NO841130L

NO841130L - Ledersekvens for aa fremme sekresjon av genprodukter

Info

Publication number: NO841130L
Application number: NO841130A
Authority: NO
Inventors: Anthony Atkinson; Nigel Peter Minton; Roger Franklin Sherwood
Original assignee: Health Lab Service Board
Priority date: 1983-03-28
Filing date: 1984-03-22
Publication date: 1984-10-01
Also published as: DE3468434D1; GB8308483D0; DK167584D0; JPS6054686A; EP0121352B1; DK167584A; EP0121352A1

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører fragmenter av spesifikke deoksyribonukleotide-sekvenser som fremmer sekresjon av genprodukter fra celler og vedrører spesielt rekombinante DNA overførings-vektorer i hvilke overførings-vektorer, f.eks. plasmider, bringes til å inneholde eksogen DNA. I enkelte tilfeller inneholder rekombinanten heterolog DNA som koder for polypeptider som ikke ordinært frembringes av organismen som kan underkastes omdannelse av den rekombinante bærer.

I prinsippet innbefatter en fremgangsmåte for å meddele en mikroorganisme evne til å syntetesere et nytt;protein tre generelle trinn: (a) isolering og rensing av det spesifikke gen eller nuk-leotidsekvenser som inneholder den genetisk kodene informasjon for aminosyresekvensen i detønskede protein eller polypeptid, (b) rekombinasjon av det isolerte gen eller nukleotidsekvensen med en passende overførings-vektor, typisk DNA av en bakteriofag eller plasmid til å danne en rekombinant overføringsvektor som delvis koder for produk-sjon av det ønskede protein eller polypeptid, og (c) overføring av vektoren til den passende mikroorganisme og seleksjon av en stamme av mottager-mikroorganismen inneholdende denønskede genetiske informasjon.

Hvis genet eller nukleotidsekvensen uttrykker sitt protein eller polypeptid i den valgte mikroorganisme bør da dyrking av mikroorganismen frembringe det ønskede protein eller polypeptid i betydelige mengder.

Når en gang mikroorganismen er blitt dyrket må proteinet eller polypeptidet isoleres fra de uønskede materialer. Dette trinn lettes vesentlig hvis hovedandelen av det øn skede protein eller polypeptid er tilstede i dyrkingsmediet og/eller det periplasmatiske rom i mikroorganismen. Med andre ord kan rensing gjennomføres på en mer effektiv måte hvis proteinet eller polypeptidet når det en gang er uttrykt, passerer gjennom cellemembranet og ut av cytoplasmaet.

Passeringen av proteinet eller .polypeptidet gjennom cellemembranet er ønskelig av to vesentlige grunner. For det første vil det ønskede protein eller polypeptid generelt være fremmed for den mikroorganisme hvori det uttrykkes. I mange tilfeller vil det derfor hurtig brytes ned av proteo-lytiske enzymer etc. i cellecytoplasmaet og vil deretter ha en kort halveringstid inne i cellen. Ved å overføre proteinet eller polypeptidet ut av cytoplasmaet hurtig etter uttrykkingen vil stabiliteten av proteinet eller polypeptidet økes sterkt. For det annet vil antallet av uønskede genetiske materialer og produkter (hvorfra det ønskede protein eller polypeptid må isoleres) være langt større i cellens cytoplasma enn i dyrkingsmediet og/ eller i cellens periplasmatiske rom. Det kan sees at for begge disse forhold vil overføringen av proteinet eller polypeptidet gjennom cellemembranet og ut av cytoplasmaet i sterk grad lette isoleringen av proteinet eller polypeptidet.

En måte hvorpå sekresjon av genproduktet fra cellens cytoplasma kan fremmes er inne i cytoplasmaet og frembringe et preprotein eller prepolypeptid hvori det ønskede polyprote-in eller polypeptid foregås av et signal-polypeptid. Det overveiende hydrofobe signal-polypeptid dirigerer det ønskede protein eller polypeptid til cellens periplasmatiske rom hvor signal-peptidet fjernes ettersom det ønskede protein eller polypeptid passerer gjennom cellemembranet.

Mange av de kjente signal-peptider inneholder cystein-rester. Disse rester er funnet å reagere i cellemembranet og derved inhibere den effektive overføring av det ønskede

genprodukt ut av cellen.

Det er et primært formål for den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe rekombinante DNA overførings-vektorer inneholdende et ledersekvens-polynukleotid som koder for et signal-peptid som er cysteinfritt. Andre formål og fordel-er ved den foreliggende oppfinnelse vil fremgå av den etterfølgende beskrivelse av oppfinnelsen.

I samsvar med oppfinnelsen tilveiebringes en rekombinant DNA overførings-vektor omfattende et ledersekvens-polynukleotid som koder for signal-polypeptid med formel I,

Overføringsvektoren kan være en bakteriofag eller foretrukket et plasmid.

Foretrukket er hovedandelen av kodonene i nukleotidsekvensen dem som foretrekkes for å uttrykke mikrobiale genomer. Passende kodoner er angitt i UK 1.568.047 og UK 2007675A og i sammenheng med oppfinnelsen vises til disse publikasjon-er .

