CN104099310B - 一种重组核酸酶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种核酸酶及其制备方法。本发明的重组核酸酶，由粘质沙雷氏菌胞外核酸酶和融合标签肽段组成。本发明还提供了制备重组核酸酶的方法，包括基因序列的优化、融合标签肽段的编码序列与核酸酶基因相连接、克隆、转化和筛选高表达菌株、培养并进行分离纯化得到高纯度重组核酸酶。本发明的重组核酸酶及其制备方法，表达方案简单，表达量高，达到30％，纯化工艺特异性强，收率高。本发明的重组核酸酶应用于医药产品的工艺中，在产品分离纯化过程中很容易利用亲和层析技术从产品中去除，有助于提高产品质量。

Description

一种重组核酸酶及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种核酸酶及其制备方法。
背景技术
生物技术产品在高效表达时宿主细胞或菌体也大量增殖，这一过程中往往伴随着大量的宿主或菌体核酸的扩增，在后续的分离过程中大量的核酸释放会给目标产品的分离纯化增加难度，同时部分残留宿主DNA与产品结合也很难去除。宿主细胞的DNA同药物一起进入人体会产生不可预料的副作用，残留DNA可能造成机体DNA的插入突变，导致抑癌基因失活、癌基因被激活等，有可能造成药物使用者致癌，因此宿主细胞DNA残留量是产品质量控制的重要指标之一。
许多机构都对重组蛋白类药物的DNA残留制定了严格的标准，1984年的国际会议上采纳了残余DNA的临时限度标准，即来自连续传代细胞系的生物制品每人份剂量DNA残留不能超过10pg。1986年WHO会议一致认为不高于100pg/剂量的细胞DNA对于非口服途径的产品，其危险性是可以忽略不计的。1987年，美国FDA建议每人份剂量残余细胞DNA的可接受限度为10pg。1997年，美国FDA将生物制品可以允许的残余DNA限度修改为不超过100pg。欧洲药典通则中对于残余DNA的限度规定为不超过10ng/剂量，但针对个别疫苗(如甲型肝炎灭活疫苗残余DNA应不超过100pg/剂量；乙型肝炎疫苗DNA残留量应不超过10pg/剂量)会有所不同。
1990年2月，卫生部颁布的《人用重组DNA制品质量控制要点》3.3.1.6条款规定，必须用敏感的方法测定来源于宿主细胞的残余DNA含量，这对于用哺乳动物传代细胞(转化的细胞系)生产的制品尤为重要。一般认为残余DNA含量小于100pg/剂量是安全的。《中国药典》三部(2005年版)对CHO细胞表达的重组乙型肝炎疫苗提出CHO细胞残余DNA含量不高于10pg/剂量。近几年，我国采用Vero细胞生产灭活疫苗逐渐增多，疫苗的种类包括人用狂犬病纯化疫苗、肾综合征出血热纯化疫苗、甲型肝炎灭活疫苗、乙型脑炎纯化疫苗。《中国药典》(2005年版三部)及(2010年版三部)对于V ero细胞培养疫苗一般要求残余外源DNA不超过100pg/剂量。
生物组织及菌体裂解后大量的核酸释放使样品的黏度很高，不利于分析及从中分离目标产品。使用核酸酶降解DNA是除去宿主细胞DNA残留的常用方法。核酸酶通过降低生物制 品，尤其是病毒类产品外源性核酸的含量，减少过敏反应，提高制品安全性。工程细胞裂解后加入核酸酶可降低料液的黏度，缩短处理时间，提高蛋白产量，离心时有利于沉淀和上清液的分离，超滤时有利于各成分的分离，提高柱层析纯化时的有效性。颗粒(病毒、包涵体等)用核酸酶预处理有助于颗粒的纯化。在ELISA、柱层析、二维电泳和免疫印迹等生物样品分析中，通过核酸酶的作用可提高分辨率和回收率。
非特异性核酸内切酶是一类高活性的水解酶，其最大特点是能非特异性地降解几乎所有形式的核酸。来自粘质沙雷氏菌非特异性核酸内切酶(Serratia marcescens non-specific endonuclease，SMNE，E.C.3.1.30.2)是其中的典型代表，该酶能降解各种形式核酸的核酸内切酶，包括单链，双链，线性和环状DNA和RNA以及基因组DNA，对核酸的序列没有严格要求，并且没有蛋白酶活性。该酶在广泛条件范围具有很高的核酸降解活性，能将核酸完全消化成杂交限度以下的2-5个碱基长度的5’-单磷酸寡核苷酸。
