CN109438585A - 一种b型嗜血杆菌多糖的纯化工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公布了一种b型嗜血杆菌多糖纯化工艺，包括切向流超滤膜包超滤、陶瓷羟基磷灰石层析、切向流超滤膜包超滤脱盐浓缩、冻干步骤。本发明的优点在于避免了苯酚的使用，防止了苯酚对环境及人员的危害，减少了乙醇的使用，降低了乙醇使用过程中的易燃易爆危险；切向流超滤膜包与羟基磷灰石的配合使用使蛋白、核酸含量更低，且更具生产放大的意义；直接和冻干工艺结合获得低含水量的多糖产品，多糖稳定性加强。

Description

一种b型嗜血杆菌多糖的纯化工艺

技术领域：

本发明涉及多糖疫苗领域中的多糖纯化，具体涉及b型流感嗜血杆菌(Hib)多糖纯化。

背景技术：

包括Hib多糖疫苗、结合疫苗及相关多价疫苗的制备过程中，多糖的制备是其关键步骤。当前国际上Hib多糖提取纯化采用相似的工艺。利用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)沉淀发酵液离心后的上清液，获得混有核酸、蛋白的复合糖。溶解复合糖后使用不同浓度的乙醇分步沉淀获得粗糖。粗糖使用苯酚抽提去除蛋白质，再次使用乙醇沉淀，最终获得低蛋白含量、低核酸含量的Hib精糖。该工艺使用大量苯酚、乙醇。一方面苯酚作为具有腐蚀性、高度毒性的化学试剂，对环境具有严重危害，污染空气及水体；大量乙醇存放对生产厂房的安全要求较高。另一方面苯酚对人体皮肤、黏膜有强烈的腐蚀作用，抑制中枢神经，损害肝、肾功能，危害生产操作人员身体健康。同时，疫苗成品中存在的苯酚残留也对使用者身体健康存在潜在危害。因此摒弃苯酚使用，减少乙醇使用，采用新工艺纯化多糖具有实际意义。

专利号CN201210037245.2，发明名称为一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的纯化方法，该专利公布了一种利用羟基磷灰石进行b型嗜血杆菌多糖纯化的方法。该方法不再使用苯酚进行蛋白去除，采用层析进行多糖纯化，去除蛋白。本专利工艺相比该专利方法，增加了羟基磷灰石层析前切向流超滤膜包超滤处理，进一步降低了蛋白、核酸含量，同时控制了层析上样溶液的离子浓度；层析过程，使用浓度更低的磷酸盐浓度；层析柱再生不使用氯化钠，使用浓度更高的磷酸盐浓度，提高层析柱使用寿命；层析后，使用切向流超滤膜包超滤代替G-25凝胶柱，更具工业应用价值；增加了冻干工艺，直接对超滤浓缩液进行冻干，多糖更稳定。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种b型嗜血杆菌多糖的纯化方法。

本发明采用超滤-陶瓷羟基磷灰石层析-超滤-冻干的方法对b型嗜血杆菌多糖进行纯化，在避免了苯酚使用的同时，还大大的减少了乙醇的使用量，克服了原有技术的不足，同时能获得较低蛋白、核酸含量的精糖。

本发明的目的通过以下方案实现：

本发明所述的b型嗜血杆菌多糖的纯化方法，包括以下步骤：

1)将粗多糖溶解于PB缓冲液中，使用切向流超滤膜包进行超滤，获得超滤溶液；

2)超滤溶液通过陶瓷羟基磷灰石层析柱进行层析，获得层析液；

3)使用切向流超滤膜包对层析液进行超滤脱盐、浓缩，获得浓缩液；

4)将浓缩液冻干获得固体b型嗜血杆菌荚膜多糖。

其中，优选的步骤1)：

使用浓度为5～15mmol/L、pH6～8磷酸盐缓冲液溶解粗多糖至浓度为3～10mg/mL，使用切向流超滤膜包进行超滤，超滤透过体积为粗多糖溶液的10～50倍体积，温度控制在8～15℃，切向流超滤膜包型号为30～300KD，超滤获得超滤溶液。

