CN104630318B - 一种金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法。该方法为：取3～20 g金钱龟肉糜和超纯水混合后搅拌，配制成浓度为10～50%(w/v)的混合溶液，加入胰蛋白酶进行酶解，酶解完毕后灭酶，冷至室温，将酶解液离心，取上清液；依次用截留分子量分别为10 KD、5 KD以及3 KD的超滤膜过滤，从而获得3种酶解液；0‑3K的酶解液进行葡聚糖凝胶Sephadex G‑15柱层析，水洗脱，在一定的检测波长下收集得到4个多肽组分，即金钱龟抗肿瘤多肽。本发明得到的金钱龟多肽有利于抗肿瘤药物和保健食品的开发利用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法。
背景技术
金钱龟（Cuora Trifasciata）又名三线闭壳龟，具有极高的药用价值。古代东汉时期《神农本草经》、战国时期《山海经》都有龟类食用药用的记载；金钱龟对解毒、消炎、益肝、补肾效果明显,常被用作保健养颜、防治肿瘤和长寿健体的主药之一。金钱龟所含的活性因子较高，对于治疗血小板减少，细胞败死有一定的效果，并且可以抑制癌细胞的生长，促进人体中的血液循环。
生物活性肽（biologically active peptides, BAP）是一种具有特殊生理功能的小分子活性物质，如抗肿瘤、抗菌、抗高血压、抗病毒以及提高免疫力等，这些物质广泛存在于动物、植物以及微生物中。不同的生物活性肽其结构有很大的差异，既有简单的二肽又有复杂结构的环肽和线肽，它们在体内非常容易被消化吸收。生物活性肽主要有4种来源，分别为蛋白酶解多肽、微生物发酵代谢多肽、天然活性多肽以及化学合成多肽。其中酶解法不仅产量大、成本低、反应过程不会产生有害物质而且此方法所得到的抗肿瘤多肽活性比较强，安全性相对比较高，所以成为了目前主要的活性肽合成方法。
由于近几年来恶性肿瘤发病率的不断提高，而传统的化疗药物不仅毒副作用大而且治疗效果并不理想，因此，生物活性肽凭借其活性高、副作用小、针对性强的优势得到了国内外科研工作者的研究和关注。
发明内容
本发明提供一种金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法，以拓展金钱龟在食品和生物医学领域的应用。
为实现本发明的目的，采用如下技术方案：
一种金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法，包括如下步骤：
（1）取3～20 g金钱龟肉糜和超纯水混合后搅拌，配制成浓度为10～50% (w/v)的混合溶液，加入胰蛋白酶进行酶解，水解过程中使用0.05～0.2 mol/L的NaOH或HCl来调节反应体系的pH值，控制pH值在pH±0.05之间，酶解完毕后灭酶，冷至室温，将酶解液离心，取上清液；
（2）取步骤（1）得到的酶解液，依次用截留分子量分别为10 KD、5 KD以及3 KD的超滤膜过滤，从而获得分子量大小范围为0-3 KD、3-5 KD和大于10 KD的金钱龟多肽的酶解液；
（3）取步骤（2）得到的0-3K的酶解液进行葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱层析，水洗脱，按照出峰的时间顺序，分别收集得到4个多肽组份分别命名为E1、E2、E3和E4，即金钱龟抗肿瘤多肽。
上述方法中，步骤（1）中，所述胰蛋白酶水解条件是：pH=7～9，酶解温度30～60℃，酶解时间4～15 h，酶与底物浓度比为0.1%～0.5%（w/w）。
上述方法中，步骤（1）所述灭酶为在80～100℃水中灭酶10～20 min。
上述方法中，步骤（1）所述离心为在6000～10000 r/min下离心30～60 min。
上述方法中，步骤（2）所述的超滤在CO2的压力为0.1～0.25 Mpa的室温下用超滤杯结合超滤膜超滤。
上述方法中，步骤（3）所述的葡聚糖凝胶Sephadex G-15分离纯化，具体条件为：柱体积为100～200 mL，上样量为1～4 mL，上样浓度为20～150 mg/mL，流动相为水，流速为0.3 mL/min，每4 min收集一管，总共收集110管，检测波长为218 nm。
上述方法中，步骤（3）所述金钱龟抗肿瘤多肽组份中E1和E2经 MALDI-TOF-TOF质谱分析鉴定得到其中三条肽序列为PGVKGPR、SSPGPPVH和KLGPKGPR。
与现有的技术相比，本发明具有如下的技术优点和效果：
