JPH0638741A - ヒラメ成長ホルモンの製造法 - Google Patents
ヒラメ成長ホルモンの製造法Info
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- JPH0638741A JPH0638741A JP10388892A JP10388892A JPH0638741A JP H0638741 A JPH0638741 A JP H0638741A JP 10388892 A JP10388892 A JP 10388892A JP 10388892 A JP10388892 A JP 10388892A JP H0638741 A JPH0638741 A JP H0638741A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ヒラメ成長ホルモン遺伝子を保有するバチル
ス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）を培
養して同ホルモンを製造する。 【効果】 同ホルモンは、菌体外に分泌されしかも分解
されることがないので、きわめて効率よく同ホルモンを
工業生産できる。
ス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）を培
養して同ホルモンを製造する。 【効果】 同ホルモンは、菌体外に分泌されしかも分解
されることがないので、きわめて効率よく同ホルモンを
工業生産できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、バイオテクノロジーに
関するものであり、更に詳細には、本発明は、ヒラメ成
長ホルモン遺伝子を保有するバチルス・ブレビス、並び
にヒラメ成長ホルモン遺伝子を保有するバチルス・ブレ
ビスを培養し、培養物中にヒラメ成長ホルモンを生成蓄
積せしめこれを採取することを特徴とする該ホルモンの
製造法に関する。
関するものであり、更に詳細には、本発明は、ヒラメ成
長ホルモン遺伝子を保有するバチルス・ブレビス、並び
にヒラメ成長ホルモン遺伝子を保有するバチルス・ブレ
ビスを培養し、培養物中にヒラメ成長ホルモンを生成蓄
積せしめこれを採取することを特徴とする該ホルモンの
製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】魚類の成長には、ほ乳類や鳥類と同様そ
れぞれの種族に特有な成長ホルモンが関与している。こ
の魚類成長ホルモンが養殖魚に応用できればその実用価
値は非常に高い。遺伝子操作技術による魚類成長ホルモ
ンの製造は種々検討されつつあり、これにより得られた
組換え体魚類成長ホルモンの実用化の検討も報告されて
きている。たとえばサケ成長ホルモンのサケ、マス養殖
への応用（特開昭６０−２１４７９８号公報）、ブリ成
長ホルモンのハマチ養殖への応用（特開昭６３−１５２
９８５号）、ヒラメ成長ホルモンのヒラメ養殖への応用
（特開平２−２３８８４号）が考えられている。
れぞれの種族に特有な成長ホルモンが関与している。こ
の魚類成長ホルモンが養殖魚に応用できればその実用価
値は非常に高い。遺伝子操作技術による魚類成長ホルモ
ンの製造は種々検討されつつあり、これにより得られた
組換え体魚類成長ホルモンの実用化の検討も報告されて
きている。たとえばサケ成長ホルモンのサケ、マス養殖
への応用（特開昭６０−２１４７９８号公報）、ブリ成
長ホルモンのハマチ養殖への応用（特開昭６３−１５２
９８５号）、ヒラメ成長ホルモンのヒラメ養殖への応用
（特開平２−２３８８４号）が考えられている。
【０００３】しかし、これらの成長ホルモン遺伝子産物
はいずれも菌体内に蓄積されるため、目的とする遺伝子
産物を純粋な形で取得するまでの過程で、目的物の菌体
からの抽出及び抽出物からの精製に多大な時間と労力と
を要するだけでなく、目的とする物質を活性のある完全
な形で純粋に得ることが容易でない。
はいずれも菌体内に蓄積されるため、目的とする遺伝子
産物を純粋な形で取得するまでの過程で、目的物の菌体
からの抽出及び抽出物からの精製に多大な時間と労力と
を要するだけでなく、目的とする物質を活性のある完全
な形で純粋に得ることが容易でない。
【０００４】一方、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細
菌は古くから種々の菌体外酵素の生産菌として工業的に
利用されてきており、これら菌体外酵素の遺伝子のプロ
モーターおよびシグナルペプチドをコードするＤＮＡ領
域をクローニングし、その下流に目的とする蛋白質の構
造遺伝子を連結し、これをバチルス属菌に導入すれば、
目的とする蛋白質を遺伝子産物として菌体外へ分泌させ
ることが可能になると考えられる。
菌は古くから種々の菌体外酵素の生産菌として工業的に
利用されてきており、これら菌体外酵素の遺伝子のプロ
モーターおよびシグナルペプチドをコードするＤＮＡ領
域をクローニングし、その下流に目的とする蛋白質の構
造遺伝子を連結し、これをバチルス属菌に導入すれば、
目的とする蛋白質を遺伝子産物として菌体外へ分泌させ
ることが可能になると考えられる。
【０００５】バチルス属菌においては、分泌される蛋白
質はアミノ末端側におよそ２０−３０アミノ酸残基から
なるシグナルペプチドを持ち前駆体として合成された
後、成熟した蛋白質になると考えられており、すでにバ
チルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のα−アミラ
ーゼ遺伝子（Ｉ．Ｐａｌｖａら、ジーン（Ｇｅｎｅ），
