CN103275191B

CN103275191B - 一种大量快速提取鲎素肽的方法

Info

Publication number: CN103275191B
Application number: CN201310244598.4A
Authority: CN
Inventors: 韩钊; 辛鹤林; 苑庆华; 吴梦楠; 梁玲玲; 李萌; 李彦彩
Original assignee: TIANJIN LANRUI BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Beihai Xinglong biological product Co., Ltd.
Priority date: 2013-06-19
Filing date: 2013-06-19
Publication date: 2014-12-10
Anticipated expiration: 2033-06-19
Also published as: CN103275191A

Abstract

本发明涉及一种大量快速提取鲎素肽的方法，该方法步骤包括：⑴收集鲎血细胞备用，将鲎血细胞悬浮于Tris-HCl,NaCl缓冲液匀浆，离心弃上清液，沉淀用同一缓冲液洗两次；⑵沉淀以固液1：6.5～8的比例加入酸液匀浆，离心收集上清液，其沉淀用酸液重抽提三次，得酸抽提液；⑶将酸抽提液用NaOH调节pH至6.5，离心去除沉淀；再用0.1－0.22μm的膜进行过滤，得上清液；⑷将上清液沸水浴处理，离心弃沉淀收集上清液；再用0.1－0.22μm的膜进行过滤，得上清液；⑸截留分子量为10kD超滤膜处理；⑹截留分子量为3kD超滤膜处理；⑺脱盐处理；⑻冷冻干燥制备成干粉。本方法鲎素肽得率及纯度高，工艺简化，时间大幅缩短，大大降低成本，处理量大幅提升。

Description

一种大量快速提取鲎素肽的方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及鲎素肽，尤其是一种大量快速提取鲎素肽的方法。

背景技术

鲎也称马蹄蟹，属肢口纲(Merostomata)剑尾目(Xiphosura)的海洋节肢动物，共4种，具有很高的药用价值，分布于我国鲎的种类主要为东方鲎。鲎血细胞提取物"鲎试剂"，可以准确、快速地检测人体内部组织是否感染细菌；在制药和食品工业中，可用它对毒素污染进行监测。鲎的肉、卵均可食用，其壳、尾、卵、肉和血均可入药。

鲎素肽来源于鲎血细胞提取物，是含有17个氨基酸残基的多肽，氨基酸序列：NH₂-K-W-C-F-R-V-C-Y-R-G-I-C-Y-R-R-C-R-CONH₂。含两对二硫键：第三位半胱氨酸残基与第十六个半胱氨酸残基，第七位半胱氨酸残基与第十二个半胱氨酸残基各形成一对二硫键。化学性质稳定，耐高温。各种研究资料显示鲎素肽具有强烈抗菌作用，抑制革兰氏阴性菌，革兰氏阳性菌，真菌生长，同时还发现鲎素具有抗肿瘤作用，国内外均有文献报道对白血病细胞，肺癌细胞，肝癌细胞，胃癌细胞具有抑制作用，毒副作用低。

目前鲎素肽的获得方法主要有三种：第一种是从天然鲎细胞裂解液中提取纯化获得，是将鲎细胞裂解粗体液经过凝胶层析和离子交换层析纯化的方法；第二化学合成的方法获得，是基于已报道的鲎素肽的氨基酸序列及分子结构运用合成化学仿制鲎素肽结构的方法；第三利用遗传工程获得鲎素肽，将鲎素肽基因克隆并整合到特定载体上，转入宿主细胞中进行表达，提取纯化后获得的方法。三种方法中以遗传工程方法最为先进，不需要对鲎取血，一劳永逸，但该方法要求技术难度大，步骤繁琐，所涉及的试剂和设备价格昂贵，并且构建的克隆在表达过程中易被宿主额外修饰，目的蛋白活性也不尽理想。化学合成方法合成鲎素肽价格昂贵。而目前报道的从天然鲎血细胞中获得鲎素肽的方法，存在处理量小、操作周期长、不能连续操作，因此主要用于实验室，不易进行规模化生产的缺点。虽然考虑到可以从提取鲎试剂的废料中应用该法使其变废为宝，但因其缺点明显也仅停留在少量提取和研究中使用。