本发明得到的金钱龟4个多肽组份对乳腺癌细胞（MCF-7）和肝癌细胞（HepG-2）均具有抑制作用。其中，E1对肝癌细胞HepG-2的半抑制浓度IC50为：77.29 µg/mL。E2对MCF-7和HepG-2半抑制浓度IC50分别为：214.17µg/mL和237.64µg/mL。MALDI-TOF-TOF-MS二级质谱分析得出E1和E2所含多肽的其中三条序列为PGVKGPR、SSPGPPVH和KLGPKGPR。当这三条多肽浓度为500 μg/ml时，对HepG-2抑制率分别为39.45%、57.97%和61.98%；，对MCF-7抑制率分别为56.52%、70.02%和39.82%。因而本发明得到的金钱龟多肽有利于抗肿瘤药物和保健食品的开发利用。
附图说明
图1为实施例1中0-3 K酶解液组份的葡聚糖凝胶SephadexG-15柱层析洗脱曲线。
图2为实施例1中所制备的4个多肽组份浓度均为500 µg/mL时对乳腺癌细胞（MCF-7）和肝癌细胞（HepG-2）抑制效果。
图3为实施例1所制备的金钱龟多肽中荷质比m/z = 709.829的二级质谱图。
图4为实施例1所制备的金钱龟多肽中荷质比m/z = 777.394的二级质谱图。
图5为实施例1所制备的金钱龟多肽中荷质比m/z = 852.541的二级质谱图。
具体实施方式
以下结合实例和附图对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护范围不限于此。
实施例1
（1）取5 g金钱龟肉糜和超纯水混合后搅拌，配制成浓度为10% (w/v)的混合溶液，加入胰蛋白酶酶解，其水解条件是：PH=7，酶解温度35℃，酶解时间5 h，酶与底物浓度比为0.2%（w/w）。该过程中使用0.05 mol/L的NaOH和HCl来调节反应体系的pH值，控制pH值在pH±0.05之间，酶解完毕后在80℃水中灭酶10 min，冷至室温，将酶解液在7000 r/min下离心30 min，取上清液。
（2）取步骤（1）得到的酶解液，依次用截留分子量分别为10 KD、5 KD以及3 KD的超滤膜过滤（CO2的压力为0.1 Mpa的室温下），从而获得分子量大小范围为0-3 KD、3-5 KD和大于10 KD的金钱龟多肽的酶解液。
（3）取步骤（2）得到的0-3K的酶解液进行葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱层析，柱体积为200 mL，上样量为1 mL，上样浓度为50 mg/mL，流动相为水，流速为0.3 mL/min，每4min收集一管，总共收集110管，检测波长为218 nm，按照出峰的时间顺序，共得到4个多肽组份分别命名为E1、E2、E3、E4（图1）。
通过步骤（1）~（3）得到4种金钱龟多肽组份，用MTT法对这4个组份进行抗肿瘤活性检测，结果表明当这4种组份的浓度分别为500 µg/mL时，对乳腺癌细胞MCF-7和肝癌细胞HepG-2均具有抑制作用（图 2）。其中，E1对肝癌细胞HepG-2的半抑制浓度IC50为：77.29 µg/mL。E2对MCF-7和HepG-2半抑制浓度IC50分别为：214.17µg/mL和237.64µg/mL。MALDI-TOF-TOF-MS二级质谱分析得出E1和E2所含多肽的其中三条序列为PGVKGPR（图3）、SSPGPPVH（图4）和KLGPKGPR（图5）当这三条多肽浓度为500 μg/ml时，对HepG-2抑制率分别为39.45%、57.97%和61.98%；，对MCF-7抑制率分别为56.52%、70.02%和39.82%。
实施例2
（1）取10 g金钱龟肉糜和超纯水混合后搅拌，配制成浓度为15% (w/v)的混合溶液，加入胰蛋白酶酶解，其水解条件是：PH=8，酶解温度30℃，酶解时间10 h，酶与底物浓度比为0.1%（w/w）。该过程中使用0.1 mol/L的NaOH和HCl来调节反应体系的pH值，控制pH值在pH±0.05之间，酶解完毕后在95℃水中灭酶15 min，冷至室温，将酶解液在6000 r/min下离心35 min，取上清液。
（2）取步骤（1）得到的酶解液，依次用截留分子量分别为10 KD、5 KD以及3 KD的超滤膜过滤（CO2的压力为0.22 Mpa的室温下），从而获得分子量大小范围为0-3 KD、3-5 KD和大于10 KD的金钱龟多肽的酶解液。
（3）取步骤（2）得到的0-3 K的酶解液进行葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱层析，柱体积为150 mL，上样量为3 mL，上样浓度为100 mg/mL，流动相为水，流速为0.3 mL/min，每4min收集一管，总共收集110管，检测波长为218 nm，共得到4个多肽组份。检测方法与结果参照实施例1。
实施例3
