KR20220119407A - 효소 조성물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

효소 조성물 및 이의 제조 방법 Download PDF

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프랭크 더글라스 이베이
조엘 앤드류 크렙스
하살 크셔사가르
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클라라 푸드즈 컴퍼니
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Abstract

재조합으로 생산된 효소적 활성 효소, 향상된 단백질 함량을 갖는 조성물 및 이의 제조 방법이 본원에서 제공된다.

Description

효소 조성물 및 이의 제조 방법
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2019년 12월 24일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/953,361호에 대한 우선권을 주장한다. 상기 언급된 특허 출원의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
단백질은 중요한 식이 영양소이다. 단백질은 연료 공급원 및/또는 신체에 의해 합성될 수 없는 필수 아미노산을 포함한 아미노산의 공급원으로 작용할 수 있다. 건강한 인간 성인을 위한 단백질의 1일 권장 섭취량은 사람의 전체 열량 요구량의 10 내지 35%이며, 현재 대부분의 인간이 섭취하는 단백질의 대부분은 동물성 공급원으로부터 유래한다. 또한, 운동선수와 보디빌더는 근육량을 늘리고 수행 능력을 개선하기 위해 보충 단백질 섭취에 의존할 수 있다. 재조합으로 생산된 단백질은 동물성 공급원이 없으며 소비자에게 대체 단백질 자원을 제공한다. 세계 인구가 증가하고 세계 식량 수요가 동시 성장함에 따라, 식이 및 보충 단백질의 대체 지속 가능한 비동물성 단백질 공급원에 대한 충족되지 않은 요구가 있다.
본 개시내용의 방법 및 조성물은 이러한 충족되지 않은 요구를 제공한다.
일부 실시양태에서, 재조합 식품 보존 효소(rFPE)를 포함하는 섭취가능한 조성물이 본원에 기재된다. 일부 경우에, FPE는 거위형(goose-type) FPE(gFPE)일 수 있다. 일부 경우에, 조성물은 반고체 또는 겔 조성물일 수 있다.
일부 실시양태에서, 섭취가능한 조성물에는 세균 불순물이 없을 수 있다.
일부 실시양태에서, gFPE는 서열번호 1에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, gFPE는 서열번호 1에 대해 적어도 97% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, gFPE는 서열번호 2에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, gFPE는 서열번호 2에 대해 적어도 97% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, gFPE는 서열 3에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, gFPE는 서열번호 3에 대해 적어도 97% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, gFPE는 서열번호 4에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, gFPE는 서열번호 4에 대해 적어도 97% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 섭취가능한 조성물은 열 처리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 섭취가능한 조성물은 gFPE를 포함하지 않는 거의 동일한 섭취가능한 조성물보다 더 긴 보관 수명을 갖는다. 일부 실시양태에서, 섭취가능한 조성물은 gFPE보다는 닭 난백 무라미다제를 포함하는 거의 동일한 섭취가능한 조성물의 보관 수명보다 더 긴 보관 수명을 갖는다. 일부 실시양태에서, gFPE는 피치아(Pichia) 세포에서 생산될 수 있다.
일부 실시양태에서, 재조합 식품 보존 효소(FPE)를 포함하는 조성물로서, 상기 FPE가 90,000 Shugar U/mg 초과의 활성을 가질 수 있는, 조성물이 본원에 기재된다.
일부 경우에, FPE는 150,000U/mg 초과의 Shugar 단위의 활성을 가질 수 있다. FPE는 200,000U/mg 초과의 Shugar 단위의 활성을 가질 수 있다. FPE는 250,000U/mg 초과의 Shugar 단위의 활성을 가질 수 있다. FPE는 300,000U/mg 초과의 Shugar 단위의 활성을 가질 수 있다. FPE는 350,000U/mg 초과의 Shugar 단위의 활성을 가질 수 있다. FPE는 400,000U/mg 초과의 Shugar 단위의 활성을 가질 수 있다. FPE는 450,000U/mg 초과의 Shugar 단위의 활성을 가질 수 있다.
재조합 FPE는 피치아 세포에서 생산될 수 있다.
조성물은 식품 조성물일 수 있다. 식품 조성물은 하나 이상의 섭취가능한 성분을 포함할 수 있다. 식품 조성물은 재조합 FPE를 포함하지 않는 거의 동일한 식품 조성물보다 더 긴 보관 수명을 가질 수 있다. 식품 조성물은 재조합 FPE보다는 닭 난백 무라미다제를 포함할 수 있는 거의 동일한 제품의 보관 수명보다 더 긴 보관 수명을 가질 수 있다.
조성물은 rFPE를 포함하는 분말 조성물일 수 있다.
재조합 FPE는 서열번호 1에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
1 Shugar 단위는 엠. 루테우스(M. luteus) 세포의 현탁액을 소화시켜 37℃, pH 7.0에서 분당 0.001의 속도로 용액의 흡광도를 감소시킬 수 있는 효소의 양일 수 있다.
조성물은 닭 난백 무라미다제를 포함하는 조성물과 비교하여 저알레르기유발성일 수 있다.
재조합 FPE는 비재조합 FPE와 비교하여 유사한 활성을 가질 수 있고/있거나 서열번호 1에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 포함하는 FPE는 언젠가는 천연 공급원으로부터 단리될 수 있을 것이다.
일부 실시양태에서, 재조합 식품 보존 효소(FPE)를 포함하는 섭취가능한 조성물로서, 상기 FPE가 서열번호 1에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있는, 조성물이 본원에 기재된다.
섭취가능한 조성물은 식품 조성물일 수 있다. 식품 조성물은 겔-유사 질감을 가지거나 일관되게 가질 수 있다. 식품 조성물은 베이킹 제품의 형태일 수 있다. 식품 조성물은 난백-유사 제품의 형태일 수 있다. FPE는 피치아 파스토리스 세포에서 재조합으로 생산될 수 있다. 식품 조성물은 액체 형태일 수 있다. 식품 조성물은 고체 형태일 수 있다.
조성물은 재조합 FPE보다는 닭 난백 무라미다제를 포함할 수 있는 거의 동일한 제품의 보관 수명보다 더 긴 보관 수명을 가질 수 있다.
식품 조성물은 중량 기준으로 적어도 0.1% FPE를 가질 수 있다. 식품 조성물은 중량 기준으로 최대 10% FPE를 가질 수 있다. FPE는 식품 조성물에서 효소적으로 활성일 수 있다. 조성물은 성분일 수 있다. 식품 조성물은 미생물 또는 세포 파편이 실질적으로 없을 수 있다. 식품 조성물은 프로바이오틱 제형일 수 있다. 재조합 FPE는 적어도 95% 순수할 수 있다.
식품 조성물은 재조합 FPE 이외에도 하나 이상의 재조합 단백질을 포함할 수 있다. 재조합 FPE는 식품에 겔 고형성 또는 증가된 점도를 제공할 수 있다. 식품 조성물은 재조합 FPE 이외에도 하나 초과의 재조합 단백질을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 재조합으로 생산된 단리된 식품 보존 효소(FPE)를 제공하는 단계 및 재조합으로 생산된 FPE를 하나 이상의 섭취가능한 성분과 조합하는 단계를 포함하는, 섭취가능한 조성물의 제조 방법이 본원에 기재된다. 일부 경우에 FPE는 거위형 FPE이다.
재조합으로 생산된 FPE는 서열번호 1에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
재조합으로 생산된 FPE는 효모 세포에서 재조합으로 생산될 수 있다. 효모 세포는 피치아 파스토리스일 수 있다.
재조합으로 생산된 FPE는 재조합으로 생산된 FPE가 결여된 거의 동일한 섭취가능한 조성물에 비해 섭취가능한 조성물의 보관 수명을 증가시킨다.
재조합으로 생산된 FPE는 섭취가능한 조성물에 겔-유사 질감을 제공한다.
섭취가능한 조성물은 인간/동물에 의해 섭취될 준비가 된 식품일 수 있다.
일부 실시양태에서, 엑스. 캄페스트리스(X. campestris) 세포를 발효 배지에 제공하는 단계; 세포를 45 내지 60℃의 온도 및 pH 8 내지 10 및 알칼리성 프로테아제에서 열처리하여 세포 파편을 포함하는 용액을 제조하는 단계; 세포 파편을 포함하는 용액에 재조합으로 생산될 수 있는 식품 보존 효소(FPE) 및/또는 서열번호 1에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 재조합으로 생산된 FPE를 첨가하여, 잔탄 검 용액을 생산하는 단계를 포함하는, 잔탄 검 제품의 제조 방법이 본원에 기재된다. 상기 방법은 또한 이소프로판올을 잔탄 검 용액에 첨가하여 잔탄 검을 침전시키는 단계; 침전된 잔탄 검을 단리하고 건조시켜 잔탄 검 제품을 수득하는 단계를 포함한다.
첨가된 FPE의 양은, 그 외에는 동일한 조건 하에 동등한 양의 잔탄 검 제품을 제조하는 데 필요할 수 있는 닭 난백 FPE의 양보다 적을 수 있다.
잔탄 검의 제조 방법은 세포 파편을 포함하는 용액을 제조한 후 조성물의 pH를 조절하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 서열번호 1에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 재조합으로 생산된 식품 보존 효소(FPE)를 포함하는 식품 보존제가 본원에 기재된다.
본 개시내용의 추가적인 측면 및 이점은 본 개시의 예시적인 실시양태만이 도시되고 설명되는 다음의 상세한 설명으로부터 당업자에게 용이하게 명백해질 것이다. 인식될 수 있는 바와 같이, 본 개시내용은 다른 실시양태 및 상이한 실시양태가 가능하고, 이의 여러 세부사항은 본 개시내용으로부터 벗어남이 없이 다양한 명백한 측면에서 수정될 수 있다. 따라서, 도면 및 설명은 본질적으로 예시적인 것으로 간주되어야 하며 제한적인 것으로 간주되어서는 안된다.
본 발명의 신규한 특징은 첨부된 청구범위에서 구체적으로 기재된다. 본 발명의 특징 및 이점의 더 나은 이해는 본 발명의 원리가 활용되는 예시적인 실시양태를 기재하는 다음의 상세한 설명 및 첨부 도면(또한, 본원에서 "도면" 및 "도")을 참조하여 얻어질 것이다:
도 1a 내지 도 1e는 통상의 식품 부패 세균에 대한 재조합 식품 보존 효소(rFPE)의 살균 활성을 예시한다.
도 2a 내지 도 2e는 다양한 온도 및 농도에서 rFPE의 겔화를 예시한다.
도 3은 rFPE에 대한 rFPE1an 항-닭 무라미다제 항체의 반응성 결여를 예시한다.
본 발명의 다양한 실시양태가 본원에 제시되고 설명되었지만, 이러한 실시양태는 단지 예시로서 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 당업자는 본 발명으로부터 벗어나지 않으면서 다수의 변경, 변화 및 대체를 생각해낼 수 있다. 본원에 기재된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 이용될 수 있음을 이해해야 한다.
본 개시내용은 현재 상업적으로 이용 가능한 효소 제품에 비해 우수한 특성을 제공하는 재조합 식품 보존 효소(rFPE)에 관한 것이다. 식품 산업에서, 미생물에 의한 부패를 감소시키기 위해 식품에 제제가 첨가된다. 항미생물 식품 보존제의 통상적인 예에는 나트륨 벤조에이트, 벤조산, 아질산염, 아황산염, 나트륨 소르베이트 및 칼슘 소르베이트가 포함된다. 대안적으로, 항미생물 활성을 보유하는 효소가 식품에 첨가할 수 있으며; 이것의 장점은 효소가 항미생물 활성을 제공하고 또한 식품의 단백질 함량을 증가시킨다는 것이다. 본 개시내용은 항미생물 활성을 보유하고, 단백질 함량을 증가시키고, 추가로 유리한 품질을 식품에 제공하고, 예를 들어 증가된 겔화 및 견고성을 고체 또는 반고체 식품에 제공하거나 증가된 점도를 액체 식품에 제공하는 rFPE에 관한 것이다. 본원에 개시된 바와 같이, 본 개시내용의 rFPE는 식품에서 항미생물 활성을 위해 사용되는 상업적으로 이용 가능한 효소에 비해 예상외로 우수한 품질을 입증한다.
식품 보존 효소(FPE)를 포함하는 섭취가능한 조성물이 본원에서 제공된다. 이러한 섭취가능한 조성물은 식품, 드링크 제품, 뉴트라슈티컬(nutraceutical), 약제, 화장품에서 사용될 수 있거나, 최종 제품을 위한 성분으로서 사용될 수 있다. 본원의 많은 실시양태에서, 섭취가능한 조성물은 액체 형태 또는 반고체 형태(예를 들어, 겔)이다. 바람직하게는, 이러한 조성물 중의 FPE는 재조합으로 제조되며, 본원에서 재조합 FPE(rFPE)로 지칭될 수 있다.
달리 나타내지 않는 한, 용어 FPE는 FPE와 rFPE 둘 다를 포함한다. 본원의 섭취가능한 조성물 중의 FPE 또는 rFPE는 섭취가능한 조성물의 단백질 함량을 증가시키고 또한 높은 투명도, 감소된 탁도 또는 실질적인 감각 중립성과 같은 하나 이상의 추가 특성을 유지하는 농도로 제공된다.
