CN103550147A - 灵芝子实体多糖注射剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种灵芝子实体多糖注射剂及其制备方法。灵芝子实体多糖注射剂的制备方法包括灵芝子实体多糖水提液的Severage法去蛋白、DEAE-52纤维素柱层析纯化、灵芝子实体多糖纯品的制备、灵芝子实体多糖注射液的制备。灵芝子实体多糖有许多的生物活性，包括调节免疫功能、抗肿瘤、抗感染、降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、清除自由基、促进核酸与蛋白质生物合成等。但目前的灵芝多糖药品多为口服药剂，灵芝子实体多糖的活性会因口服而受到限制，而注射剂通过静脉注射或腹腔注射能够直接进入人体直接起药效作用，是口服的药效不可比拟的。目前市场上还没有灵芝子实体多糖的注射剂，本发明开发的灵芝子实体多糖注射剂是安全的，可供医学临床应用。
Description
技术领域 本发明涉及一种注射剂及其制备方法，具体涉及一种灵芝子实体多糖注射剂及其制备方法
背景技术 灵芝（Ganoderma lucidum），属于担子菌，多孔菌科目(Polyporaceae)，灵芝科，灵芝属(Ganodelma) ，我国民间视其为神草仙药，将子实体、孢子粉、菌丝入药。最早的药学著作《专著神农本草经》把灵芝列为上品，谓其“久味苦平，主治胸中结，益心气，补中，增智慧，不忘，久服轻身不老”。 灵芝具有抗癌、清除自由基、延缓衰老、增强免疫力、降低胆固醇、降血脂、降血糖、清除毒素等药效。
现代医学研究表明；灵芝的主要活性成分包括灵芝多糖、三萜化合物、生物碱、腺苷等，其中灵芝多糖（GLPS）是灵芝的主要活性成分之一。灵芝中有几种活性成份已被分离与鉴定，如三萜类化合物、多糖、核苷、甾醇类、生物碱。多糖是灵芝的主要活性成份。
多糖类物质易溶于热水，但不溶于高浓度的有机溶剂，根据这个原理，提取多糖的主要方法热水浸提法，一般是利用热水溶解多糖，然后利用有机溶剂（乙醇）等作为介质将多糖沉淀下来，该法比较简单，设备要求低，也可以用酶辅助法、超声波或微波机械辅助方法提取。酶辅助法是利用纤维素酶或胰蛋白酶降解糖细胞内存在着的蛋白质、纤维素、果胶质等成分。超声或微波的辅助也是热水浸提的基础之上，利用超声或微波的机械剪切力作用破坏细胞壁，使多糖物质较为容易的释放溶解入水中。超临界流体萃取法是最近几年研究的热点方法，是利用超临界二氧化碳萃取技术，此法对多糖结构破坏小，产品质量高，但是成本高，操作繁琐。
灵芝多糖有许多的生物活性，包括调节免疫功能、抗肿瘤、抗感染、降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、清除自由基、促进核酸与蛋白质生物合成等。
抗肿瘤活性：灵芝多糖具有抑制肿瘤生长，激活免疫细胞的作用，灵芝多糖虽然不能直接杀死肿瘤细胞，但是可以促进机体巨噬细胞的增殖，并能激活巨噬细胞吞噬癌变细胞的能力，同时也具有增强机体免疫反应及自然杀伤细胞的活性，进而起到抑制肿瘤细胞作用。
免疫调节功能：普遍认为灵芝多糖主要是通过直接或间接激活T细胞、B细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞等免疫细胞调控免疫应答、维持免疫平衡、诱导T细胞活性变化、维持细胞群及内环境的平衡稳定等而实现免疫调节功能。据报道灵芝多糖可明显促进T细胞、B细胞、巨噬细胞的数量、活性和免疫应答等而实现其免疫调节功能。
清除自由基和抗衰老作用：许多疾病的发展都与人体自由基有密切关系，当人体自由基过多，就会对人体各种细胞器官造成损伤，所以控制体内自由基的数量对于维持人体健康具有十分重要的意义。据报道灵芝多糖有助于提高细胞的存活率，对四氧嘧啶引发的小鼠氧自由基损伤也有很好的保护作用。李明春等人报道灵芝多糖对小鼠细胞自由基的产生有抑制作用，并对PMA引起的自由基的产量有拮抗作用。灵芝多糖也具有抗衰老的作用，可以降低过氧化脂质的含量，同时也可以提高过氧化氢酶（CAT）的作用。
