JP3686985B2 - 新規タンパク質及び該タンパク質をコードする遺伝子並びに該タンパク質の製造法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規タンパク質及び該タンパク質をコードする遺伝子並びに該タンパク質の製造方法に関する。更に詳細には、本発明は、新規な上皮細胞増殖因子（Epidermal Growth Factor：EGF）様生理活性を有するタンパク質及び該タンパク質をコードする遺伝子並びに該遺伝子を組み込んだバチルス属細菌を培養することにより、該タンパク質を培養物中に生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする該タンパク質の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＥＧＦは、ヒトや馬の尿中やウサギ、ラットおよびマウスの顎下腺から単離されており、哺乳動物の体内に存在していることが知られている（Adv. Metab. Dis., 8, 265(1975))。ヒト上皮細胞増殖因子（human Epidermal Growth Factor : h-EGF）は、５３個のアミノ酸からなる分子量約６，０００のペプチドで、分子内に３ヶ所のジスルフィド結合をもち配列番号１７に示されるアミノ酸配列であることが知られている（H. Gregory, Nature, 257, 325(1975))。
ＥＧＦの生理活性として現在までに報告されているものは、細胞増殖作用、胃酸分泌抑制作用、抗潰瘍作用、消化管粘膜保護作用、ＤＮＡ合成促進作用、角膜修復作用、カルシウム遊離促進作用、創傷治癒促進作用、抗炎症作用、鎮痛作用、肝細胞障害抑制作用及び毛胞退縮作用などがある（日本組織培養学会編、細胞成長因子、２０頁、朝倉書店 １９８４年）。ＥＧＦはこのような作用を有することから創傷治癒薬、抗潰瘍剤、抗癌剤補助剤などとしての様々な応用が試みられている（BIO INDUSTRY, 8, 275(1991))。
【０００３】
このようにＥＧＦについての種々の応用研究が進められている一方、同時にＥＧＦの効率的生産方法についても種々検討がなされており、遺伝子組換えによるＥＧＦの製造法も種々報告されている。特に恵比須らはバチルス・ブレビスＨＰＤ３１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１：なおこの菌株はバチルス・ブレビスＨ１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７））と同一菌株である）を宿主菌としたｈ−ＥＧＦの分泌生産系において、ｈ−ＥＧＦを培地中に約３ｇ／ｌ生産させることに成功している（特開平６−１３３７８２）。しかしその後、この菌株で継代培養を行うと、ｈ−ＥＧＦの生産性が低下する場合のあることが観察されている。継代培養で生産性が減少すると、種培養から数回の植え継ぎを行って徐々にスケールアップを重ね、大量培養を行う商業スケールでの培養において特に問題で、菌株が保有している能力を十分に発揮できず、最終的には低い生産量になることが想定される。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
このように従来技術では、ｈ−ＥＧＦの生産量が非常に少ない場合も認められ、産業上適用するためにはもう一段の技術開発が必要とされている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
このような技術の現状に鑑み、本発明者らは、発想の大転換を行い、ｈ−ＥＧＦを直接生産するのではなく、ｈ−ＥＧＦ様生理活性を有する新規タンパク質を見出しこれを生産すること、しかもこれを遺伝子工学による手法で安定的に工業生産すること、という全く新規な技術課題を設定し、この技術課題を解決することにより上記目的を達成することとした。
【０００６】
そこで本発明者らは、各方面から検討した結果、マウスＥＧＦ（配列番号１６：ｍ−ＥＧＦ）とヒトＥＧＦ（配列番号１７：ｈ−ＥＧＦ）は、ともに５３アミノ酸残基からなり、その高次構造は類似するがアミノ酸配列において１６アミノ酸が異なることにはじめて注目し、これら２種類のＥＧＦがキメラになった新規タンパク質を構築した。そしてこれらのタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだバチルス・ブレビスＨＰＤ３１を培養し、該タンパク質を分泌生産させたところ、該タンパク質のアミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸配列であれば継代培養を行っても安定に分泌生産されることが分かり、しかもこれらのタンパク質も天然のＥＧＦと同様の種々の生理活性を有することが明らかとなり、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、新規タンパク質及び該タンパク質をコードする遺伝子並びに該遺伝子を組み込んだバチルス属細菌を培養することにより、該タンパク質を培養物中に生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする新規タンパク質の製造法に関するものである。
以下、本発明について詳しく説明する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の新規タンパク質は、配列番号１に示すように５３アミノ酸から成り、Ｎ末端から数えて１０番目までのアミノ酸配列（Ａ領域とする）は配列番号１６のｍ−ＥＧＦのＮ末端から１０番目のアミノ酸配列と同一の配列である。
【０００９】
また、本発明のタンパク質のＮ末端から数えて１１番目から３３番目のアミノ酸配列（Ｂ領域とする）、３４番目から４７番目のアミノ酸配列（Ｃ領域とする）及び４８番目から５３番目のアミノ酸配列（Ｄ領域とする）は、配列番号１６に示すｍ−ＥＧＦと配列番号１７に示すｈ−ＥＧＦのアミノ酸配列各々の本発明タンパク質のＢ，Ｃ，Ｄ領域に相当する部分のアミノ酸配列を組み合わせた新規タンパク質である。
具体的にはＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２または３に示した何れかであり、Ｃ領域のアミノ酸配列は配列番号４または５であり、Ｄ領域のアミノ酸配列は配列番号６または７のアミノ酸配列である。さらに具体的には、本発明のタンパク質は配列番号８〜１１のアミノ酸配列で示されるタンパク質である。
但し、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ全ての領域が、配列番号１６のｍ−ＥＧＦと同じ配列のものはｍ−ＥＧＦそのものであって、本発明から除外されることはもちろんである。同様に、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ全ての領域が、配列番号１７のｈ−ＥＧＦと同じ配列のものはｈ−ＥＧＦそのものであって、本発明から除外される。
【００１０】
また、本タンパク質をコードする遺伝子は化学的に合成した遺伝子を用いることができ、合成遺伝子を用いる場合は発現系の細胞において最も容認されたコドンを採用した遺伝子が好適に使用出来る。
具体的には、配列番号１２〜１５に示す塩基配列を有する遺伝子などを用いることが出来る。
【００１１】