该酶由分子量为30kDa的两个亚基组成，作用的pH范围为6～10，温度0～42℃，酶发挥活性需要1～2mM Mg2+。在离子型及非离子型表面活性剂和1mmol/L PMSF，1mmol/LEDTA，尿素存在下，核酸酶仍具有活性。大于150mmol/L的单价阳离子，大于100mmol/L的磷酸根，大于100mmol/L硫酸铵和大于100mmol/L盐酸胍抑制酶的活性。
核酸酶具有广阔的应用前景，目前市场上销售的核酸酶产品主要是德国Merck公司的
Figure BSA00000879846900021
endonuclease。该产品是将Serratia marcescens核酸酶基因克隆到pNUC1质粒载体，转化大肠杆菌W3310实现核酸酶基因的分泌表达，生产工艺保证了产品的纯度和活性，使该产品同自然提取酶相比，最大限度地降低了蛋白酶活性和病毒污染。
美国Acambis公司的ChimeriVaxTM Platform疫苗研究平台系统，采用黄热病毒载体研究生产登革热、WN和JE脑炎疫苗。这些重组疫苗的研发始于1997～1999年，在2000～2003年获得IND批准。在质量控制方面包括：(1)种子系统(外源因子检测，逆转录病毒检测，效力，基因序列鉴别和免疫染色鉴别，小鼠和猴体神经毒力的安全性，无菌性等)；(2)疫苗收获液检定(无菌性，效力，外源因子检测，逆转录病毒检测，基因序列鉴别等)；(3)纯化的疫苗原液(无菌性，效力，基因序列鉴别，HAS，残余DNA检测，内毒素等)；(4)半成品(无菌性，效力，基因序列鉴别和免疫染色鉴别小鼠神经毒力安全性，残余Benzonase检测，残余DNA检测，赋形剂，渗透压等)；(5)成品(无菌性，内毒素，免疫染色鉴别，一般安全性、外观、pH、渗透压、赋形剂等)。这表明Benzonase核酸酶已经用于疫苗的开发和生产。
2007年，薛惠斌在腺病毒CNHK200-hEndostatin的质量控制及其大规模扩增-纯化的初 步研究中应用Benzonase提高重组腺病毒的质量，工艺条件：最佳的作用浓度在100～200u/ml，置于37℃水浴，60分钟。重组复制型溶瘤腺病毒p53产品工艺中也使用了benzonase酶，质量标准制定了相应的残留量检测项目。《Vaccine》杂志2007年发表了关于人用罗斯河病毒感染(Ross River virus)疫苗的临床前试验文章，其中疫苗制备工艺首先是40升反应器中病毒的微载体培养，然后收获培养上清进行过滤，滤液中加入Benzonase核酸酶处理，浓度2000U/L，37℃，1小时以消化残留的Vero细胞DNA。后续病毒经甲醛灭活24小时后再加入Benzonase核酸酶1000U/L以进一步处理残留的核酸。
2009年发表于《THE JOURNAL OF GENE MEDICINE》的一项关于腺病毒载体纯化的研究(Purification of adenoviral vectors by combined anion exchange and gelfiltration chromatography)中应用Benzonase的条件为：1200U Benzonase加到12.5ml(98U/ml)粗裂解物，37℃保温1小时，然后2-8℃条件3000g离心10分钟后进一步纯化。结果病毒颗粒的收率有很大改善，在超滤后纯化的第一步97％的Benzonase核酸酶能够去除。
2010年《Gene Therapy》杂志报道了通过单纯疱疹病毒互补系统生产、纯化腺相关病毒的工作，其中重组病毒颗粒释放后采用Benzonase核酸酶(25U ml/L，MgCl22mmol/L).处理，37℃振荡保温2～4小时，这样便于在后续的工艺中有效地去除残留DNA。
2011年，Langfield K.K.等在《Methods Mol Biol.》杂志发表了关于制备麻疹病毒的文章。麻疹病毒作为具有肿瘤治疗前景的溶瘤病毒，正在进行临床试验，但溶瘤病毒的活性依赖于高浓度具有感染性的病毒颗粒。在纯化中，病毒培养上清过滤后采用Benzonase核酸酶处理来消化其中的核酸以便于后续的制备工作。
2012年，Bandeira V.等在纯化慢病毒颗粒载体(Lentiviral vector)的工艺过程中使用了Benzonase核酸酶，结果能去除99％的DNA残留。美国食品药品监督管理局网站(www.fda.gov)公开了病毒载体的生产工艺过程，其中有Benzonase核酸酶的处理步骤，通过37℃保温1小时，就能有效去除细胞及质粒DNA。宫颈癌疫苗GARDASIL的工艺过程中使用Benzonase核酸酶4℃处理病毒颗粒过夜以帮助消化DNA从而使宿主残留DNA在后续纯化过程中容易去掉，降低终产品中宿主DNA的残留量。
