CN109852633A - 一种基于芽孢杆菌表达系统高效表达灵杆菌非特异性核酸酶的方法 - Google Patents
一种基于芽孢杆菌表达系统高效表达灵杆菌非特异性核酸酶的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种基于芽孢杆菌表达系统高效表达灵杆菌非特异性核酸酶的方法，其特征在于：包括以芽孢杆菌作为宿主表达体系，利用芽孢杆菌胞外分泌能力实现灵杆菌非特异性核酸酶的高效表达；本发明重组表达出的灵杆菌非特异性核酸酶，比活力是目前商业化产品的3倍，本发明选用的芽孢杆菌分泌表达系统，从根本上解决了由其他表达系统自身特性所引入的内毒素及糖基化修饰等影响酶活或限制其应用的缺陷，高效的分泌型表达无需破碎细胞，纯化步骤更为简便，可以线性放大，便于规模性生产，值得推广。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学及分子生物学领域，尤其涉及一种基于芽孢杆菌表达系统高效表达灵杆菌非特异性核酸酶的方法。
背景技术
非特异性核酸酶是一类高活性水解酶，其最大的特性是能够非特异性降解几乎所有类型的核酸，且对核酸的序列没有严格的偏好性，其中来源于灵杆菌的非特异性核酸酶(extracellular Serratia marcescens nuclease，SMNE)，是一种分泌至胞外的糖非特异性核酸内切酶，对底物特异性要求较低，能够非特异性将一切形式的核酸降解为2-4个核苷酸，因此其最典型的用途主要是重组蛋白工程纯化上游工艺中核酸的去除，降低样本粘度便于后续处理，且对于包涵体的纯化同样有利，特别是微量分析时，如ELISA、二维凝胶电泳，可消除带点核酸对所分析的蛋白样品结果的影响，从而提高各研究手段的分析精度与效率。随着分子生物学的高速发展，通过基因工程菌株进行重组表达是高效且安全获得目的蛋白最广泛的方法，然而迄今为止，目前所使用的工程菌对SMNE进行重组表达都存在一些问题：
(一)以大肠杆菌表达体系时，具体为提取灵杆菌Serratia marcescens染色体DNA并制备DNA文库，根据灵杆菌基因组DNA序列设计引物，采用PCR方法扩增出非特异性胞外核酸酶的DNA片段，并通过该技术在基因的5’端引入6个组氨酸标签序列，之后将该基因构建于分泌表达载体pET-20b上，置于lac操纵子调控之下，转化进入大肠杆菌表达菌株，如BL21(DE3)，其后通过调整IPTG浓度诱导SMNE的重组表达，表达后的纯化步骤涉及镍基质的亲和层析、离子交换层析、疏水层析、反向层析、肝素琼脂糖亲和层和凝胶分子排阻等层析纯化过程；上述过程以大肠杆菌为表达宿主，通过构建适用于大肠杆菌的分泌表达载体，实现SMNE的胞外重组表达，这是由于SMNE非特异性切割核酸的特性，对于其表达宿主细胞是毒性蛋白，一旦表达即切割宿主细胞的核酸，造成宿主细胞的死亡，因此，需要严格控制其表达的操纵子来调控其基因的表达，而目前常用的乳糖操纵子，依靠IPTG诱导其进行表达，然而由于培养基中无可避免存在乳糖类似物，易引起目的蛋白的渗漏表达，对宿主大肠杆菌依然存在潜在的致死隐患，因此由大肠杆菌所引入的内毒素问题对后续纯化分离增加了操作上的难度，另一方面，由于大肠杆菌胞外蛋白分泌能力相较于其他原核生物始终较弱，表达出的蛋白容易受到该体系分泌能力的限制，分泌量低且在胞内快速以包涵体形式存在，降低了可溶性目的蛋白的获得，而对包涵体的纯化需经过反复的变性复性过程，操作繁琐且对目的蛋白的活性有一定影响；