鲎试剂生产的废料中鲎素肽的含量要比未经萃取的鲎细胞裂解产物含量低，现有技术对未经萃取的鲎细胞裂解产物提取鲎素肽的方法由于缺点明显也仅仅停留在小量制取和实验室研究使用，而对鲎试剂生产的废料中鲎素肽的再利用也起不到广泛的推广。

通过检索，发现如下两篇与本专利申请相关的公开专利文献：1、涉及一种含肽物质在医用配制品中的用途，尤其是鲎素肽在制备抗肝癌药物中的用途（CN1311034A）。鲎素肽可作为有效活性组份用于制备抗肝癌药物。根据经鲎素肽处理的人肝癌SMMC-7721细胞的生长曲线测定、分裂指数观察、软琼脂培养细胞集落形成观察；鲎素肽对碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶、ATP酶、C-erB-2p⁵³基因表达的影响，对细胞形态和超微结构的影响，以及对荷瘤裸鼠实体瘤的抑制作用的研究表明，对肝癌细胞有显著的诱导分化的抗肿瘤作用。作为有效活性组份用于制备抗肝癌药物的T-1可由鲎血细胞中分离提取，其方法如：1)鲎血细胞的分离提取：采鲎血，收集鲎血细胞备用。2)鲎血细胞酸抽提液制备：将鲎血细胞悬浮于缓冲液匀浆，然后离心弃上清液，所收集的沉淀用同一缓冲液洗两次。洗涤后的沉淀悬浮于HCl中匀浆。匀浆液再离心，收集上清液。沉淀用HCl重抽提，同样收集上清液，最后弃去沉淀。3次收集的上清液即为所需的鲎血细胞酸抽提液。低温保存备用。3)T-1的分离：将所得的鲎血细胞酸抽提液经凝胶过滤，用HCl溶液洗脱，再用核酸蛋白检测仪收集在280nm处记录图形。收集第III个峰，即为T-1。4)T-1的纯化：选用阳离子交换剂对T-1作进一步纯化。用缓冲液洗脱。核酸蛋白检测仪收集并在280nm处记录。收集最后一个峰则为纯化的T-1。将收集的T-1冷冻干燥，所得干粉低温保存备用。2、本发明属于一种鲎素肽在制备抗血栓药物和保健品的应用及其制备方法（CN102188691A）。鲎素肽在制备抗血小板聚集、抗血栓药物和保健品中的应用，或作为抗血小板聚集、抗血栓药物和保健品组分，或利用鲎素肽作为抗血小板聚集、抗血栓药物前体改造。这种鲎素肽用鲎血细胞或鲎试剂生产废料制备，能够显著地抑制血小板聚集，防止血栓形成，具有很好的抗血小板聚集，延长出血时间(BT)和凝血时间(CT)的作用。一种鲎素肽的制备方法，其工艺步骤如下:(1)从鲎血细胞的裂解产物或鲎试剂生产的废料中用20mmol/L HCl溶液匀浆制备成粗制液;(2)将步骤(1)所得粗制液用8000转/分钟离心15分钟，收集上清液，将上清液用三层纱布过滤，用葡聚糖G-50分离，20mmol/L HCl溶液洗脱，流速1.0mL/分钟，洗脱峰有三组，收集第三组洗脱产物，调节溶液至pH6.0～7.0，10000转/分钟离心15分钟，上清液冷冻干燥备用；经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳证实是单一电泳条带，分子量约在2KDa。5.根据权利要求4所述鲎素肽的制备方法，其特征在于：所述葡聚糖G-50的层析柱长90厘米，直径1.5厘米。

通过比对，上述公开专利文献的技术方案与本专利申请有本质的不同，上述两篇专利文献纯化步骤中都经过葡聚糖G-50分离，流速1.0mL/分钟，层析柱长90厘米，直径1.5厘米，在1100分钟接收完第三组洗脱产物。凝胶层析的上样量是柱床体积的1～5%，通过计算该方法的一次上样量为1.59ml～7.85ml，收集洗脱峰需要1100分钟（18.3h），并且不能连续操作，在不进行第二步离子交换层析的情况下，耗时长、处理量小的缺点已经很明显。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种从鲎血细胞的裂解产物或鲎试剂生产的废料中大量快速提取鲎素肽的方法，本发明的方法可以明显提高样品处理量，加快鲎素肽的提取速度，使鲎试剂生产的废料真正变废为宝易于推广、并且对比现有方法提取成本低，为满足医药、保健品行业及动植物养殖业的广泛应用提供了可能。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种大量快速提取鲎素肽的方法，该方法的步骤如下：