其中，优选的步骤2)：

将超滤溶液上样至陶瓷羟基磷灰石层析柱上，收集206nm显示的流穿峰获得层析液，使用高浓度的PB缓冲液洗脱蛋白与核酸；

其中，陶瓷羟基磷灰石柱高范围16～24cm，上样量0.5～1.5CV(柱体积)，流速100～300cm/h；

其中，高浓度的PB缓冲液浓度为200～500mmol/L磷酸盐缓冲液、pH在6.5～8之间。

其中，优选的步骤3)：

使用切向流超滤膜包对层析液进行超滤脱盐、浓缩，获得浓缩液；

超滤中添加水为注射用水，超滤倍数为10～50倍；最终浓缩为层析液体积的1/10～1/2，温度控制在8～15℃，切向流超滤膜包型号为30～300KD。

其中，优选的步骤4)冻干过程：

将浓缩液冻干获得固体b型嗜血杆菌荚膜多糖，

其中冻干过程分为：预冻干、冻干、二次冻干三个阶段；预冻干的温度在-30～-55℃，时间为2～5小时；冻干的温度在-30～-35℃，时间为10～24小时；二次冻干温度在15～30℃，时间为2～10小时。

b型嗜血杆菌粗糖属于现有产品，其制备方法按照国际通用制备工艺，参照文献(Anderson，1977.INFCTION AND IMMUNITY.Vol 15.No.2，P472～477)培养b型嗜血杆菌，添加甲醛灭菌，发酵液离心。上清液添加CTAB沉淀过夜，离心获得复合多糖。复合多糖氯化钙溶液解离，乙醇分部沉淀去除核酸，离心获得沉淀进行旋蒸获得粗糖。

本发明的优点在于，采用超滤-羟基磷灰石层析-超滤-冻干进行多糖纯化，避免了苯酚的使用，防止了苯酚对环境及人员的危害，减少了乙醇的使用，降低了乙醇使用过程中的易燃易爆危险；切向流超滤膜包与羟基磷灰石的配合使用使蛋白、核酸含量更低，且更具生产放大的意义；直接和冻干工艺结合获得低含水量的多糖产品，多糖稳定性加强。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明做进一步的描述，但本发明的保护范围不局限于以下所述。

实施例1

1)将粗多糖溶解于PB缓冲液中，使用切向流超滤膜包进行超滤，获得超滤溶液：

使用浓度为5mmol/L、pH6.5磷酸盐缓冲液溶解粗多糖至浓度为5mg/mL，超滤透过体积为粗多糖溶液的10倍体积，温度控制在8℃，切向流超滤膜包型号为30KD。

2)超滤溶液通过陶瓷羟基磷灰石层析柱进行层析，获得层析液：

将超滤溶液上样至陶瓷羟基磷灰石层析柱上，收集206nm显示的流穿峰获得层析液，使用高浓度的PB缓冲液洗脱蛋白与核酸；羟基磷灰石柱高范围16cm，上样量0.5CV(柱体积)，流速100cm/h；高浓度的PB缓冲液浓度为200mmol/L磷酸盐缓冲液、pH在6.5。

3)使用切向流超滤膜包对层析液进行超滤脱盐，浓缩，获得浓缩液：

超滤中添加水为注射用水，超滤倍数为10倍；最终浓缩为层析液体积的1/10，温度控制在8℃，切向流超滤膜包型号为30KD。

4)将浓缩液冻干获得固体b型嗜血杆菌荚膜多糖：

冻干经预冻、冻干、二次冻干三个阶段；预冻干温度在-55℃，时间为2小时；冻干阶段温度在-30℃，时间为10小时；二次冻干温度在15℃，时间为2小时。

实施例2

1)将粗多糖溶解于PB缓冲液中，使用切向流超滤膜包进行超滤，获得超滤溶液：

使用浓度为15mmol/L、pH 8磷酸盐缓冲液溶解粗多糖至浓度为10mg/mL，超滤透过体积为粗多糖溶液的50倍体积，温度控制在15℃，切向流超滤膜包型号为300KD。

2)超滤溶液通过陶瓷羟基磷灰石层析柱进行层析，获得层析液：

将超滤溶液上样至陶瓷羟基磷灰石层析柱上，收集206nm显示的流穿峰获得层析液，使用高浓度的PB缓冲液洗脱蛋白与核酸；羟基磷灰石柱高范围24cm，上样量1.5CV(柱体积)，流速300cm/h；高浓度的PB缓冲液浓度为500mmol/L、pH在8。

3)使用切向流超滤膜包对层析液进行超滤脱盐，浓缩，获得浓缩液：

超滤中添加水为注射用水，超滤倍数为50倍；最终浓缩为原层析液体积的1/2，温度控制在15℃，切向流超滤膜包型号为300KD。

4)将浓缩液冻干获得固体b型嗜血杆菌荚膜多糖：

冻干经预冻、冻干、二次冻干三个阶段；预冻干温度在-55℃，时间为5小时；冻干阶段温度在-35℃，时间为24小时；二次冻干温度在30℃，时间为10小时。

实施例3、

通过本发明工艺所获得b型嗜血杆菌多糖各项指标与国家药典及现有专利(专利号：CN201210037245.2)进行比较结果如下：

可以发现本工艺所获得b型嗜血杆菌多糖各项指标均符合国家药典要求，且蛋白、核酸含量低于已现有专利方法所获得的多糖。

Claims (7)

