JPH06315384A - セリンプロテアーゼインヒビターの産生のための遺伝子組み換え法と、同じ目的に有用なｄｎａ塩基配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、プロテアーゼインヒビターの合
成、特にヒトの多形核（ＰＭＮ）−顆粒球プロテアーゼ
を阻害対象とする組換えインヒビターおよびその類縁体
の合成に関するものである。 【構成】 本発明の合成方法は、組換えＤＮＡ法であっ
て、特許請求の範囲に記載のＤＮＡ塩基配列を使用する
方法である。本発明の合成方法ではまた、特許請求の範
囲に記載の組換えベクターおよび形質転換宿主細胞が使
用される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の分野】本発明はプロテアーゼインヒビターおよ
びその類縁体の合成方法およびこの方法に有用なＤＮＡ
塩基配列、組換えベクターおよび形質転換宿主細胞に関
するものである。本出願は１９８４年１２月６日に出願
されたＵ．Ｓ．特許出願連続番号Ｎｏ．６７８，８２２
の一部継続出願である。

【０００２】

【従来の技術】発明の背景 内生タンパク分解酵素は、侵入する生物体、抗原−抗体
複合体と、生体に最早必要乃至は有用でないある特定の
組織タンパクを分解するのに役立つ。正常に機能してい
る生物体では、タンパク分解酵素は、限られた量だけ生
産され、一部はプロテアーゼのインヒビターの合成を通
じて制御されている。

【０００３】多数の天然に存在するプロテアーゼインヒ
ビターは、その反応を場所的に及び時間的に制御するこ
とによって、内生プロテアーゼを制御している。その
上、プロテアーゼインヒビターは、感染及び寄生生物に
よって身体の中に持ち込まれたプロテアーゼを阻害する
ことがある。特別にタンパクの加水分解の攻撃や感染を
受け易い組織、例えば、呼吸路の組織はプロテアーゼイ
ンヒビターに富んでいる。

【０００４】プロテアーゼインヒビターは、ヒト血漿タ
ンパクの約１０％を構成している。少くとも８種のイン
ヒビターがこの材料源から単離され、文献中にその特性
が記載されている。これらの中には、α₂ −マクログロ
ブリン（α₂ Ｍ）、α₁ −プロテアーゼインヒビター
（α₁ ＰＩ）、α₁ −アンチキモトリプシン（α₁ Ａｃ
ｈｙ）、β₁ −アンチコラゲナーゼ（β₁ ＡＣ）、及
び、インター−α−トリプシンインヒビター（ＩαＩ）
がある。

【０００５】プロテアーゼ／プロテアーゼインヒビター
のバランスの攪乱は、気腫、関節炎、糸球体腎炎、歯周
炎、筋ジストロフィー、腫瘍の侵入及びさまざまな他の
病理的状態を包含するプロテアーゼを媒介とする組織の
破壊へと導く。ある状況、例えば、敗血症とか急性白血
病のようなきびしい病理学的進行の場合には、存在する
遊離のタンパク分解酵素の量は、分泌細胞からの酵素の
放出により増加する。それに加えて、他の状況下では、
これとは別に生体の制御的なインヒビターの容量が減少
するため、プロテアーゼ／プロテアーゼインヒビター−
バランスの変化が起きることもある。このような制御的
なインヒビターの容量が減少する例は、α₁ −プロテア
ーゼインヒビターの欠損であり、肺気腫の発生と大きく
関わり合っている。

【０００６】生体にこのような常規を逸脱した状態が存
在すると、タンパク分解酵素を制御するための方策を講
じなければ、生体への深刻な傷害が起り得る。したがっ
て、生体に投与すれば、タンパク分解酵素を制御するこ
とが出来るプロテアーゼインヒビターが探し求められて
きた。

【０００７】白血球エラスターゼは、病理学的見地から
ことのほか興味深いセリンプロテアーゼの１つの例であ
る。白血球エラスターゼは、細胞外に放出されると、結
合組織やその他の貴重なタンパクを分解する。正常に機
能している生体にとって、ある一定量の結合組織や他の
タンパクを分解することは必要であるが、過剰の白血球
エラスターゼの存在は、気腫やリューマチ様関節炎のよ
うな様々な病理的状態と関連づけられている。白血球エ
ラスターゼが正常よりも大量に存在する場合、その効果
に抵抗するため、白血球エラスターゼ活性を阻害するプ
ロテアーゼインヒビターが探し求められてきた。精製し
た形で薬剤として役立つに足る量を、組み換えＤＮＡ法
によって生産できるとしたら、このようなプロテアーゼ
インヒビターは特別に有用であろう。

【０００８】文献によると、過去において、少くとも２
種の白血球エラスターゼインヒビターが同定されてい
る。“ヒト多形核白血球の中性プロテアーゼ”（Ｈａｖ
ｅｍａｎｎら（編）ＵｒｂａｎとＳｃｈｗａｒｚｅｎｂ
ｅｒｇ，Ｉｎｃ．（１９７８））中の“ヒト粘液性分泌
物中の顆粒球中性プロテアーゼの酸に安定なインヒビタ
ー；生化学と可能な生物学的機能”において、Ｓｃｈｉ
ｅｉｓｌｅｒらが記述した１つのタンパクがヒトの精液
のプラズマ及び痰から単離され、Ｎ末端アミノ酸として
チロシンを持つ、大きさが１１ｋｄａのタンパクとして
特徴づけられた。このタンパクの文献報告からは、部分
的なアミノ酸配列しか提供されていないが、部分的な配
列からさえも、このタンパクは本発明のタンパク類とは
実質的に異なっていることがわかる。このタンパクのア
ミノ酸配列の報告と、本発明のタンパクのアミノ酸配列
データーから考えると、Ｓｃｈｉｅｓｓｌｅｒらによっ
て配列が決定されたものは、元来一本鎖のポリペプタイ
ドではないタンパクの分解物であったかもしれないとい
うことが発明者らに示唆される。

【０００９】１例において、ヒトの血漿から単離された
２番目のタンパク、α₁ −ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉ
ｂｉｔｏｒと名付けられた。このタンパクに関する業績
は、ＴｒａｖｉｓとＳａｌｖｅｓｅｎによって総説、Ａ
ｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ５２：６５５−７０９（１９８３）にまとめられて
いる。このタンパクのアミノ酸配列のレポートは、これ
も本発明のタンパクから実質的に異なっていることを示
している。

【００１０】本発明の一本鎖ポリペプチドのタンパク類
が以前の技術による一本鎖ポリペプチドのセリンプロテ
アーゼインヒビターのいずれとも著しく異なっているか
ら、以前に研究された、一本鎖ポリペプチドのセリンプ
ロテアーゼインヒビター類は本発明のタンパク類とは
“実質的に相同”ではない。