Benzonase核酸酶的应用使细胞基质DNA被水解成小片段甚至寡核苷酸后在疫苗的纯化过程中很容易去除，大大降低了残留DNA的含量，提高了疫苗产品的质量。保证了产品的安全性。同时与疫苗颗粒相比，Benzonase核酸酶是小分子蛋白质，在去除血清蛋白的过程中也很容易去除。然而Benzonase核酸酶的使用是直接加入到疫苗溶液中，终产品可以控制含量，但无法完全避免。Benzonase核酸酶是外源性蛋白，极微量的残留都有可能引发个别接种 者出现过敏反应，导致临床不测事件发生。
2009年，张开俊等发表了《Serratia marcescens非特异性核酸内切酶的原核表达及其应用》的研究工作，其中采用分泌表达的方式进行表达，表达量非常低，目标蛋白占大肠杆菌菌体总蛋白约5％，只有8.0mg/L。2011年，蔡俊杰进行了《粘质沙雷氏菌胞外核酸酶重组表达纯化及鉴定》的研究工作，表达量有所提高，达到菌体总蛋白的10％。但产品没有活性。
因此非常有必要开发一种高效表达的重组核酸酶以满足医药产品开发的需求，又能方便地与产品实现分离。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表达量高，而且使用后容易从样品中去除的重组核酸酶，为了实现发明的目的，本发明采用了以下技术方案：
一种重组核酸酶，由粘质沙雷氏菌胞外核酸酶和融合标签肽段组成。
融合标签肽段序列在粘质沙雷氏菌胞外核酸酶的N端，或者融合标签肽段序列在粘质沙雷氏菌胞外核酸酶的的C端。或者融合标签肽段序列在粘质沙雷氏菌胞外核酸酶的的N端和C端。
本发明采用的融合标签肽段为2～10个组氨酸的多聚氨基酸、FLAG(DYKDDDDK氨基酸序列)、人c-myc蛋白表位、流感病毒血凝素表面抗原决定簇、葡萄球菌蛋白A、谷胱甘肽巯基转移酶、绿色荧光蛋白和硫氧环蛋白序列。
优选的融合标签多聚氨基酸肽段序列为6个组氨酸序列。
本发明的重组核酸酶的分子量为26kd-45kd，优选的分子量为30～40kd，其中最优选的为28kd。
本发明重组核酸酶的比活性为0.2～1.5x106U/mg，优选的为1.0～1.5x106U/mg
本发明还提供了一种制备重组核酸酶的方法，包括(1)、重组核酸酶基因的获得；(2)表达载体的构建及转化大肠杆菌工程菌：将融合标签肽段的编码序列与核酸酶cDNA相连接的片段插入到表达载体质粒的酶切位点，然后转化大肠杆菌宿主菌；(3)、阳性克隆的筛选、培养、诱导表达：筛选出阳性克隆在培养基上进行培养，经诱导使目标蛋白表达；(4)、重组核酸酶的分离、纯化：首先将大肠杆菌工程菌菌体收集、破菌，经离心得到破菌液上清，然后对破菌液上清用层析技术纯化得到重组核酸酶。
核酸酶cDNA序列是已知的，编码一个全长246个氨基酸的蛋白质。核酸酶的编码序列可以来源于基因文库，再1根据表达的序列进行序列优化；或根据文献报道的核酸酶cDNA序列优化后进行全基因合成，标签肽段的编码序列和核酸酶编码序列通过PCR扩增获得重组 核酸酶的编码序列。
本发明一种重组核酸酶的制备方法步骤(3)中是用氨苄青霉素做抗性筛选，也可以使用卡那霉素做抗性筛选。
本发明一种重组核酸酶的制备方法步骤(3)中诱导表达使用浓度为0.1～1.5mmol/L的IPTG作为诱导剂，优选0.4～1.0mmol/L的IPTG作为诱导剂。
本发明一种重组核酸酶的制备方法步骤(3)中诱导表达使用浓度为0.1～20mmol/L的乳糖作为诱导剂，优选1～5mmol/L的乳糖作为诱导剂。
本发明一种重组核酸酶的制备方法，表达载体是pET系列载体质粒和载体上含有融合标签肽段编码序列的质粒载体。
本发明一种重组核酸酶的制备方法，步骤(3)中培养的温度控制在25℃～40℃，优选在28℃～30℃。
本发明一种重组核酸酶的制备方法，采用亲和层析技术，凝胶颗粒上结合了能与融合标签肽段特异结合的配基，再结合离子交换层析、分子筛层析、疏水层析一种或多种方法进行纯化使产品纯度达到95％以上。
本发明一种重组核酸酶及其制备方法，其表达方案简单，表达量高，达到30％，纯化工艺特异性强，收率高。本发明的重组核酸酶应用在医药产品的工艺中，在产品分离纯化过程中很容易利用亲和层析技术从产品中去除，从而提高了产品的质量。
附图说明