血管系统：灵芝多糖具有缩短小鼠血栓长度，减轻血栓重量的作用[]。此外灵芝的提取液能有效缓解心脏舒张功能障碍和防止在心肌缺血和再灌注时产生的不可逆心肌损伤。
降血糖、护肝，抗氧化及抗辐射：灵芝多糖可以明显的降低小鼠血糖水平，同时，试验也表明对肝损伤和肾损伤都有一定的保护和修复作用。此外，灵芝的热水浸膏对抗辐射、抗氧化、抗诱变等有较强的活性作用，而且热水提取法对其活性几乎没有损失。灵芝多糖也能显著提高人体淋巴结细胞的活性指数，对肝脏有很好的保护作用，对肝炎有一定的疗效。罗少洪在研究中也表明灵芝多糖对降血糖也具有很好的功效。另外，灵芝多糖还具有抗菌消炎、去火、修复细胞、延缓疲劳、抗毒素、降低胆固醇等活性作用。
发明内容 本发明的目的在于提供一种灵芝子实体多糖注射剂及其制备方法，为医学应用提供更加有效的灵芝产品。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的。
本发明的灵芝子实体多糖注射剂的制备方法，包括灵芝子实体多糖水提液去蛋白，纯化、注射剂制备，其特征在于制备步骤如下：
（1）灵芝子实体多糖水提液去蛋白：把灵芝子实体水提物，放入烘箱105℃烘至恒重，称取灵芝子实体多糖粉于烧杯中，加入去离子水，其中灵芝子实体多糖粉与水的重量比为1︰240～250，沸水水浴1h后5000r/min 离心20 min，取上清液，在旋转蒸发仪中100r/min，75℃浓缩至含水率为19％～20%，得灵芝子实体多糖浓缩物，将灵芝子实体多糖浓缩物用Sevage法进行脱蛋白处理，取脱蛋白处理后的上清液加入4～５倍体积的无水乙醇，放置冰箱4℃过夜，5000r/min离心10min取沉淀物，并于烘箱105℃干燥；将烘干的干物质利用索氏提取器，在75℃下分别用丙酮、无水乙醚和无水乙醇回流6h，沉淀物105℃烘干，获得脱蛋白灵芝子实体多糖；所述Sevage试剂，即氯仿与乙醇体积比为5:1的混合液；所述将灵芝子实体多糖浓缩物进行脱蛋白处理，即往灵芝子实体多糖浓缩物中加入2倍重量的 Sevage试剂，涡旋振荡仪上3000r/min震荡10min后，10000r/min离心10min，取上清液；加入重量为上清液2倍的Sevage试剂，涡旋振荡仪上3000r/min震荡10min后，10000r/min离心10min，取上清液，如此反复处理 8次，得脱蛋白处理后的上清液；
（2）纯化：
A、DEAE-52纤维素柱层析阶段性梯度洗脱：取步骤（1）制备的脱蛋白灵芝子实体多糖，加入重量比为19～20︰1的去离子水溶解，并用DEAE-52纤维素柱层析纯化；层析柱的规格是2.6×60cm，装柱高为35cm，先用去离子水洗柱，而后用浓度为0.1mol/L的NaCl溶液洗脱，最后用浓度为0.5mol/L的NaCl溶液进行洗脱，洗脱流速为1.3mL/min，每300s收集一管，每管6.5mL，计滴自动部份收集器自动收集洗脱液，取对应管号为28～44管的洗脱液，合并为DEAE-52纤维素柱层析阶段性梯度洗脱液；
B、灵芝子实体多糖纯品的制备
取步骤A的DEAE-52纤维素柱层析阶段性梯度洗脱液用去离子水透析48h后，在旋转蒸发仪中100r/min，75℃浓缩至10mL～20 mL，并加入4～５倍体积无水乙醇，醇沉，取沉淀物并105℃干燥，获得灵芝子实体多糖纯品；
（3）灵芝子实体多糖注射液的制备
取注射生理盐水复溶灵芝子实体多糖纯品，使溶液中灵芝子实体多糖浓度为2.1mg/mL，按活性炭与生理盐水的重量体积比（mg/mL）为0.04%，加入活性炭，沸水煮浴20min，45μm过滤后装瓶灭菌。
本发明使用的化学制剂均为分析纯。
本发明还保护利用上述方法制备的灵芝子实体多糖注射剂。
本发明的优点：
灵芝具有抗癌、清除自由基、延缓衰老、增强免疫力、降低胆固醇、降血脂、降血糖、清除毒素等药效。现代医学研究表明，灵芝多糖（GLPS）是灵芝的主要活性成分。灵芝多糖有许多的生物活性，包括调节免疫功能、抗肿瘤、抗感染、降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、清除自由基、促进核酸与蛋白质生物合成等。目前，市场上的灵芝多糖药品多为口服药剂，灵芝多糖的活性会因口服而受到限制，而注射剂通过静脉注射或腹腔注射直接进入人体，注射剂的药效与口服药剂的药效是不可比拟的。