【００１１】トリプシンは、病理学的見地から特別興味
のあるもう１つのタンパクである。トリプシンは、膵臓
炎のような種々の急性症状のなかで、膵臓のような特定
の軟かい器管の組織の分解を始めることが知られてい
る。これらの症状の治療を目的として、トリプシンの作
用を阻害するだろうと期待されたタンパク類の使用によ
る種々の努力がなされたが、目覚しい成功は得られなか
った。このような努力の実例は、ヒトの膵臓炎の治療に
牛の外生トリプシンインヒビターを用いる試みである。
このような技術は、ヨーロッパで試みられたが、米国食
品医薬品局（ＦＤＡ）によって効果があると認められな
かった。

【００１２】したがって、種々の急性または慢性症状中
の、過剰のトリプシンを中和する効果のあるプロテアー
ゼインヒビターが必要である。上記で論議した白血球エ
ラスターゼインヒビターの場合にもそうであったよう
に、トリプシンインヒビターは、もし、組み換えＤＮＡ
法によって精製した形で、薬剤として役立てるに足る量
だけ単離製造できれば、ことのほか有用であろう。カテ
プシンＧは、白血球に大量に存在するもう１つのプロテ
アーゼである。カテプシンＧは、補足的経路のタンパク
をはじめとする種々の価値のあるタンパクをｉｎ ｖｉ
ｔｒｏで分解できることが知られている。膵臓のエラス
ターゼが、膵臓炎で役割を果している可能性のあるもう
１つのプロテアーゼである。したがって、これらのプロ
テアーゼに対する阻害剤も薬剤としての潜在的価値があ
る。

【００１３】白血球エラスターゼ、トリプシン、カテプ
シンＧと膵臓のエラスターゼは、セリンプロテアーゼと
して知られている一群のプロテアーゼの例であり、共通
の構造と作用機作の要素を持っている。それらの異なる
基質に対する活性や、異なるインヒビターへの活性は、
２、３のアミノ酸残基だけが異なっていることから生ず
ると信じられている。類推によれば、やはり構造と作用
機作の共通の要素を持っていて、比較的少ないアミノ酸
の変化が、異なったプロテアーゼの阻害を結果として生
ずるセリンプロテアーゼインヒビターを想像することが
可能であり、しかも、少くともこの群の１員は、前述の
群中のセリンプロテアーゼのすべてを阻害するであろ
う。そうであるとすれば、この群のセリンプロテアーゼ
インヒビターは、大きな価値があるであろう。

【００１４】

【発明の開示】驚くべきことに、本発明者達は、このよ
うなセリンプロテアーゼインヒビターの合成を導き、合
成を行なうことができるＤＮＡ配列を発見した。このイ
ンヒビターは、耳下腺分泌物から単離されたものと生物
学的に等価である。組み換えＤＮＡ法によって作られ、
本明細書に記載の本発明のプロテアーゼインヒビター
は、少くとも２箇所の活性部位を持っている。すなわ
ち、白血球エラスターゼ阻害の性質を示す１つの部位
と、トリプシンに対して阻害活性を示す２番目の部位で
ある。

【００１５】本発明によって生産される組み換えインヒ
ビターは、熱や酸による変性に著しく抵抗性があり、ま
た様々なタンパク分解酵素によるタンパク分解作用に対
しても抵抗性があると考えられる。この出願に用いられ
るように“組み換えインヒビター”は、組み換えＤＮＡ
の方法論と技術によって生産されるプロテアーゼインヒ
ビターのことを指すよう意図されている。さらに、本発
明の組み換えインヒビターの活性形は、哺乳動物の身体
の細胞外の部位で普通に出会うような条件下では、熱力
学的に安定である。組み換えプロテアーゼインヒビター
の変成した形はまた、ジスルフィド結合を形成する能力
も持っており、生化学的刺激の存在しない状態で活性三
次構造をとるのに必要な非共有結合的相互作用を成立さ
せる能力がある。

【００１６】より十分に、以下に示す本発明のＤＮＡ塩
基配列は、発表されている他の白血球エラスターゼイン
ヒビターのアミノ酸配列とは大きく異なっているところ
のタンパクの合成を導き行なう能力がある。したがっ
て、本発明のＤＮＡ塩基配列の同定によって、本出願の
中で明らかにされる。新規の組み換えプロテアーゼイン
ヒビターの製造に関する組換えＤＮＡ法の本発明を可能
とした。このような組換え法は、セリンプロテアーゼ阻
害活性を持っている経済的な薬剤組成物を供給するため
に、量的にも、純度的にも、阻害剤の製造を可能にす
る。さらに、ＤＮＡ塩基配列の同定により、上述のセリ
ンプロテアーゼ阻害剤の類縁体を製造する組み換えＤＮ
Ａ法の発明を可能にした。

【００１７】発明の要旨 本発明は、プロテアーゼインヒビターの製造に関するも
のであり、一般、そして更に特定的には、ヒト、多形核
（ＰＭＮ）−顆粒球プロテアーゼを阻害対象とした組換
えインヒビターの製造に関するものである。特に本発明
は白血球エラスターゼやトリプシンを始めとするヒト・
セリンプロテアーゼに対するインヒビターの製造のため
の組換えＤＮＡ法に関するものである。それに加えて、
本発明は、当該セリンプロテアーゼインヒビターの類縁
体の製造に関する組み換えＤＮＡ法にも関連する。本発
明はまた、以下に述べるような組み換えＤＮＡ法におい
て有用な合成並びに天然のＤＮＡ塩基配列に関するもの
である。

【００１８】セリンプロテアーゼ阻害活性を持つ一本鎖
のポリペプチドであるセリンプロテアーゼインヒビター
の組み換えＤＮＡ合成法を提供することが本発明の目的
の一つである。これらのインヒビターは、ヒトの耳下腺
分泌物から単離された天然の白血球エラスターゼまたは
トリプシンインヒビターによって示される活性と生物学
的に同等な活性を持っている。

【００１９】これらのセリンプロテアーゼインヒビター
の代替組み換えＤＮＡ合成を容易にするために、等価の
天然のＤＮＡ塩基配列と同様に、これらの組み換えプロ
テアーゼインヒビターの産生を導き行なうことができる
合成ＤＮＡ塩基配列を供給することが、この発明のなお
それ以上の目的である。このような自然のＤＮＡ塩基配
列は、プロテアーゼインヒビターの合成を導き行なうこ
とができる遺伝子が、そこから単離、同定されうるｃＤ
ＮＡもしくはゲノムライブラリーから単離されうる。

