物的氧化酶活性低于所述绿豆蛋白来源的相应氧化酶活性，和所述可食用蛋白分离物的感官特性不同于所述绿豆蛋白来源的相应感官特性。
根据本发明的优选方面，本发明提供了用于蛋代用品的方法和组合物，所述组合物包含由转谷氨酰胺酶改性的基于植物的蛋白分离物；其中所述组合物基本上不含蛋，和其中所述组合物包含天然蛋的一种或多种功能特性。更优选地，所述组合物提供了由0.0001％至0.0125％转谷氨酰胺酶改性的绿豆蛋白分离物，并具有显著降低活性的脂氧合酶或可氧化脂质类的其他酶。
在某些方面，本发明所述方法和组合物提供了纯化的蛋白分离物，所述分离物具有以下特征的一种或多种的调节感官特性：涩的味道或气味、豆腥的味道或气味、苦的味道或气味、烧焦的味道或气味、黄油的味道或气味、果仁的味道或气味、甜的味道或气味、酸的味道或气味、水果的味道或气味、花香的味道或气味、木质的味道或气味、泥土的味道或气味、豆腥的味道或气味、辛辣的味道或气味、金属的味道或气味、甜的味道或气味、发霉的味道或气味、青草的味道或气味、青味或青气味、油的味道或气味、醋的味道或气味、中性的味道或气味、以及温和的味道或气味。优选地，所述纯化的蛋白分离物具有调节的感官特性，例如以下一种或多种的减少或缺失：涩的味道或气味、豆腥的味道或气味、苦的味道或气味、烧焦的味道或气味、黄油的味道或气味、果仁的味道或气味、甜的味道或气味、酸的味道或气味、水果的味道或气味、花香的味道或气味、木质的味道或气味、泥土的味道或气味、豆腥的味道或气味、辛辣的味道或气味、金属的味道或气味、甜的味道或气味、发霉的味道或气味、青草的味道或气味、青味或青气味、油的味道或气味、醋的味道或气味、中性的味道或气味、以及温和的味道或气味。
所述纯化的蛋白分离物适用于各种食品应用，并已掺入例如可食用的无蛋乳液，蛋类似物，无蛋炒蛋/搅拌蛋类，无蛋糕，无蛋磅蛋糕，无蛋天使食品蛋糕，无蛋黄色蛋糕，无蛋和无乳制品的奶油干酪，无蛋面食面团，无蛋奶油冻，无蛋冰淇淋，和无乳制品乳类中。所述纯化的蛋白分离物还适合用作奶油干酪，面食面团，面食，乳类饮料或乳状饮料，包含所述乳类饮料或乳状饮料的食品，奶油冻，冰淇淋，冷冻甜品，肉类复制品(例如熟食肉类复制品；乳化挤压肉类(如香肠类、鱼饼类复制品))；蘸料类，馅料类和涂抹物类，薯片类，以及饼干类的基于植物的类似物。其他应用也适用于本发明所述的功能性绿豆蛋白分离物，前述所列是非限制性的。
4.附图简要说明
图1A描绘了根据本发明所述方法的绿豆蛋白分离的一般过程图。
图1B描绘了在所述水提取步骤中使用转谷氨酰胺酶进行蛋白分离的一般过程图。
图1C描绘了在所述纯化步骤中使用转谷氨酰胺酶进行蛋白分离的一般过程图。
图1D描绘了在所述纯化步骤中使用转谷氨酰胺酶进行干式分级分离蛋白分离的一般过程图。
图2提供了根据本发明提供的方法制备蛋白分离物的方法的一个实施方案。
图3描绘了中试规模蛋白分离的一般过程方框流程图。
图4图解地描绘了超滤的原理。对角线表示半透膜，其中水和较低分子量的溶质可通过渗透膜，而较高分子量的溶质则保留在渗余物中。
图5A图解地描绘了分别在pH 4.9、5.2、5.6和6.0下经酸沉淀后绿豆分离物的蛋白纯度。
图5B图解地描绘了分别在pH 4.9、5.2、5.6和6.0下经酸沉淀后绿豆分离物的蛋白产率。
图6A描绘了分别在pH 4.9、5.2、5.6和6.0下经酸沉淀后绿豆分离物的尺寸排阻色谱。
图6B图解地描绘了分别在pH 4.9、5.2、5.6和6.0下经酸沉淀后绿豆分离物的蛋白和非蛋白种类的量。
图7图解地描绘了分别在pH 4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0和6.2下经历酸沉淀的绿豆分离物中的总蛋白回收率。所述y轴表示从100.7克含蛋白的提取物中回收的蛋白克数。
图8A和8B图解地描绘了分别在pH值为4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0和6.2经酸沉淀后绿豆蛋白分离物中回收的总油类。y轴表示每克样品(提取物或分离物)回收的粗脂肪毫克数。图8A提供了在每种上述pH值下所得沉淀分离物和沉淀前的绿豆蛋白提取物(最左边)中所回收粗脂肪量的视图。图8B提供了在pH值为4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8和6.0所得沉淀分离物中回收的粗脂肪量的更近视图。
图9A和9B图解地描绘了分别在pH值为4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0和6.2经酸沉淀后所得绿豆蛋白分离物中回收的脂肪酸(以脂肪酸甲酯测量)的量。所测量的具体脂肪酸(从左至右)为：C14:0(肉豆蔻酸甲酯)、C15:0(十五烷酸甲酯)、C16:0(棕榈酸甲酯)、C16:1(棕榈油酸甲酯)、C17:0(十七烷酸甲酯)、C18:0(硬脂酸甲酯)、C18:1(油酸甲酯)、C18:2(亚油酸甲酯)、C18:3(甲基α亚油酸酯)、C20:0(二十碳酸二甲酯)。图9A提供了对上述每个pH值下沉淀所得的分离物进行回收得到的这些脂肪酸中每一种的量的视图，而图9B提供了较小的脂质类型的量的更近视图。
图10图解地描绘了分别在pH值为4.4、5.0、5.6和6.0下经酸沉淀后绿豆蛋白分离物的凝胶起始温度。
图11图解地描绘了分别在pH值为4.4、4.0、5.6和6.0下经酸沉淀后绿豆蛋白分离物的凝胶强度。
图12图解地描绘了分别在pH值为4.4、5.0、5.6和6.0下经酸沉淀后绿豆蛋白分离物的凝胶弹性。
图13图解地描绘了分别在pH 5.2和5.6下经酸沉淀后绿豆蛋白分离物制成的仿蛋类蛋糕的硬度、粘结性、弹性和回复性。
图14A描绘了绿豆蛋白提取物的尺寸排阻色谱。蛋白(包括8s球蛋白和11s球蛋白)和非蛋白的相对百分比如图所示。
图14B描绘了通过萃取、等电沉淀和清洗步骤获得的绿豆蛋白沉淀的尺寸排阻色谱。蛋白(包括8s球蛋白和11s球蛋白)和非蛋白的相对百分比如图所示。
图14C描绘了通过提取和等电沉淀获得的绿豆蛋白沉淀的尺寸排阻色谱。蛋白(包括8s球蛋白和11s球蛋白)和非蛋白的相对百分比如图所示。
图14D描绘了通过提取和等电沉淀所得绿豆蛋白沉淀物上清液的尺寸排阻色谱。蛋白(包括8s球蛋白和11s球蛋白)和非蛋白的相对百分比如图所示。
图14E描绘了通过萃取、等电沉淀和清洗步骤获得的绿豆蛋白沉淀的尺寸排阻色谱。蛋白(包括8s球蛋白和11s球蛋白)和非蛋白的相对百分比如图所示。
图14F描绘了通过萃取、等电沉淀和清洗步骤获得的绿豆蛋白沉淀物的上清液的尺寸排阻色谱。蛋白(包括8s球蛋白和11s球蛋白)和非蛋白的相对百分比如图所示。
图15以表格和图形形式提供了SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.12的氨基酸序列比对。
图16图解地描绘了不同纯化的蛋白分离物的变性温度曲线。
图17表示用于研究来自不同来源的纯化蛋白分离物的解折叠热力学固态差示扫描量热法曲线。
图18图解地描绘了(A)熔融温度和(B)各种纯化蛋白分离物的材料吸收的热量。
图19描绘了用于评估通过热诱导凝胶化、离心破碎后样品保留液体(水)的水结合能力测试结果。
图20示出了来自各种来源纯化蛋白分离物的凝胶化温度。
图21直观地描绘了使用蛋(A)、盐沉淀(B)和等电沉淀(C)纯化所得绿豆蛋白分离物制成的蛋糕替代品横截面。
图22图解地描绘了将(◆)盐沉淀蛋白分离物、(Δ)等电沉淀的蛋白分离物与(□)整蛋比较的振荡温度折线图。
图23图解地描绘了将(◆)盐沉淀蛋白分离物、(Δ)等电沉淀的蛋白分离物与(□)整蛋比较的振荡幅度扫描。
图24将使用主成分分析二维可视化各种蛋控制的结构特征与不同过程下制得的绿豆分离物结构特征进行比较。
图25描绘了含指定纯化绿豆蛋白浓度样品的发泡能力测试结果。
图26图解地描绘了各种绿豆蛋白分离物制剂相对于几种对比材料的溶解度。
图27图解地描绘了各种绿豆蛋白分离物制剂相对于几种对比材料的泡沫稳定性。
图28图解地描绘了各种绿豆蛋白分离物制剂相对于几种对比材料的乳液稳定性。
图29直观地描绘了用以下所得的四种液体搅拌制剂制成的蛋糕替代物横截面：(A)纯化的绿豆分离物，(B)用ι-角叉菜胶和阿拉伯树胶纯化的绿豆分离物，(C)用魔芋和黄原胶纯化的绿豆分离物，(D)用结冷胶纯化的绿豆分离物。
图30示出了(□)商业液体蛋制品、(◇)均质化的全壳蛋和用结冷胶配制的液体搅拌物中粘度与剪切速率的比较。
图31直观地描绘了用转谷氨酰胺酶处理和不用转谷氨酰胺酶处理的提取物浊度。
图32直观地描绘了与各种浓度的转谷氨酰胺酶反应的绿豆蛋白分离物。图16直观地描绘了各种形式的绿豆纯化蛋白分离物。
图33直观地描绘了在烹饪过程中用转谷氨酰胺酶反应的绿豆制备的炒蛋模拟物。
图34直观地描绘了含绿豆蛋白分离物和未用转谷氨酰胺酶预处理的炒蛋模拟物。
图35描绘了在等电沉淀后用不同水平的转谷氨酰胺酶处理的绿豆制备的上清液和沉淀的蛋白质免疫印迹图。
图36描绘了上清液的朱红染色SDS-PAGE膜和用不同水平的转谷氨酰胺酶处理的、经等电点沉淀后的绿豆制备的沉淀的图。
图37图解地描绘了在等电沉淀后用不同水平转谷氨酰胺酶反应的绿豆制备的溶液上清液中的总蛋白。
图38图解地描绘了最终蛋白分离物的近似％干产率。
图39图解地描绘了无水磷酸氢二钠(DSP)浓度对绿豆分离物凝胶结构的影响。
图40描绘了DSP浓度对绿豆分离物分散稳定性的影响。
图41描绘了使用绿豆蛋白分离物制成的液体蛋模拟物中长链六偏磷酸钠的剂量响应曲线。
图42描绘了六偏磷酸钠链长对用绿豆蛋白分离物制成的液体蛋模拟物粘度的影响(虚线标记商业液体全蛋样品的粘度)。
图43描绘了在冰箱中储存15天后长链SHMP浓度对用绿豆蛋白分离物的制成的液体蛋模拟物乳液稳定性的影响。
图44描绘了使用绿豆蛋白分离物制成的液体蛋模拟物中焦磷酸四钠的剂量响应曲线(虚线表示商业液体全蛋样品的粘度)。
图45图解地描绘了使用本发明所述绿豆蛋白分离物组合物制成的绿豆糕的结构特征分析(硬度、咀嚼性、弹性、回复性和粘结性)结果。
图46图解地描绘了与杏仁乳，一半和一半以及乳类相比的绿豆蛋白饮料系统的粒度。
图47图解地描绘了与椰奶和豆奶相比的绿豆蛋白饮料系统的乳液稳定性。
图48直观地描绘了绿豆蛋白基黄油系统。
图49直观地描绘了各种形式的绿豆纯化蛋白分离物。
图50直观地描绘了使用(A)蛋和(B)来自绿豆的蛋白提取物(19％)磅蛋糕的横截面。
图51直观地描绘了由蛋(左)、蛋白提取物(中)和重新溶解的分离物(右)制成的磅蛋糕的顶视图。
图52直观地描绘了使用蛋(左)制成的磅蛋糕与使用纯化的蛋白分离物(右)制成的磅蛋糕的对比横截面。
图53直观地描绘了使用蛋白(左)与纯化的蛋白分离物(右)制成的天使蛋糕的对比侧视图。
图54直观地描绘了图53中天使蛋糕的一部分的横截面图。
图55图解地描绘了将绿豆蛋白肉模拟物、商业鸡块/鸡条和商业鸡块模拟物比较的结构特征分析。
图56直观地描绘了绿豆蛋白肉模拟物、商业鸡块/条带和商业鸡块模拟物的图片。
图57直观地描绘了使用四种液体搅拌制剂制成的蛋糕替代品：(A)通过盐沉淀纯化的绿豆分离物；(B)通过等电点沉淀纯化的绿豆分离物；(C)纯化的绿豆和小麦蛋白分离物(50:50)；(D)纯化的绿豆和豌豆蛋白分离物(50:50)。
图58图解地描绘了图57中所示的四种液体搅拌制剂相比较的振荡温度折线图。
图59图解地描绘了图57中所示的四种液体搅拌制剂相比较的振荡幅度扫描图。
图60直观地描绘了使用(A)蛋、(B)纯化的金扁豆蛋白分离物和(C)纯化的托尔木豆蛋白(toor dal protein)分离物制成的磅蛋糕横截面。
图61A直观地描绘了绿豆蛋白分离物基的脂肪减少起酥油模型。
图61B描绘用于绿豆蛋白分离物基的脂肪减少起酥油模型制成的成品糕和糖霜模拟物。
图62A描绘在培养步骤之前的Theromomix中的未完成的非乳制品模拟物。
图62B描绘了完成的非乳制品模拟物。左边样品在没有完成步骤的情况下进行培养，而右边的样品已均质化为光滑均一的成品，且培养步骤在pH值为5时停止。
图62C描绘了完成的、压好的非乳制奶油干酪模拟物。
图63A描绘了用于挤出绿豆蛋白基的面团模拟物的染料#143。
图63B描绘了干燥后完成的绿豆蛋白基的面食模拟物。
5.具体实施方式
5.1术语
本发明使用的单数形式“一”，“一个/一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。
术语“约/大约”表示并包含指示值以及高于和低于所述值的范围。在某些实施方案，术语“约/大约”表示指定值±10％、±5％、或±1％。在某些实施方案，术语“约/大约”表示所述值的指定值±一个标准偏差。
术语“减少/降低”表示相对于参考值的指示值的减少或降低。在一些实施方案，术语“减少/降低”(包括“减小”)是指指示值相对于参考值减少或降低约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、或50％。在一些实施方案，术语“减少/降低”(包括“减小”)是指指示值相对于参考值减少或降低至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％，45％、或50％。
本发明使用的术语“蛋”包括但不限于鸡蛋，其他鸟蛋(例如鹌鹑蛋、鸭蛋、鸵鸟蛋、火鸡蛋、矮脚鸡蛋、鹅蛋)和鱼蛋如鱼籽等。典型的食物应用比较是关于鸡蛋的。
本发明使用的术语“富集的”是指一个样品中分子(例如蛋白质)的百分比量相对于参考样品中分子的百分比量的增加。譬如，相对于整个绿豆，富集某种类型的球蛋白的分离物意指，以所述分离物中总蛋白量的百分比表示的所述分离物中球蛋白的量，高于以所述整个绿豆中总蛋白量的百分比表示的整个绿豆中的所述球蛋白的蛋白量。在一些实施方案，所述富集是基于重量/重量。在一些实施方案，所述富集是指相对于所述参考值或参考量增加约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、或50％。在一些实施方案，所述富集是指相对于所述参考值或参考量增加至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、或50％。
本发明使用的“分离物的植物来源”是指整株植物物料，例如整个绿豆，或来自由所述植物制成的中间体物料，例如脱壳豆、面粉/粉状物、粉末、粗粉、磨碎的谷物类、饼状物(例如，脱脂或脱油饼状物)，或适合于本发明公开的加工技术以生成纯化的蛋白分离物的任何其他中间体物料。
术语“转谷氨酰胺酶”是指催化γ-羧酰胺基团与各种伯胺之间的所述酰基转移的酶(R-谷氨酰基-肽：胺谷氨酰转移酶)，分类为EC 2.3.2.13。其用于食品工业，以改善一些食品(如乳制品、肉类和谷物制品)的质地。其可从细菌来源、真菌、霉菌、鱼、哺乳动物和植物中分离得到。
关于特定组分(例如蛋白质含量)的术语“大多数”或“主要地”，是指所述组分具有所述参考批次、工艺物料流、食品配方或组合物的至少50重量％。
除非另有说明，否则成分的百分比(％)是指通常基于干重的总重量％，除非另有说明。
术语“纯化的蛋白分离物”，“蛋白分离物”，“分离物”，“沉淀/物”，“蛋白提取物”，“分离的蛋白”或“分离的多肽”是指蛋白质级分，借助其来源或衍生来源的蛋白质或多肽：(1)与其天然状态下伴随的天然相关组分无关，(2)以自然界中未发现的纯度存在，其中纯度可根据其他细胞物质的存在来判断(例如，不含来自同一物种的其他蛋白)，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)在自然界中不存在(例如，其是在自然界中发现的多肽片段，或其包括自然界中未发现的氨基酸类似物或衍生物，或除标准肽键以外的连接)。一种或多种蛋白质或级分可部分地从残余源材料和/或非固体蛋白质材料中去除或分离，因此是非天然存在的并且通常不存在于自然界中。还可使用本领域已知的和本发明所述的蛋白纯化技术，通过分离使多肽或蛋白基本上不含天然相关组分。在与其天然来源的细胞不同的细胞体系中化学合成或合成的多肽将与其天然相关组分“分离”。如此定义，“分离的”不一定要求如此描述的蛋白质、多肽、肽或寡肽已从其天然环境中物理去除。
多肽的序列同源性，其也称为序列同一性百分比，通常使用序列分析软件进行测定。参见，例如，遗传计算机组(Genetics Computer Group，GCG)的序列分析软件包，威斯康星大学生物技术中心，大学街910号，麦迪逊，威斯康星大学53705(UniversityofWisconsin Biotechnology Center,910University Avenue,Madison,Wis.53705)。蛋白质分析软件使用分配给各种置换、缺失和其他修饰(包括保守氨基酸置换)的同源性测定来匹配相似序列。譬如，GCG包含诸如“空位(Gap)”和“最佳配合(Bestfit)”的程序，其可与默认参数一同用于确定密切相关的多肽之间的序列同源性或序列同一性，例如来自不同生物种类的同源多肽或者野生型蛋白质与其突变蛋白质之间的序列同源性或序列同一性。参见，例如，GCG版本6.1。
将特定多肽序列与含有来自不同生物体的大量序列的数据库进行比较时的优选算法是计算机程序BLAST(Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)；Gish andStates,Nature Genet.3:266-272(1993)；Madden et al.,Meth.Enzymol.266:131-141(1996)；Altschul et al.,Nucleic Acids Res.25:3389-3402(1997)；Zhang andMadden,Genome Res.7:649-656(1997))，尤其是blastp或tblastn(Altschul et al.,NucleicAcids Res.25:3389-3402(1997))。
BLASTp的优选参数是：期望值：10(默认值)；筛选：seg(默认值)；打开空位成本：11(默认值)；延长空位成本：1(默认值)；最大联配：100(默认值)；字号：11(默认值)；描述数量：100(默认值)；罚分矩阵：BLOWSUM62。
比较同源性的多肽序列的长度通常为至少约16个氨基酸残基，通常至少约20个残基，更通常至少约24个残基，通常至少约28个残基，和优选大于约35个残基。当检索含有来自大量不同生物体的序列的数据库时，优选比较氨基酸序列。使用氨基酸序列的数据库检索可通过本领域已知的除blastp之外的算法来测定。譬如，可使用GCAS版本6.1中的程序FASTA来比较多肽序列。FASTA提供查询和检索序列之间最佳重叠区域的比对和百分比序列同一性。Pearson,Methods Enzymol.183:63-98(1990)(通过引用并入本文)。譬如，氨基酸序列之间的序列同一性百分比可使用FASTA以其默认参数(字号为2和PAM250打分矩阵)来确定，如GCG版本6.1中所提供的，其通过引用并入本文。
5.2绿豆蛋白分离物组合物
本发明提供一种或多种可食用绿豆蛋白分离物，其包含一种或多种所需食品品质，所述食品品质包括但不限于高蛋白含量，高蛋白纯度，小分子量非蛋白物质(包括单糖和二糖)的减少保留，油脂的减少保留，优异的结构构建特性比如高凝胶强度和凝胶弹性，优良的感官特性，以及高功能8s球蛋白/β伴大豆球蛋白的选择性富集。
在优选实施方案中，本发明提供的所述蛋白分离物衍生自绿豆。在一些实施方案，所述绿豆是绿豆(Vigna radiata)。在本发明的各个方面，本发明所述的纯化的绿豆蛋白分离物可从绿豆蛋白的任何来源生成，包括绿豆(V.radiata)的任何品种或栽培品种。譬如，所述蛋白分离物可直接由整个植物物料(例如整个绿豆)，或由所述植物制成的中间体物料，例如脱壳豆、粉状物、粉末、粗粉、磨碎的谷物类、饼状物(例如，脱脂或脱油的饼状物)，或适合于本发明公开的加工技术以生成纯化的蛋白分离物的任何其他中间体物料制得。在一些实施方案，所述植物蛋白的来源可以是两种或更多种中间体物料的混合物。本发明提供的候选中间体物料的实例并非限制性的。
在优选实施方案中，本发明提供了主要包含基于蛋白的级分的绿豆蛋白分离物组合物。在优选实施方案中，所述蛋白级分是50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％的所述绿豆分离物。在优选实施方案中，至少60重量％的所述纯化的分离物是蛋白级分。在优选实施方案中，至少65重量％的所述纯化的分离物是蛋白级分。在优选实施方案中，至少70重量％的所述纯化的分离物是蛋白级分。在一些实施方案，至少75重量％的所述纯化的分离物是蛋白级分。在一些实施方案，至少80重量％的所述纯化的分离物是蛋白级分。在一些实施方案，高达约95％重量的所述纯化的分离物是蛋白级分。
优选的实施方案包括来自绿豆的高纯度蛋白分离物，其包含至少50重量％的蛋白，所述蛋白由至少一种球蛋白类型蛋白组成或包含至少一种球蛋白类型蛋白。虽然不希望受特定理论的束缚，但据信所述球蛋白级分提供了功能性的基础。因此，相对于整个绿豆，所述纯化的蛋白分离物富集于球蛋白中。在一些实施方案，所述球蛋白样蛋白是绿豆8s球蛋白/β-伴大豆球蛋白。在一些实施方案，至少约10重量％、15重量％、20重量％、25重量％、30重量％、35重量％、40重量％、45重量％、50重量％、55重量％、60重量％、65重量％、70重量％、75重量％、80重量％、85重量％或大于85重量％的所述分离物的蛋白级分由绿豆8s球蛋白/β-伴大豆球蛋白组成或包含绿豆8s球蛋白/β-伴大豆球蛋白。在其他实施方案，约60重量％至80重量％、65重量％至85重量％、70重量％至90重量％或75重量％至95重量％的所述分离物的蛋白级分由绿豆8s球蛋白/β-伴大豆球蛋白组成或包含绿豆8s球蛋白/β-伴大豆球蛋白。
在一些实施方案，纯化的蛋白分离物浓缩为100-200g/L或更高。
在一些实施方案，相对于整个绿豆或绿豆粉，减少了所述绿豆分离组合物中11s球蛋白的量。在一些实施方案，所述11s球蛋白的量小于所述分离物的所述蛋白级分的10％、8％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。
在一些实施方案，所述组合物中的蛋白包含非变性蛋白。在其他实施方案，所述组合物中的蛋白包含变性蛋白。
在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包含衍生自所述分离物的所述植物来源的约1％至10％，2％至9％，3％至8％，或4％至6％的碳水化合物(例如，淀粉、多糖类、纤维)。在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包含衍生自所述分离物的所述植物来源的小于约10％、9％、8％、7％、6％或5％的碳水化合物。在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包含衍生自所述分离物的所述植物来源的约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或约1％的碳水化合物。在一些实施方案，实施本发明提供的方法导致生成绿豆蛋白分离物，其中最初在所述绿豆蛋白来源中发现的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的碳水化合物的含量已降低。
在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包含衍生自所述分离物的所述植物来源的约1％至10％，2％至9％，3％至8％，或4％至6％的灰分。在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包含衍生自所述分离物的所述植物来源的至少约10％、9％、8％、7％、6％或5％的灰分。在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包含衍生自所述分离物的所述植物来源的约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或约1％的灰分。在一些实施方案，实施本发明提供的方法导致生成绿豆蛋白分离物，其中最初在所述绿豆蛋白来源中发现的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的灰分已降低。
在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包含衍生自所述分离物的所述植物来源的约1％至10％，2％至9％，3％至8％，或4％至6％的脂肪。在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包含衍生自所述分离物的所述植物来源的至少约10％、9％、8％、7％、6％或5％的脂肪。在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包含衍生自所述分离物的所述植物来源的约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或约1％的脂肪。在一些实施方案，实施本发明提供的方法导致生成绿豆蛋白分离物，其中最初在所述绿豆蛋白来源中发现的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的脂肪已降低。