このようにして得た遺伝子を宿主菌内に導入、保持させるベクターは、宿主菌内で複製可能なプラスミドを利用することができる。例えば宿主菌が枯草菌（バチルス・ズブチリス：（Bacillus subtilis）やバチルス・ブレビスの系ではｐＵＢ１１０やｐＮＵ２００（鵜高重三、日本農芸化学会誌、６１、６６９（１９８７））、ｐＨＹ７００（S. Ebisu et al, Biosci. Biotech. Biochem, 56, 812-813(1992))、ｐＨＴ１１０（特開平６−１３３７８２）やこれらの派生体などのプラスミドを使用できる。
【００１２】
これらのプラスミドを構築する方法としては、公知の方法が適宜用いられ、例えばモレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリーマニュアル第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Molecular Cloning 2nd ed., A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989）に記載の方法などが例示される。
【００１３】
本発明において宿主菌として用いる細菌は、バチルス属に属する細菌であればよいが、枯草菌やバチルス・ブレビス、バチルス・チョーシネンシス（Bacillus choshinensis）などが好適に使用できる。
【００１４】
宿主菌を形質転換する方法は公知の方法で良く、例えば、枯草菌ではChang and Cohenの方法（S. Chang and S. N. Cohen, Molec. gen. Genet, 168, 111-115(1979))、バチルス・ブレビスではTakahashiらの方法（Takahashi et al, J. Bacteriol., 156, 1130(1983))またはTakagiらの方法（H. Takagi et al, Agric, Biol. Chem., 53, 3099-3100(1989))などが例示される。
【００１５】
得られた形質転換体の培養に用いる培地は、形質転換体が生育して本タンパク質を生産しうるものであれば如何なるものでもよい。
該培地に含有される炭素源としては、例えば、グルコース、シュークロース、グリセロール、澱粉、デキストリン、糖蜜、有機酸などが用いられる。また、窒素源としては、カゼイン、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸、尿素、グリシンなどの有機窒素源、硫酸アンモニウムなどの無機窒素源などが用いられる。その他、塩化カリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウムなどの無機塩が必要に応じて培地に加えられる。栄養要求性を示す菌はその生育に必要な栄養物質を培地に添加すればよい。該栄養物質としては、アミノ酸類、ビタミン類、核酸などが挙げられる。
【００１６】
また、培養に際して必要があれば、培地に抗生物質例えばペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、バシトラシン、Ｄ−サイクロセリン、アンピシリン、ネオマイシンなどを加える。更に必要により、消泡剤例えば大豆油、ラード油、各種界面活性剤などを加えてもよい。
【００１７】
培地の初発ｐＨは５．０〜９．０、さらに好ましくは６．５〜７．５である。培養温度は通常１５℃〜４２℃、さらに好ましくは２４℃〜３７℃であり、培養時間は通常１６〜１６６時間、さらに好ましくは２４〜９６時間である。
【００１８】
本発明で、形質転換体を前記の条件で培養することによって、培養物中に本タンパク質が生成、蓄積され、継代培養によっても安定に分泌生産される。
このようにして得られたタンパク質は公知の方法により、例えば膜処理、硫安分画法、クロマトグラフィーなど（蛋白質・核酸の基礎実験法、南江堂（１９８５））で精製することができる。
また、ｐＨ調整による等電点沈殿とＮａＣｌの添加による塩析を組み合わせることにより、非常に簡便かつ効率的に本タンパク質を精製することができる。
【００１９】
このようにして得られた本タンパク質の生理活性については既存の方法で測定することができる。例えば細胞増殖活性は、ラットの初代培養肝実質細胞を用いた細胞増殖試験で確認することができる（J. Antibiotics, 38, 1767-1773(1985))。また、ＤＮＡ合成刺激作用は3Ｈ−チミジンのヒト繊維芽細胞などを用いた取り込み試験で確認することができる（細胞成長因子、朝倉書店（１９８４））。
【００２０】
本発明では、新規なタンパク質を創製することによって、ＥＧＦ様生理活性を有するタンパク質を安定に分泌生産できるようになった。
また本タンパク質は天然のＥＧＦと同様な生理活性を有するので、天然ＥＧＦと同じ分野への適用が考えられる。
【００２１】
以下本発明を実施例により更に詳しく説明するが、これは例示的なものであり、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２２】
【実施例１】
（１）プラスミドｐＨＴ−ｈＥＧＦの構築
ｈ−ＥＧＦのアミノ酸配列をコードする合成遺伝子（ＢＩＯ ＩＮＤＵＳＴＲＹ，９，１００−１０７（１９９１））を鋳型にし、配列番号１８のｐｒｉｍｅｒ５及び配列番号１９のｐｒｉｍｅｒ３を使って、常法によりＰＣＲを行い、約２１０ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＡｐａＬＩとＰｓｔＩで切断し、５％アグリルアミドゲル電気泳動を行い２０５ｂｐ断片を切り出し、電気溶出法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）により回収した。
バチルス・ブレビスＨＰ９２６（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３８２）が保有するプラスミドｐＨＴ９２６より調製したプラスミドｐＨＴ１１０−ＥＧＦ（特開平６−１３３７８２）をＰｓｔＩで部分分解さらにＡｐａＬＩで完全分解し、０．８％アガロース電気泳動を行い、３．３ｋｂのＤＮＡ断片を切り出し、ＧＥＮＥ ＣＬＥＡＮ（Ｂｉｏ １０１，ＵＳＡ）にて回収し、先に得た２０５ｂｐのＤＮＡ断片とＴ４リガーゼでライゲーションし、配列番号１７のｈ−ＥＧＦのアミノ酸配列をコードする遺伝子を保有するプラスミドｐＨＴ−ｈＥＧＦを得た。
【００２３】
（２）プラスミドｐＨＴ−Ａ， ｐＨＴ−ＡＢ， ｐＨＴ−ＡＣ，ｐＨＴ−ＡＢＣ， ｐＨＴ−Ｂ， ｐＨＴ−Ｃ， ｐＨＴ−ＢＣの構築
▲１▼プラスミドｐＨＴ−Ａの構築
（１）で得たプラスミドｐＨＴ−ｈＥＧＦを鋳型にし、ｐｒｉｍｅｒＡ（配列番号２０）及びｐｒｉｍｅｒ３を使って、常法によりＰＣＲを行い、約１８０ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｈＩで切断し、１０％アクリルアミドゲル電気泳動後、電気溶出法によって回収しＤＮＡ断片Ａを得た。
（１）で得たプラスミドｐＨＴ−ｈＥＧＦを制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｈＩで切断し、アガロース電気泳動後回収し、これに先に得たＤＮＡ断片Ａを挿入しプラスミドｐＨＴ−Ａを得た。
【００２４】
▲２▼プラスミドｐＨＴ−Ｂの構築
▲１▼と同じ方法でｐｒｉｍｅｒ５及びｐｒｉｍｅｒＢ（配列番号２１）を使って、約１００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅し、制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｈＩで切断し、ＤＮＡ断片Ｂを得た。