【００２０】さらに、先に検討したプロテアーゼインヒ
ビターの類縁体を製造する組み換えＤＮＡ法及びこのよ
うな方法に役立つ、相当する類縁ＤＮＡ塩基配列を提供
することが本発明の目的である。なおその他の本発明の
目的と利点は、以下に続く記述において一部出てくるで
あろう。そして一部は記述から明白であるか、発明の実
施から学ばれることもあろう。その目的と利益は、添付
した特許請求の範囲において特に指摘されている手段と
組合せによって了解され、達成されるであろう。

【００２１】この目的を達成するため、そして本発明の
目的に従って、セリンプロテアーゼ阻害活性を示すとこ
ろの、活性型で一本鎖ペプタイドのタンパクであるプロ
テアーゼインヒビターの組み換えＤＮＡ方法論による産
生を導き行なうことができるＤＮＡ塩基配列を発見し
た。これらの組み換えプロテアーゼインヒビターは、熱
や酸による変性に対して著しく耐性である。さらに、こ
れらのプロテアーゼインヒビターは、キモトトリプシン
やマウスの顎下腺プロテアーゼやクロストリパインのよ
うな多くのタンパク分解酵素に接触した後でさえ、それ
らの生物活性を維持している。

【００２２】これらの組み換えセリンプロテアーゼイン
ヒビターの製造を導き行なうために発見されたＤＮＡ塩
基配列の（遺伝暗号鎖）コーディングストランドは以下
の通りである。

【化１３】

【００２３】上述の略号によって表示されているヌクレ
オタイドは、提起された具体的態様に係る詳細な記述に
おいて明らかになる。これらの遺伝子組み換えセリンプ
ロテアーゼインヒビター、特に本発明の分泌形白血球プ
ロテアーゼインヒビター（ＳＬＰＩ）の製造を導き行な
うために発見した、２番目の好ましいＤＮＡ塩基配列に
対するコーディングストランドは以下の如くである。

【００２４】

【化１４】

【００２５】さらに目的を達成するため、そして本発明
の目的に従って、上述の天然または合成ＤＮＡ塩基配列
を用いて、セリンプロテアーゼインヒビターの微生物に
おける製造に帰着する組み換えＤＮＡ法を明らかにす
る。この組み換えＤＮＡ法は以下の項目を包含する。 （ａ）宿主微生物を導き、セリンプロテアーゼ阻害活
性、好ましくは白血球エラスターゼ阻害活性を持つタン
パクの製造を行なうことができるＤＮＡ配列の調製。 （ｂ）宿主微生物の中に導入され、複製することができ
るＤＮＡ塩基配列をクローニングすること。このような
ベクターＤＮＡ塩基配列に対するオペレーショナルエレ
メント（操作要因）を含んでいる。 （ｃ）ＤＮＡ塩基配列とオペレーショナルエレメントを
含むベクターをプロテアーゼ阻害タンパクを発現するこ
とができる宿主微生物の中に移すこと。 （ｄ）ベクターの増幅とインヒビターの発現のため適切
な条件下でその微生物を培養すること。 （ｅ）インヒビターを収穫すること；そして （ｆ）インヒビターがセリンプロテアーゼ阻害活性を有
する活性三次構造をとれるようにすることである。

【００２６】本発明において使うための天然のＤＮＡ塩
基配列の同定単離を容易にするため、本発明者達はヒト
耳下腺組織ｃＤＮＡライブラリーを開発した。このライ
ブラリーは、細胞が本発明のセリンプロテアーゼインヒ
ビターを合成するようにしむけることができる遺伝情報
を含んでいる。ここに述べられた組み換えＤＮＡ法に用
いられることがある他の天然ＤＮＡ塩基配列は、ヒト・
ゲノムライブラリーから単離することができる。

【００２７】本発明の方法において役に立つ合成塩基配
列は、ポリヌクレオチドの合成と、この道の普通の技量
を持った人々にとって知られている配列を行なう技術に
よって作ることができる。先に述べた過程において、有
用な天然のＤＮＡ塩基配列は、以下の項目を含む方法に
よって同定・単離することができる： （ａ）細胞から、好ましくは耳下腺の細胞からセリンプ
ロテアーゼインヒビターを誘発させることができるヒト
ｃＤＮＡライブラリーを調製すること。

【００２８】（ｂ）プロテアーゼ阻害剤の遺伝子または
そのタンパク生産物に結合することができる少なくとも
１つのプローブでヒトＤＮＡライブラリーをプローブす
ること。 （ｃ）クローンが遺伝子又はそのタンパク生成物に対す
る、少くとも１つのプローブに結合する能力によって、
阻害剤をコードしている遺伝子を含む少なくとも１つの
クローンを同定すること。 （ｄ）同定されたクローンから阻害剤をコードしている
遺伝子の単離、そして （ｅ）遺伝子またはそれについての適切な断片を宿主の
微生物の遺伝子を維持し、表現することに必要なオペレ
ーショナルエレメントにつなぐこと。

【００２９】上述の工程において、有用な天然のＤＮＡ
塩基配列も、以下の項目を含む方法によって同定・単離
できる。 （ａ）宿主ｒｅｃ Ａ ｒｅｃ ＢＣ Ｅ．ｃｏｌｉに
おいて繁殖させたヒト・ジェノミックＤＮＡライブラリ
ーを調製すること。 （ｂ）ヒト・ゲノムＤＮＡライブラリーをセリンプロテ
ィンインヒビター遺伝子に結合することができるか、そ
のタンパク生成物に結合することができる少くとも１つ
のブローブでプローブすること。

【００３０】（ｃ）遺伝子又はそのタンパク産物に対す
る少くとも１つのプローブに結合するクローンの能力に
よってインヒビターをコードする遺伝子を含む少くとも
１つのクローンを同定する。 （ｄ）同定されたクローンからインヒビターをコードす
る遺伝子を単離する。そして、 （ｅ）遺伝子もしくは適当なその断片を宿主微生物中の
遺伝子を維持し発現するのに必要なオペレーショナルエ
レメントにつなぐこと。

【００３１】さらに、目的を達成するため、そして本発
明の目的に従って、セリンプロテアーゼインヒビターの
医薬として有用な類縁体は上記で詳述した遺伝子組み換
えＤＮＡ法により、適切なベクターにクローニングを行
なって、適切な宿主微生物に移した場合、欲しい類縁体
の発見を誘導できる遺伝子をつくり出すために、上に列
挙した組み換えＤＮＡ技術を通じて合成的なＤＮＡ塩基
配列もしくは天然ＤＮＡ断片を変えることにより生産す
ることができる。