具体实施方式 为了充分公开本发明的灵芝子实体多糖注射剂及其制备方法，以下结合实施例加以说明。
实施例1：一种灵芝子实体多糖注射剂的制备方法称取脱蛋白的灵芝子实体多糖纯品1.2g，溶在600mL的注射生理盐水中，调节灵芝子实体多糖浓度为2.1mg/mL，加入0.24mg活性炭，沸水煮浴20min，45μm过滤后分装于3mL安瓶，每瓶装2mL，121℃湿热高压蒸汽灭菌30min，得供静脉注射或腹腔注射用的灵芝子实体多糖注射剂。
将该灵芝子实体多糖注射剂于5℃冰箱中或室温避光保存放置六个月,未见固体析出,注射液的澄清度检查符合中国2010版药典。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (3)
1.一种灵芝子实体多糖注射剂的制备方法，包括灵芝子实体多糖水提液去蛋白、纯化、灵芝子实体多糖注射液制备，其特征在于制备步骤如下：
（1）灵芝子实体多糖水提液去蛋白：把灵芝子实体水提物，放入烘箱105℃烘至恒重，称取灵芝子实体多糖粉于烧杯中，加入去离子水，其中灵芝子实体多糖粉与水的重量比为1︰240～250，沸水水浴1h后5000r/min 离心20 min，取上清液，在旋转蒸发仪中100r/min，75℃浓缩至含水率为19％～20%，得灵芝子实体多糖浓缩物，将灵芝子实体多糖浓缩物用Sevage法进行脱蛋白处理，取脱蛋白处理后的上清液加入4～５倍体积的无水乙醇，放置冰箱4℃过夜，5000r/min离心10min取沉淀物，并于烘箱105℃干燥；将烘干的干物质利用索氏提取器，在75℃下分别用丙酮、无水乙醚和无水乙醇回流6h，沉淀物105℃烘干，获得脱蛋白灵芝子实体多糖；所述Sevage试剂，即氯仿与乙醇体积比为5:1的混合液；所述将灵芝子实体多糖浓缩物进行脱蛋白处理，即往灵芝子实体多糖浓缩物中加入2倍重量的 Sevage试剂，涡旋振荡仪上3000r/min震荡10min后，10000r/min离心10min，取上清液；加入重量为上清液2倍的Sevage试剂，涡旋振荡仪上3000r/min震荡10min后，10000r/min离心10min，取上清液，如此反复处理 8次，得脱蛋白处理后的上清液；
（2）纯化：
A、DEAE-52纤维素柱层析阶段性梯度洗脱：取步骤（1）制备的脱蛋白灵芝子实体多糖，加入重量比为19～20︰1的去离子水溶解，并用DEAE-52纤维素柱层析纯化；层析柱的规格是2.6×60cm，装柱高为35cm，先用去离子水洗柱，而后用浓度为0.1mol/L的NaCl溶液洗脱，最后用浓度为0.5mol/L的NaCl溶液进行洗脱，洗脱流速为1.3mL/min，每300s收集一管，每管6.5mL，计滴自动部份收集器自动收集洗脱液，取对应管号为28～44管的洗脱液，合并为DEAE-52纤维素柱层析阶段性梯度洗脱液；
B、灵芝子实体多糖纯品的制备
取步骤A的DEAE-52纤维素柱层析阶段性梯度洗脱液用去离子水透析48h后，在旋转蒸发仪中100r/min，75℃浓缩至10mL～20 mL，并加入4～５倍体积无水乙醇，醇沉，取沉淀物并105℃干燥，获得灵芝子实体多糖纯品；
（3）灵芝子实体多糖注射液的制备
取注射生理盐水复溶灵芝子实体多糖纯品，使溶液中灵芝子实体多糖浓度为2.1mg/mL，按活性炭与生理盐水的重量体积比（mg/mL）为0.04%，加入活性炭，沸水煮浴20min，45μm过滤后装瓶灭菌。
2.根据权利要求1所述的一种灵芝子实体多糖注射剂制备方法，其特征在于所述灵芝子实体多糖注射液的制备，称取脱蛋白的灵芝子实体多糖纯品1.2g，溶在600mL的注射生理盐水中，调节灵芝子实体多糖浓度为2.1mg/mL，加入0.24mg活性炭沸水煮浴20min，45μm过滤后分装于3mL安瓶，每瓶装2mL，121℃湿热高压蒸汽灭菌30min，得灵芝子实体多糖注射剂。
3.由权利要求1或2的方法制备的灵芝子实体多糖注射剂。
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