본원의 임의의 섭취가능한 조성물에서 rFPE의 사용은 소비자에게 유리한 감각 프로파일을 유지하면서 비동물성 단백질 공급원을 가능하게 한다. 이러한 조성물, 이의 제조 방법 및 이의 사용 방법의 다양한 실시양태가 본원에 제공된다.
본 개시내용의 일부 예시적인 실시양태가 본원에 제공된다. 하나의 예에서, g형 FPE(gFPE)와 같은 식품 보존 효소(FPE)는 숙주 세포에서 재조합으로 생산될 수 있다. 숙주 세포는 세균 또는 효모, 또는 다른 진균 숙주 세포일 수 있다. gFPE는 숙주 세포에 의해 분비되고 배양 배지로부터 수집 및 정제될 수 있다. 정제된 gFPE는 동결건조되고 섭취가능한 조성물 중의 성분으로서 사용될 수 있다. 일부 경우에, 최종 사용자는 주로 gFPE 단백질을 포함하는 동결건조된 분말 조성물을 제공받을 수 있다. 최종 사용자는 식품 조성물의 성분으로서 gFPE를 사용할 수 있다. 하나의 예에서, 사용자는 50℃ 내지 120℃ 범위의 온도에서 열처리에 의해 gFPE를 포함하는 겔을 제조할 수 있다. 겔은 항미생물제로서 소화 효소로서 FPE를 사용하거나 사용 의도 없이 제조될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, gFPE는 추가적인 겔화제를 필요로 하지 않으면서 용액에서 겔을 형성하는 예상치 못한 효과를 갖는다. 따라서, 사용자는 열처리에 의해서만 gFPE-포함 조성물을 겔화할 수 있다.
다른 예에서, 사용자는 식물 섬유, 다른 단백질, 결합제 등과 같은 다른 겔화제를 포함하는 섭취가능한 조성물 중의 하나의 성분으로서 gFPE를 사용할 수 있다.
식품/섭취가능한 조성물은 0.05% gFPE w/w만큼 적게 또는 30% gFPE w/w만큼 높게 포함할 수 있다. 더 적은 양은 섭취가능한 액체 조성물의 점도를 증가시킬 수 있는 반면, 더 많은 양은 섭취가능한 조성물을 고체 또는 반고체 상태로 변형시킬 수 있다.
다른 예에서, 사용자는 gFPE를 사용하여 미생물 세포벽을 분해하여 잔탄 검과 같은 검 유사 물질을 형성할 수 있다. 그 다음, 잔탄 검을 식품 조성물에 첨가할 수 있다.
하나의 예에서, 서열번호 1을 갖는 rFPE(rFPE1)는 효모 숙주 세포에서 재조합으로 생산될 수 있다. rFPE1은 숙주 세포에 의해 분비되고 배양 브로스로부터 수집 및 단리될 수 있다. rFPE1은 또한 정제 및 동결건조될 수 있다. 그 다음, rFPE1은 섭취가능한 조성물에서 이의 항미생물 활성으로 인한 더 긴 보관 수명 또는 이의 낮은 열 겔화 프로파일로 인한 겔화와 같은 기능을 제공하는 데 사용될 수 있다. rFPE1은 기능적 특성을 제공하는 것 외에도 조성물의 영양 함량을 증가시킬 수 있다.
식품 보존 효소
FPE는 펩티도글리칸의 N-아세틸무람산과 N-아세틸글루코사민 사이의 β-1,4-글리코시드 결합을 절단함으로써 세균 세포벽의 펩티도글리칸을 효과적으로 가수분해할 수 있는 효소를 포함할 수 있다. 일부 경우에 FPE는 무라미다제일 수 있다. 일부 경우에 FPE는 라이소자임일 수 있다. 일부 경우에 FPE는 거위형 라이소자임일 수 있으며 "gFPE"로 지칭될 수 있다.
일부 경우에 FPE는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 효소 또는 이의 효소적 활성 단편 또는 서열번호 1에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 효소일 수 있다. FPE는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 효소 또는 이의 효소적 활성 단편 또는 서열번호 2에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 효소일 수 있다. FPE는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 효소 또는 이의 효소적 활성 단편 또는 서열번호 3에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 효소일 수 있다. FPE는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 효소 또는 이의 효소적 활성 단편 또는 서열번호 4에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 효소일 수 있다. 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 어느 하나를 갖는 rFPE, 예를 들어 "본원에 기재된 rFPE" 또는 이의 효소적 활성 단편 또는 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 효소는 본원에서 gFPE로 지칭될 수 있다.
gFPE와 같은 재조합 FPE의 특이적 효소 활성은 천연 공급원(즉, 비-재조합 무라미다제) 또는 닭 무라미다제로부터 단리된 천연 무라미다제의 특이적 효소 활성보다 더 높을 수 있다. FPE의 특이적 효소 활성은 마이크로코쿠스 리소데이크티쿠스(Micrococcus lysodeikticus)와 같은 미생물을 포함하는 용액의 흡광도 손실을 측정하는 Shugar 분석과 같은 통상적인 분석을 사용하여 측정될 수 있다. 1 Shugar 단위는 엠. 리소데이크티쿠스의 용액에서 세포벽의 구조적 완전성을 파괴하여, 25℃에서 분당 0.0001의 흡광도 감소를 유발할 수 있는 효소의 양으로서 정의될 수 있다.
본원에 기재된 rFPE, 예를 들어 gFPE의 특이적 효소 활성은 적어도 35,000 Shugar 단위/mg(U/mg)일 수 있다. gFPE와 같은 rFPE의 특이적 활성은 적어도 50,000 Shugar U/mg, 60,000 Shugar U/mg, 70,000 Shugar U/mg, 80,000 Shugar U/mg, 90,000 Shugar U/mg, 100,000 Shugar U/mg, 110,000 Shugar U/mg, 120,000 Shugar U/mg, 130,000 Shugar U/mg, 140,000 Shugar U/mg, 150,000 Shugar U/mg, 170,000 Shugar U/mg, 200,000 Shugar U/mg, 220,000 Shugar U/mg, 250,000 Shugar U/mg, 270,000 Shugar U/mg, 300,000 Shugar U/mg, 350,000 Shugar U/mg, 400,000 Shugar U/mg, 450,000 Shugar U/mg, 500,000 Shugar U/mg, 550,000 Shugar U/mg, 600,000 Shugar U/mg 또는 700,000 Shugar U/mg일 수 있다.
gFPE와 같은 rFPE의 특이적 효소 활성은 35,000 U/단백질 mg 내지 600,000 U/단백질 mg일 수 있다. gFPE와 같은 rFPE의 특이적 효소 활성은 35,000 U/단백질 mg 내지 50,000 U/단백질 mg, 35,000 U/단백질 mg 내지 75,000 U/단백질 mg, 35,000 U/단백질 mg 내지 100,000 U/단백질 mg, 35,000 U/단백질 mg 내지 150,000 U/단백질 mg, 35,000 U/단백질 mg 내지 175,000 U/단백질 mg, 35,000 U/단백질 mg 내지 200,000 U/단백질 mg, 35,000 U/단백질 mg 내지 250,000 U/단백질 mg, 35,000 U/단백질 mg 내지 300,000 U/단백질 mg, 35,000 U/단백질 mg 내지 500,000 U/단백질 mg, 35,000 U/단백질 mg 내지 600,000 U/단백질 mg, 50,000 U/단백질 mg 내지 75,000 U/단백질 mg, 50,000 U/단백질 mg 내지 100,000 U/단백질 mg, 50,000 U/단백질 mg 내지 150,000 U/단백질 mg, 50,000 U/단백질 mg 내지 175,000 U/단백질 mg, 50,000 U/단백질 mg 내지 200,000 U/단백질 mg, 50,000 U/단백질 mg 내지 250,000 U/단백질 mg, 50,000 U/단백질 mg 내지 300,000 U/단백질 mg, 50,000 U/단백질 mg 내지 500,000 U/단백질 mg, 50,000 U/단백질 mg 내지 600,000 U/단백질 mg, 75,000 U/단백질 mg 내지 100,000 U/단백질 mg, 75,000 U/단백질 mg 내지 150,000 U/단백질 mg, 75,000 U/단백질 mg 내지 175,000 U/단백질 mg, 75,000 U/단백질 mg 내지 200,000 U/단백질 mg, 75,000 U/단백질 mg 내지 250,000 U/단백질 mg, 75,000 U/단백질 mg 내지 300,000 U/단백질 mg, 75,000 U/단백질 mg 내지 500,000 U/단백질 mg, 75,000 U/단백질 mg 내지 600,000 U/단백질 mg, 100,000 U/단백질 mg 내지 150,000 U/단백질 mg, 100,000 U/단백질 mg 내지 175,000 U/단백질 mg, 100,000 U/단백질 mg 내지 200,000 U/단백질 mg, 100,000 U/단백질 mg 내지 250,000 U/단백질 mg, 100,000 U/단백질 mg 내지 300,000 U/단백질 mg, 100,000 U/단백질 mg 내지 500,000 U/단백질 mg, 100,000 U/단백질 mg 내지 600,000 U/단백질 mg, 150,000 U/단백질 mg 내지 175,000 U/단백질 mg, 150,000 U/단백질 mg 내지 200,000 U/단백질 mg, 150,000 U/단백질 mg 내지 250,000 U/단백질 mg, 150,000 U/단백질 mg 내지 300,000 U/단백질 mg, 150,000 U/단백질 mg 내지 500,000 U/단백질 mg, 150,000 U/단백질 mg 내지 600,000 U/단백질 mg, 175,000 U/단백질 mg 내지 200,000 U/단백질 mg, 175,000 U/단백질 mg 내지 250,000 U/단백질 mg, 175,000 U/단백질 mg 내지 300,000 U/단백질 mg, 175,000 U/단백질 mg 내지 500,000 U/단백질 mg, 175,000 U/단백질 mg 내지 600,000 U/단백질 mg, 200,000 U/단백질 mg 내지 250,000 U/단백질 mg, 200,000 U/단백질 mg 내지 300,000 U/단백질 mg, 200,000 U/단백질 mg 내지 500,000 U/단백질 mg, 200,000 U/단백질 mg 내지 600,000 U/단백질 mg, 250,000 U/단백질 mg 내지 300,000 U/단백질 mg, 250,000 U/단백질 mg 내지 500,000 U/단백질 mg, 250,000 U/단백질 mg 내지 600,000 U/단백질 mg, 300,000 U/단백질 mg 내지 500,000 U/단백질 mg, 300,000 U/단백질 mg 내지 600,000 U/단백질 mg 또는 500,000 U/단백질 mg 내지 600,000 U/단백질 mg일 수 있다. gFPE와 같은 rFPE의 특이적 효소 활성은 최대 50,000 U/단백질 mg, 75,000 U/단백질 mg, 100,000 U/단백질 mg, 150,000 U/단백질 mg, 175,000 U/단백질 mg, 200,000 U/단백질 mg, 250,000 U/단백질 mg, 300,000 U/단백질 mg, 500,000 U/단백질 mg 또는 600,000 U/단백질 mg일 수 있다.
gFPE와 같은 rFPE의 특이적 활성은 난백과 같은 천연 공급원으로부터 단리된 무라미다제의 특이적 활성과 유사하거나 이보다 더 클 수 있다. gFPE와 같은 rFPE의 특이적 활성은 난백으로부터 단리되거나 재조합으로 생산된 닭 무라미다제의 특이적 활성과 유사하거나 이보다 더 클 수 있다.
gFPE와 같은 본원에 기재된 rFPE는 항미생물 활성을 가질 수 있다. gFPE/rFPE1과 같은 재조합으로 생산된 FPE의 항미생물 활성은 상업적으로 이용 가능한 무라미다제 및/또는 비-재조합 무라미다제의 항미생물 활성과 유사하거나 이보다 더 높을 수 있다. gFPE의 항미생물 활성은 닭 무라미다제의 항미생물 활성과 유사하거나 이보다 더 높을 수 있다.
본원에 기재된 gFPE의 높은 특이적 활성으로 인해, gFPE를 포함하는 식품은 gFPE 없이 제조된 식품의 보관 수명과 유사하거나 이보다 더 긴 보관 수명을 가질 수 있다. gFPE를 포함하는 식품의 보관 수명은 상업적으로 이용 가능한 무라미다제 및/또는 비-재조합 무라미다제를 사용하여 제조된 식품의 보관 수명과 유사하거나 이보다 더 길 수 있다.
본원에 기재된 gFPE는 재조합으로 생산될 때 천연 공급원으로부터 단리된 무라미다제와 비교하여 저알레르기유발성일 수 있다. 일부 경우에, rFPE1은 닭 무라미다제와 비교하여 저알레르기유발성일 수 있다.