２２，２２９（１９８３））、バチルス・リケニフォル
ミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉ
ｓ）のペニシリナーゼ遺伝子（Ｓ．Ｃｈａｎｇら、モレ
キュラー・クローニング・アンド・ジーン・レギュレー
ション・イン・バチライ（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｉ）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ，６５９頁、１９８２年）、バチルス・サチルス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のα−アミラーゼ
遺伝子（Ｈ．Ｙａｍａｚａｋｉら、ジャーナル・オブ・
バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）１５
６，３２７（１９８３））がクローン化され、これらの
シグナルペプチドを利用した異種蛋白質の分泌が報告さ
れている。
質はアミノ末端側におよそ２０−３０アミノ酸残基から
なるシグナルペプチドを持ち前駆体として合成された
後、成熟した蛋白質になると考えられており、すでにバ
チルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のα−アミラ
ーゼ遺伝子（Ｉ．Ｐａｌｖａら、ジーン（Ｇｅｎｅ），
２２，２２９（１９８３））、バチルス・リケニフォル
ミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉ
ｓ）のペニシリナーゼ遺伝子（Ｓ．Ｃｈａｎｇら、モレ
キュラー・クローニング・アンド・ジーン・レギュレー
ション・イン・バチライ（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｉ）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ，６５９頁、１９８２年）、バチルス・サチルス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のα−アミラーゼ
遺伝子（Ｈ．Ｙａｍａｚａｋｉら、ジャーナル・オブ・
バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）１５
６，３２７（１９８３））がクローン化され、これらの
シグナルペプチドを利用した異種蛋白質の分泌が報告さ
れている。
【０００６】上記した異種蛋白質の分泌生産には、主に
バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ）が宿主として用いられているが、この微生物は菌
体外プロテアーゼを多量に生産するため、組換えＤＮＡ
技術を用いて分泌された異種蛋白質は分解を受け、その
蓄積量は著しく減少する。
バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ）が宿主として用いられているが、この微生物は菌
体外プロテアーゼを多量に生産するため、組換えＤＮＡ
技術を用いて分泌された異種蛋白質は分解を受け、その
蓄積量は著しく減少する。
【０００７】これに対し、鵜高らはバチルス・ブレビス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）にはプロテアーゼ
を生産しない菌株が多いことを見いだし、その１菌株バ
チルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ Ｐ−７２２４：特開
昭６０−５８０７４号公報、特開昭６２−２０１５８９
号公報参照）の主要菌体外タンパク質［Ｈ．Ｙａｍａｇ
ａｔａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，１２３
９（１９８７）；塚越規弘、日本農芸化学会誌，６１，
６８（１９８７）および特開昭６２−２０１５８３号公
報にそれぞれ“ｏｕｔｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ
ｍｉｄｄｌｅｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ”、“菌体外タ
ンパク質”として記載されている。］遺伝子のプロモー
ターおよび該主要菌体外タンパク質の１種であるＭＷタ
ンパク質（ｍｉｄｄｌｅ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）
のシグナルペプチドをコードする領域を用いて分泌ベク
ターを作製し、本菌株を宿主としたα−アミラーゼ（特
開昭６２−２０１５８３号公報、Ｈ．Ｙａｍａｇａｔａ
ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，１２３９（１
９８７）やブタペプシノーゲン（鵜高重三、日本農芸化
学会昭和６２年度大会講演要旨集、ｐ８３７−８３８；
塚越規弘、日本農芸化学会誌，６１，６８（１９８
７））の分泌生産に成功している。
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）にはプロテアーゼ
を生産しない菌株が多いことを見いだし、その１菌株バ
チルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ Ｐ−７２２４：特開
昭６０−５８０７４号公報、特開昭６２−２０１５８９