Ved en foretrukket utførelsesform av den foreliggende over-førings-vektor har nukleotidsekvensen formel II

Nukleotidsekvensen som koder for signal-polypeptidet (ledersekvens-polynukleotidet) vil foretrukket foreligge nedstrøms fra og i lesefase med en bakterial eller en gjær-promoter og et prokaryotisk ribosom-bindesete i overførings-vektoren. Videre vil ledersekvens-polynukleotidet enten befinne seg oppstrøms fra et innskudds-sete for et strukturelt gen eller foretrukket befinne seg oppstrøms fra og i lesefase med et strukturelt gen som koder for et ønsket protein eller polypeptid. Foretrukket koder genet for et eukaryotisk, -foretrukket et mammalt protein eller polypeptid.

Det strukturelle gen kan f.eks. kode for slike eukaryotiske proteiner som humant veksthormon, humant insulin eller humant chorionisk somåtomammotropin. Alternativt kan det kode for slike prokaryotiske proteiner som E.coli ^-galaktosidase eller Pseudomonas karboksypeptidase G2

(CPG2) (karboksypeptidase G_ er et enzym som fremstil-

les av Pseudomonas species stamme RS-16 som har anvendelse ved cancer-kjemoterapi. Det er en Zn^<+>holdig dimer med 2 x 42.000 dalton og har høye affiniteter (Km verdier på IO<->"<*>eller 10~^M) for både 5-metyltetrahydrofolat som

er den overveiende kretsløpform av folat i pattedyr og for folinsyreantagonisten "methotrexat" (MTX) som anvendes hyppig i cancer-kjemoterapi. Enzymet kan anvendes direkte for plasma-deplesjon av reduserte folater, hovedsakelig som ko-faktorer i purin og spesielt i pyrimidin-biosyntese. CPG2er vist å inhibere utvikling av Walker 256 carcinom in vivo og å fjerne MTX fra sirkulasjon i pasienter hvor langvarig eksponering for høye doser av MTX fører til gift-virkning .

Eksempler på overførings-vektorer i samsvar med oppfinnelsen som koder for CPG2er pNMl, pNMlll, pNMl4, pNM21, pNM22, pNM31, pNM32 og pLEC3.

Promoteren er foretrukket en høy-uttrykk bakterial eller gjaer-promoter for det strukturelle gen i en rekke verter. Det spesielle valg av promoter vil avhenge av den mikroorganisme som skal omdannes. F.eks. vil omdannelsen av E.coli generelt påvirkes av en overførings-vektor hvori en E.coli promoter styrer uttrykket av det strukturelle gen. Eksempler på E.coli promotere er dem som forekommer i plasmidene pBR 322 og pAT 153. I motsetning hertil vil omdannelsen av Pseudomonas species generelt påvirkes av en overf(zirings-vektor hvori en Pseudomonas promoter styrer uttrykkingen av det strukturelle gen. Eksempler på Pseudomonas promotere er dem som forekommer i plasmidet pKT 230 eller Pseudomonas kromosom<a>l DNA.

For å uttrykke det strukturelle gen omdannes den foreliggende overførings-vektor i en passende mikroorganisme. I oppfinnelsens sammenheng kan det således tilveiebringes en mikroorganisme som er omdannet ved hjelp av en rekombinant DNA overførings-vektor i samsvar med oppfinnelsen. Mikroorganismen er foretrukket en bakterie eller gjær hvori høyt uttrykk av det strukturelle gen, innenfor overførings-vektoren, forekommer. I avhengighet av valget av promoter kan mikroorganismen være en stamme valgt fra en av de følg-ende bakterier E.coli, Pseudomonas og Bacillus eller gjæren Saccharomyces cerevisiae.

Etter å ha omdannet mikroorganismen kan så proteinet eller polypeptidet som det strukturelle gen koder for, deretter uttrykkes ved å dyrke den omdannede mikroorganisme i et dyrkingsmedium. Det er den primære fordel ved den foreliggende oppfinnelse at dyrking av den omdannede mikroorganisme tilveiebringer et preprotein eller prepolypeptid hvori det ønskede protein eller polypeptid foregås av det foreliggende signal-polypeptid. Dette betyr at hurtig etter uttrykkingen dirigerer signal-polypeptidet detønskede protein eller polypeptid til cellens periplasmatiske rom hvor signal-polypeptidet fjernes ettersom det ønskede protein eller polypeptid passerer gjennom cellemembranet. Da det foreliggende signal-polypeptid er fritt for cystein-rester vil detønskede genprodukt effektivt bli utskilt gjennom membranet.

De foreliggende overførings-vektorer kan fremstilles ved hjelp av hvilke som helst av de metodene som er velkjent innenfor rekombinant DNA teknikk. F.eks. kan ledersekvens-polynukleotidet synteteseres ved hjelp av den modifiserte triestermetode til K. Itakura et al, JACS, 1975, 97, 7327 eller ved hjelp av den forbedrede oligodeoksynukleotid-fremstilling som er beskrevet i UK 2007675A. Det vises således i oppfinnelsens sammenheng til begge disse publika-sjoner. Det syntetiserte polynukleotid kan så innføres i en overførings-vektor, foretrukket et plasmid. I overfør-ings-vektoren vil det foretrukket foreligge nedstrøms fra og i lesefase med en bakteriell eller en gjær-promoter og et prokaryotisk ribosom-bindesete. Ledersekvens-polynukleotidet bør altså være enten oppstrøms fra et strukturelt'gen-innskuddssete eller oppstrøms fra og i lesefase med et strukturelt gen.

Alternativt kan DNA fragmenter som inneholder ledersekvens-polynukleotidet oppnås fra 'naturlig kilde, spesielt fra den kromosomale DNA av Pseudomonas species stamme RS-16. I dette spesielle tilfelle foregår et polynukleotid (formel II ovenfor) som koder for det foreliggende signal-polypeptid umiddelbart et strukturelt gen som koder for SPG2.