섭취가능한 조성물
본원에 개시된 섭취가능한 조성물은 FPE, 바람직하게는 rFPE 또는 gFPE를 포함하거나, 이것으로 본질적으로 구성되거나, 또는 이것으로 구성된 생성물을 포함한다. 섭취가능한 조성물은 rFPE1 이외에도 천연적으로 단리된 FPE1 또는 gFPE를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 섭취가능한 조성물은 약 0.5% 내지 약 25%의 농도로 rFPE를 가질 수 있다. 본원에 개시된 섭취가능한 조성물은 약 0.5% 내지 약 1%, 약 0.5% 내지 약 2%, 약 0.5% 내지 약 5%, 약 0.5% 내지 약 7%, 약 0.5% 내지 약 10%, 약 0.5% 내지 약 15%, 약 0.5% 내지 약 20%, 약 0.5% 내지 약 25%, 약 1% 내지 약 2%, 약 1% 내지 약 5%, 약 1% 내지 약 7%, 약 1% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 15%, 약 1% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 25%, 약 2% 내지 약 5%, 약 2% 내지 약 7%, 약 2% 내지 약 10%, 약 2% 내지 약 15%, 약 2% 내지 약 20%, 약 2% 내지 약 25%, 약 5% 내지 약 7%, 약 5% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 15%, 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 25%, 약 7% 내지 약 10%, 약 7% 내지 약 15%, 약 7% 내지 약 20%, 약 7% 내지 약 25%, 약 10% 내지 약 15%, 약 10% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 25%, 약 15% 내지 약 20%, 약 15% 내지 약 25% 또는 약 20% 내지 약 25%의 rFPE 농도를 가질 수 있다. 본원에 개시된 섭취가능한 조성물은 약 0.5%, 약 1%, 약 2%, 약 5%, 약 7%, 약 10%, 약 15%, 약 20% 또는 약 25%의 rFPE 농도를 가질 수 있다. 본원에 개시된 섭취가능한 조성물은 적어도 약 0.5%, 약 1%, 약 2%, 약 5%, 약 7%, 약 10%, 약 15% 또는 약 20%의 rFPE 농도를 가질 수 있다. 본원에 개시된 섭취가능한 조성물은 최대 약 1%, 약 2%, 약 5%, 약 7%, 약 10%, 약 15%, 약 20% 또는 약 25%의 rFPE 농도를 가질 수 있다.
섭취가능한 제품은 하나 이상의 다른 단백질, 예컨대, 비-FPE 단백질 또는 비-재조합 단백질을 포함할 수 있다. rFPE는 섭취가능한 제품 중의 단백질 함량을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 섭취가능한 조성물은 유청 단백질, 완두콩 단백질, 대두 단백질, 아몬드 단백질, 귀리 단백질, 아마씨 단백질, 식물성 단백질 또는 난백 단백질을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 다른 단백질은 조류, 어류, 양서류 또는 파충류 공급원으로부터의 rFPE를 포함할 수 있다.
섭취가능한 조성물은 최종 제품 또는 완제품의 성분일 수 있다. FPE 조성물은 이후에 최종 사용자를 위한 최종 제품을 제조하기 위해 다른 성분과 혼합되는 성분일 수 있다. 최종 제품 또는 완제품은 최종 사용자가 섭취하거나 사용하도록 준비가 된 것이다. 완제품은 가공 식품 또는 가공 드링크와 같은 가공 제품일 수 있다. 섭취가능한 조성물의 비제한적인 예에는 식품, 음료 제품, 식이 보조제, 식품 첨가물, 뉴트라슈티컬, 건강관리 제품 및 화장품이 포함된다.
본원에 개시된 섭취가능한 조성물은 액체 또는 반고체일 수 있다. 섭취가능한 조성물은 겔-유사 질감을 가질 수 있다. 본원에 개시된 임의의 섭취가능한 액체 또는 반고체 조성물은 분말화된 rFPE를 용액에 혼합함으로써 생성될 수 있다. 용액은 최종 제품일 수 있거나 또는 최종 제품을 생성하기 위해 이후에 추가로 변형되는 중간 용액일 수 있다.
섭취가능한 액체 조성물 또는 음료의 예에는 소다수, 비타민 드링크, 단백질 쉐이크, 식사 대용 쉐이크, 주스, 원기회복 음료, 우유 기반 드링크 또는 비유제품 기반 드링크, 가향수, 탄산 드링크, 커피, 카페인 드링크, 차, 맥주, 주류 및 스포츠 드링크가 포함된다. 섭취가능한 액체 조성물에서, rFPE는 액체 조성물에 증가된 점도를 제공한다.
투명도는 또한 반투명도(translucency)의 결여에 의해 결정될 수 있다. 반투명도가 결여된 재료는 유백색, 백색 또는 불투명한 외관을 가질 수도 있다. rFPE를 갖는 섭취가능한 조성물은 유백색, 백색 또는 불투명한 외관이 결여될 수 있다.
rFPE를 갖는 섭취가능한 조성물은 또한 rFPE를 갖지 않거나 rFPE와 동일한 농도로 존재하는 상이한 효소를 갖는 조성물과 비교하여 개선된 감각 호소력을 가질 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 섭취가능한 조성물은 액체 형태일 수 있다. 액체 형태는 가용성 rFPE 용액과 같은 중간 제품일 수 있다. 일부 경우에, 액체 형태는 rFPE를 포함하는 음료와 같은 최종 제품일 수 있다. 본원에서 고려되는 상이한 유형의 음료의 예에는 주스, 소다수, 소프트 드링크, 가향수, 단백질수, 강화수, 탄산수, 영양 드링크, 에너지 드링크, 스포츠 드링크, 회복 드링크, 가열 드링크, 커피 기반 드링크, 차 기반 드링크, 식물성 우유, 우유 기반 드링크, 비유제품, 식물성 우유 드링크, 유아용 조제분유 드링크, 알코올 드링크 및 식사 대용 드링크가 포함된다.
일부 실시양태에서, 섭취가능한 식품 조성물은 반고체 형태일 수 있다. 식품은 젤리, 사탕, 육수(broth), 수프, 젤라틴 함유 제품, 겔화된 제품 및 구미 제품일 수 있다. rFPE가 첨가될 수 있는 식품의 추가의 예시적인 카테고리는 소스, 드레싱 및 조미료를 포함한다.
일부 실시양태에서, 섭취가능한 식품 조성물은 고체 형태일 수 있다. 상기 조성물은 베이킹 제품, 빵, 글루텐 함유 제품, 글루텐 무함유 제품, 소스, 드레싱, 조미료, 향신료 블렌드, 조미료 믹스, 코팅, 빵가루(breading), 과일 스낵, 채소 스낵, 냉동 유제품, 냉동 "유제품-유사" 제품, 간편식(prepared meal), 육류 제품, 비육류 제품, 버거, 패티, 단백질 보충제, 영양 바, 디저트 또는 "계란-유사" 제품일 수 있다.
일부 실시양태에서, 섭취가능한 식품 조성물 및 이러한 조성물의 제조 방법은 가열 조건을 포함한다. 예를 들어, 섭취가능한 식품 조성물은 가열된 또는 뜨거운 음료, 예컨대, 따뜻한 또는 뜨거운 드링크, 수프 또는 육수일 수 있다. 일부 경우에, 섭취가능한 식품 조성물은 완제품의 성분을 제조하기 위한 가열 단계를 가질 수 있다. 다른 예는 팬 프라이 및 베이킹을 포함한다.
일부 실시양태에서, gFPE를 포함하는 섭취가능한 식품 조성물은 완제품을 생성하기 위해 다른 성분(들) 또는 요소(들)과 함께 성분으로서 사용되는 조성물이다. 예를 들어, gFPE는 물 또는 다른 액체와 혼합될 수 있고, 이후 이러한 혼합물은 음료, 식품, 식이 보조제 또는 뉴트라슈티컬을 생성하기 위한 성분으로서 사용될 수 있다. 일부 경우에, gFPE는 다른 성분, 예컨대 다른 액체(예를 들어, 넛 밀크, 과일 주스, 채소 추출물 또는 탄산화된 용액)과 함께 혼합될 수 있다. 이러한 용액은 최종 사용자를 위한 최종 제품을 제조하기 위해 이후에 다른 성분과 혼합될 수 있는 성분일 수 있으며; 예를 들어, 용액은 농축된 gFPE를 함유하는 시럽일 수 있다. 최종 제품 또는 완제품은 최종 사용자가 섭취하도록 준비가 된 것이다. 완제품은 가공 식품 또는 가공 드링크와 같은 가공 제품일 수 있다. 일부 예에서, gFPE는 개별 용기로 제공되어 최종 사용자에 의해 최종 제품으로 혼합된다. 일부 경우에, gFPE는 사탕, 구미 제품, 겔화된 제품(예컨대, JelloTM) 또는 스포츠 겔을 제조하기 위해 겔화제와 같은 다른 성분과 혼합된다.
gFPE를 함유하는 섭취가능한 식품의 제조 동안 또는 후에 액체, 고체, 시럽 또는 분말로서 제형화될 수 있다. 조성물은 냉장 보관되거나, 냉동 보관되거나, 따뜻하게 보관되거나, 실온에서 보관되거나, 가열된 온도에서 유지될 수 있다. 식품의 제조는 가열 단계를 포함할 수 있거나, 식품은 가열된 온도에서 보관되거나 제공된다.
섭취가능한 액체 조성물 또는 음료의 예에는 소다수, 비타민 드링크, 단백질 쉐이크, 식사 대용 쉐이크, 주스, 원기회복 드링크, 우유 기반 드링크 또는 비유제품 기반 드링크, 가향수, 탄산 드링크, 커피, 카페인 드링크, 차, 꽃 기반 드링크, 맥주, 주류 및 스포츠 드링크가 포함된다.
본원의 임의의 섭취가능한 액체 또는 반고체 조성물은 분말화된 gFPE를 용액에 혼합함으로써 생성될 수 있다. 용액은 최종 제품, 또는 최종 제품을 생성하기 위해 추가로 변형되는 중간 용액일 수 있다.
gFPE 용액을 제조하기 위해 사용될 수 있는 용매의 예에는 정수, 탄산수, 알코올, 주스, 및 본원에 더욱 상세하게 설명된 것을 포함하는 임의의 다른 상업적으로 이용 가능한 드링크가 포함된다.
gFPE를 포함하는 섭취가능한 조성물의 생성 방법은 gFPE를 용매 및, 임의로, 하나 이상의 다른 성분과 혼합하는 단계를 포함할 수 있다. 혼합은 막자사발, 기계식 그라인더, 블렌딩, 균질화 공정 또는 초음파처리 공정을 포함하는 통상적으로 사용되는 임의의 혼합 방법에 의해 수행될 수 있다.
용액에 첨가되는 gFPE의 양은 (최종 생성물 또는 중간 생성물에서) 본원에서 유도된 gFPE 농도를 생성하는 양일 수 있다.
바람직하게는, 용액에 gFPE를 첨가하면 대부분 또는 거의 모든 gFPE가 실온에서 용액에 가용화된다. 하나의 예에서, 용해도는 투명도 또는 탁도의 결여 정도에 기반하여 결정된다.
본원의 섭취가능한 조성물은 또한 가열 단계를 거칠 수 있다. 이러한 단계는 gFPE의 용해도를 변형 또는 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 레토르팅, 고온 충전 또는 저온살균과 같은 제품을 제조하는 공정에서 가열 단계를 수행하는 것은 본원에서 용해도를 증가시키고 이에 따라 gFPE 용액의 투명도를 증가시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다.
gFPE를 함유하는 섭취가능한 식품의 제조는 건조 및/또는 농축 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 건조 단계는 건조, 탈수, 농축, 및/또는 고체 단백질 또는 조성물을 형성한다. 건조 방법의 일부 비제한적인 예에는 열적 건조, 증발(예를 들어, 진공 또는 공기를 통한 증발), 증류, 비등, 오븐에서 가열, 진공 건조, 분무 건조, 동결 건조(freeze drying) 및 동결건조(lyophilization) 또는 이들의 임의의 조합이 포함된다.
gFPE를 함유하는 섭취가능한 식품의 제조는 희석 및/또는 수화를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 희석은 물 또는 또 다른 액체 형태일 수 있는 액체의 첨가를 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 희석될 수 있다(예를 들어, 20% 물 내지 99.9% 물). 또 다른 예에서, 건조 조성물은 수화될 수 있다(예를 들어, 건조 고체 내지 99.9% 물).
일부 실시양태에서, gFPE를 함유하는 섭취가능한 식품 조성물은 분말 형태이며 분말화된 조성물이 용액으로 제형화되는 경우, gFPE는 실질적으로 완전히 가용성이다. 일부 실시양태에서, 분말화된 조성물이 용액으로 제형화되는 경우, gFPE는 실질적으로 완전히 가용성이며 용액은 실질적으로 투명하다. 일부 실시양태에서, 분말화된 조성물이 용액으로 제형화되는 경우, gFPE는 실질적으로 완전히 가용성이며 용액은 실질적으로 투명하며, 용액은 본질적으로 감각 중성이거나 또는 유청 단백질, 대두 단백질, 완두콩 단백질, 난백 단백질 또는 전란 단백질과 같은 다른 분말화된 단백질로 제조된 용액과 비교하여 개선된 감각 호소력을 갖는다. 일부 실시양태에서, 분말화된 조성물은 물에 가용화되며, 여기서 gFPE의 농도는 조성물의 전체 중량당 중량(w/w) 및/또는 전체 용적당 중량(w/v)으로 1%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39% 또는 40%, 또는 이의 근사값이다.