(二)以毕赤酵母为表达宿主重组表达SMNE，具体根据灵杆菌基因组序列设计引物，采用PCR方法扩增出非特异性胞外核酸酶整套DNA片段，包括编码的信号肽、前导肽和成熟核酸酶序列，并通过该技术在成熟核酸酶的5’端引入6个组氨酸标签序列，之后将该基因构建于分泌表达载体pPIC3.5K上，置于AOX启动子调控之下，转化进入毕赤酵母表达菌株，其后通过调整甲醇浓度诱导SMNE的重组表达；表达后的纯化步骤涉及盐析、镍基质的亲和层析、离子交换层析、肝素琼脂糖亲和层和凝胶分子排阻等层析纯化过程，该方法毕赤酵母表达体系具有真核翻译后修饰系统，表达的目的核酸酶具有糖基化现象，从而影响了核酸酶的活性及其性质，此外，启动AOX需要以甲醇作为诱导剂，其中由于甲醇的挥发性使得诱导过程中不断需要补加，操作繁琐且对环境有一定影响，同时毕赤酵母虽然能够较快达到较高的细胞密度，但在分泌蛋白的过程中由于真核体系自身的翻译后修饰分选造成发酵时间过长，通常需要78h以上，大大增加了重组SMNE获得的周期。
本专利主要提供了一种新的克隆表达重组SMNE的方法和思路，通过选择一种更为接近 SMNE来源的原核宿主芽孢杆菌作为重组表达体系，利用芽孢杆菌较强的胞外分泌能力来实现SMNE的高比活力的高效表达。
发明内容
针对上述使用大肠杆菌作为表达宿主表达时，存在大肠杆菌保外分泌蛋白能力不足，以及菌体生长受到抑制甚至死亡，操作步骤繁琐，影响蛋白的产量与降低酶的活性；以毕赤酵母作为表达宿主表达时，真核表达系统翻译后修饰影响来源于原核的SMNE活性，并且比活低于原始来源等问题，本发明的提供了一种新的重组表达方式生产制备具有高比活力的非特异性核酸酶，具体方案如下：
一种基于芽孢杆菌表达系统高效表达灵杆菌非特异性核酸酶的方法，其特征在于：包括以芽孢杆菌作为宿主表达体系，利用来源于灵杆菌的非特异性核酸酶自身来源的信号肽作为分泌表达的前导肽，通过芽孢杆菌胞外分泌能力以及分子伴侣系统实现灵杆菌的非特异性核酸酶的高效表达，具体步骤如下：
步骤1：通过人工合成或者PCR扩增获取灵杆菌非特异性核酸酶基因；
步骤2：构建灵杆菌非特异性核酸酶的组成型表达质粒；
步骤3：构建灵杆菌非特异性核酸酶的重组表达菌株；
步骤4：灵杆菌非特异性核酸酶的重组表达；
步骤5：灵杆菌非特异性核酸酶的纯化；
步骤6：灵杆菌非特异性核酸酶的活力检测。
进一步的，所述步骤1中采用PCR扩增获取灵杆菌非特异性核酸酶基因：选取菌株Serratia marcescens SM6平板培养菌落作为PCR模板，以灵杆菌非特异性核酸酶基因的5’- 端和3’-端互补序列作为PCR扩增引物，利用高保真DNA聚合酶进行扩增获取灵杆菌非特异性核酸酶基因的DNA片段。
进一步的，所述步骤2需先制备线性化的pNC载体片段，使用Hi-Fusion无缝克隆试剂盒将步骤1中获取的灵杆菌非特异性核酸酶基因DNA和制备获取的pNC载体片段连接成环状DNA，将其转入大肠杆菌JM109感受态细胞内进行培养以及碱裂解法抽取获得灵杆菌非特异性核酸酶的组成型表达质粒。
进一步的，所述步骤3将步骤2中获取的质粒通过采取电击转化法转化短短芽孢杆菌感受态细胞，在T2培养基中进行活化培养，并以硫酸新霉素的选择压力维持质粒在菌株中的保持，最终获得灵杆菌非特异性核酸酶的重组表达菌株。
进一步的，所述步骤4中灵杆菌非特异性核酸酶的重组表达，利用LB培养基，以1:5(v/v) 接种灵杆菌非特异性核酸酶的重组表达菌株培养液，在30℃摇床以200rpm摇动培养，获得灵杆菌非特异性核酸酶的重组表达。
进一步的，所述步骤5中针对重组表达的灵杆菌非特异性核酸酶的细菌，进行培养24h，接着离心收集上清液，针对上清液中含有的非特异性核酸酶可溶组分进行Ni亲和层析和阴离子交换层析纯化，获得高纯度灵杆菌非特异性核酸酶。
进一步的，所述步骤6以测活液为底物，并对步骤5中纯化获得的重组非特异性核酸内切酶进行梯度稀释进行测定，于37℃下孵育30min后终止反应，使用分光光度计检测A260 吸光值，并计算ΔA260值，同时计算比活。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果如下：