在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包含衍生自所述分离物的所述植物来源的约1％至10％的水分。在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包含衍生自所述分离物的所述植物来源的少于约10％、9％、8％、7％、6％或5％的水分。在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包含衍生自所述分离物的所述植物来源的约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或约1％的水分。
在具体实施方案中，所述绿豆蛋白分离物包含衍生自所述分离物的所述植物来源的小于10％的碳水化合物，小于8％的灰分，小于5％的脂肪，和小于7％的水分。
5.2.1所述分离物组合物的绿豆蛋白
豆科植物含有许多类型的蛋白，其中两种是球蛋白类和白蛋白类。球蛋白类和白蛋白类均是可溶性蛋白，占绿豆中总蛋白的大部分。球蛋白类可进一步分类为豆球蛋白类(legumins)、豌豆球蛋白类(vicilins)和convicilins。在5,000种或已知的绿豆(V.radiata)种类中，蛋白含量范围为约20-30％。
构成本发明提供的分离物的所述蛋白级分的大多数(以重量计)的球蛋白型蛋白可全部是相同类型的球蛋白型蛋白，或者其可以包含多于一种类型的球蛋白型蛋白。譬如，所述球蛋白型蛋白可包括7S球蛋白、8S球蛋白和/或11S球蛋白。在一些实施方案，所述球蛋白型蛋白主要是8S球蛋白，即球蛋白型蛋白重量的大部分是8S球蛋白。所述球蛋白型蛋白还可以或可选地包括与7S、8S和/或11S球蛋白同源的蛋白。
在一些实施方案，本发明提供的绿豆蛋白分离物的球蛋白型蛋白是β-伴大豆球蛋白。在一些实施方案，所述β-伴大豆球蛋白与SEQ ID NO.1至少50％相同。在一些实施方案，所述β-伴大豆球蛋白与SEQ ID NO.1至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、大于90％、或大于95％相同。
在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包含具有与来自绿豆的一种或多种球蛋白型蛋白(例如7S、8S、11S)至少75％同一性的序列的蛋白，其中相对于在所述分离物的所述植物来源中发现的蛋白的量，所述蛋白富集于所述分离物中。在一些实施方案，所述富集的蛋白与来自绿豆的一种或多种球蛋白型蛋白(例如7S、8S、11S)具有至少50％、60、70％、80％、85％、90％、95％、98％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％的同一性或甚至更高的同一性。
在一些实施方案，本发明提供的富集绿豆蛋白分离物包含至少一种蛋白质，所述蛋白质包含具有与选自序列组中序列至少50％、60％、70％、80％、90％或95％或更高同一性的氨基酸序列，所述序列组的序列对应于以下NCBI登录号：XP_014524354(SEQ ID NO:1)、NP_001304229(SEQ ID NO:2)、XP_014523938(SEQ ID NO:3)、NP_001304202(SEQ IDNO:4)、NP_001304231(SEQ ID NO:5)、XP_014523923(SEQ ID NO:6)、XP_014507363(SEQ IDNO:7)、XP_014492536(SEQ ID NO:8)、XP_014521758(SEQ ID NO:9)、XP_014515669(SEQ IDNO:10)、XP_014523936(SEQ IDNO:11)、和XP_014524353(SEQ ID NO:12)。在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包含至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种富集的蛋白质，其包含具有与选自序列组中序列至少50％、60％、70％、80％、90％或95％或更高的同一性的氨基酸序列，所述序列组的序列对应于以下NCBI登录号：XP_014524354(SEQ IDNO:1)、NP_001304229(SEQ ID NO:2)、XP_014523938(SEQ ID NO:3)、NP_001304202(SEQ IDNO:4)、NP_001304231(SEQ ID NO:5)、XP_014523923(SEQ ID NO:6)、XP_014507363(SEQ IDNO:7)、XP_014492536(SEQ ID NO:8)、XP_014521758(SEQ ID NO:9)、XP_014515669(SEQ IDNO:10)、XP_014523936(SEQ ID NO:11)、和XP_014524353(SEQ IDNO:12)。
在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包含具有与SEQ ID NO:1至少90％同一性的蛋白质。在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包含具有与SEQ ID NO:1至少90％同一性的蛋白质，其量为分离物总蛋白质的至少1％。在一些实施方案，具有与SEQ IDNO:1至少90％同一性的蛋白质的所述量是分离物的至少5％、10％、15％或20％。在一些实施方案，相对于在所述分离物的所述植物来源中发现的所述蛋白质的所述量，所述绿豆蛋白分离物富集具有与SEQ ID NO:1至少90％同一性的蛋白质。在一些实施方案，所述富集的蛋白质富集至少5％、10％、15％、20％或大于20％。在任何前述实施方案中，所述绿豆蛋白分离物可包含具有与SEQ ID NO:1至少95％同一性的蛋白质。
在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包含具有与SEQ ID NO:2至少90％同一性的蛋白质。在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包含具有与SEQ ID NO:2至少90％同一性的蛋白质，其量为分离物总蛋白质的至少1％。在一些实施方案，所述具有与SEQ ID NO:2至少90％同一性的蛋白质的量是分离物的至少5％、10％、15％或20％。在一些实施方案，相对于在分离物植物来源中发现的蛋白质的量，所述绿豆蛋白分离物富集具有与SEQ IDNO:2至少90％同一性的蛋白质。在一些实施方案，所述富集的蛋白质富集至少5％、10％、15％、20％或大于20％。在任何前述实施方案中，所述绿豆蛋白分离物可包含具有与SEQ IDNO:2至少95％同一性的蛋白质。
在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包含具有与SEQ ID NO:3至少90％同一性的蛋白质。在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包含具有与SEQ ID NO:3至少90％同一性的蛋白质，其量为分离物总蛋白质的至少1％。在一些实施方案，所述具有与SEQ ID NO:3至少90％同一性的蛋白质的量是分离物的至少5％、10％、15％或20％。在一些实施方案，相对于分离物植物来源中发现的蛋白质的量，所述绿豆蛋白分离物富集具有与SEQ IDNO:3至少90％同一性的蛋白质。在一些实施方案，所述富集的蛋白质富集至少5％、10％、15％、20％或大于20％。在任何前述实施方案中，所述绿豆蛋白分离物可包含具有与SEQ ID NO:3至少95％同一性的蛋白质。
在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包含具有与SEQ ID NO:4至少90％同一性的蛋白质。在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包含具有与SEQ ID NO:4至少90％同一性的蛋白质，其量为分离物总蛋白质的至少1％。在一些实施方案，所述具有与SEQ ID NO:4至少90％同一性的蛋白质的量是分离物的至少5％、10％、15％或20％。在一些实施方案，相对于分离物植物来源中发现的蛋白质的量，所述绿豆蛋白分离物富集具有与SEQ IDNO:4至少90％同一性的蛋白质。在一些实施方案，所述富集的蛋白质富集至少5％、10％、15％、20％或大于20％。在任何前述实施方案中，所述绿豆蛋白分离物可包含具有与SEQ ID NO:4至少95％同一性的蛋白质。
在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包含与SEQ ID NO：5具有至少90％同一性的蛋白。在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包含与SEQ IDNO：5具有至少90％同一性的蛋白，其量为所述分离物总蛋白的至少1％。在一些实施方案，具有与SEQ ID NO:5至少90％同一性的蛋白质的量是分离物的至少5％、10％、15％或20％。在一些实施方案，相对于在所述分离物的所述植物来源中发现的蛋白质的量，所述绿豆蛋白分离物富含/富集与SEQ IDNO：5具有至少90％同一性的蛋白。在一些实施方案，所述富集的蛋白富含至少5％、10％、15％、20％或大于20％。在任何前述实施方案中，所述绿豆蛋白分离物可包含与SEQ IDNO：5具有至少95％同一性的蛋白。
在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包含与SEQ ID NO：6具有至少90％同一性的蛋白。在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包含与SEQ IDNO：6具有至少90％同一性的蛋白，其量为所述分离物总蛋白质的至少1％。在一些实施方案，具有与SEQ IDNO:6至少90％同一性的蛋白质的量是分离物的至少5％、10％、15％或20％。在一些实施方案，相对于在所述分离物的所述植物来源中发现的蛋白质的量，所述绿豆蛋白分离物富含/富集与SEQID NO：6具有至少90％同一性的蛋白。在一些实施方案，所述富集的蛋白富含至少5％、10％、15％、20％或大于20％。在任何前述实施方案中，所述绿豆蛋白分离物可包含与SEQID NO：6具有至少95％同一性的蛋白。
在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包含与SEQ ID NO：7具有至少90％同一性的蛋白。在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包含与SEQ IDNO：7具有至少90％同一性的蛋白，其量为所述分离物总蛋白质的至少1％。在一些实施方案，具有与SEQ IDNO:7至少90％同一性的蛋白质的量是分离物的至少5％、10％、15％或20％。在一些实施方案，相对于在所述分离物的所述植物来源中发现的蛋白质的量，所述绿豆蛋白分离物富含/富集与SEQID NO：7具有至少90％同一性的蛋白。在一些实施方案，所述富集的蛋白富含至少5％、10％、15％、20％或大于20％。在任何前述实施方案中，所述绿豆蛋白分离物可包含与SEQID NO：7具有至少95％同一性的蛋白。
在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包含与SEQ ID NO：8具有至少90％同一性的蛋白。在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包含与SEQ IDNO：8具有至少90％同一性的蛋白，其量为所述分离物总蛋白质的至少1％。在一些实施方案，具有与SEQ IDNO:8至少90％同一性的蛋白质的量是分离物的至少5％、10％、15％或20％。在一些实施方案，相对于在所述分离物的所述植物来源中发现的蛋白质的量，所述绿豆蛋白分离物富含/富集与SEQID NO：8具有至少90％同一性的蛋白。在一些实施方案，所述富集的蛋白富含至少5％、10％、15％、20％或大于20％。在任何前述实施方案中，所述绿豆蛋白分离物可包含与SEQID NO：8具有至少95％同一性的蛋白。
在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包含与SEQ ID NO：9具有至少90％同一性的蛋白。在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包含与SEQ IDNO：9具有至少90％同一性的蛋白，其量为所述分离物总蛋白质的至少1％。在一些实施方案，具有与SEQ IDNO:9至少90％同一性的蛋白质的量是分离物的至少5％、10％、15％或20％。在一些实施方案，相对于在所述分离物的所述植物来源中发现的蛋白质的量，所述绿豆蛋白分离物富含/富集与SEQID NO：9具有至少90％同一性的蛋白。在一些实施方案，所述富集的蛋白富含至少5％、10％、15％、20％或大于20％。在任何前述实施方案中，所述绿豆蛋白分离物可包含与SEQID NO：9具有至少95％同一性的蛋白。
在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包含与SEQ ID NO：10具有至少90％同一性的蛋白。在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包含与SEQ IDNO：10具有至少90％同一性的蛋白，其量为所述分离物总蛋白质的至少1％。在一些实施方案，具有与SEQ ID NO:10至少90％同一性的蛋白质的量是分离物的至少5％、10％、15％或20％。在一些实施方案，相对于在所述分离物的所述植物来源中发现的蛋白质的量，所述绿豆蛋白分离物富含/富集与SEQIDNO：0具有至少90％同一性的蛋白。在一些实施方案，所述富集的蛋白富含至少5％、10％、15％、20％或大于20％。在任何前述实施方案中，所述绿豆蛋白分离物可包含与SEQ IDNO：10具有至少95％同一性的蛋白。
在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包含与SEQ ID NO：11具有至少90％同一性的蛋白。在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包含与SEQ IDNO：11具有至少90％同一性的蛋白，其量为所述分离物总蛋白质的至少1％。在一些实施方案，具有与SEQ ID NO:11至少90％同一性的蛋白质的量是分离物的至少5％、10％、15％或20％。在一些实施方案，相对于在所述分离物的所述植物来源中发现的蛋白质的量，所述绿豆蛋白分离物富含/富集与SEQIDNO：11具有至少90％同一性的蛋白。在一些实施方案，所述富集的蛋白富含至少5％、10％、15％、20％或大于20％。在任何前述实施方案中，所述绿豆蛋白分离物可包含与SEQIDNO：11具有至少95％同一性的蛋白。
在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包含与SEQ ID NO：12具有至少90％同一性的蛋白。在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物包含与SEQ IDNO：12具有至少90％同一性的蛋白，其量为所述分离物总蛋白质的至少1％。在一些实施方案，具有与SEQ ID NO:12至少90％同一性的蛋白质的量是分离物的至少5％、10％、15％或20％。在一些实施方案，相对于在所述分离物的所述植物来源中发现的蛋白质的量，所述绿豆蛋白分离物富含/富集与SEQIDNO：12具有至少90％同一性的蛋白。在一些实施方案，所述富集的蛋白富含至少5％、10％、15％、20％或大于20％。在任何前述实施方案中，所述绿豆蛋白分离物可包含与SEQIDNO：12具有至少95％同一性的蛋白。
根据其他实施方案，本发明提供了包含上述蛋白质片段的纯化蛋白分离物。所述这些片段优选包含至少20个连续氨基酸，更优选至少25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或甚至更多个连续氨基酸。
5.2.2降低过敏原含量
在一些实施方案，本发明提供的所述绿豆蛋白分离物具有降低的过敏原含量。在一些实施方案，所述降低的过敏原含量与分离物植物来源的过敏原含量有关。所述绿豆蛋白分离物或包含所述蛋白分离物的组合物可以是不含动物成分的、不含乳制品的、不含大豆的和不含谷蛋白的。通常对蛋类过敏的受试者可避免出现如荨麻疹或皮疹、肿胀、喘息、胃痛、痉挛、腹泻、呕吐、头晕甚至过敏反应等的不良免疫反应。进一步地，所述纯化的蛋白分离物或包含所述蛋白分离物的组合物可能不会引发对乳、蛋、大豆和小麦过敏原过敏的受试者的过敏反应。因此，在一些实施方案，所述蛋白分离物基本上不含过敏原。在一些实施方案，如Vig r 1、Vig r 2、Vig r4和Vig r 6的蛋白质也可去除。在具体实施方案中，所述绿豆蛋白分离物具有降低的(相对于所述分离物的所述植物来源)或不可检测量的蛋白质，所述蛋白质包含与发病相关的蛋白质(PR-10)，其具有至少50％、60％、70％、80％、90％或95％同一性或更高的氨基酸序列，所述发病相关蛋白质对应于登录号AAX19889.1(SEQID NO:13)。
5.2.3减少抗营养因素
膳食抗营养因子是可对蛋白质的消化率、氨基酸的生物利用度和食物的蛋白质质量生成不利影响的化学物质(Gilani etal.,2012)。在一些实施方案，本发明提供的所述绿豆蛋白分离物具有减少量的抗营养因子。在一些实施方案，所述减少量的抗营养因子是相对于所述分离物的所述植物来源的过敏原含量。在一些实施方案，所述降低的抗营养因子选自单宁、植酸、血凝素(凝集素)、多酚、胰蛋白酶抑制剂、α-淀粉酶抑制剂、凝集素和蛋白酶抑制剂。在具体实施方案中，所述绿豆蛋白分离物具有降低的(相对于所述分离物的所述植物来源)或不可检测量的蛋白质，其包含具有与凝集素蛋白至少50％、60％、70％、80％、90％或95％或更高同一性的氨基酸序列，所述凝集素蛋白对应于登录号XP_014512565(SEQID NO:14)。在另一个具体实施方案中，所述绿豆蛋白分离物具有降低的(相对于所述分离物的所述植物来源)或不可检测量的蛋白质，其包含具有与蛋白酶至少50％、60％、70％、80％、90％或95％或更高同一性的氨基酸序列，所述蛋白酶对应于登录号的XP_014505181(SEQ ID NO:15)。
5.2.4减少环境污染物
有利地，本发明提供的生产绿豆蛋白分离物的方法生成具有一种或多种减少环境污染物的食品安全组合物(相对于所述分离物的所述植物来源)。在优选的实施方案中，环境污染物不含所述绿豆蛋白分离物，低于0.1ppm的检测水平，或以不具有毒理学意义的水平存在。在一些实施方案，所述减少的环境污染物是农药残留物。在一些实施方案，所述农药残留物选自由以下成员组成的组：氯化农药，包括甲草胺、艾氏剂、α-BHC、α-氯丹、β-BHC、DDD、DDE、DDT、δ-BHC、狄氏剂、硫丹I、硫丹II、硫丹硫酸盐、异狄氏剂、异狄氏醛、γ-BHC、γ-氯丹、七氯、七氯环氧化物、甲氧基氯和氯菊酯；有机磷农药，包括谷硫磷(azinophosmethyl)、三硫憐(carbophenothion)、毒虫畏(chlorfenvinphos)、甲基毒死蜱(chlorpyrifos methy)、二嗪农、敌敌畏、毒死蜱、(dursban)、地虫磷(dyfonate)、乙硫磷(ethion)、杀螟松、马拉硫磷、杀扑磷(methidathion)、甲基对硫磷、对硫磷、伏杀硫磷(phosalone)和甲基嘧啶磷(pirimiphos methyl)。
在其他实施方案，所述减少的环境污染物选自二恶英和多氯联苯(PCB)类的残余物。在其他实施方案中，所述减少的环境污染物是霉菌毒素(mycotoxin)。在一些实施方案，所述霉菌毒素选自黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和赭曲霉毒素A。
5.3生成绿豆蛋白分离物的方法
本发明还提供了生成绿豆蛋白分离物的方法，所述绿豆蛋白分离物具有用于广泛食品应用的高功能性。在一些实施方案，生成所述分离物的方法包含选自以下的一个或多个步骤：
(a)从水溶液中的绿豆蛋白来源中提取一种或多种绿豆蛋白。在一些实施方案，所述提取是在约6.5-10.0之间的pH值下进行。
(b)使用以下两种方法中的至少一种从所述提取物中纯化蛋白：
(i)在接近富含球蛋白级分的所述等电点的pH值，例如约5.0-6.0之间的pH值下，从所述提取物中使蛋白沉淀；和/或
(ii)使用过滤法(例如微滤法、超滤法或离子交换色谱法)从所述提取物中分级分离和浓缩蛋白。
(c)回收纯化的蛋白分离物。
在优选实施方案中，本发明提供的方法生成包含一种或多种以下特征的绿豆蛋白分离物：蛋白含量为至少60重量％；球蛋白型蛋白含量为所述蛋白含量的至少50重量％；相对于所述绿豆蛋白的未经改性的来源，降低的氧化酶活性；与所述绿豆蛋白的所述未经改性的来源不同的一种或多种调节的感官特性。
在优选实施方案中，所述绿豆蛋白分离物是使用一系列机械方法来生成，采用用作pH调节剂的唯一化学物质，例如氢氧化钠和柠檬酸、以及乙二胺四乙酸(EDTA)，以防止可影响所述分离物味道的脂质氧化活性。
5.3.1脱壳和研磨
尽管本发明提供的绿豆蛋白分离物可由任何合适的绿豆蛋白来源制得，其中所述起始物料是整个植物物料，例如整个绿豆，本发明提供的方法的第一步包括使所述原料来源脱壳。在一些此类实施方案中，可在点蚀、浸泡和干燥的一个或多个步骤中使原始绿豆脱壳，以去除种皮(果壳)和果皮(麸皮)。然后将去壳的所述绿豆研磨以生成具有明确粒度分布的粉状物/面粉。在一些实施方案，所述粒度分布小于1000、900、800、700、600、500、400、300、200或100μm。在具体实施方案中，所述粒度分布小于300μm，以在提取步骤中提高蛋白的生成速率和产率。所用的研磨机类型可包括锤子、销、刀、毛刺和空气分级研磨机中的一种或组合。
在可行的情况下，可认为将所得粉状物进行空气分级对于加速蛋白提取过程和提高整个过程的效率是必要的。所采用的方法是使用细研磨机，例如空气分级研磨机，确保将所述绿豆研磨至通常小于45μm的粒度。然后将所得粉状物通过空气分级机，将所述粉状物分成粗粒部分和细粒部分。使所述粉状物通过空气分级机的行为旨在将粉状物中的大部分可用蛋白浓缩成所述粉状物总质量的较小部分。典型的细粒部分(高蛋白质)产率可以是10-50％。细粒部分的粒度小于20μm；然而，这可能受到原始绿豆的生长季节和区域的影响。高蛋白级分通常含有原始样品中150-220％的蛋白。所得的富含淀粉的副产物流也变得有价值，并且也具有可行的、可销售的利益。
5.3.2提取
在优选实施方案中，所述方法包括提取步骤。在所述提取步骤的一些实施方案中，将中间体原料(例如绿豆粉)与水溶液混合以形成浆体。在一些实施方案，所述水溶液是水，例如软水。所述水提取可包括生成水溶液，所述水溶液包含1份所述植物蛋白来源(例如粉状物)和约例如3至15份水提取溶液。在其他实施方案，每份植物蛋白来源使用5至10体积的水提取溶液。水提取溶液与粉状物的其他有用比例包括1:1、2:1、4:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1，或者1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15。
优选地，所述水提取是在所需温度下进行，例如在冷却的混合罐中在约2-10℃下进行以形成浆体。在一些实施方案，所述混合是在中等至高剪切下进行。在一些实施方案，将食品级消泡剂(例如，KFO 402聚乙二醇)添加至所述浆体中以减少所述混合过程中的起泡。在其他实施方案中，在提取过程中不使用消泡剂。
可采用食品级50％氢氧化钠溶液调节所述浆体的pH值，以达到所需提取的pH值，以使目标蛋白溶解至水溶液中。在一些实施方案，所述提取是在约6.5-10.0之间的pH值下进行。在一些实施方案，所述提取是在约pH 5.5-pH 9、pH 6.6-pH 8.5或更优选pH 6.5-pH8的pH值下进行。在具体实施方案中，所述提取是在约6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、或10.0的pH值下进行。在具体实施方案中，所述提取是在约7.0的pH值下进行。
提取后，将所述溶解的蛋白提取物与所述浆体分离，例如，在由滗析器和圆盘堆叠式离心机组成的固/液分离单元中进行分离。将所述提取物在低温下，优选在3-10℃之间离心。收集所述提取物并将所得沉淀重新悬浮，优选以3：1的水/粉状物重新悬浮。再次调节pH值并离心。将两次提取物合并，并使用尼龙网过滤。
5.3.3木炭处理
任选地，可对所述蛋白提取物进行碳吸附步骤以从所述蛋白提取中除去非蛋白、异味组分和其他纤维状固体/固形物。此碳吸附步骤生成澄清的蛋白提取物。在碳吸附步骤的一个实施方案中，然后将所述蛋白提取物通过食品级粒状炭填充的环形篮柱(<5％w/w木炭/蛋白提取物比率)在4℃至8℃下送出。以下实施例1中还提供了示例性碳吸附方案。
