CN106317203A - 高纯度鲎素提存方法 - Google Patents

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高德友
邓晓龙
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Stone Lion Starfish Food Co Ltd
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids

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Abstract

本发明涉及提取纯化海洋生物活性成分技术领域，具体的涉及一种高纯度鲎素提存方法。本发明提供的高纯度鲎素提存方法，通过鲎血采集、细胞破碎、收集沉淀、收集上清液、透析、干燥、初次纯化、二次纯化等工艺对鲎素进行提纯，此高纯度鲎素提取方法工艺简单，无需复杂的设备即可实现高纯度的鲎素提取，所提取的鲎素纯度高达95％以上，充分利用了海洋的宝贵资源，所提取的鲎素可用于生物、医疗、健康、科研等方面，具有积极的经济和社会意义。

Description

高纯度鲎素提存方法
技术领域
本发明涉及提取纯化海洋生物活性成分技术领域，具体的涉及一种高纯度鲎素提存方法。
背景技术
鲎是一种古老的生物，从4亿多年前问世至今仍保留其原始的面貌，因为鲎血细胞的携氧蛋白为带铜离子的血蓝素，所以鲎血呈蓝色。近年来研究发现，鲎血细胞提取物具有抗癌及阻止肿瘤恶化的功能，因此对鲎的研究受到越来越多的关注。
鲎素是一个分子量约为2.36ku的抗菌肽，亦可称为鲎肽或鲎肽素，是从鲎血细胞中分离出的一种具有抗肿瘤和抑制微生物增殖的活性多肽。鲎素中的氨基酸多为阳离子氨基酸，带有较多的正电荷，但其两性化合物及双硫键的特性让鲎素容易靠近细胞膜，鲎素可以抑制肿瘤细胞的生成与生长，最新研究发现鲎素具有抗癌、阻止肿瘤恶化等功能，特别是鲎素在攻击癌细胞后并不会造成其他的副作用，因此鲎素的开发对于未来癌症治疗具有相当重要的作用，而高纯度鲎素的提取是研究鲎素的基础，也是最为重要的工作。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种高纯度鲎素提存方法。
为实现上述目的，高纯度鲎素提存方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，采用心房取血方式对活体鲎进行鲎血采集，同时加入抗凝血剂；
步骤2，将步骤1取得的鲎血与20mmol/L Tris-HCl、pH8.0、含50mmol/L的NaCl缓冲液混合后进行超声波破碎，低温高速离心，收集沉淀；
步骤3，沉淀与含20mmol/L的HCl缓冲液混合均质，将均质液低温高速离心，收集上清液；
步骤4，用截留分子量大于等于1000ku透析袋透析上清液后冷冻干燥，即得鲎素粗品；
步骤5，将步骤4获得的鲎素粗品配置成母液，上样于平衡过的Sephadex G-50层析柱，洗脱、收集以核酸蛋白仪于280nm处记录图形，收集最后一个峰形较好的峰，透析后冷冻干燥；
步骤6，二次纯化，将初次纯化后的产品配置成母液，上样于平衡过的CM-Sepharose CL-6B层析柱，洗脱、收集以核酸蛋白仪于280nm处记录图形，收集最后一个峰形较好的峰，透析后冷冻干燥。
进一步的，步骤1中取血量为活体鲎血量的约1/3。
进一步的，步骤2中鲎血与缓冲液的比例为1:5。
进一步的，步骤2重复两次操作后，将两次收集的沉淀合并。
进一步的，步骤3中沉淀与20mmol/L的HCl缓冲液的比例为1:5。
进一步的，步骤3重复两次操作后，合并上清液。
进一步的，步骤2、步骤3中高速离心的速率为9000r/min、温度为4℃、离心时间20-25min。
进一步的，步骤5中，采用20mmol/L的HCl溶液对Sephadex G-50层析柱洗脱。
进一步的，步骤6中，采用20mmol/L的NaAc(pH6.0)的溶液对CM-Sepharose CL-6B层析柱洗脱。
进一步的，洗脱是溶液流速为1mL/min。
由上述对本发明的描述可知，本发明提供的高纯度鲎素提存方法，通过鲎血采集、收集沉淀、收集上清液、透析干燥、初次纯化、二次纯化等工艺对鲎素进行提纯，高纯度鲎素提取方法工艺简单，无需复杂的设备即可实现高纯度的鲎素提取，所提取的鲎素纯度高达95％以上，充分利用了海洋的宝贵资源，所提取的鲎素可用于生物、医疗、健康、科研等方面，具有积极的经济和社会意义。
具体实施方式
以下通过具体实施方式对本发明作进一步的描述。
为实现上述目的，高纯度鲎素提存方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，采用心房取血方式对活体鲎进行鲎血采集，取血量为活体鲎血量的约1/3，同时加入抗凝血剂；
步骤2，将步骤1取得的鲎血以料液比1:5，与20mmol/L Tris-HCl、pH8.0、含50mmol/L的NaCl缓冲液混合后进行超声波破碎，低温高速离心收集沉淀，离心的速率为9000r/min、温度为4℃、离心时间20-25min，重复两次操作后，将两次收集的沉淀合并；
步骤3，沉淀以料液比1:5，与含20mmol/L的HCl缓冲液混合均质，将均质液低温高速离心收集上清液，离心的速率为9000r/min、温度为4℃、离心时间20-25min，重复两次操作后，合并上清液；
步骤4，用截留分子量大于等于1000ku透析袋透析上清液后冷冻干燥，即得鲎素粗品；
步骤5，将步骤4获得的鲎素粗品配置成5mg/mL母液，上样于平衡过的Sephadex G-50层析柱，采用20mmol/L的HCl溶液对Sephadex G-50层析柱洗脱、溶液流速为1mL/min,每5mg/mL收集成一管，收集以核酸蛋白仪于280nm处记录图形，收集最后一个峰形较好的峰，透析后冷冻干燥；
步骤6，二次纯化，将初次纯化后的产品配置成母液，上样于平衡过的CM-Sepharose CL-6B层析柱，采用20mmol/L的NaAc(pH6.0)的溶液对CM-Sepharose CL-6B层析柱洗脱、溶液流速为1mL/min,每5mg/mL收集成一管，收集以核酸蛋白仪于280nm处记录图形，收集最后一个峰形较好的峰，透析后冷冻干燥，获得高纯度鲎素产品，所提取的鲎素纯度高达95％以上。
上述仅为本发明的一个具体实施方式，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。