（1）取18 g金钱龟肉糜和超纯水混合后搅拌，配制成浓度为30% (w/v)的混合溶液，加入胰蛋白酶酶解，其水解条件是：PH=9，酶解温度60℃，酶解时间15 h，酶与底物浓度比为0.5%（w/w）。该过程中使用0.2 mol/L的NaOH和HCl来调节反应体系的pH值，控制pH值在pH±0.05之间，酶解完毕后在100℃水中灭酶20 min，冷至室温，将酶解液在8000 r/min下离心60 min，取上清液。
（2）取步骤（1）得到的酶解液，依次用截留分子量分别为10 KD、5 KD以及3 KD的超滤膜过滤（CO2的压力为0.25 Mpa的室温下），从而获得分子量大小范围为0-3 KD、3-5 KD和大于10 KD的金钱龟多肽的酶解液。
（3）取步骤（2）得到的0-3 K的酶解液进行葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱层析，柱体积为180 mL，上样量为2 mL，上样浓度为70 mg/mL，流动相为水，流速为0.3 mL/min，每4min收集一管，总共收集110管，检测波长为218 nm，共得到4个多肽组份。检测方法与结果参照实施例1。
实施例4
（1）取20 g金钱龟肉糜和超纯水混合后搅拌，配制成浓度为50% (w/v)的混合溶液，加入胰蛋白酶酶解，其水解条件是：PH=8.5，酶解温度55℃，酶解时间12 h，酶与底物浓度比为0.3%（w/w）。该过程中使用0.15 mol/L的NaOH和HCl来调节反应体系的pH值，控制pH值在pH±0.05之间，酶解完毕后在85℃水中灭酶17 min，冷至室温，将酶解液在9000 r/min下离心55 min，取上清液。
（2）取步骤（1）得到的酶解液，依次用截留分子量分别为10 KD、5 KD以及3 KD的超滤膜过滤（CO2的压力为0.18 Mpa的室温下），从而获得分子量大小范围为0-3 KD、3-5 KD和大于10 KD的金钱龟多肽的酶解液。
（3）取步骤（2）得到的0-3 K的酶解液进行葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱层析，柱体积为190 mL，上样量为4 mL，上样浓度为120 mg/mL，流动相为水，流速为0.3 mL/min，每4min收集一管，总共收集110管，检测波长为218 nm，共得到4个多肽组份。检测方法与结果参照实施例1。
本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取3～20g金钱龟肉糜和超纯水混合后搅拌，配制成浓度为10～50％(w/v)的混合溶液，加入胰蛋白酶进行酶解，水解过程中使用0.05～0.2mol/L的NaOH或HCl来调节反应体系的pH值，控制pH值在pH±0.05之间，酶解完毕后灭酶，冷至室温，将酶解液离心，取上清液；所述胰蛋白酶水解条件是：pH＝7～9，酶解温度30～60℃，酶解时间4～15h，酶与底物浓度比为0.1％～0.5％(w/w)
(2)取步骤(1)得到的酶解液，依次用截留分子量分别为10KD、5KD以及3KD的超滤膜过滤，从而获得分子量大小范围为0-3KD、3-5KD和大于10KD的金钱龟多肽的酶解液；
(3)取步骤(2)得到的0-3K的酶解液进行葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱层析，水洗脱，按照出峰的时间顺序，分别收集得到4个多肽组份分别命名为E1、E2、E3和E4，即金钱龟抗肿瘤多肽；所述金钱龟抗肿瘤多肽组份中E1和E2经MALDI-TOF-TOF质谱分析鉴定得到其中三条肽序列为PGVKGPR、SSPGPPVH和KLGPKGPR。
2.根据权利要求1所述的一种金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述灭酶为在80～100℃水中灭酶10～20min。
3.根据权利要求1所述的一种金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述离心为在6000～10000r/min下离心30～60min。
4.根据权利要求1所述的一种金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于步骤(2)所述的超滤在CO2的压力为0.1～0.25Mpa的室温下用超滤杯结合超滤膜超滤。
5.根据权利要求1所述的一种金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的葡聚糖凝胶Sephadex G-15分离纯化，具体条件为：柱体积为100～200mL，上样量为1～4mL，上样浓度为20～150mg/mL，流动相为水，流速为0.3mL/min，每4min收集一管，总共收集110管，检测波长为218nm。
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