5.3.4酸沉淀
在一些实施方案，在提取和任选的碳吸附之后，将所述澄清的蛋白提取物用食品安全的酸性溶液酸化以在冷却条件(例如，2℃至8℃)下达到其等电点。在此种条件下，所述目标蛋白沉淀析出并与水溶液分离。在一些实施方案，将所述水溶液的pH值调节至富含蛋白级分中的一种或多种球蛋白型蛋白中的至少一种的等电点，例如绿豆8s/β伴大豆球蛋白。在一些实施方案，在所述调节步骤之前，从包含蛋白提取物的水溶液调节pH值，所述蛋白提取物具有约6.5-10.0的初始pH值。在一些实施方案，将所述pH值调节至约5.0至6.5。在一些实施方案，将所述pH值调节至约5.2-6.5，5.3至6.5，5.4至6.5，5.5至6.5，或5.6至6.5。在一些实施方案，将所述pH值调节至约5.2-6.0，5.3至6.0，5.4至6.0，5.5至6.0，或5.6至6.0。在某些实施方案，将所述pH值调节至约pH 5.4-5.8。在一些实施方案，将所述pH值调节至约5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1或6.2。
在本发明提供方法的优选实施方案中，调节所述pH以达到约pH 5.6至pH 6.0的范围，实现所需绿豆蛋白的沉淀。不受理论束缚，据信在约pH 5.6至pH 6.0的范围内进行等电沉淀，生成优异的绿豆蛋白分离物，其具有一种或多种优良品质，所述品质选自蛋白质产率、蛋白质纯度、小分子量非蛋白类(包括单糖和二糖)的降低保留、油类和脂类的降低保留、如高凝胶强度和凝胶弹性结构构建特性、卓越的感官特性、以及高功能8s球蛋白/β伴大豆球蛋白的选择性富集。通过本发明提供的方法，所制得的绿豆蛋白分离物的这些出乎意料的优异特征，如实施例6和8中所述。如以下实施例6中所述结果所示，相比于在pH值低于5.6下进行酸沉淀所得绿豆蛋白分离物，在pH值为5.6至pH6.0的范围内进行酸沉淀所得绿豆蛋白分离物，在蛋白质回收率(与小分子的回收相比)、胶凝起始温度、凝胶强度、凝胶弹性和感官特性上，具有优良的品质特性。与相比，在pH值范围约为5.2至5.8内进行酸沉淀所得绿豆蛋白分离物，相比于在所述范围之外进行酸沉淀所得绿豆蛋白分离物，也具有低得多的脂质保留。
用于诱导蛋白沉淀析出的合适的食品级酸包括但不限于苹果酸、乳酸、盐酸和柠檬酸。在具体实施方案中，所述沉淀步骤是用20％食品级柠檬酸溶液进行。在其他实施方案，所述沉淀步骤是用40％食品级柠檬酸溶液进行。
在一些实施方案，除了所述pH调节之外，可将EDTA(例如2mM食品级EDTA)添加至所述沉淀溶液中以抑制可能生成异味化合物的脂质氧化。
在另一替代实施方案中，所述沉淀步骤包括在pH 5.6下的等电沉淀与低温沉淀(在1-4℃下)组合/结合，其中将所述pH值调节至5.4-5.8。
在另一替代实施方案中，在高流速下的低离子强度沉淀与低温沉淀(在1-4℃下)组合/结合。在一些此类实施方案中，滤液的快速稀释在冷的(1-4℃)0.3％NaCl中以1体积上清液与3体积冷的0.3％NaCl的比例进行。附加的再悬浮和均质化步骤确保生成所需的蛋白分离物。
在一些实施方案，然后将沉淀析出的蛋白浆体从经pH调节的水溶液中移出并送至固/液分离装置(例如，一个圆盘堆叠式离心机)中。在所述方法的一些实施方案中，加入0.3％(w/w)食品级氯化钠进行分离，在重相中回收蛋白质凝乳。在优选实施方案中，在冷却条件(2至8℃)下用4体积的软水清洗蛋白质凝乳，除去最终的残余杂质，例如纤维状固形物类、盐类和碳水化合物类。
5.3.5过滤
在所述方法的一些实施方案中，过滤用作酸沉淀的替代或添加步骤。不受理论束缚，据信虽然蛋白的酸沉淀有助于去除小分子，但可采用替代方法例如超滤法(UF)来避免沉淀/蛋白聚集事件。因此，在一些实施方案，纯化所述富含蛋白的级分以得到绿豆蛋白分离物包括使用至少一种选择性膜进行过滤、微滤或超滤程序。下述实施例34中提供了示例性方式。
5.3.6巴斯德氏杀菌(巴氏杀菌/巴氏灭菌，Pasteurization)
在一些实施方案，由酸沉淀和分离生成的经清洗的蛋白质凝乳溶液是在高温/短时巴氏杀菌步骤中进行巴氏消毒，以杀死可能存在于所述溶液中的任何致病细菌。在具体实施方案中，巴氏杀菌是在74℃下进行20至23秒。在需要干燥分离物的特定实施方案中，将巴氏杀菌的溶液通过喷雾干燥器以除去任何残留的水含量。典型的喷雾干燥条件包括入口温度为170℃，出口温度为70℃。最终干燥的蛋白分离物粉体通常具有小于5％的水分含量。
5.3.7分离方法的具体实施方式
本发明提供的用于生成绿豆蛋白分离物的方法的示例性实施方案如下：
1)在一个或多个阶段中采用pH>6.5的软水进行提取。提取包括将绿豆粉与水溶液以1：3-1：15(粉状物：水)的比例在中等至高剪切下接触，然后进行固液分离步骤；
2)任选地用活性炭处理；
3)等电沉淀(pH 5.6+/-0.2)结合低温沉淀法(1-4℃)，或者低离子强度沉淀在非常高的流速下结合冷冻沉淀法(1-4℃)；
4)然后进行固液分离步骤。
通常，所述分离步骤包括采用低浓度NaCl溶液，0.1％至0.9％NaCl，优选0.3％至0.5％NaCl清洗。
如以下实施例中所述，本发明提供的方法增加了蛋白质的浓度，并显著降低了豆豉的味道和香味以及所得绿豆蛋白分离物中美拉德反应物的浓度。
5.3.8步骤顺序和附加步骤
应理解，上述方法的步骤可以可替换的顺序进行。譬如，在一些实施方案，使所述植物蛋白来源经历分级分离过程发生在减少至少一种杂质之前和纯化富含蛋白的级分以得到纯化的蛋白分离物之前。在此类实施方案中，减少至少一种杂质可发生在纯化所述富含蛋白的级分之前或之后以得到纯化的蛋白分离物。在一些实施方案，减少杂质可在将所述植物蛋白来源进行分级分离过程之前和纯化所述富含蛋白的级分以得到纯化的蛋白分离物之前，和在纯化所述富含蛋白的级分以得到纯化的蛋白分离物之前，进行所述植物蛋白来源的分级分离过程。
在一些实施方案，所述方法包括附加步骤，包括选自以下的一种或多种：回收所述纯化的蛋白分离物(例如，使用离心)，清洗所述纯化的蛋白分离物，使用所述纯化的蛋白分离物制备糊剂，或使用所述纯化的蛋白分离物制备粉剂。在一些实施方案，将所述纯化的蛋白分离物再水化(例如，水化至约80％水分含量)，并将所述再水化的纯化蛋白分离物的pH值调节至约pH 6.0。
在其他方面，本发明提供的组合物和方法在提取后减少或去除包含碳水化合物(例如，淀粉)或富含碳水化合物的蛋白分离物的级分，并提供利用这些物料流作为生产多种食物应用产品流的机会，包括面条和多种面包制品应用。因此，本发明还提供了通过本发明所述的提取方法生成的绿豆衍生的碳水化合物(例如，淀粉)级分或富含碳水化合物的蛋白分离物。
5.4使用转谷氨酰胺酶的搅拌蛋/炒蛋类似物(ScrambledEggAnalog)
另一方面，本发明提供了基于植物的搅拌蛋/炒蛋类似物，其包含通过本发明所述方法生成的绿豆蛋白分离物，其中所述绿豆蛋白已与转谷氨酰胺酶接触以提供有利的质地、功能和感官特性。
采用转谷氨酰胺酶的食品加工方法已记载在例如日本专利JP59059151中，所述专利公开了采用转谷氨酰胺酶处理含有蛋白类、油类或脂肪类、和水的乳液以生成凝胶状交联凝胶。许多专利公开了转谷氨酰胺酶与乳类或奶酪的使用，譬如，美国专利号6,093,424和其他参考文献(例如中国专利101703147A)公开了转谷氨酰胺酶与豌豆蛋白分离物。
即使考虑到这些努力，但仍需制备可食用乳液的方法和组合物，例如蛋代用品或搅拌蛋/炒蛋类似物。
因此，在本发明提供的方法和组合物的一些实施方案中，将转谷氨酰胺酶添加至包含绿豆蛋白分离物的基于植物的蛋模拟乳液中，以在加热所述乳液时得到更坚固和更光滑的凝胶质地。
在一些实施方案，当转谷氨酰胺酶用于制备本发明提供的基于植物的蛋类似物时，将其微囊化。基于植物的蛋模拟乳液中的转谷氨酰胺酶的微囊化通过防止蛋白底物与转谷氨酰胺酶的接触而保持稳定的乳液。交联反应是在加热时引发以熔化所述微囊化组合物。包含转谷氨酰胺酶的蛋模拟乳液固有地不稳定，因为在将转谷氨酰胺酶添加至所述乳液中时才开始交联反应。
除了由绿豆蛋白分离物制备基于植物的蛋类似物之外，所述方法还可应用于豆科植物家族的其他脉冲亲属，其显示出相似的功能。
转谷氨酰胺酶的一个优点是增强贮存稳定的冷藏或室温蛋模拟乳液，所述乳液可用于生成具有烹饪或搅拌蛋/炒蛋或烘焙产品的许多特征的高质量的成品食品，例如通常含有蛋的蛋糕和饼干。另外的优势包括生成具有可变分子量和尺寸的富含蛋白质的成分，从而在成品食品中生成一系列质地特征。因此，在各个方面，转谷氨酰胺酶有助于最终产品的功能和质地。
在本发明的某些方面，制备蛋代用品组合物的方法包含使豆类蛋白与一定量的转谷氨酰胺酶(优选在0.0001％至0.1％之间)接触，以生成所需的植物蛋白分离物。在一些优选实施方案中，所述方法提供0.001％和0.05％之间的转谷氨酰胺酶量。在更优选的实施方案中，所述方法提供0.001％和0.0125％之间的转谷氨酰胺酶量。在其他实施方案，在优选范围之外生成的蛋白分离物生成较粗或不易均质化成制剂的搅拌物类似物。当采用转谷氨酰胺酶处理蛋白提取物时，在pH 5.6时，向蛋白中增加转谷氨酰胺酶的量，未出现沉淀。因此，使蛋白与优选量的转谷氨酰胺酶接触的附加步骤生成了所需的搅拌物类似物。
因此，在各个方面，本发明提供了一种绿豆衍生的搅拌物类似物，其包含本发明所述的蛋白分离物，其中所述搅拌物类似物包含至少一种或多种以下组分：水、磷酸氢二钠和油。在一些实施方案，所述搅拌物类似物还包含NaCl。在一些实施方案，使搅拌物类似物与转谷氨酰胺酶接触。在具体实施方案中，所述搅拌物类似物包含以下配方：蛋白固体：11.3g，水：81.79g，磷酸氢二钠：0.4g，油：6.2g，NaCl：0.31g(基于100g的总重量)，其中所述蛋白固体与在0.001％和0.0125％之间的转谷氨酰胺酶接触。
在另外的实施方案中，所述方法和组合物不含脂氧合酶。
因此，本发明提供了用于蛋替代品的组合物，所述组合物包含通过转谷氨酰胺酶改性的基于植物的蛋白分离物；其中所述组合物基本上不含蛋，和其中所述组合物包含天然蛋的一种或多种功能特性。优选地，所述组合物包含天然蛋的乳化特性。更优选地，所述组合物提供了由0.0001％至0.0125％的转谷氨酰胺酶改性的基于植物的蛋白分离物，并具有降低的或甚至显著降低的脂氧合酶活性或可氧化脂质类的其他酶活性，以相对于基于整个植物提取物的体积表示。更优选地，所述组合物基本上不含脂氧合酶或可氧化脂质类的酶。在进一步的实施方案中，所述基于植物的蛋白分离物是稳定交联的。
在一些方面，所述转谷氨酰胺酶减少或不与脂氧合酶或可氧化脂质类的酶交联。其他实施方案包括将转谷氨酰胺酶包封在微胶囊中。包含基于植物的蛋白分离物的所述组合物适于在室温下冷藏或储存，并在乳液中是贮存稳定的。在其他方面，所述转谷氨酰胺酶是游离的、交联的和/或固定化的。
本发明的其他方面包括纯化的蛋白分离物，所述蛋白分离物包含：经转谷氨酰胺酶改性的植物蛋白含量为至少60重量％；球蛋白型蛋白含量为所述植物蛋白的至少50重量％；相对于所述植物蛋白未经改性的来源，降低的氧化酶活性；和与所述植物蛋白的所述未经改性的来源不同的一种或多种调节的感官特性。其优选的实施方案包括由0.0001％至0.0125％的转谷氨酰胺酶改性的纯化蛋白分离物。
根据本发明的优选方法，提供了用于生成纯化的蛋白分离物的方法，包含：a.从pH值在约6.5-10.0之间的水溶液中的来源中提取一种或多种植物蛋白；b.在接近其富含球蛋白级分的等电点的pH值下或在约5.0-6.0之间的pH值下，使所述植物蛋白沉淀；或者使用微滤法或超滤法或离子交换色谱法分级分离和浓缩所述植物蛋白；c.回收所述纯化的蛋白分离物，所述分离物包含：至少60重量％的植物蛋白含量；所述植物蛋白的至少50重量％的球蛋白型蛋白含量；相对于所述植物蛋白未经改性的来源，降低的氧化酶活性；和与所述植物蛋白的所述未经改性的来源不同的一种或多种调节的感官特性；和d.在所述提取步骤a或所述回收步骤b中采用转谷氨酰胺酶改性所述植物蛋白。
制备纯化的蛋白分离物的方法的优选实施方案包括在所述提取步骤a或所述回收步骤b中采用转谷氨酰胺酶改性所述植物蛋白的步骤d，所述步骤d包含0.0001％至0.0125％的转谷氨酰胺酶。进一步的实施方案提供了包含纯化的蛋白分离物的组合物，所述纯化的蛋白分离物是稳定交联的，并且基本上不含脂氧合酶或可氧化脂质类的酶。另外的实施方案包括包封和/或固定化所述转谷氨酰胺酶。
根据本发明的优选组合物，提供了蛋代用品组合物，其包含：植物蛋白固体/固形物、水、磷酸氢二钠、油和诸如NaCl的盐，其中所述植物蛋白固体/固形物包含通过转谷氨酰胺酶改性的植物蛋白分离物。优选地，所述蛋代用品组合物的基于植物的蛋白分离物是采用0.0001％至0.0125％的转谷氨酰胺酶进行改性。所述转谷氨酰胺酶减少或不与脂氧合酶或可氧化脂质类的酶交联。在此类实施方案中，所述蛋代用品组合物具有降低的或甚至显著降低的脂氧合酶活性或其他可氧化脂质类的酶的活性。所述转谷氨酰胺酶交联除脂氧合酶以外的蛋白，并使其不含所述脂氧合酶，使所述脂氧合酶在等电沉淀和离心步骤中保留在上清液中，远离所述交联蛋白。更优选地，所述蛋代用品组合物基本上不含脂氧合酶或可氧化脂质类的酶。另外的实施方案包括使基于植物的蛋白分离物与包封在微胶囊中的转谷氨酰胺酶接触。所得的蛋代用品组合物适于在室温下冷藏或储存，并在乳液中贮存稳定。在加热所述乳液时，所述蛋代用品组合物形成凝胶，例如搅拌蛋/炒蛋类似物。本发明的蛋代用品组合物具有一种或多种类似于天然蛋的感官特性。所述组合物具有调节的感官特性，例如增加或减少的蓬松度、透气性和粉状质地。
5.4.1交联以制备类似蛋的质地
适于生成类似蛋质地的绿豆蛋白分离物可通过在制备本发明提供的绿豆分离物的方法中加入交联步骤来制备。在一个实施例中，所述交联步骤可添加至所述方法程序的提取步骤中，如图1B所示。譬如，制备将一份绿豆粉与三至十五份水混合的均匀水溶液，并用合适的无机或有机酸或碱将pH值调节至6.5至8。离心所述混合物，从富含碳水化合物的重相中滗析出富含蛋白的上清液。将转谷氨酰胺酶粉体以0.001至0.5％(w/w)的浓度加入富含蛋白的溶液中，加热至约50℃(转谷氨酰胺酶的最佳反应温度)并温育15至90分钟。将反应混合物快速加热至大于70℃，保持1至5分钟，以使所述转谷氨酰胺酶失活。将溶液的pH值调节至或接近所述蛋白混合物的富含球蛋白组分的等电点(pH约5.4-5.8)，快速冷却至低于50℃，并以大于3,000x g进行离心。滗析上清液，留下富含蛋白的粉体，外观为白色至浅棕褐色，然后可通过常用方法进一步加工成干燥粉体/粉末。所述富含蛋白的粉体可掺入基于植物的蛋模拟乳液中，所述乳液在加热时生成类似蛋的质地，所述加热可在烤箱、锅、煎锅或热水浴中进行。
在另一实施例中，制备将一份绿豆粉与三至十五份水混合的均匀水溶液，并用合适的无机或有机酸或碱将pH值调节至6.5至8。将所述溶液以大于3000x g进行离心，并将富含蛋白的上清液与富含碳水化合物的重相分离。将转谷氨酰胺酶粉体以0.001至0.5％(w/w)的浓度加入溶液中，加热至约50℃(转谷氨酰胺酶的最佳反应温度)并温育15至90分钟。温育后，向溶液中加入过氧化氢溶液至终浓度为0.01至0.1％(w/w)。此举会氧化转谷氨酰胺酶上的半胱氨酸残基，从而抑制活性。然后将所述溶液置于目的蛋白或蛋白级分的PI点(约5.4-5.8的pH值)。然后将溶液冷却并离心。此后滗析出上清液，留下富含球蛋白的重质级分。将富含球蛋白的级分用水稀释至固体浓度为约5-20％固体(w/w)，然后喷雾干燥。然后将其与水混合用于喷雾干燥。氢氧化钠是此过程中的加工助剂。其具有作为抗微生物剂和漂白剂的附加益处。喷雾干燥后，所有残留的氧化剂均应完全腐烂。
在另一实施例中，将绿豆提取物与转谷氨酰胺酶接触，但所述方法不包括停止转谷氨酰胺酶活性的步骤。制备将一份绿豆粉与三至十五份水混合的均匀水溶液，并用合适的无机或有机酸或碱将pH值调节至6.5至8。将其以大于3000x g进行离心，并将富含蛋白的上清液与富含碳水化合物的重相分离。将转谷氨酰胺酶粉体以0.001至0.5％(w/w)的浓度加至溶液中。选择转谷氨酰胺酶浓度以生成最终产品所需的质地。将所述溶液加热至约50℃(转谷氨酰胺酶的最佳反应温度)并温育15至90分钟。然后将溶液置于目的蛋白或蛋白级分的PI点(约5.4-5.8的pH值)。然后将溶液冷却并离心。此后滗析出上清液，留下富含球蛋白的重质级分。将所得重质级分快速加热至大于70℃，保持1至5分钟，以使转谷氨酰胺酶失活。将所述重质级分与水混合并进行喷雾干燥。
适于生成类似蛋质地的绿豆蛋白分离物也可通过在所述蛋白的酸沉淀后进行交联来制备，如图1C所示。在一个实施例中，制备将一份绿豆粉与三至十五份水混合的均匀水溶液，并用合适的无机或有机酸或碱将pH值调节至6.5至8。然后将溶液以大于3,000×g进行离心。滗析富含蛋白的上清液，留下富含碳水化合物的重相。将富含蛋白的溶液的pH值调节至或接近所述蛋白混合物的富含球蛋白组分(pH约5.4-5.8)的等电点，导致富含球蛋白的蛋白沉淀析出。将所述溶液以大于3,000x g进行离心。滗析上清液，留下富含球蛋白的蛋白级分。将此种富含球蛋白的蛋白级分在水中再稀释，以达到5％至25％的蛋白质浓度。将转谷氨酰胺酶粉体以0.001-0.5％(w/w)的浓度加入溶液中，加热至约50℃(转谷氨酰胺酶的最佳反应温度)并温育15至90分钟。将反应混合物快速加热至大于70℃，保持1至5分钟，以使转谷氨酰胺酶失活。然后将混合物快速冷却至低于50℃并以大于3,000x g进行离心。滗析上清液，留下富含蛋白的粉体，外观为白色至浅棕褐色，然后可通过常用方法进一步加工成干燥粉体。富含蛋白的粉体可掺入基于植物的蛋模拟乳液中，所述乳液在加热时生成类似蛋的质地，所述加热可在烤箱、锅、煎锅或热水浴中进行。
在另一实施方案，其中所述交联是在蛋白的酸沉淀之后施加，使用干法分提代替水提取以生成浓缩物，如图1D所示。去壳的绿豆通过连续的磨机，例如，辊磨机，然后是针磨机，以形成具有非常细的粒度的粉状物。然后将所述粉状物通过高速旋风分离器以将较大的粒子与较小的粒子分离。然后将富含蛋白的粒子(约55-60％蛋白)在水中稀释，以得到约5-25％固体的溶液。将所述溶液的pH值调节至或接近所述蛋白混合物的富含球蛋白组分的等电点(pH约5.4-5.8)，导致富含球蛋白的蛋白沉淀析出。将溶液以大于3,000x g进行离心。滗析上清液，留下富含球蛋白的蛋白级分。将此种富含球蛋白的蛋白级分在水中再稀释，以达到5至25％的蛋白质浓度。将转谷氨酰胺酶粉体以0.001-0.5％(w/w)的浓度加入溶液中，加热至约50℃(转谷氨酰胺酶的最佳反应温度)并温育15至90分钟。将反应混合物快速加热至大于70℃，保持1至5分钟，以使转谷氨酰胺酶失活。然后将混合物快速冷却至低于50℃并以大于3,000x g进行离心。滗析上清液，留下富含蛋白的粉体，外观为白色至浅棕褐色，然后可通过常用方法进一步加工成干燥粉体。富含蛋白的粉体可掺入基于植物的蛋模拟乳液中，所述乳液在加热时生成类似蛋的质地，所述加热可在烤箱、锅、煎锅或热水浴中进行。
5.4.2采用固定化转谷氨酰胺酶进行交联
作为使用大量一次性转谷氨酰胺酶的替代方案，可使用固定在惰性多孔珠或聚合物片上的转谷氨酰胺酶处理工艺流，其可在反应器中以扁平或螺旋缠绕构型使用。用于珠子的典型固定化酶载体包括二氧化硅(珍珠岩)或藻酸钙。通过使转谷氨酰胺酶的水溶液与珠材料以及交联剂(例如戊二醛)接触来制备固定化转谷氨酰胺酶，所述交联剂将酶固定至固体基质上。然后在使用前干燥和调节含酶载体。固定化酶反应器的优点包括：1)改进对酶反应暴露和温度条件的控制，从而使批次之间的结果更均匀统一；2)通过重复使用转谷氨酰胺酶实现经济效益提高。所述固体基质降低了转谷氨酰胺酶的变性潜力和速率。
5.4.3采用微胶囊化转谷氨酰胺酶进行交联
在本发明提供方法的一些实施方案中，微囊化的转谷氨酰胺酶用于制备基于植物的液体蛋状乳液。譬如，制备含有脂肪、水和乳化剂的乳液，其中脂肪的熔点为50℃和80℃之间。代表性的脂肪包括硬脂酸、棕榈和椰子起酥油。然后使用高剪切混合器或均化器将转谷氨酰胺酶分散在所述乳液中，以得到约5-20％固体的可流动溶液。然后在典型条件(150-175℃)下将乳液进行喷雾干燥并进行较短时间。然后可将含有转谷氨酰胺酶的喷雾干燥粉体掺入如本发明所述的基于植物的蛋模拟乳液中。
5.5具有改良的感官特性的绿豆分离物
本发明还提供了从绿豆蛋白来源生成可食用绿豆蛋白分离物的方法，所述方法包括：将绿豆蛋白来源进行分级分离过程以得到富含蛋白的级分，其中至少50重量％的富含蛋白级分包含一种或多种球蛋白型蛋白或由一种或多种球蛋白型蛋白组成；在可食用的绿豆蛋白分离物中减少至少一种杂质，所述至少一种杂质与变味或异味相关；和纯化所述富含蛋白的级分以得到可食用的绿豆蛋白分离物。在一些实施方案，至少60重量％的可食用绿豆蛋白分离物是植物蛋白。在一些实施方案，所述可食用蛋白分离物的氧化酶活性低于所述植物蛋白来源的相应氧化酶活性。在一些实施方案，所述可食用绿豆蛋白分离物的感官特性不同于所述绿豆蛋白来源的相应感官特性。
在某些方面，所述方法和组合物提供生成纯化的蛋白分离物，所述蛋白分离物具有以下特征的一种或多种的调节的感官特性：涩的味道或气味、豆腥的味道或气味、苦的味道或气味、烧焦的味道或气味、黄油的味道或气味、果仁的味道或气味、甜的味道或气味、酸的味道或气味、水果的味道或气味、花的味道或气味、木质的味道或气味、泥土的味道或气味、豆腥的味道或气味、辛辣的味道或气味、金属的味道或气味、甜的味道或气味、发霉的味道或气味、草的味道或气味、青味或青气味、油的味道或气味、醋的味道或气味、中性的味道或气味、以及温和的味道或气味。优选地，所述纯化的蛋白分离物具有调节的感官特性，例如以下一种或多种的减少或缺失：涩的味道或气味、豆腥的味道或气味、苦的味道或气味、烧焦的味道或气味、黄油的味道或气味、果仁的味道或气味、甜的味道或气味、酸的味道或气味、水果的味道或气味、花的味道或气味、木质的味道或气味、泥土的味道或气味、豆腥的味道或气味、辛辣的味道或气味、金属的味道或气味、甜的味道或气味、发霉的味道或气味、草的味道或气味、青味或青气味、油的味道或气味、醋的味道或气味、中性的味道或气味、以及温和的味道或气味。
5.5.1改性感官特性的方法
优选地，本发明提供的方法减少或除去可能赋予纯化的蛋白分离物中的变味或异味或与之相关的至少一种杂质。一种或多种杂质可以是挥发性或非挥发性化合物，并且可包含例如脂氧合酶(EC1.13.11.-)，众所周知，其可催化氧化脂肪酸。作为其他实施例，所述至少一种杂质可包含苯酚、醇、醛、硫化物、过氧化物或萜烯。还除去了归类为白蛋白的其他生物活性蛋白质，所述生物活性蛋白质包括凝集素类和蛋白酶抑制剂类，例如丝氨酸蛋白酶抑制剂和胰蛋白酶抑制剂。
在一些实施方案，所述至少一种杂质可包含一种或多种用于氧化酶活性的底物，例如一种或多种脂肪酸。在一些实施方案，本发明提供的方法减少或去除一种或多种选自如下的脂肪酸：C14：0(肉豆蔻酸甲酯)、C15：0(十五烷酸甲酯)、C16：0(棕榈酸甲酯)、C16：1(棕榈油酸甲酯)、C17：0(十七烷酸甲酯)、C18：0(硬脂酸甲酯)、C18：1(油酸甲酯)、C18：2(亚油酸甲酯)、C18：3(甲基α亚油酸酯)、C20：0(二十碳酸二甲酯)以及C22：0(二十二烷酸甲酯)。不受理论束缚，据信减少或去除一种或多种脂肪酸或其它脂质底物的氧化酶活性，也降低了所述绿豆蛋白分离物随时间的腐败。进一步的优势，增加所述分离物中蛋白与非蛋白分子的比例，可在下游食品应用中实现更一致和均匀的性能和功能。
在一些实施方案，减少杂质包括减少至少一种与脂质底物反应的酶。在此类实施方案中，减少此种杂质会减少至少一种亲脂性异味、亲脂性底物或辅因子。在一些实施方案，使用例如木炭、膨润土或活性炭通过固体吸附程序来减少杂质。
在一些实施方案，所述纯化的绿豆蛋白分离物相对于绿豆蛋白来源具有降低的氧化酶活性。例如，相对于绿豆蛋白来源，所述纯化的绿豆分离物的氧化酶活性可降低约5％、10％、15％、20％或25％。在一些实施方案，所述氧化酶活性是脂氧合酶活性。在一些实施方案，由于脂氧合酶活性降低，所述纯化的蛋白分离物相对于所述植物蛋白来源具有较低的脂质氧化或残留脂质。
在一些实施方案，通过使绿豆蛋白提取物或分离物与转谷氨酰胺酶活性接触来实现绿豆蛋白分离物中降低的脂氧合酶活性。因此，本发明还提供了通过转谷氨酰胺酶改性的绿豆蛋白分离物，其中所述分离物相对于分离物的植物来源具有降低的或甚至显著降低的脂氧合酶活性(或其他可氧化脂质类的酶的活性)。譬如，相对于所述分离物的植物来源，通过转谷氨酰胺酶改性的绿豆蛋白分离物可具有至少约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、或75％降低的脂氧合酶活性(或可氧化脂质类的酶的活性)。在一些实施方案，用于改性绿豆蛋白分离物的转谷氨酰胺酶的量在约0.0001％至0.0125％之间，被改性的分离物或提取物的量基于体积进行表示。
在其他实施方案，减少至少一种杂质包括除去纤维状固体、盐或碳水化合物。减少此类杂质包括除去至少一种可能赋予变味或异味或与之相关的化合物。譬如，可使用活性炭、碳或粘土除去这些化合物。作为另一个实施例，可使用螯合剂(例如，EDTA、柠檬酸、或磷酸盐)除去至少一种化合物，以抑制可氧化脂质或残留脂质的至少一种酶。在具体实施例中，EDTA可用于结合脂氧合酶的辅因子，脂氧合酶是可将残留脂质氧化成化合物(例如己醛)的酶，众所周知，会留下异味。