号公報参照）の主要菌体外タンパク質［Ｈ．Ｙａｍａｇ
ａｔａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，１２３
９（１９８７）；塚越規弘、日本農芸化学会誌，６１，
６８（１９８７）および特開昭６２−２０１５８３号公
報にそれぞれ“ｏｕｔｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ
ｍｉｄｄｌｅｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ”、“菌体外タ
ンパク質”として記載されている。］遺伝子のプロモー
ターおよび該主要菌体外タンパク質の１種であるＭＷタ
ンパク質（ｍｉｄｄｌｅ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）
のシグナルペプチドをコードする領域を用いて分泌ベク
ターを作製し、本菌株を宿主としたα−アミラーゼ（特
開昭６２−２０１５８３号公報、Ｈ．Ｙａｍａｇａｔａ
ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，１２３９（１
９８７）やブタペプシノーゲン（鵜高重三、日本農芸化
学会昭和６２年度大会講演要旨集、ｐ８３７−８３８；
塚越規弘、日本農芸化学会誌，６１，６８（１９８
７））の分泌生産に成功している。
【０００８】また、高木らは、バチルス・ブレビスの中
でプロテアーゼを菌体外に生産しない菌株バチルス・ブ
レビスＨＰＤ３１（なお、この菌株は本明細書における
バチルス・ブレビスＨ１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８
７）と同一菌株である）を分離し、これを宿主として耐
熱性α−アミラーゼの高分泌生産（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，５８，２７７９−２３８０（１９８
９））や、山形らによるヒトＥＧＦの高分泌生産（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，３
５８９−３５９３（１９８９））に成功している。
でプロテアーゼを菌体外に生産しない菌株バチルス・ブ
レビスＨＰＤ３１（なお、この菌株は本明細書における
バチルス・ブレビスＨ１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８
７）と同一菌株である）を分離し、これを宿主として耐
熱性α−アミラーゼの高分泌生産（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，５８，２７７９−２３８０（１９８
９））や、山形らによるヒトＥＧＦの高分泌生産（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，３
５８９−３５９３（１９８９））に成功している。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明が解決しようと
する課題は、ヒラメ成長ホルモンを菌体外に多量に分泌
ししかもそれを分解することなく効率的に工業生産でき
る新しいシステムを開発することである。
する課題は、ヒラメ成長ホルモンを菌体外に多量に分泌
ししかもそれを分解することなく効率的に工業生産でき
る新しいシステムを開発することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】上記した目的を達成する
ため、本発明者らはヒラメ成長ホルモンを効率よく生産
させる方法を提供すべく鋭意研究を重ねたところ、バチ
ルス・ブレビスを宿主として用いてヒラメ成長ホルモン
遺伝子を発現させることにより、培養物中に著量のヒラ
メ成長ホルモンが生産されることを見いだし、本発明を
完成するに至った。
ため、本発明者らはヒラメ成長ホルモンを効率よく生産
させる方法を提供すべく鋭意研究を重ねたところ、バチ
ルス・ブレビスを宿主として用いてヒラメ成長ホルモン
遺伝子を発現させることにより、培養物中に著量のヒラ
メ成長ホルモンが生産されることを見いだし、本発明を
完成するに至った。
【００１１】すなわち本発明は、バチルス・ブレビスを
宿主として用いるヒラメ成長ホルモンの製造に関するも
のであって、その具体的態様は次のとおりである。
宿主として用いるヒラメ成長ホルモンの製造に関するも
のであって、その具体的態様は次のとおりである。
【００１２】（１）ヒラメ成長ホルモン遺伝子を保有す
るバチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉ
ｓ）
るバチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉ
ｓ）
【００１３】（２）ヒラメ成長ホルモン遺伝子を保有す
るバチルス・ブレビスを培養することによりヒラメ成長
ホルモンを培養物中に生成、蓄積せしめ、これを採取す
ることを特徴とする該ホルモンの製造法。
るバチルス・ブレビスを培養することによりヒラメ成長
ホルモンを培養物中に生成、蓄積せしめ、これを採取す
ることを特徴とする該ホルモンの製造法。
【００１４】（３）上記（１）、（２）におけるバチル
ス・ブレビスとしてバチルス・ブレビスＨ１０２（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ Ｈ１０２）の使用。