附图1、pET-22a-NU-n质粒编码重组核酸酶表达全菌蛋白SDS-PAGE分析
M：标准蛋白质分子量(97.4、66.2、43、31、20、14.4kd)；
1：未诱导菌体总蛋白；
2-4：诱导菌体总蛋白。
附图2、pET-11b-NU-c质粒编码重组核酸酶表达全菌蛋白SDS-PAGE分析
M：标准蛋白质分子量(97.4、66.2、43、30、20.1、14.4kd)；
1、2：诱导菌体总蛋白；
3：未诱导菌体总蛋白。
附图3、pET-28a-NU-nc质粒编码重组核酸酶表达全菌蛋白SDS-PAGE分析
M：标准蛋白质分子量(97.4、66.2、43、31、20、14.4kd)；
1：未诱导菌体总蛋白；
2-5：诱导菌体总蛋白。
附图4、pGEX-NU-GST质粒编码重组核酸酶表达全菌蛋白SDS-PAGE分析
M：标准蛋白质分子量(97.4、66.2、43、31、20、14.4kd)；
1：未诱导菌体总蛋白；
2、3：诱导菌体总蛋白。
附图5、IMAC亲和层析结果图谱
附图6、离子交换Q柱层析结果图谱
附图7、HIC疏水层析结果图谱
附图8、纯化重组核酸酶(pET-28a-NU-nc质粒编码)SDS-PAGE分析
M：标准蛋白质分子量(97.4、66.2、43、31、20、14.4kd)；
1：重组核酸酶5μg；
2：重组核酸酶2μg；
3：重组核酸酶1μg。
附图9、纯化重组核酸酶(pET-28a-NU-nc质粒编码)免疫印迹分析
M：标准蛋白质分子量(97.4、71.4、43、31、24.7、16.6kd)；
1：重组核酸酶2μg；
2：重组核酸酶1μg；
3：重组核酸酶0.5μg；
4：Benzonase酶0.5μg。
附图10、ELISA检测重组核酸酶含量与OD450nm的关系图
具体实施例
下面结合具体实施例进一步说明本发明，但是并非限定本发明。
实施例一 重组核酸酶基因的获得
根据文献报道(GenBank：M19495.1)的粘质沙雷菌(S.marcescens)核酸酶基因序列，进行基因表达序列优化，优化后序列见序列表1，合成20段互补的寡核苷酸，按分子克隆的常规方法，首先用T4噬菌体多核苷酸激酶37℃处理30min，磷酸化的各寡核苷酸片段以等摩尔混合，94℃变性5min，立即65℃退火10min，然后加入T4连接酶，16℃连接过夜，获得目的基因模板片段。取4个灭菌的微量离心管，加入：
Figure BSA00000879846900071
上述混合物轻轻震荡混匀后再短暂离心，然后置于14℃水浴中保温连接过夜(12～16h)。取5μl连接产物加入到50μl冰上解冻的大肠杆菌TOP10感受态细胞中，轻旋几次混匀，冰上放置30分钟。将管放入预加温到42℃的水浴中，热激90秒。然后迅速置于冰上，使细胞冷却10分钟。每管中加800μl LB培养基(不含抗生素)，37℃振荡培养1小时。室温4,000rpm离心5分钟，弃去800μl上清后，用剩余50μl培养基重悬细胞并涂布到含Amp的LB琼脂平板表面，再在平板上滴加40μl 20mg/ml X-gal、7μl200mg/ml IPTG。将平板置于室温直至液体被吸收。倒置平皿，于37℃培养，12-16小时后可出现菌落，白色菌落即为获得阳性菌落。
实施例二 N端带融合标签重组核酸酶基因的表达
设计一对引物，引物1和2分别见序列表序列2和序列3，基因5‘端引物带有Nde I酶切位点，3’端引物带有BamH I酶切位点，在0.2ml PCR微量离心管中配制25μl反应体系：
Figure BSA00000879846900072
94℃预变性5min，设置94℃1min、55℃1min、72℃2min，共30个循环，最后72℃10min。PCR结束后取10μl产物进行琼脂糖凝胶电泳，片段大小与设计的大小777bp一致，见序列表序列4，其编码的氨基酸序列见序列表序列5。
pET-22a质粒用Nde I、BamH I双酶切回收大片段，与PCR的核酸酶基因片段连接，20μL反应体系基因片段与载体大片段的比例为10∶1，加T4DNA连接酶300单位，15℃连接过夜，取10μL连接产物直接转化大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布于氨苄青霉素抗性平板，37℃培养过夜，获得工程菌进行进一步筛选。
