JPH0669377B2 - Ｄｎａ塩基配列およびベクタ− - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、遺伝子の発現およびその結果産生された蛋白
質の分泌に関与する領域を含むDNA塩基配列の下流に、
所望の蛋白質の遺伝子を含むDNA塩基配列を結合させる
ことが可能な制限酵素切断部位を有するDNA塩基配列が
結合しているDNA塩基配列に関するものである。

また、本発明は、所望の蛋白質の遺伝子を結合させるこ
とが可能な制限酵素切断部位を有するDNA塩基配列が、
遺伝子の発現およびその結果産生された蛋白質の分泌に
関与する領域の下流に、結合しているDNA塩基配列を、
バチルス属細菌で複製可能なプラスミドDNAまたはファ
ージDNAに結合して得られることを特徴とする発現・分
泌ベクターに関するものである。

以下本発明の背景を説明する。

近年の分子生物学の著しい発展により、所望の蛋白質を
コードする遺伝子を適当なベクターに結合して、宿主菌
へ導入することにより、該蛋白質を宿主菌により生産さ
せることが可能となった。

宿主菌としては、従来、遺伝学的および分子生物学的検
討の最も進んだ大腸菌が用いられてきた。しかし、大腸
菌を用いる場合は、通常菌体内に所望の蛋白質が蓄積さ
れるので、該蛋白質の精製は非常に困難となり、また、
発熱物質の混入が避けられず大きな問題となっている
（鎮目和夫、日本臨床、40（８）、48、（1982））。一
方、バチルス属細菌においては、該細菌が多量の蛋白質
を菌体外へ分泌する性質を有し、また、病原性を有さず
永い間発酵工業で用いられてきた経験があること（Deba
bov.“The Molecular Biology of the Bacilli"１,332,
（1982）Dubnaw.D.A.編Academic Press）がよく知られ
ている。このことから、バチルス属細菌を宿主として使
用可能な発現・分泌ベクターを創製することは微生物に
よる蛋白質生産の観点から、大きな工業的意義を有する
ものである。

本発明者らは、この点に鑑み検討を重ねた結果、バチル
ス属細菌を宿主として使用可能な高効率発現・分泌ベク
ターの構築に成功し本発明を完成した。

以下本発明を詳細に説明する。

本発明で言う遺伝子の発現に関与する領域とは、RNAポ
リメラーゼが認識し結合する領域である−35および−10
領域を含むプロモーター領域、およびRNAポリメラーゼ
により合成されたmRNAがリボゾームと結合するためのDN
A塩基配列をコードするリボゾーム結合領域を含むもの
である。これらの領域が遺伝子の発現に重要な役割を果
たし、これらの領域の構造は直接的に発現量に関係して
いることは今日広く知られている（中村研三、化学の領
域、37、349（1982））。

バチルス属細菌を宿主菌として所望の蛋白質の遺伝子を
発現させる場合は、バチルス属細菌のRNAポリメラーゼ
およびリボーゾームが、プロモーター領域およびリボゾ
ーム結合領域の認識に関して厳格な特異性をもつため
（堀之内末治 蛋白質、核酸、酵素、28 1468（198
3））それらの領域が、バチルス属由来のものであるこ
とが望ましい（Goldfard.D.S.,ら Nature 293,309（1
981））。

また、発現の結果産生された蛋白質の菌体内から菌体外
への分泌に関与する領域については、菌体外へ存在する
成熟蛋白質の上流部分に存在する分泌シグナルと呼ばれ
るポリペプチドをコードするDNA塩基配列が重要なこと
がよく知られており、該ポリペプチドは菌体内で成熟蛋
白のアミノ末端上流に結合した形で合成され、分泌の際
に細胞膜通過において重要な役割を果たすことが明らか
になっている。（G.Blobel,J.Cell.Biol67835（197
5））。