在一些实施方案，所述蛋白与残余源材料的分离除去了与蛋白相关的不需要的感官特性，例如豆腥味或与下表1中的化合物相关的任何不合适的风味特征。
本发明公开的方法和组合物提供了蛋白分离物，其特征在于，其具有良好的感官特性的能力，例如通过减少不需要的特征，例如“豆腥”的气味和味道。在优选实施方案中，除去或基本上减少与异味相关的组分。去除不需要的化合物可以改善气味、风味或味道或其组合。在一些实施方案，用于生成减少异味的蛋白分离物的方法涉及以下一种或多种方法：
1)等电点(pH～5.6至pH6.0)沉淀以显著降低脂氧合酶的水平，所述脂氧合酶可将任何残留的脂质氧化成化合物，例如己醛，众所周知，会留下异味；
2)使用螯合剂，例如EDTA，来结合脂氧合酶的辅因子；和/或
3)在提取后使用固定化活性炭除去生成异味的化合物。在脂质底物丰富的情况下，脂质可在上清液中收集并除去或减少。本发明方法可通过富集一类蛋白和减少酶类如脂氧合酶来改善蛋白分离物的功能，所述酶主要催化氧化不饱和脂肪酸或不饱和脂肪。因此，在一些实施方案，纯化蛋白级分或减少一类蛋白以减少异味的方法可最低限度地影响所述蛋白分离物组合物保留一种或多种所需功能特性的能力。
因此，在某些方面，本发明公开的方法和组合物调节或改善蛋白分离物的风味特征，其反过来调节或改善包含蛋白分离物的食品的风味特征。在某些实施方案，除去或减少植物蛋白来源的某些非蛋白级分，例如多糖，尤其是豆类中那些难以消化的形式，可赋予更理想的风味。去除或减少非蛋白级分可使不需要的小分子去除或减少，包括交联的多酚、挥发物和重金属离子的去除或减少。本发明公开的方法和组合物可提供目标化合物的去除或减少，包括但不限于交联多酚类、挥发物类、重金属离子类、对香豆酸(4-羟基肉桂酸)、阿魏酸(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸)和4-羟基苯甲酸(已知的多酚类)以及归因于不需要的味道或气味的各种化合物的去除或减少。因此，所述方法和组合物可提供溶解的植物蛋白，其特征在于，具有中性味道和/或气味。在其他实施方案，所述方法和组合物提供味道或气味的调节，其中选择的化合物被除去、减少或甚至掺入。
因此，可通过调节归因于某些风味的一种或多种小分子来去除、减少或添加一种或多种所需的味道或气味。一种此类方法涉及使蛋白沉淀以除去通常与赋予不需要的风味相关的小分子。
表征食品样品气味的一种方法包括使用GC SNFR嗅觉端口(Olfactory Port)(PerkinElmer)。将来自样品的挥发性化合物注入GC柱中，并使用质谱来分离和鉴定所得化合物。表1提供了示例性化合物列表及其对感官特性的影响。可分离和鉴定其他化合物以关联其感官特性。
表1：
因此，在一些实施方案，所述方法提供去除或减少这些和/或其他化合物中的一种或多种。譬如，如表1所示，己醛的存在可导致食品具有类似鲜切草的气味。在一些实施方案，除去或减少此种气味。同理，所述方法通过鉴定制剂配方中的某些化合物，将一种或多种化合物与嗅觉相关联并除去或减少所述化合物从而将所述制剂配方进行迭代、改性或改进。
在一些实施方案，所述纯化的蛋白分离物具有一种或多种感官特性，其不同于植物蛋白来源的相应感官特性。感官特性的实例包括但不限于涩的味道或气味、豆腥的味道或气味、苦的味道或气味、烧焦的味道或气味、黄油的味道或气味、果仁的味道或气味、甜的味道或气味、酸的味道或气味、水果的味道或气味、花的味道或气味、木质的味道或气味、泥土的味道或气味、豆腥的味道或气味、辛辣的味道或气味、金属的味道或气味、甜的味道或气味、发霉的味道或气味、草的味道或气味、青味或青气味、油的味道或气味、醋的味道或气味、中性的味道或气味、以及温和的味道或气味。所述植物蛋白来源可具有味道、气味或感官印象(例如，豆腥的味道或气味)，其使得所述植物蛋白来源不合需要或不适合用于代替参考食品，例如，蛋类。相对于植物蛋白来源，所述纯化的蛋白分离物具有改性的感官特性，并且此类改性的感官特性可使纯化的蛋白分离物更适合用作参考食品或作为参考食品的代用品。换言之，所述纯化的蛋白分离物可具有感官特性，其区分纯化的蛋白分离物，或掺入纯化的蛋白分离物的组合物，味道，气味或感官印象，其类似或等同于所述参考食品的味道、气味或感官印象。例如，所述纯化的蛋白分离物可减少或消除所述植物蛋白来源的感官特性。
在一些实施方案，所述纯化的蛋白分离物的感官特性可以与蛋的相应感官特性相似或等同。在一些实施方案，所述纯化的蛋白分离物提供与参考食品(例如蛋类(液体的、搅拌蛋/炒蛋的或蛋糕形式)，蛋糕(例如，磅蛋糕、黄色蛋糕或天使蛋糕)，奶油干酪，面食，乳液，甜食，冰淇淋，奶油冻，乳类，熟食肉类，鸡肉(如鸡块)，或涂层/包衣)的味道、气味或感官印象相似或等同的味道、气味或感官印象。
5.6绿豆蛋白分离物的食品功能
在某些方面，本发明提供的高纯度绿豆蛋白分离物具有所需的功能特征，例如通过工业中的标准方法测定的乳化、水结合、发泡和凝胶化特性。与蛋类的特征相比，测得的纯化蛋白分离物的此类特性相当于至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。本发明提供的方法生成高纯度的，优选50％、60％、70％、80％、90％或更高的绿豆蛋白分离物，其具有与食品如蛋类相一致的功能特性，例如乳化和凝胶化。在优选的实施方案中，所述蛋白含量为至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。
如以下实施例中所证明的，通过掺入具有一种或多种功能特性的纯化的绿豆蛋白分离物，制备了许多食品应用。所述功能特性可包括但不限于食品(如蛋类食品)的碎屑密度、结构/质地、弹性/弹力、凝结、粘附、保湿、口感、膨松、通气/起泡、乳脂状、和乳化。口感是在食品测试和描述中使用的概念。可评估使用示例性蛋白分离物制得的产品的口感。在一些实施方案，使用示例性蛋白分离物制得的产品(例如烘焙食品)具有与用天然蛋类制成的产品类似的口感。在一些实施方案，使用示例性蛋白分离物制得的产品的口感，优于先前已知或已尝试过的蛋代用品(例如香蕉，改性乳清蛋白或Egg BeatersTM)的口感。
可包括在口感度量中的特性的实例包括：粘结性：当用臼齿咬合时样品在破裂之前变形的程度；密度：完全咬住臼齿后，样品横截面的紧密度；干度：样品在口中感觉干燥的程度；脆度：样品破碎、破裂或粉碎的力；脆度包括易碎度、松脆度、脆声和脆性；颗粒度：样品含有小颗粒状粒子的程度，可看作是光滑度的对立面；胶黏度：将半固体食品分解为准备吞咽状态所需的能量；硬度：使产品变形至给定距离所需的力，即在臼齿之间压缩的力，用切牙咬合，在舌头和上颚之间压缩的力；沉重度：首次放在舌头上时感知到的产品重量；吸湿性：产品吸收的唾液量；放湿性：样品释放的湿度/多汁性的量；口腔涂层：咀嚼后口腔中涂层的类型和程度(例如，脂肪/油)；粗糙度：舌头感知产品表面的磨蚀程度；滑溜度：产品滑过舌头的程度；平滑度：产品中没有任何粒子、团块、凸起等；均匀度：样品均匀的程度；均质性；咬合的均匀性：通过咬合的力的均匀性；咀嚼的均匀性：产品的咀嚼特性在整个咀嚼过程中均匀的程度；黏度：从勺子上方的舌头吸取液体所需的力；和湿度：产品表面感受到的水分量。
所述纯化的蛋白分离物本身或当掺入组合物中时也可具有一种或多种功能特性。所述这些功能特性可包括但不限于乳化，水结合能力，发泡，凝胶化，碎屑密度，结构形成，质地构建，粘结性，粘附性，弹性，弹力，溶解度，黏度，脂肪吸收，味道结合，凝结，膨松，通气，乳脂状，成膜性，光泽添加，光亮添加，冷冻稳定性，解冻稳定性，或颜色。
在一些实施方案，所述纯化的蛋白分离物的至少一种功能特性不同于植物蛋白来源的相应功能特性。在一些实施方案，所述纯化的蛋白分离物的至少一种功能特性与参考食品(例如蛋类(液体的、搅拌蛋/炒蛋的或蛋糕形式)，蛋糕(例如，磅蛋糕、黄色蛋糕或天使蛋糕)，奶油干酪，面食，乳液，甜食，冰淇淋，奶油冻，乳类，熟食肉类，鸡肉(如鸡块)，或涂层/包衣)的相应功能特性相似或等同。
在一些实施方案，当所述纯化的蛋白分离物包含在食品组合物中时，所述食品组合物具有至少一种与参考食品(例如蛋类，液态蛋，炒蛋/搅拌蛋，蛋饼，蛋糕(例如，磅蛋糕、黄色蛋糕或天使蛋糕)，奶油干酪，面食，乳液，甜食，冰淇淋，奶油冻，乳类，熟食肉类，鸡肉(如鸡块)，或涂层/包衣)的相应功能特性相似或等同的功能特性。
在一些实施方案，所述纯化的蛋白分离物，单独使用或当掺入组合物中时，能够在加热或室温下形成凝胶。
5.6.1流变性质
使用混合流变仪(TA Instruments Discovery HR-1)，测定蛋白分离物制剂的粘弹性行为(例如，凝胶化温度、弹性、粘度)随时间和温度的函数变化。此种物理测量可与产品性能相关联。在一些实施方案，蛋白分离物和含有蛋白分离物的制剂的某些物理测量用于预测最佳原料来源(它们具有显著差异的程度)和发挥产品开发努力。
如实施例6.3中所证明的，由本发明所述的分离方法，利用pH值约为5.6至6.0范围内进行沉淀，制备而得绿豆蛋白分离物具有优异的结构构建性质，所述性质包括凝胶化温度、凝胶强度和凝胶弹性，制备过程中没有添加其他诸如碱金属离子(例如NaCl，KCl)、水胶体或其他增稠剂或胶凝剂的组分。因此，另一方面，本发明提供的绿豆蛋白分离物，其凝胶起始温度低于90℃。在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物的所述凝胶化起始温度低于89℃、88℃或87℃。另一方面，本发明提供了绿豆蛋白分离物，其凝胶强度大于2％振荡张力。在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物的所述凝胶强度大于3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％振荡张力。另一方面，本发明提供了具有大于300Pa的凝胶弹性的绿豆蛋白分离物。在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物的所述凝胶弹性大于300、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000或大于8000Pa。
本发明还公开了利用本发明所述的绿豆蛋白分离物在广泛的实验参数(包括Na2HPO4浓度和水分含量)下配制的蛋和无蛋产品的粘度。所述方法可用于指导产品开发和质量控制。图30示出了()商业液体蛋制品、(◇)均质化的全壳蛋和(Δ)用结冷胶配制的液体蛋糊中粘度与剪切速率的比较。y轴显示的粘度(Pa.s)是对数形式，因为样品上显示的极端范围具有低至0.03Pa.s(蛋)和高达0.27Pa.s，62％水分，0.5％Na2HPO4的粘度值。
5.6.2水分含量
在一些实施方案，本发明提供了具有所需水分含量的纯化蛋白分离物。在各种实施方案中，％水分含量为约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、80％、85％、90％甚至更高。
5.6.3粒度
豌豆蛋白分离物可商购获得，其粒度范围为150-400微米，以适合各种应用。较小的颗粒尺寸非常适合饮料，营养棒和任何需要光滑口感的应用。较大的颗粒尺寸具有优异的保水性，可减少蒸煮损失，提高产量并提供湿润的口感。中等粒度可用于需要两种属性的应用。小、中、大尺寸的颗粒具有不同的应用和口感。更大的粒度更适合烘焙。
绿豆蛋白浓缩物的粒度通常大于其他蛋白分离物。蛋白浓缩物仍以一种细粉末形式，其较大粒度使所述蛋白浓缩物非常适合吸水应用和增强烘焙食品和面食的结构。在某些实施方案中，所述纯化的蛋白分离物具有所期望的或优异的保水性，所述保水性减少烹饪损失，提高产量并提供湿润的口感。
在一些实施方案，所述粒度分布在约8.9-223.0μm的范围内。在一些实施方案，所述蛋白组合物的粒度小于或等于10微米。更优选地，所述蛋白组合物的所述粒度小于或等于1微米。在更优选的实施方式中，所述蛋白组合物的所述粒度包含小于或等于100微米。在另外的实施方案中，所述蛋白组合物的所述粒度为约30nm。在其他实施方案中，所述蛋白组合物的所述粒度包含10-100nm。
5.7绿豆分离物的食品应用
在一些实施方案，绿豆蛋白分离物可作为基于动物或植物蛋白中的直接蛋白质替代物，用于跨种类的各种常规食品和饮料产品中。在一些实施方案，所述使用水平为包括最终产品的3％至90％(w/w)。表2中总结了本发明提供的所述绿豆蛋白分离物的示例性食物类别和使用水平。在一些实施方案，所述绿豆蛋白分离物也可用作食品中现有蛋白的补充物。
本发明提供的纯化的绿豆蛋白分离物适用于各种食品应用，并已掺入例如可食用的无蛋乳液，蛋类似物，无蛋炒蛋/搅拌蛋类，无蛋蛋糕，无蛋磅蛋糕，无蛋天使蛋糕，无蛋黄色蛋糕，无蛋奶油干酪，无蛋面食面团，无蛋奶油冻，无蛋冰淇淋，和无乳制品乳类中。
在各个方面，所述组合物和方法在多种食品应用(包括液态和蛋糕炒蛋/搅拌蛋代用品)中掺入一种或多种纯化的蛋白分离物，以达到所需的乳化、水结合和凝胶化水平。在优选实施方案中，功能性蛋替代产品包含纯化的蛋白分离物或提取物(10-15％)和一种或多种：油(10％)，水胶体，防腐剂和任选的调味剂，水，卵磷脂，黄原胶，碳酸钠，黑盐。
因此，所述方法和组合物使得成分具有来自一种或多种纯化的蛋白分离物的所需功能，所述纯化的蛋白分离物适合作为各种食品应用中的替代成分，包括但不限于肉类代用品类、蛋类代用品类、烘焙食品类和强化饮料类。
在一些实施方案，将所述纯化的蛋白分离物掺入蛋代用品中。在一些此类实施方案中，所述纯化的蛋白分离物(例如调味料或香料)的感官特性与蛋的相应感官特性相似或等同。所述蛋代用品可具有至少一种功能特性(例如，乳化，水结合能力，发泡，凝胶化，碎屑密度，结构形成，质地构建，粘结性，粘附性，弹性，弹力，溶解度，黏度，脂肪吸收，味道结合，凝结，膨松，通气，乳脂状，成膜性，光泽添加，光亮添加，冷冻稳定性，解冻稳定性或颜色)，其与蛋的相应功能特性相似或等同。除了纯化的蛋白分离物之外，所述蛋代用品可包括但不限于ι-角叉菜胶、阿拉伯树胶、魔芋、黄原胶或结冷胶中的一种或多种。
在一些实施方案，将所述纯化的蛋白分离物掺入无蛋蛋糕(例如磅蛋糕、黄色蛋糕或天使蛋糕)中。在一些此类实施方案中，无蛋蛋糕的至少一种感官特性(例如，味道或气味)与含蛋蛋糕的相应感官特性相似或等同。无蛋蛋糕可具有至少一种与含蛋蛋糕的相应功能特性相似或等同的功能特性。所述至少一种功能特性可以是，例如，乳化，水结合能力，发泡，凝胶化，碎屑密度，结构形成，质地构建，粘结性，粘附性，弹性，弹力，溶解度，黏度，脂肪吸收，味道结合，凝结，膨松，通气，乳脂状，成膜性，光泽添加，光亮添加，冷冻稳定性，解冻稳定性或颜色。
在一些实施方案，将所述纯化的蛋白分离物掺入无蛋蛋糕混合物或无蛋糕面糊中。在一些此类实施方案中，无蛋蛋糕混合物或面糊具有至少一种无蛋糕面糊的感官特性(例如，味道或气味)，其类似或等同于含蛋蛋糕混合物或面糊的相应感官特性。无蛋蛋糕混合物或面糊可具有至少一种与含蛋蛋糕面糊的相应功能特性相似或等同的功能特性。所述至少一种功能特性可以是，例如，乳化，水结合能力，发泡，凝胶化，碎屑密度，结构形成，质地构建，粘结性，粘附性，弹性，弹力，溶解度，黏度，脂肪吸收，味道结合，凝结，膨松，通气，乳脂状，成膜性，光泽添加，光亮添加，冷冻稳定性，解冻稳定性或颜色。
在其中所述纯化的蛋白分离物包含在无蛋磅蛋糕中的一些实施方案中，所述无蛋磅蛋糕的峰高度是含蛋磅蛋糕的峰高的至少90％。在其中所述纯化的蛋白分离物包含在无蛋磅蛋糕面糊中的一些实施方案中，所述无蛋磅蛋糕面糊的比重为0.95-0.99。
在一些方面，增加的功能性与食品应用中的纯化蛋白分离物相关。譬如，用纯化的蛋白分离物生成的食品可能在穹顶或裂纹，糕弹力，糕粘结性，糕弹性，糕峰高，面糊比重，中心隆起，中心裂纹，褐变，口感，回弹，异味或味道中具有增加的功能性。
在一些实施方案，所述纯化的蛋白分离物包含在奶油干酪、面食面团、面食、乳类、奶油冻、冷冻甜点(例如，包含冰淇淋的冷冻甜点)、熟食肉类、或鸡肉(例如鸡块)中。
在一些实施方案，将所述纯化的蛋白分离物掺入食品或饮料组合物，例如蛋代用品，蛋糕(例如，磅蛋糕、黄色蛋糕或天使蛋糕)，蛋糕面糊，蛋糕混合物，奶油干酪，面食面团，面食，奶油冻，冰淇淋，乳类，熟食肉类或甜食中。所述食品或饮料组合物可提供与复制参考食品或饮料组合物的质地和口感相似或等同的感官印象。在一些实施方案，在将其包含在食品或饮料组合物中之前，所述纯化的蛋白分离物在某种程度上根据纯化的蛋白分离物的目标应用进行进一步加工。譬如，可将所述纯化的蛋白分离物在缓冲液中稀释以将pH调节至适合于目标应用的pH值。作为另一个实施例，可浓缩所述纯化的蛋白分离物以用于目标应用。作为又一个实施例，可干燥所述纯化的蛋白分离物以用于目标应用。
包含来自绿豆作为主要功能成分的高纯度蛋白分离物的各种食品应用包括无蛋乳液(例如，与炒蛋/搅拌蛋类似或等同的无蛋食品)，磅蛋糕，黄色蛋糕，天使蛋糕，奶油干酪，面食面团，面食，奶油冻，冰淇淋，乳类，熟食肉类或甜食。实施例8-12、20和21提供了掺入各种食品应用中的蛋白分离物的实施例。
5.7.1素食蛋糕
各种实验提供了绿豆蛋白分离物适合用作配制的素食蛋糕中的唯一胶凝剂的证据。在一些实施方案，由ι-角叉菜胶和阿拉伯树胶组成的水胶体体系增强了绿豆分离物在配制的蛋糕中的天然胶凝性质。在其他实施方案，由1.5：1比例的高酰基和低酰基结冷胶组成的水胶体体系增强了绿豆分离物在配制的蛋糕中的天然胶凝性质。在进一步实施方案中，由魔芋和黄原胶组成的水胶体体系增强了绿豆分离物在配制的蛋糕中的天然胶凝性质。
5.7.2无蛋乳液
在另一方面，本发明提供了可食用的无蛋乳液，其包含本发明所述的绿豆蛋白分离物。在一些实施方案，所述乳液包含一种或多种选自水、油、脂肪、水胶体和淀粉的附加组分。在一些实施方案，至少或约60-85％的可食用无蛋乳液是水。在一些实施方案，至少或约10-20％的可食用无蛋乳液是所述蛋白分离物。在一些实施方案，至少或约5-15％的可食用无蛋乳液是脂肪。在一些实施方案，至少或约0.01-6％的可食用无蛋乳液是水胶体级分或淀粉。在一些实施方案，所述水胶体级分包含高酰基结冷胶、低酰基结冷胶、ι-角叉菜胶、阿拉伯树胶、魔芋、刺槐豆胶、瓜尔豆胶、黄原胶、或其一种或多种胶的组合。在一些实施方案，所述乳液还包含以下一种或多种：调味剂、着色剂、抗微生物剂、膨松剂和盐。
在一些实施方案，所述乳液还包含磷酸盐。在一些实施方案，所述磷酸盐选自由磷酸氢二钠(DSP)、六偏磷酸钠(SHMP)、和焦磷酸四钠(TSPP)组成的组。在具体实施方案中，所述乳液包含DSP。在另一具体实施方案，所述乳液包含DSP。在一些实施方案，所述乳液中的DSP的量为至少或约0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.11％、0.12％、0.13％、0.14％或0.15％；或大于0.15％。在另一具体实施方案，所述乳液包含SHMP。在一些实施方案，所述SHMP是短链SHMC、常规链SHMP或长链SHMP。在一些实施方案，所述乳液中的SHMP的量为至少或约0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、或1％；或大于1％。
在具体实施方案中，本发明提供了可食用的无蛋乳液，其pH值为约5.6至6.8。在一些实施方案，所述可食用无蛋乳液包含水，本发明所述的绿豆蛋白分离物，修饰蛋白分离物结构的酶，以及油或脂肪。在一些实施方案，所述酶包含转谷氨酰胺酶或蛋白水解酶。在一些实施方案，至少或约70-85％的可食用无蛋乳液是水。在一些实施方案，至少或约7-15％的可食用无蛋乳液是所述蛋白分离物。在一些实施方案，至少或约0.0005-0.0025％(5-25份/百万份)的可食用无蛋乳液是修饰蛋白分离物结构的酶。在一些实施方案，至少或约5-15％的可食用无蛋乳液是油或脂肪。
本发明还提供了使用任何上述无蛋乳液制备的蛋糕。
在一些实施方案，方法提供了使用本发明所述的蛋白分离物制得的无蛋乳液，其中所述无蛋乳液可用于制备例如与炒蛋/搅拌蛋、煎蛋卷、用蛋制作的乳蛋糕类似或等同的无蛋食品。因此，在一些实施方案，所述无蛋乳液包含一种或多种本发明公开的示例性蛋白分离物。所述无蛋乳液可进一步包含例如脂质，一种或多种碳水化合物，和任选的蛋白改性酶，盐，调味剂和/或颜色。可选择所述这些成分的比例以调节所得无蛋食品的质地、风味和/或颜色。所得无蛋食品可提供与复制蛋的质地和口感相似或等同的感官印象。液态搅拌物和蛋糕的感官质量参数的特征在于柔软、紧凑的凝胶，其具有干净的咬合和类似于蛋类的适度咀嚼。
一些实施方案提供了制备作为蛋替代品的蛋白的方法。例如，通过将实施例8中制备的蛋白分离物与2％Na2HPO4组合，并将此成分加入以下液体组合物：21％总固体和0.25％Na2HPO4，所述蛋白易于用作一种基于植物的蛋替代品，一种合适的替代品成分。
5.7.3烘焙蛋糕
在另一方面，本发明提供了一种或多种无蛋蛋糕混合物，其适用于制备一种或多种无蛋糕面糊，由其可制备一种或多种无蛋蛋糕(egg-free cake)。在一些实施方案，所述无蛋蛋糕混合物包含本发明所述的粉状物/面粉、糖和绿豆蛋白分离物。在一些实施方案，所述无蛋蛋糕混合物还包含一种或多种选自以下的附加组分：塔塔粉，磷酸氢二钠，小苏打和pH稳定剂。在一些实施方案，所述粉状物包含细面粉/蛋糕粉。
本发明还提供了无蛋糕面糊，其包含上述无蛋蛋糕混合物和水。在一些实施方案，所述无蛋糕面糊是无蛋磅蛋糕面糊、无蛋天使蛋糕面糊或无蛋黄色蛋糕面糊。在一些实施方案，所述无蛋糕面糊的比重为0.95-0.99。
本发明还提供了由上述无蛋糕面糊制成的无蛋蛋糕。在一些实施方案，所述无蛋蛋糕的峰高是含蛋磅蛋糕的峰高的至少90％。在一些实施方案，所述无蛋蛋糕的一种或多种特征与含蛋蛋糕的一种或多种相应特征相似或等同。在一些实施方案，所述一种或多种特征包括弹力、粘结性、弹性、峰高、中心隆起、中心裂纹、褐变、口感、回弹或风味。在一些实施方案，所述一种或多种特征包括硬度、弹力、粘结性、弹性或咀嚼性。在一些实施方案，所述一种或多种特征包括功能特性或感官特性。在一些实施方案，所述功能特性包含以下一种或多种：乳化、水结合能力、发泡、凝胶化、碎屑密度、结构形成、质地构建、粘结性、粘附性、弹力、弹性、溶解度、黏度、脂肪吸收、味道结合、凝结、膨松、通气、乳脂状、成膜性、光泽添加、光亮添加、冷冻稳定性、解冻稳定性或颜色。
在具体实施方案中，本发明提供了无蛋磅蛋糕混合物，其包含本发明所述的粉状物、糖和绿豆蛋白分离物。在一些实施方案，所述粉状物包含蛋糕粉/细面粉。在一些实施方案，所述无蛋磅蛋糕混合物还包含油或脂肪。在一些实施方案，所述油或脂肪包含黄油或起酥油。在一些实施方案，至少或约25-31％的无蛋磅蛋糕面糊是粉状物。在一些实施方案，至少或约25-31％的无蛋磅蛋糕面糊是油或脂肪。在一些实施方案，至少或约25-31％的无蛋磅蛋糕面糊是糖。在一些实施方案，至少或约6-12％的无蛋磅蛋糕面糊是所述蛋白分离物。在一些实施方案，所述面糊还包含磷酸氢二钠或小苏打。
本发明还提供了无蛋磅蛋糕面糊，其包含上述无蛋磅蛋糕混合物，并且还包含水。在一些实施方案，所述无蛋磅蛋糕面糊包含约四份无蛋磅蛋糕混合物；和约一份水。在一些实施方案，至少或约20-25％的无蛋磅蛋糕面糊是粉状物。在一些实施方案，至少或约20-25％的无蛋磅蛋糕面糊是油或脂肪。在一些实施方案，至少或约20-25％的无蛋磅蛋糕面糊是糖。在一些实施方案，至少或约5-8％的无蛋磅蛋糕面糊是所述蛋白分离物。在一些实施方案，至少或约18-20％的无蛋磅蛋糕面糊是水。
在另一具体实施方案，本发明提供了无蛋天使蛋糕混合物，其包含本发明所述的粉状物、糖和绿豆蛋白分离物。在一些实施方案，至少或约8-16％的无蛋天使蛋糕混合物是粉状物。在一些实施方案，至少或约29-42％的无蛋天使蛋糕混合物是糖。在一些实施方案，至少或约7-10％的无蛋天使蛋糕混合物是所述蛋白分离物。在一些实施方案，所述无蛋天使蛋糕混合物还包含塔塔粉、磷酸氢二钠、小苏打或pH稳定剂。在一些实施方案，所述粉状物包含蛋糕粉/细面粉。本发明还提供了无蛋天使蛋糕面糊，其包含上述无蛋天使蛋糕混合物和水。
在另一具体实施方案，本发明提供了无蛋黄色蛋糕(egg-free yellow cake)混合物，其包含本发明所述的粉状物、糖和绿豆蛋白分离物。在一些实施方案，至少或约20-33％的无蛋黄色蛋糕混合物是粉状物。在一些实施方案，至少或约19-39％的无蛋黄色蛋糕混合物是糖。在一些实施方案，至少或约4-7％的无蛋黄色蛋糕混合物是所述蛋白分离物。在一些实施方案，所述无蛋黄色蛋糕混合物还包含发酵粉、盐、干乳和起酥油中的一种或多种。本发明还提供了无蛋黄色蛋糕面糊，其包含上述无蛋黄色蛋糕混合物和水。
一些实施方案提供了使用蛋白分离物生成无蛋磅蛋糕的方法。譬如，通过将包含绿豆蛋白分离物的液态溶液与糖、蛋糕粉和黄油在17℃至20℃下以1：1：1：1(w/w)比率混合来形成面糊。使用在Hobart混合器上的单级混合在22℃下将各成分混合在一起，并持续6分钟。将所得面糊在磅蛋糕盘中在150℃下烘烤45分钟并在22℃下在盘中冷却2小时。
采用所述蛋白分离物制成的蛋糕的感官质量参数的特征在于蓬松、柔软、通气的质地。测得峰高为含蛋磅蛋糕的90-110％。具有纯化的绿豆蛋白分离物的蛋糕面糊的比重为0.95-0.99，其与具有0.95-0.96的全蛋蛋糕面糊的比重相似。
5.7.4奶油干酪类似物