【００３２】さらに、目的を達成するために、そして本
発明の目的に従って、本発明に従った組み換えプロテア
ーゼインヒビター、もしくは上に述べた、組み換えＤＮ
Ａ法で生産された生物活性を有するアナログを活性成分
として含んでいる薬剤組成物を明らかにする。本発明に
組み込まれていてこの出願の一部をなしている添付され
ている図面は、この発明に役立つ種々のプラスミドを図
解し、同時に、本発明の原理を説明するのに役立つ記述
を含んでいる。

【００３３】図１は、プラスミドｐＳＧＥ６の地図であ
る。図２は、プラスミドｐＳＧＥ８の地図である。図３
は、プラスミドｐＧＳ２８５の地図である。図４は、プ
ラスミドｐＧＳ４８５の地図である。

【００３４】好適態様に関する説明 現在において提出した発明の実施態様について、今、詳
細に述べよう。それらは、あとに続く実施例とともに本
発明の原理を説明するのに役に立つ。上記したように、
本発明は精製した形で単離されたプロテアーゼインヒビ
ターに関するものである。望ましくは、本発明のセリン
プロテアーゼインヒビターは、一本鎖ポリペプチドタン
パクであり、ヒト・耳下腺分泌物から単離された天然の
セリンプロテアーゼインヒビターと実質的に同族である
かもっとも好ましくは生物学的に等価である。

【００３５】本明細書および請求範囲を通じて使われて
いる“生物学的に等価”とは、組成物は、プロテアーゼ
によって誘起された、同じ型の組織の損傷を防ぐことが
できるが、必ずしも天然プロテアーゼインヒビターと同
程度ではないということである。あとに続く明細書の記
載および請求の範囲を通じて使用されている“実質的に
相同”とは、天然の耳下腺インヒビターに対して以前に
報告されている一本鎖ペプタイドセリンプロテアーゼイ
ンヒビターによって示された相同性以上の相同性のこと
である。好ましくは、相同性の程度が４０％より大き
く、最も好ましくは５０％より大きく、特別に好ましい
群のタンパクは天然耳下腺インヒビターとの相同性が６
０％より大きい。上に記述したような百分率の相同性
は、２つの配列のうちの小さい方に見出された成分の百
分率として計算されており、２つの配列のうちの大きい
方でも、同じことがみつかるかもしれない。この成分は
４つの続いたアミノ酸の配列として理解されているもの
である。

【００３６】本発明の組み換え法によって製造される好
ましいプロテアーゼインヒビターは、Ｒｏｂｅｒｔ
Ｃ．Ｔｏｍｐｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．の“セリンプロテア
ーゼインヒビターと同じものを単離する方法”と題し
て、１９８４年１２月６日に提出した米国特許出願連続
番号Ｎｏ．６７８，８２３及びこの出願と同日付けで出
願された、Ｒｏｂｅｒｔ Ｃ．Ｔｏｍｐｓｏｎらの“セ
リンプロテアーゼ阻害剤と同じものを単離する方法”と
題する米国特許出願連続番号Ｎｏ． に記述されている。

【００３７】このようなプロテアーゼインヒビターは、
熱や酸による変性に対し、著しく耐性であり、又、キモ
トリプシン、マウス顎下腺プロテアーゼ、クロストリパ
インをはじめとする、多くのタンパク分解酵素に接触し
た場合、活性喪失に対し抵抗性である。これらのインヒ
ビターは、必要なジスルフィド結合を形成する能力を持
ち、生化学的刺激の存在しないところで、プロテアーゼ
インヒビター活性を表わすことができる３次構造をとる
べく適切な非共有結合的相互作用を受ける。あるいは、
ジスルフィド結合が切れて非共有結合的相互作用が破壊
されてもこのような結合を再生し、相互作用を取戻し、
生化学的刺激のないところで、このような活性３次構造
を再びとることができる。

【００３８】これらの特性を持っている好ましいセリン
プロテアーゼインヒビターのアミノ酸の配列を検討し、
その配列を以下の如く決定した。

【化１５】

【００３９】上記の略号は、ポリペプチド中の下記のと
おりにアミノ酸残基に対応する。アミノ酸 略 号 アラニン Ａｌａ バリン Ｖａｌ ロイシン Ｌｅｕ イソロイシン Ｉｌｅ プロリン Ｐｒｏ フェニールアラニン Ｐｈｅ トリプトファン Ｔｒｐ メチオニン Ｍｅｔ グリシン Ｇｌｙ セリン Ｓｅｒ スレオニン Ｔｈｒ

【００４０】アミノ酸 略 号 システィン Ｃｙｓ チロシン Ｔｙｒ アスパラギン Ａｓｎ グルタミン Ｇｌｎ アスパラギン酸 Ａｓｐ グルタミン酸 Ｇｌｕ リジン Ｌｙｓ アルギニン Ａｒｇ ヒスチジン Ｈｉｓ

【００４１】本発明により明らかにされた組み換えＤＮ
Ａ法によって製造されるこれらのプロテアーゼインヒビ
ターは１つ以上の区別できるドメインを持っていること
が発見された。１つ以上の区別できるドメインとは、そ
のタンパクが異なる酵素に対して機能する複数の活性部
位を持っているということである。これらの場所の存在
と位置づけは、プロテアーゼインヒビターの少くとも２
つの部分の間には、実質的な相同性があることが発見さ
れたことによって決定された。区別できるドメインの存
在が、本発明のプロテアーゼインヒビターに対して白血
球エラスターゼもトリプシンも含む広い範囲のセリンプ
ロテアーゼを阻害する能力を与えていると考えられる。

【００４２】さらに、これらプロテアーゼインヒビター
のはっきりしたドメインの複数性のために、プロテアー
ゼインヒビターが附加的特性をもつプロテアーゼインヒ
ビターをつくるために、さまざまな他の活性部位がその
上に構築されるような枠組みとして役立つかもしれない
ということが注目された。本発明の好適態様では、白血
球エラスターゼ、カテプシンＧ、膵臓のエラスターゼと
トリプシンを阻害するプロテアーゼインヒビターの産生
が含まれている。これらの酵素はすべて共通のメカニズ
ムと多くの構造的特徴を共有しているセリンプロテアー
ゼとして知られているプロテアーゼのクラスのメンバー
である。

【００４３】本発明によって生産されたプロテアーゼイ
ンヒビターにおいて、小数のアミノ酸側鎖を細工するこ
とによってインヒビターの複合性が創り出され、各々が
全体のクラスのセリンプロテアーゼの少くとも１員を阻
害することができると考えられる。その上、このような
側鎖の修飾は、上に述べたような特定のセリンプロテア
ーゼのクラスのメンバーに関して阻害活性が改善されて
いる複合性のインヒビターを産生することが期待でき
る。