⑴原料处理:

a，收集鲎血细胞备用；

b，将鲎血细胞悬浮于Tris-HCl,NaCl缓冲液匀浆；

c，然后8000r/min下离心30min，弃上清液，所收集的沉淀用同一缓冲液洗两次；

⑵酸解：

a，洗涤后的沉淀以固液比例1：6.5～8的比例加入酸液匀浆；

b，匀浆液在8000r/min，离心30min，收集上清液；

c，其沉淀用酸液重抽提，同样收集上清液，最后弃去沉淀，三次收集的上清液即为所需的鲎血细胞酸抽提液；

⑶调pH值去沉淀：

a，将鲎血细胞酸抽提液用NaOH调节pH至6.5，离心去除沉淀；

b，再用0.1－0.22μm的膜进行过滤，得上清液；

⑷热变性处理：

a，将上步所得上清液沸水浴处理5～10min，8000r/min离心20min弃沉淀收集上清液；

b，再用0.1－0.22μm的膜进行过滤，得上清液；

⑸截留分子量为10kD超滤膜处理；

⑹截留分子量为3kD超滤膜处理；

⑺脱盐处理；

⑻冷冻干燥制备成干粉低温保存。

而且，所述步骤⑴中的Tris-HCl为20m mol/L，所述NaCl为pH8.8含50m mol/L NaCl。

而且，所述步骤⑵中的酸液为20m mol/L HCl。

而且，所述步骤⑵中的离心温度为4℃。

而且，所述步骤⑸及步骤⑹的超滤膜处理可具体运用超滤管、超滤杯或切向流超滤系统设备来完成。

而且，所述步骤⑺脱盐处理可具体通过截留分子量500D透析袋或超滤膜来完成。

本发明的优点和效果是：

1、本方法鲎素肽得率及纯度高，与现有提取方法相比，工艺简化，时间大幅缩短，处理量大幅提升。

2、本方法对于处理量和处理速度的提升，使得鲎试剂生产的废料真正变废为宝，而且所用设备和试剂较现有方法大大降低成本，而鲎素肽得率不降低，从而大大降低了提取成本。

3、本方法提取的鲎素肽纯度高，蛋白电泳为单一条带，且具有明显的抑菌效果，为满足医药、保健品行业及动植物养殖业的广泛应用提供了可能。

附图说明

图1为营养琼脂培养皿菌落生长图，其中，(a)为阳性对照组，(b)为加入鲎素肽组，(c)为阴性对照组；

图2为鲎素肽的Tricine-SDS-PAGE电泳图，其中，(a)分子量范围是1.5～45kD的分子量标准物，(b)纯化后的鲎素肽组分。

具体实施方式

下面结合具体实施方案对本发明进一步说明，其具体实施方案应该理解为仅为举例说明，不是限定性的，不能以下述举例说明来限定本发明的保护范围。

一种大量快速提取鲎素肽的方法，该方法的步骤如下：

⑴原料处理:

a，收集鲎血细胞备用；

b，将鲎血细胞悬浮于Tris-HCl,NaCl缓冲液匀浆；

所述Tris-HCl为20m mol/L，所述NaCl为pH8.8含50m mol/L NaCl；

(2)酸解：

a，洗涤后的沉淀以固液比例1：6.5～8的比例加入酸液匀浆；

b，匀浆液在8000r/min，4℃下离心30min，收集上清液；

c，其沉淀用酸液重抽提，同样收集上清液，最后弃去沉淀，三次收集的上清液即为所需的鲎血细胞酸抽提液，置-20℃低温保存备用;

所述酸液为20m mol/L HCl，

(3)调pH值去沉淀：

a，将鲎血细胞酸抽提液用NaOH调节pH至6.5，离心去除沉淀；

b，再用0.1－0.22μm的膜进行过滤，的上清液；

(4)热变性处理：

b，再用0.1－0.22μm的膜进行过滤，的上清液；

(5)截留分子量为10kD超滤膜处理；

所述超滤膜处理可具体运用超滤管、超滤杯或切向流超滤系统设备来完成。

(6)截留分子量为3kD超滤膜处理；

(7)脱盐处理：

此步骤可具体通过截留分子量500D透析袋或超滤膜来完成。

(8)冷冻干燥制备成干粉低温保存。

实施例1

鲎血细胞的裂解产物用切向流超滤系统制备鲎素肽工艺步骤如下：

(1)原料处理：无菌无热源器材抽取新鲜鲎血约1000mL，1500转/分钟离心5分钟，收集鲎血细胞，称量100g鲎血细胞（湿重），将鲎血细胞悬浮于200mL，20mmol/L Tris-HCl,PH8.8含50mmol/L NaCl缓冲液进行匀浆，然后8000r/min下离心20min，弃上清液，所收集的沉淀用同一缓冲液洗两次；