氨苄青霉素做抗性筛选，得到阳性克隆pET-22a-NU-n。提取质粒，用限制性内切酶进行鉴定。阳性转化子用通用引物进行序列分析，结果克隆序列与设计序列完全一致。
接种阳性克隆进行培养，经0.8mmol/L的IPTG诱导，表达结果见附图1，与对照相比，重组核酸酶的表达量达到30％以上。
实施例三 C端带融合标签重组核酸酶基因的表达
设计一对引物，引物3和4分别见序列表序列6和序列7，基因5‘端引物带有Nde I酶切位点，3’端引物带有BamH I酶切位点，在0.2ml PCR微量离心管中配制25μl反应体系：
Figure BSA00000879846900081
94℃预变性5min，设置94℃1min、56℃1min、72℃2min，共30个循环，最后72℃10min。PCR结束后取10μl产物进行琼脂糖凝胶电泳，片段大小与设计的大小784bp一致，见序列表序列8，其编码的氨基酸序列见序列表序列9。
pET-11b质粒用Nde I、BamH I双酶切回收大片段，与PCR的核酸酶基因片段连接，20μL反应体系基因片段与载体大片段的比例为10∶1，加T4DNA连接酶300单位，15℃连接过夜，取10μL连接产物直接转化大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布于氨苄青霉素抗性平板，37℃培养过夜，获得工程菌进行进一步筛选。
氨苄青霉素做抗性筛选，得到阳性克隆pET-11b-NU-c。提取质粒，用限制性内切酶进行鉴定。阳性转化子用通用引物进行序列分析，结果克隆序列与设计序列完全一致。
接种阳性克隆进行培养30℃，250rpm，6个小时，经1.0mmol/L的IPTG诱导，表达结果见附图2，与对照相比，重组核酸酶的表达量达到30％以上。
实施例四 两端带融合标签重组核酸酶基因的表达
设计一对引物，引物5和6分别见序列表序列10和序列11，基因5‘端引物带有Nde I酶切位点，3’端引物带有BamH I酶切位点，在0.2ml PCR微量离心管中配制25μl反应体系：
Figure BSA00000879846900091
94℃预变性5min，设置94℃1min、58℃1min、72℃90s，共35个循环，最后72℃10min。PCR结束后取10μl产物进行琼脂糖凝胶电泳，片段大小与设计的大小811bp一致，见序列表序列12，其编码的氨基酸序列见序列表序列13。
pET-28a质粒用Nde I、BamH I双酶切回收大片段，与PCR的核酸酶基因片段连接，20μL反应体系基因片段与载体大片段的比例为10∶1，加T4DNA连接酶300单位，15℃连接过夜，取10μL连接产物直接转化大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布于氨苄青霉素抗性平板，37℃培养过夜，获得工程菌进行进一步筛选。
氨苄青霉素做抗性筛选，得到阳性克隆pET-28a-NU-nc。提取质粒，用限制性内切酶进行鉴定。阳性转化子用通用引物进行序列分析，结果克隆序列与设计序列完全一致。
接种阳性克隆进行培养，经0.5mmol/L的IPTG诱导，表达结果见附图3，与对照相比，重组核酸酶的表达量达到30％以上。
实施例五 GST融合重组核酸酶基因的表达
设计一对引物，引物7和8分别见序列表序列14和序列15，引物7带有BamH I酶切位点，引物8带有Xho I酶切位点。以重组质粒pET-22a-NU-n为模板，50μL体系扩增核酸酶基因，扩增程序为：94℃5min；94℃30s，52℃30s，72℃30s，30个循环；最后72℃延伸10min。将PCR产物切胶回收，用BamH I和Xho I同时酶切PCR纯化产物和pGEX-4T-1，酶切后切胶回收，以T4连接酶16℃连接过夜，构建表达载体pGEX-NU-GST，转化GT116，提取质粒，双酶切鉴定及测序。重组质粒的GST融合重组核酸酶编码基因序 列见序列表序列16，其编码的氨基酸序列见序列表序列17。重组表达载体pGEX-NU-GST转化到感受态大肠杆菌BL21(DE3)中。将阳性菌落过夜培养物按1％比例接种到含氨苄青霉素(Amp)100μg/mL的LB液体培养基中，37℃、250rpm培养至OD600约0.6，取2mL菌液做未诱导对照，剩余菌液添加IPTG至终浓度为1mmol/L，25℃继续培养6h，离心收集菌体，进行SDS-PAGE分析，结果见图4，目标蛋白的表达量大于30％。