본원에 기재된 섭취가능한 식품 조성물의 일부 실시양태에서, 조성물은 동물 유래 성분, 유청 단백질, 카제네이트, 지방, 락토스, 가수분해된 락토스, 대두 단백질, 콜라겐, 가수분해된 콜라겐 또는 젤라틴, 또는 이들의 임의의 조합을 본질적으로 갖지 않는다. 본원에 기재된 조성물은 콜레스테롤, 글루코스, 지방, 포화 지방, 트랜스 지방 또는 이들의 임의의 조합을 본질적으로 갖지 않을 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 조성물은 건조 중량 기준으로 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 0.5% 미만의 지방을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 지방-함유(예를 들어, 마요네즈와 같은)일 수 있으며, 이러한 조성물은 최대 약 60% 지방 또는 저지방 조성물(예를 들어, 저지방 마요네즈)을 포함할 수 있고, 이러한 조성물은 더 적은 지방 백분율을 포함할 수 있다. 동물 유래 성분이 없는 조성물은 채식 및/또는 완전 채식으로 간주될 수 있다.
일부 실시양태에서, gFPE 분말 조성물은 5% 미만의 회분(ash)을 포함한다. 용어 "회분"은 당업계에 공지된 용어이며, 하나 이상의 이온, 원소, 미네랄, 및/또는 화합물과 같은 무기물을 나타낸다. 일부 경우에, gFPE 분말 조성물은 전체 중량당 중량(w/w) 및/또는 전체 용적당 중량(w/v)으로 5%, 4.5%, 4%, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.5%, 1%, 0.75%, 0.5%, 0.25% 또는 0.1% 미만의 회분을 포함한다.
일부 실시양태에서, gFPE 분말 조성물의 수분 함량은 15% 미만일 수 있다. gFPE 분말 조성물은 전체 중량당 중량(w/w) 및/또는 전체 용적당 중량(w/v)으로 15%, 12%, 10%, 8%, 6%, 5%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 수분을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, gFPE 분말 조성물의 탄수화물 함량은 30% 미만일 수 있다. gFPE 분말 조성물은 w/w 또는 w/v으로 30%, 27%, 25%, 22%, 20%, 17%, 15%, 12%, 10%, 8%, 5%, 3% 또는 1% 미만의 탄수화물 함량을 가질 수 있다.
일부 경우에, gFPE 분말 조성물 중의 단백질 함량은 전체 중량당 중량(w/w) 및/또는 전체 용적당 중량(w/v)으로 30% 내지 99%일 수 있다. 일부 경우에, gFPE 분말 조성물 중 단백질 함량은 적어도 30% w/w 또는 w/v일 수 있다. 일부 경우에, gFPE 분말 조성물 중 단백질 함량은 최대 99% w/w 또는 w/v일 수 있다. 일부 경우에, gFPE 분말 조성물 중 단백질 함량은 30% 내지 40%, 30% 내지 50%, 30% 내지 60%, 30% 내지 70%, 30% 내지 75%, 30% 내지 80%, 30% 내지 85%, 30% 내지 90%, 30% 내지 95%, 30% 내지 99%, 40% 내지 50%, 40% 내지 60%, 40% 내지 70%, 40% 내지 75%, 40% 내지 80%, 40% 내지 85%, 40% 내지 90%, 40% 내지 95%, 40% 내지 99%, 50% 내지 60%, 50% 내지 70%, 50% 내지 75%, 50% 내지 80%, 50% 내지 85%, 50% 내지 90%, 50% 내지 95%, 50% 내지 99%, 60% 내지 70%, 60% 내지 75%, 60% 내지 80%, 60% 내지 85%, 60% 내지 90%, 60% 내지 95%, 60% 내지 99%, 70% 내지 75%, 70% 내지 80%, 70% 내지 85%, 70% 내지 90%, 70% 내지 95%, 70% 내지 99%, 75% 내지 80%, 75% 내지 85%, 75% 내지 90%, 75% 내지 95%, 75% 내지 99%, 80% 내지 85%, 80% 내지 90%, 80% 내지 95%, 80% 내지 99%, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 99%, 90% 내지 95%, 90% 내지 99% 또는 95% 내지 99% w/w 또는 w/v일 수 있다. 일부 경우에, gFPE 분말 조성물 중 단백질 함량은 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% w/w 또는 w/v일 수 있다. 일부 경우에, gFPE 분말 조성물 중 단백질 함량은 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% w/w 또는 w/v일 수 있다. 일부 경우에, gFPE 분말 조성물의 단백질 함량은 최대 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% w/w 또는 w/v일 수 있다.
rFPE의 겔화
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 FPE는 반고체 조성물을 형성할 수 있다. 일부 경우에, 반고체 조성물은 본원에 기재된 FPE의 열처리 시에 생성될 수 있다. gFPE는 식품에 겔화를 제공할 수 있다. gFPE는 세균과 같은 특정 미생물의 세포벽 펩티도글리칸을 분해하거나 소화하여 겔을 형성하는 데 사용할 수 있다. 일부 경우에, gFPE는 미생물 세포벽을 분해하거나 분해하지 않으면서 겔을 형성할 수 있다. 일부 경우에, gFPE의 열처리 시 형성된 겔 조성물은 임의의 미생물 불순물을 포함하지 않을 수 있다. 일부 경우에, gFPE와 같은 FPE의 열처리 시에 형성된 겔 조성물은 임의의 세균 불순물을 포함하지 않을 수 있다. 일부 경우에, gFPE의 열처리 시 형성된 겔 조성물은 임의의 다른 겔화제 또는 결합제를 포함하지 않을 수 있다. 일부 경우에, gFPE는 닭 무라미다제에 의해 제공되는 겔화와 비교하여 개선된 겔화를 조성물에 제공할 수 있다.
일부 경우에, gFPE는 50℃ 내지 130℃ 범위의 온도에서 열처리 시 겔을 형성한다. 일부 경우에, gFPE는 0.05%만큼 낮은 w/w 단백질 농도에서 50℃ 내지 130℃ 범위의 온도에서 열처리 시 겔을 형성한다. 일부 경우에, gFPE는 임의의 다른 겔화제의 부재 하에 0.05%만큼 낮은 w/w 단백질 농도에서 50℃ 내지 130℃ 범위의 온도에서 열처리 시 겔을 형성한다.
일부 경우에, gFPE는 50℃ 내지 130℃의 온도에서 열처리 시 겔을 형성한다. 일부 경우에, gFPE는 적어도 50℃의 온도에서 열처리 시 겔을 형성할 수 있다. 일부 경우에, gFPE는 최대 130℃의 온도에서 열처리 시 겔을 형성할 수 있다. 일부 경우에, gFPE는 50℃ 내지 60℃, 50℃ 내지 70℃, 50℃ 내지 75℃, 50℃ 내지 80℃, 50℃ 내지 90℃, 50℃ 내지 95℃, 50℃ 내지 100℃, 50℃ 내지 110℃, 50℃ 내지 120℃, 50℃ 내지 130℃, 60℃ 내지 70℃, 60℃ 내지 75℃, 60℃ 내지 80℃, 60℃ 내지 90℃, 60℃ 내지 95℃, 60℃ 내지 100℃, 60℃ 내지 110℃, 60℃ 내지 120℃, 60℃ 내지 130℃, 70℃ 내지 75℃, 70℃ 내지 80℃, 70℃ 내지 90℃, 70℃ 내지 95℃, 70℃ 내지 100℃, 70℃ 내지 110℃, 70℃ 내지 120℃, 70℃ 내지 130℃, 75℃ 내지 80℃, 75℃ 내지 90℃, 75℃ 내지 95℃, 75℃ 내지 100℃, 75℃ 내지 110℃, 75℃ 내지 120℃, 75℃ 내지 130℃, 80℃ 내지 90℃, 80℃ 내지 95℃, 80℃ 내지 100℃, 80℃ 내지 110℃, 80℃ 내지 120℃, 80℃ 내지 130℃, 90℃ 내지 95℃, 90℃ 내지 100℃, 90℃ 내지 110℃, 90℃ 내지 120℃, 90℃ 내지 130℃, 95℃ 내지 100℃, 95℃ 내지 110℃, 95℃ 내지 120℃, 95℃ 내지 130℃, 100℃ 내지 110℃, 100℃ 내지 120℃, 100℃ 내지 130℃, 110℃ 내지 120℃, 110℃ 내지 130℃ 또는 120℃ 내지 130℃의 온도에서 열처리 시 겔을 형성할 수 있다. 일부 경우에, gFPE는 50℃, 60℃, 70℃, 75℃, 80℃, 90℃, 95℃, 100℃, 110℃, 120℃ 또는 130℃의 온도에서 열처리 시 겔을 형성할 수 있다. 일부 경우에, gFPE는 적어도 50℃, 60℃, 70℃, 75℃, 80℃, 90℃, 95℃, 100℃, 110℃ 또는 120℃의 온도에서 열처리 시 겔을 형성할 수 있다. 일부 경우에, gFPE는 최대 60℃, 70℃, 75℃, 80℃, 90℃, 95℃, 100℃, 110℃, 120℃ 또는 130℃의 온도에서 열처리 시 겔을 형성할 수 있다.
일부 경우에, gFPE는 0.05% 내지 30% w/w의 농도에서 겔을 형성할 수 있다. 일부 경우에, gFPE는 적어도 0.05% w/w의 농도에서 겔을 형성할 수 있다. 일부 경우에, gFPE는 최대 30% w/w의 농도에서 겔을 형성할 수 있다. 일부 경우에, gFPE는 0.05% 내지 1%, 0.05% 내지 2%, 0.05% 내지 5%, 0.05% 내지 8%, 0.05% 내지 10%, 0.05% 내지 15%, 0.05% 내지 20%, 0.05% 내지 25%, 0.05% 내지 30%, 1% 내지 2%, 1% 내지 5%, 1% 내지 8%, 1% 내지 10%, 1% 내지 15%, 1% 내지 20%, 1% 내지 25%, 1% 내지 30%, 2% 내지 5%, 2% 내지 8%, 2% 내지 10%, 2% 내지 15%, 2% 내지 20%, 2% 내지 25%, 2% 내지 30%, 5% 내지 8%, 5% 내지 10%, 5% 내지 15%, 5% 내지 20%, 5% 내지 25%, 5% 내지 30%, 8% 내지 10%, 8% 내지 15%, 8% 내지 20%, 8% 내지 25%, 8% 내지 30%, 10% 내지 15%, 10% 내지 20%, 10% 내지 25%, 10% 내지 30%, 15% 내지 20%, 15% 내지 25%, 15% 내지 30%, 20% 내지 25%, 20% 내지 30% 또는 25% 내지 30% w/w의 농도에서 겔을 형성할 수 있다. 일부 경우에, gFPE는 0.05%, 1%, 2%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25% 또는 30% w/w의 농도에서 겔을 형성할 수 있다. 일부 경우에, gFPE는 적어도 0.05%, 1%, 2%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20% 또는 25% w/w의 농도에서 겔을 형성할 수 있다. 일부 경우에, gFPE는 최대 1%, 2%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25% 또는 30% w/w의 농도에서 겔을 형성할 수 있다.
일부 경우에, gFPE는 0.05% 내지 2% w/w의 농도만큼 낮은 농도에서 겔을 형성할 수 있다. 일부 경우에, gFPE는 적어도 0.05% w/w의 농도에서 겔을 형성할 수 있다. 일부 경우에, gFPE는 최대 2% w/w의 농도에서 겔을 형성할 수 있다. 일부 경우에, gFPE는 0.05% 내지 0.06%, 0.05% 내지 0.125%, 0.05% 내지 0.25%, 0.05% 내지 0.5%, 0.05% 내지 1%, 0.05% 내지 1.5%, 0.05% 내지 2%, 0.06% 내지 0.125%, 0.06% 내지 0.25%, 0.06% 내지 0.5%, 0.06% 내지 1%, 0.06% 내지 1.5%, 0.06% 내지 2%, 0.125% 내지 0.25%, 0.125% 내지 0.5%, 0.125% 내지 1%, 0.125% 내지 1.5%, 0.125% 내지 2%, 0.25% 내지 0.5%, 0.25% 내지 1%, 0.25% 내지 1.5%, 0.25% 내지 2%, 0.5% 내지 1%, 0.5% 내지 1.5%, 0.5% 내지 2%, 1% 내지 1.5%, 1% 내지 2% 또는 1.5% 내지 2% w/w의 농도에서 겔을 형성할 수 있다. 일부 경우에, gFPE는 0.05%, 0.06%, 0.125%, 0.25%, 0.5%, 1%, 1.5% 또는 2% w/w의 농도에서 겔을 형성할 수 있다. 일부 경우에, gFPE는 적어도 0.05%, 0.06%, 0.125%, 0.25%, 0.5%, 1% 또는 1.5% w/w의 농도에서 겔을 형성할 수 있다. 일부 경우에, gFPE는 최대 0.05%, 0.06%, 0.125%, 0.25%, 0.5%, 1%, 1.5% 또는 2% w/w의 농도에서 겔을 형성할 수 있다.