【００４４】これらの目標を達成するのに必要なアミノ
酸の側鎖の変化は、本発明によって生産された好ましい
インヒビターとこのインヒビターの重要な機能部分がＸ
−線結晶学によって解明された他のセリンプロテアーゼ
阻害剤の間の構造類似性の特定の要素によって示唆され
る。構造的類似性のこれらの要素は上述の本発明によっ
て製造された好ましいセリンプロテアーゼインヒビター
のアミノ酸１７から２９及び７０から８３を含んでい
る。量的か質的かのいずれかにおいて、トリプシン様セ
リンプロテアーゼインヒビターの活性を改良するために
示唆された変化は、２０番目のアミノ酸をＡｒｇからＰ
ｈｅ、ＴｙｒあるいはＴｒｐ、７２あるいは７４番目の
アミノ酸をＬｅｕから、ＬｙｓまたはＡｒｇ、そして７
３番目のアミノ酸をＭｅｔからＬｙｓまたはＡｒｇへ変
換することの１つもしくはそれ以上を含んでいる。

【００４５】カテプシンＧをはじめとするキモトリプシ
ン様セリンプロテアーゼに対する活性を、量的又は質的
に改善するべく示唆された変化は、アミノ酸２０をＡｒ
ｇからＰｈｅ、ＴｙｒまたはＴｒｐへ、アミノ酸７２ま
たは７４をＬｅｕからＰｈｅ、ＴｙｒまたはＴｒｐへ、
そしてアミノ酸７３をＭｅｔからＰｈｅ、Ｔｙｒもしく
はＴｒｐへ変換することを、１つもしくはそれ以上行な
うことを含んでいる。

【００４６】膵臓のエラスターゼ様セリンプロテアーゼ
に対する阻害活性を、量的もしくは質的に変えるべく示
唆された変化は、アミノ酸２０をＡｒｇからＡａｌへ、
７２または７４番目のアミノ酸をＬｅｕからＡｌａへ、
そして７３番目のアミノ酸をＭｅｔからＡｌａへ変換す
ることの１つ又はそれ以上を含んでいる。本発明の実施
にあたっては、本発明のタンパクに新しいプロテアーゼ
阻害活性を付与するためのアミノ酸の変更が、白血球エ
ラスターゼもしくはトリプシンに対するインヒビターの
活性を破壊するかもしれないということに心にとめてお
かねばならない。このような効果は本発明の教示に従っ
て行なわれる型通りの実験によって決定されよう。

【００４７】さらに、上に提出されたように、特定のア
ミノ酸もしくは特定のアミノ酸の配列を置換すると、一
方では強化されないドメインの活性を幾分か犠牲にする
ことになるが、本発明のプロテアーゼインヒビターの白
血球エラスターゼもしくは、トリプシン阻害活性のいず
れかを増強するかもしれないということが考えられる。
事実：阻害タンパクの中のどの領域の活性も、適切なア
ミノ酸置換によって完全に除去され、その際、それに対
して通常そのタンパクが活性がある１つか、もしくはい
くつかの酵素のサブセットに対して、特異性のあるタン
パクをつくるかもしれない。

【００４８】例えば、７３位置のＭｅｔに対し、Ｇｌｙ
を置換するか、もしくは、７２か、７４の位置のＬｅｕ
に対してＧｌｙを置換すると、白血球エラスターゼ阻害
ドメインを不活性化するが、２０の位置のＡｒｇに対し
Ｇｌｙを置換するとトリプシン阻害ドメインを不活性化
する。これらドメインはまた、各々が望ましい阻害機能
を保持する、別々のタンパクに分けることもできる。本
発明の請求範囲は、これらの手段によるこのようなイン
ヒビターを産生する他の工程に対しても拡張される。本
発明者らは、前記で議論したプロテアーゼインヒビター
の細胞内生産を導き行なうことができる合成的ＤＮＡ塩
基配列を発見した。この塩基配列は、次のような構造を
もっている：

【００４９】

【化１６】

【００５０】この中で、ヌクレオチドは、下記のとおり
の略号で表されている：ヌクレオチド 略 号 デオキシアデニル酸 Ａ デオキシグアニル酸 Ｇ デオキシシチジル酸 Ｃ チミジル酸 Ｔ本発明者ら
は、前記で議論したプロテアーゼインヒビター、とりわ
け、上述の分泌性白血球プロテアーゼインヒビター（Ｓ
ＬＰＩ）の細胞外産生を導き行なうことができる２番目
の好ましい合成ＤＮＡ塩基配列を発見した。この塩基配
列は次のような構成をもっている：

【００５１】

【化１７】

【００５２】上記で注意したように、本プロテアーゼイ
ンヒビターの複合的ドメイン構造のため、上に議論した
ようなセリンプロテアーゼインヒビターの類縁体生産を
導くことができるＤＮＡ配列を結果として生ずる、ここ
に提出する合成的ＤＮＡ配列に変化を与えることが考え
られる。特に本発明に従って組み換えＤＮＡ技術によっ
て生産されたセリンプロテアーゼインヒビターの好まし
い類縁体は、次のアミノ酸配列をもっている：

【００５３】

【化１８】 ここでＲ₁ とＲ₇ は同一か、異なったものであり、置換
もしくは無置換のアミノ酸残基もしくはその誘導体から
なる群から選ばれ；そしてＲ₂ 、Ｒ₃ 、Ｒ₄ 、Ｒ₅ 、Ｒ
₆ 、Ｒ₈ 及びＲ₉ は同一か異なったものであり、メチオ
ニン、バリン、アラニン、フェニールアラニン、チロシ
ン、トリプトファン、リジン、グリシン及びアルギニン
からなる群から選ばれる。

【００５４】上記のＤＮＡ塩基配列は、本発明の好まし
い具体例を表していることに留意すべきである。ジェネ
ティックコードの縮重のためにヌクレオチドの多数の選
択、当該プロテアーゼインヒビター、もしくはその類縁
体の生産を導き、行なうことができるＤＮＡ塩基配列に
導く多数のヌクレオチドの選択がなされうるということ
が理解されるべきである。上記した塩基配列に対し、機
能的に同等であるＤＮＡ塩基配列もしくは上に提出した
アミノ酸配列に従って生産されたプロテアーゼインヒビ
ターの類縁体の産生を導き行なうであろうところの配列
に機能的に等価である配列は、それ自体で本発明の中に
包含されるものとする。