Et antall av DNA fragmentene inneholdende dette ledersekvens-polynukleotid kan derfor gjenkjennes på grunn av deres evne til ved innføring i et plasmid og omdannelse av en mikroorganisme ved hjelp av den resulterende rekombinant-vektor, til å muliggjøre at en mikroorganisme vokser på folat. Eksempler på slike rekombinante overførings-vektorer som inneholder både et polynukleotid som koder for det foreliggende signal-polypeptid (formel II ovenfor) og et strukturelt gen som koder for CPG2, er pNMl, pNMlll, pNMl4, pNM21, pNM22, pNM31, pNM32 og pLEC3. Selvfølgelig, når en gang en Fol<+>rekombinant vektor er oppnådd på

denne måte kan den subklones til å gi alternative vektorer (enten Fol<+>eller Fol") som også inneholder et polynukleotid som koder for det foreliggende signal-polypeptid.

Når et passende DNA fragment er blitt isolert kan det inn-føres i en overførings-vektor, foretrukket et plasmid. I overførings-vektoren bør ledersekvens-polynukleotidet på det innskutte fragment være nedstrøms fra og i lesefase med en bakteriell eller en gjær-promoter og et prokaryotisk ribosom-bandesete. Ledersekvens-polynuklerotidet bør også være enten oppstrøms fra et strukturelt gen-innskuddssete eller oppstrøms fra og i lesefase med et strukturelt gen.

Det strukturelle gen for innføring nedstrøms fra og i lesefase med det foreliggende ledersekvens-polynukleotid kan f.eks. oppnås ved hjelp av de syntetiske metoder som er nevnt tidligere (dette er særlig nyttig for fremstilling av gener som koder for små proteiner, som f.eks. humant veksthormon, insulin og humant chorionisk somatomammotropin). Alternativt kan det strukturelle gen fremstilles fra m=RNAved bruk av enzymet revers transkriptase eller kan isoleres fra naturlige kilder (kromosomal DNA).

Et eksempel på den siste metode er isolering av DNA fragmentene inneholdene en polynukleotidsekvens (vist i tabell 1) som koder for enzymet CPG2(aminosyresekvens også vist i tabell 1) fra Pseudomonas species stamme RS-16 kromosomal DNA. Eksempler på plasmider inneholdende et CPG2strukturelt gen, såvel som et polynukleotid som koder for det foreliggende signal-polypeptid (formel II ovenfor) er pNMl, pNMlll, pNM14, pNM21, pNM22, pNM31, pNM32 og pLEC3.

Etter fremstilling eller isolering innføres ledersekvens-polynukleotidet og det strukturelle gen i en overførings-vektor, foretrukket et plasmid, til å danne en rekombinant DNA overførings-vektor i samsvar med den foreliggende oppfinnelse. Innføringstrinnet eller trinnene vil foretrukket gjennomføres ved hjelp av en av de velkjente metoder på om-rådet som anvender restriksjons-endonukleaser, se f.eks. metodene drøftet i UK 2090600A som det vises til i oppfinnelsens sammenheng. Valget av overførings-vektor vil bli bestemt av den mikroorganisme hvori ledersekvens-polynukleotidet og det strukturelle gen skal uttrykkes. Generelt vil overførings-vektoren være en kloningsbærer som er egnet for omdannelse av de valgte mikroorganismer og som fremvis-er en fenotypisk egenskap, som f.eks. antibiotisk resi-stens, som de rekombinante overførings-vektorer kan utvelg-es med. Hvis mikroorganismen således er E-coli vil passende overførings-vektorer da være E.coli plasmidene pBR322 og pATl53. Hvis alternativt mikroorganismen er Pseudomonas, vil da en passende overførings-vektor være Pseudomonas pkT230.

De foreliggende rekombinante DNA overførings-vektorer, mikroorganismer omdannet ved hjelp av de foreliggende rekombinante DNA overførings-vektorer og fremgangsmåter for fremstilling av disse vektorer og mikroorganismer skal nå beskrives ved hjelp av eksempler med spesiell henvisning til figurene hvori: Fig. 1 er et restriksjonsenzym spaltningssete-kart av pNMl, Fig. 2 er et restriksjonsenzym spaltningssete-kart av

pNMlll,

Fig. 3 er et restriksjonsenzym spaltningssete-kart av

pNM14,

Fig. 4 er et restriksjonsenzym spaltningssete-kart av

pNM21,

Fig. 5 er et restriksjonsenzym spaltningssete-kart av

pNM22, og

Fig. 6 illustrerer fremgangsmåten for fremstilling av et-rekombinant plasmid inneholdende både det foreliggende ledersekvens-polynulkeotid og det ^-galaktosidase strukturelle gen, og Fig. 7 er et restriksjonsenzym spaltningssete-kart av pLEC3.

Vedr. til tabell 1:

Aminosyrene 1 til 22 er det foreliggende signal-polypeptid.

Aminosyrene 23-415 er det CPG2strukturelle gen.

NB. Ledersekvens-polynukleotidet er det foretrukne polynukleotid med formel II.

Materialer og metoder

Bakteristammer og plasmider

De anvendte bakteriestammer var Escherichia coli W5445 ( pro leu thi thr° sup E44 lac Y ton A r- m~ Str<r>), Pseudomonas putida 2440 (r~) og Pseudomonas sp stamme RS-16.