식품과 같은 섭취가능한 반고체 또는 겔 조성물은 0.05% 내지 25% gFPE w/w를 포함할 수 있다. 식품과 같은 섭취가능한 반고체 또는 겔 조성물은 적어도 0.05% gFPE w/w를 포함할 수 있다. 식품과 같은 섭취가능한 반고체 또는 겔 조성물은 최대 25% gFPE w/w를 포함할 수 있다. 식품과 같은 섭취가능한 반고체 또는 겔 조성물은 0.05% 내지 0.1%, 0.05% 내지 1%, 0.05% 내지 2%, 0.05% 내지 5%, 0.05% 내지 10%, 0.05% 내지 15%, 0.05% 내지 20%, 0.05% 내지 25%, 0.1% 내지 1%, 0.1% 내지 2%, 0.1% 내지 5%, 0.1% 내지 10%, 0.1% 내지 15%, 0.1% 내지 20%, 0.1% 내지 25%, 1% 내지 2%, 1% 내지 5%, 1% 내지 10%, 1% 내지 15%, 1% 내지 20%, 1% 내지 25%, 2% 내지 5%, 2% 내지 10%, 2% 내지 15%, 2% 내지 20%, 2% 내지 25%, 5% 내지 10%, 5% 내지 15%, 5% 내지 20%, 5% 내지 25%, 10% 내지 15%, 10% 내지 20%, 10% 내지 25%, 15% 내지 20%, 15% 내지 25% 또는 20% 내지 25% gFPE w/w를 포함할 수 있다. 식품과 같은 섭취가능한 반고체 또는 겔 조성물은 0.05%, 0.1%, 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20% 또는 25% gFPE w/w를 포함할 수 있다.
gFPE를 포함하는 조성물은 c형 라이소자임 또는 닭 무라미다제 함유 조성물의 겔 강도보다 더 큰 겔 강도를 가질 수 있다. 일부 경우에, gFPE 조성물은 닭 무라미다제 또는 c형 라이소자임 함유 조성물에 비해 약 또는 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%의 겔 강도를 갖는다. 일부 경우에, gFPE 조성물은 닭 무라미다제 또는 c형 라이소자임 함유 조성물에 비해 최대 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%의 겔 강도를 갖는다.
gFPE를 포함하는 액체 조성물은 c형 라이소자임 또는 닭 무라미다제를 포함하는 조성물의 점도보다 더 큰 점도를 가질 수 있다. 일부 경우에, 액체 gFPE 조성물은 닭 무라미다제 또는 c형 라이소자임 함유 조성물에 비해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%의 점도를 갖는다. 일부 경우에, 액체 gFPE 조성물은 닭 무라미다제 또는 c형 라이소자임 함유 조성물에 비해 최대 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%의 점도를 갖는다.
검 제조에서 gFPE/FPE1의 용도
gFPE는 투명한 채식 겔을 생산하기 위해 사용될 수 있고 식품의 성분으로서 사용되는 검으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, gFPE는 잔탄 검, 젤란 또는 디우탄 검과 같은 세균 다당류를 제조하는 데 사용될 수 있다. gFPE를 사용하여 제조된 검 함유 용액의 투과율은 닭 무라미다제와 같은 통상적으로 사용되는 무라미다제를 사용하여 제조된 검의 투과율보다 높으므로, gFPE를 사용하여 형성된 겔의 증가된 투명도를 초래할 수 있다. gFPE를 사용하여 제조된 검 함유 용액의 투명도는 닭 무라미다제와 같은 통상적으로 사용되는 무라미다제를 사용하여 제조된 검의 투명도보다 더 높을 수 있다.
본원에 기재된 rFPE의 활성이 예상외로 높기 때문에, 본원에 기재된 검 및 겔의 제조는 천연 공급원으로부터 단리된 무라미다제 또는 닭 무라미다제를 사용할 때 요구되는 것보다 더 적은 효소를 요구할 수 있다. 일부 경우에, 검 또는 겔의 제조에 요구되는 양 또는 효소 단위는 닭 무라미다제와 같은 천연적으로 수득된 무라미다제를 사용하는 검 또는 겔의 제조에 요구되는 양 또는 효소 단위보다 2배, 3배, 5배, 7배 또는 10배 적을 수 있다.
본원에 기재된 검 및 겔은 세균 배양물을 소화시켜 제조될 수 있다. 발효 후, 세균 배양물은 고온 및 알칼리성 조건 하에 알칼리성 프로테아제로 처리될 수 있다. 세균은 먼저 실온 또는 25℃ 내지 37℃의 온도에서 배양될 수 있다. 검 제조를 위해, 세균 배양의 온도는 약 45℃, 약 47℃, 약 50℃, 약 52℃, 약 55℃, 약 57℃, 약 60℃, 약 65℃ 또는 약 75℃로 증가될 수 있다.
세균 배양물은 또한 높은 pH와 알칼리성 프로테아제로 처리될 수 있다. 세균 배양물은 약 8, 약 8.5, 약 9, 약 9.5, 약 10, 약 10.5 또는 약 11의 pH에서 알칼리성 프로테아제로 처리될 수 있다. 알칼리성 프로테아제를 사용한 세균 배양물의 단백질분해에는 gFPE와 같은 FPE로의 처리가 뒤따를 수 있다
배양물의 pH는 gFPE로 처리하기 전에 변형될 수 있다. gFPE 처리는 중성 pH에서 수행될 수 있다. gFPE 처리는 약 5.5, 약 6, 약 6.5, 약 7, 약 7.5 또는 약 8의 pH에서 수행될 수 있다.
배양물의 온도는 또한 gFPE로 처리하기 전에 변형될 수 있다. gFPE 처리는 약 30℃, 약 32℃, 약 35℃, 약 37℃ 또는 약 40℃의 온도에서 수행될 수 있다.
잔탄 검과 같은 검을 제조하기 위한 gFPE와 배양물의 반응은 알코올을 사용하여 종결될 수 있다. gFPE와 세균 배양물의 반응을 종결시키기 위해 이소프로판올이 사용될 수 있다. 반응을 종결시킬 수 있는 다른 알코올 또는 용액도 고려된다. 그 다음, 이러한 반응으로부터 제조된 검은 배양물로부터 추출, 예를 들어 침전될 수 있다.
이러한 반응으로부터 제조된 검은 섭취 전에 추가로 처리될 수 있다. 예를 들어, 검은 섭취 전에 열처리되거나 건조될 수 있다.
패키징
본원에 개시된 섭취가능한 조성물의 이점 중 하나는 간단한 패키징을 가능하게 한다는 것이다. 하나의 예에서, 섭취가능한 조성물은 조성물의 탁도가 결여되어 더욱 소비자에게 호소력 있는(consumer-appealing) 제품이 될 수 있기 때문에 투명한 용기에 패키징될 수 있다.
섭취가능한 조성물은 냉장 보관되거나, 냉동 보관되거나, 따뜻하게 보관되거나, 실온에서 보관되거나, 가열된 온도에서 유지될 수 있다.
재조합 FPE
rFPE는 임의의 종의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, rFPE는 조류, 어류, 양서류 또는 파충류의 FPE 아미노산 서열을 가질 수 있다. 조류로부터의 아미노산 서열을 갖는 rFPE는 가금류(poultry, fowl), 물새, 사냥용 새, 닭, 메추라기, 칠면조, 오리, 타조, 거위, 갈매기, 뿔닭, 꿩, 에뮤 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. rFPE는 안세르 안세르 안세르(Anser anser anser) 또는 갈루스 갈루스 도메스티쿠스(Gallus gallus domesticus)와 같은 단일 종으로부터 유래된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 대안적으로, rFPE는 둘 이상의 종으로부터 유래된 아미노산 서열을 가질 수 있고, 그 자체로 하이브리드일 수 있다.
rFPE는 FPE의 비-천연 발생 변이체일 수 있다. 이러한 변이체는 천연 FPE 서열에 비해 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다.
이러한 변이체는 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가질 수 있다. 바람직하게는, 변이체는 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 경우에, 바람직한 변이체는 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 경우에, 바람직한 변이체는 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나에 대해 적어도 97% 서열 동일성을 가질 수 있다. 아미노산 서열의 맥락에서 본원에서 사용된 용어 "서열 동일성"은 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해, 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로 고려하지 않으면서 서열을 정렬하고 필요한 경우 갭을 도입한 후 선택된 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당업계의 기술 내에 있는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 정렬을 측정하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다.
일부 실시양태에서, 변이체는 감소된 알레르기항원성(allergenicity)과 같은 추가적인 특징을 부여하는 변이체이다.
rFPE를 발현하는데 사용되는 숙주 유기체에 따라, rFPE는 야생형 FPE와 상이한 글리코실화, 아세틸화 또는 인산화 패턴을 가질 수 있다. 예를 들어, rFPE는 글리코실화, 아세틸화 또는 인산화되거나 되지 않을 수 있다. rFPE는 조류, 비-조류, 미생물, 비-미생물, 포유동물 또는 비-포유동물 글리코실화, 아세틸화 또는 인산화 패턴을 가질 수 있다.
일부 경우에, rFPE는 탈글리코실화(예를 들어, 화학적으로, 효소적으로, 엔도-H, PNGase F, O-글리코시다제, 뉴라미니다제, β1-4 갈락토시다제, β-N-아세틸글루코사미니다제), 탈아세틸화(예를 들어, 단백질 탈아세틸화효소, 히스톤 탈아세틸화효소, 시르투인) 또는 탈인산화(예를 들어, 산 포스파타제, 람다 단백질 포스파타제, 송아지 장 포스파타제, 알칼리성 포스파타제)될 수 있다. 탈글리코실화, 탈아세틸화 또는 탈인산화는 더욱 균일한 단백질 또는 더 적은 변형으로 조성물을 생성할 수 있는 단백질을 생성할 수 있다.
rFPE는 숙주 세포에서 재조합으로 발현된다. 본원에 사용된 바와 같이, "숙주" 또는 "숙주 세포"는 원하는 생성물을 생산하기 위해 선택되거나 유전적으로 변형된 임의의 단백질 생산 숙주를 의미한다. 예시적인 숙주는 사상 진균과 같은 진균뿐만 아니라 세균, 효모, 식물, 곤충 및 포유동물 세포를 포함한다. 숙주 세포는 아르술라 종(Arxula spp.), 아르술라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans), 클루이베로마이세스 종(Kluyveromyces spp.), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 코마가타엘라 파피이(Komagataella phaffii), 피치아 종(Pichia spp.), 피치아 안구스타(Pichia angusta), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 종(Saccharomyces spp.), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 종(Schizosaccharomyces spp.), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 야로위아 종(Yarrowia spp.), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 아가리쿠스 종(Agaricus spp.), 아가리쿠스 비스포루스(Agaricus bisporus), 아스퍼길루스 종(Aspergillus spp.), 아스퍼길루스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스퍼길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스퍼길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼길루스 니제르(Aspergillus niger), 아스퍼길루스 오리재(Aspergillus oryzae), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 콜레토트리쿰 종(Colletotrichum spp.), 콜레토트리쿰 글로에스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporiodes), 엔도시아 종(Endothia spp.), 엔도시아 파라시티카(Endothia parasitica), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 푸사리움 종(Fusarium spp.), 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 푸사리움 솔라니(Fusarium solani), 무코르 종(Mucor spp.), 무코르 미에헤이(Mucor miehei), 무코르 푸실루스(Mucor pusillus), 마이셀리오프토라 종(Myceliophthora spp.), 마이셀리오프토라 써모필라(Myceliophthora thermophila), 뉴로스포라 종(Neurospora spp.), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 페니실리움 종(Penicillium spp.), 페니실리움 카멤베르티(Penicillium camemberti), 페니실리움 카네센스(Penicillium canescens), 페니실리움 크리소게늄(Penicillium chrysogenum), 페니실리움(탈라로마이세스) 에머소니이(Penicillium(Talaromyces) emersonii), 페니실리움 푸니쿨로 숨(Penicillium funiculo sum), 페니실리움 푸르푸로제늄(Penicillium purpurogenum), 페니실리움 로케포르티(Penicillium roqueforti), 플레우로투스 종(Pleurotus spp.), 플레우로투스 오스트레아투스(Pleurotus ostreatus), 리조무코르 종(Rhizomucor spp.), 리조무코르 미에헤이(Rhizomucor miehei), 리조무코르 푸실루스(Rhizomucor pusillus), 리조푸스 종(Rhizopus spp.), 리조푸스 아리주스(Rhizopus arrhizus), 리조푸스 올리고스포러스(Rhizopus oligosporus), 리조푸스 오리재(Rhizopus oryzae), 트리코더마 종(Trichoderma spp.), 트리코더마 알트로비리데(Trichoderma altroviride), 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei) 또는 트리코더마 비레우스(Trichoderma vireus)일 수 있다. 숙주 세포는 미국 식품의약국(FDA)에 의해 일반적으로 안전한 것으로 간주되는 물질(generally regarded as safe)로서 승인된 유기체일 수 있다.
rFPE 단백질은 효모, 사상 진균 또는 세균에서 재조합으로 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, rFPE 단백질은 피치아 종(코마가타엘라 파피이 및 코마가타엘라 파스토리스), 사카로마이세스 종, 트리코더마 종, 슈도모나스 종 또는 이. 콜라이 종에서 재조합으로 발현된다.