【００５５】以下の図式は、縮重した遺伝暗号の結果と
して考えられるコドンの置換の例として、上記に数え上
げた好ましいアミノ酸配列の製造のための本発明の範囲
に含めることを意図した追加のＤＮＡ配列である。この
タンパクの生産に対する等価ＤＮＡ塩基配列を決定する
ための例を辿ることによって、当業者ならば、好ましい
アミノ酸配列の類縁体の生産のための等価なＤＮＡ塩基
配列も決定できる。

【００５６】

【化１９】

【００５７】上記の配列において、使用されている略号
は下記のヌクレオチドを表わすものである： ヌクレオチド 略 号 Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔ Ｎ Ａ，Ｇ Ｐ Ｃ，Ｔ Ｑ

【００５８】直前に挙げたものを含め、本発明の合成Ｄ
ＮＡ塩基配列において用いられる遺伝暗号を選択する場
合に、特定のアミノ酸を指示するのに用いられる遺伝暗
号は高度に発現されるタンパクと関連するものであるこ
とが望ましい。これらの望ましい遺伝暗号は１部Ｇｒａ
ｎｔｈａｎ，Ｒ ｅｔ ａｌ．らの“Ｃｏｄｏｎ Ｃａ
ｔａｌｏｇ Ｕｓａｇｅ Ｉｓ ａ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓ
ｔｒａｔｅｇｙ Ｍｏｄｕｌａｔｅｄ Ｆｏｒ Ｇｅｎ
ｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｖｉｔｙ”は、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９：ｒ４３（１９８
１）に出ている。本発明の好ましいＤＮＡ配列は、縮重
した配列のいずれに対しても、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉの配列遺伝暗号を選択することによって選ば
れた。

【００５９】さらに、本発明のプロテアーゼインヒビタ
ーの類縁体の産生を導き行なうことが出来る追加の合成
ＤＮＡ塩基配列をつくり上げるための合成ＤＮＡ塩基配
列の変換を容易にする遺伝暗号を選ぶことが望ましい。
特に、もし可能なら、制限酵素、エンドヌクレアーゼの
切断位置を、追加の遺伝暗号を挿入することが望ましい
合成ＤＮＡの位置の近くに、もしくは類縁体か作られる
ように遺伝暗号を取り換えることが望ましい位置に、も
ってくることができるようにヌクレオチド配列を選ぶこ
とが望ましい。本発明のＤＮＡ配列の望ましい実施態様
においては、制限酵素の切断位置が上に示したヌクレオ
チド配列の下に示してある。

【００６０】本発明において考えられている合成ＤＮＡ
配列をつくり出す方法は、一般的に、最近の報告によっ
て導かれたこの道の普通のわざの１つによって遂行され
る型通りの業務の範囲内にある。本発明において明らか
にした合成ＤＮＡ塩基配列を得るために用いられる適切
な方法の例は、Ｍａｔｔｅａｃｃｉ，Ｍ，Ｄ，とＣａｒ
ｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｊ．ＡＭ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．１０３：３１８５（１９８１）及び、Ｂｅａｕｃａ
ｇｅ，Ｓ．Ｌ．とＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｔｅ
ｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２２；１８５９（１９
８１）、によって提出されており、両方とも、特別に参
照事項としてこの中に組み込まれている。本発明の別の
実施態様において、１つのＤＮＡ塩基配列が、本発明の
望ましい分泌白血球プロテアーゼインヒビター（ＳＬＰ
Ｉ）をコードするヒト・ジェノミックライブラリーから
単離された。この４番目の遺伝暗号からコードされ、現
在発明者らに知られているイントロン（介在配列）を含
むこの塩基配列は以下の通りである：

【００６１】

【化２０】

【００６２】

【化２１】

【００６３】

【化２２】

【００６４】これらの配列において使用されているアミ
ノ酸残基を表わす１文字の略号は慣用のものであり、例
えば、Ａ．Ｌ．ＬｅｈｎｉｎｇｅｒによるＢｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ 第２版、Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅ
ｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７６）７２頁に
出ている。この塩基配列とここに含まれるアミノ酸配列
データーを用いて、上のゲノム配列に加えられた場合、
全プロテアーゼインヒビター剤をコードする遺伝子に到
達する合成ＤＮＡ配列が構築できる。そのかわりに、上
に示したＤＮＡ塩基配列を用いてプローブを作り、最初
の３つのアミノ酸に対するコドンを持っている、ヒトゲ
ノムライブラリーから、ＤＮＡ断片を回収するのに用い
た。

【００６５】このようなプローブは、それに加えて適切
なリーダー配列を含むヒトゲノム配列を同定するのに用
いられる。このリーダー配列、または、どの他の適切な
リーダー配列も、ＤＮＡゲノム配列と併用して、哺乳動
物の発現システムに用いられると考えられる。本発明の
もう１つの別法としての具体的態様において、本発明の
好ましい分泌性白血球プロテアーゼインヒビターの細胞
内生産を導き、行なうことができるＤＮＡ配列をコード
する耳下腺ライブラリーからｃＤＮＡクローンを単離し
た。このクローンはＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．
の下に、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａ
ｎｄのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ ＣｕｌｔｕｒｅＣ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されている。

【００６６】セリンプロテアーゼ阻害活性を有する少な
くとも１つの活性部位をもつ１本鎖ポリペプタイドから
構成されている１つのプロテアーゼインヒビターの製造
に対する組み換えＤＮＡ法が明らかとなった。本発明の
態様の１つにおいて、この活性部位は、ヒト・耳下腺分
泌物から単離された天然の白血球エラスターゼインヒビ
ターの活性部位と生物学的に等価な方法で機能する。天
然又は合成ＤＮＡ塩基配列は、プロテアーゼインヒビタ
ーの直接生産に用いることができる。

【００６７】この方法は、以下の工程を含む： （ａ）宿主微生物が、セリンプロテアーゼインヒビター
活性をもっているタンパクを生産するよう導くＤＮＡ塩
基配列の調製。 （ｂ）ＤＮＡ塩基配列を宿主に移し増殖することができ
るベクターにそのＤＮＡ塩基配列をクローニングするこ
と。このようなベクターは、そのＤＮＡ塩基配列に対し
てオペレーショナルエレメントを含んでいる。 （ｃ）合成ＤＮＡ塩基配列とオペレーショナルエレメン
トを含むベクターをプロテアーゼインヒビターを発現す
ることができる宿主微生物に移す。 （ｄ）その微生物をベクターの増殖とインヒビターの発
現に適切な条件下で培養すること。 （ｅ）インヒビターを収穫すること。そして、 （ｆ）インヒビターがセリンプロテアーゼ阻害活性を持
つ、活性３次構造をとれるようにすること。