实施例六 重组核酸酶的分离纯化
1、菌体培养
配制4升LB培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，pH7.0)，培养基配好后于121℃温度下湿热消毒灭菌30min。灭菌结束后待培养基冷却不烫手时于超净台中加Amp使其终浓度为100mg/L，冷却后置4℃冰箱中备用。
无菌操作条件下在平板中挑取pET-22a-NU-nc单菌落于100ml LB培养基(含Aamp)中，然后置于37℃下，180rpm摇床培养过夜。从培养过夜的种子培养物按2％接种量转接于LB培养基中，于37℃、250rpm培养4小时，培养液的OD600约为0.8，然后加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L。继续培养4小时，离心收集菌体(5,000rpm×10min)。菌体用洗涤液20mMTris-HCl，pH7.0，0.15M NaCl洗涤2-3次。
2、菌体破碎
取约10g湿菌体，按1g湿菌体加20ml破菌缓冲液(50mM Tris-HCl buffer，0.1MNaCl，pH8.5)悬浮菌体，即用200mL破菌缓冲液悬浮菌体，然后冰浴超声破碎(超声功率5000W，每次超声5s，间歇5s，即占空比50％，共进行90个循环)，收集破菌上清：10,000rpm离心10min，收集上清液。
3、产物的分离
IMAC层析柱(Chelating Sepharose Fast Flow凝胶)用蒸馏水以流速10ml/min冲洗100mL。再用平衡液(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，pH8.0)平衡5CV至流出液与平衡液电导及紫外吸收值一致。破菌上清补加NaCl使终浓度为0.5M，调pH至8.0，然后上层析柱，收集流出液。用平衡液洗涤层析柱使紫外吸收和电导均达到基线。用洗脱液(20mM Tris-HCl，0.5MNaCl，0.5M咪唑，pH8.0)进行梯度洗脱，分别用150mM咪唑和300mM咪唑进行洗脱，收集洗脱峰，层析图谱见图5。最后用100％洗脱液洗涤层析柱。层析结束后用蒸馏水冲洗层析柱后保存于20％酒精中。
4、产物的进一步纯化
将收集到的目标峰去盐后进行离子交换层析法纯化，其过程为用pH值为8.5的20mmol/L Tris.CL缓冲液稀释，使其电导率小于5mS/cm。用同样的缓冲液平衡Q柱，上样后用平衡缓冲液洗至基线，用0.01～0.5mol/LD NaCL梯度洗脱，收集目标蛋白峰，层析图谱见图6。目标蛋白补加(NH4)2SO4使终浓度为1.0-1.5mol/L，样品上1.0mol/L(NH4)2SO4，20mmol/L PB，pH7.4的缓冲液平衡的Phenyl-Sepharose Fast Flow柱，通过降低盐浓度梯度洗拖，收集目标蛋白峰，见图7的疏水层析图谱。
得到的疏水层析峰经Sephadex G-25脱盐，平衡液为20mmol/L PB，pH7.4。样品脱盐后即为精细纯化的核酸酶，15％SDS-PAGE电泳分析样品纯度，结果见图8，样品纯度达到99％以上。
实施例七 GST融合重组核酸酶基因的表达
含pGEX-NU-GST表达质粒的重组接种至LB液体培养基(含Amp，100μg/mL)，30℃摇床振荡(250rpm)培养过夜。次日按1％接种LB液体培养基中(含Amp，100μg/mL)，30℃摇床振荡(250rpm)培养至OD600＝0.5时，加入IPTG(终浓度为1mmol/L)，诱导表达5h，离心，4℃，5000rpm，20min，弃上清，收集沉淀称重。菌体用裂解液(500mmol/LNaCl，20mmol/L Tris-HCl，pH7.5)重悬菌体沉淀，超声波破碎菌体(冰上操作，15s/5s，全程15min)，破碎后于14000rpm、4℃离心20min，分别收集裂解上清和沉淀，