在另一方面，本发明提供了无蛋奶油干酪，其包含本发明所述的绿豆蛋白分离物。在一些实施方案，所述无蛋奶油干酪包含一种或多种选自水、油或脂肪、和水胶体的附加组分。在一些实施方案，至少或约75-85％的无蛋奶油干酪是水。在一些实施方案，至少或约10-15％的无蛋奶油干酪是所述蛋白分离物。在一些实施方案，至少或约5-10％的无蛋奶油干酪是油或脂肪。在一些实施方案，至少或约0.1-3％的无蛋奶油干酪是水胶体。在一些实施方案，所述水胶体包含黄原胶或低甲氧基果胶和氯化钙体系。在一些实施方案，所述无蛋奶油干酪还包含调味剂或盐。在一些实施方案，所述无蛋奶油干酪的一种或多种特征与含蛋奶油干酪的一种或多种相应特征相似或等同。在一些实施方案，所述特征是味道、黏度、乳脂状、稠度、气味、涂抹性、颜色、热稳定性或熔融特性。在一些实施方案，所述特征包括功能特性或感官特性。在一些实施方案，所述功能特性包括：乳化、水结合能力、发泡、凝胶化、碎屑密度、结构形成、质地构建、粘结性、粘附性、弹力、弹性、溶解度、黏度、脂肪吸收、味道结合、凝结、膨松、通气、乳脂状、成膜性、光泽添加、光亮添加、冷冻稳定性、解冻稳定性或颜色。在一些实施方案，所述感官特性包括味道或气味。
实施例31提供了使用由低甲氧基果胶和CaCl2组成的水胶体体系的示例性奶油干酪类似物，所述水胶体体系形成连续的软凝胶，其具有令人联想到的奶油干酪的质地感官特性。其他结果提供了由黄原胶组成的水胶体体系，形成连续的软凝胶，其具有令人联想到的奶油干酪的质地感官特性。
5.7.5无蛋面食面团
另一方面，本发明提供了无蛋面食面团，其包含本发明所述的绿豆蛋白分离物。在一些实施方案，所述无蛋面食面团包含一种或多种选自粉状物、油或脂肪、和水的附加组分。在一些实施方案，所述粉状物包含粗面面粉。在一些实施方案，所述油或脂肪包含特级初榨油。在一些实施方案，所述无蛋面食面团还包含盐。本发明还提供了由上述无蛋面食面团制成的无蛋面食。在一些实施方案，所述无蛋面食是新鲜的。在一些实施方案，将所述无蛋面食干燥。在一些实施方案，所述无蛋面食的一种或多种特征与含蛋面食的一种或多种相应特征相似或等同。在一些实施方案，所述一种或多种特征包括咀嚼性、密度、味道、烹饪时间、保质期、粘结性或粘附性。在一些实施方案，所述一种或多种特征包括功能特性或感官特性。在一些实施方案，所述功能特性包括：乳化、水结合能力、发泡、凝胶化、碎屑密度、结构形成、质地构建、粘结性、粘附性、弹力、弹性、溶解度、黏度、脂肪吸收、味道结合、凝结、膨松、通气、乳脂状、成膜性、光泽添加、光亮添加、冷冻稳定性、解冻稳定性或颜色。在一些实施方案，所述感官特性包括味道或气味。
5.7.6植物基乳
另一方面，本发明提供了植物基乳，其包含本发明所述的绿豆蛋白分离物。在一些实施方案，所述植物基乳包含一种或多种选自水、油或脂肪、和糖的附加组分。在一些实施方案，至少或约5％的植物基乳是所述蛋白分离物。在一些实施方案，至少或约70％的植物基乳是水。在一些实施方案，至少或约2％的植物基乳是油或脂肪。在一些实施方案，所述植物基乳还包含以下的一种或多种：磷酸氢二钠、大豆卵磷脂和微量矿物质。在具体实施方案中，所述植物基乳不含乳糖。在其他具体实施方案中，所述植物基乳不包含胶类或稳定剂类。
5.7.7无蛋奶油冻
在另一方面，本发明提供了无蛋奶油冻，其包含本发明所述的绿豆蛋白分离物。在一些实施方案，所述无蛋奶油冻包含一种或多种选自奶油和糖的附加组分。在一些实施方案，至少或约5％的无蛋奶油冻是所述蛋白分离物。在一些实施方案，至少或约81％的无蛋奶油冻是奶油。在一些实施方案，至少或约13％的无蛋奶油冻是糖。在一些实施方案，所述无蛋奶油冻还包含以下的一种或多种：ι-角叉菜胶、κ-角叉菜胶、香草和盐。在一些实施方案，所述奶油是浓奶油。
5.7.8无蛋冰淇淋
在另一方面，本发明提供了无蛋冰淇淋，其包含本发明所述的绿豆蛋白分离物。在一些实施方案，所述无蛋冰淇淋是软饮冰淇淋或普通冰淇淋。在一些实施方案，所述无蛋冰淇淋包含一种或多种选自奶油、乳类和糖的附加组分。在一些实施方案，至少或约5％的无蛋冰淇淋是所述蛋白分离物。在一些实施方案，至少或约41％的无蛋冰淇淋是奶油。在一些实施方案，至少或约40％的无蛋冰淇淋是乳类。在一些实施方案，至少或约13％的无蛋冰淇淋是糖。在一些实施方案，所述无蛋冰淇淋还包含ι-角叉菜胶、κ-角叉菜胶、香草和盐中的一种或多种。在一些实施方案，所述奶油是浓奶油。在一些实施方案，所述乳类是全脂乳。在具体实施方案中，所述无蛋冰淇淋不含乳糖。在其他具体实施方案中，所述无蛋冰淇淋不包含胶类或稳定剂类。在其他实施方案，所述无蛋冰淇淋提供传统的口感和基于蛋的冰淇淋的质地，但相对于基于蛋的冰淇淋可以较慢的速率融化。
5.7.9脂肪减少起酥油系统(FRSS)
在另一个方面，本发明提供了脂肪减少起酥油系统，其包含本发明所述的绿豆蛋白分离物。在一些实施方案，所述FRSS包含一种或多种选自水、油或脂肪的附加组分。在一些实施方案，所述FRSS还包含柠檬酸钠。在进一步的一些实施方案中，所述FRSS还包含柑橘类纤维。在一些实施方案，至少或约5％的所述FRSS是蛋白分离物。在优选的实施方案中，与使用基于动物和/或乳制品的起酥油的相同食品应用相比，基于绿豆的FRSS能够利用FRSS降低食品应用(例如烘焙应用)中的脂肪含量。在一些实施方案，与使用基于动物和/或乳制品的起酥油的相同食品应用相比，脂肪的减少量为至少10％、20％、30％或40％。
在FRSS的具体实施方案中，所述FRSS通过本发明所述的分离方法制备，其中酸沉淀步骤在约6.0的pH下进行。一些此类实施方案中，将所得绿豆蛋白分离物在箱式干燥器上干燥。
5.7.10肉类似物
在另一个方面，本发明提供了包含本发明所述的绿豆蛋白分离物的肉类似物。在一些实施方案，所述肉类似物包含一种或多种选自水，油，磷酸氢二钠，转谷氨酰胺酶，淀粉和盐的其他组分。在一些实施方案，至少或约10％的所述肉类似物是蛋白分离物。在一些实施方案，所述肉类似物的制备包括将肉类似物的组分混合成乳液并将乳液倒入可以捆扎成香肠状物(chubbs)的肠衣中。在一些实施方案，将含有所述肉类似物的鲢鱼在50℃的水浴中温育2小时。在进一步的实施方案中，所述温育的香肠状物(chubbs)经过压力烹饪。在一些实施方案，加压蒸煮在15psi，约121℃下进行30分钟。
5.7.11食品应用：共成分(Co-Ingredients)
5.7.11.1胶类
用于配制本发明所述的一种或多种绿豆基食品的各种胶类包括例如魔芋、阿拉伯树胶、藜芦(Versawhip)、瓜尔豆胶+黄原胶、Q-提取物、CMC6000(羧甲基纤维素)、Citri-Fi200(柑橘纤维)、苹果纤维、胡芦巴纤维。
5.7.11.2磷酸盐
用于配制一种或多种本发明所述的绿豆基食品的各种磷酸盐包括磷酸氢二钠(DSP)、六偏磷酸钠(SHMP)和焦磷酸四钠(TSPP)。在具体实施方案中，所述绿豆基食品包括DSP。在一些实施方案，乳液中所述DSP的量为至少或约0.01％，0.02％，0.03％，0.04％，0.05％，0.06％，0.07％，0.08％，0.09％，0.1％，0.11％，0.12％，0.13％，0.14％或0.15％；或大于0.15％。在另一个具体实施方案中，所述绿豆基食品包含SHMP。在一些实施方案，所述SHMP是短链SHMC，常规链SHMP或长链SHMP。在一些实施方案，乳液中所述SHMP的量为至少或约0.4％，0.5％，0.6％，0.7％，0.8％，0.9％或1％；或大于1％。
5.7.11.3淀粉
淀粉是最普遍的食品成分之一，并已显示出具有有用的乳化特性。已知淀粉和淀粉颗粒可稳定乳液。因此，一种或多种淀粉由植物成分例如葛粉、玉米淀粉、木薯淀粉、绿豆淀粉、马铃薯淀粉、甘薯淀粉、大米淀粉、西米淀粉、小麦淀粉制成。疏水性允许淀粉吸附在油-水界面处，此举可防止再聚结从而防止液滴稳定性。
5.7.11.4防腐剂
在某些实施方案，所述方法和组合物包含与所述蛋白分离物组合的有效量的添加的防腐剂。
防腐剂可防止由细菌、霉菌、真菌或酵母(抗菌剂)引起的食物腐败；减缓或防止颜色、味道或质地的变化，延缓酸败(抗氧化剂)；保持新鲜感。它们包括但不限于以下物质：抗坏血酸、柠檬酸、苯甲酸钠、丙酸钙、异抗坏血酸钠、亚硝酸钠、山梨酸钙、山梨酸钾、BHA、BHT、EDTA、生育酚(维生素E)和抗氧化剂，其可防止脂肪和油类以及含有它们的食物变得腐臭或生成异味。参见表3。
表3：
5.8组合物的储存和保质期
在一些实施方案，所述蛋白分离物或包含所述蛋白分离物的组合物可在室温下储存稳定至多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10周。在一些实施方案，所述蛋白分离物或包含所述蛋白分离物的组合物可在室温下储存稳定至多达数月，例如大于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或13个月。在一些实施方案，所述蛋白分离物或包含所述蛋白分离物的组合物可用于冷藏或冷冻储存稳定数月，例如大于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或13个月。在一些实施方案，所述蛋白分离物或包含所述蛋白分离物的组合物可用于冷藏或冷冻储存稳定多年，例如大于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或13年。在一些实施方案，所述蛋白分离物或包含所述蛋白分离物的组合物可在室温下稳定储存数月，例如大于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或13个月。在一些实施方案，所述蛋白分离物或包含所述蛋白分离物的组合物可在室温下储存稳定数年，例如大于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或13年。
在一些实施方案，作为干物质的储存可增加所述蛋白分离物或包含蛋白分离物的组合物的保质期。在一些实施方案，将所述蛋白分离物或包含蛋白分离物的组合物作为干物质储存，以便随后用液体(例如水)重构。在一些实施方案，所述纯化的蛋白分离物是粉体形式，其运输成本较低，降低了腐败风险并延长了保质期(由于水含量和水活性大大降低)。
在其他实施方案，所述纯化的蛋白分离物或包含蛋白分离物的组合物用液体(例如水、乳类或其他适合食用的液体)重构。在一个实施例，可将36-45克液体加入12-15克干重的组合物中以生成液体搅拌物。可改变液体的量以适应所述重构组合物的特定目的。
在另外的实施方案中，在加热条件下、在冷藏或较冷条件下或不在环境条件下，食品组合物包含乳液中的所述纯化的蛋白分离物或其制剂配方。
6.实施例
6.1实施例1：粒度表征
种子研磨的效率反映在粉状物的粒度分布中，并且影响分离的材料的组成及其功能。使用Mastersizer eros(Malvern)表征绿豆粉的粒度，并示于表4中。用于分离的材料显示粒度分布在8-220μm的范围内。
表4：
6.2实施例2：蛋白分离物纯化方案
本实施例提供了用于制备绿豆蛋白分离物的示例性方案。
A.多级提取.将水与绿豆粉状物以5：1的自来水/粉状物比例混合。用NaOH将混合物的pH值调节至pH 6.5-pH 8。将混合物在4℃下以6000x g离心15分钟。收集提取物，将所得沉淀重悬于3：1的水-粉状物中。用NaOH将pH值调节至pH 6.5-pH 8，并在4℃下以6000x g再次离心15分钟。将两次提取物合并，并通过100μm尼龙网过滤。
B.木炭过滤或除去异味(任选的).木炭规格：～500μm-1500μm粒度，12x30目尺寸，酸洗。木炭制备：将100g木炭在3kg水中混合，倒入通过过滤器过滤并收集木炭。然后将1g木炭加入10g提取物中并温育约15分钟。然后将混合物在4℃下以10000x g离心15分钟。所述混合物也可用螯合剂处理，例如2mM CaNa2EDTA。
C.酸沉淀.将pH 5.6+/-0.2的等电沉淀与低温沉淀法在1-4℃下组合使用。用20％柠檬酸将pH值降至pH 5.4-5.8。在冰上冷却1小时。或者，低离子强度沉淀法可在非常高的流速下结合冷冻沉淀法(在1-4℃下)进行。滤液的快速稀释在冷的(4℃)0.3％NaCl中以1体积上清液与3体积冷的0.3％NaCl比例进行。然后将滤液在4℃下以10,000x g离心15分钟。
D.回收.收集沉淀，将所述沉淀重悬浮并用0.3％NaCl(4℃)(1：4(w/w))匀浆。用柠檬酸将pH值维持在5.6+/-0.1。将悬浮液在4℃下以10,000x g离心15分钟，并将最终的沉淀物均质化。
将最终的沉淀均质化并记录水分含量。
6.3实施例3：木炭处理蛋白提取物
此实施例提供了用于在蛋白提取过程中进行碳吸附步骤以除去非蛋白，异味组分(例如豆腥味)的示例性方案。输入豆类粉或材料的典型起始重量为1-12kg，典型产率为约25％，水分含量为78％左右。
木炭规格：～500um-1500um粒度，12×30目尺寸，酸洗。
木炭制备：将100g木炭在3kg水中混合，倒入过滤器中并收集。重复所述清洗步骤，总共清洗2次。
提取物的制备：将水与粉状物以3：1的水与粉状物比混合，然后在4℃下以6000×g离心20分钟。收集上清液并通过100um尼龙网过滤。
木炭处理：将制备的木炭与1L提取物混合并搅拌15分钟。然后将提取物-木炭混合物通过100um过滤器过滤以除去大的木炭颗粒，并在4℃下以10,000×g离心15分钟以除去残留的灰分。向提取物中加入500mM CaNa2EDTA至终浓度为2mM CaNa2EDTA，混合，然后在4℃下温育60分钟。滤液的快速稀释在冷(4℃)0.3％NaCl中以1体积上清液与3体积冷0.3％NaCl的比例进行。然后将滤液在4℃下以10,000×g离心15分钟，并收集沉淀。
将沉淀悬浮并用0.3％NaCl+0.7mM CaNa 2EDTA(4℃)1：4(w/w)匀浆，并在4℃下以10,000×g离心15分钟。将得到的沉淀用0.3％NaCl(4℃)清洗1：4(w/w)，然后在4℃下以10,000×g离心15分钟。
将最终的沉淀均质化并记录水分含量。
6.4实施例4：中试规模蛋白分离方法
本实施例提供了用于中试规模制备绿豆蛋白分离物的示例性方案。一般的工艺流程图如图3所示。此过程从蛋白提取阶段开始，其中研磨的绿豆粉与5-10体积的软水混合，在冷却的混合罐中形成浆体(2℃-8℃)。用食品级50％NaOH溶液调节浆体的pH值以达到pH7，以使目标蛋白溶解于水溶液中。然后将浆体送至固/液分离装置操作(通常是滗析器和盘式堆叠离心机的组合)，并将溶解的蛋白提取物与粉状物的纤维淀粉部分进行分离。
任选地，泵送所述蛋白提取物以在4℃下通过食品级炭填充的环形篮柱(<5％活性炭与蛋白提取物比率，w/w)。此碳吸附步骤的主要功能是在蛋白提取中除去非蛋白、异味组分(例如豆腥味)。其还去除一些纤维状固体/固形物，因此生成澄清的蛋白提取物。
将澄清的蛋白提取物用20％食品级柠檬酸溶液酸化，以在低温条件(2℃)下达到其等电点(pH 5.6)。在此条件下，目标蛋白沉淀析出并与水溶液分离。除了pH调节之外，在此步骤期间还添加2mM食品级EDTA以抑制可能导致异味化合物生成的脂氧合酶活性。然后将沉淀的蛋白浆体送至固/液分离装置操作(通常是一个盘式堆叠离心机)，并在所述离心步骤的重相中回收蛋白凝乳。
然后在低温条件(2℃)下在清洗步骤期间用4体积的软水清洗蛋白凝乳。清洗被认为是去除蛋白凝乳中的杂质(例如纤维状固体/固形物、盐、碳水化合物)的抛光步骤。在此步骤中，通常加入0.3％(w/w)食品级氯化钠以促进离心过程中的固/液分离。
然后将经清洗的蛋白凝乳溶液通过高温/短时(HTST)巴氏杀菌步骤进行巴氏灭菌。与乳类巴氏杀菌相似，此步骤的主要功能是杀死可能存在于经清洗的蛋白凝乳溶液中的任何致病细菌。示例性HTST条件是74℃下持续20-23秒。
处理的最后步骤是喷雾干燥，其中将经巴氏杀菌的蛋白溶液通过喷雾干燥器以除去水含量。典型的喷雾干燥条件是干燥器入口温度为170℃，干燥器出口温度为72℃。经干燥的蛋白分离物粉体通常具有<5％的水分含量。
6.5实施例5：超滤研究
进行超滤研究以评估从绿豆蛋白分离物中去除残留的源材料(例如污染包括多糖的分子)的有效性。超滤(UF)是一种多类膜过滤，其中诸如压力或浓度梯度的力导致通过半透膜分离。悬浮的固体和高分子量的溶质保留在所谓的渗余物中，而水和低分子量溶质通过渗透物中的膜(图4)。
基于所述粒度测定的一个实验使用100kDaMWCO膜。即使在低跨膜压力下，流速也比先前观察到的快得多，并且最终是各种级分(～4X浓度)。渗透物部分颜色明显为黄色并具有特征性的生豆气味。将约750ml材料浓缩至200ml，然后加入260ml新鲜的100mMNa+/K+磷酸盐缓冲液(pH6.8)清洗或渗滤。获得两种渗透物级分，来自渗滤步骤的初级和渗透物。最后将保留物体积浓缩至200ml并冲洗膜以获得残留蛋白质。
总体而言，所述方法成功地去除了与用于炒蛋的蛋白分离物中的不需要的气味相关的小分子，如通过嗅觉感测判断的，并且还通过证明大分子结构基于粒度测定在UF单元中分配而物理地去除。额外的UF试验可以确定含有剪切的水胶体的微流化材料是否可以直接进行UF。因此，所述方法提供了使用超滤去除与不需要的气味相关的小分子。
6.6等电沉淀pH值的影响
6.6.1对蛋白质产量、纯度和小分子保留的影响
研究了在等电沉淀过程中pH值的影响，以确定对所得绿豆蛋白分离物的蛋白质产率、纯度和非蛋白保留的影响。如实施例2中所述制备绿豆分离物，不同之处在于等电沉淀步骤在pH 4.9、pH 5.2、pH 5.6或pH 6下进行。蛋白质纯度(mg/蛋白质/mg干重)和蛋白质产率测定(g/g粉状物)，其结果分别如图5A和5B所示。这些结果表明，当在pH 5.6下进行等电沉淀时，蛋白质纯度和蛋白质产率最高。
尺寸排阻色谱分析也可用于分离物，其结果如图6A中所述，并汇总于图6B中。这些结果表明，在较低的pH值(即pH 4.9和5.2)下，更多小分子(例如碳水化合物，如单糖和二糖)与所述分离物中的蛋白一起回收，相对于小分子回收率，pH值越高(即pH值为5.6和6.0)时，回收蛋白的百分比显着提高。因此，绿豆蛋白在约pH 5.6至约pH 6.0的范围内进行沉淀，可提供与多余气味相关小分子的更好去除，使得所得分离物中蛋白的回收率更高。
6.6.2对粗脂质和脂肪酸保留的影响
在等电沉淀中，进一步调查pH值的影响，以确定对所得绿豆蛋白分离物中油和脂质保留的影响。绿豆分离物的制备如下。将绿豆粉与蒸馏水以1：5的比例混合，并使用顶置式混合器混合5分钟。然后使用10MNaOH将溶液的pH调节至7.0，同时进行混合。然后在4℃下将溶液以6,000g离心10分钟。然后从瓶中倾析出上清液并保存，同时弃去沉淀。将所得上清液等重量分成10批。将每批混合物与顶置式混合器混合，并使用20％(w/w)柠檬酸溶液，将pH调节至十(10)个所需pH值中的一个：pH4.4、4.6、4.8、5、5.2、5.4、5.6、5.8、6和6.2。一旦每批达到所需的pH，将溶液再搅拌1分钟，以稳定pH值。然后将每批样品移至离心机中，并在4℃下以10,000g旋转15分钟。然后弃去上清液，收集沉淀物用于定量测定：(1)总蛋白质回收率；(2)粗脂质；和(3)脂肪酸分析。
使用Dionex ASE 350系统，通过加压流体提取，提取粗脂质。使用硅藻土以约1：1的比例(w：w)混合样品。使用石油醚(BD分析)在100℃下提取所得样品5分钟。蒸发所述提取物，并将残余物重量记录为％粗脂质。使用甲基叔丁基醚(BD分析纯)，将约100mg每种粗提取物稀释至10mL。将500μL每种提取物转移至琥珀色HPLC小瓶中。通过添加250μL氢氧化三甲基锍溶液(TCI有机，0.2M甲醇溶液)，衍生游离脂肪酸。将小瓶在100℃下加热10分钟，冷却，并转移至GC进行分析。使用购自NuChekPrep的游离脂肪酸混合物74x鉴定FAME。使用FAMEWAX柱(30m×0.25mm×0.25μm，Restek)，在Agilent 7890B GC-FID系统上对样品进行分离。
如图7所示，当绿豆蛋白在pH 5.4至5.6下进行酸沉淀时，总蛋白质回收率最高，与早期观察结果一致。所述y轴表示从100.7克包含蛋白质的提取物中回收蛋白质的克数。
如图8所示，在pH 5.4至5.6下，经历酸沉淀的绿豆蛋白分离物也保留了最少量在沉淀pH范围内所测得的粗脂质。如图8A所示，当分离物在pH 4.4、4.6、4.8和5.0、6.0和6.2下进行沉淀时，相对于预沉淀提取物(最左边)中的粗脂质的量，粗脂质的总量出现富集。图9A和9B描绘了每种从pH4.4至6.2沉淀所得绿豆蛋白分离物中的特定脂肪酸(FAMES)的量。所测得的特定脂肪酸(从左至右)为：C14：0(肉豆蔻酸甲酯)；C15：0(十五烷酸甲酯)；C16：0(棕榈酸甲酯)；C16：1(棕榈油酸甲酯)；C17：0(十七烷酸甲酯)；C18：0(硬脂酸甲酯)；C18：1(油酸甲酯)；C18：2(亚油酸甲酯)；C18：3(甲基α亚油酸酯)；C20：0(二十碳酸二甲酯)；C22:0(二十二碳酸甲酯)。图9A提供了在上述每个pH值下，从沉淀的分离物中回收的每种这些脂肪酸中的量的视图，而图9B提供了较小的脂质类型的量的更近视图。对于每种所测量的特定脂肪酸，在pH 5.4至5.6下经历酸沉淀的绿豆蛋白分离物也保留了最少量的FAMES。
6.6.3对凝胶化的影响
对等电沉淀过程中pH值的影响进行了进一步的调查，以确定对结构构建性质的影响，特别是，由所得绿豆蛋白分离物形成凝胶的能力。
使用动态振荡流变学，分别对pH值为4.4、4.0、5.6和6.0沉淀所得的绿豆蛋白分离物凝胶化进行表征。使用配备有平坦平行板几何形状(直径40mm)的流变仪(MCR502，AntonPaar)，对因温度升高对每种分离物导致的粘弹性进行监测。对于每个沉淀pH值，以13.3％蛋白质浓度制备分离物样品。将约1.5mL样品加载到流变仪的下板上，并根据标准程序进调整。向溶剂捕集器中加入2mL蒸馏水，以防止由于测量期间温度升高而导致样品内的水分蒸发。
在小的变形条件(0.1％张力)下，恒定角频率为10rad/s，以5℃/min的加热速率，从30℃升温至95℃，然后在95℃下保持5分钟，在温度斜坡升温期间，连续记录储存(G')和损失(G“)模量。在95℃下保持5分钟之后，将材料的温度降低至50℃，并以10rad/s的恒定频率进行0.01至100％张力的幅度扫描测试，以表征凝胶材料的线性粘弹性区域。每个样品以一式三份运行。
分析流变学数据，以提取与表征在上文定义的条件下由分离物产生的凝胶行为相关的某些特征。
从原始数据中提取起始凝胶化温度，并将其解释为在所检查的范围内相角与温度的拐点。在凝胶化事件时，相角随温度的变化而显著降低，并且可用于温度的精确测量，在所述温度上物料的其内部结构发生了明显的转变。如图10所示，与在pH4.4至5.0(均为90.7℃)下沉淀的所得分离物相比，在pH5.6(87.4℃)至pH6.0(85.4℃)下沉淀所得分离物的凝胶起始温度显著降低。
凝胶强度还可从原始数据中提取，并将所述凝胶强度定义为储存模量超过作为振荡张力的函数的线性粘弹性范围的振荡张力(％)。如图11所示，与在pH值4.4和5.0(均低于1.40％)下沉淀所得的分离物相比，在pH值5.6(7.00％)和pH值6.0(11.83％)下沉淀所得的分离物的凝胶强度显著更高。特别地，当分离物在pH值5.6至6.0沉淀时，凝胶强度的增加幅度为约5至9倍，与在pH 4.4至5.0沉淀所得的分离物相比，具有意想不到的优异凝胶强度。同样地，从储能模量与振荡张力的原始数据中提取得到凝胶弹性，并将其定义为储能模量超过作为振荡张力的函数的线性粘弹性范围的应力(Pa)。如图12所示，与在pH 4.4(194.40Pa)至pH5.0(207Pa)下沉淀所得的分离物相比，在pH5.6(1145.08Pa)至pH6.0(8209.94Pa)下沉淀所得分离物的凝胶弹性显著更高。特别是，当分离物在pH 5.6至6.0下沉淀时，凝胶强度的增加幅度约为五至四十倍，与在pH 4.4至5.0下沉淀所得的分离物相比，具有出乎意料的优异凝胶弹性。
6.6.4对感官特性的影响
对等电沉淀过程中pH值的影响进行进一步的调查，以确定分别在pH 5.2和5.6下沉淀所得的分离物，用于制备蛋类似物蛋糕对感官性质的影响。包含在pH 5.2下沉淀所得的蛋白分离物的蛋糕制剂包括：水(78％)；蛋白分离物(14.72％)；油(6.2％)；DSP(0.42％)；乳化剂(0.4％)；盐(0.31％)和酶(0.002％)。包含在pH 5.6下沉淀所得蛋白分离物的蛋糕制剂包括：水(79％)；蛋白分离物(14.02％)；油(6.2％)；DSP(0.42％)；乳化剂(0.4％)；盐(0.31％)和酶(0.002％)。对每个样品，将绿豆蛋白分离物与配方中的水、油、磷酸氢二钠、乳化剂和盐进行混合，在中等至高剪切力混合下制备均匀混合物。然后将混合物加热至50℃，然后加入酶。然后将此材料填充到硅胶模具中，形成蛋糕。将硅氧烷模具在55℃下保持23分钟，然后转移到冲击式烘箱中，在250°F下烹饪10分钟。将硅氧烷模具冷却并脱模，得到圆形蛋糕。
使用在pH值5.2沉淀所得绿豆蛋白分离物制备的蛋糕制剂，没有完全“烹饪”，即蛋糕不形成坚固的凝胶，而使用在pH5.6沉淀所得分离物制备的蛋糕制剂形成了完整的糊状物。此结果限制了对两种蛋糕进行直接感官比较的能力。然而，10名受试者对产品进行了抽样并提供了感官评论，总结在下表5中。几乎所有受试者都认为，用在pH 5.2下沉淀所得分离物制成的蛋糕，不同于用在pH 5.6下沉淀所得分离物制成的蛋糕。用在pH 5.2下沉淀所得分离物制成的蛋糕的最常用属性描述是“酸的”。
表5.