また、実用上の観点から、発現・分泌ベクターを創製す
る場合は、高発現および大量分泌生産という点で菌体外
に短時間のうちに多量に分泌生産される菌体外酵素遺伝
子を用いることが非常に重要である。そのような酵素と
しては、菌体外プロテアーゼ、α−アミラーゼ、レバン
シュークラーゼ等が知られておりそれらのいずれの酵素
の遺伝子も発現・分泌ベクターの構築に用いられるが、
本発明者らは先に述べたような観点から、特に、バチル
ス・アミロリキファシエンスの中性プロテアーゼが該細
菌で短時間の間に多量に分泌される蛋白質であることに
注目し、該中性プロテアーゼ遺伝子をバチルス・ズブチ
リスを宿主菌としてクローン化し（MT−0150（FERM−BP
−425））、そのDNA塩基配列をすでに決定し、該中性プ
ロテアーゼ遺伝子の発現に関与するプロモーター領域お
よび発現した蛋白質の分泌に関与する領域を含む、中性
プロテアーゼ遺伝子の全DNA塩基配列を明らかにした
（特願昭59−175158）。その結果、該中性プロテアーゼ
遺伝子には、分泌された中性プロテアーゼをコードする
DNA塩基配列の上流に663塩基対からなるオープン・リー
ディング・フレームが存在していることを見出した（H.
Shimada.ら,J.Biotechnol.2 75（1985））。

このことにより、該中性プロテアーゼ遺伝子には、菌体
外中性プロテアーゼをコードするDNA塩基配列の上流に2
21アミノ酸からなるプレプロタンパクをコードするDNA
塩基配列が存在することが明らかになった。該中性プロ
テアーゼは、菌体内ではプレプロタンパクを結合した形
で合成される。しかしながら、菌体外に分泌された中性
プロテアーゼには、このプレプロタンパクが存在してい
ない。このことは、このプレプロタンパクが、中性プロ
テアーゼの分泌の際に切断され除去され、該中性プロテ
アーゼの分泌の際に重要な役割を果たしていることを示
唆する。一方、従来知られている菌体外酵素の分泌シグ
ナルは、20アミノ酸から40アミノ酸であることが知られ
ている（Perlman.D.J.,Mol.Biol.67,391（1983））。ま
た、他の菌体外酵素と異なり、中性プロテアーゼは、短
時間の内に多量に分泌されるという性質を有している。
以上の点から、該中性プロテアーゼのプレプロタンパク
は、この中性プロテアーゼの高発現、多量分泌という性
質に大きな影響を与えていると考えられる。

従って、本発明者らは、従来知られている菌体外酵素の
分泌シグナルとこの中性プロテアーゼのプレプロタンパ
クの相違点に着目し、プレプロタンパクをコードするDN
A塩基配列に種々の長さの欠失を設けたDNA断片を作成し
た。次に、このDNA断片と分泌シグナルを欠くα−アミ
ラーゼをコードするDNA塩基配列を結合させた組み換え
体DNA分子を作成した。さらに、この組み換え体DNA分子
で形質転換したバチルス属細菌が分泌産生するα−アミ
ラーゼの活性の強さを調べることにより、これらのDNA
断片の有する、遺伝子を発現させその結果産生された蛋
白質を分泌させる能力（産生・分泌能）に検討を加えた
（実施例１）。

その結果、驚くべきことに、プレプロタンパクをコード
するDNA塩基配列に欠失を設けたDNA断片のうち、あるDN
A断片には、中性プロテアーゼの完全なプレプロタンパ
クをコードするDNA塩基配列よりも、α−アミラーゼ遺
伝子を強力に発現させその結果産生されたα−アミラー
ゼを多量に分泌させる能力が存在していることを発見
し、このような性質を有するDNA断片のDNA塩基配列を決
定することに成功した（第１図）。

さらに、本発明者らは、このDNA断片を用いて、バチル
ス属細菌で所望の蛋白質を極めて効率良く発現、分泌さ
せることの可能な発現・分泌ベクター（pES84）を構築
することに成功するに至った（実施例２）。