ｐＨＴ−ｈＥＧＦを制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｈＩで切断し、先に得たＤＮＡ断片Ｂを挿入しプラスミドｐＨＴ−Ｂを得た。
【００２５】
▲３▼プラスミドｐＨＴ−Ｃの構築
▲１▼と同じ方法でｐｒｉｍｅｒＡ及びｐｒｉｍｅｒＣ（配列番号２２）を使って約１４０ｂｐのＤＮＡ断片を増幅し、制限酵素ＳｐｈＩとＢｇｌＩＩで切断し、ＤＮＡ断片Ｃを得た。
ｐＨＴ−ｈＥＧＦを制限酵素ＳｐｈＩとＢｇｌＩＩで切断し、先に得たＤＮＡ断片Ｃを挿入しプラスミドｐＨＴ−Ｃを得た。
【００２６】
▲４▼プラスミドｐＨＴ−ＡＢの構築
▲１▼と同じ方法でｐｒｉｍｅｒ Ａ及び同 Ｂを使って約１００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅し、制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｈＩで切断し、ＤＮＡ断片ＡＢを得た。
ｐＨＴ−ｈＥＧＦを制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｈＩで切断し、先に得たＤＮＡ断片ＡＢを挿入しプラスミドｐＨＴ−ＡＢを得た。
【００２７】
▲５▼プラスミドｐＨＴ−ＡＣの構築
▲３▼で得た約１４０ｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＢｇ１ＩＩで切断し、ＤＮＡ断片ＡＣを得た。
ｐＨＴ−ｈＥＧＦを制限酵素ＥｃｏＲＩとＢｇ１ＩＩで切断し、先に得たＤＮＡ断片ＡＣを挿入しプラスミドｐＨＴ−ＡＣを得た。
【００２８】
▲６▼プラスミドｐＨＴ−ＢＣの構築
▲３▼で得たプラスミドｐＨＴ−Ｃを制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｈＩで切断し、これに▲２▼で得たＤＮＡ断片Ｂを挿入しプラスミドｐＨＴ−ＢＣを得た。
【００２９】
▲７▼プラスミドｐＨＴ−ＡＢＣの構築
▲３▼で得たプラスミドｐＨＴ−Ｃを制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｈＩで切断し、これに▲４▼で得たＤＮＡ断片ＡＢを挿入しプラスミドｐＨＴ−ＡＢＣを得た。
【００３０】
ここで得られた７種類のプラスミド中のタンパク質をコードする塩基配列をダイデオキシ法（Sanger, F., Nickelen, S. ＆ Colusion ; A. R., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5493(1977))によって決定し、目的通りの塩基配列であることを確認した。
【００３１】
ここで得たプラスミドｐＨＴ−Ａが保持する遺伝子Ａ（配列番号１２）がコードするタンパク質をＡ（配列番号８）、プラスミドｐＨＴ−Ｂが保持する遺伝子Ｂがコードするタンパク質をＢ、プラスミドｐＨＴ−ＡＢが保持する遺伝子ＡＢ（配列番号１３）がコードするタンパク質をＡＢ（配列番号９）、プラスミドｐＨＴ−Ｃが保持する遺伝子Ｃがコードするタンパク質をＣ、プラスミドｐＨＴ−ＡＣが保持する遺伝子ＡＣ（配列番号１４）がコードするタンパク質をＡＣ（配列番号１０）、プラスミドｐＨＴ−ＢＣが保持する遺伝子ＢＣがコードするタンパク質をＢＣそしてプラスミドｐＨＴ−ＡＢＣが保持する遺伝子ＡＢＣ（配列番号１５）がコードするタンパク質をＡＢＣ（配列番号１１）とした。
【００３２】
【実施例２】
（１）本発明タンパク質（以下本タンパク質とする）のバチルス・ブレビスＨＰＤ３１による分泌生産
実施例１で得た８種類のプラスミドｐＨＴ−ｈＥＧＦ（本試験における対照プラスミド）、ｐＨＴ−Ａ，ｐＨＴ−ＡＢ，ｐＨＴ−ＡＣ，ｐＨＴ−ＡＢＣ，ｐＨＴ−Ｂ，ｐＨＴ−Ｃ，ｐＨＴ−ＢＣでバチルス・ブレビスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭＢＰ−１０８７）をエレクトロポレーション法（H. Takagi at al. Agric. Biol, Chem., 53, 3099-3100(1989))によって形質転換した。これらのプラスミドを保持するバチルス・ブレビスＨＰＤ３１を２ＳＬ培地（ペプトン４％、酵母エキス０．５％、グルコース２％、ＭｇＳＯ4 ０．０１％、ＦｅＳＯ4 ０．００１％、ＭｎＳＯ4 ０．００１％、ＺｎＳＯ4 ０．０００１％、エリスロマイシン１０μｇ／ｍｌ、ｐＨ７．２）を３ｍｌ分注した試験管に植菌し、３０℃で３日間振とう培養を行った。培養上清中の本タンパク質量をＨＰＬＣ（カラム：Ｃ１８−１００Ａ、径４ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、バッファー：０．１％ ＴＦＡ／Ｈ2Ｏ，０．１％、ＴＦＡ／５０％アセトニトリル、リニアグラジエント、検出：ＵＶ２７６ｎｍ）で分析し、市販ＥＧＦ（フナコシ（株）社製）を標準品として同条件でＨＰＬＣを行った時のピーク面積と比較して生産量を求め、これを第１代の生産量とした。
次に、３日間培養した第１代培養液を２ＳＬ培地に１％植菌し同じように培養し、第２代培養液とし同様に本タンパク質の生産量を求めた。その結果を図１に示す。図中、白ヌキは第１代培養液１の生産量、及び斜線は第２代培養液２の生産量をそれぞれ示す。
【００３３】
この結果から明らかなように、Ａ、ＡＢ、ＡＣ、ＡＢＣの４種類のタンパク質は第２代培養でもその生産性はあまり低下せず、Ｂ、ＢＣおよび対照のｈ−ＥＧＦでは第２代培養では殆どタンパク質の生産は認められなかった。この結果は、Ａ領域すなわちＮ末端から１０番目までのアミノ酸配列がｍ−ＥＧＦのＮ末端から１０番目までのアミノ酸配列と同一であれば、本タンパク質はバチルス・ブレビスによって安定に生産されるものと思われた。また、Ｂ領域（１１番目から３３番目までのアミノ酸配列領域）、Ｃ領域（３４番目から４７番目までのアミノ酸配列領域）は安定生産性には影響を与えないものと推測された。
【００３４】
（２）本タンパク質遺伝子を保有する各プラスミドの安定性
第１代、第２代培養した菌株をエリスロマイシン含有寒天培地に塗抹し、出現したコロニーをニトロセルロース膜にレプリカ後、ｈ−ＥＧＦ抗体でコロニーイムノアッセイを行った。その結果、表２３に示すように、プラスミドｐＨＴ−Ａ，ｐＨＴ−ＡＢ，ｐＨＴ−ＡＣ，ｐＨＴ−ＡＢＣを保持するバチルス・ブレビスＨＰＤ３１では第２代まで出現するコロニーのすべてが本タンパク質を生産するのに対して、ｐＨＴ−ｈＥＧＦ（対照）、ｐＨＴ−Ｂ、ｐＨＴ−Ｃ、ｐＨＴ−ＢＣを保持する菌株では本タンパク質生産株の出現頻度は極端に悪くなった。後者の４種類の菌株のプラスミドを解析したところ、コピー数の低下や、遺伝子の一部欠損がみられた。
【００３５】
【表２３】
【００３６】
（３）本タンパク質遺伝子を保有する各プラスミドの継代培養でのタンパク質生産の安定性
実施例１で得た８種類それぞれのプラスミドを保持する形質転換体のうち、第２世代まで安定に本タンパク質を生産する菌株を選択し、再度培養試験を行い、その結果を図２に示す。図中、白ヌキは第１代培養液１の生産量、及び斜線は第２代培養液２の生産量をそれぞれ示す。
【００３７】
この結果から明らかなように、いずれの菌株でも安定化が進み、プラスミドｐＨＴ−Ａ，ｐＨＴ−ＡＢ，ｐＨＴ−ＡＣ，ｐＨＴ−ＡＢＣを保持するバチルス・ブレビスＨＰＤ３１株では第２世代では生産性は下がらないが、ｐＨＴ−ｈＥＧＦ（対照）、ｐＨＴ−Ｂ、ｐＨＴ−Ｃ、ｐＨＴ−ＢＣを保持する菌株ではいずれも６０％程度の生産性しか示さなかった。