ス・ブレビスとしてバチルス・ブレビスＨ１０２（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ Ｈ１０２）の使用。
【００１５】ヒラメ成長ホルモンをコードするＤＮＡと
しては、ヒラメ成長ホルモンをコードするものであれば
いずれでもよく、例えば、ヒラメ成長ホルモンの産生細
胞であるヒラメ脳下垂体のポリ（Ａ）ＲＮＡより調製し
たｃＤＮＡライブラリーからクローン化されたものが挙
げられ、その具体例としては、Ｈ．Ｍｏｒｉら（Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，３９
７７（１９８９））の方法でクローン化されたＤＮＡが
挙げられる。このヒラメ成長ホルモン遺伝子を保持する
ｐＦＧＨは大腸菌 ＨＢ１０１株に導入され、通商産業
省工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に受託番
号第１２６６５号、ＦＥＲＭ Ｐ−１２６６５として寄
託されている。
しては、ヒラメ成長ホルモンをコードするものであれば
いずれでもよく、例えば、ヒラメ成長ホルモンの産生細
胞であるヒラメ脳下垂体のポリ（Ａ）ＲＮＡより調製し
たｃＤＮＡライブラリーからクローン化されたものが挙
げられ、その具体例としては、Ｈ．Ｍｏｒｉら（Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，３９
７７（１９８９））の方法でクローン化されたＤＮＡが
挙げられる。このヒラメ成長ホルモン遺伝子を保持する
ｐＦＧＨは大腸菌 ＨＢ１０１株に導入され、通商産業
省工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に受託番
号第１２６６５号、ＦＥＲＭ Ｐ−１２６６５として寄
託されている。
【００１６】本発明に用いるベクターとしては、微生物
中で複製可能なものであればいずれでもよいが、例え
ば、バチルス属細菌を宿主とする系ではＳｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のｐＵＢ１１０をベ
ースとするものが用いられる。宿主内に安定に保持され
るためには、抗生物質等に対する耐性遺伝子（例えばエ
リスロマイシン耐性）を保有させることも出来る。
中で複製可能なものであればいずれでもよいが、例え
ば、バチルス属細菌を宿主とする系ではＳｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のｐＵＢ１１０をベ
ースとするものが用いられる。宿主内に安定に保持され
るためには、抗生物質等に対する耐性遺伝子（例えばエ
リスロマイシン耐性）を保有させることも出来る。
【００１７】プロモーター、ＳＤ、シグナルペプチドコ
ード遺伝子としては、宿主内で機能するものであればい
ずれでも良いが、バチルス・ブレビス４７またはバチル
ス・ブレビスＨ１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）由
来のプロモーター、ＳＤ、シグナルペプチドをコードす
る遺伝子を用いるのが有効である。
ード遺伝子としては、宿主内で機能するものであればい
ずれでも良いが、バチルス・ブレビス４７またはバチル
ス・ブレビスＨ１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）由
来のプロモーター、ＳＤ、シグナルペプチドをコードす
る遺伝子を用いるのが有効である。
【００１８】バチルス・ブレビス４７のＭＷＰプロモー
ター、ＳＤ配列、シグナルペプチド遺伝子を保持する発
現ベクターｐＮＵ２００は既知であり（鵜高重三、日本
農芸化学会誌，６１，ｐ６６９（１９８７））、このベ
クターを利用することが出来る。
ター、ＳＤ配列、シグナルペプチド遺伝子を保持する発
現ベクターｐＮＵ２００は既知であり（鵜高重三、日本
農芸化学会誌，６１，ｐ６６９（１９８７））、このベ
クターを利用することが出来る。
【００１９】プラスミドを構築する方法としては、常法
が適宜用いられ、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎ
ｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｅｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ（１９８２）に記載の方法などが例示される。
が適宜用いられ、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎ
ｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｅｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ（１９８２）に記載の方法などが例示される。
【００２０】ベクターのプロモーター、シグナルペプチ
ドコード遺伝子領域の下流にヒラメ成長ホルモン遺伝子
をｉｎ ｆｒａｍｅに連結することによって、ヒラメ成
長ホルモンが発現する発現ベクターを構築することがで
きる。連結の方法は、融合タンパク質としてシグナルペ
プチド下流にヒラメ成長ホルモンをコードする遺伝子を
連結する。
ドコード遺伝子領域の下流にヒラメ成長ホルモン遺伝子
をｉｎ ｆｒａｍｅに連結することによって、ヒラメ成
長ホルモンが発現する発現ベクターを構築することがで
きる。連結の方法は、融合タンパク質としてシグナルペ
プチド下流にヒラメ成長ホルモンをコードする遺伝子を
連結する。