ここで言う本発明の発現・分泌ベクター（pES84）と
は、遺伝子の発現およびその結果産生された蛋白質の分
泌に関与する領域を含むDNA塩基配列が、適当な制限酵
素切断部位を有するDNA塩基配列を介してバチルス属細
菌で複製可能なファージDNAまたはプラスミドDNAと結合
したものを指す。該発現、分泌ベクターに所望の蛋白質
をコードする遺伝子を含むDNA塩基配列を結合させるこ
とにより、所望の蛋白質を菌体外に産生可能となるもの
である。すなわち、該発現・分泌ベクターに含まれる遺
伝子の発現およびその結果産生された蛋白質の分泌に関
与する領域の下流に所望の蛋白質をコードするDNA塩基
配列を結合し宿主菌となるバチルス属細菌へ導入するこ
とにより、所望の蛋白質をコードする遺伝子を宿主菌で
発現させその結果産生された蛋白質を、該宿主菌の培養
液中に多量に分泌生産させて、培養上清から簡単な工程
で回収精製することが可能となるものである。

発現・分泌ベクターを構成するプラスミドあるいはファ
ージとしては、バチルス属細菌で複製可能なものであれ
ばいかなるものでも使用可能であるが、通常よく用いら
れるものとしてプラスミドとしてはスタフィロコッカス
由来のpUB110、pBP5、pC194、pE194、pSA0510、pBD6等
およびその誘導体、またファージとしては、φ105、φ2
9、φ109、p11等およびその誘導体を挙げることができ
る。

また、ここで述べる制限酵素切断部位を有するDNA塩基
配列は、所望の蛋白質をコードする遺伝子を含むDNA塩
基配列を結合させるために必要なものである。その配列
としては、所望の蛋白質をコードするDNA塩基配列を結
合させることが可能なものであればいかなるものでもよ
い。

実際に、その一例として、発現・分泌ベクターpES84を
用いて、バチルス・ズブチリスで、ヒト−β−インター
フェロンとヒト成長ホルモンを、世界に先駆けて極めて
効率的に培地中に分泌生産させることに成功した（実施
例３、４）。

このことより、pES84に含まれている中性プロテアーゼ
遺伝子の発現およびその結果産生された蛋白質の分泌に
関与する領域が、所望の蛋白質をコードする遺伝子を発
現させその結果産生された蛋白質を分泌させるのに極め
て有効であることが明らかとなった。また、この例が示
すように、異なった蛋白質をコードする遺伝子を発現さ
せその結果産生された蛋白質を菌体外に分泌させること
に成功したことから、本発明の発現・分泌ベクター（pE
S84）に存在している（第３図に示した）制限酵素切断
部位に所望の遺伝子、例えば、インターフェロン、成長
ホルモン、インターロイキン、神経成長因子、カリクレ
イン、プラスミノーゲンアクティベーター、あるいは、
その他の生理活性ポリペプチドまたは酵素等の遺伝子を
コードするDNA塩基配列を直接あるいは適当なリンカー
を用いて、挿入結合させることにより得た組み換え体DN
Aを用いてバチルス・ズブチリスを形質転換することに
より該蛋白質を菌体外に効率的に分泌生産させることが
可能となった。

以下具体例によって、本発明の発現・分泌ベクター（pE
S84）の創製法およびバチルス・ズブチリスを宿主菌と
したヒト−β−インターフェロン遺伝子およびヒト成長
ホルモン遺伝子の発現とその結果産生されたヒト−β−
インターフェロンおよびヒト成長ホルモンの分泌生産に
ついて説明する。なお、本発明は以下の実施例により何
ら制限されるものでない。

実施例１ プレプロタンパクをコードするDNA塩基配列
に種々の長さの欠失を設けたDNA断片の作成法およびそ
の分泌能の検定。

中性プロテアーゼ遺伝子の発現およびその結果産生され
た蛋白質の分泌に関与する領域は、バチルス・アミロリ
キファシエンス由来の中性プロテアーゼ遺伝子とプラス
ミドpUB110 DNAから成るプラスミドpNP150 DNAから、
エキソヌクレアーゼ（Bal31）を用いて、中性プロテア
ーゼ遺伝子のプレプロタンパクをコードするDNA塩基配
列に種々の長さの欠失を設けたDNA断片を調製した。

pNP150は、該プラスミドを有するバチルス・ズブチリス
（FERM−BP−425）から、Gryczanの方法（Gryczan,T.
J.,ら,J.Bacteriol.134318（1978））を用いて調製し
た。