【００３８】
以上の結果より、本タンパク質のＡ領域のアミノ酸配列がｍ−ＥＧＦのＮ末端から１０番目までのアミノ酸配列と同一であれば、本タンパク質はバチルス・ブレビスによって安定に生産され、Ｂ領域およびＣ領域は安定性生産性には影響を与えないことが明らかとなった。
【００３９】
【実施例３】
本タンパク質の精製
ｐＨＴ−ｈＥＧＦ（対照）、ｐＨＴ−Ａ，ｐＨＴ−ＡＢ，ｐＨＴ−ＡＣ，ｐＨＴ−ＡＢＣそれぞれのプラスミドを保持するバチルス・ブレビスＨＰＤ３１株を、寒天培地にて３０℃で１日培養し、２ＳＬ培地に一晩３０℃で振とう培養を行ったものを前培養液とした。
２Ｌジャーファーメンターに２ＳＬ培地を１Ｌ分注した後１２０℃で１５分滅菌し、前培養液２０ｍｌ接種し、３０℃、攪拌２００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍの条件で３日間培養を行った。
【００４０】
培養終了後、培養液から０．４５μｍの濾過膜を用いて菌体を除去し、濾過画分に本タンパク質を含む培養上清を回収した。この培養上清画分のｐＨを塩酸を用いて３．８に調整し夾雑タンパク質を沈殿させた。次いで０．４５μｍの濾過膜を用いて濾過及び、２０ｍＭ ＣＨ3ＣＯＯＮａ（ｐＨ３．８）の緩衝液５００ｍｌによる洗浄濾過を行い、本タンパク質を含む濾過画分を回収した。さらにこの濾過画分にＮａＣｌを２Ｍ濃度になるように加えることにより、本タンパク質を特異的に沈殿させた。これを０．４５μｍの濾過膜を用いて濾過及び、２ＭＮａＣｌを含む２０ｍＭ ＣＨ3ＣＯＯＮａ（ｐＨ３．８）の緩衝液５００ｍｌによる洗浄濾過をし、濃縮液を２００ｍｌまで濃縮することにより、本タンパク質を沈殿濃縮液中に回収した。遠心分離により沈殿画分を回収し、０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）の緩衝液に溶解し、同緩衝液で透析後、凍結乾燥してｈ−ＥＧＦを０．５２ｇ、タンパク質Ａを０．５６ｇ、タンパク質Ｂを０．５９ｇ、タンパク質Ｃを０．５２ｇ、タンパク質ＡＢを０．７７ｇ、タンパク質ＡＣを０．７０ｇ、タンパク質ＢＣを０．４７ｇ、タンパク質ＡＢＣを０．８４ｇ得た。この操作で得られたそれぞれのタンパク質の純度は９４〜９５％、回収率は８５〜９５％であった。
【００４１】
【実施例４】
本タンパク質の生理活性の確認
コラゲナーゼ灌流法により単離した肝実質細胞を８×１０5cells/60mm tissue culture dish(type I collagen-coated, Corning 25010 COL-1）の割合で播種し、ウイリアムス培地Ｅ（ＷＥ培地）を用いて培養を行った（J. Antibiotics, 38,1767-1773(1985))。
播種後１０％ウシ胎児血清、０．１μＭインスリンを含むＷＥ培地で４時間培養し、３７℃に保温したリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄した後、０．１μＭインスリンと１２．５ｎｇ／ｍｌ及び２５ｎｇ／ｍｌ濃度の実施例３で得たｈ−ＥＧＦ及び７種類の本タンパク質を含有するＷＥ培地で培養した。また、陰性対照として０．１μＭインスリンのみを含む培地にて培養した区を設けた。
培養開始２４時間後に新鮮培地に交換し、さらに２４時間、すなわちｈ−ＥＧＦ及び本タンパク質添加４８時間培養後の細胞より常法により単離核を調製しカウントした。
【００４２】
結果は、陰性対照の細胞数を１００としたときの相対値として図３に示した。この結果から明らかなように、本タンパク質全てにおいて、ｈ−ＥＧＦ添加区と同程度のラット肝細胞増殖効果が確認できた。
【００４３】
【発明の効果】
本発明によって従来未知の新規タンパク質の製造がはじめて可能となった。しかも本タンパク質は、新規であるばかりでなく、ｈ−ＥＧＦ様生理活性を有しており、各種の用途に応範に使用することができる。
したがって本発明は、ｈ−ＥＧＦ製造の有効な代替法としての著効も有するものである。
【００４４】
【配列表】
本発明に係る新規タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１に示し、そのＢ領域のアミノ酸配列を配列番号２又は３に示し、そのＣ領域のアミノ酸配列を配列番号４又は５に示し、そのＤ領域のアミノ酸配列を配列番号６又は７に示す。
【００４５】
本発明に係る新規タンパク質の具体例について、それらのアミノ酸配列を配列番号８〜１１に示し、これらのアミノ酸配列をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１２〜１５に示す。
配列番号１６、１７は、マウス及びヒトＥＧＦ（ｍ−ＥＧＦ、ｈ−ＥＧＦ）のアミノ酸配列をそれぞれ示す。
【００４６】
配列番号１８〜２２は、ＰＣＲ用プライマーを示し、それぞれプライマー５、プライマー３、プライマーＡ、プライマーＢ、プライマーＣを示す。
下記表１〜２２に、配列番号１〜２２で示される各配列を示す。
【００４７】
【表１】
【００４８】
【表２】
【００４９】
【表３】
【００５０】
【表４】
【００５１】
【表５】
【００５２】
【表６】
【００５３】
【表７】
【００５４】
【表８】
配列番号 ：８
配列の長さ：５３
配列の型 ：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
【００５５】
【表９】
【００５６】
【表１０】
【００５７】
【表１１】
【００５８】
【表１２】
【００５９】
【表１３】
【００６０】
【表１４】
【００６１】
【表１５】
【００６２】
【表１６】
【００６３】
【表１７】
【００６４】
【表１８】
【００６５】
【表１９】
【００６６】
【表２０】
【００６７】
【表２１】
【００６８】
【表２２】
【図面の簡単な説明】
【図１】初代形質転換体の第１、第２代培養における本タンパク質の生産性を示す。
【図２】安定形質転換体の第１、２代培養における本タンパク質の生産性を示す。
【図３】肝実質細胞増殖試験の結果であって、４ｄｉｓｈの平均±標準偏差を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規タンパク質及び該タンパク質をコードする遺伝子並びに該タンパク質の製造方法に関する。更に詳細には、本発明は、新規な上皮細胞増殖因子（Epidermal Growth Factor：EGF）様生理活性を有するタンパク質及び該タンパク質をコードする遺伝子並びに該遺伝子を組み込んだバチルス属細菌を培養することにより、該タンパク質を培養物中に生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする該タンパク質の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＥＧＦは、ヒトや馬の尿中やウサギ、ラットおよびマウスの顎下腺から単離されており、哺乳動物の体内に存在していることが知られている（Adv. Metab. Dis., 8, 265(1975))。ヒト上皮細胞増殖因子（human Epidermal Growth Factor : h-EGF）は、５３個のアミノ酸からなる分子量約６，０００のペプチドで、分子内に３ヶ所のジスルフィド結合をもち配列番号１７に示されるアミノ酸配列であることが知られている（H. Gregory, Nature, 257, 325(1975))。