1.一种b型嗜血杆菌荚膜多糖的纯化工艺，包括以下步骤：

1)将粗多糖溶解于PB缓冲液中，使用切向流超滤膜包进行超滤，获得超滤溶液；

2)超滤溶液通过陶瓷羟基磷灰石层析柱进行层析，获得层析液；

3)使用切向流超滤膜包对层析液进行超滤脱盐、浓缩，获得浓缩液；

4)将浓缩液冻干获得固体b型嗜血杆菌荚膜多糖。

2.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于，步骤1)：

使用浓度为5～15mmol/L、pH6～8磷酸盐缓冲液溶解粗多糖至浓度为3～10mg/mL，使用切向流超滤膜包进行超滤，超滤透过体积为粗多糖溶液的10～50倍体积，温度控制在8～15℃，切向流超滤膜包型号为30～300KD，超滤获得超滤溶液。

3.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于，步骤2)：

将超滤溶液上样至陶瓷羟基磷灰石层析柱上，收集206nm显示的流穿峰获得层析液，使用高浓度的PB缓冲液洗脱蛋白与核酸；

其中，陶瓷羟基磷灰石柱高范围16～24cm，上样量0.5～1.5CV(柱体积)，流速100～300cm/h；

其中，高浓度的PB缓冲液浓度为200～500mmol/L磷酸盐缓冲液、pH在6.5～8之间。

4.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于，步骤3)：

使用切向流超滤膜包对层析液进行超滤脱盐、浓缩，获得浓缩液；

超滤中添加水为注射用水，超滤倍数为10～50倍；最终浓缩为层析液体积的1/10～1/2，温度控制在8～15℃，切向流超滤膜包型号为30～300KD。

5.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于，步骤4)：

将浓缩液冻干获得固体b型嗜血杆菌荚膜多糖，

其中冻干过程分为：预冻干、冻干、二次冻干三个阶段；预冻干的温度在-30～-55℃，时间为2～5小时；冻干的温度在-30～-35℃，时间为10～24小时；二次冻干温度在15～30℃，时间为2～10小时。

6.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将粗多糖溶解于PB缓冲液中，使用切向流超滤膜包进行超滤，获得超滤溶液：

粗多糖浓度5mg/mL，PB缓冲液浓度为5mmol/L、pH 6.5，超滤体积为10倍原体积，温度控制在8℃，切向流超滤膜包型号为30KD。

(2)超滤溶液通过陶瓷羟基磷灰石层析柱进行层析，获得层析液：

将超滤溶液上样至陶瓷羟基磷灰石层析柱上，收集206nm显示的流穿峰获得层析液，使用高浓度的PB缓冲液洗脱蛋白与核酸；羟基磷灰石柱高范围16cm，上样量0.5CV(柱体积)，流速100cm/h；高浓度的PB缓冲液浓度为200mmol/L、pH在6.5。

(3)使用切向流超滤膜包对层析液进行超滤脱盐，浓缩，获得浓缩液：

超滤中添加水为注射用水，超滤倍数为10倍；最终浓缩为原体积的1/10，温度控制在8℃，切向流超滤膜包型号为30KD。

(4)将浓缩液冻干获得固体b型嗜血杆菌荚膜多糖：

冻干经预冻、冻干、二次冻干三个阶段；预冻干温度在-55℃，时间为2小时；冻干阶段温度在-30℃，时间为10小时；二次冻干温度在15℃，时间为2小时。

7.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于，包括以下步骤：

1)将粗多糖溶解于PB缓冲液中，使用切向流超滤膜包进行超滤，获得超滤溶液：

粗多糖浓度10mg/mL，PB缓冲液浓度为15mmol/L，pH8，超滤体积为50倍原体积，温度控制在15℃，切向流超滤膜包型号为300KD。

2)超滤溶液通过陶瓷羟基磷灰石层析柱进行层析，获得层析液：

将超滤溶液上样至陶瓷羟基磷灰石层析柱上，收集206nm显示的流穿峰获得层析液，使用高浓度的PB缓冲液洗脱蛋白与核酸；羟基磷灰石柱高范围24cm，上样量1.5CV(柱体积)，流速300cm/h；高浓度的PB缓冲液浓度为500mmol/L、pH在8。

3)使用切向流超滤膜包对层析液进行超滤脱盐，浓缩，获得浓缩液：

超滤中添加水为注射用水，超滤倍数为50倍；最终浓缩为原体积的1/2，温度控制在15℃，切向流超滤膜包型号为300KD。

4)将浓缩液冻干获得固体b型嗜血杆菌荚膜多糖：

冻干经预冻、冻干、二次冻干三个阶段；预冻干温度在-55℃，时间为5小时；冻干阶段温度在-35℃，时间为24小时；二次冻干温度在30℃，时间为10小时。