De anvendte plasmider var p'BR 322 (F Bolivar et al Gene, 1977, 2, 95), pAT153 (A J Twigg et al, Nature, 1980, 283, 216) og pKT230 (M Bagdasarin et al, Gene 1981, 16, 237) og pROG5 (R.F. Sherwood et al, The Molecular Biology of Yeast, 1979, Cold Spring Harbor Publications).

Medier og dyrkingsbetingelser

E.coli ble rutinemessig dyrket i L-næringsvæske (1% trypton, 0,5% gjærekstrakt, 0,5% NaCl). Størket medium (L-agar) besto av L-næringsvæske med tilsetning av 2%

(vekt/volum) agar (Bacto-Difco). Antibiotiske konsentra-sjoner anvendt for seleksjon av transformanter var 50^ug/ ml ampicillin, 15^ug/ml tetrasyklin og 30^,ug/ml kana-mycin. I tilfellet av E.coli ble disse gjennomført i 2YT flytende medium (1,6% trypton, 1% gjærekstrakt, 0,5% NaCl) inneholdende 1% glukose og 0,05% folat når dette passet. Pseudomonadene ble dyrket i en minimal saltoppløsning be-stående av pr. liter: MgS04, 0,05g; CaCl2, 2H20,

0,05g; FeS04.7H20, 0,005g; MnS04, 0,0015 g;

Na2Mbo4, 2H20, 0,0015g; KH2P04; 5g; K2HPC>4.

3H20, 12g; glutamat 10g. Minimalmediet anvendt for E.coli var M9 medium (J Miller, Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1972).

Rensing av DNA

Plasmider ble renset fra kloramfenicol-forsterkede kulturer (D B Clewell, J Bacteriol, 1972, 110, 667) ved hjelp av Brij-lysis (D B Clewell et al, Proe Nati Acad Sei, USA, 1969, 62, 1159) og etterfølgende cæsiumklorid-etidium bromid densitets-gradient sentrifugering (A C<p>lman et al, Eur.J. Biochem, 1978, 91, 303). En hurtig, liten skala-plasmidisoleringsteknikk (Burnboim et al, Nuc.Acids Res, i979, 7, 1513) ble også anvendt for seleksjonsformål. Kromosomal DNA fra donor Pseudomonad-stammen (RS-16) ble fremstilt hovedsakelig som 'beskrevet av J Marmar, J.Moi. Biol, 1961, 3, 208.

Restreksjons-, ligerings og omdannelses- metoder

Restreksjons-endonukleaser og DNA-ligase ble erholdt fra Bethesda Research Laboratories og anvendt i bufferne og under betingelsene anbefalt av leverandøren. Omdannelse av E.coli var hovedsakelig som beskrevet av S N Cohen et al, Proe.Nati.Acad.Sei., USA, 1972, 69, 2110, mens Ps-putida ble omdannet ved metoden til M Bagdasarian og K N Timmis, Current Topics in Microbiology and Immunology, utgitt av P H HofSchneider og W Goebel, Springer Verlag, Berlin, 1981, side 47.

Agarosege1- elektroforese

Prøver ble elektroforesebehandlet i 0,8% agarose-blokkgeler (10 cm x 20 cm x 0,5 cm) på et standard vertikalt system (Raven), under anvendelse av Tris-borat-EDTA buffer. Elek troforese av ubehandlet DNA var ved 125V, 50 mA i 3 timer mens behandlet DNA ble elektroforesebehandlet ved 15V, 10 mA i 16 timer. Fragmentstørrelser ble bedømt ved sammen-ligning med fragmenter av Ts DNA behandlet med Hindlll og

A DNA-fraksjon med både Hind III og EcoRI. Fragmenter ble isolert fra geler under anvendelse av elektroeluering (M W McDONNELL et al, Proe.Nat1.Acad.Sei., USA, 1977, 74, 4835).

Bestemmelse av karboksypeptidase G., aktivitet

Bakterier ble dyrket i 1 liters porsjonskultur og 100 ml prøver tatt ved forskjellige trinn i voksefasén. Prøver ble avkjølt på is, sentrifugert ved 13.000 x g i 10 min. og resuspendert og frosset i 5 ml 0,1 M Tris HC1, pH 7,3 under anvendelse av 0,2 mM ZnSO^. Cellene ble revet opp under anvendelse av en MSE Ultrasonic Disintegrator (150 W) med medium frekvens, amplityde 2, for tre 30 sekunders perioder på is. Celleavfall ble fjernet ved sentrifugering ved 10.000 x g i 5 min. CPG2aktivitet ble bestemt etter J L McCullough et al, J.Biol.Chem, 1971, 246, 7207. En 1 ml reaksjons-kyvette inneholder 0,9 ml 0,1 M Tris-HCl, pH 7,3 pluss 0,2 mM ZnS04 og 0,1 ml av 0,6 mM "methotrexat" ble ekvilibrert ved 37°C. Enzymekstrakt ble tilsatt til test— kyvetten og nedsettelsen i absorsjon ved 320 nm mot under anvendelse av et Pye-Unicam SP1800 dobbelt-stråle spektro-fotometer. Enzymaktivitet pr. ml ekstrakt ble beregnet som

A 320 nm absorpsjon/min. delt med 8,3 som er ekvivalent med hydrolyse av 1^umol MTX/min ved 37°C. Proteinkon-sentrasjonen ble bestemt ved hjelp av metoden til M M Bradford, Anal Biochem, 1976, 72, 248.