得られたプラスミドpNP150 DNA 10μｇを制限酵素Pvu
l（ベーリンガー・マンハイム社製）10単位を用いて、3
7℃で１時間反応させ完全に切断した。そのPvul切断DNA
は、フェノール抽出を三回繰り返し、残留するフェノー
ルをエーテル抽出により除去したのち、エタノール沈澱
を行って回収した。

その回収DNAは、エキソヌクレアーゼBal31（ベーリンガ
ー・マンハイム社製）10単位を用いて30℃で50分間反応
させた。

反応系の組成は、20mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.1）1mM
EDTA.12mM CaCl₂、12mM MgCl₂、600mM NaClであ
る。

反応終了後、フェノール抽出、エーテル抽出、エタノー
ル沈澱を順次行った後、DNAを回収した。回収DNA（以
後、エキソヌクレアーゼ処理DNAと称す。）は、50μ
の50mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）（以後、DNAバッフ
ァーと称す。）に溶解した。その溶解液のDNA濃度を定
量したところ、エキソヌクレアーゼ処理DNA溶液のDNA濃
度は、0.1μｇ／μであった。この行程によりプラス
ミドpNP150のプレプロタンパクをコードするDNA塩基配
列に種々の長さの欠失を設けたDNA断片が得られた。

これらのDNA断片が有する種々の長さのプレプロタンパ
クをコードする領域の分泌能を調べるために次にそれ自
身の分泌シグナルを欠くα−アミラーゼ遺伝子を用いて
α−アミラーゼの菌体外へ分泌生産される量について調
べた。

次に、分泌シグナルを欠くα−アミラーゼ遺伝子を、該
遺伝子を含むプラスミドpAM29を用いて調製した。

プラスミドpAM29は、α−アミラーゼの分泌に関与する
分泌シグナル部分を削除した成熟型α−アミラーゼをコ
ードするDNA塩基配列のＮ−末端側に制限酵素SmaI切断
部位、制限酵素BamHI切断部位を、またＣ末端側に制限
酵素HindIII切断部位、制限酵素PvuII切断部位が存在す
るように、合成DNAを用いて造成したものである。

該プラスミド（10μｇ）を制限酵素SmaI（宝酒造社製）
10単位と制限酵素PvuII（宝酒造製）10単位とで分解し
たのち、１％アガーロースゲル電気泳動を行って、1700
塩基対から成るα−アミラーゼの分泌に関与する分泌シ
グナル部分を削除した成熟型α−アミラーゼをコードす
るDNA塩基配列で、そのＮ末端には制限酵素BamHI切断部
位をまたそのＣ末端には制限酵素HindIII切断部位を有
するDNA断片（以後、α−アミラーゼ構造遺伝子と称
す。）を３μｇ調製した。

これを、30μｌのDNAバッファーで溶解した。ここで、
得られたDNA断片と先に述べたpNP150のプレプロタンパ
クをコードするDNA塩基配列に種々の長さの欠失を設け
たDNA断片との結合による組み換え体DNA分子の作成法に
ついては第４図に示す。

すなわち、α−アミラーゼ構造遺伝子を溶解したDNAバ
ッファー10μとエキソヌクレアーゼ処理DNA溶液10μ
とを、大腸菌T₄リガーゼ（宝酒造製）10単位を用いて
10℃で18時間反応させ、組み換え体DNA分子を作成し
た。この反応系の組成は、66mMトリス−塩酸緩衝液（pH
7.5）、6.6mM MgCl₂、10mMジチオスレイトール、2mM
ATP（アデノシン三リン酸）である。