숙주 세포, 예를 들어 피치아 종, 사카로마이세스 종, 트리코더마 종, 슈도모나스 종에서의 rFPE의 발현은 전사 후 또는 번역 후 변형의 일부로서 FPE 서열에의 펩티드 부가를 초래할 수 있다. 이러한 펩티드는 천연 FPE 서열의 일부가 아닐 수 있다. 예를 들어, 코마가타엘라 파피이 및 코마가타엘라 파스토리스와 같은 피치아 종에서 FPE 서열을 발현하는 것은 N-말단 또는 C-말단에의 펩티드 부가를 초래할 수 있다. 일부 경우에, 테트라펩티드 EAEA는 숙주 세포에서 발현 시 FPE 서열의 N-말단에 부가된다.
rFPE의 발현은 발현 벡터, 플라스미드, 숙주 게놈에 통합된 핵산 또는 다른 수단에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 발현을 위한 벡터는 (a) 프로모터 요소, (b) 신호 펩티드, (c) 이종 FPE 서열 및 (d) 종결자 요소를 포함할 수 있다.
FPE의 발현에 사용될 수 있는 발현 벡터는 요소 (a), (b), (c) 및 (d)를 갖는 발현 카세트를 포함하는 것들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 신호 펩티드 (c)는 벡터에 포함될 필요가 없다. 일반적으로, 발현 카세트는 동족 숙주 미생물의 게놈에 통합될 때 이식유전자의 전사를 매개하도록 설계된다.
숙주 미생물로의 형질전환 전에 벡터의 증폭을 돕기 위해, 복제 기점 (e)가 벡터(예컨대, PUC_ORIC 및 PUC(DNA2.0))에 포함될 수 있다. 발현 벡터로 안정적으로 형질전환된 미생물의 선택을 돕기 위해, 벡터는 또한 URA3 유전자 및 제오신(Zeocin) 내성 유전자 (ZeoR)와 같은 선택 마커 (f)를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 또한 숙주 미생물로의 형질전환 전에 발현 벡터의 선형화를 가능하게 하는 제한 효소 부위 (g)를 함유하여 발현 벡터의 숙주 게놈으로의 안정한 통합을 용이하게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 요소 (b), (e), (f), 및 (g) 중 어느 것도 포함하지 않는 요소 (b), (e), (f) 및 (g)의 임의의 서브세트를 함유할 수 있다. 당업자에게 공지된 다른 발현 요소 및 벡터 요소는 본원에 기재된 요소와 조합되어 사용되거나 이를 대체할 수 있다.
예시적인 프로모터 요소 (a)는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터 및 하이브리드 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 프로모터는 acu-5, adh1+, 알코올 데하이드로게나제(ADH1, ADH2, ADH4), AHSB4m, AINV, alcA, α-아밀라제, 대체 옥시다제(AOD), 알코올 옥시다제 I(AOX1), 알코올 옥시다제 2(AOX2), AXDH, B2, CaMV, 셀로바이오하이드롤라제 I(cbh1), ccg-1, cDNA1, 세포 필라멘트 폴리펩티드(cfp), cpc-2, ctr4+, CUP1, 디하이드록시아세톤 신타제(DAS), 에놀라제(ENO, ENO1), 포름알데하이드 데하이드로게나제(FLD1), FMD, 포르메이트 데하이드로게나제(FMDH), G1, G6, GAA, GAL1, GAL2, GAL3, GAL4, GAL5, GAL6, GAL7, GAL8, GAL9, GAL10, GCW14, gdhA, gla-1, α-글루코아밀라제(glaA), 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제(gpdA, GAP, GAPDH), 포스포글리세레이트 뮤타제(GPM1), 글리세롤 키나제(GUT1), HSP82, invl+, 이소시트레이트 리아제(ICL1), 아세토하이드록시산 이소메로리덕타제(acetohydroxy acid isomeroreductase)(ILV5), KAR2, KEX2, β-갈락토시다제(lac4), LEU2, melO, MET3, 메탄올 옥시다제(MOX), nmt1, NSP, pcbC, PET9, 페록신 8(PEX8), 포스포글리세레이트 키나제(PGK, PGK1), pho1, PHO5, PHO89, 포스파티딜이노시톨 신타제(PIS1), PYK1, 피루베이트 키나제(pki1), RPS7, 소르비톨 데하이드로게나제(SDH), 3-포스포세린 아미노트랜스퍼라제(SER1), SSA4, SV40, TEF, 번역 연장 인자 1 알파(TEF1), THI11, 호모세린 키나제(THR1), tpi, TPS1, 트리오스 포스페이트 이소머라제(TPI1), XRP2, YPT1 및 이들의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
신호 서열, 표적화 신호, 국소화 신호, 국소화 서열, 신호 펩티드, 전이 펩티드, 리더 서열 또는 리더 펩티드로도 알려진 신호 펩티드 (b)는 단백질 또는 폴리뉴클레오티드의 분비를 뒷받침할 수 있다. 숙주 세포로부터 재조합 또는 이종 발현된 단백질의 세포외 분비는 단백질 정제를 촉진할 수 있다. 신호 펩티드는 단백질의 전구체(예를 들어, 프리프로펩티드, 프리단백질)로부터 유래될 수 있다. 신호 펩티드는 천연 FPE에서 신호 펩티드 이외의 단백질의 전구체로부터 유래될 수 있다.
FPE를 코딩하는 임의의 핵산 서열은 (c)로서 사용될 수 있다. 바람직하게 이러한 서열은 숙주 세포에 최적화된 코돈이다.
예시적인 전사 종결자 요소는 acu-5, adh1+, 알코올 데하이드로게나제(ADH1, ADH2, ADH4), AHSB4m, AINV, alcA, α-아밀라제, 대체 옥시다제(AOD), 알코올 옥시다제 I(AOX1), 알코올 옥시다제 2(AOX2), AXDH, B2, CaMV, 셀로바이오하이드롤라제 I(cbh1), ccg-1, cDNA1, 세포 필라멘트 폴리펩티드(cfp), cpc-2, ctr4+, CUP1, 디하이드록시아세톤 신타제(DAS), 에놀라제(ENO, ENO1), 포름알데하이드 데하이드로게나제(FLD1), FMD, 포르메이트 데하이드로게나제(FMDH), G1, G6, GAA, GAL1, GAL2, GAL3, GAL4, GAL5, GAL6, GAL7, GAL8, GAL9, GAL10, GCW14, gdhA, gla-1, α-글루코아밀라제(glaA), 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제(gpdA, GAP, GAPDH), 포스포글리세레이트 뮤타제(GPM1), 글리세롤 키나제(GUT1), HSP82, invl+, 이소시트레이트 리아제(ICL1), 아세토하이드록시산 이소메로리덕타제(ILV5), KAR2, KEX2, β-갈락토시다제(lac4), LEU2, melO, MET3, 메탄올 옥시다제(MOX), nmt1, NSP, pcbC, PET9, 페록신 8(PEX8), 포스포글리세레이트 키나제(PGK, PGK1), pho1, PHO5, PHO89, 포스파티딜이노시톨 신타제(PIS1), PYK1, 피루베이트 키나제(pki1), RPS7, 소르비톨 데하이드로게나제(SDH), 3-포스포세린 아미노트랜스퍼라제(SER1), SSA4, SV40, TEF, 번역 연장 인자 1 알파(TEF1), THI11, 호모세린 키나제(THR1), tpi, TPS1, 트리오스 포스페이트 이소머라제(TPI1), XRP2, YPT1 및 이들의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
예시적인 선택가능한 마커 (f)는 항생제 내성 유전자(예를 들어, 제오신, 암피실린, 블라스티시딘, 카나마이신, 누르세오트리신, 클로로암페니콜, 테트라사이클린, 트리클로산, 간시클로버 및 이들의 임의의 조합), 영양요구성 마커(예를 들어, ade1, arg4, his4, ura3, met2 및 이들의 임의의 조합)를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
하나의 예에서, 피치아 종에서의 발현을 위한 벡터는 FPE를 코딩하는 핵산 서열과 프레임 내 융합된 신호 펩티드(알파 교배 인자)에 작동 가능하게 연결된 AOX1 프로모터, 및 FPE를 코딩하는 핵산 서열의 바로 하류에 있는 종결자 요소 (AOX1 종결자)를 포함할 수 있다.
또 다른 예에서, DAS1 프로모터를 포함하는 벡터는 FPE를 코딩하는 핵산 서열과 프레임 내 융합된 신호 펩티드(알파 교배 인자), 및 FPE의 바로 하류에 있는 종결자 요소(AOX1 종결자)에 작동 가능하게 연결된다.
본원에 기재된 재조합 단백질은 하나 이상의 숙주 세포로부터 분비될 수 있다. 일부 실시양태에서, rFPE는 숙주 세포로부터 분비된다. 분비된 rFPE은 원심분리, 분별, 여과, 친화성 정제 및 세포, 액체 및 고체 배지 성분, 기타 세포 생성물 및 부산물로부터 단백질을 분리하기 위한 기타 방법과 같은 방법에 의해 단리 및 정제될 수 있다. 일부 실시양태에서, rFPE은 피치아 종에서 생산되고 숙주 세포로부터 배양 배지 내로 분비된다. 그 다음, 분비된 rFPE는 추가 사용을 위해 다른 배지 성분으로부터 분리된다.
섭취가능한 제품 및 rFPE는 임의의 미생물 성장이 실질적으로 없을 수 있다. 예를 들어, rFPE는 미생물 성장을 포함하는 배양물로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, rFPE 조성물은, 예를 들어, 프로바이오틱 제형의 경우에 미생물 성장을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 프로바이오틱 조성물은 rFPE를 포함한다. 프로바이오틱 조성물은 rFPE를 생산하는 미생물을 포함할 수 있다.
Figure pct00001
실시예
실시예 1: 발현 작제물, 형질전환, 단백질 정제 및 가공
피치아 파스토리스에서 서열번호 1을 갖는 g형 식품 보존 효소(rFPE1)의 성숙한 형태의 재조합 발현을 위해 6개의 발현 작제물을 생성하였다. 작제물은 AOX1, Pex11, DAS1, FLD1, FGH1 및 FDH1 프로모터를 포함하였다. rFPE1 코딩 서열(서열번호 1을 코딩함)은 프로모터 서열 하류의 알파 교배 인자 신호 서열과 프레임내(in-frame) 융합되었다. AOX1 유전자로부터의 전사 종결자는 rFPE1 서열의 하류에 배치하였다.
피. 파스토리스 균주는 세포질 킬러 플라스미드를 제거하도록 변형시킨 다음, AOX1 유전자에 결실을 갖도록 추가로 변형시켰다. 이러한 결실은 에너지 공급원으로서 메탄올을 소비하는 균주의 능력을 감소시키는 메탄올-활용 느린(mutS) 표현형을 생성하였다. 피. 파스토리스 세포를 6가지 발현 작제물 중 하나로 형질감염시켰다.
발효: 6가지 rFPE1 발현 작제물 중 하나로 형질감염된 세포를 주변 조건에서 별도의 생물반응기에서 성장시켰다. 발효 공정을 위한 시드 트레인은 진탕기 플라스크를 액체 성장 브로스로 접종함으로써 시작하였다.
배양물을 30℃, 설정된 pH 및 용존 산소(DO)에서 성장시켰다. 배양물에 탄소원 공급원을 공급하였다.
생산을 확장하기 위해, rFPE1 피. 파스토리스 시드 균주를 냉동저장고에서 꺼내 실온으로 해동시켰다. 해동된 시드 바이알의 내용물을 사용하여 배플 플라스크에 액체 시드 배양 배지를 접종하고 이를 진탕 인큐베이터에서 30℃에서 성장시켰다. 그 다음, 상기 시드 플라스크를 옮기고 기본 염 배지, 미량 금속 및 글루코스를 함유하는 일련의 더 크고 더 큰 시드 발효기(수는 규모에 따라 다름)에서 성장시켰다. 시드 반응기의 온도를 30℃, pH 5, 및 30% DO에서 제어하였다. 질소 공급원으로도 작용하는 암모니아 수산화물을 공급하여 pH를 유지한다. 일단 충분한 세포 덩어리에 도달하면, 성장된 rFPE1 피. 파스토리스는 기본 염 배지, 미량 금속 및 글루코스를 함유하는 생산 규모 반응기에 접종한다. 시드 탱크에서와 같이, 배양은 공정 전반에 걸쳐 30℃, pH 5 및 30% DO에서 제어한다. 다시 암모니아 수산화물을 공급하여 pH를 유지한다. 초기 뱃치 글루코스 단계 동안, 배양물이 모든 글루코스 및 후속적으로 생성되는 에탄올을 소비하도록 정치시킨다. 표적 세포 밀도가 달성되고 글루코스 및 에탄올 농도가 0인 것으로 확인되면, 글루코스 유가식(fed-batch) 성장 단계를 개시한다. 이 단계에서, 배양물이 표적 세포 밀도에 도달할 때까지 글루코스를 공급한다. 0이 아닌 글루코스 농도의 존재 하에 에탄올이 축적되는 것을 방지하기 위해 글루코스를 제한된 속도로 공급한다. 최종 유도 단계에서, 배양물에 글루코스 및 메탄올을 공동 공급하여 rFPE1을 생성하도록 유도한다. 글루코스는 원하는 성장 속도를 생성하는 양으로 공급하면서, 메탄올은 발현이 일관되게 유도되는 것을 보장하는 1%로 메탄올 농도를 유지하도록 공급하였다. 특정 공정 매개변수(예를 들어, 세포 밀도, 글루코스/메탄올 농도, 생성물 역가 및 품질)를 분석하기 위해 발효 공정 전반에 걸쳐 규칙적인 샘플을 채취한다. 지정된 발효 시간 후, 분비된 rFPE1을 수집하고 하류 가공을 위해 옮긴다.