【００６８】この方法における使用のために考えられた
合成ＤＮＡ塩基配列が、上に詳細に検討された。別の実
施態様において、この方法で天然のＤＮＡ塩基配列も使
うことができるということが更に考えられる。これらの
配列には、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ断片が用いら
れる。この実施態様のより好ましい変形として天然のＤ
ＮＡ配列は、以下の項目を含む方法によって得られる。 （ａ）セリンプロテアーゼインヒビターを産生できる細
胞、さらに望ましくは、耳下腺の細胞からヒトのｃＤＮ
Ａライブラリーを調製する。

【００６９】（ｂ）プロテアーゼインヒビター遺伝子も
しくはそのタンパク産物に結合することができる少くと
も１つのプローブで、ヒトＤＮＡライブラリーを検索す
る。 （ｃ）そのクローンが遺伝子もしくはそのタンパク産物
に対する、少くとも１つのプローブと結合する能力によ
ってインヒビターをコードする遺伝子を含む少くとも１
つのクローンを同定する。 （ｄ）選ばれた単一クローンもしくは複数のクローンか
らインヒビターをコードする遺伝子の単離。 （ｅ）遺伝子もしくはその適切な断片を宿主微生物中の
遺伝子を維持し、発現するために必要なオペレーショナ
ルエレメントにつなげること。

【００７０】前出の方法において、有用な天然のＤＮＡ
塩基配列もまた以下の工程を経て同定単離できる： （ａ）より好ましくは、宿主ｒｅｃ Ａ ｒｅｃ ＢＣ
Ｅ．ｃｏｌｉ中で繁殖させたヒト・ジェノミックライ
ブラリーを作る。 （ｄ）ヒトジェノミックライブラリーをセリンプロテイ
ンインヒビター遺伝子、もしくは、その生産物に結合す
ることができる少なくとも１つのプローブを用いて検索
する。

【００７１】（ｃ）そのクローンが遺伝子またはタンパ
ク産物に対する少なくとも１つのプローブに結合するク
ローンの能力によってインヒビターをコードする遺伝子
を含む少くとも１つのクローンを同定する。 （ｄ）同定されたクローンからのインヒビターをコード
する遺伝子を単離する。 （ｅ）遺伝子もしくはその適当なフラグメントを宿主微
生物中の遺伝子を維持し、表現するのに必要なオペレー
ショナルエレメントにつなげること。

【００７２】上記に挙げた方法を用いるのに、適切な天
然のＤＮＡ遺伝子を単離するにあたり、適当な遺伝子の
両端部分、すなわち遺伝子の断面の内側または最も近い
部分に位置している２つの制限酵素切断部位を同定する
ことがより好ましい。適切な遺伝子を含むＤＮＡ断片を
次に適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて、ゲノム物
質の残りから除去する。切り出した後、セリンプロテア
ーゼインヒビタータンパクのＮ−及びＣ−末端にコード
することができ、またそのＤＮＡ配列をそのオペレーシ
ョナルエレメントに融合させることができるように、Ｄ
ＮＡ配列の３′及び５′末端は再構築される。

【００７３】本発明における、使用のため考えられるベ
クターは、優先されるか、もしくは、必要となるオペレ
ーショナルエレメントとともに、前記で検討したような
ＤＮＡ塩基配列が挿入され、又そのベクターが、その後
宿主微生物に移され、その微生物中で複製出来るよう
な、ベクターすべてを含む。より好ましいベクターは、
その制限酵素切断部位がよく報告されていて、ＤＮＡ塩
基配列の転写に、より好まれるか、もしくは必要であ
る、オペレーショナルエレメントを含んでいるようなベ
クターである。

【００７４】本明細書に記載のオペレーショナルエレメ
ントの用語には、少なくとも１つのプロモーター、少く
とも１つのオペレーター、少くとも１つのリーダー配
列、少くとも１つのシャイン−ダルガーノ配列、少くと
も１つの停止コドン及びベクターＤＮＡの適切な転写と
その次の翻訳に必要か、より好ましい他のＤＮＡのすべ
てが含まれる。特に、このようなベクターは、少くとも
１つの選択可能なマーカーとともに、宿主微生物によっ
て認識される複製の少くとも１つの起点、及び合成ＤＮ
Ａの塩基配列の転写を始めることが出来る少くとも１つ
のプロモーター塩基配列を含んでいると予測されてい
る。ある実施態様においては、ベクターは、レギュレー
ターとして機能することができるあるＤＮＡを含み、レ
ギュレータープロテインをコードすることができる他の
ＤＮＡ塩基配列を含んでいることが、さらに、より好ま
しい。

【００７５】これらのレギュレーターは、１つの実施態
様においては、ある環境条件の存在下でＤＮＡ配列の発
現を防ぐのに役立ち、他の環境条件では転写と、続いて
起る合成ＤＮＡ塩基配列によってコードされたタンパク
の発現が行なわれる。とりわけ、例えば、イソプロピル
チオー−ｄ−ガラクトシッドが存在しないと、合成ＤＮ
Ａの発現が起らないようなベクターのなかには調節断片
が挿入されることがより好ましい。この状況下では、合
成ＤＮＡを含む形質転換した微生物は、プロテアーゼイ
ンヒビターの発現がはじまる以前にある望ましい密度ま
で育てられるかもしれない。この実施態様においては、
望ましいプロテアーゼインヒビターの発現は、望ましい
密度が達された後にＤＮＡ塩基配列の発現を起すことが
できるある物質を微生物の環境に加えることにより誘導
される。

【００７６】それに加えて、ベクター中か、もしくは合
成ＤＮＡ配列の５′末端に、適切な分泌リーダー配列が
存在することがより望ましい。リーダー配列は、リーダ
ー配列がプロテアーゼインヒビターの発現を導くことが
できるヌクレオチド配列のはじめの部分に、翻訳停止シ
グナルを間にはさまずに、すぐに隣りあっていることが
できるような位置にある。リーダー配列の存在は、一部
には以下の理由のうち１つかそれ以上の理由から、望ま
れる：１）リーダーインヒビターが存在すると、宿主が
初期の生産物を成熟した組み換えプロテアーゼインヒビ
ターに仕上げることを容易にするかもしれないこいと；
２）リーダー配列の存在は、プロテアーゼインヒビター
を細胞質の外へ導くことにより、組み換えプロテアーゼ
インヒビターの精製を容易にするかもしれないこと。
３）リーダー配列の存在は、組み換えプロテアーゼイン
ヒビターが、プロテアーゼインヒビターを細胞質の外へ
導くことを通じてその活性構造へ組み込まれる能力に影
響を与えるかもしれないこと。