組み換え体DNA分子を用いてバチルス・ズブチリスをプ
ロトプラスト法（Chang.S ＆ Cohen.S.N.,Mol.Gen.Gene
t.,168111（1978））により形質転換した。該プロトプ
ラスト再生培地には、硫酸カナマイシン（ベーリンガー
・マンハイム社製）を100μｇ／ml、および可溶性デン
プンを最終の濃度１％になるように加えた。形質転換に
用いた宿主菌は、アミラーゼ生産能を欠くバチルス・ズ
ブチルス1A289菌（オハイオ大学、バチルスストックセ
ンター保存株）を用いた。アミラーゼを分泌産生してい
る形質転換株の選択は、ヨード・ヨードカリ法（J.Bact
eriol119416（1974））により行った。その結果、アミ
ラーゼを分泌産生している形質転換株を78株得た。

これらの株をBY培地（0.5％肉エキス、0.2％イースト・
エクストラクト、0.2％NaCl、１％ポリペプトンおよび
カナマイシン５μｇ／ml）で37℃10時間振とう培養した
後、遠心分離法により菌体と培養上清とに分離した。次
に、培養上清に存在するα−アミラーゼの活性を、ジニ
トロサリチル酸を用いる可溶性デンプンからの還元基の
生成を調べる方法（BiochemicainformationII p28−30
ベーリンガー・マンハイム社製カタログ）により行っ
た。この方法により、得られた形質転換株の中から最も
多量に（野性株の300倍）α−アミラーゼを菌体外へ分
泌する形質転換株（＃84）を選択した。

該形質転換株（＃84）から、アルカリ法（Birnboim H.
C.ら Nucleic.Acids.Res.７1513（1979））でプラスミ
ド（pNPA84）を得た。該プラスミド（pNPA84）のDNA塩
基配列をマキサム・ギルバート法（Maxam,A.M. ＆ Gilb
ert,W.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74560（1977））で決
定した。その結果、pNPA84は、第１図に示したDNA塩基
配列からなるDNA断片の下流にα−アミラーゼ構造遺伝
子が結合したプラスミドであることが判明した。該α−
アミラーゼ構造遺伝子は、それ自身の発現および分泌に
関与する領域を欠いている。このことから、第１図に示
したDNA塩基配列を有するDNA断片は、遺伝子を発現させ
その結果産生された蛋白質を極めて効率よく分泌させる
機能を有していることが明らかになった。

実施例２ 発現・分泌ベクターpES84の構築。

実施例１により第１図に示したDNA塩基配列は異種遺伝
子に発現・分泌に有効であることが判明した。そこでこ
の領域を有する発現・分泌ベクターすなわち、中性プロ
テアーゼ遺伝子の発現およびその結果産生された蛋白質
の分泌に関与する領域の下流に、所望の蛋白質の遺伝子
が結合可能な制限酵素切断部位を有するDNA塩基配列が
結合している発現・分泌ベクターpES84を創製した。以
下、その創製法を示す（第５図参照）。

中性プロテアーゼ遺伝子の発現およびその結果産生され
た蛋白質の分泌に関与する領域の調製は、実施例１の第
１図に示したDNA塩基配列を含むDNA断片を有するプラス
ミドpNPA84を用いて行った。該プラスミドpNPA84 DNA
を形質転換株（＃84）よりアルカリ法（Birnboim.H.C.
ら Nucleic.Acids.Res.７1513（1979））で２μｇ調製
した。続いて、このDNAを10μのDANバッファーに溶解
させた。このpNPA84 DNAを含む溶液10μを制限酵素B
amHI（宝酒造製）と制限酵素HindIII（宝酒造製）で分
解したのち、アガロースゲル電気泳動法により、α−ア
ミラーゼ構造遺伝子を削除したDNA断片（以後、DNA断片
Ａと称す。）0.2μｇを調製した。さらに、これを２μ
のDNAバッファーで溶解した。次に、所望の蛋白質を
結合させることが可能な制限酵素切断部位を有するDNA
断片の化学合成を以下のように行った。