裂解上清使用GSTrap FF(谷胱甘肽琼脂糖树脂GlutathioneSepharose4B)柱进行亲和层析纯化，其中平衡缓冲液为PBS(140mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/LNa2HPO4，1.8mmol/L KH2PO4，pH7.3)，洗脱缓冲液(50mmol/LTris-HCl，10mmol/L还原型谷胱甘肽，pH8.0)，用大约5倍柱床容积的平衡缓冲液PBS平衡柱子，上样经0.45μm的过滤器过滤的超声裂解液的上清，再用PBS平衡洗脱杂蛋白，用5倍柱床容积的洗脱缓冲液洗脱结合在柱子上的融合蛋白，收集洗脱液。对目标蛋白进行过夜透析，透析液为凝血酶裂解液(PBS，pH7.3)，以除去还原型谷胱甘肽。Lowry法融合蛋白的浓度，根据每毫克蛋白加入10μL(10单位)的凝血酶，室温(22-25℃)孵育16h，用PBS(pH7.3)缓冲液过夜透析除去GST。然后与Glutathione Sepharose4B(按每毫升层析介质结合8mg蛋白)孵育30min，500×g离心5min，上清中为不带标签的核酸酶。
实施例八 重组核酸酶的活性分析
重组核酸酶能够将DNA消化分解为3～8b的寡核苷酸链。采用分光光度法进行酶活性测定。配制以下活性测定试剂：
溶液A：称取3.0g Tris溶解于450ml蒸馏水中，用1.0mol/L HCL调pH为8.0，定容至500ml，即为50mM Tris-HCL pH8.0的溶液。取100ml50mM Tris-HCL pH8.0，加入 20mgMgCl2，10mg BSA，完全溶解后4℃冰箱备用。
溶液B：10mg鱼精DNA用10ml溶液A溶解，鱼精DNA的浓度为1mg/ml。并经超声处理。
溶液C：0.8ml高氯酸加蒸馏水至20ml。
将纯化的带标签重组核酸酶用溶液A稀释30000倍备用。按表1依次加样，每个样品平行2管，然后置于37℃水浴中，保温15、30、45、60分钟后分别取样0.5ml，加入已含有0.5ml高氯酸溶液的小管中，混匀后置冰浴30-60分钟，然后4℃离心(10,000rpm，5分钟)，转移上清液1ml置于新的小管中，以空白管上清液调零，测定OD260nm的吸收值。
表1 酶活性测定加样表
重组核酸酶管 空白管
溶液B 2.500ml 2.500ml
酶溶液 0.125ml -
溶液A - 0.125ml
活性单位定义为37℃，30分钟，鱼精DNA吸光值A260增加1.0所需的酶量为一个活性单位(相当于完全消化37μg鱼精DNA的酶量)。
Figure BSA00000879846900121
测得的带标签重组核酸酶的活性为150U/μl。Lowry法测定的蛋白浓度为0.14mg/ml，因此酶的比活性为1.07x106U/mg。
实施例九 重组核酸酶的免疫印迹检测
配制试验所需要的溶
10×缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷58g与甘氨酸29g，加水溶液并稀释至1000ml。4℃保存。
电转膜缓冲液：取10×缓冲液100ml与甲醇200ml，加水稀释至1000ml。
TTBS缓冲液：取三羟甲基氨基甲烷6.05g与氯化钠4.5g，取聚山梨酯80 0.55ml，加适量水溶液，用盐酸调PH至7.5，加水稀释至500ml。4℃保存。
底物缓冲液：取3，3‘-二氨基联苯胺盐酸盐15mg，加甲醇5ml与30％过氧化氢15ul，加TTBS缓冲液25ml溶解，即得。临用前配制。
重组核酸酶样品先进行12.5％SDS-PAGE电泳分离，样品与阳性对照品上样量应大于100ng。取出凝胶，切去凝胶边缘，浸于电转膜缓冲液中。另取与凝胶同样大小的厚滤纸2张、垫片2张、硝酸纤维素膜1张，用电转膜缓冲液浸透。用湿转膜法进行转移：在电极板的黑片到白片上依次放上湿垫片1张、湿滤纸1张、电泳凝胶、硝酸纤维素膜1张、湿滤纸1张、湿垫片1张，盖上电极板，按0.8mA/cm2硝酸纤维素膜恒电流转移。取出硝酸纤维素膜浸入封闭液(2％牛血清白蛋白的TTBS缓冲液)4度封闭过夜(或室温封闭2h)。弃去液体。加入TTBS缓冲液20ml，摇动加入适量的重组核酸酶抗体(稀释度1∶2000)，4℃振荡结合过夜。硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液淋洗1次，再用TTBS缓冲液浸洗3次，每次8min。弃去液体，再加入TTBS缓冲液20ml，摇动加入适量的第二抗体(二抗稀释度1∶1万)，室温1h。硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液淋洗1次，再用TTBS缓冲液浸洗4次，每次8min。弃去液体，加入适量底物缓冲液，置于室温避光条件下显色10min，显色程度适当时水洗终止反应，结果见图9。