(2)酸解：洗涤后沉淀悬浮于700mL，20mmol/L HCl中匀浆，匀浆液在8000r/min，4℃离心20min，收集上清液，其沉淀用相同方法重抽提，同样收集上清液，最后弃去沉淀，3次收集的上清液约1200ml即为所需的鲎血细胞酸抽提液；

(3)调pH值去沉淀：用NaOH调节PH至6.5，离心去除沉淀，用0.22μm的膜进行过滤；

(4)热变性处理：沸水浴处理10min，8000r/min离心20min弃沉淀收集上清液，用0.22μm的膜进行过滤，所剩滤液体积约为1000ml；

(5)10kD膜包的切向流超滤系统处理：首先用过0.22μm滤膜的0.5M NaOH溶液将超滤系统进行灭菌处理，随后用超纯水清洗超滤系统直至出样口pH为7.0即可，将进样管和回流管放入装有上步获得滤液的容器中，出样管放入经无菌处理的容器中，开启蠕动泵，缓慢加快速度，使膜前压和膜后压之和小于0.1pa，稳定流速直至将溶液全部过完为止，随后对膜包进行冲洗，1000ml样品超滤1h便能完成，收集出样口的溶液约900ml进行下一步操作；

(6)3kD膜包的切向流超滤系统处理：超滤系统的灭菌和清洗方法同上步，将进样管和回流管放入装有上步获得滤液的容器中，出样管放入经无菌处理的容器中，开启蠕动泵，缓慢加快速度，使膜前压和膜后压之和小于0.1pa，稳定流速直至将溶液全部过完为止，随后对膜包进行冲洗，900ml样品超滤1.5h便能完成，收集出样口的溶液约800ml进行下一步操作；

(7)脱盐处理：将上步获得溶液装入处理好的截留分子量500D透析袋中进行透析，透析过程在4℃下配有磁力搅拌条件下进行，每隔1h更换一次透析液，透析液为超纯水，透析1天即可；

(8)冷冻干燥制备成干粉低温保存。

鲎素肽抑菌活性验证

(1)阳性样品制备：采取的自然环境中的土壤，以土壤重量(g)：灭菌生理盐水体积(ml)=1：9的比例将两者混合并匀浆，随后进行2次10倍稀释，即总稀释倍数为1000倍作为工作浓度的阳性样本。

(2)鲎素肽样品制备：用生理盐水溶解鲎素肽干粉，使其浓度达到20μg/ml。

(3)操作方法：取阳性样品100μl与100μl生理盐水混匀，取100μl涂布于营养琼脂固体培养基上，做平行对照；取阳性样品100μl与20μg/ml的鲎素肽样品100μl（鲎素肽终浓度为10μg/ml）混匀，取100μl涂布于营养琼脂固体培养基上，做平行对照；取100μl的生理盐水涂布于营养琼脂固体培养基上，做平行对照；37℃培养48h后进行菌落技术。

(4)结果：阳性对照组：110CFU/皿，加入鲎素肽组：1CFU/皿，阴性对照组：0CFU/皿。10μg/ml的鲎素肽抑制率为99%。通过观察阳性对照组可以发现8种不同的菌落，从而更验证了鲎素肽抗菌的广谱性。

如图1所示，根据阳性样品对比，加入鲎素肽后菌落总数测定验证其抑菌活性，10μg/ml的鲎素肽抑制率为99%。

鲎素肽分子量的验证

普通的十二炕基硫酸纳—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)无法看清10KD以下的蛋白条带，因此选用Tricine-SDS-PAGE蛋白电泳的方法，分离胶（16%/6M urea）上叠加间隙胶（10%）和浓缩胶（4%）的配置，跑出的条带清晰可见，并证实为单一条带，根据蛋白迁移率计算样品分子量为2.3kDa。