액체 성장 브로스로부터 세포를 분리하고/하거나, 액체 성장 브로스의 다수의 여과 단계를 수행하고/하거나, 크로마토그래피를 수행하고/하거나, 최종 단백질 생성물을 건조시켜 단리된 재조합 rFPE1 분말을 생성하여 rFPE1 생성물을 정제하였다.
실시예 2: 닭 무라미다제와 대비한 rFPE1의 특이적 활성
10ml 인산칼륨 완충액(KPI 50mM, pH 6.2 내지 6.6) 중의 0.05% 또는 5mg의 동결건조된 마이크로코쿠스 루테우스(엠. 리소데이크티쿠스)의 초기 현탁액 농도를 제조하고 뒤집어서(30초) 혼합하여 현탁시켰다. 용액을 약 15 내지 20분 동안 침강시켜 세포를 적절하게 재수화시켰다. 그 다음, 세포 현탁액의 A450 흡광도는 0.6 내지 0.7인 것으로 결정되었다. 분석을 수행하기 전, 세포 현탁액을 마이크로플레이트에 첨가하고 온도를 25℃로 조정하였다. rFPE1 제제(실시예 1로부터)의 특이적 활성은 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 본 분석에서 닭 무라미다제의 것보다 거의 10배 더 큰 것으로 관찰되었다.
Figure pct00002
실시예 3: 잔탄 검
크산타노나스 캄페스트리스로부터의 잔탄 검의 제조에서 rFPE1이 닭 무라미다제(리소빈)를 대체할 수 있는지 여부를 검토하기 위해 기능적 분석을 수행하였다. 세포 배양으로부터 세균성 다당류(잔탄, 젤란 및 디우탄 검을 포함)를 생산하기 위한 여러 효소적 산업 공정이 있다.
세균 배양물을 알칼리성 조건(pH 10) 하에 55℃에서 열 사멸시킨 다음, 알칼리성 프로테아제(서브틸리신-관련 세린 프로테아제)를 사용하여 단백질가수분해/가용화하였다. 단백질가수분해 후, 제제를 중성 pH(예를 들어, pH 6.5 내지 7.5)로 완충하고 ~30 ppm(백만분율)의 농도를 사용하여 25℃에서 무라미다제로 효소 처리하였다. 잔탄 검의 경우, 반응은 1.6x 중량의 99% 이소프로판올을 사용하여 고체 검을 추출하여 종결시켰다. 그 다음, 검 잔류물을 건조시키고 원하는 최종 %(w/v)로 물에 재현탁하고 샘플을 통한 광 투과율(%T; 또는 600nm에서 투명도)을 측정하여 품질을 평가하였다. 다양한 효소 농도의 rFPE1(실시예 1로부터) 또는 닭 무라미다제를 사용하여 잔탄 검을 제조하였다. 투과율 결과는 표 3에 나타낸다.
Figure pct00003
실시예 4: 항미생물 활성
난백 무라미다제는 이의 세균 세포벽 분해 활성으로 인해 일반적으로 안전한 것으로 간주되는 물질(Generally Regarded As Safe: GRAS)로 인증되있기 때문에 식품 및 음료 제품에 직접 첨가되는 통상적인 보존제/항세균제이다. 따라서, rFPE1(실시예 1)를 이것이 오에노코쿠스 오에니(Oenococcus oeni)(와인, 맥주 및 과일 주스 오염균), 페디오코쿠스 담노수스(Pediococcus Damnosus)(맥주 및 와인 부패), 마이크로코쿠스 루테우스(Micrococcus luteus)(식품 부패), 락토바실루스 브레비스(Lactobacillus brevis)(맥주 제조에 사용되는 유익한 세균) 및 크산토모나스 캄페스트리스(Xanthamonas campestris)(잔탄 검 제조)의 살아있는 배양물(~2×107 세포/ml)을 사멸시킬 수 있는지를 결정하기 위해 콜로니 형성 단위(CFU) 분석에서 시험하였다. 이러한 실험의 결과를 도 1a 내지 도 1e에 나타낸다.
본 실험을 위해, 세균 배양물을 각각의 선호 배지에서 성장시킨 다음, 물을 사용하여 1.0의 최종 OD600으로 조정하였다. 그 다음, 세포 현탁액을 500 ppm rFPE1(최종 농도) 또는 물 단독(대조군)과 혼합하고, 세포 희석 및 플레이팅(하기 참조) 전에 실온(25℃)에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 도 1a 내지 도 1e에 도시된 바와 같이, rFPE1은 오. 오에니, 피. 담노수스 및 엠. 루테우스 세포에 대한 상당한 살균 활성을 제공하였지만, rFPE는 유익한 세균인 엘. 브레비스의 생존력에는 가시적인 효과를 미치지 않았다. rFPE1이 잔탄 검 제조 동안 살아있는 크산토모나스 캄페스트리스 세포를 사멸시키는 데 일상적으로 사용되지는 않지만, 500 ppm의 rFPE1은 처리 후 통계적으로 최대 48시간 동안 이 세균 종의 성장을 제어하는 것으로 입증되었다(도 1e 참조). 따라서, 이러한 결과는 rFPE1의 살균/정균(bacteriostatic) 활성이 현재 닭 난백 무라미다제가 사용되는 임의의 식품 또는 음료 용도를 대체할 수 있음을 입증한다.
다른 실험에서, rFPE1 및 닭 무라미다제 효소의 최소 억제 농도를 측정하였다. 본 분석의 2가지 상이한 반복실험의 결과는 하기 표 4 및 5에 나타낸다.
Figure pct00004
Figure pct00005
실시예 5: rFPE1의 겔화
서열번호 1을 갖는 FPE1(rFPE1)은 실시예 1에 상술된 바와 같이 재조합으로 생산하였다. 20% rFPE1 용액을 1X PBS(pH 7.4)에서 제조하였다. 29 mg rFPE1 분말을 145μl 1XPBS에 재현탁하였다. 용액을 포함하는 튜브를 100℃에서 비등 수조에 수초 동안 떨어뜨렸다. 도 2a는 비등 전과 비등 후의 용액을 나타낸다. 도 2a에 도시된 바와 같이, rFPE1은 거의 즉각적으로 겔을 형성하였다.
20% rFPE1 용액의 100μl 용액을 튜브에서 55℃, 60℃, 65℃, 70℃ 또는 75℃의 온도에서 10분 동안 가열한 후 얼음에 넣고 4℃에서 보관하였다. 20% 농도의 재조합 닭 c형 라이소자임(cOVL)의 비교 용액도 동일한 온도에서 가열하였다. 결과는 도 2b에 도시한다. 도 2b에 도시된 바와 같이, rFPE1은 60℃에서 시작하는 온도에서 겔화되는 반면, cOVL은 75℃에서도 겔화되지 않았다. 도 2c는 함몰부 및 깨끗한 모서리를 갖는 겔화된 rFPE1을 도시한다.
rFPE1 용액의 겔화는 또한 75℃에서 15분 동안 처리한 후 얼음에 보관할 때 0.063% 내지 15% 범위의 상이한 농도에서 측정하였다. rFPE1은 0.063%만큼 낮은 농도에서 겔화될 수 있었고, 여기서 눈에 잘 띄지 않는(discreet) 겔 입자를 형성하였다. 더 높은 농도에서 rFPE1은 커드(curd)-유사 구조를 형성하고 15% 농도에서 구조화된 겔 입자를 형성하였다.
본 실시예에서 설명된 온도에서의 겔화는 라이소자임 단백질에서 비교적 알려지지 않았으며 따라서 예상밖의 것이다. 이러한 결과는 rFPE1이 (이의 낮은 열 겔화 프로파일(유리-전이 온도)로 인해) 복합 단백질-단백질 또는 단백질-탄수화물 식품 조성물 또는 식품에서 단백질 겔화 및 항미생물 특성을 위한 조핵제(nucleator)로서 사용될 수 있음을 보여준다.
실시예 6: rFPE1의 면역 반응성
cOVL 또는 rFPE1에 대해 유도된 항체의 교차반응성은 리소빈, 상업적으로 이용 가능한 c형 OVL 및 rFPE1에서 시험하였다. SDS-PAGE는 항-coVL 또는 항-FPE1 1차 항체를 사용하여 rFPE1, 리소빈, cOVL 및 희석된 거위 난백에 대해 수행하였다. 레인 1 내지 8은 항-cOVL 항체의 1:3000 희석액으로 처리한 반면, 레인 9 내지 16은 항-rFPE1 항체의 1:10,000 희석액으로 처리하였다.
[표 5]
Figure pct00006
도 3에 도시된 바와 같이, 좌측 웨스턴 블롯은 항-cOVL 항체가 리소빈에 결합함을 나타낸다(약 13kD의 MW). 우측 겔에서 항-r rFPE1 항체는 정제된 rFPE1에 결합한다(약 20 kD의 MW). 결과는 닭 난백 라이소자임 단백질에 대한 상업적으로 이용 가능한 항체(공지된 식품 알레르겐)가 재조합 또는 천연 거위 난백 라이소자임을 인식하지 않는다는 것을 보여준다.