所望の蛋白質を結合させることが可能な制限酵素切断部
位を有するDNA断片の塩基配列は、第２図に示したごと
くである。第２図に示したDNA塩基配列の両方の鎖をそ
れぞれ常法に従い化学合成し精製した（大塚栄子、化学
の領域、35（10）762（1981））。

合成DNA1μｇをそれぞれ10μのDNAバッファーに溶解
させた。次に、両一本鎖DNA間で再構成を行わせ図２に
示したDNA塩基配列を有する二本鎖DNAを得た。再構成
は、一本鎖DNAを含むそれぞれ５μを混合後、90℃で
５分間処理し、更に、０℃で１時間放置する方法により
行った。再構成した二本鎖DNAとDNA断片Ａを結合させる
ことにより、発現・分泌ベクターpES84を作成した。
（第５図） 前述の二本鎖DNAを含む溶液10μとDNA断片Ａを含む溶
液２μを大腸菌T₄DNAリガーゼ（宝酒造製）10単位を
用いて、４℃で16時間反応させることにより、合成二本
鎖DNAとDNA断片Ａとからなる組み換え体DNA分子を作成
した。この反応系の組成は、66mMトリス−塩酸緩衝液
（pH7.5）,6.6mM MgCl₂,10mMジチオスレイトール、2mM
ATP（アデノシン三リン酸）である。これらの組み換
え体DNA分子を用いて、プロトプラスト法（前述）で、
バチルス・ズブチリスを形質転換し、該形質転換株か
ら、アルカリ法（前述）でプラスミドを得た。該プラス
ミドのDNA塩基配列をマキサム・ギルバート法（前述）
で決定した。その結果、該プラスミドは中性プロテアー
ゼ遺伝子の発現およびその結果産生された蛋白質の分泌
に関与する領域の下流に、所望の蛋白質を結合させるこ
との可能な制限酵素切断部位を有するDNA塩基配列が結
合したDNA断片（第３図）を有する発現・分泌ベクターp
ES84であることが確認された。さらにこのプラスミドpE
S84をプロトプラスト法（前述）により、バチルス属細
菌（MT−0207、FERM BP−926）へ導入し、発現・分泌
ベクターpES84を含む形質転換株（MT−8400、FERM BP
−923）を得た。

実施例３ 発現・分泌ベクターpES84を用いたヒト−β
−インターフェロン遺伝子のバチルス・ズブチリスにお
ける発現と分泌 ヒト−β−インターフェロン遺伝子は、該遺伝子を含む
プラスミドpIF20を用いて調製した。該プラスミドpIF20
は、ヒト−β−インターフェロンの分泌に関与する分泌
シグナル部分を削除した成熟蛋白質をコードするDNA塩
基配列の両末端に制限酵素Sau3AI切断部位が存在するよ
うに、合成DNAを用いて造成したものである。該プラス
ミドpIF20を制限酵素Sau3AI（宝酒造製）で分解する
と、約500塩基対から成るヒト−β−インターフェロン
の分泌に関与する分泌シグナル部分を削除した成熟蛋白
質をコードするDNA塩基配列（以後、ヒト−β−インタ
ーフェロン構造遺伝子と称す。）が調製できる。

該ヒト−β−インターフェロン構造遺伝子（0.1μｇ）
と制限酵素BamHI（宝酒造製）で完全に分解した発現・
分泌ベクターpES84（0.1μｇ）とを、大腸菌T₄DNAリガ
ーゼ（宝酒造製）10単位を用いて反応させ組み換え体DN
A分子を作成した（第６図、反応条件、反応系の組成
は、前述の通り）。該組み換え体分子を用いて、バチル
ス、ズブチルス（MT−0207）をプロトプラスト法（前
述）により形質転換し、形質転換株を得た。次に、該形
質転換株をペンアッセイ培地（Difco社製）を用いて、3
0℃で14時間振とう培養した後、培養液を遠心分離する
ことにより培養上清と菌体とに分けた。培養上清に含ま
れるヒト−β−インターフェロンの免疫的活性の測定
は、抗ヒト−β−インターフェロン血清を用いた酵素免
疫測定法（酵素免疫測定法、石川栄治編 67（1981））
を用いた。その結果、該形質転換株の培養上清中には、
2.5×10⁴U／mlのヒト−β−インターフェロンが存在し
た。このヒト−β−インターフェロンを分泌産生する形
質転換株（MT−8401、FERM BP−924）に含まれるプラ
スミド（pESI84）を、アルカリ法（前述）を用いて調製
した。さらに、該プラスミド（pESI84）の制限酵素地図
を作成した結果、該プラスミド（pESI84）が、本発明の
発現・分泌ベクターpES84とヒト−β−インターフェロ
ン構造遺伝子とからなる組み換え体DNA分子であること
が確認された。なお、ここで示す1U単位は、１×10^-8mg
のヒト−β−インターフェロンに対応するものである。