ＥＧＦの生理活性として現在までに報告されているものは、細胞増殖作用、胃酸分泌抑制作用、抗潰瘍作用、消化管粘膜保護作用、ＤＮＡ合成促進作用、角膜修復作用、カルシウム遊離促進作用、創傷治癒促進作用、抗炎症作用、鎮痛作用、肝細胞障害抑制作用及び毛胞退縮作用などがある（日本組織培養学会編、細胞成長因子、２０頁、朝倉書店 １９８４年）。ＥＧＦはこのような作用を有することから創傷治癒薬、抗潰瘍剤、抗癌剤補助剤などとしての様々な応用が試みられている（BIO INDUSTRY, 8, 275(1991))。
【０００３】
このようにＥＧＦについての種々の応用研究が進められている一方、同時にＥＧＦの効率的生産方法についても種々検討がなされており、遺伝子組換えによるＥＧＦの製造法も種々報告されている。特に恵比須らはバチルス・ブレビスＨＰＤ３１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１：なおこの菌株はバチルス・ブレビスＨ１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７））と同一菌株である）を宿主菌としたｈ−ＥＧＦの分泌生産系において、ｈ−ＥＧＦを培地中に約３ｇ／ｌ生産させることに成功している（特開平６−１３３７８２）。しかしその後、この菌株で継代培養を行うと、ｈ−ＥＧＦの生産性が低下する場合のあることが観察されている。継代培養で生産性が減少すると、種培養から数回の植え継ぎを行って徐々にスケールアップを重ね、大量培養を行う商業スケールでの培養において特に問題で、菌株が保有している能力を十分に発揮できず、最終的には低い生産量になることが想定される。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
このように従来技術では、ｈ−ＥＧＦの生産量が非常に少ない場合も認められ、産業上適用するためにはもう一段の技術開発が必要とされている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
このような技術の現状に鑑み、本発明者らは、発想の大転換を行い、ｈ−ＥＧＦを直接生産するのではなく、ｈ−ＥＧＦ様生理活性を有する新規タンパク質を見出しこれを生産すること、しかもこれを遺伝子工学による手法で安定的に工業生産すること、という全く新規な技術課題を設定し、この技術課題を解決することにより上記目的を達成することとした。
【０００６】
そこで本発明者らは、各方面から検討した結果、マウスＥＧＦ（配列番号１６：ｍ−ＥＧＦ）とヒトＥＧＦ（配列番号１７：ｈ−ＥＧＦ）は、ともに５３アミノ酸残基からなり、その高次構造は類似するがアミノ酸配列において１６アミノ酸が異なることにはじめて注目し、これら２種類のＥＧＦがキメラになった新規タンパク質を構築した。そしてこれらのタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだバチルス・ブレビスＨＰＤ３１を培養し、該タンパク質を分泌生産させたところ、該タンパク質のアミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸配列であれば継代培養を行っても安定に分泌生産されることが分かり、しかもこれらのタンパク質も天然のＥＧＦと同様の種々の生理活性を有することが明らかとなり、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、新規タンパク質及び該タンパク質をコードする遺伝子並びに該遺伝子を組み込んだバチルス属細菌を培養することにより、該タンパク質を培養物中に生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする新規タンパク質の製造法に関するものである。
以下、本発明について詳しく説明する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の新規タンパク質は、配列番号１に示すように５３アミノ酸から成り、Ｎ末端から数えて１０番目までのアミノ酸配列（Ａ領域とする）は配列番号１６のｍ−ＥＧＦのＮ末端から１０番目のアミノ酸配列と同一の配列である。
【０００９】
また、本発明のタンパク質のＮ末端から数えて１１番目から３３番目のアミノ酸配列（Ｂ領域とする）、３４番目から４７番目のアミノ酸配列（Ｃ領域とする）及び４８番目から５３番目のアミノ酸配列（Ｄ領域とする）は、配列番号１６に示すｍ−ＥＧＦと配列番号１７に示すｈ−ＥＧＦのアミノ酸配列各々の本発明タンパク質のＢ，Ｃ，Ｄ領域に相当する部分のアミノ酸配列を組み合わせた新規タンパク質である。
具体的にはＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２または３に示した何れかであり、Ｃ領域のアミノ酸配列は配列番号４または５であり、Ｄ領域のアミノ酸配列は配列番号６または７のアミノ酸配列である。さらに具体的には、本発明のタンパク質は配列番号８〜１１のアミノ酸配列で示されるタンパク質である。
但し、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ全ての領域が、配列番号１６のｍ−ＥＧＦと同じ配列のものはｍ−ＥＧＦそのものであって、本発明から除外されることはもちろんである。同様に、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ全ての領域が、配列番号１７のｈ−ＥＧＦと同じ配列のものはｈ−ＥＧＦそのものであって、本発明から除外される。
【００１０】
また、本タンパク質をコードする遺伝子は化学的に合成した遺伝子を用いることができ、合成遺伝子を用いる場合は発現系の細胞において最も容認されたコドンを採用した遺伝子が好適に使用出来る。
具体的には、配列番号１２〜１５に示す塩基配列を有する遺伝子などを用いることが出来る。
【００１１】
このようにして得た遺伝子を宿主菌内に導入、保持させるベクターは、宿主菌内で複製可能なプラスミドを利用することができる。例えば宿主菌が枯草菌（バチルス・ズブチリス：（Bacillus subtilis）やバチルス・ブレビスの系ではｐＵＢ１１０やｐＮＵ２００（鵜高重三、日本農芸化学会誌、６１、６６９（１９８７））、ｐＨＹ７００（S. Ebisu et al, Biosci. Biotech. Biochem, 56, 812-813(1992))、ｐＨＴ１１０（特開平６−１３３７８２）やこれらの派生体などのプラスミドを使用できる。
【００１２】
これらのプラスミドを構築する方法としては、公知の方法が適宜用いられ、例えばモレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリーマニュアル第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Molecular Cloning 2nd ed., A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989）に記載の方法などが例示される。
【００１３】
本発明において宿主菌として用いる細菌は、バチルス属に属する細菌であればよいが、枯草菌やバチルス・ブレビス、バチルス・チョーシネンシス（Bacillus choshinensis）などが好適に使用できる。
【００１４】