芽孢杆菌是一类具有生物安全性且有强蛋白分泌能力的革兰氏阳性菌，相较于传统的大肠杆菌表达系统，它可以持续且大量地将带有分选信号肽的蛋白分泌出胞外，本发明利用芽孢杆菌作为表达宿主，从根本上就去除了内毒素或糖基引入的可能性，进而解决了内毒素及糖基化修饰等影响酶活或限制其应用的问题，为后期重组SMNE获得后在医疗上的应用减少了上游纯化工艺的复杂性，同时由于其自身所具有的强分泌能力，在芽孢杆菌胞内有众多促蛋白折叠的分子伴侣，使蛋白在分泌前体被切除前能够形成正确的构象，从而分泌到胞外后具有正常的酶活功能，确保高比活的SMNE的高效重组表达，本发明制备产品的比活力是目前商业化产品的3倍；本发明使用组成型表达质粒，简化了发酵步骤，高效的分泌型表达无需破碎细胞，纯化步骤更为简便，纯化方式可以线性放大，适用于规模化生产，具有更高的经济效益，值得推广。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例技术描述中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为pNC-SMNE的载体图谱。
图2为SMNE重组表达粗酶活检测；其中泳道2为对照λDNA，3为上清粗酶液消化条带。
图3为Toyopearl-650M-AFC-Ni+亲和层析SDS-PAGE结果。
图4为Toyopearl-650M-AEC-Q离子交换层析SDS-PAGE纯化结果。
图5为SMNE酶活测量折线图。
图6为SMNE与商业化Benzonase比活力对照。
图7为在不同温度下重组SMNE对细胞破碎液的消化能力。
图8为在不同温度下商业化Benzonase对细胞破碎液的消化能力。
序列表为使用灵杆菌非特异性核酸酶基因的特异性引物进行PCR扩增获得灵杆菌非特异性核酸酶的基因。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
为了达到本发明的目的，如图1-图8所示，一种基于芽孢杆菌表达系统高效表达高比活力的灵杆菌非特异性核酸酶，包括以芽孢杆菌作为宿主表达体系，利用芽孢杆菌胞外分泌能力实现灵杆菌的非特异性核酸酶的高比活力的高效表达。
(一)灵杆菌非特异性核酸基因的获取：
本发明从菌株Serratia marcescens SM6的基因组中使用灵杆菌非特异性核酸酶基因的特
异性引物进行PCR扩增获得灵杆菌非特异性核酸酶的基因(序列表)，具体操作为：以菌株Serratia marcescens SM6平板培养菌落以去离子水重悬后，95℃温育10min，作为PCR 模板，以灵杆菌非特异性核酸酶基因的5’-端序列(上游引物)及3’-端反向互补序列(下游引物)作为引物，采用高保真DNA聚合酶进行特异性扩增灵杆菌非特异性核酸酶的基因，位于上游引物添加了载体pNC上游同源序列，位于下游引物的添加载体pNC下游同源序列，进而有利于通过无缝克隆的方法插入载体；通过标准PCR反应流程进行，获取理论值大小一致的灵杆菌非特异性核酸酶基因的DNA片段。
(二)构建灵杆菌非特异性核酸酶的组成型表达质粒：
本发明在获得灵杆菌非特异性核酸酶基因后，将该基因连同组成型表达元件以无缝克隆的方式插入质粒载体pNC上，连接产物转化进入大肠杆菌，扩增后提取质粒，获得了灵杆菌非特异性核酸酶的组成型表达质粒，具体操作为：pNC质粒以HindIII与XbaI限制酶双酶切后，再以碱性磷酸酶AP进行去磷酸化处理，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收线性化的pNC载体片段，溶于TE Buffer中，使用Hi-Fusion无缝克隆试剂盒将经PCR扩增得到的SMNE基因DNA与线性化的pNC载体片段连接成环状DNA并使用化学转化法转化进入大肠杆菌JM109感受态细胞中，经细胞培养以及碱裂解法抽提质粒，获得了SMNE的组成型表达质粒，命名为pNC-HisT-SMNE，如图1所示。