Claims (10)

1.高纯度鲎素提存方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，采用心房取血方式对活体鲎进行鲎血采集，同时加入抗凝血剂；
步骤2，将步骤1取得的鲎血与20mmol/L Tris-HCl、pH8.0、含50mmol/L的NaCl缓冲液混合后进行超声波破碎，低温高速离心，收集沉淀；
步骤3，沉淀与含20mmol/L的HCl缓冲液混合均质，将均质液低温高速离心，收集上清液；
步骤4，用截留分子量大于等于1000ku透析袋透析上清液后冷冻干燥，即得鲎素粗品；
步骤5，将步骤4获得的鲎素粗品配置成母液，上样于平衡过的SephadexG-50层析柱，洗脱、收集以核酸蛋白仪于280nm处记录图形，收集最后一个峰形较好的峰，透析后冷冻干燥；
步骤6，二次纯化，将初次纯化后的产品配置成母液，上样于平衡过的CM-SepharoseCL-6B层析柱，洗脱、收集以核酸蛋白仪于280nm处记录图形，收集最后一个峰形较好的峰，透析后冷冻干燥。
2.根据权利要求1所述的高纯度鲎素提存方法，其特征在于：所述步骤1中取血量为活体鲎血量的约1/3。
3.根据权利要求1所述的高纯度鲎素提存方法，其特征在于：所述步骤2中鲎血与缓冲液的比例为1:5。
4.根据权利要求1或3所述的高纯度鲎素提存方法，其特征在于：所述步骤2重复两次操作后，将两次收集的沉淀合并。
5.根据权利要求1所述的高纯度鲎素提存方法，其特征在于：所述步骤3中沉淀与20mmol/L的HCl缓冲液的比例为1:5。
6.根据权利要求1或5所述的高纯度鲎素提存方法，其特征在于：所述步骤3重复两次操作后，合并上清液。
7.根据权利要求1所述的高纯度鲎素提存方法，其特征在于：所述步骤2、步骤3中高速离心的速率为9000r/min、温度为4℃、离心时间20-25min。
8.根据权利要求1所述的高纯度鲎素提存方法，其特征在于：所述步骤5中，采用20mmol/L的HCl溶液对Sephadex G-50层析柱洗脱。
9.根据权利要求1所述的高纯度鲎素提存方法，其特征在于：所述步骤6中，采用20mmol/L的NaAc(pH6.0)的溶液对CM-Sepharose CL-6B层析柱洗脱。
10.根据权利要求8、9所述的高纯度鲎素提存方法，其特征在于：所述洗脱流速为1mL/min。
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CN106974876A (zh) * 2017-03-14 2017-07-25 天津喜诺生物医药有限公司 一种由鲎细胞裂解液制备眼部护理液的方法
CN110898080A (zh) * 2019-11-01 2020-03-24 广西中医药大学 鲎血浆在促生长发育中的应用

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