此外，对由每种分离物制成的蛋糕进行质构剖面分析(TPA)。使用配备有38mm探针的布鲁克菲尔德纹理分析仪(Brookfield Texture Analyzer)记录仪器结构轮廓参数。样品最初由5g负载触发，以1mm/s的测试速度进行两次单轴压缩循环。目标压缩距离设定为7mm，对应于70％的变形。对硬度、粘结性、弹力和弹性进行测定，其结果在图13中提供。用在pH 5.2下沉淀的分离物制备的样品与在pH 5.6下沉淀的分离物制备的样品相比，在牢固性、粘性、弹力和弹性方面较差。
6.6.5结论
总之，在约pH值5.6至pH值6.0的pH范围内进行酸沉淀的绿豆蛋白分离物，与在低于pH值5.6的pH下经历酸沉淀的绿豆蛋白分离物相比，在蛋白质回收、凝胶化起始温度、凝胶强度、凝胶弹性和感官特性方面具有优异的品质(与小分子的回收相比)。在pH范围为约pH 5.2至pH 5.8下进行酸沉淀的绿豆蛋白分离物，与在此范围之外进行酸沉淀的绿豆蛋白分离物相比，也显示出显著较低的脂质保留。
6.7实施例7：低产量替代工艺
另一种方法，生成非常低的蛋白质量。在沉淀之前，将提取物在65℃下加热2小时，然后在25℃，10,000×g下离心1小时。弃去沉淀物，收集上清液，并以非常高的流速结合冷冻沉淀法，通过低离子强度沉淀进行沉淀。
6.8实施例8：绿豆蛋白分离物的蛋白组成
在整个分离过程中，对根据实施例2制备的绿豆蛋白分离物进行生化分析，以确定它们的组成构成，以及任何组成变化，例如蛋白富集。四(4)个非连续批次的绿豆蛋白分离物。
表6提供了根据本发明所述方法制备的绿豆蛋白分离物与起始材料去壳绿豆相比较的蛋白质、碳水化合物、脂肪、水分和灰分含量的近似分析。
表6.
绿豆蛋白主要包含(～90％)球蛋白，由8s、11s和7s球蛋白代表。8s球蛋白，通常占绿豆中总球蛋白的约90％，是分子量为～150kDa的异三聚体蛋白质，每个单体具有～49kDa的分子量。11s球蛋白，通常占绿豆中总球蛋白的10％，分子量为～64kDa。7s球蛋白，通常占绿豆中总球蛋白的5％，分子量为～44-45kDa。为了检查整个蛋白分离过程中蛋白分布的变化，对通过分离过程的渐进阶段获得的样品进行尺寸排阻色谱(SEC)分析。
图14A和14B提供了取自从绿豆粉中提取蛋白之后但在等电沉淀(IEP)之前立即获得的样品(A)和在IEP和清洗之后获得的样品(B)的蛋白分子量分布比较。提取物的IEP和清洗，导致总蛋白从62.4％(+/-5.34％)富集至70％(+/-11.7％)，非蛋白种类从37.55％(+/-5.35％)减少到30％(+/-11.7％)。似乎8s蛋白的量也出现增加(占非聚集蛋白质总量的％)，以及11s蛋白质的量出现减少(占总非聚集蛋白质的％)。
分别对从IEP步骤和清洗步骤获得的上清液和沉淀级分中的蛋白谱图进行评价，以确认在整个分离过程中8s球蛋白的富集和11s球蛋白的减少。图14C和14D显示IEP导致大部分8s球蛋白保留在沉淀(沉淀)级分中，上清液中存在非常少的8s；而大多数11s球蛋白保留在上清液中，沉淀物中几乎没有。图14E和14F显示IEP之后的清洗步骤进一步增强沉淀物中的8s球蛋白群，在上清液中留下非常少的量，而11s球蛋白在沉淀物中几乎检测不到，但构成了上清液中大部分蛋白。SEC分析发现，大部分总蛋白表现为非常高分子量的附聚物，其特性不清楚，并可代表8s和/或11s球蛋白的附聚物。然而，在整个分离过程中，对应于8s和11s分子量的种群分布模式有力表明，通过分离过程，8s球蛋白正在富集，而11s球蛋白却正在减少。
为了在蛋白质鉴定水平上判定8s球蛋白是否通过分离过程正在富集，通过二维液相色谱-串联质谱法(2D-LC-MS/MS)，对提取物和分离物的蛋白特性进行调查。针对绿豆(Vigna radiata)基因组和诱饵序列数据库查寻原始MS/MS谱。参照总蛋白量，使用光谱计数来计算每种蛋白的相对量。表7提供了样品中总蛋白丰度>1％的蛋白的预测同一性和代表性量(表示为％平均值)。提供仅通过提取过程(“提取”)所获取的样品和通过包括IEP(“分离”)的分离全过程所采集的样品的值。分离物中相对于提取物的蛋白丰度的百分比增加表示为“富集％”。
表7
图15提供了表格和图形形式的上述序列(SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.12)的氨基酸序列比对。所述比对表明SEQ IDNO 2-SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.12具有与SEQ ID NO.1至少50％内同一性，此是预测的β-伴大豆球蛋白蛋白。这些结果表明，相对于绿豆分离物组合物中的总蛋白，绿豆提取物的等电沉淀富集β-伴大豆球蛋白(高达30％)。
6.9实施例9：蛋白分离物分析
对四(4)个非连续批次的绿豆蛋白分离物(根据实施例2制备)进行分析，以验证分离过程生成一致的产品。表8中提供了批次分析的结果。结果表明，分离过程生成了一致的产品。
CFU＝菌落形成单位
6.10实施例10：氨基酸谱
对实施例9中所述的4个代表性批次绿豆蛋白分离物的氨基酸组成进行分析，其结果提供于下表9中。结果表明，所述蛋白分离物的所述氨基酸谱图在批次之间是一致的，且所述绿豆蛋白分离物含有平衡的氨基酸谱图。
6.11实施例11：维生素类、矿物质类、碳水化合物类和脂质类
对3个非连续批次的蛋白分离物(根据实施例2制备)进行维生素类、矿物质类、碳水化合物类和脂质类的分析，其结果提供于下表10中。
N/A＝不可用
6.12实施例12：环境污染物
6.12.1农药残留
考虑到所述绿豆蛋白分离物衍生自天然来源，对3个非连续批次的所述蛋白分离物进行许多氯化和有机磷农药残留物分析。测试的所述氯化农药包括甲草胺、艾氏剂、α-BHC、α-氯丹、β-BHC、DDD、DDE、DDT、δ-BHC、狄氏剂、硫丹I、硫丹II、硫丹硫酸酯、异狄氏剂、异狄氏醛、γ-BHC、γ-氯丹、七氯、七氯环氧化物、甲氧基氯和氯菊酯。测试的所述有机磷农药包括谷硫磷(azinophos methyl)、三硫憐(carbophenothion)、毒虫畏(chlorfenvinphos)、甲基毒死蜱(chlorpyrifos methy)、二嗪农、敌敌畏、毒死蜱(dursban)、地虫磷(dyfonate)、乙硫磷(ethion)、杀螟松、马拉硫磷、杀扑磷(methidathion)、甲基对硫磷、对硫磷、伏杀硫磷(phosalone)和甲基嘧啶磷(pirimiphos methyl)。表11中提供了批次分析的结果，并且表明所述绿豆蛋白分离物(根据实施例2制备)的氯化和有机磷农药残留物的水平低于0.1ppm的检测水平。
6.12.2二恶英类和多氯联苯类
除了农药残留之外，还分析了3个非连续批次绿豆蛋白分离物(根据实施例2制备)中的二恶英类和多氯联苯(PCB)类残留物。表12中提供了分析结果。确定这些化合物不存在于测试材料中或以无毒理学意义的水平存在。
ND＝未检测到；PCB＝多氯联苯；ppb＝十亿分之一；ppt＝万亿分之一。
a.环境保护局(EPA)方法1613B[高分辨率气相色谱/高分辨率质谱(HRGC/HRMS)]。
b.环境保护局(EPA)方法1668A(HRGC/HRMS)。
6.12.3霉菌毒素类
通过液相色谱-质谱法分析非连续批次的所述绿豆蛋白分离物(根据实施例2制备)中霉菌毒素，包括黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和赭曲霉毒素A的存在(LC-MS)。表13中提供的分析结果表明，所述蛋白分离物没有任何残留的霉菌毒素类物质。
a检测限＝5至10ppb
b检测限＝10ppb
6.13实施例13：抗营养因子
膳食抗营养因子是蛋白消化率、氨基酸的生物利用度和食物的蛋白质量产生不良影响的化学物质(Gilani etal.,2012)。绿豆中报道的所述抗营养因子是单宁、植酸、血凝素(凝集素)、多酚、胰蛋白酶抑制剂、a-淀粉酶抑制剂和蛋白酶抑制剂(Dahiya etal.,2015)，据报道是在某些加工步骤中部分或完全的去除，或部分或完全的降解，如去壳、发芽、浸泡和加热(Mubarak，2005)。
使用二维纳米液相色谱-质谱/质谱法(LC-MS/MS)方法结合蛋白质组学分析法，对所述绿豆蛋白分离物(根据实施例2制备)和绿豆粉的代表性批次基于蛋白的抗营养因子的存在进行分析。表14中提供的结果表明，与绿豆粉样品相比，蛋白分离过程导致凝集素和蛋白酶抑制剂的相对丰度降低。经后面的蛋白组学分析，未发现与已知-淀粉酶抑制剂相匹配的物质。在单独的分析中，对每种蛋白分离物和绿豆粉的3个代表性批次中的凝集素水平进行分析，结果显示这些样品中的凝集素水平低(<0.05mg/g)。
除了基于蛋白的抗营养因子(即蛋白酶抑制剂、α-淀粉酶抑制剂和凝集素)之外，还测量了几个绿豆蛋白和绿豆粉的代表性批次中基于非蛋白的抗营养因子(即多酚和植酸)的水平。通常，与绿豆粉中的水平(117-344mg GAE/100g)相比，在所述蛋白分离物中鉴定出低水平的总多酚(98-203mg没食子酸当量(GAE)/100g)。与绿豆粉中的植酸范围为685-716mg/100g相比，所述蛋白分离物中植酸的水平范围为759-918mg/100g。
6.14实施例14：致敏性
根据过敏原在线(AllergenOnline)数据库(http://www.allergenonline.org/)，对与绿豆相关的5种推定的蛋白过敏原进行比较蛋白分析，在5批绿豆粉及其相应的蛋白分离物(FARRP，2016)中鉴定出1,867种蛋白的联合组合。总共，粉状物和蛋白分离物中的18个序列与推定的绿豆过敏原中的4个匹配。所述匹配物在全长比对上计算得出的序列同一性>50％，E值低于1e-7。推定的过敏原为种子白蛋白(CAA50008.1，4次命中)、发病相关蛋白-10(PR-10)(AAX19889.1，2次命中)、8S球蛋白β-同种型前体(ABG02262.1，12次命中)、和8s球蛋白α-同种型前体(ABW23574.1，12次命中)。表15中示出了所述蛋白分离物和绿豆粉的代表性批次中推定的所述过敏原匹配的相对丰度。所述蛋白分离过程基本上将所述PR-10蛋白过敏原的水平移除或降低至无可忽略的水平。更具体地，在绿豆粉中检测到PR-10蛋白过敏原的水平为0.002至0.003％，且当在蛋白分离物中测量这些过敏原的水平时，在一批中检测到痕量水平(0.001％)(批号15-686-0319-120.1)，而其他4批中未检测到PR-10蛋白过敏原。与绿豆粉相比，蛋白分离过程似乎没有显著改变推定的白蛋白和球蛋白过敏原的相对丰度，且所指出的差异可能在实验误差内。
对在喷雾干燥的蛋白分离物(成品；批号123.1)中鉴定的1,083种蛋白的联合组合进行类似的分析，以及从喷雾干燥的蛋白分离物制备的未烹饪和烹饪的样品(表16)。更具体地，将喷雾干燥的样品重悬于100mM希佩斯(Hepes)pH 8.6中，并在10mM磷酸钠(NaP)pH8.0缓冲液中稀释至0.5mg/mL。接下来，为了制备未烹饪的样品，将喷雾干燥的材料溶解在水中以制备12％w/w蛋白溶液，并在10mMNaP pH 8缓冲液中稀释至0.5mg/mL。在加入NaP缓冲液之前，以类似的方式制备蒸煮的样品，并进行另外的蒸煮步骤(250°F，10分钟)。未检测到与发病相关的蛋白10(AAX19889.1)匹配。如下表16所示，蛋白分离过程和烹饪不会显著改变推定的过敏原的相对丰度(所有变化均在每个样品的初始值的3％内)。然而，假定的8s球蛋白同种型前体和α亚基两者都是绿豆种子中的主要蛋白储存来源和功能蛋白，其水平在蛋白分离过程略微富集或耗尽。
a蛋白登入号：XP_014524354、XP_014523938、NP_001304202、XP_014523923、XP_014507363、
NP_001304231、XP_014492536、XP_014523936、XP_014524353和XP_014523928的平均值。
b蛋白登入号：XP_014513134的平均值。
6.15实施例15：绿豆蛋白分离物的稳定性
目前24个月的稳定性研究正在进行，其中在室温下将4个非连续批次的所述绿豆蛋白分离物(根据实施例2制备)储存在气密容器中。在整个研究期间(即4、6、9、12、18和24个月)的不同时间点测量蛋白分离物的组成(即水分、蛋白、油、灰分和碳水化合物)。稳定性研究的中期结果列于下表17中。所述绿豆蛋白分离物的水分、蛋白含量、油含量、分和碳水化合物与已建立的产品规格没有显着差异，这表明所述蛋白分离物在储存长达6个月后是稳定的。所述蛋白分离物中油/脂质含量的值如下所示，并且这些值在储存长达6个月后没有显着变化。
6.16实施例16：所述绿豆蛋白分离物的蛋白质消化率和校正的氨基酸评分
联合国粮食及农业组织(粮农组织)于1989年提出的PDCAAS评级，于1993年被FDA采纳为评估蛋白质量的“首选最佳”方法(FAO/WHO,1991；U.S.FDA,1993)。此方法基于以下原则：蛋白的营养价值，取决于其提供足够量的氮和氨基酸，以满足人类(必需)氨基酸需求的能力。虽然一些蛋白质的质量可以使用氨基酸评分值直接进行评估，但是其他蛋白质因为消化率和/或生物利用度不佳而不能用于评估。因此，氨基酸组成和消化率测量都被认为是准确预测人类饮食食品蛋白质量所必需的(FAO/WHO，1991)。在实践中，PDCAAS将测试蛋白的第一限制必需氨基酸的含量与必需氨基酸的参考模式(即氨基酸评分)中相同氨基酸的含量相关联，以校正粪便消化率，此是通常使用大鼠平衡测定法进行测量(FAO/WHO，1991)。
使用下式计算所述绿豆蛋白分离物(根据实施例2制备)的PDCAAS，其中必需氨基酸的参考模式是基于2-5岁学前龄儿童的氨基酸要求，其由粮农组织/世界卫生组织/联合国大学于1985年确定(见表18)。
FAO＝联合国粮食及农业组织
*每种氨基酸的值是4批次数据的平均值。
**粮农组织为2至5岁的学龄前儿童确定的氨基酸参考要求(FAO/WHO/UNU，1985)。
如表18所示，所述蛋白分离物中的所述限制性氨基酸是具有0.65的最低氨基酸评分的含硫氨基酸、甲硫氨酸和半胱氨酸。考虑到0.65的氨基酸评分，基于公开的绿豆真实粪便消化率为84％(Khan etal.,1979)，所述绿豆蛋白分离物的％PDCAAS计算为0.55(即0.65x 84％)。使用两批绿豆蛋白分离物在大鼠中进行体内粪便消化率研究。在未烹饪的分离物的饮食和通过加热过程制备和烹饪的分离物上评估每种分离物的消化率。测试组由四只雄性白化大鼠组成，每只大鼠喂食15g/天的饮食，所述饮食是由大约10％的蛋白与大鼠存活所需的其他维生素、矿物质和卡路里一起配制的。试验组连续9天喂食所述饮食，在第5-9天进行粪便收集。然后通过氮含量分析粪便物的蛋白浓度，使用凯氏定氮法评估蛋白来源的真实消化率(TD)。如表19所示，体内PDCAAS值与上述体外值一致，并且不受烹饪过程的影响。对于所述绿豆蛋白分离物，平均测得的真消化率评分为96.4，与酪蛋白对照的测得的真消化率评分97.1相比是有利的。
6.17实施例17：来自绿豆和其他植物来源的分离物的热表征
通过差示扫描量热法(DSC)测定绿豆蛋白分离物(根据实施例2制备)作为热稳定性的指标的变性。使用固态差示扫描量热计(Q20，TA Instruments)测定变性温度。吸热峰的温度与蛋白质变性有关。通过低离子强度的低温沉淀生成来自各种植物来源的分离物。使用蒸馏水稀释至13％固体进行调节的分离溶液用于DSC分析。在40℃下平衡后，将封闭在密封铝盘中的样品和空的对照盘以3℃/min的增量从40℃加热至120℃。与全蛋类似，绿豆中的分离物显示出比来自其他植物来源(84℃-101℃)的材料显著更低的热稳定性(70℃-78℃)。蛋白分离物的变性温度示出在图16中，并总结于下表20中。
表20
使用固态差示扫描量热法，研究从不同绿豆来源纯化的蛋白分离物的解折叠热力学。通过低离子强度沉淀，在非常高的流速下结合冷冻沉淀法，分离蛋白质。温度扫描范围为40℃至100℃，速率为每分钟4℃。熔化温度在77℃至85℃之间变化，如图17所示。
使用固态差示扫描量热法，研究由pH值.5.6下等电沉淀制备的蛋白的解折叠热力学。巴氏灭菌前的分离物(62.1)、巴氏杀菌后的分离物(62.2)、喷雾干燥的分离物(62.3)以不同的固体百分比溶解，并进行比较。熔化温度和材料吸收的热量(焓)分别如图18A和图18B。温度扫描范围为40℃至100℃，速率为每分钟5℃。喷雾干燥分离物变性温度较高(向上移动2℃至5℃)，所有分离物的变性吸收能量相同，固体％增加。
6.18实施例18：凝胶化：水结合能力和结构构建性能
表21示出了用于评估植物分离物样品在热诱导凝胶化、通过离心破碎后保留液体(水)能力的水结合能力。％WBC越高，保留的水量越高。将植物分离物用蒸馏水归一化至13％固体，在65℃加热，85℃加热60分钟，并以4700rpm离心15分钟。计算离心过程中凝胶释放的血清重量％WBC。
表21
图19示出了热诱导的绿豆分离物凝胶在两个温度(65℃和85℃)下显示出比来自其他植物来源的分离凝胶更高的水结合能力，这表明更强的凝胶网络和增加的绿豆分离物的功能。
在65℃下热诱导凝胶化10-90分钟后测定凝胶结构的强度。冷却后，通过旋转仪(Vortex)剧烈搅拌样品。根据以下标准进行分类，对观察来自绿豆和其他植物来源的分离物中的热诱导凝胶的结构进行目视评估和分类，其结果如表22所示：
表22
这些结果表明，相对于其他测试的植物分离物，绿豆蛋白分离物在加热时显示出更高的凝胶化和凝胶网络构建性质。
6.19实施例19：使用动态振荡流变学的绿豆分离物和其他植物来源的流变学表征
用动态振荡流变学表征绿豆的高纯度蛋白分离物，其他植物来源和所关注的食物应用的凝胶化。使用配置有平行板几何形状(直径40mm)的发现混合流变仪(TAInstruments)，检测材料在45℃-95℃温度范围内、变形条件(0.5％张力)为10弧度/秒的恒定角频率下的的存储(G')和损耗(G“)模量。当G'经历最高相对增加的温度时，记录凝胶化温度。在每个振荡温度斜坡之后，材料的温度降低到50℃，并进行0.01％至10％张力的振幅扫描测试，以记录凝胶材料的线性粘弹性区域。
图20示出了来自各种绿豆来源的分离物的凝胶化温度：HCF-213、HCF-234和HCF-208a具有与全蛋相当的凝胶化温度。
图21在视觉上描绘了从单一来源获得的所述凝胶化绿豆分离物，但与蛋相比，在不同条件下进行沉淀。虽然在与均质化的全壳蛋相同的温度下，配制的所述绿豆分离物不凝胶化(参见图22)，但它们在幅度扫描中具有类似于全蛋的粘弹性曲线，尤其是通过盐沉淀获得的所述分离物(参见图23)。
6.20实施例20：使用质构剖面分析(TPA)对凝胶绿豆分离物进行纹理表征
使用配备38mm探针的布鲁克菲尔德纹理分析仪(Brookfield TextureAnalyzer)，记录仪器纹理轮廓参数。样品以1mm/s的测试速度进行两次单轴压缩循环，最初由5g负载触发。目标压缩距离设定为7mm，对应于70％的变形。测定硬度、粘结性、弹力、咀嚼性和弹性，并与所关注的食品应用进行比较。使用主成分分析二维可视化仪，图24比较了在不同过程下配制的绿豆分离物与各种对比蛋的结构特征。几种使用不同流程1-4(即JP1-69、JP1-70、JP1-71)配制的纯化蛋白分离物的结构，在硬度、粘结性、弹性、咀嚼性和硬度、粘性、弹力、咀嚼性和弹性方面表示出来，与对比蛋的结构进行对比。用于蛋白质修饰酶，水胶体和盐水平的组分中的配方是不同的。纯化参数在pH、盐、酸、温度和时间方面发生了变化。
6.21实施例21：发泡能力试验
使用美膳雅(Cuisinart)手持式混合器，在室温下以4速搅拌4-6分钟，注意样品没有过度搅拌，制备蛋白质溶液泡沫(在指定浓度下)后，通过测量％膨胀率，对绿豆分离物(根据实施例2制备)进行发泡能力测试。％膨胀率测量为泡沫体积与初始液体体积的比率。然后将泡沫静置30分钟并测量％排水。％排水率，作为泡沫稳定性的指标，是30分钟后泡沫体积与初始泡沫体积的比率。％排水率越高，表明泡沫稳定性越低。图25示出了2种绿豆蛋白分离物与对照蛋白比较而得的％膨胀率和％排水量的结果。
6.22实施例22：来自绿豆的分离物的溶解度的表征
使用比浊法测量绿豆分离物(根据实施例2制备)的溶解度。比浊法测量液体样品中散射的光量，并以高灵敏度对浊度进行定量。使用NEPHELOstarPlus板读数器(BMGLabtech)对96孔基板进行溶解度测量。NEPHELOstar使用波长为632.8nm的偏振氦氖激光器。所使用的浊度计设置包括2.5mm的光束焦点和10％的强度。采用直径为3毫米轨道均值。每孔的测量时间为0.26秒，定位延迟(稳定时间)为0.1秒。在测量之前，将每个板在500rpm下进行10s的双轨道振荡，以使孔内的样品溶液均匀化。溶解度测量在室温下进行，使用透明、平底96孔Greiner微孔板。在各种溶剂条件下，包括pH值3、5和7，以及在0、0.4、0.8和1wt％NaCl下存在下，研究绿豆分离物的溶解度。使用柠檬酸盐和磷酸氢二钠缓冲液，对含水级分的pH值进行控制。使用浓度梯度范围为0-8.9wt％蛋白分离物，对所有12种溶剂条件下(3个pH×4个NaCl浓度)的蛋白溶解度进行测定。每次测量一式三份进行，以确保重现性。
通过相对浊度计单位(RNU)的数据与蛋白浓度的线性拟合，测定溶解度。拟合两条线，并优化线性回归，以获得两条最适合RNU增加的线，所述RNU随着蛋白质浓度的增加而发生。测定对应此两条线彼此相交蛋白浓度的溶解度值。图26中提供的数据对应于这些溶解度值。在几乎所有测试的条件下，与牛奶、均质化的全蛋、chia、高粱粉和有机牛奶相比，含有绿豆蛋白分离物的水溶液显示出优异的溶解性。
6.23实施例23：来自绿豆的分离物的泡沫稳定性的表征
在Krüss的泡沫动态分析仪(Dynamic FoamAnalyzer，DFA100)仪器上进行泡沫稳定性测定。使用三种测定模式来收集关于泡沫稳定性的最大量的信息：泡沫和液位高度(通过光散射测定)，结构(通过图像分析泡沫的时间流逝图像来测定)和液体含量(通过沿整个样品的不同高度配置的一串电极测定的电导率来测定)。Advance软件用于数据分析。使用以下仪器设置：空气流速为0.2L/min，高度测定的光照度为40％，结构测定的光照度为75％。使用45mL蛋白水溶液，并对所述液体机械吹扫两倍体积(90mL)空气。使空气通过DFA100中的16-40μm烧结玻璃料。在10分钟的时间段内评估泡沫的稳定性，此时间在对样品吹扫空气后立即开始。数据采样间隔为每分钟6帧(fpm)，生成用于气泡结构分析的60个图像。将摄像机定位在测定容器底部上方55mm的高度处。
在各种溶剂条件下制备含水蛋白样品，包括在pH值为3、5和7、和蛋白浓度为4.2和8.9wt％蛋白下。使用柠檬酸盐和磷酸氢二钠缓冲液来控制含水级分的pH值。每个样品以一式三份进行。
计算泡沫的稳定性作为泡沫指数。所述泡沫稳定性是最大泡沫高度和泡沫高度随时间衰减的量度。从空气吹扫结束到实验结束(10分钟)，以时间积分泡沫和溶液的总高度。此积分结合了最大发泡能力(如由最大高度所述)和稳定性(由泡沫和溶液的高度损失确定)的影响。高泡沫指数表明为发泡性能良好的物料。图27中的数据报告了绿豆分离物和几种参考物料的泡沫质量。
6.24实施例24：来自绿豆的分离物的乳液稳定性的表征
对含有绿豆蛋白分离物的水包油乳液进行乳液稳定性测定，以研究分离物的乳化性质。首先，制备在各种溶剂条件下的分离物水溶液。乳液中的最终蛋白浓度为4.2和8.9wt％蛋白，并且在pH值为3、5和7以及不存在和存在NaCl(1wt％)的情况下制备含水级分。使用柠檬酸盐和磷酸氢二钠缓冲液来控制含水级分的pH值。高速涡旋混合水溶液约10秒。通过血清移液管以总体积的1/3的质量比加入菜籽油，并高速涡旋10秒。使用具有ProScientific PRO25D均化器的20mm锯齿探针在5000rpm下将所述总体积(约15mL)均化4分钟。然后使用正位移移液管将乳液分配至4mL玻璃小瓶中，每个玻璃小瓶分配3mL样品。每个样品以一式三份进行。在测定之前，使用Pro Scientific PRO25D均化器，采用7mm直径的锯齿探针将样品在5000rpm下均化4分钟。