宿主菌を形質転換する方法は公知の方法で良く、例えば、枯草菌ではChang and Cohenの方法（S. Chang and S. N. Cohen, Molec. gen. Genet, 168, 111-115(1979))、バチルス・ブレビスではTakahashiらの方法（Takahashi et al, J. Bacteriol., 156, 1130(1983))またはTakagiらの方法（H. Takagi et al, Agric, Biol. Chem., 53, 3099-3100(1989))などが例示される。
【００１５】
得られた形質転換体の培養に用いる培地は、形質転換体が生育して本タンパク質を生産しうるものであれば如何なるものでもよい。
該培地に含有される炭素源としては、例えば、グルコース、シュークロース、グリセロール、澱粉、デキストリン、糖蜜、有機酸などが用いられる。また、窒素源としては、カゼイン、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸、尿素、グリシンなどの有機窒素源、硫酸アンモニウムなどの無機窒素源などが用いられる。その他、塩化カリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウムなどの無機塩が必要に応じて培地に加えられる。栄養要求性を示す菌はその生育に必要な栄養物質を培地に添加すればよい。該栄養物質としては、アミノ酸類、ビタミン類、核酸などが挙げられる。
【００１６】
また、培養に際して必要があれば、培地に抗生物質例えばペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、バシトラシン、Ｄ−サイクロセリン、アンピシリン、ネオマイシンなどを加える。更に必要により、消泡剤例えば大豆油、ラード油、各種界面活性剤などを加えてもよい。
【００１７】
培地の初発ｐＨは５．０〜９．０、さらに好ましくは６．５〜７．５である。培養温度は通常１５℃〜４２℃、さらに好ましくは２４℃〜３７℃であり、培養時間は通常１６〜１６６時間、さらに好ましくは２４〜９６時間である。
【００１８】
本発明で、形質転換体を前記の条件で培養することによって、培養物中に本タンパク質が生成、蓄積され、継代培養によっても安定に分泌生産される。
このようにして得られたタンパク質は公知の方法により、例えば膜処理、硫安分画法、クロマトグラフィーなど（蛋白質・核酸の基礎実験法、南江堂（１９８５））で精製することができる。
また、ｐＨ調整による等電点沈殿とＮａＣｌの添加による塩析を組み合わせることにより、非常に簡便かつ効率的に本タンパク質を精製することができる。
【００１９】
このようにして得られた本タンパク質の生理活性については既存の方法で測定することができる。例えば細胞増殖活性は、ラットの初代培養肝実質細胞を用いた細胞増殖試験で確認することができる（J. Antibiotics, 38, 1767-1773(1985))。また、ＤＮＡ合成刺激作用は3Ｈ−チミジンのヒト繊維芽細胞などを用いた取り込み試験で確認することができる（細胞成長因子、朝倉書店（１９８４））。
【００２０】
本発明では、新規なタンパク質を創製することによって、ＥＧＦ様生理活性を有するタンパク質を安定に分泌生産できるようになった。
また本タンパク質は天然のＥＧＦと同様な生理活性を有するので、天然ＥＧＦと同じ分野への適用が考えられる。
【００２１】
以下本発明を実施例により更に詳しく説明するが、これは例示的なものであり、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２２】
【実施例１】
（１）プラスミドｐＨＴ−ｈＥＧＦの構築
ｈ−ＥＧＦのアミノ酸配列をコードする合成遺伝子（ＢＩＯ ＩＮＤＵＳＴＲＹ，９，１００−１０７（１９９１））を鋳型にし、配列番号１８のｐｒｉｍｅｒ５及び配列番号１９のｐｒｉｍｅｒ３を使って、常法によりＰＣＲを行い、約２１０ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＡｐａＬＩとＰｓｔＩで切断し、５％アグリルアミドゲル電気泳動を行い２０５ｂｐ断片を切り出し、電気溶出法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）により回収した。
バチルス・ブレビスＨＰ９２６（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３８２）が保有するプラスミドｐＨＴ９２６より調製したプラスミドｐＨＴ１１０−ＥＧＦ（特開平６−１３３７８２）をＰｓｔＩで部分分解さらにＡｐａＬＩで完全分解し、０．８％アガロース電気泳動を行い、３．３ｋｂのＤＮＡ断片を切り出し、ＧＥＮＥ ＣＬＥＡＮ（Ｂｉｏ １０１，ＵＳＡ）にて回収し、先に得た２０５ｂｐのＤＮＡ断片とＴ４リガーゼでライゲーションし、配列番号１７のｈ−ＥＧＦのアミノ酸配列をコードする遺伝子を保有するプラスミドｐＨＴ−ｈＥＧＦを得た。
【００２３】
（２）プラスミドｐＨＴ−Ａ， ｐＨＴ−ＡＢ， ｐＨＴ−ＡＣ，ｐＨＴ−ＡＢＣ， ｐＨＴ−Ｂ， ｐＨＴ−Ｃ， ｐＨＴ−ＢＣの構築
▲１▼プラスミドｐＨＴ−Ａの構築
（１）で得たプラスミドｐＨＴ−ｈＥＧＦを鋳型にし、ｐｒｉｍｅｒＡ（配列番号２０）及びｐｒｉｍｅｒ３を使って、常法によりＰＣＲを行い、約１８０ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｈＩで切断し、１０％アクリルアミドゲル電気泳動後、電気溶出法によって回収しＤＮＡ断片Ａを得た。
（１）で得たプラスミドｐＨＴ−ｈＥＧＦを制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｈＩで切断し、アガロース電気泳動後回収し、これに先に得たＤＮＡ断片Ａを挿入しプラスミドｐＨＴ−Ａを得た。
【００２４】
▲２▼プラスミドｐＨＴ−Ｂの構築
▲１▼と同じ方法でｐｒｉｍｅｒ５及びｐｒｉｍｅｒＢ（配列番号２１）を使って、約１００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅し、制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｈＩで切断し、ＤＮＡ断片Ｂを得た。
ｐＨＴ−ｈＥＧＦを制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｈＩで切断し、先に得たＤＮＡ断片Ｂを挿入しプラスミドｐＨＴ−Ｂを得た。
【００２５】
▲３▼プラスミドｐＨＴ−Ｃの構築
▲１▼と同じ方法でｐｒｉｍｅｒＡ及びｐｒｉｍｅｒＣ（配列番号２２）を使って約１４０ｂｐのＤＮＡ断片を増幅し、制限酵素ＳｐｈＩとＢｇｌＩＩで切断し、ＤＮＡ断片Ｃを得た。
ｐＨＴ−ｈＥＧＦを制限酵素ＳｐｈＩとＢｇｌＩＩで切断し、先に得たＤＮＡ断片Ｃを挿入しプラスミドｐＨＴ−Ｃを得た。
【００２６】
▲４▼プラスミドｐＨＴ−ＡＢの構築
▲１▼と同じ方法でｐｒｉｍｅｒ Ａ及び同 Ｂを使って約１００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅し、制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｈＩで切断し、ＤＮＡ断片ＡＢを得た。
ｐＨＴ−ｈＥＧＦを制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｈＩで切断し、先に得たＤＮＡ断片ＡＢを挿入しプラスミドｐＨＴ−ＡＢを得た。
【００２７】
▲５▼プラスミドｐＨＴ−ＡＣの構築
▲３▼で得た約１４０ｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＢｇ１ＩＩで切断し、ＤＮＡ断片ＡＣを得た。