其中质粒上的灵杆菌非特异性核酸酶基因处于细胞壁蛋白P2启动子的调控之下，所表达的SMNE带有N-端6xHis纯化标签与分泌表达信号肽，该质粒序列的正确性经测序确认无误。
(三)构建灵杆菌非特异性核酸酶的重组表达菌株：
将SMNE的组成型表达质粒转化进入芽孢杆菌表达菌株，成功将其构建成为SMNE的重组表达菌株，具体操作为：将测序正确的质粒pNC-HisT-SMNE以电击转化法(Eppendorf电转仪；1.5KV，1cm Bio-Rad电转杯)转化短短芽孢杆菌(Brevibacillusbrevis)感受态细胞，对获得的转化进行菌落PCR验证后，对阳性转化子在T2培养基中进行活化培养，并以硫酸新霉素的选择压力维持质粒在菌株中的持续保持，最终获得了SMNE的重组表达菌株。
(四)灵杆菌非特异性核酸酶的重组表达：
含有pNC-HisT-SMNE重组质粒的的表达菌株经扩大培养后，获得了SMNE的重组表达，并确认了细菌蛋白粗提液具有SMNE的活性，具体操作为：在LB培养基中，以1:50(v/v)接种灵杆菌非特异性核酸酶的重组表达菌株培养液后，在30℃摇床以200rpm摇动培养24h，获得灵杆菌非特异性核酸酶的重组表达。
重组表达获取的灵杆菌非特异性核酸酶需进行活性检测，具体操作为：取1ml诱导后的培养液，以12000g离心1min收集上清液，取1μl清液，在1×reaction buffer(50mMTris-HCl， 1mM MgCl2，0.1mg/ml BSA)缓冲条件下、50μl反应体系中，与底物λDNA在37℃温育 5min，然后使用1％琼脂糖凝胶电泳检测底物λDNA被蛋白上清液消化的情况，并使用无转化质粒的空菌株作为负对照，结果显示，底物λDNA被蛋白清液消化完全，表明上清液具有SMNE的活性，其重组表达成功，如图2所示。
(五)灵杆菌非特异性核酸酶的纯化：
重组表达灵杆菌非特异性核酸酶的细菌经过24h培养后，离心收集上清液，上清液中含有灵杆菌非特异性核酸酶的可溶组分经过Ni亲和层析和阴离子交换层析纯化，获得了高纯度灵杆菌非特异性核酸酶，具体操作为：菌培养液以8500g离心30min收集上清液，含有重组 SMNE的上清液经过Ni亲和层析纯化(Toyopearl AF-Chelate-650M)，如图3所示；Ni亲和层析过程中使用的缓冲液为：平衡buffer(1xPBS)；漂洗buffer(1xPBS，20mMimidazole)；洗脱buffer(1xPBS，200mM imidazole)；重组SMNE被洗脱下来后，再经过阴离子交换层析 (Toyopearl AEC-650M)，如图4所示；阴离子交换层析过程中使用的缓冲液为：平衡buffer- (1xPBS)；漂洗buffer-(1xPBS)；洗脱buffer-(1xPBS，50-150mM NaCl)；收集流川液透析至贮存缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.0，2mM MgCl2，20mM NaCl，50％glycerol)，保存于-20℃；上述整个纯化过程在4℃或冰浴中进行。
经SDS-PAGE电泳分析及Image J软件比对，并通过NanoDrop微量分光光度计(ThermoFisher)浓度检测，最终纯化获得的重组SMNE纯度为90％，浓度为0.08mg/ml，产率为10mg/L。
(六)灵杆菌非特异性核酸酶的活力检测：