Formulaction Turbiscan Lab仪器用于研究乳液稳定性。此仪器使用光散射来表征乳液中的相分离。由仪器收集的原始数据包括作为样品高度与时间之间函数的透射率和反向散射值。在10分钟的时间内测定每个样品，以25秒的时间间隔测定样品上的入射光的反向散射。
处理来自Turbiscan测量仪的反向散射数据，以评估作为时间函数的总体乳液稳定性。减去在0分钟时间点测定的反向散射基线后，检查在10分钟的最终时间点的反向散射(BS)(等式1)。使用相对样品的整个高度在10分钟处的后向散射(ΔBS)的这种变化来提取乳液稳定性的指数，称为稳定性指数(SI)(等式2，图28)。稳定性指数基本上是ΔBS相对于高度的曲线下面积，并且由以下所示的等式定义。
ΔBSh，t＝BSh，t-BSh，0 (1)
稳定性指数越高，乳液的稳定性越差。稳定性指数越低表明乳液稳定性越高。
6.25实施例25：液体蛋代用品
图29(A-D)在视觉上描绘了包含绿豆蛋白分离物的四种液体蛋替代配方。
A---绿豆分离物
B---绿豆分离物与ι-角叉菜胶&阿拉伯树胶
C---绿豆分离物与魔芋&黄原胶
D---绿豆分离物与结冷胶
图30示出了液体搅拌配方中粘度与剪切速率的比较。含有绿豆蛋白分离物和结冷胶的蛋状蛋糕配方具有与普通蛋类似的粘度特征。他们的牛顿行为使它们可以倾倒并且适合用作液体蛋糊代用品。
蛋状蛋糕的代表性配方包括：水(75-85％)；绿豆蛋白分离物(10-15％)；油(5-10％)；水胶体(0.1-3％)(包括下列组合之一：(1)高酰基和低酰基结冷胶；(2)ι-角叉菜胶和阿拉伯树胶；(3)魔芋胶和黄原胶胶；淀粉(0.1-6％)；味道(1-2％)；和盐(<1％))。乳液混合物的pH值为5.6-6.8。
将来自绿豆的高纯度分离物再水化至80％水分含量，并用1MNaOH调节至pH值6.0。在室温下，使用以5000rpm运行的Pro Scientific剪切混合器，制备植物蛋白分离物、油、水胶体、盐和其他成分的乳液。将乳液沉积在圆形模具(直径为3英寸)中，每个模具沉积的量为50g。对流烤箱设定在220°F，烘烤55分钟。
6.26实施例26：使用转谷氨酰胺酶制备搅拌物产品(Scramble Product)
在加工过程中，通过与转谷氨酰胺酶发生预反应，制备和使用绿豆蛋白浓缩物或分离物。将转谷氨酰胺酶加入到含有绿豆蛋白的含水中间工艺流中，在规定的温度下培养一段规定的时间，然后通过加热短时间，或者加入如过氧化氢的氧化剂使酶失活。在制备蛋白质浓缩物或分离物的过程中的多个点施用转谷氨酰胺酶。此流程的结果是纯化的、稳定的、交联的、高功能的绿豆富集蛋白的产品，所述产品可用于冷藏或室温贮存稳定液状基于植物的食品乳液。
在使蛋白质与转谷氨酰胺酶粉末接触后，注意到0.2％转谷氨酰胺酶处理的提取物比0％转谷氨酰胺酶更浑浊，表明转谷氨酰胺酶处理的提取物中蛋白质发生聚集。图31显示在50℃培养15分钟后但在等电沉淀之前的提取物。显然，用转谷氨酰胺酶处理的所有提取物随着添加更多转谷氨酰胺酶而更浑浊，再次表明转谷氨酰胺酶处理的提取物中蛋白发生聚集。还注意到，在此流程的冷却部分后，较高的转谷氨酰胺酶提取物开始形成凝乳。
进行附加的测试，以判定添加到900g提取物中的不同量的转谷氨酰胺酶粉末如何影响搅拌物配方中的最终分离物。图32示出了转谷氨酰胺酶粉末的变化量(作为提取物重量的百分比)。转谷氨酰胺酶的增加量，可导致橡胶状沉淀或凝乳。
在搅拌类似物中，掺入与转谷氨酰胺酶反应的蛋白的优选实施方式，引进更蓬松、更通风和/或更少粉末的特征。见图33，图示描述了在烹饪过程中显示的含有0.0125％转谷氨酰胺酶的改良搅拌物配方；和图34所示，其将所需的特征性蓬松，更通风和更少粉末的搅拌物与不含转谷氨酰胺酶的搅拌物进行比较。
6.27实施例27：转谷氨酰胺酶反应的绿豆蛋白的分析
为了判定转谷氨酰胺酶是否以及在何种程度上将脂氧合酶交联到制备的绿豆分离物中的目标蛋白球蛋白上，如图1B所示，在等电沉淀之前与不同量的转谷氨酰胺酶反应，制备分离物。沉淀后收集上清液和沉淀(含有富含球蛋白的重馏分)，在SDS PAGE上运行，通过蛋白印迹法(Western Blotting)，测定每个样品中脂氧合酶的量。
图35描绘了对脂氧合酶染色的蛋白印迹，所有泳道含有来自上清液(泳道4-9)或沉淀(泳道10-12)的约5μg蛋白样品，其中样品已经与不同量的如下转谷氨酰胺酶发生反应：
泳道键(所有上清液和沉淀均在IEP后)：
1.提取物
2. 0％TG上清液
3.梯形图
4. 0.0125％TG上清液
5. 0.025％TG上清液
6. 0.05％TG上清液
7. 0.1％TG上清液
8. 0.15％TG上清液
9. 0.2％上清液
10. 0％TG沉淀
11. 0.0125％TG沉淀
12. 0.025％TG沉淀
如在泳道10-12中所示，无脂氧合酶被带到富含球蛋白的沉淀上，而泳道2和4-9显示脂氧合酶明显保留在上清液中。不受理论的束缚，虽然预计转谷氨酰胺酶可能将脂氧合酶与所需的蛋白进行交联，但这一结果意味着，转谷氨酰胺酶并非与脂氧合酶进行交联或不与目标蛋白质球蛋白进行交联，这是出乎意料的。
为了判定在用转谷氨酰胺酶处理的沉淀中是否形成任何高分子量蛋白复合物，所述膜是丽春红染色的。如图36所示，似乎存在约100-150kda的高分子量蛋白(以椭圆形示出)。此外，与0％转谷氨酰胺酶相比，这些沉淀中50Kda球蛋白带的量减少，这指明一种由球蛋白连接在一起形成的复合物。需设计另外的测试进一步辨别复合物。
为了判定转谷氨酰胺酶处理对由分离步骤生成蛋白的产量的影响，对来自与不同量的转谷氨酰胺酶反应的样品的上清液和沉淀的蛋白量进行评估。如图37所示，上清液的蛋白浓度，随着转谷氨酰胺酶量的增加而降低。如图38所示，在提取物中加入0.05％转谷氨酰胺酶后，最终蛋白分离物的％干燥产率(所用沉淀/粉状物中的固体g)增加。同时，这些结果表明，在富含球蛋白的沉淀级分中保留了蛋白越多，随着转移谷氨酰胺酶处理过程中转谷氨酰胺酶处理量的增加，总蛋白质产量增加。
同时，这些结果表明，在分离过程中，随着转谷氨酰胺酶处理量的增加，更多的蛋白质保留在富含球蛋白的沉淀级分中，并且总蛋白质产量增加。
6.28实施例28：磷酸盐对绿豆衍生的蛋类似物组合物的影响
磷酸盐通常用作乳制品和肉蛋白系统中的缓冲和乳化盐。已经证明，蛋白系统中使用的磷酸盐类型及其浓度，会影响蛋白的结构和功能特性。本实施例展示了三种磷酸盐：((1)磷酸氢二钠；(2)六偏磷酸钠；和(3)焦磷酸四钠)及其浓度对蛋糕类似物和液体蛋类似物中绿豆蛋白分离物功能的影响。
6.28.1磷酸氢二钠浓度对使用绿豆蛋白分离物制备的蛋糕类似物结构特性的影响
使用含不同水平的磷酸氢二钠、水、低芥酸菜子油、酶的绿豆蛋白分离物制备蛋糕类似物，如表23中所述。将所有成分混合，制成均匀混合物。将所述混合物加热至40-55℃，并倒入每个装有50g圆形硅氧烷模具的空腔中。将模具在40-50℃下培养20-60分钟，然后在250-275℉下置于对流烘箱中烘烤45-60分钟，制成蛋糕。烘焙后，将蛋糕冷却至室温，脱模，用于纹理轮廓分析。
使用配备38mm直径圆柱形探针的布鲁克菲尔德纹理分析仪(Brookfield TextureAnalyzer)，对绿豆蛋白蛋糕进行结构剖面分析。将绿豆蛋糕样品切成直径为2.54cm，高度为1cm的圆柱体。使用在5g负载下触发的两个单轴压缩循环分析样品。目标压缩距离设定为0.7cm，对应于以1mm/s的速率实施70％变形。测定绿豆蛋白蛋糕的硬度、粘结性、弹力和弹性，并与商品蛋糕产品进行比较。
表23.
向配方中加入在0.01-0.5％之间的磷酸氢二钠，改善绿豆蛋糕的整体感官特性，并且紧密地模拟蛋糕的结构(图39)。在没有DSP(0％)的情况下，与含蛋的蛋糕相比，绿豆蛋糕具有显著更低的硬度、粘结性、弹力和弹性。添加DSP后，绿豆蛋糕的硬度、粘结性、弹力和弹性增加，与含蛋的蛋糕相当。结构参数在0.06和0.5％之间没有显着变化，并且在此浓度范围内与DSP剂量无关。这些结果表明，DSP影响绿豆蛋白分离物在蛋糕类似物配方中的功能，提供改善的结构性能。使用磷酸氢二钠剂量低至0.06％的绿豆蛋糕有助于实现配方中蛋糕型结构。
6.28.2磷酸氢二钠浓度对绿豆蛋白分离物分散性的影响
使用表24中所示的配方制备绿豆分离物分散体。首先，将磷酸氢二钠与蒸馏水混合并涡旋直至完全溶解。然后将绿豆蛋白分离物加入溶液中，并使用Pro Scientific Inc.均化器在6000-7000rpm下均化3-5分钟。将样品置于冰箱(～4℃)中24小时，然后照片记录，并进行pH值测量。
表24：含DSP的绿豆蛋白分离物分散体
DSP浓度的增加，改善了绿豆蛋白分离物在水中的分散稳定性。不含DSP(0％DSP)的样品，定性地显示在24小时内静置时的最大分离(图40)，其中绿豆蛋白分离物朝向管底部沉降，形成相对透明的顶层液体。在浓度为0.43％和1％DSP时，静置24小时后未观察到分离。此外，随着DSP浓度的增加，绿豆蛋白分离物的pH值也随之增加。这些结果表明，添加磷酸氢二钠，可提高绿豆蛋白分离物的分散能力和分散稳定性。pH变化和混合物离子强度的变化可以是驱动分散稳定性的机制。
6.28.3六偏磷酸钠浓度和链长对绿豆蛋白分离物制备的液体蛋类似物粘度和乳化稳定性的影响
表25:磷酸盐测试
磷酸盐测试 pH(1％；去离子水) 简称
六偏磷酸钠长链FCC，粉碎 6 SHMP22
六偏磷酸钠正链FCC，粉末 7 SHMP11
六偏磷酸钠短链，粉末 8.3 SHMP6
使用表26中所示的配方制备液体蛋类似物。将所有成分混合，制备一致且均匀的混合物。将混合物在50-55℃保持10-20分钟，然后在70-75℃下巴氏灭菌5-15分钟。将从巴氏灭菌器倒出的最终混合物装瓶，并冷藏储存，直至进一步测试。
在4℃下，使用剪切流变仪(发现HR-1、TA仪器)在0.1s-1至50s-1的不同剪切速率下测量这些样品的粘度。通过目测评估乳液中的分离，定性测量乳液稳定性。
表26：使用绿豆蛋白分离物的液体蛋类似物的配方
加入长链六偏磷酸钠，大大降低了使用绿豆蛋白分离物制成的液体蛋类似物配方的粘度(图41)。随着配方中SHMP22浓度在0.1和1.1％之间范围内的增加，配方中粘度降低。SHMP22的1.03％配方的粘度(0.62±0.01Pa-s)与液体全蛋的粘度(0.14±0.02Pa-s)接近，相比之下，不含SHMP的配方，其粘度更高(4.1±0.35Pa-s)。
与长链六偏磷酸钠相比，短链七亚磷酸钠对绿豆蛋白液体蛋类似物的粘度具有更大的影响。在1.03％时，配方中的SHMP6比SHMP 22和SHMP11进一步降低了粘度，并且与液体全蛋更相当(图42)。另外，对于给定类型的六偏磷酸钠链长，SHMP浓度越高(在0.1-1.1％之间)，配方粘度越低。
当在超过13天的冷藏储存测试时，SHMP22浓度越高，产生乳液越稳定(图43)。使用1.03％SHMP22制备的制剂在13天的冷藏中未分离。然而，SHMP22在0.135％的制剂中不太稳定，并且在储存13天后显示出分离。
6.28.4焦磷酸四钠(TSPP)对使用绿豆蛋白分离物制备的液体蛋类似物粘度的影响
TSPP的添加大大降低了使用绿豆蛋白分离物制成的液体蛋类似物制剂的粘度，类似于六偏磷酸钠降低粘度的方式(图44)。随着配方中TSPP浓度在0.2和1％之间的增加，粘度降低。
6.29实施例29：绿豆蛋糕稳定性
6.29.1湿度和pH值
在12周内评估绿豆蛋糕在冷冻储存条件(-20和-80℃)下的稳定性。所述绿豆蛋糕由15.5％喷雾干燥的绿豆蛋白分离物(批号122.1)、水、盐、脂肪和少量食品添加剂(<3％产品)制备。将各成分混合，并在121.1℃下预煮10分钟，并装入聚乙烯袋中，在研究过程中储存在冰箱里。在0、2、4、8和12周测量pH值和水分的变化。在每个时间点，将冷冻蛋糕在121.1℃的对流烘箱中解冻20至24分钟，直至内部温度为74℃。使用标准pH计测量pH值，通过重量分析法使用干燥失重分析仪测量蛋糕中的水分含量。总体而言，在整个研究期间pH和湿度没有显著变化，表明绿豆蛋糕在-20和-80℃下储存12周后是稳定的(表27)。
6.29.2纹理轮廓
在第0天以及第2、4、8和12周，评价如上6.29.1节中所述制备的绿豆蛋糕结构特征(硬度，咀嚼性，弹力，弹性和粘结性)。储存条件(-20℃和-80℃)与如上6.29.1节中所述的相似。在Brookfield CT3分析仪上，使用圆柱形探针(38mm直径)进行纹理轮廓分析，所述圆柱形探针设定为70％变形，触发负荷为5.0g，测试速度为1mm/s。分析结果在图45中提供。总体而言，绿豆蛋糕的硬度，咀嚼性和粘结性在研究的前4周增加，并且在第8周和第12周之间没有显着差异。尽管在整个研究的前半部分，这些性质发生了变化，感官小组成员报告没有显著差异。
6.30实施例30：使用酸沉淀法所制的其他植物蛋白分离物的感官结果
使用上述酸沉淀方法所制得大豆蛋白分离物，制备蛋状糊状产品。所得产物具有非常难闻的气味和味道，并且乳液是粘稠的。所述产品看起来非常类似于华夫饼糊，没有流动，并且试图混合时是淤泥。成品的结构很差，大多数配方甚至都没有烹饪。当它烹饪时，生成粉红色的内部结构，烹饪的产品具有一个非常丝绸般的顶部，内部出现一点分离。
使用上述酸沉淀方法制备的蚕豆蛋白分离物，制备蛋糊状产品。所得到的产品最初没有任何气味，但随着混合启动，乳液发出一种非常强烈的“酸奶酪”气味，所述气味变得明显。此种气味延续到产品的味道。此种产品颜色非常黄，并且煮成一团质量小的凝乳。所述产品没有形成一个固体单元，烹饪后似乎破碎了。
使用上述酸沉淀方法制备而成的鹰嘴豆蛋白分离物，制备蛋糊状产品。所得到的产物表现不佳，是本实验中表现最差的蛋白分离物之一。由于蛋白中含有大量水分，8个冰球中有6个爆炸。当它达到室温时，所述蛋白在容器中脱水，基本上受到了破坏。味道类似于鹰嘴豆泥或芝麻酱的苦味，这种味道非常令人不愉快。纹理也很差，特别是那些爆炸的蛋白。
6.31实施例31：奶油干酪类似物
代表性的奶油干酪类似物制剂包括：
水(75-85％)
蛋白分离物(10-15％)
油(5-10％)
水胶体(0.1-3％)，其中包括1)低甲氧基果胶和氯化钙体系；2)黄原胶
调味剂(1-2％)
盐(<1％)
在室温下，使用Pro Scientific剪切混合器以5000rpm运行4分钟，制备植物蛋白分离物、油、水胶体、盐和其他成分的乳液。将乳液沉积在圆形模具中(直径3英寸)。每个模具沉积的量为50g。流烤箱设定在220°F，55分钟。
6.32实施例32：替代性酸奶系统
代表性的替代酸奶配方包括：水、绿豆蛋白分离物、糖、油和细菌培养物。
以下测试是在魔豆酸奶原型上进行的，并针对达能(Dannon)的全天然原味酸奶和卢塞恩(Lucerne)的希腊原味酸奶进行基准测试。
6.32.1凝胶体系的流变性质
使用流变仪DHR-1测量原型的流变学性质，其中1ml样品进行0.03-500Pa的振荡幅度，在10℃下具有1Hz的恒定频率，具有锥板内几何形状进行扫描。测量储能模量和损耗模量，其可以帮助识别凝胶的粘弹性。LVE区域中G'的平台值描述了静止样品的刚性，而G”的平台值是未剪切样品粘度的量度。屈服应力也来自储能模量和损耗模量函数的交点，表明材料在此处从粘弹性固体转变为粘弹性液体。
表28
上述结果表明，用绿豆蛋白分离物制备的酸奶原型，显示出与达能酸奶更相似的结构。卢塞恩的希腊酸奶相比，所述酸奶原型具有光滑和奶油结构，其具有更硬化的凝胶状结构。所述原型仅使用椰子油、蛋白和水制成。添加稳定剂和胶类可以使产品更接近结构光谱的另一端。
6.32.2乳液凝胶的结构分析
使用Brookfield TA仪器对这3个样品进行结构剖面分析。TPA是一种测试，其中样品在循环中被压缩两次。使用圆柱形探针TA-11(25.4mmD，35mmL)在6孔板孔中压缩16ml样品。测试速度设定为1mm/s，目标压缩为10mm。对3个样品重复进行三次压缩，获得以下数据(表29)。
酸奶 凝胶硬度(g)
绿豆 18
达能(Dannon) 36
卢塞恩(Lucerne) 166
上述结果表明，用绿豆蛋白分离物制备的原型，具有与达能更相似的口感和结构，差异为2倍。
6.33实施例33：绿豆衍生的蛋白饮料系统
代表性蛋白饮料系统制剂包括：水、绿豆蛋白分离物、糖和油。
对绿豆衍生的蛋白饮料原型进行粒度分析，并对有机谷的全脂牛奶和一半&一半，365日常价值(Everyday Value)的杏仁乳进行基准测试。乳液稳定性也是针对丝(Silk)的椰奶和365日常价值的豆浆的基准。
6.33.1脂肪滴的粒度
使用Mastersizer 3000测量脂肪滴的粒度分布。此仪器利用激光衍射，测量由分散颗粒衍射的散射光的强度的角度变化。然后使用米氏(Mie)光散射理论，分析角散射强度数，计算产生散射图案的粒子的尺寸。
首先将乳液样品在蒸馏水中稀释，并加入到室中，直到激光遮蔽极限在测量范围内。
下表30和图46中的数据示出了饮料产品中颗粒的平均尺寸等级。此图是通过对从三次测定获得的三个分布求平均值而生成的。如图46所示，乳制品替代饮料产品观察到两个峰，而乳制品饮料仅观察到一个峰。
表30
6.33.2液体乳液体系的乳液稳定性
当光源随时间经过乳剂样品时，通过检测反向散射和透射的变化，测量乳剂稳定性。将3ml的乳液样品转移到玻璃小瓶中，并在室温下每1分钟进行扫描，共扫描60分钟。
稳定性分析仪的稳定性指数(TSI)用于反映所研究的乳液样品的乳液稳定性。它被计算为相对于第一次扫描的累积Δ后向散射差。TSI的值越大，检测到的后向散射之间的差异越大，表明样品的稳定性越低。
表31
所述TSI值用于在相同协议下的样本之间的比较。如表31和图47中的数据所示，豆浆蛋白质饮料制成的原型，与豆奶饮料相比，具有类似的稳定性行为。所述TSI值比椰奶低6倍，表明绿豆蛋白基饮料比椰奶饮料具有更好的存储稳定性。
6.34实施例34：绿豆蛋白衍生的黄油系统
代表性的基于绿豆的黄油系统包括：磷酸氢二钠、水、绿豆蛋白分离物、细菌培养物和油。图48中描绘了原型非乳制绿豆基黄油系统。
6.35实施例35：磅蛋糕
图49提供了在从绿豆提取物中分离蛋白的各个阶段期间的视觉描绘，其中美拉德(Maillard)反应物和豆腥味的浓度显著降低。绿豆分离物在烘焙食品中的应用，导致更好的产品外观(更浅的颜色)和感官特性(减少的苦味和豆腥味)。图50提供了与用蛋制成的磅蛋糕相比19％的绿豆蛋白提取物的磅蛋糕的横截面。图51提供了磅蛋糕圆弧顶的顶视图，其中基于蛋的蛋糕(左)和再溶解的沉淀(右)具有与原始蛋白提取物(中心)相反的类似圆顶和裂缝。
使用蛋白提取物的代表性磅蛋糕配方包括：蛋糕粉(25％)，黄油(25％)，糖(25％)，34％总固体的蛋白提取物和19％蛋白。
在霍巴特(Hobart)N90混合器上，使用单阶段混合方法，以低速使用平桨制备蛋糕面糊。将粉状物、糖和黄油加入混合器中。通过将绿豆粉与水以1：1(w/w)的比例混合，在室温下，以6000×g离心30分钟，制备绿豆提取物。将蛋白提取物以流的形式加入，并低速混合1分钟。以中速继续混合5分钟。将面糊倒入21盎司的矩形铝盘中，在300°F下，烘烤45分钟。比较绿豆提取物磅蛋糕和含蛋磅蛋糕，如图49所示。并标识示在下表32中。
表32
属性 绿豆提取物磅蛋糕 蛋磅蛋糕
比重 0.92±0.04 0.91±0.01
峰高(内) 2.89±0.07 2.400.01
使用蛋白分离物的代表性磅蛋糕配方包括：蛋糕粉(25％)，黄油(25％)，糖(25％)，含蛋白分离物固体(>80％蛋白)(5-6.25％)，磷酸氢二钠或小苏打，和水。
表33提供了用纯化的绿豆蛋白分离物制备的代表性磅蛋糕与含蛋的磅蛋糕的功能特性比较的结果。
表33
在霍巴特(Hobart)N90混合器上，使用单阶段混合方法，以低速使用平桨制备蛋糕面糊。将粉状物、糖和黄油加入霍巴特(Hobart)N50搅拌机中。混合蛋白分离物和水。在流中加入蛋白分离物，以低速混合一分钟。继续以中速混合5分钟。将面糊倒入10盎司长方形铝盘中。在300°F下烘烤45分钟。用纯化蛋白分离物制备的代表性磅状蛋糕示出在图52中。
6.36实施例36：天使蛋糕
使用纯化的绿豆蛋白分离物制成的代表性天使蛋糕配方包括：蛋糕粉(15.2％)、酒石膏(0.6％)、糖(42％)、盐(0.2％)、蛋白分离物固体(7.56-10.5％)、磷酸氢二钠(pH稳定剂)(0-0.21％)，加水(31-34.23)。
用添加的水和磷酸氢二钠溶解蛋白。将蛋白分离物、添加的水、磷酸氢二钠和塔塔粉在具有气泡搅拌器的霍巴特(Hobart)N50混合器上以中速混合。然后缓慢加入糖，继续搅拌。加入糖和粉状物，同时在霍巴特(Hobart)混合器上以低速混合。将140g面糊填充在4“×5”管盘中并在350°F下烘烤17分钟。结果示出在图53和图54中。
表34提供了用绿豆蛋白分离物制成的代表性天使蛋糕与蛋白天使蛋糕的功能特性比较的结果。
表34
属性 蛋白天使蛋糕 绿豆分离物(208A)天使蛋糕
蛋/替代品中的固体％ 20 18.5
硬度(G) 319±65 820±223
回复性 0.31±0.04 0.24±0.02
粘结性 0.7±0.04 0.61±0.02
弹性(MM) 7.52±1.68 9.58±0.7
咀嚼指数(G) 190±31 406112
6.37实施例37：面食面团
使用纯化的蛋白分离物制成的代表性面食面团配方包括：将100g绿豆蛋白分离物与1/2杯粗面粉粉末，1/2茶匙盐和35mL特级初榨橄榄油脉冲混合，然后与30mL水混合。所得到的面食具有保持结构的能力，并且在烹饪期间的较长时间内保持所需的凹痕结构。此外，所得面食面团在蒸煮过程中保留了结构，建议用于罐装应用，包括面食汤。所得到的面食具有光滑的结构和白色外观。
6.38实施例38：肉类似物
使用绿豆蛋白分离物制备无蛋乳液，将所述乳液制成：(i)蛋类似物，用作早餐三明治中的蛋糕和作为糊状物；(ii)用作熟食肉或鸡块的肉类似物。
为了用作含蛋类似物，使用蛋白分离物在有和没有如下的情况下：(a)缓冲盐；(b)在20℃至95℃的温度下加热；(c)低剪切至高剪切均匀化。当所述分离物与转谷氨酰胺酶在25-55℃内混合，然后在25-55℃内培养0-60分钟，最后放入烘箱在121-200℃内烘烤5-15分钟后，分离物生成各种类似烹饪的鸡蛋结构的类型。使用上述方法生产的无蛋糕的结构包括坚硬，干净的切口，内聚，弹性结构，类似于在高热锅上制备的烹饪好的蛋糊。无蛋蛋糊的质地柔软，有弹力，通透，有松紧感，乳脂状，粘性和弹性，类似于中低熟蛋糊。
代表性配方：
a.80％水；
b.包含约85％的植物蛋白的11.8％蛋白分离物；
c.0.43％磷酸氢二钠；
c.0.0010％(10ppm)转谷氨酰胺酶；
d.6.2％菜籽油；
e.1.15％蛋类型和乳制品类型的口味；
f.0.15％天然黄色；
g.00.3％盐，其中混合物的pH值约为6.5。
将蛋白分离物粉末和所剩余的干燥物与水和油混合，在热夹套混合器(Thermomix)中低剪切8分钟(设定2将提供RPM范围)。将所述混合物加热，同时继续混合直至温度达到83℃。然后将所述混合物冷却至50℃，加入10ppm转谷氨酰胺酶，再混合30秒。混合后，在50℃下，将所得乳液加入圆形硅氧烷模具(直径3)中培养60分钟。培养后，将样品在121℃的冲击式烘箱中烘烤10分钟。由此生成的圆形蛋糕，具有温和的蛋和乳制品风味，以及中性植物风味。蛋糕质地柔软，有弹力，通透，有松紧感，乳脂状，有粘性，有弹性，类似蛋糕。