ｐＨＴ−ｈＥＧＦを制限酵素ＥｃｏＲＩとＢｇ１ＩＩで切断し、先に得たＤＮＡ断片ＡＣを挿入しプラスミドｐＨＴ−ＡＣを得た。
【００２８】
▲６▼プラスミドｐＨＴ−ＢＣの構築
▲３▼で得たプラスミドｐＨＴ−Ｃを制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｈＩで切断し、これに▲２▼で得たＤＮＡ断片Ｂを挿入しプラスミドｐＨＴ−ＢＣを得た。
【００２９】
▲７▼プラスミドｐＨＴ−ＡＢＣの構築
▲３▼で得たプラスミドｐＨＴ−Ｃを制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｈＩで切断し、これに▲４▼で得たＤＮＡ断片ＡＢを挿入しプラスミドｐＨＴ−ＡＢＣを得た。
【００３０】
ここで得られた７種類のプラスミド中のタンパク質をコードする塩基配列をダイデオキシ法（Sanger, F., Nickelen, S. ＆ Colusion ; A. R., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5493(1977))によって決定し、目的通りの塩基配列であることを確認した。
【００３１】
ここで得たプラスミドｐＨＴ−Ａが保持する遺伝子Ａ（配列番号１２）がコードするタンパク質をＡ（配列番号８）、プラスミドｐＨＴ−Ｂが保持する遺伝子Ｂがコードするタンパク質をＢ、プラスミドｐＨＴ−ＡＢが保持する遺伝子ＡＢ（配列番号１３）がコードするタンパク質をＡＢ（配列番号９）、プラスミドｐＨＴ−Ｃが保持する遺伝子Ｃがコードするタンパク質をＣ、プラスミドｐＨＴ−ＡＣが保持する遺伝子ＡＣ（配列番号１４）がコードするタンパク質をＡＣ（配列番号１０）、プラスミドｐＨＴ−ＢＣが保持する遺伝子ＢＣがコードするタンパク質をＢＣそしてプラスミドｐＨＴ−ＡＢＣが保持する遺伝子ＡＢＣ（配列番号１５）がコードするタンパク質をＡＢＣ（配列番号１１）とした。
【００３２】
【実施例２】
（１）本発明タンパク質（以下本タンパク質とする）のバチルス・ブレビスＨＰＤ３１による分泌生産
実施例１で得た８種類のプラスミドｐＨＴ−ｈＥＧＦ（本試験における対照プラスミド）、ｐＨＴ−Ａ，ｐＨＴ−ＡＢ，ｐＨＴ−ＡＣ，ｐＨＴ−ＡＢＣ，ｐＨＴ−Ｂ，ｐＨＴ−Ｃ，ｐＨＴ−ＢＣでバチルス・ブレビスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭＢＰ−１０８７）をエレクトロポレーション法（H. Takagi at al. Agric. Biol, Chem., 53, 3099-3100(1989))によって形質転換した。これらのプラスミドを保持するバチルス・ブレビスＨＰＤ３１を２ＳＬ培地（ペプトン４％、酵母エキス０．５％、グルコース２％、ＭｇＳＯ4 ０．０１％、ＦｅＳＯ4 ０．００１％、ＭｎＳＯ4 ０．００１％、ＺｎＳＯ4 ０．０００１％、エリスロマイシン１０μｇ／ｍｌ、ｐＨ７．２）を３ｍｌ分注した試験管に植菌し、３０℃で３日間振とう培養を行った。培養上清中の本タンパク質量をＨＰＬＣ（カラム：Ｃ１８−１００Ａ、径４ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、バッファー：０．１％ ＴＦＡ／Ｈ2Ｏ，０．１％、ＴＦＡ／５０％アセトニトリル、リニアグラジエント、検出：ＵＶ２７６ｎｍ）で分析し、市販ＥＧＦ（フナコシ（株）社製）を標準品として同条件でＨＰＬＣを行った時のピーク面積と比較して生産量を求め、これを第１代の生産量とした。
次に、３日間培養した第１代培養液を２ＳＬ培地に１％植菌し同じように培養し、第２代培養液とし同様に本タンパク質の生産量を求めた。その結果を図１に示す。図中、白ヌキは第１代培養液１の生産量、及び斜線は第２代培養液２の生産量をそれぞれ示す。
【００３３】
この結果から明らかなように、Ａ、ＡＢ、ＡＣ、ＡＢＣの４種類のタンパク質は第２代培養でもその生産性はあまり低下せず、Ｂ、ＢＣおよび対照のｈ−ＥＧＦでは第２代培養では殆どタンパク質の生産は認められなかった。この結果は、Ａ領域すなわちＮ末端から１０番目までのアミノ酸配列がｍ−ＥＧＦのＮ末端から１０番目までのアミノ酸配列と同一であれば、本タンパク質はバチルス・ブレビスによって安定に生産されるものと思われた。また、Ｂ領域（１１番目から３３番目までのアミノ酸配列領域）、Ｃ領域（３４番目から４７番目までのアミノ酸配列領域）は安定生産性には影響を与えないものと推測された。
【００３４】
（２）本タンパク質遺伝子を保有する各プラスミドの安定性
第１代、第２代培養した菌株をエリスロマイシン含有寒天培地に塗抹し、出現したコロニーをニトロセルロース膜にレプリカ後、ｈ−ＥＧＦ抗体でコロニーイムノアッセイを行った。その結果、表２３に示すように、プラスミドｐＨＴ−Ａ，ｐＨＴ−ＡＢ，ｐＨＴ−ＡＣ，ｐＨＴ−ＡＢＣを保持するバチルス・ブレビスＨＰＤ３１では第２代まで出現するコロニーのすべてが本タンパク質を生産するのに対して、ｐＨＴ−ｈＥＧＦ（対照）、ｐＨＴ−Ｂ、ｐＨＴ−Ｃ、ｐＨＴ−ＢＣを保持する菌株では本タンパク質生産株の出現頻度は極端に悪くなった。後者の４種類の菌株のプラスミドを解析したところ、コピー数の低下や、遺伝子の一部欠損がみられた。
【００３５】
【表２３】
（３）本タンパク質遺伝子を保有する各プラスミドの継代培養でのタンパク質生産の安定性
実施例１で得た８種類それぞれのプラスミドを保持する形質転換体のうち、第２世代まで安定に本タンパク質を生産する菌株を選択し、再度培養試験を行い、その結果を図２に示す。図中、白ヌキは第１代培養液１の生産量、及び斜線は第２代培養液２の生産量をそれぞれ示す。
【００３７】
この結果から明らかなように、いずれの菌株でも安定化が進み、プラスミドｐＨＴ−Ａ，ｐＨＴ−ＡＢ，ｐＨＴ−ＡＣ，ｐＨＴ−ＡＢＣを保持するバチルス・ブレビスＨＰＤ３１株では第２世代では生産性は下がらないが、ｐＨＴ−ｈＥＧＦ（対照）、ｐＨＴ−Ｂ、ｐＨＴ−Ｃ、ｐＨＴ−ＢＣを保持する菌株ではいずれも６０％程度の生産性しか示さなかった。
【００３８】
以上の結果より、本タンパク質のＡ領域のアミノ酸配列がｍ−ＥＧＦのＮ末端から１０番目までのアミノ酸配列と同一であれば、本タンパク質はバチルス・ブレビスによって安定に生産され、Ｂ領域およびＣ領域は安定性生産性には影響を与えないことが明らかとなった。
【００３９】
【実施例３】
本タンパク質の精製
ｐＨＴ−ｈＥＧＦ（対照）、ｐＨＴ−Ａ，ｐＨＴ−ＡＢ，ｐＨＴ−ＡＣ，ｐＨＴ−ＡＢＣそれぞれのプラスミドを保持するバチルス・ブレビスＨＰＤ３１株を、寒天培地にて３０℃で１日培養し、２ＳＬ培地に一晩３０℃で振とう培養を行ったものを前培養液とした。
２Ｌジャーファーメンターに２ＳＬ培地を１Ｌ分注した後１２０℃で１５分滅菌し、前培養液２０ｍｌ接種し、３０℃、攪拌２００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍの条件で３日間培養を行った。
【００４０】