従来、ヒト−β−インターフェロンはヒト組織またはヒ
ト組織由来の培養細胞より、多大な労力を経て得ていた
ものである。本発明の組み換え体DNA分子pESI84で形質
転換したバチルス・ズブチリス（MT−8401）を用いるこ
とにより、ヒト−β−インターフェロンを容易かつ多量
に得ることが可能となった。

実施例４ 発現・分泌ベクターpES84を用いたヒト成長
ホルモン遺伝子のバチルス・ズブチリスにおける発現と
分泌 ヒト成長ホルモン遺伝子は、該遺伝子を含むプラスミド
phGH318を用いて調製した。該プラスミドphGH318は、ヒ
ト成長ホルモンをコードするDNA塩基配列とプラスミドp
BR232DNAとから成り立つものである。該プラスミドphGH
318を制限酵素BamHI（宝酒造製）と制限酵素HindIII
（宝酒造製）とで分解すると、約900塩基対のヒト成長
ホルモンをコードするDNA塩基配列を含むDNA塩基配列
（以後、DNA断片Ｂと称す。）を調製することができ
る。DNA断片Ｂには、ヒト成長ホルモン遺伝子以外のDNA
塩基配列も含まれている。そのため、本発明の発現・分
泌ベクターpES84を用いて、ヒト成長ホルモン遺伝子を
発現させその結果産生されたヒト成長ホルモンを分泌さ
せるためには、DNA断片Ｂからヒト成長ホルモン遺伝子
以外のDNA塩基配列を削除する必要がある。そこで、第
７図に示すようにDNA断片Ｂ（１μｇ）にエキソヌクレ
アーゼBal31（宝酒造製）10単位を10℃で１分間反応さ
せること（反応系は、前述の通り）により、DNA断片Ｂ
からヒト成長ホルモン遺伝子以外のDNA塩基配列を削除
した約700塩基対からなるDNA断片（以後DNA断片Ｃと称
す。）を調製した。

次に、DNA断片Ｃ（0.1μｇ）と制限酵素BamHIで完全に
分解した発現・分泌ベクターpES84（0.1μｇ）とを、大
腸菌T₄DNAリガーゼ（宝酒造製）を用いて反応させ、組
み換え体DNA分子を作成した（反応条件、反応系の組成
は、前述の通り）。該組み換え体DNA分子を用い、バチ
ルス・ズブチリス（MT−0207）をプロトプラスト法（前
述）により、形質転換し形質転換株を得た。次に、該形
質転換株をペンアッセイ培地（Difco社製）を用いて、3
0℃で16時間振とう培養した後、遠心分離法により培養
上清と菌体を分離した。培養上清に含まれるヒト成長ホ
ルモンの免疫活性の測定には、抗ヒト成長ホルモン血清
を用いた酵素免疫測定法（前述）を用いた。該形質転換
株（MT−8402、FERM BP−925）の培養上清に、ヒト成
長ホルモンに対する免疫活性が認められた。その分泌生
産量は、10mg／であった。

次に、ヒト成長ホルモンを産生する形質転換株からアル
カリ法でプラスミド（pESG84）を調製した後、該プラス
ミド（pESG84）の制限酵素地図を作成をした結果、ヒト
成長ホルモンを分泌産生する形質転換株より得られたプ
ラスミド（pESG84）は、本発明の発現・分泌ベクターpE
S84とヒト成長ホルモン遺伝子（DNA断片Ｃ（前述））と
からなる組み換え体DNA分子であることが確認された。