或者，在加入酶后，将相同的乳液混合物配方倒入肠衣中，在末端打结以制成管形香肠状物(chubbs)，并在50℃的水浴中培养2小时，制成强凝胶。解开香肠状物(chubbs)，并将凝胶切成圆形蛋糕，并在121℃烘箱烘烤10分钟。所得的圆形蛋糕具有温和的蛋和乳制品风味以及中性植物风味。蛋糕质地柔软，有弹力，通透，有松紧感，乳脂状，有粘性，有弹性，类似蛋糕。
6.39实施例39：肉类似物
使用绿豆蛋白分离物制备无蛋乳液，将其制成肉类似物。使用蛋白分离物，在有和没有如下的情况下：(a)缓冲盐；(b)在50℃和95℃的温度之间加热；和(c)低到中剪切均化。当在25-55℃下与转谷氨酰胺酶混合，然后在25-55℃培养60-120分钟，最后在15-29psi压力下烹饪20-60分钟时，煮熟的产品具有类似熟食肉的质地。
代表性配方：
a.80％水；
b.含有约85％植物蛋白的13％蛋白分离物；
c.0.43％磷酸氢二钠；
c.0.0010％(10ppm)转谷氨酰胺酶；
d.6.2％菜籽油；
g.0.3％盐，其中混合物的pH约为6.5。
在热夹套混合器(Thermomix)中，将蛋白分离物粉末和所剩余的干燥物与水和油混合，低剪切8分钟(设定2)。将所述混合物加热，同时继续混合直至温度达到83℃。然后将所述混合物冷却至50℃，并加入10ppm转谷氨酰胺酶并再混合30秒。将乳液混合物倒入肠衣中，在末端系紧以制成管状的香肠状物，并在50℃的水浴中培养2小时。培养后，将样品在15psi，约121℃下加压蒸煮30分钟。将香肠状物冷却至室温，解开，所得到的凝胶具有类似于鸡块的结构。所述凝胶质地柔软，中等耐嚼，纤维状，弹力，有松紧感，粘性和弹性，类似于鸡块。
6.40实施例40：肉类似物的比较分析
按照表35中所示的配方，使用绿豆蛋白分离物制备肉类似物。将绿豆蛋白分离物与配方中的水、油、磷酸氢二钠、盐和淀粉混合，以在中等至高剪切下制备均匀混合物。混合。然后将混合物加热至25-95℃之间的温度，然后加入酶。然后将该材料填充到肠衣中以形成圆柱形的香肠状物(chubbs)。将香肠状物在40-55℃保持60-120分钟，然后在8-15psig的压力下挤出和蒸煮30-120分钟。将香肠状物冷却并切成块状。
表35
分析肉类似物样品的结构特性。使用布鲁克菲尔德(Brookfield)CT3质构分析仪进行纹理轮廓分析。25.4mm圆柱形探针用于所述分析。将绿豆块样品切成直径为2.54cm，高度为1cm的圆柱体。使用在5g负载下触发的两个单轴压缩循环分析样品。目标压缩距离设定为0.7cm，对应于以1mm/s的速率进行的70％变形。
在酶处理之前经历加热的样品被称为“预热试验”，并且在酶处理之前未加热的样品被称为“无热试验”。
使用绿豆蛋白分离物的'预热'和'不加热'试验，使得肉类似物显示出与使用大豆分离蛋白和豌豆蛋白分离物(图55)制备的商业鸡块和商业肉类似物的硬度、粘结性、咀嚼性和弹性相当的质地特性。通过纹理剖面分析记录，绿豆蛋白肉类似物在质地上优于一些商业肉类似物。凝胶质地柔软，中等耐嚼，纤维状，弹力，松紧感，粘性和弹性类似于鸡块。另外，在绿豆蛋白肉类似物中也观察到类似于鸡的肌纤维的视觉纤维外观(图56)。
6.41实施例41：用其他蛋白分离物制成的食品应用
在各种食品应用中，其他蛋白分离物的功能不如绿豆。参见图57，所述图可视地描绘出用四种液体糊状物配方制成的蛋糕替代物：(A)通过盐沉淀的纯化的绿豆分离物；(B)通过等电点沉淀纯化的绿豆分离物；(C)纯化的绿豆和小麦蛋白分离物(50:50)；(D)纯化的绿豆和豌豆蛋白分离物(50:50)。如(C)和(D)所示，当绿豆蛋白分离物结合其他如小麦或豌豆蛋白结合时，其功能丧失。与仅用绿豆蛋白分离物制备的配方相比，振幅扫描测试后的极低储能模量证明了这一点。参见图61-63。
6.42实施例42：脂肪减少起酥油(FRSS)的工艺和组合物
本发明还提供了代表性的起酥油模型系统，所述系统具有减少在普通烘焙应用中使用的必需脂肪的能力。通过利用本发明提供的特定绿豆蛋白分离物，所述系统能够允许模型系统中的脂肪减少，高达和>40％，对质地、水分和结构的负返回最小至零，与等量的等效现有量面包起酥油相比。
6.42.1用于FRSS应用的代表性绿豆蛋白分离方法
步骤1：用4000L逆渗透水(1份粉状物与5份水的比例)提取800kg去壳、研磨的绿豆粉(100目筛网尺寸)，提取浆料的pH值为6.7左右。为了溶解粉状物中的蛋白，通过加入NaOH，将提取物的pH调节至pH值7。萃取温度约为15℃。
步骤2：将提取的浆料以～2100L/hr进料速率进料至中试滗析器离心机(AlfaLaval Foodec360)，以3272rpm旋转速度离心分离纤维和富含淀粉固相中液相蛋白提取物。
步骤3：然后将来自滗析器的液相送至高速旋转离心机(AlfaLaval Clara 80)，分离液体中存在的细颗粒。以1695L/h进料，以8142rpm速度进行离心。经高速旋转离心机分离后除去一部分细颗粒。
步骤4：通过添加柠檬酸，将来自步骤3所得的澄清的液体提取物pH值调节至pH6.0，且目标蛋白在目标pH下沉淀出来。用外部热交换器将沉淀槽冷却至10℃。
步骤5：将来自步骤4沉淀所得的蛋白浆料，以350-500L/hr的进料速率送至高速旋转离心机(Alfa Laval Clara 80)，并从总固体～17％(TS)离心物中固体排出部分回收蛋白。所回收的蛋白质纯度为83-87％(干质量，凯氏定氮法用于量化样品中的氮含量)。
步骤6：将回收浆料(17％TS)置于中试规模的箱式干燥器中进行喷雾干燥，应用两个入口空气温度条件(180和210℃)，并将浆料在45-55kg/hr给料速率下进料到干燥器中。收集得到水分小于5％的喷雾干燥粉末(浅黄色)。
6.42.2代表性的FRSS配方
代表性的脂肪减少起酥油系统(FRSS)配方包含绿豆蛋白分离物(根据上述方法制备)包括：水(34.55％)，精制椰子油(44.4％)，推进器压榨菜籽油(14.8％)，绿豆分离物(4.93％)，柠檬酸钠(0.98％)，橙子柑橘纤维(0.29％)。
使用福维克(Vorwerk)热夹套混合器(Thermomix)将柠檬酸钠和自来水溶解蛋白质。将绿豆分离物与柠檬酸钠和水混合，使用加热和特定的剪切，以生成稳定的乳液混合物。将额外的水，一部分最终重量的油和柑橘纤维合并，再加入蛋白混合物，使用加热和剪切一段时间。将最终混合物冷却至(40-50℃)的范围，并转移至干净的热夹套混合器(Thermomix)容器中进行进一步处理。
将混合物在中等涡旋下转动，进行持续油乳化(10分钟)。将剩下的两种油进行调和和混合。以恒定的流量，将油按照剩余油的总重量所需持续的时间进行流动。当油和蛋白混合物结合以保持整个最终产品的一致性时，将剪切逐渐增加。将最终产物置于真空袋中，并压缩以固结FRSS物质。将成品袋装产品冷藏12小时以上，以固化最终结构。
图61A描绘了完成的绿豆分离物起酥油模型，所述起酥油模式可应用于烘焙应用。
6.42.3利用绿豆衍生的FRSS进行烘焙应用
将FRSS应用于许多烘焙应用中，其量等于通常用于现有的破裂棕榈油起酥油的量，尝试以1比1的比较证明蛋白驱动系统的生存力。将海绵蛋糕(其不包括蛋和乳制品)的试验配方与使用起酥油、蛋和乳制品(黄油和乳类)的已知商业海绵蛋糕进行比较。
使用上述纯化的绿豆分离物的代表性白色海绵蛋糕制剂包括：糖(42.401％)，多用途面粉(23.77％)，蛋糕粉(22.63％)，文丘拉(Ventura)，棕榈起酥油(8.401％)，复式发酵粉(1.087％)，盐(.988％)，天然调味剂(.287％)，碳酸氢钠(0.247％)，柠檬酸(0.099％)，香草(0.049％)。额外的水用于完成蛋糕模型。
组合地，使用基于纯化的绿豆分离物的FRSS的代表性的蛋糕糖霜模型配方包括：糖果糖10x(71.88％)，FRSS(23.89％)，自来水(3.17％)，盐(1.06％)。
将糖霜类似物与用氢化棕榈油制备的商业上已知的糖霜进行比较。
通过将糖和FRSS与香草和天然香料组合来制备滤饼混合物。将干燥成分合并，筛分(#16)，然后加入到调好的起酥油/糖混合物中。整批混合10分钟，或直到完全结合，并最终筛分(#16)以保持材料的一致性。使用带有桨叶附件的霍巴特(Hobart)立式搅拌机，加入自来水，制成蛋糕糊。将水和混合物低速混合30秒。将碗状物和桨状物搅拌，然后中速转动1分钟，将混合物完全乳化，并将空气加入系统中。将混合物倒入9“×9”盘中，并在350度下烘烤18-24分钟。将成品蛋糕在架子上冷却至环境温度。
通过使用霍巴特(Hobart)混合器和桨叶附件，以低速组合1/2总糖果糖和总FRSS来制备糖霜类似物，直至完成掺入。将碗状物和桨状物搅拌，少量加入另外1/2的糖，至彻底混合。加入水和盐，将混合物混合成光滑的稠度。
图61B描绘了成品蛋糕和糖霜类似物。
6.42.4其他应用：绿豆衍生的非乳制奶油干酪类似物
利用上述绿豆蛋白分离物的水结合和乳化性质，生成样品非乳制奶油干酪类似物。通过加热和剪切操作，以及用钙和最终培养进行调理，以获得传统乳制品奶油干酪的质地和风味。
使用纯化的绿豆蛋白分离物的代表性配方包括：自来水(65.01％)，压榨机压榨的菜籽油(27.95％)，纯化的绿豆蛋白分离物(9.75-11.25％)，糖(1.5-5％)，氯化钙(1.30％)，盐(0.65％)，乳酸(0.26％)。
使用福维克(Vorwerk)热夹套混合器(Thermomix)，将水、糖、盐和蛋白一起溶解。施行加热和中等剪切30分钟。最终温度将超过85℃。使混合物在中等温度下再运行7-10分钟，稍微冷却(50-60℃)并保持稠度。
将热夹套混合器(Thermomix)速度增加至中等高度，将75％的菜籽油加入混合物中。加入稀释在25g剩余油中的氯化钙，并使其剪切5分钟。在钙完全掺入后，剩余的油以恒定的流量流动，持续剩余油的总重量的时间。
将碱均质化后，将其转移至冰浴中，并冷却至40℃。使用热夹套混合器(Thermomix)加热至40℃，将冷却的混合物以中速剪切，保持混合物光滑，并设定适当的培养温度。用5g自来水稀释培养沉淀-CH(0.022-0.25％)，制备混合物的培养物。当引入培养物时，将所得批次旋转5分钟，以完全掺入培养物。将完成的混合物转移至1qt容器中，调整PH值后，将容器置于真空水浴(40℃)中。
最终混合物pH需作为水浴中类似物的起始点。将产物“培养”不少于3小时，或直至pH值降至4.6-5.1。
在85℃下，将最终培养的混合物在热夹套混合器(Thermomix)中以中速剪切7分钟，以使产物光滑和均质化，并设定培养过程。将最终混合物压入模具中以形成最终结构。
图62A描绘了在培养步骤之前的热夹套混合器(Thermomix)中的未完成的非乳制品类似物。图62B描绘了完成的非乳制品类似物。左边的样品在没有完成步骤的情况下进行培养，而右边的样品已经均质化为成品以获得平滑的稠度，并且培养过程在pH5下停止。图62C描绘了成品压制的非乳制奶油干酪类似物。
6.42.5其他应用：绿豆衍生面食面团和面食
利用上述纯化的绿豆分离物的结合和结构构建能力，生成样品面食面团。面食类似物不含麸质，依靠所述蛋白分离物的结构构建能力，模仿传统的小麦粉结构。
使用上述绿豆蛋白分离物的代表性配方包括：绿豆粉原料(41％)，纯化绿豆分离物(9％)，长粒白米粉(30％)，玉米粉(20％)。使用额外的自来水(配方总重量的32.5％)来完成面团。基于环境条件(湿度)，水量按照+/-2％进行变动。
使用罗马帕玛(Roma Pama)面食挤出机，将干燥组分和纯化的绿豆分离物(喷雾干燥的)加入RP料斗中，并混合至少2分钟，以完全混合。一旦配料混合好，将自来水加入混合物中，RP开始形成面团。所述混合物具有湿砂的稠度。面食面团在RP料斗中转动9-11分钟，直到面团达到最佳调理条件。
使用#143面食染料作为RP，将面团以平滑且连续的运动挤出，直到料斗为空。当挤出面团时，将其收集在带孔的干燥篮中，再放入干燥架上。挤压的面食使用至少2小时进行处理，并固化面食。
图63A示出用于挤出面食类似物的染料#143。图63B描绘了干燥后的成品面食类似物。本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请，通过引用并入本发明，如同每个单独的出版物或专利申请进行具体地和单独地指出，通过引用并入本发明。尽管为了清楚理解的目的，已经通过说明和实施例，详细地描述了前述发明，但根据本发明的教导，本领域普通技术人员将容易明白，在不脱离所附权利要求的精神或范围的情况下，可以对其做出某些变化和改变。
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本发明，如同每个单独的出版物或专利申请被具体和单独地指出通过引用并入。尽管为了清楚理解的目的，已通过示例说明和实施例详细地描述了前述发明，但根据本发明的教导，本领域普通技术人员将容易明白，可在不脱离所附权利要求的精神或范围情况下进行某些改变和修改/修饰。

Claims (54)

1.纯化的绿豆蛋白分离物，其包含：
至少60重量％的绿豆蛋白含量；
所述植物蛋白的至少50重量％的球蛋白型蛋白含量；
相对于所述植物蛋白未经改性的来源，降低的氧化酶活性；和
与所述绿豆蛋白的所述未经改性的来源不同的一种或多种调节的感官特性。
2.根据权利要求1所述的纯化的绿豆蛋白分离物，其特征在于，其等电点范围为约pH5.2至约pH 6.0。
3.根据权利要求1所述的纯化的绿豆蛋白分离物，其特征在于，其等电点范围为约pH5.4至约pH 6.0。
4.根据权利要求1所述的纯化的绿豆蛋白分离物，其特征在于，其等电点范围为约pH5.6至约pH 6.0。
5.根据权利要求1所述的纯化的绿豆蛋白分离物，其特征在于，其等电点为pH 5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。
6.根据权利要求1-5任一项所述的纯化的绿豆蛋白分离物，其中所述调节的感官特性包含以下一种或多种的减少或缺失：涩的味道或气味、豆腥的味道或气味、苦的味道或气味、烧焦的味道或气味、黄油的味道或气味、果仁的味道或气味、甜的味道或气味、酸的味道或气味、水果的味道或气味、花的味道或气味、木质的味道或气味、泥土的味道或气味、豆腥的味道或气味、辛辣的味道或气味、金属的味道或气味、甜的味道或气味、发霉的味道或气味、草的味道或气味、青味或青气味、油的味道或气味、醋的味道或气味、中性的味道或气味、以及温和的味道或气味。
7.根据权利要求1-6任一项所述的纯化的绿豆蛋白分离物，其中所述降低的氧化酶活性包含相对于所述绿豆蛋白未经改性的来源，脂质类或残余脂质类的氧化减少。
8.根据权利要求1-7任一项所述的纯化的绿豆蛋白分离物，其中所述降低的氧化酶活性包含相对于所述绿豆蛋白未经改性的来源中脂质类的量，所述分离物中脂质类或残余脂质类的量减少。
9.根据权利要求1-8任一项所述的纯化的绿豆蛋白分离物，其中所述降低的氧化酶活性包含相对于所述绿豆蛋白未经改性的来源，脂氧合酶(EC 1.13.11.-)的量减少。
10.根据权利要求1-9任一项所述的纯化的绿豆蛋白分离物，其中所述纯化的蛋白分离物具有选自乳化、水结合、发泡、凝胶化、碎屑密度、结构形成、质地构建、粘结性/粘附性、弹力/弹性、溶解度、黏度、脂肪吸收、味道结合、凝结、膨松、通气、乳脂状、成膜性、光泽/光亮添加、冷冻/解冻稳定性和颜色的一种或多种功能特性。
11.根据权利要求1-10任一项所述的纯化的绿豆蛋白分离物，其中所述纯化的蛋白分离物具有低于90℃的凝胶化起始温度。
12.根据权利要求1-11任一项所述的纯化的绿豆蛋白分离物，其中所述纯化的蛋白分离物具有大于2％振荡应变的凝胶强度。
13.根据权利要求1-12任一项所述的纯化的绿豆蛋白分离物，其中所述纯化的蛋白分离物具有大于300Pa的凝胶弹性。
14.可食用组合物，其包含权利要求1-13任一项所述的纯化的绿豆蛋白分离物，其中所述组合物是选自由凝胶、泡沫、乳液和水溶液组成的组。
15.根据权利要求1-14任一项所述的纯化的绿豆蛋白分离物，其中所述分离物包含大于75％的绿豆蛋白。
16.根据权利要求1-15任一项所述的纯化的绿豆蛋白分离物，其中所述绿豆蛋白包含至少60％的球蛋白型蛋白。
17.根据权利要求1-16任一项所述的纯化的绿豆蛋白分离物，其中所述球蛋白型蛋白包含8S球蛋白/β伴大豆球蛋白。
18.根据权利要求1-17任一项所述的纯化的绿豆蛋白分离物，其中所述球蛋白型蛋白是与SEQ ID NO：1具有至少50％同一性的蛋白质。
19.根据权利要求1-18任一项所述的纯化的绿豆蛋白分离物，其中相对于在所述分离物的所述植物来源中发现的蛋白质的量，所述球蛋白型蛋白富集于所述分离物中。
20.根据权利要求19所述的纯化的绿豆蛋白分离物，其中相对于在所述分离物的所述植物来源中发现的蛋白质的量，所述富集为至少5％、10％、15％、20％或大于20％。
21.根据权利要求1-20任一项所述的纯化的绿豆蛋白分离物，其中相对于在所述分离物的所述植物来源中发现的一种或多种化合物的量，选自由过敏原类、抗营养因子类、和环境污染物类组成的组的一种或多种化合物已在所述分离物中减少。
22.根据权利要求1-21任一项所述的纯化的绿豆蛋白分离物，其与一种或多种共成分接触，所述一种或多种共成分选自由水胶体、胶类、磷酸盐、和转谷氨酰胺酶组成的组。
23.根据权利要求1-22任一项所述的纯化的绿豆蛋白分离物，其中所述磷酸盐是磷酸氢二钠。
24.蛋代用品，其包含权利要求1-23任一项所述的纯化的绿豆蛋白分离物，其中所述蛋代用品的特征在于具有与蛋类似的一种或多种感官特性。
25.根据权利要求24所述的蛋代用品，其中所述蛋代用品具有与蛋的相应功能特性相似或等同的至少一种功能特性。
26.根据权利要求25所述的蛋代用品，其中所述至少一种功能特性包含乳化、水结合能力、发泡、凝胶化、碎屑密度、结构形成、质地构建、粘结性、粘附性、弹力、弹性、溶解度、黏度、脂肪吸收、味道结合、凝结、膨松、通气、乳脂状、成膜性、光泽添加、光亮添加、冷冻稳定性、解冻稳定性或颜色。
27.脂肪减少起酥油系统，其包含权利要求1-26任一项所述的纯化的绿豆蛋白分离物。
28.食品或饮料组合物，其包含权利要求1-26任一项所述的纯化的绿豆蛋白分离物。
29.根据权利要求28所述的食品或饮料组合物，其中所述食品或饮料组合物是选自由以下组成的组：可食用的无蛋乳液，蛋类似物，无蛋炒蛋/搅拌蛋类，无蛋馅饼，无蛋磅蛋糕，无蛋天使蛋糕，无蛋黄色蛋糕，无蛋和无乳制品的奶油干酪，无蛋面食面团，无蛋奶油冻，无蛋冰淇淋，和无乳制品乳类，奶油干酪，面食面团，面食，乳类饮料或乳状饮料，包含所述乳类饮料或乳状饮料的食品，奶油冻，冰淇淋，冷冻甜品，肉类复制品，熟食肉类复制品，乳化挤压肉类，香肠类，鱼饼类复制品，蘸料类，馅料类，涂抹物类，薯片类和饼干类。
30.根据权利要求1-29任一项所述的纯化的绿豆蛋白分离物，其中所述绿豆蛋白分离物通过包含以下的方法生成：
(a)从pH值在约6.5和10.0之间的水溶液中的绿豆蛋白来源中提取一种或多种绿豆蛋白；和
(b)在pH 5.2至pH 6.0的pH值范围内使所述提取的绿豆蛋白沉淀。
31.生成纯化的绿豆蛋白分离物的方法，所述方法包含：
(a)从pH值在约6.5-10.0之间的水溶液中的绿豆蛋白来源中提取一种或多种绿豆蛋白；
(b)在接近其富含球蛋白级分的等电点的pH值下或在约5.0-6.0之间的pH值下，使所述绿豆蛋白沉淀；或者使用微滤法或超滤法来分级分离和浓缩所述植物蛋白；和
(c)回收纯化的绿豆蛋白分离物，所述分离物包含：
至少60重量％的绿豆蛋白含量；
所述绿豆蛋白的至少50重量％的球蛋白型蛋白含量；
相对于所述绿豆蛋白未经改性的来源，降低的氧化酶活性；和
与所述绿豆蛋白的所述未经改性的来源不同的一种或多种调节的感官特性。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述提取步骤是在约6.5-8.0的pH值范围内进行。
33.根据权利要求31所述的方法，其中所述沉淀步骤是在约pH 5.2至pH 6.0的pH值范围内进行。
34.根据权利要求31所述的方法，其中所述沉淀步骤是在约pH 5.4至pH 6.0的pH值范围内进行。
35.根据权利要求31所述的方法，其中所述沉淀步骤是在约pH 5.6至pH 6.0的pH值范围内进行。
36.根据权利要求31所述的方法，其中所述沉淀步骤是在pH 5.6、5.7、5.8、5.9或6.0下进行。
37.根据权利要求31-36任一项所述的方法，其进一步包含采用活性炭、木炭或粘土处理所述植物蛋白的步骤。
38.根据权利要求31-37任一项所述的方法，其进一步包含在约1至4℃的温度下进行低温沉淀的步骤。
39.根据权利要求31-38任一项所述的方法，其进一步包含通过离心来回收所述纯化的蛋白分离物。
40.根据权利要求31-39任一项所述的方法，其进一步包含将所述纯化的蛋白分离物再水化至80％水分含量并调节至约pH 6.0。
41.根据权利要求31-40任一项所述的方法，其中所述方法进一步包含选自由以下组成的组的一个或多个附加步骤：在钙盐溶液中稀释含水蛋白；通过热处理过滤蛋白；通过选择性膜进行渗滤；在缓冲液中稀释蛋白以调节每个目标应用的pH值；根据应用来浓缩蛋白；和根据应用来干燥蛋白。
42.根据权利要求31-41任一项所述的方法，其中所述方法包含减少亲脂性异味、底物或辅因子。
43.根据权利要求31-41任一项所述的方法，其中所述方法调节异味或气味；调节所需的味道；或提供与参考食品相似或等同的感官印象。
44.根据权利要求31-43任一项所述的方法，其进一步包含在食品或饮料组合物中配制所述纯化的绿豆蛋白分离物的步骤。
45.由权利要求31-50任一项所述的方法生成的纯化的绿豆蛋白分离物。
46.由包含权利要求31-50任一项所述的方法的方法生成的食品或饮料组合物。
47.由权利要求31-50任一项所述的方法生成的蛋代用品。
48.纯化的绿豆蛋白分离物，其包含：
至少60重量％的转谷氨酰胺酶改性的绿豆蛋白含量；
所述植物蛋白的至少50重量％的球蛋白型蛋白含量；
相对于所述植物蛋白未经改性的来源，降低的氧化酶活性；和
与所述植物蛋白的所述未经改性的来源不同的一种或多种调节的感官特性。
49.根据权利要求55所述的纯化的蛋白分离物，其中所述纯化的绿豆蛋白分离物是由0.0001％至0.0125％的转谷氨酰胺酶进行改性。
50.生成纯化的蛋白分离物的方法，所述方法包含：
a.从pH值为约6.5-10.0之间的水溶液中的来源中提取一种或多种植物蛋白；
b.在接近其富含球蛋白级分的等电点的pH值下或在约5.2-6.0之间的pH值下使所述植物蛋白沉淀；或者使用微滤法或超滤法来分级分离和浓缩所述植物蛋白；
c.回收所述纯化的蛋白分离物，所述分离物包含：
至少60重量％的植物蛋白含量；
所述植物蛋白的至少50重量％的球蛋白型蛋白含量；
相对于所述植物蛋白未经改性的来源，降低的氧化酶活性；和
与所述绿豆蛋白的所述未经改性的来源不同的一种或多种调节的感官特性；和
d.在所述提取步骤a或所述回收步骤b中采用转谷氨酰胺酶改性所述绿豆蛋白。
51.根据权利要求57所述的生成纯化的蛋白分离物的方法，其中在所述提取步骤a或所述回收步骤b中采用转谷氨酰胺酶改性所述植物蛋白的所述步骤d包含使所述绿豆蛋白与0.0001％至0.0125％转谷氨酰胺酶接触。
52.根据权利要求57或58所述的生成纯化的蛋白分离物的方法，其中所述纯化的蛋白分离物是稳定交联的。
53.根据权利要求57-59任一项所述的生成纯化的蛋白分离物的方法，其中所述纯化的蛋白分离物基本上不含脂氧合酶或可氧化脂质类的酶。
54.根据权利要求57-60任一项所述的生成纯化的蛋白分离物的方法，其中所述转谷氨酰胺酶被包封或固定化在固体基质上。
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