Cellefraksjoneringsteknikk

Bakteriekulturer ble dyrket i 1avfosfat-mediet til H C Neu og L A Heppel, (J Biol Chem, 1964, 240, 3685) supplert med 100^ug/ml ampicillin, til en Od45q = 1,0. 40 ml kul-

tur ble sentrifugert ved 5000 g i 10 min., vasket i 5 ml 10

mM Tris-HCl pH 7,0 og resuspendert i 0,9 ml 0,58 M sukrose, 0,2 mM DTT, 30 mM Tris HC1 pH 8,0. Omdannelse til sferoplaster ble oppnådd ved tilsetning av 20^ul lysozym (2 mg/ml), 40^ul 0,1 M EDTA og inkubering ved 23°C i 10

min. (HC Neu et al, J Biol Chem, 1964, 239, 3893). Sferoplastene ble anbragt på is og 0,1 ml av 30% (vekt/volum) BSA tilsatt, etterfulgt av 5 ml. sukrosetrisbuffer. Sedi-mentering, av sferoplastene ble oppnådd ved sentrifugering ved 5000 g i 10 min og supernatanten tilbakeholdt som den "periplasmatiske" fraksjon. Pelleten ble resuspendert i 5 ml 10 mM Tris-HCl, 0,2 mM DTT pH 7,0 og ultralydbehandlet ved 20 Kc/sek., 2 Amp i 15 sek. Resterende hele celler ble fjernet ved sentrifugering ved 1000 x g i 10 min. Sentrifugering ved 100000 x g i 1 time ved 4°C separerte de oppløselige (cytoplasmatiske) proteiner fra de partikkel-formede (membranbundne) proteiner. Membran peiletet ble resuspendert i 1 ml 10 mM Tris-HCl, 0,2 mM DTT, pH 7,0.

CPG2ble analysert som beskrevet. Alkali-fosfatase ble analysert i henhold til J Miller, Experiments in Molecular genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1972, NADH oksidase i henhold til M J Osborn et al, J Biol Chem, 1972, 247, 3962 og glyseraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase etter K Suzuki et al, FEMS, 1971,

13, 217.

Eksempel 1

Fremstilling av rekombinant plasmid pNMl (Et plasmid inneholdende både det foreliggende ledersekvens-polynukleotid og det CPG2strukturelle gen)

For isolering av genet for karboksypeptidase sammen

med ledersekvens-polynukleotidet ble kromosomat DNA fremstilt fra Pseudomonas-verten (stamme RS-16) delvis behandlet med Sau 3A og fragmenter på mellom 6-8 Md isolert fra agarosegeler ved elektroeluering. DNA-fragmentene ble

ligert med alkali-fosfatase behandlet BamHl fraksjon pBR322, innført i E.coli W5445 og Ap tranformanter selektert. Av de oppnådde 3.500 Ap kolonier var omtrent 70% TC<S>. Anvendelse av en hurtig plasmid-isoleringstek-nikk på 50 Ap TC tranformanter viste at 90% av gen-banken inneholdt plasmider av den forventede størrelse. Som i den ytterligere kontroll på at genebanken var auten-tisk ble de individuelle kloner selektert for anskaffelse av en Leu<+>fenotype. To slike kloner ble identifisert. Begge inneholdt et plasmid som kunne omdanne leuB (B-ispropylmalat-dehydrogenase) E.coli mutanter til fototropi.

Anskaffelse av et funksjonelt CPG2gen bør gjøre E.coli istand til å anvende folinsyre som en karbonkilde. De 2.400 genbankkloner ble selektert for evnen til å vokse på minimalmedium inneholdende folat som den eneste kilde for karbon (det vil si Fol<+>). En enkel Fol+ klone ble de-tektert og vist å inneholde et plasmid som kunne omdanne plasmid minus W5445 til Fol<+>fenotypen. Klassisk res-triks jons-kartlegging av dette plasmid (pNMl) ble foretatt som viste nærvær av et 5,9 Md innskudd av pseudomonad DNA inne i pBR322. Restriksjonsenzym-spaltningssetekartet for pNMl er gitt i fig. 1. Nukleotidsekvensen av ledersekvenspolynukleotidet og det CPG2strukturelle gen er gitt i tabell 1.

Eksempel 2

Subkloning av plasmid pNMl til å danne pNMlll

For nøyaktig å finne posisjonen for CPG2 genet og ledersekvens-polynukleotidet inne i 5,9 Md innskuddet ble det foretatt subkloning av forskjellige restriksjonsenzym-fragmenter i pBR322. Et funksjonelt CPG2gen ble ikke funnet å forekomme på Xhol eller Sphl fragmenter av pNMl innskuddet, men var tilstede på et 3,1 Md Bglll fragment. Det siste fragment ble klonet inn i BamHl setet av pBR322 til å gi pNMll (6,0 Md). En ytterligere reduksjon av størrelsen av pNMll ble oppnådd ved å behandle med Sali og religere det resulterende fragment til å gi pNMlll. I tillegg var plasmider hvori det mindre 0,95 Md Sali fragment var blitt' innført i den motsatte orientering til stamplas-midet (pNMll) var Fol-. Samlet indikerer disse subklon-ingsresultater at C^ G^ genet og ledersekvens-polynukleotidet ligger mellom Bglll setet ved 4,14 og SAll setet ved 6,03 på pNMl. Videre inneholder genet et Sphl (5,17), Sali (5,07) og minst et Xhol (4,56 og/eller 5,56) sete. Re-striks jonsenzym-spaltningssetekartet for pNMlll er gitt i fig. 2. ;

Eksempel 3

Fremstilling av rekombinant plasmid pNMl4. ( Et plasmid inneholdende både det foreliggende ledersekvens- polynukleotid og det CPG^strukturelle gen)