【図面の簡単な説明】

第１図は、pNPA84DNAにおける遺伝子の発現およびその
結果産生された蛋白質の分泌に関与するDNA断片のDNA塩
基配列を示す図であり、 第２図は、所望の蛋白質を結合させることが可能な制限
酵素切断部位を有するDNA断片のDNA塩基配列を示す図で
あり、 第３図は、発現・分泌ベクターpES84における遺伝子の
発現およびその結果産生された蛋白質の分泌に関与する
DNA断片とその下流に存在する所望の蛋白質をコードす
る制限酵素切断部位を有するDNA断片のDNA塩基配列を示
す図である。 なお、第１図、第２図、第３図において、Ａはアデニン
を、Ｃはシトシンを、Ｇはグアニンを、Ｔはチミンをそ
れぞれ示す。 第４図は、中性プロテアーゼのプレプロタンパクをコー
ドするDNA塩基配列に種々の長さの欠失を設けたDNA断片
を作成し、分泌シグナルを欠くα−アミラーゼ遺伝子を
結合させた組み換え体DNA分子の作成法を示す図であ
り、 第５図は、発現・分泌ベクターpES84の創製法を示す図
であり、 第６図は、プラスミドpESI84の創製法を示す図であり、 第７図は、プラスミドpESG84の創製法を示す図であり、 なお、第４図、第５図、第６図、第７図において １は、中性プロテアーゼ遺伝子の発現に関与する領域、 ２は、中性プロテアーゼのプレプロタンパクをコードす
るDNA断片 ３は、発現・分泌ベクターpNPA84およびpES84が有する
蛋白質の分泌に関与する領域 ４は、中性プロテアーゼをコードするDNA断片 ５は、α−アミラーゼ構造遺伝子 ６は、ヒト−β−インターフェロン構造遺伝子 ７は、ヒト成長ホルモン構造遺伝子 ８は、制限酵素切断部位を有するDNA断片を、それぞれ
示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/56 (Ｃ１２Ｎ 15/75 Ｃ１２Ｒ 1:07） 審査官 佐伯 裕子 (56)参考文献 特開 昭60−141290（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−210986（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−91980（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−19092（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−132895（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２（２) （1985）Ｐ．75−86 Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１（1984）Ｐ. 265−278 Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．95（１）（1984) Ｐ．87−94 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，156（１) （1983）Ｐ．327−337 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅ ｓ．Ｃｏｍｍｏｎ．，112（２）（1983) Ｐ．678−683 Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏｌ．，46（５）（1983）Ｐ．1059− 1065

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】バチルス・アミロリキファシエンスＦ株の
   菌体外中性プロテアーゼに由来し、遺伝子の発現および
   その結果産生された蛋白質の分泌に関与する領域を含む
   塩基配列の下流に、所望の蛋白質をコードする遺伝子を
   含むDNA塩基配列を結合させることが可能な制限酵素切
   断部位を有する塩基配列の片方の鎖が下記に示す順序で
   あることを特徴とする塩基配列。
2. 【請求項２】バチルス・アミロリキファシエンスＦ株の
   菌体外中性プロテアーゼに由来し、遺伝子の発現および
   その結果産生された蛋白質の分泌に関与する領域を含む
   塩基配列の下流に、所望の蛋白質をコードする遺伝子を
   含むDNA塩基配列を結合させることが可能な制限酵素切
   断部位を有する塩基配列の片方の鎖が下記に示す順序で
   ある塩基配列の全部を含み、該配列がバチルス属細菌で
   複製可能なプラスミドまたはファージに由来するDNA塩
   基配列に結合していることを特徴とする発現・分泌ベク
   ター。
3. 【請求項３】バチルス属細菌で複製可能なプラスミド
   が、プラスミドpUB110由来であることを特徴とする特許
   請求の範囲第２項に記載の発現・分泌ベクターpES84。