본 발명의 바람직한 실시양태가 본원에 제시되고 설명되었으나, 이러한 실시양태가 단지 예로서 제공된다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명은 본 명세서 내에 제공된 특정 예로 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명은 전술한 명세서를 참조하여 설명되었으나, 본원의 실시양태의 설명 및 예시는 제한적인 의미로 해석되는 것을 의미하지는 않는다. 당업자는 이제 본 발명으로부터 벗어나지 않으면서 다수의 변경, 변화 및 대체를 생각해낼 것이다. 또한, 본 발명의 모든 측면은 다양한 조건 및 변수에 따라 좌우되는 본원에 기재된 특정 묘사, 구성 또는 상대적 비율로 제한되지 않음이 이해될 것이다. 본원에 기재된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있음이 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명은 임의의 이러한 대안, 변형, 변경 또는 등가물을 또한 포함하는 것으로 고려된다. 하기 청구범위는 본 발명의 범위를 정의하고, 이러한 청구범위 및 그 등가물의 범위 내의 방법 및 구조가 이에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Clara Foods Co. <120> ENZYME COMPOSITIONS AND METHODS OF MAKING THEM <130> 49160-718.601 <150> US62/953,361 <151> 2019-12-24 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 185 <212> PRT <213> Anser anser anser <400> 1 Arg Thr Asp Cys Tyr Gly Asn Val Asn Arg Ile Asp Thr Thr Gly Ala 1 5 10 15 Ser Cys Lys Thr Ala Lys Pro Glu Gly Leu Ser Tyr Cys Gly Val Ser 20 25 30 Ala Ser Lys Lys Ile Ala Glu Arg Asp Leu Gln Ala Met Asp Arg Tyr 35 40 45 Lys Thr Ile Ile Lys Lys Val Gly Glu Lys Leu Cys Val Glu Pro Ala 50 55 60 Val Ile Ala Gly Ile Ile Ser Arg Glu Ser His Ala Gly Lys Val Leu 65 70 75 80 Lys Asn Gly Trp Gly Asp Arg Gly Asn Gly Phe Gly Leu Met Gln Val 85 90 95 Asp Lys Arg Ser His Lys Pro Gln Gly Thr Trp Asn Gly Glu Val His 100 105 110 Ile Thr Gln Gly Thr Thr Ile Leu Ile Asn Phe Ile Lys Thr Ile Gln 115 120 125 Lys Lys Phe Pro Ser Trp Thr Lys Asp Gln Gln Leu Lys Gly Gly Ile 130 135 140 Ser Ala Tyr Asn Ala Gly Ala Gly Asn Val Arg Ser Tyr Ala Arg Met 145 150 155 160 Asp Ile Gly Thr Thr His Asp Asp Tyr Ala Asn Asp Val Val Ala Arg 165 170 175 Ala Gln Tyr Tyr Lys Gln His Gly Tyr 180 185 <210> 2 <211> 184 <212> PRT <213> Ambystoma mexicanum <400> 2 Ser Gly Cys Tyr Gly Asn Ile Met Asp Val Pro Thr Thr Gly Ala Ser 1 5 10 15 Cys Leu Thr Ala Ser Gln Asp Asn Leu Pro Tyr Cys Gly Val Ala Ala 20 25 30 Ser Gln Gln Met Ala Ala Thr Asp Leu Pro Asp Met Asn Gln Tyr Lys 35 40 45 Glu Lys Ile Leu Ala Val Ala Gln Asn Leu Cys Met Asp Gly Ala Val 50 55 60 Ile Ala Gly Ile Ile Ser Arg Glu Ser Arg Ala Gly Ala Val Leu Gln 65 70 75 80 Asn Gly Trp Gly Asp Asn Gly His Ala Phe Gly Leu Met Gln Ile Asp 85 90 95 Ile Arg Trp His Ser Ile Glu Gly Ala Trp Asn Ser Gln Glu Asn Ile 100 105 110 Asn Glu Gly Thr Gly Ile Leu Ile Asn Met Ile Val Ala Ile Ser Asp 115 120 125 Lys Phe Pro Ser Trp Ser Val Asn Asp Asn Leu Lys Gly Gly Ile Ala 130 135 140 Ala Tyr Asn Ala Gly Pro Gly Asn Ile Tyr Ser Tyr Ser Gln Val Asp 145 150 155 160 Gln Tyr Thr Thr Asp Gly Asp Tyr Ser Asn Asp Val Val Ala Arg Ala 165 170 175 Gln Tyr Tyr Lys Thr Gln Gly Tyr 180 <210> 3 <211> 266 <212> PRT <213> Ambystoma mexicanum <400> 3 Phe Arg Tyr Ala Ile Leu Ala Arg Glu Glu Glu Pro Arg Val Arg Arg 1 5 10 15 Ala Ala Leu Val Asp Lys Pro Arg Val Glu Ile Ala Asp Val Leu Ile 20 25 30 Ser Thr Phe Thr Glu Ser Gly Val Ile Glu Val Val Leu Gln Ala Leu 35 40 45 Arg Glu Ile Gly Cys Asn Asp Leu Arg Glu Arg Phe Ala Lys Asp Thr 50 55 60 Ser Glu Gly Ser Pro Thr Ser Ala Ser Lys Tyr Gly Asp Ile Met Lys 65 70 75 80 Val Glu Thr Thr Gly Ala Ser Met Gln Thr Ala Gln Gln Asp Tyr Leu 85 90 95 Asp Phe Ser Gly Ala Arg Ala Ser His Ala Met Ala Glu Thr Asp Leu 100 105 110 Ile Glu Met Asn Asn Tyr Lys Ser Val Ile Lys Asn Ala Ala Gly Lys 115 120 125 Lys Gly Val Asp Pro Ala Leu Ile Ala Ala Met Ile Ser Arg Ser Cys 130 135 140 Arg Ala Gly Lys Thr Leu Ser Gly Gly Trp Gly Cys Trp Asp Glu Lys 145 150 155 160 Arg Gln Lys Tyr Asn Thr Tyr Gly Leu Met Gln Ile Asp Val Asn Pro 165 170 175 Lys Gly Gly Gly His Thr Pro Lys Gly Ser Trp Asp Ser Glu Glu His 180 185 190 Leu Cys Gln Ala Ile Asp Ile Leu Ile Arg Phe Ile Thr Arg Ile Arg 195 200 205 Gln Lys Tyr Pro Gln Trp Ser Lys Glu Glu Gln Leu Lys Gly Gly Ile 210 215 220 Ala Ala Tyr Asn Ala Gly Asp Gly Asn Ile Gly Pro Gly Lys Asp Val 225 230 235 240 Asp Ser Lys Thr Thr Asn Gly Asp Tyr Ala Asn Asp Ile Val Ala Arg 245 250 255 Ala Gln Trp Tyr Lys Ser Asn Gly Gly Phe 260 265 <210> 4 <211> 120 <212> PRT <213> Chlamys islandica <400> 4 Ala His Asn Phe Ala Thr Gly Ile Val Pro Gln Ser Cys Leu Glu Cys 1 5 10 15 Ile Cys Lys Thr Glu Ser Gly Cys Arg Ala Ile Gly Cys Lys Phe Asp 20 25 30 Val Tyr Ser Asp Ser Cys Gly Tyr Phe Gln Leu Lys Gln Ala Tyr Trp 35 40 45 Glu Asp Cys Gly Arg Pro Gly Gly Ser Leu Thr Ser Cys Ala Asp Asp 50 55 60 Ile His Cys Ser Ser Gln Cys Val Gln His Tyr Met Ser Arg Tyr Ile 65 70 75 80 Gly His Thr Ser Cys Ser Arg Thr Cys Glu Ser Tyr Ala Arg Leu His 85 90 95 Asn Gly Gly Pro His Gly Cys Glu His Gly Ser Thr Leu Gly Tyr Trp 100 105 110 Gly His Val Gln Gly His Gly Cys 115 120

Claims (66)

  1. 재조합 식품 보존 효소(rFPE)를 포함하는 섭취가능한 조성물로서, 상기 FPE가 거위형 라이소자임(gFPE)이고; 상기 조성물은 반고체 또는 겔 조성물인 섭취가능한 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 섭취가능한 조성물은 세균 불순물이 없는 것인 섭취가능한 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 gFPE는 서열번호 1에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 섭취가능한 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 gFPE는 서열번호 1에 대해 적어도 97% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 섭취가능한 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 gFPE는 서열번호 2에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 섭취가능한 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 gFPE는 서열번호 2에 대해 적어도 97% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 섭취가능한 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 gFPE는 서열번호 3에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 섭취가능한 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 gFPE는 서열번호 3에 대해 적어도 97% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 섭취가능한 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 gFPE는 서열번호 4에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 섭취가능한 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 gFPE는 서열번호 4에 대해 적어도 97% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 섭취가능한 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 섭취가능한 조성물은 열처리되는 것인 섭취가능한 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 섭취가능한 조성물은 gFPE를 포함하지 않는 거의 동일한 섭취가능한 조성물보다 더 긴 보관 수명을 갖는 것인 섭취가능한 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 섭취가능한 조성물은 gFPE보다는 닭 난백 무라미다제를 포함하는 거의 동일한 섭취가능한 조성물의 보관 수명보다 더 긴 보관 수명을 갖는 것인 섭취가능한 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gFPE는 피치아(Pichia) 세포에서 생산되는 것인 조성물.
  15. 재조합 식품 보존 효소(rFPE)를 포함하는 조성물로서, 상기 rFPE가 약 90,000 Shugar U/mg 초과의 활성을 갖는 것인 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 rFPE는 약 150,000 Shugar U/mg 초과의 활성을 갖는 것인 조성물.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 rFPE는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 세포에서 생산되는 것인 조성물.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 식품 조성물인 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 식품 조성물은 하나 이상의 섭취가능한 성분을 포함하는 것인 조성물.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 식품 조성물은 rFPE를 포함하지 않는 거의 동일한 식품 조성물보다 더 긴 보관 수명을 갖는 것인 조성물.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식품 조성물은 rFPE보다는 닭 난백 무라미다제를 포함하는 거의 동일한 제품의 보관 수명보다 더 긴 보관 수명을 갖는 것인 조성물.
  22. 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 rFPE를 포함하는 분말 조성물인 조성물.
  23. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rFPE는 서열번호 1에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  24. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rFPE는 서열번호 1에 대해 적어도 97% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  25. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rFPE는 서열 2에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  26. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rFPE는 서열번호 2에 대해 적어도 97% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  27. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rFPE는 서열번호 3에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  28. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rFPE는 서열번호 3에 대해 적어도 97% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  29. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rFPE는 서열번호 4에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  30. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rFPE는 서열번호 4에 대해 적어도 97% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  31. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 닭 난백 무라미다제를 포함하는 거의 동일한 조성물과 비교하여 저알레르기유발성인 조성물.
  32. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rFPE는 비-재조합 FPE 및/또는 닭 무라미다제와 비교하여 더 높은 활성을 갖는 것인 조성물.
  33. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rFPE는 약 200,000 Shugar U/mg 초과의 활성을 갖는 것인 조성물.
  34. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rFPE는 약 300,000 Shugar U/mg 초과의 활성을 갖는 것인 조성물.
  35. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rFPE는 약 450,000 Shugar U/mg 초과의 Shugar 단위의 활성을 갖는 것인 조성물.
  36. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 1 Shugar 단위는 엠. 루테우스(M. luteus) 세포 현탁액을 소화시켜 37℃, pH 7.0에서 분당 0.001의 속도로 용액의 흡광도를 감소시킬 수 있는 효소의 양인 조성물.
  37. 재조합 식품 보존 효소(rFPE)를 포함하는 섭취가능한 조성물로서, 상기 FPE가 서열번호 1에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 섭취가능한 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 상기 섭취가능한 조성물은 식품 조성물인 섭취가능한 조성물.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 식품 조성물은 겔-유사 질감을 갖거나 컨시스턴트한(consistently) 것인 섭취가능한 조성물.
  40. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 식품 조성물은 베이킹 제품의 형태인 섭취가능한 조성물.
  41. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식품 조성물은 난백-유사 제품의 형태인 섭취가능한 조성물.
  42. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 식품 조성물은 액체 형태인 섭취가능한 조성물.
  43. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 식품 조성물은 고체 형태인 섭취가능한 조성물.
  44. 제37항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 rFPE보다는 닭 난백 무라미다제를 포함하는 거의 동일한 조성물의 보관 수명보다 길거나 이와 유사한 보관 수명을 갖는 것인 조성물.
  45. 제37항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식품 조성물은 중량 기준으로 적어도 0.05% rFPE를 갖는 것인 섭취가능한 조성물.
  46. 제37항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식품 조성물은 중량 기준으로 최대 10% rFPE를 갖는 것인 섭취가능한 조성물.
  47. 제37항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 섭취가능한 조성물은 성분인 섭취가능한 조성물.
  48. 제37항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식품 조성물은 미생물 또는 세균 세포 파편이 실질적으로 없는 것인 섭취가능한 조성물.
  49. 제37항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식품 조성물은 프로바이오틱 제형인 섭취가능한 조성물.
  50. 제37항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rFPE는 적어도 80% 순수한 것인 섭취가능한 조성물.
  51. 제37항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식품 조성물은 rFPE 이외에도 하나 초과의 재조합 단백질을 포함하는 것인 섭취가능한 조성물.
  52. 제37항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rFPE는 식품에 겔 고형성 또는 증가된 점도를 제공하는 것인 섭취가능한 조성물.
  53. 제37항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 식품은 rFPE 외에 겔화제를 포함하지 않는 것인 섭취가능한 조성물.
  54. 제37항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rFPE는 피치아 파스토리스 세포에서 재조합으로 생산되는 것인 섭취가능한 조성물.
  55. a. 재조합으로 생산된 단리된 식품 보존 효소(FPE)를 제공하는 단계로서, 상기 FPE는 거위형 FPE(gFPE)인 단계;
    b. 재조합으로 생산된 FPE를 하나 이상의 섭취가능한 성분과 조합하는 단계
    를 포함하는, 섭취가능한 조성물의 제조 방법.
  56. 제55항에 있어서, 재조합으로 생산된 gFPE는 서열번호 1 내지 4 중 하나에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, 재조합으로 생산된 gFPE는 효모 세포에서 재조합으로 생산되는 것인 방법.
  58. 제57항에 있어서, 효모 세포는 피치아 파스토리스인 방법.
  59. 제55항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합으로 생산된 gFPE는 재조합으로 생산된 gFPE가 결여되어 있거나 FPE보다는 닭 난백 무라미다제를 포함하는 거의 동일한 섭취가능한 조성물에 비해 상기 섭취가능한 조성물의 보관 수명을 증가시키는 것인 방법.
  60. 제55항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합으로 생산된 gFPE는 섭취가능한 조성물에 겔-유사 질감을 제공하거나 섭취가능한 조성물의 점도를 증가시키는 것인 방법.
  61. 제55항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 섭취가능한 조성물은 인간/동물에 의해 섭취되도록 준비가 된 식품인 방법.
  62. a. 엑스. 캄페스트리스(X. campestris) 세포를 발효 배지에 제공하는 단계;
    b. 상기 세포를 45 내지 60℃의 온도에서 8 내지 10의 pH 및 알칼리성 프로테아제로 열처리하여 세포 파편을 포함하는 용액을 제조하는 단계;
    c. 세포 파편을 포함하는 용액에 재조합으로 생산된 식품 보존 효소(FPE) 및/또는 서열번호 1에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 재조합으로 생산된 FPE를 첨가하여 잔탄 검 용액을 제조하는 단계;
    d. 잔탄 검 용액에 알코올을 첨가하여 잔탄 검을 침전시키는 단계; 및
    e. 침전된 잔탄 검을 단리 및 건조시켜 단리된 잔탄 검 제품을 수득하는 단계
    를 포함하는, 단리된 잔탄 검 제품의 제조 방법.
  63. 제62항에 있어서, 첨가된 FPE의 양은, 그 외에는 동일한 조건 하에 잔탄 검 제품의 동등한 양을 제조하는 데 필요한 닭 난백 FPE의 양보다 적은 것인 방법.
  64. 제62항 또는 제63항에 있어서, 세포 파편을 포함하는 용액을 제조한 후 조성물의 pH를 조정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  65. 제62항 내지 제64항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 잔탄 검 제품을 하나 이상의 추가 성분과 조합하여 섭취가능한 조성물을 형성하는 단계를 포함하는, 섭취가능한 조성물의 제조 방법.
  66. 서열번호 1에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 재조합으로 생산된 식품 보존 효소(FPE)를 포함하는 식품 보존제.
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