灵杆菌非特异性核酸酶可以将一切核酸降解为2～4bp的寡核苷酸，这些寡核苷酸的产生，由于摩尔吸光系数的改变会使260nm处的吸光度值增加。以测活液(50mmol/LTris-HCl(pH 8.0)，1mmol/L MgCl2，0.1mg/ml BSA，1mg/ml鲑鱼精DNA)为底物，对纯化获得的重组SMNE进行梯度稀释(用50mM Tris-HCl pH 8.0，2mM MgCl2，20mM NaCl，50％glycerol)进行测定，于37℃下孵育30min后，用4％冰镇的高氯酸溶液终止反应，使用分光光度计检A260吸光值，并计算ΔA260值；以最适条件和过量底物存在的条件下，在260nm 波长处每30min能引起吸光度变化1.0的酶量定义为1个活性单位(U)，按下式计算比活：
比活(U/mg)＝活性(U/μl)蛋白浓度(mg/μl)
对纯化所得的重组SMNE进行梯度稀释，使用上述所述方法检测不同酶量下的A260值变化，通过减除空白对照的吸光值后绘制曲线，如图5所示，结果显示，纯化获得的灵杆菌非特异性核酸酶具有良好的核酸酶活力，比活力为1.3×107U/mg，与目前市场上商品化的Benzonase比活力(3.56×106U/mg)的比活里相比较有显著提高，如图6所示。
灵杆菌非特异性核酸酶具有较为广泛的应用条件，在实际应用过程复杂的反应环境会对其消化能力产生一定影响，因此设计实验检测其在实际情况下对底物的消化情况，将其稀释至与商业化Benzonase同样活性值后，对以PBS作为缓冲液进行破碎的大肠杆菌为底物，在不同温度下孵育30min，通过1％的琼脂糖凝胶检测。结果表明，纯化获得的重组SMNE与商业化Benzonase有相同的应用范围，如图7-8所示。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 淮海工学院，江苏愚公生命科技有限公司
<120> 一种基于芽孢杆菌表达系统高效表达灵杆菌非特异性核酸酶的方法
<130> czg2019032001
<141> 2019-03-20
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 741
<212> DNA
<213> 灵杆菌(Serratia marcescens)
<400> 1
atggacacgc tcgaatccat cgacaactgc gcggtcggct gcccgaccgg cggcagcagc 60
aacgtgtcta tcgtgcgtca tgcttatacg ttgaacaaca acagcaccac caagttcgcc 120
aactgggtgg cttatcacat caccaaagac accccggcca gcggcaagac gcgcaactgg 180
aaaaccgatc cggcgctcaa cccggcggac acgttggcgc cggccgatta cactggcgcc 240
aacgcggcgc tgaaggtcga tcgcggtcat caggcgccgc tggcctcgct ggcgggcgtc 300
tccgactggg aatcgctgaa ttacctgtcc aacatcacgc cgcaaaagtc cgatcttaac 360
cagggcgcct gggcgcgcct ggaagatcag gaacgcaagc tgatcgatcg cgccgatatc 420
tcctcggtct ataccgtgac cggcccgctg tatgaacgcg atatgggcaa actgccgggc 480
acccagaaag cgcacaccat cccgagcgcc tactggaagg tgattttcat caacaacagc 540