【００２１】ヒラメ成長ホルモン遺伝子を組み込んだ発
現ベクターで形質転換する微生物としては、ベクター、
プロモーターが発現可能な微生物であれば何れでもよ
く、例えば、バチルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ Ｐ−
７２２４）、バチルス・ブレビスＨ１０２（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１０８７）などが挙げられるが、好適にはバチル
ス・ブレビスＨ１０２が用いられる。微生物を形質転換
する方法は、公知の方法でよく、例えばＴａｋａｈａｓ
ｈｉらの方法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５６，１
１３０（１９８３））またはＴａｋａｇｉらの方法（Ａ
ｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３０９９−３１００
（１９８９））等が例示される。
現ベクターで形質転換する微生物としては、ベクター、
プロモーターが発現可能な微生物であれば何れでもよ
く、例えば、バチルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ Ｐ−
７２２４）、バチルス・ブレビスＨ１０２（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１０８７）などが挙げられるが、好適にはバチル
ス・ブレビスＨ１０２が用いられる。微生物を形質転換
する方法は、公知の方法でよく、例えばＴａｋａｈａｓ
ｈｉらの方法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５６，１
１３０（１９８３））またはＴａｋａｇｉらの方法（Ａ
ｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３０９９−３１００
（１９８９））等が例示される。
【００２２】得られた形質転換体の培養に用いる培地
は、形質転換体が生育して目的とする外来遺伝子産物を
産生しうるものであれば如何なるのでもよい。
は、形質転換体が生育して目的とする外来遺伝子産物を
産生しうるものであれば如何なるのでもよい。
【００２３】該培地に含有される炭素源としては、例え
ばグルコース、グリセロール、澱粉、デキストリン、糖
蜜、尿素、有機酸等が考えられる。該培地に含有される
窒素源としては、カゼイン、ポリペプトン、肉エキス、
酵母エキス、カザミノ酸、グリシンなどの有機窒素源、
硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源
などが用いられる。また、糖と無機窒素源を主とする合
成培地を用いて培養しても良い。栄養要求性を示す菌
は、その生育に必要な栄養物質を培地に添加すればよ
い。該栄養物質としては、アミノ酸類、ビタミン類、核
酸、塩類などが挙げられる。
ばグルコース、グリセロール、澱粉、デキストリン、糖
蜜、尿素、有機酸等が考えられる。該培地に含有される
窒素源としては、カゼイン、ポリペプトン、肉エキス、
酵母エキス、カザミノ酸、グリシンなどの有機窒素源、
硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源
などが用いられる。また、糖と無機窒素源を主とする合
成培地を用いて培養しても良い。栄養要求性を示す菌
は、その生育に必要な栄養物質を培地に添加すればよ
い。該栄養物質としては、アミノ酸類、ビタミン類、核
酸、塩類などが挙げられる。
【００２４】また、培養に際して必要があれば、培地に
抗生物質例えばペニシリン、エリスロマイシン、クロラ
ムフェニコール、バシトラシン、Ｄ−サイクロセリン、
アンピシリンなどが加えられる。更に必要により、消泡
剤、例えば大豆油、ラード油各種界面活性剤などを培地
に加えても良い。
抗生物質例えばペニシリン、エリスロマイシン、クロラ
ムフェニコール、バシトラシン、Ｄ−サイクロセリン、
アンピシリンなどが加えられる。更に必要により、消泡
剤、例えば大豆油、ラード油各種界面活性剤などを培地
に加えても良い。
【００２５】培地の初発ｐＨは５．０〜９．０であり、
さらに好ましくは６．５〜７．５である。培養温度は通
常１５℃〜４２℃、さらに好ましくは２４℃〜３７℃で
あり、培養時間は通常１６〜１６６時間、さらに好まし
くは２４〜９６時間である。
さらに好ましくは６．５〜７．５である。培養温度は通
常１５℃〜４２℃、さらに好ましくは２４℃〜３７℃で
あり、培養時間は通常１６〜１６６時間、さらに好まし
くは２４〜９６時間である。
【００２６】本発明によれば、形質転換体を上記のよう
にして培養することによって、培養物、つまり菌体及び
培養液に著量のヒラメ成長ホルモンが効率的に生成、蓄
積されるので、培養終了後、それ自体公知の方法、例え
ば遠心分離、濾過などで菌体と上清とを分離し、それぞ
れから常法にしたがってヒラメ成長ホルモンを分離精製
する。
にして培養することによって、培養物、つまり菌体及び
培養液に著量のヒラメ成長ホルモンが効率的に生成、蓄
積されるので、培養終了後、それ自体公知の方法、例え
ば遠心分離、濾過などで菌体と上清とを分離し、それぞ
れから常法にしたがってヒラメ成長ホルモンを分離精製
する。
【００２７】この場合、形質転換する微生物として、例
えばバチルス・ブレビスＨ１０２等を使用すれば、電気
パルス法等によって容易に形質転換することが出来るの
みでなく、目的とする産物を菌体外に生産するというす
ぐれた性質を有しているので、上記のようにして得られ