Det 3,1 Md Bgl II fragment fra eksempel 2 ovenfor ble delvis behandlet med Sau3A. Disse fragmenter ble så klonet inn i Barn HI setet av pATl53 og omdannet inn i E.coli W5445. Av de to Ap r Tc s Fol ■+• kolonier som ble opp-

nådd innholdt en et plasmid som hadde opptatt et ekstra Sal I og Barn HI sete, dette var pNMl4. Restriksjonsenzym-spaltningssetekartet for pNMl4 er gitt i fig. 3. Sekvensering av ledersekvenspolynukleotidet og det CPG2strukturelle gen tilstede i pNM14 ga nukleotidstrukturen vist i tabell 1. DNA sekvensering av pNMl4 viste også at Sal I - Barn HI fragmentet var en duplikering av et segment av DNA innenfra innskuddet (markert på fig. 3) sammensatt av to tilliggende Sau 3A fragmenter.

Eksempel 4 og 5

Fremstilling av rekombinante plasmider pNM21 og pNM22 ( plasmider inneholdende både det foreliggende ledersekvens-polynukleotid og det CPG,, strukturelle gen)

3,1 Md Bgl II fragmentet fra eksempel 2 ble klonet inn i Barn HI setet av pAT 153 og omdannet i E.coli W5445. To

Ap r Tc s Fol ■+- kolonier ble oppnådd, en inneholdende et plasmid pNM21 hvori fragmentet ble innført i den motsatte orientering til pNMl og en inneholdende et plasmid pNM22 hvori fragmentet ble innført i den samme orientering som pNMl. Restriksjonsenzym-spaltningssetekart for pNM21 og pNM22 er gitt i henholdsvis figurene 4 og 5.

De to plasmider, pNM21 og pNM22 omdannet begge E.coli til Fol<+>som indikerte at en pseudomonad-promoter var tilstede på 3,1 Md fragmentet.. Celler som bar plasmidet pNM21, hvori Bglll fragmentet var klonet i den motsatte orientering til pNMl, fremviste imidlertid hurtigere vekst med folinsyre som eneste karbonkilde. Denne forskjell var klart synlig på agarmedium hvor kolonier utviklet konsen-triske gule omgivende "kranser" av utfelt pterinsyre som er det uoppløselige produkt av folat-hydrolyse.

Bekreftelse om at pNM21 ga forbedret uttrykk av CPG2i forhold til pNM22 ble oppnådd ved å bedømme enzymproduksjonen under porsjonsvekst av celler inneholdende det ene eller det annet plasmid (cellene ble dyrket i kompleks medium supplert med 1% (vekt/volum) glukose og etter behov 0,05% (vekt/volum) folinsyre. Generasjonstiden var 56-66 min. Det ble tatt prøver av kulturen hver time og hele celler ble revet opp ved hjelp av ultralyd. Enzymaktivitet ble bestemt i sentrifugalekstrakten). Resultatene er gitt i tabell 2.

Uttrykket av CPG2fra plasmidene pNM22 og pNMl var 2,5 enheter/liter kultur og representerer 0,005% oppløselig,

protein. I motsetning hertil var uttrykket fra pNM21 3000-3500 enheter/liter kultur som representerte 4,7% oppløselig protein. Da det klonede gen er skutt inn i BamHl setet for pATl53 skyldes det iakttatte høyere uttrykk av pNM21 nesten sikkert den transkripsjonene gjennomlesning fra Tc promoteren. Det lave uttrykk av CPG2.som bæres av plasmidene

pNMl og pNM22 tilsvarer det syn at pseudomonas promotere funksjonerer dårlig i E.coli. Det syntes også klart fra tabell 2 at i nærvær av folat er der en dobbelt økning i den spesifikke aktivitet av enzym målt i celle-sonikatene. Dette fenomen er iakttatt ved alle forsøk men syntes ikke å være forbundet med klassisk induksjon av CPG2: genet, da totalt enzymutbytte i nærvær eller fravær av folat forblir ved omtrent 3000 u/liter kultur. Det gjenspeiler faktisk en konsistent depresjon i oppløselige proteinnivåer målt i sonikater fra celler dyrket i nærvær av folat. Der er ingen tydelig forskjell i veksthastigheten av celler som dyrkes med folat og grunnene til dette resultat er ikke klare.

Uttrykking av det klonede gen i Ps. putida

Den iakttagelse at CPG2genet ble uttrykt i E.coli uansett orienteringen av genet inne i vektoren antyder at promoterområdet av CPG2genet var blitt klonet med det strukturelle gen og ledersekvens-polynukleotidet. Den lave uttrykking av CPG2i E.coli fra dens naturlige promoter (pNMl, pNM22, pNMlll) bekreftet andre funn om at Pseudomonas promotere gjenkjennes dårlig av E.coli RNA polymeraser. Det kunne forventes at hvis genet ble innført tilbake i en pseudomonad cellulær omgivelse ville forbedret uttrykking resultere fra Pseudomonas promoteren. 3.1 Md Bglll fragmentet ble subklonet inn i Pseudomonas kloningsvektor pKT230 i dets eneste BamHl setet. To plasmider ble oppnådd, idet pNM31 og pNM32 representerte de to mulige orienteringer av det klonede gen. Disse plasmider ble omdannet i Ps.putida 2440 ved hjelp av metoden til Bagdasarian og Timmis. Pseudomonad-celler som bar begge plasmider ble dyrket i minimale saltmedier og enzymproduksjonen overvåket.