实施例十 重组核酸酶的ELISA检测
重组核酸酶一抗用包被缓冲液(0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6)稀释至终浓度分别为100μg/mL，酶标板每孔加100μL，放置于4℃包被过夜。次日倒掉样品孔中的包被液，用洗涤缓冲液(PBS，0.15M，0.05％Tween-20，pH7.4)洗涤3次(加200μL/孔)，每次洗涤后要在滤纸上扣干样品孔中的残留液体。然后每孔加入300μL封闭液(BSA0.5g/洗涤缓冲液100ml)进行封闭，于37℃放置2h。倒掉封闭液，用洗涤缓冲液洗涤样品孔2次。用稀释液将标准重组核酸酶稀释成1280、640、320、160、80、40、20pg/ml，每孔分别加100μL，然后于37℃保温2h。倒掉样品孔中的反应液，用蒸馏水将洗涤液20倍稀释后每孔200μL振荡洗涤1～3min，洗板5次，每次洗涤后要在滤纸上扣干残留液体。用稀释液将酶标抗体稀释1000倍后每孔加入100μL，然后于37℃反应1.5h。倒掉未结合的酶标抗体，每孔加入200μL稀释后的洗涤液振荡洗涤，每次1～3min，共5次。然后加入显色液置37℃，20min。每孔加入100μL终止液终止反应。将96孔板放入酶标仪中，进行读数，结果见表2。以标准品OD450nm值对核酸酶含量作图，结果见图10，进行线性回归得到公式y＝0.0012x+0.0137(R2＝0.9989)，以样品OD450nm吸收值代入公式计算样品中核酸酶的含量。
经过重组核酸酶作用的狂犬疫苗产品(酶用量10,000U/L，37℃，1小时，pH7.4)过Sepharose4B分子筛纯化后样品中重组核酸酶残留量ELISA检测结果为小于20pg/ml。
表2 ELISA分析OD450nm读数
Figure BSA00000879846900141
Figure ISA00000879847100011
Figure ISA00000879847100021
Figure ISA00000879847100031
Figure ISA00000879847100041
Figure ISA00000879847100051
Figure ISA00000879847100061
Figure ISA00000879847100071
Figure ISA00000879847100081

Claims (7)

1.一种表达重组核酸酶基因的方法，其特征在于：(1)重组核酸酶基因的获得；(2)表达载体的构建及转化大肠杆菌工程菌：将融合标签肽段的编码序列与核酸酶基因序列相连接的片段插入到表达载体质粒的酶切位点，然后转化大肠杆菌宿主菌；(3)阳性克隆的筛选、培养、诱导表达：筛选出阳性克隆在培养基上进行培养，经诱导使目标蛋白表达；(4)重组核酸酶的分离、纯化：首先将大肠杆菌菌体收集、破菌，经离心得到破菌液上清，然后对破菌液上清用层析技术纯化得到重组核酸酶；
步骤(1)所述的重组核酸酶基因序列如SEQ ID NO.1所示；
步骤(2)所述表达载体是pET系列载体质粒或载体上带有融合标签肽段编码序列的质粒载体；
步骤(3)中培养的温度控制在25℃～40℃。
2.根据权利要求1所述的一种表达重组核酸酶基因的方法，其特征在于：步骤(1)中的基因序列如SEQ ID NO.4所示。
3.根据权利要求1所述的一种表达重组核酸酶基因的方法，其特征在于：步骤(1)中的基因序列如SEQ ID NO.8所示。
4.根据权利要求1所述的一种表达重组核酸酶基因的方法，其特征在于：步骤(1)中的基因序列如SEQ ID NO.12所示。
5.根据权利要求1所述的一种表达重组核酸酶基因的方法，其特征在于：步骤(1)中的基因序列如SEQ ID NO.16所示。
6.根据权利要求1所述的一种表达重组核酸酶基因的方法，其特征在于：步骤(3)中培养的温度控制在28℃～30℃。
7.根据权利要求1所述的一种表达重组核酸酶基因的方法，其特征在于：采用亲和层析技术，凝胶颗粒上结合了能与融合标签肽段特异结合的配基，再结合离子交换层析、分子筛层析、疏水层析一种或多种方法进行纯化。
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