た培養上清に含まれる外来遺伝子産物を容易に得ること
が出来る。また、バチルス・ブレビスＨ１０２等は、プ
ロテアーゼを産生しないので、菌体外に分泌された外来
遺伝子産物つまりヒラメ成長ホルモンを分解したり、変
性したりすることがなく、きわめて効率的にヒラメ成長
ホルモンを製造することができる。
えばバチルス・ブレビスＨ１０２等を使用すれば、電気
パルス法等によって容易に形質転換することが出来るの
みでなく、目的とする産物を菌体外に生産するというす
ぐれた性質を有しているので、上記のようにして得られ
た培養上清に含まれる外来遺伝子産物を容易に得ること
が出来る。また、バチルス・ブレビスＨ１０２等は、プ
ロテアーゼを産生しないので、菌体外に分泌された外来
遺伝子産物つまりヒラメ成長ホルモンを分解したり、変
性したりすることがなく、きわめて効率的にヒラメ成長
ホルモンを製造することができる。
【００２８】
【作用】本発明のヒラメ成長ホルモンの製造法によれ
ば、ヒラメ成長ホルモンを効率よく量産化することがで
きる。従って、ヒラメ成長ホルモンの持つヒラメの成長
促進作用を利用して、ヒラメ養殖産業分野に大きく貢献
することができる。
ば、ヒラメ成長ホルモンを効率よく量産化することがで
きる。従って、ヒラメ成長ホルモンの持つヒラメの成長
促進作用を利用して、ヒラメ養殖産業分野に大きく貢献
することができる。
【００２９】以下本発明を実施例により更に詳しく説明
する。
する。
【００３０】
【実施例１】 ヒラメ成長ホルモン発現プラスミドｐＮＵ２１７ｆＧＨ
の構築と形質転換体の調製
の構築と形質転換体の調製
【００３１】ヒラメ成長ホルモン遺伝子（森ら，Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１７，３９７７（１９
８９））を含むベクターｐＦＧＨ（図１）をＰｖｕIIで
消化、ＸｈｏＩ Ｌｉｎｋｅｒを付加した後、ＢａｍＨ
Ｉ、ＸｈｏＩで消化して１．１ｋｂのＤＮＡ断片を得、
さらに大腸菌ベクターｐＢＲＡＮ４のＢａｍＨＩ、Ｘｈ
ｏＩ部位に挿入し、ｐＨＧＨ１を得た。ｐＨＧＨ１のヒ
ラメ成長ホルモン遺伝子にはヒラメ本来のシグナル配列
が含まれており、微生物による効果的な分泌発現には不
要な領域と考えられた。従って、ヒラメ成長ホルモンの
効率的な分泌発現のために以下のような方法でこの配列
を除去し、図２に示したアミノ酸配列を導入した。つま
り、ｐＨＧＨ１をＨａｅII、ＸｈｏＩで切断しＨａｅII
部位の上流に図２に示したアミノ酸配列をコードする合
成ＤＮＡを連結し、ｐＢＲＡＮ４のＮｃｏｌＩ、Ｘｈｏ
Ｉ部位に挿入しｐＨＧＨ１２を構築した。
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１７，３９７７（１９
８９））を含むベクターｐＦＧＨ（図１）をＰｖｕIIで
消化、ＸｈｏＩ Ｌｉｎｋｅｒを付加した後、ＢａｍＨ
Ｉ、ＸｈｏＩで消化して１．１ｋｂのＤＮＡ断片を得、
さらに大腸菌ベクターｐＢＲＡＮ４のＢａｍＨＩ、Ｘｈ
ｏＩ部位に挿入し、ｐＨＧＨ１を得た。ｐＨＧＨ１のヒ
ラメ成長ホルモン遺伝子にはヒラメ本来のシグナル配列
が含まれており、微生物による効果的な分泌発現には不
要な領域と考えられた。従って、ヒラメ成長ホルモンの
効率的な分泌発現のために以下のような方法でこの配列
を除去し、図２に示したアミノ酸配列を導入した。つま
り、ｐＨＧＨ１をＨａｅII、ＸｈｏＩで切断しＨａｅII
部位の上流に図２に示したアミノ酸配列をコードする合
成ＤＮＡを連結し、ｐＢＲＡＮ４のＮｃｏｌＩ、Ｘｈｏ
Ｉ部位に挿入しｐＨＧＨ１２を構築した。
【００３２】次に、ｐＨＧＨ１２のＮｃｏＩ ｓｉｔｅ
をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した後ＸｈｏＩ
で切断し０．９５ｋｂのヒラメ成長ホルモンを含むＤＮ
Ａ断片を得た。一方大腸菌ベクターｐＴＡ−Ｔｒｐ（図
３）のＥｃｏＲＩ ｓｉｔｅをＴ４ＤＮＡポリメラーゼ
で平滑末端化した後ＳａｌＩで切断し、３．７ｋｂＤＮ
Ａ断片を得、前記の０．９５ｋｂＤＮＡとＤＮＡリガー
ゼで連結しｐＨＧＨ８０を得た。
をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した後ＸｈｏＩ
で切断し０．９５ｋｂのヒラメ成長ホルモンを含むＤＮ
Ａ断片を得た。一方大腸菌ベクターｐＴＡ−Ｔｒｐ（図
３）のＥｃｏＲＩ ｓｉｔｅをＴ４ＤＮＡポリメラーゼ
で平滑末端化した後ＳａｌＩで切断し、３．７ｋｂＤＮ
Ａ断片を得、前記の０．９５ｋｂＤＮＡとＤＮＡリガー
ゼで連結しｐＨＧＨ８０を得た。
【００３３】更に、このプラスミドをＥｃｏＴ２２１，
ＮｒｕＩで消化後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化
し、ＤＮＡリガーゼ処理してｐＨＧＨ８１を得た（図
３）。
ＮｒｕＩで消化後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化
し、ＤＮＡリガーゼ処理してｐＨＧＨ８１を得た（図
３）。
【００３４】分泌発現ベクターｐＮＵ２００（４．５ｋ
ｂ）［鵜高重三，日本農芸化学会誌，６１，６６９（１
９８７）］はバチルス・ブレビス４７のＭＷＰ遺伝子の
プロモーター、シグナルペプチド、ＭＷタンパク質Ｎ末
端の１部（９アミノ酸）を持つベクターである（図
４）。
ｂ）［鵜高重三，日本農芸化学会誌，６１，６６９（１
９８７）］はバチルス・ブレビス４７のＭＷＰ遺伝子の
プロモーター、シグナルペプチド、ＭＷタンパク質Ｎ末