如图2所示，通过蛋白电泳验证其分子量为2.3KD且为单一条带；

效率对比

采用本发明的纯化方法，300ml鲎血可获得55mg的鲎素肽，略高于现有技术方法300ml鲎血获得50mg的鲎素肽。

实施例2

鲎试剂生产剩余废料用超滤管制备鲎素肽工艺步骤如下：

(1)原料处理：收集鲎试剂生产过程产生的细胞裂解团块并称取10g(湿重)，将鲎血细胞悬浮于50mL20mmol/L Tris-HCl,pH8.8含50mmol/L NaCl缓冲液进行匀浆，然后8000r/min下离心20min，弃上清液，所收集的沉淀用同一缓冲液洗两次；

(2)酸解：洗涤后沉淀悬浮于70mL，20mmol/L HCl中匀浆，匀浆液在8000r/min，4℃离心20min，收集上清液，其沉淀用相同方法重抽提，同样收集上清液，最后弃去沉淀，3次收集的上清液约120ml即为所需的鲎血细胞酸抽提液；

(4)热变性处理：沸水浴处理10min，8000r/min离心20min弃沉淀收集上清液，用0.22μm的膜进行过滤，所剩滤液体积约为100ml；

(5)10kD超滤管（处理量15ml）处理：取10个处理量为15ml的10kD超滤管，将15ml超纯水加入10kD超滤管的上管中，放入离心机转子（可同时放入10超滤管）中6000r/min离心20min，弃上管和下管中的超纯水，再重复此步骤2次对超滤管进行清洗，将100ml样品平均装入10个超滤管的上管中，6000r/min离心30min，收集超滤管下管的溶液约90ml进行下一步操作，超滤后对超滤管进行清洗并在上管中加入20%乙醇溶液4℃保存，超滤管可重复使用；

(6)3kD超滤管（处理量15ml）处理：取10个处理量为15ml的3kD超滤管，将15ml超纯水加入3kD超滤管的上管中，放入离心机转子（可同时放入10超滤管）中6000r/min离心20min，弃上管和下管中的超纯水，再重复此步骤2次对超滤管进行清洗，将100ml样品平均装入10个超滤管的上管中，6000r/min离心40min，收集超滤管下管的溶液约80ml进行下一步操作，超滤后对超滤管进行清洗并在上管中加入20%乙醇溶液4℃保存，超滤管可重复使用；

(8)冷冻干燥制备成干粉低温保存。

如图1所示，根据阳性样品对比，加入鲎素肽后菌落总数测定验证其抑菌活性，10μg/ml的鲎素肽抑制率为99%，如图2所示，通过蛋白电泳验证其分子量为2.3KD且为单一条带；

Claims

1.一种大量快速提取鲎素肽的方法，其特征在于：该方法的步骤如下：

⑴原料处理:

a，收集鲎血细胞备用；

b，将鲎血细胞悬浮于Tris-HCl,NaCl缓冲液匀浆；其中，Tris-HCl为20mmol/L，NaCl为pH8.8含50mmol/L NaCl；

⑵酸解：

a，洗涤后的沉淀以固液比例1：6.5～8的比例加入酸液匀浆；所述酸液为20mmol/L HCl；

b，匀浆液在8000r/min，离心30min，收集上清液；

⑶调pH值去沉淀：

a，将鲎血细胞酸抽提液用NaOH调节pH至6.5，离心去除沉淀；

b，再用0.1－0.22μm的膜进行过滤，得上清液；

⑷热变性处理：

b，再用0.1－0.22μm的膜进行过滤，得上清液；

⑸截留分子量为10kD超滤膜处理；

⑹截留分子量为3kD超滤膜处理；

⑺脱盐处理；

⑻冷冻干燥制备成干粉低温保存。

2.根据权利要求1所述的大量快速提取鲎素肽的方法，其特征在于：所述步骤⑵中的离心温度为4℃。

3.根据权利要求1所述的大量快速提取鲎素肽的方法，其特征在于：所述步骤⑸及步骤⑹的超滤膜处理具体运用超滤管、超滤杯或切向流超滤系统设备来完成。

4.根据权利要求1所述的大量快速提取鲎素肽的方法，其特征在于：所述步骤⑺脱盐处理具体通过截留分子量500D透析袋或超滤膜来完成。