培養終了後、培養液から０．４５μｍの濾過膜を用いて菌体を除去し、濾過画分に本タンパク質を含む培養上清を回収した。この培養上清画分のｐＨを塩酸を用いて３．８に調整し夾雑タンパク質を沈殿させた。次いで０．４５μｍの濾過膜を用いて濾過及び、２０ｍＭ ＣＨ3ＣＯＯＮａ（ｐＨ３．８）の緩衝液５００ｍｌによる洗浄濾過を行い、本タンパク質を含む濾過画分を回収した。さらにこの濾過画分にＮａＣｌを２Ｍ濃度になるように加えることにより、本タンパク質を特異的に沈殿させた。これを０．４５μｍの濾過膜を用いて濾過及び、２ＭＮａＣｌを含む２０ｍＭ ＣＨ3ＣＯＯＮａ（ｐＨ３．８）の緩衝液５００ｍｌによる洗浄濾過をし、濃縮液を２００ｍｌまで濃縮することにより、本タンパク質を沈殿濃縮液中に回収した。遠心分離により沈殿画分を回収し、０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）の緩衝液に溶解し、同緩衝液で透析後、凍結乾燥してｈ−ＥＧＦを０．５２ｇ、タンパク質Ａを０．５６ｇ、タンパク質Ｂを０．５９ｇ、タンパク質Ｃを０．５２ｇ、タンパク質ＡＢを０．７７ｇ、タンパク質ＡＣを０．７０ｇ、タンパク質ＢＣを０．４７ｇ、タンパク質ＡＢＣを０．８４ｇ得た。この操作で得られたそれぞれのタンパク質の純度は９４〜９５％、回収率は８５〜９５％であった。
【００４１】
【実施例４】
本タンパク質の生理活性の確認
コラゲナーゼ灌流法により単離した肝実質細胞を８×１０5cells/60mm tissue culture dish(type I collagen-coated, Corning 25010 COL-1）の割合で播種し、ウイリアムス培地Ｅ（ＷＥ培地）を用いて培養を行った（J. Antibiotics, 38,1767-1773(1985))。
播種後１０％ウシ胎児血清、０．１μＭインスリンを含むＷＥ培地で４時間培養し、３７℃に保温したリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄した後、０．１μＭインスリンと１２．５ｎｇ／ｍｌ及び２５ｎｇ／ｍｌ濃度の実施例３で得たｈ−ＥＧＦ及び７種類の本タンパク質を含有するＷＥ培地で培養した。また、陰性対照として０．１μＭインスリンのみを含む培地にて培養した区を設けた。
培養開始２４時間後に新鮮培地に交換し、さらに２４時間、すなわちｈ−ＥＧＦ及び本タンパク質添加４８時間培養後の細胞より常法により単離核を調製しカウントした。
【００４２】
結果は、陰性対照の細胞数を１００としたときの相対値として図３に示した。この結果から明らかなように、本タンパク質全てにおいて、ｈ−ＥＧＦ添加区と同程度のラット肝細胞増殖効果が確認できた。
【００４３】
【発明の効果】
本発明によって従来未知の新規タンパク質の製造がはじめて可能となった。しかも本タンパク質は、新規であるばかりでなく、ｈ−ＥＧＦ様生理活性を有しており、各種の用途に応範に使用することができる。
したがって本発明は、ｈ−ＥＧＦ製造の有効な代替法としての著効も有するものである。
【００４４】
【配列表】
本発明に係る新規タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１に示し、そのＢ領域のアミノ酸配列を配列番号２又は３に示し、そのＣ領域のアミノ酸配列を配列番号４又は５に示し、そのＤ領域のアミノ酸配列を配列番号６又は７に示す。
【００４５】
本発明に係る新規タンパク質の具体例について、それらのアミノ酸配列を配列番号８〜１１に示し、これらのアミノ酸配列をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１２〜１５に示す。
配列番号１６、１７は、マウス及びヒトＥＧＦ（ｍ−ＥＧＦ、ｈ−ＥＧＦ）のアミノ酸配列をそれぞれ示す。
【００４６】
配列番号１８〜２２は、ＰＣＲ用プライマーを示し、それぞれプライマー５、プライマー３、プライマーＡ、プライマーＢ、プライマーＣを示す。
下記表１〜２２に、配列番号１〜２２で示される各配列を示す。
【００４７】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
配列番号 ：８
配列の長さ：５３
配列の型 ：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【表１４】
【表１５】
【表１６】
【表１７】
【表１８】
【表１９】
【表２０】
【表２１】
【表２２】
【図面の簡単な説明】
【図１】初代形質転換体の第１、第２代培養における本タンパク質の生産性を示す。
【図２】安定形質転換体の第１、２代培養における本タンパク質の生産性を示す。
【図３】肝実質細胞増殖試験の結果であって、４ｄｉｓｈの平均±標準偏差を示す。
Claims (12)
- 配列表の配列番号１のアミノ酸配列で示される新規タンパク質（但し、該配列において、Ｘａ１−Ｘａ１１に該当するアミノ酸が、それぞれ同時に、Ｘａ１＝Ａｓｎ，Ｘａ２＝Ｇｌｙ，Ｘａ３＝Ｈｉｓ，Ｘａ４＝Ｓｅｒ，Ｘａ５＝Ｓｅｒ，Ｘａ６＝Ｔｈｒ，Ｘａ７＝Ｉｌｅ，Ｘａ８＝Ｓｅｒ，Ｘａ９＝Ａｓｐ，Ｘａ１０＝Ｔｈｒ，およびＸａ１１＝Ａｒｇである場合を除く。）。
- Ｎ末端から数えて１１番目から３３番目までのアミノ酸配列が配列番号２または３のアミノ酸配列であり、３４番目から４７番目までのアミノ酸配列が配列番号４または５のアミノ酸配列であり、４８番目から５３番目までのアミノ酸配列が配列番号６または７のアミノ酸配列である請求項１に記載の新規タンパク質（但し、該１１番目から３３番目までのアミノ酸配列、３４番目から４７番目までのアミノ酸配列および４８番目から５３番目までのアミノ酸配列が、それぞれ同時に、配列番号２、配列番号３、および配列番号４のアミノ酸配列である場合を除く。）
- 配列番号８のアミノ酸配列で示される請求項１又は２に記載の新規タンパク質。
- 配列番号９のアミノ酸配列で示される請求項１又は２に記載の新規タンパク質。
- 配列番号１０のアミノ酸配列で示される請求項１又は２に記載の新規タンパク質。
- 配列番号１１のアミノ酸配列で示される請求項１又は２に記載の新規タンパク質。
- 配列番号１２の塩基配列で示され、請求項３に記載のアミノ酸配列をコードする新規タンパク質遺伝子のＤＮＡ。
- 配列番号１３の塩基配列で示され、請求項４に記載のアミノ酸配列をコードする新規タンパク質遺伝子のＤＮＡ。
- 配列番号１４の塩基配列で示され、請求項５に記載のアミノ酸配列をコードする新規タンパク質遺伝子のＤＮＡ。
- 配列番号１５の塩基配列で示され、請求項６に記載のアミノ酸配列をコードする新規タンパク質遺伝子のＤＮＡ。
- 請求項１〜６に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子のＤＮＡを組み込んだ発現プラスミドを保有するバチルス属細菌を培養することにより、新規タンパク質を培養物中に生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする新規タンパク質の製造法。
- バチルス属細菌がバチルス・ブレビスであることを特徴とする請求項１１に記載の新規タンパク質の製造法。
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|---|---|---|---|
| JP12397096A JP3686985B2 (ja) | 1996-04-23 | 1996-04-23 | 新規タンパク質及び該タンパク質をコードする遺伝子並びに該タンパク質の製造法 |
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Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
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1996
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1997
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