端の１部（９アミノ酸）を持つベクターである（図
４）。
【００３５】このｐＮＵ２００のＢａｍＨＩ部位はＭＷ
Ｐタンパク質Ｎ末端側９アミノ酸目のところにあり、こ
の部位をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した。さ
きに得られたプラスミドｐＨＧＨ８１をＥｃｏＲＩ、Ｅ
ｃｏＴ１４Ｉで消化後平滑末端化し１．０ｋｂＤＮＡを
得た。この両ＤＮＡを混合しＤＮＡリガーゼ処理の後バ
チルス・ブレビスＨ１０２を形質転換し、ｐＮＵ２１７
ｆＧＨを保持する形質転換体を得た。
Ｐタンパク質Ｎ末端側９アミノ酸目のところにあり、こ
の部位をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した。さ
きに得られたプラスミドｐＨＧＨ８１をＥｃｏＲＩ、Ｅ
ｃｏＴ１４Ｉで消化後平滑末端化し１．０ｋｂＤＮＡを
得た。この両ＤＮＡを混合しＤＮＡリガーゼ処理の後バ
チルス・ブレビスＨ１０２を形質転換し、ｐＮＵ２１７
ｆＧＨを保持する形質転換体を得た。
【００３６】
【実施例２】 形質転換体の培養及びヒラメ成長ホルモンの生産
【００３７】ｐＮＵ２１７ｆＧＨを保有するバチルス・
ブレビスＨ１０２を５’ＰＹ培地（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２２７９（１９８９））に植
え、３０℃で２日間振とう培養した。上記培養液を遠心
分離し、その上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動（Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０（１９８０））
で分離し、ウサギ抗ヒラメ成長ホルモン血清を用いたウ
ェスタンブロッティング法（Ａｎａｌ，Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，１１２，１９５（１９８１））により分析した。
その結果、分子量２２ｋｄと２０ｋｄの位置にヒラメ成
長ホルモンタンパク質を検出した（図５）。ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動で分離される２２ｋｄと
２０ｋｄのヒラメ成長ホルモンをゲルから抽出し、気相
プロテインシークエンサーによってＮ末端アミノ酸配列
を解析した。その結果、２２ｋｄのタンパク質は図６の
ｆＧＨ１の配列を、２０ｋｄのタンパク質はｆＧＨ２の
配列であることが判明した。これらのタンパク質はいま
までに分泌発現の例はなく、本発明による方法により初
めて菌体外に生産されたものである。
ブレビスＨ１０２を５’ＰＹ培地（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２２７９（１９８９））に植
え、３０℃で２日間振とう培養した。上記培養液を遠心
分離し、その上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動（Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０（１９８０））
で分離し、ウサギ抗ヒラメ成長ホルモン血清を用いたウ
ェスタンブロッティング法（Ａｎａｌ，Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，１１２，１９５（１９８１））により分析した。
その結果、分子量２２ｋｄと２０ｋｄの位置にヒラメ成
長ホルモンタンパク質を検出した（図５）。ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動で分離される２２ｋｄと
２０ｋｄのヒラメ成長ホルモンをゲルから抽出し、気相
プロテインシークエンサーによってＮ末端アミノ酸配列
を解析した。その結果、２２ｋｄのタンパク質は図６の
ｆＧＨ１の配列を、２０ｋｄのタンパク質はｆＧＨ２の
配列であることが判明した。これらのタンパク質はいま
までに分泌発現の例はなく、本発明による方法により初
めて菌体外に生産されたものである。
【００３８】
【発明の効果】本発明により、ヒラメ成長ホルモンが工
業規模で生産可能となり、このホルモンを利用すること
によってヒラメの養殖が大幅に促進され、水産業に大き
く貢献することができる。
業規模で生産可能となり、このホルモンを利用すること
によってヒラメの養殖が大幅に促進され、水産業に大き
く貢献することができる。
【図１】プラスミドｐＨＧＨ１２の構築図である。
【図２】プラスミドｐＨＧＨ１２の構築に使用した合成
ＤＮＡである。
ＤＮＡである。
【図３】プラスミドｐＨＧＨ８１の構築図である。
【図４】ヒラメ成長ホルモン発現プラスミドｐＮＵ２１
７ｆＧＨの構築図である。
７ｆＧＨの構築図である。
【図５】ヒラメ成長ホルモン蛋白質のウェスタンブロッ
ティング図である。
ティング図である。
【図６】ゲルから抽出した２２ｋｄ及び２０ｋｄのヒラ
メ成長ホルモンのＮ末端アミノ酸配列の解析図である。
メ成長ホルモンのＮ末端アミノ酸配列の解析図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:08） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:08） (72)発明者 宮 内 明 千葉県銚子市高田町３−850 (72)発明者 松 崎 淳 一 東京都世田谷区野毛２−29−15 ハイツグ リーン202号
Claims (3)
- 【請求項１】 ヒラメ成長ホルモン遺伝子を保有するバ
チルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉ
ｓ）。 - 【請求項２】 ヒラメ成長ホルモン遺伝子を保有するバ
チルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）
を培養することによりヒラメ成長ホルモンを培養物中に
生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするヒ
ラメ成長ホルモンの製造法。 - 【請求項３】 該バチルス・ブレビスがバチルス・ブレ
ビスＨ１０２（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ Ｈ１
０２）であることを特徴とする請求項１又は請求項２の
ヒラメ成長ホルモンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10388892A JPH0638741A (ja) | 1992-03-31 | 1992-03-31 | ヒラメ成長ホルモンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10388892A JPH0638741A (ja) | 1992-03-31 | 1992-03-31 | ヒラメ成長ホルモンの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0638741A true JPH0638741A (ja) | 1994-02-15 |
Family
ID=14365971
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10388892A Pending JPH0638741A (ja) | 1992-03-31 | 1992-03-31 | ヒラメ成長ホルモンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0638741A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4226842C1 (de) * | 1992-08-13 | 1994-02-24 | Shinohara Machinery Co | Vorrichtung zum Steuern einer Offsetdruckmaschine |
| US6506595B2 (en) | 1998-03-31 | 2003-01-14 | Itoham Foods Inc. | DNAs encoding new fusion proteins and processes for preparing useful polypeptides through expression of the DNAs |
| WO2004033682A1 (ja) * | 2002-10-10 | 2004-04-22 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | 超耐熱性エンドグルカナーゼの製造法 |
| US8597908B2 (en) | 2004-07-06 | 2013-12-03 | Kaneka Corporation | Process for producing protein A-like protein with use of Brevibacillus genus bacterium |
-
1992
- 1992-03-31 JP JP10388892A patent/JPH0638741A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4226842C1 (de) * | 1992-08-13 | 1994-02-24 | Shinohara Machinery Co | Vorrichtung zum Steuern einer Offsetdruckmaschine |
| US6506595B2 (en) | 1998-03-31 | 2003-01-14 | Itoham Foods Inc. | DNAs encoding new fusion proteins and processes for preparing useful polypeptides through expression of the DNAs |
| WO2004033682A1 (ja) * | 2002-10-10 | 2004-04-22 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | 超耐熱性エンドグルカナーゼの製造法 |
| US8597908B2 (en) | 2004-07-06 | 2013-12-03 | Kaneka Corporation | Process for producing protein A-like protein with use of Brevibacillus genus bacterium |
| US8889389B2 (en) | 2004-07-06 | 2014-11-18 | Kaneka Corporation | Process for producing protein A-like protein with use of Brevibacillus genus bacterium |
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