ccggcggtga accgctatgc tgctttcctg ttcgatcaga acacgccgaa gggcgccgat 600
ttctgccaat tccgcgtgac ggtggacgag atcgagaaac gcaccggcct gatcatctgg 660
gccggtctgc cggacgacgt gcaggcttcg ctgaagagca aaccgggcgt cctgccggag 720
ctcatgggct gcaaaaacta a 741
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggatccgtcg atctagacat ggacacgctc gaatcc 36
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cactataatg ccgaagcttt tagtttttgc agcccatg 38
Claims (7)
1.一种基于芽孢杆菌表达系统高效表达灵杆菌非特异性核酸酶的方法，其特征在于：包括以芽孢杆菌作为宿主表达体系，利用芽孢杆菌胞外分泌能力实现灵杆菌的非特异性核酸酶的高效表达，具体步骤如下：
步骤1：通过人工合成或者PCR扩增获取灵杆菌非特异性核酸酶基因；
步骤2：构建灵杆菌非特异性核酸酶的组成型表达质粒；
步骤3：构建灵杆菌非特异性核酸酶的重组表达菌株；
步骤4：灵杆菌非特异性核酸酶的重组表达；
步骤5：灵杆菌非特异性核酸酶的纯化；
步骤6：灵杆菌非特异性核酸酶的活力检测。
2.根据权利要求1所述的一种基于芽孢杆菌表达系统高效表达灵杆菌非特异性核酸酶的方法，其特征在于：
所述步骤1中采用PCR扩增获取灵杆菌非特异性核酸酶基因：选取菌株Serratia marcescens SM6平板培养菌落作为PCR模板，以灵杆菌非特异性核酸酶基因的5’-端和3’-端互补序列作为PCR扩增引物，利用高保真DNA聚合酶进行扩增获取灵杆菌非特异性核酸酶基因的DNA片段。
3.根据权利要求1所述的一种基于芽孢杆菌表达系统高效表达灵杆菌非特异性核酸酶的方法，其特征在于：
所述步骤2表达质粒骨架为pNC，通过酶切连接或无缝克隆的方式在其中插入SMNE编码基因和多聚组氨酸标签。
4.根据权利要求1所述的一种基于芽孢杆菌表达系统高效表达灵杆菌非特异性核酸酶的方法，其特征在于：
所述步骤3将步骤2中获取的质粒转入大肠杆菌感受态细胞内进行培养扩增，然后抽提质粒，通过点击转化法转入短短芽孢杆菌感受态细胞，活化培养后获得灵杆菌非特异性核酸酶的重组表达菌株。
5.根据权利要求1所述的一种基于芽孢杆菌表达系统高效表达灵杆菌非特异性核酸酶的方法，其特征在于：
所述步骤4中灵杆菌非特异性核酸酶的重组表达，利用LB培养基接种灵杆菌非特异性核酸酶的重组表达菌株培养液，在30℃摇床以200rpm摇动培养，获得灵杆菌非特异性核酸酶的重组表达。
6.根据权利要求1所述的一种基于芽孢杆菌表达系统高效表达灵杆菌非特异性核酸酶的方法，其特征在于：
所述步骤5中灵杆菌非特异性核酸酶的纯化，将灵杆菌非特异性核酸酶的重组表达菌株培养24h，接着离心收集上清液，针对上清液中含有的非特异性核酸酶可溶组分进行Ni亲和层析和阴离子交换层析纯化，获得高纯度灵杆菌非特异性核酸酶。
7.根据权利要求1所述的一种基于芽孢杆菌表达系统高效表达灵杆菌非特异性核酸酶的方法，其特征在于：
所述步骤6以测活液为底物，并对步骤5中纯化获得的重组非特异性核酸内切酶进行梯度稀释进行测定，并计算比活。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190607 |
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