Utbytter på 500 -1000 enheter/liter kultur ble oppnådd uansett genorienteringen inne i plasmidet. Spesifikk aktivitet av enzymet i celle-sonikater var 1,5 til 4,0 U/mg protein som representerte 0,3 til 0,7% oppløselig protein (sammenlignet med < 0,05% oppløselig protein i donorstam-men RS-16). Dette resultat indikerer sterkt at CPG2promoteren er til stede og virker i en pseudomonad-bakgrunn. Når de samme plasmider ble omdannet i E.coli W5445 ble det funnet 12 til 40 enheter/liter med spesifikk aktivitet < 0,07 U/mg (< 0,01% oppløselig protein).

Periplasmatisk lokalisering av CPG^

Det er tydelig at CPG2er lokalisert i eller nær det periplasmatiske rom av Pseudomonas stammen RS-16. Pterinsyre, produktet fra CPG2hydrolyse av folinsyre er ytterst uoppløselig og finnes overveiende utenfor cellen i både flytende og fast medium. Exogen pterinsyre sees også

i E.coli kulturer inneholdende det klonede gen når folinsyre er til stede i mediet. Dette vises klart ved "kran-sen" av utfelt pterinsyre som iakttas rundt kolonier som bærer plasmider hvor uttrykking av CPG2er fra Tc promoteren av pBR322 (f.eks. pNM21).

Lokaliseringen av CPG2frembragt av E.coli celler som

bærer pNM21 ble undersøkt ved separering av cellulære proteiner i cytoplasmatiske, periplasmatiske og hele membranfraksjoner. Som en kontroll ble også tre markeringsenzym-er, alkali-fosfatase (periplasmatisk), glyseraldehyd-3-fosfat-dehodrogenase (cytoplasmatisk) og NADH.02oksydo-reduktase (membran-bundet) også bestemt. Som det kan sees av tabell 3 forekommer 97% av CPG2aktiviteten i peri-plasmaet, ekvivalent med det markør-periplasmatiske enzym alkalifosfatase. Dette bekrefter nærværet i pNM21 av et ledersekvens-polynukleotid inntil CPG2 genet som koder for et

signal-polypeptid i henhold til oppfinnelsen som fremmer sekresjonen av CPG2fra cytoplasmaet inn i det periplasmatiske rom.

Karboksypeptidase syntetisert i E. coli

Den spesifikke aktivitet av CPG-, i rå celleekstrakter av celler som inneholdt pNM21 var 50 ganger høyere enn ekviva-lente ekstrakter fra Pseudomonas stamme RS-16. For å be-stemme om det klonede genprodukt i E.coli hadde de samme egenskaper som CPG2fra pseudomonaden ble enzym renset fra E.coli inneholdende pNM21. Den spesifikke aktivitet av renset CPG2(enkelt bånd SDS-PAGE) var 535 U/mg protein som sammenlignes med 550 U/mg av protein fra pseudomonaden. CPG2renset fra E.coli klon pNM21 samme-kromatorgraferte med CPG2fra Pseudomonas stammen RS-16 ved en sub-enhet molekylvektverdi på 42.000 dalton. Km verdier under anvendelse av "methotrexat" som substrat var henholdsvis 7.4 x 10 —6 M og 8.0 x 10" — 6M. I tillegg indikerte antiserum dannet mot Pseudomonas enzym immunologisk identitet mellom E.coli og Pseudomonas CPG2idet en sammenfallende utfel-lingslinje ble dannet ved Ouchterlony dobbelt diffusjons-analyse.

Eksempel 6

Fremstilling av et rekombinant plasmid inneholdende både det foreliggende ledersekvens- polynukleotid og det ^ - galaktosidase- strukturelle gen

Plasmid pNM14 (eksempel 3) ble behandlet med Sau 3A (GATC) og fragmentene ble klonet inn-i Barn HI setet åv M13 mp7 templat DNA (enkelt trådet DNA)(trinn A i fig, 6). Produktet som inneholdt et 318bp Sau 3A fragment som koder for det foreliggende signal-polypeptid og de første 22 aminosyrer i CPG2(nukleotidsekvensen av dette fragment vist i tabell 4) ble selektert og gjort dobbelttrådet. Den DNA som kodet for signal-polypeptidet (og den første del av CPG2) ble så kuttet ut som et Eco RI fragment. Dette Eco RI fragment ble så klonet inn i promoter-kloningsvektoren E.coli pMC1403 (M.J. Casadaban et al, J Bacteriol, 1980, 143, 9 71) som bare bærer det strukturelle gen (lac Z) for f -galaktosidase (det vil si ingen promoter og intet ATG start-kodon) (trinn B og C i fig. 6). Det ble oppnådd plasmider hvori Eco RI fragmentet var innskutt i begge orienteringer men bare dem hvori fusjon av CPG2-sekvensen til / -galaktosidasesekvensen hadde foregått (i) ga et 0,34 Kb fragment ved behandling med BamHl; (ii) gjorde det mulig for vertscellen og hydrolysere den fargeløse laktose-analog, BCIG, og gi en blå farging til kolonier. Det 0,34 Kb BamHl fragment er blitt reklonet inn i Ml3mp7 og sekven-sert for å bekrefte at fusjon har skjedd. "Forløper"-fusjonen som ble frembragt vil bestå av signal-peptidet, de første 22 aminosyrer i CPG2, 6 aminosyrer avledet fra M13 mp7 og pMCl403 linkerenheter og ^-galaktosidase videre fra dens 8. aminosyre.

Lokaliseringsforsøk er blitt gjennomført med celler som inneholder et plasmid som koder for "fusjonsgenet" hvor de cellulære proteiner er blitt fraksjonert i periplasmatiske, cytoplasmatiske og membranfraksjoner. I disse forsøk ble en organisme (E.coli MC 1061) som ikke inneholder lac Z genet dyrket i fosfatmedium (H.C. Neu et al, J Biol Chem, 1964, 240, 3685) og periplasmatiske enzymer ble frigitt fra de høstede celler ved omdannelse til sferoplaster. Separering av oppløselig proteiner (cytoplasmatiske) fra par-tikkelformede proteiner (membranbånd) ble oppnådd ved ultralydbehandling av de høstede sferoplaster og etterfølg-ende sentrifugering ved 100.000 gil time for å sedimen-tere cellemembranet (T.J. Silhary et al, Proe Nati Acad Sei USA, 1976, 73, 3423).

Resultatene gitt i tabell 5 viser nærværet av 50% av galaktosidase-aktiviteten i det periplasmatiske rom. Dette resultat er i direkte motsetning til lignende arbeider som innbefatter fusjon av andré periplasmatiske protein-signal-sekvenser til ^ -galaktosidase, hvor fusjonsproteinene ikke sendes ut men blir innesperret i membranen (P.J. Bass-fordet et al, J Bacteriol, 1979, 139, 19 og S D Emr Et al, J Cell, Biol, 1980, 86, 701).

Eksempel 7

Fremstilling av et rekombinant plasmid inneholdende både det foreliggende ledersekvens- polynukleotid og det CPG,, strukturelle gen som kan formeres i E. coli og. S. cerevisiae

Et 2,03 kilobase BamHl fragment som koder for det foreliggende signal-polypeptid og hele CPG2molekylet ble klonet i begge orienteringer inn i BamHl setet av en E.coli/S. cerevisiae skyttelvektor pROG5 (R.F. Sherwood og R.K. Gibson, The Molecular Biology og Yeast, 1979, Cold Spring Harbor Publications) til å gi plasmider pLEC 3 og pLEC4 (fig. 7). Disse plasmider ble omdannet i S. cerevisiae stamme LL20 ved hjelp av den litiumacetat-induserte omdan-nelsesmetode beskrevet av Ito et al, J. Bact. , 1983, 153, 163. Utbytter ekvivalentet med 10-20 enheter/liter kultur-volum ble oppnådd uansett genorienteringen inne i plasmidet. Spesifikk aktivitet av enzymet i totale cellekstrakter var 0,2-0,3 u/mg protein som representerte 0,005% oppløse-lig protein. Dette uttrykksnivå fra pseudomonad-promoteren i en gjærbakgrunn tilsvarer det nivå som finnes når genet ble utlest fra sin egen promoter i E.coli (0,01% oppløselig protein).

Lokaliseringsforsøk ble gjennomført med gjærceller som inneholdt de ovennevnte plasmider ved sferoplastering av cellene under anvendelse av standard teknikk beskrevet av J.B.D. Beggs, Nature, 1978, 2 75, 105. Periplasmatiske enzymer, lokalisert på utsiden av cellemembranet, ble fri gitt når celleveggen ble fjernet. Den osmotiske stabilasa-tor (0,2M sorbitol) ble så erstattet med 0,IM Tris-HCl-buffer, pH 7,3 inneholdende 0,2mM ZnCl2for lysing av sferoplastene og det hele ble sentrifugert ved 100.000 x g i en time for- å separere proteiner i den oppløselige cytoplasmatiske fraksjon fra membranbundne proteiner. Resultatene i tabell 6 viser nærværet av 64% av CPG2aktiviteten i den periplasmatiske fraksjon og ytterligere 16% assosiert med cellemembranfraksjonen.

Claims

1. En rekombinant DNA overførings-vektor omfattende et 1edersekvens-polynukleotid, karakterisert ved at ledersekvens-polynukleotidet koder for et signal-polypeptid med formel I

2. Overførings-vektor som angitt i krav 1, karakterisert ved at ledersekvens-polynukleotidet har formel II,

3. Overførings-vektor som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at ledersekvens-polunuk-leotidet befinner seg nedstrøms fra og i lesefase med en bakteriell eller en gjær-promoter og et prokaryotisk ribosom-bindingssete.

4. Overføringsvektor som angitt i krav 1 til 3, karakterisert ved at ledersekvens-polunuk-leotidet befinner seg oppstrøms fra og i lesefase med et strukturelt gen.

5. Overførings-vektor som angitt i krav 4, karakterisert ved at det strukturelle gen koder for humant veksthormon, humant insulin eller humant chorionisk somato-mammotropin.

6. Overførings-vektor som angitt i krav 4, karakterisert ved at det strukturelle gen koder for E.coli -galaktosidase.

7. Overførings-vektor som angitt i krav 4, karakterisert ved at det strukturelle gen koder for Pseudomonas karboksypeptidase G^ (CPG2 ).

8. Overførings-vektor som angitt i krav 7, karakterisert ved at den omfatter et polynukleotid med formel

9. Overførings-vektor som angitt i krav 1 til 8, karakterisert ved at overførings- vektoren er et plasmid.

10. Overførings-vektor som angitt i krav 9 sammen med 7, k? a r • a k t e r i s e r t ved at den _har ;betegnelsen pNMl, pNMlll, pNMl4, pNM21-, pNM22, pNM31, pNM32 og pLEC3.