【００７７】とりわけ、リーダー配列は、最初の産物を
リーダーペプチダーゼによって、リーダー配列を除去
し、セリンプロテアーゼ阻害活性の潜在力をもつより好
ましいポリペプタイドを残すため、初期の翻訳産物の開
裂を導く。宿主微生物のある種においては、適切なリー
ダー配列の存在によりＥｓｃｈｅｒｌｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉの場合のように完成したタンパクを細胞周辺腔に輸
送できるようにする。ある酵母や、ＢａｃｉｌｌｉやＰ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの場合には、適切なリーダー配列
は、タンパク細胞膜を通って細胞外の培地への輸送がで
きるようにする。この状況では、目的のタンパクは、細
胞外タンパクから精製できる。

【００７８】３番目に、本発明によって調製されるプロ
テアーゼインヒビターの中のあるものの場合には、完成
されたタンパクを適切なエラスターゼ阻害剤活性をもつ
活性性構造をとるように組み込まれる環境のなかに位置
させることに、リーダー配列の存在が必要である。それ
以上のオペレーショナルエレメントには、そればかりで
はないが、リボゾーム結合部位と余所者タンパクの微生
物発現のために必要な他のＤＮＡ配列がふくまれる。

【００７９】本発明のより好ましい態様においては、GA
GGCGCAAAAA(ATG) の配列がリボゾーム結合部位として用
いられるであろう。この中で検討された、オペレーショ
ナルエレメントは、以前の文献や、ここに含まれている
教訓に照らしてバイオテクノロジーの普通の技能をもっ
た人々によって型通りに選ばれる。これらのオペレーシ
ョナルエレメントの一般的例は、Ｂ．Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅ
ｎｅｓ Ｗｉｌｅｙ＆ Ｓｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１
９８３）に出ており、これはこの中に参照によって特別
に折り込まれている。この中で考察されているようなベ
クターは、一部はプラスミッドｐＢＲ３２２そして／又
はｐＩＱの部分から組立てられる。

【００８０】本発明のより好ましい実施態様において、
プロテアーゼインヒビターをコードする合成ＤＮＡ配列
のすぐ前に、さらにあらたなＤＮＡ配列が位置してい
る。この追加のＤＮＡ配列は、翻訳カップラーとして機
能することができる。即ち、それはリボゾームをそれが
隣り合って並んでいるプロテアーゼインヒビターＲＮＡ
のリボゾーム結合部位のすぐ隣りにリボゾームを位置さ
せるのに役立つＲＮＡをコードしているＤＮＡの配列で
ある。本発明の１つの実施態様において、翻訳カップラ
ーは、ＤＮＡ配列TAACGAGGCGCAAAAAATGAAAAAGACAGCTATC
GCGATCGGAGTGTAAGAAATG を使用し、翻訳カップラーに関
連したその道の普通のわざをもった人々にとって現在知
られている方法を使って導き出すことができる。２番目
の好ましい翻訳カップラーはTAACGAGGCGCAAAAAATGAAAAA
GACAGCTATCGCGATCAAGGAGAAATAAATG.のＤＮＡ配列をもっ
ている。

【００８１】前記したベクターの、すべての必要なそし
て望ましい成分要素の合成と単離ができたところで、ベ
クターはその道の普通の技能をもつ人々に一般に知られ
ている方法によって組立てられる。このようなベクター
の組立ては、その道の普通の技能をもった人々によって
遂行される義務的職務の範囲内にあると信じられてお
り、そしてそれ自体、特別むずかしい実験をしなくても
遂行できる。例えば、参照として特別に本出願に加えた
ＳｈｏｎｅｒらＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎ
ｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１；５４０３−５４０７（１
９８４）、において、明らかにされているように、類似
のＤＮＡ配列が適切なクローニングベクターにつなげら
れている。

【００８２】本発明のクローニングベクターの構築にお
いて、合成ＤＮＡ配列の多重コピーとその付随のオペレ
ーショナルエレメントが各ベクターに挿入されるかもし
れないということが、つけ加えて注目されるべきであ
る。このような実施態様においては、宿主生物は、望ま
れるプロテアーゼのベクターあたりのより大きな量を生
産するであろう。ベクターの中に挿入され得るＤＮＡ配
列の複数のコピーの数は、結果としてできたベクター
は、その大きさのため、適切な宿主微生物に移された
り、その中で複製したり転写されたりする能力によって
のみ制限を受ける。

【００８３】さらにつけ加えて、ベクターが、薬剤抵抗
性マーカーや宿主微生物による特性の発現の原因となる
他のマーカーのような選択可能なマーカーを含んでいる
ことがより望ましい。本発明の特に望ましい実施態様に
おいて、テトラサイクリン抵抗性に対する遺伝子がクロ
ーニングベクターに優先的に含まれている。

【００８４】このような薬剤抵抗性や他の選択可能なマ
ーカーは、部分的にトランスフォーマントの選択を容易
にすることを意図している。それに加えて、クローニン
グベクターの上の、このような選択可能なマーカーの存
在は、混入した微生物が培地中で増殖するのを防ぐのに
役立つかもしれない。この実施態様において、この形質
転換した宿主微生物の純粋な培養は、生き残るのに誘導
した表現型を必要とする条件下で微生物を培養すること
によって得られるであろう。

【００８５】このようにして得られたベクターは、次に
適切な宿主微生物に移される。外生のＤＮＡを取り込ん
で、それらの遺伝子や付随するオペレーショナルエレメ
ントを発現する能力を持った微生物はすべて選ばれてよ
いと信じられている。宿主微生物は、通性嫌気性または
好気性菌であることがより望ましい。この方法における
使用に好ましい特別な宿主は、酵母と細菌である。特定
の酵母は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ層の酵母であ
り、特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｖｉｓ
ｉａｅである。特別の細菌は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ層、Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ層及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ層
の細菌、特に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ及
びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉである。

【００８６】宿主微生物が選ばれた後、ベクターはその
道の普通の技能をもつ人々によって、一般的に知られて
いる方法を用いて宿主微生物に移される。このような方
法の例は、Ｒ．Ｗ．Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，“細菌
の遺伝の進歩”、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）に見出される。これ
は、特別に参照としてこの中にとり込まれている。上に
述べたようなオペレーショナルエレメントの使用を通じ
て、温度調節が、遺伝子発現を調節する手段として考え
られるので、１つの実施態様において形質転換が低温で
起ることがより好ましい。もう１つの実施態様におい
て、滲透のレギュレーターがベクターに挿入されたなら
ば、形質転換を通じての塩の濃度の調節が、合成遺伝子
の適切なコントロールを確保するために必要となるであ
ろう。

【００８７】組み換えセリンプロテアーゼインヒビター
が終局的に酵母中で発現される場合を考えると、クロー
ニングベクターを、まずＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉに最初に移すことがより望ましい。Ｅ．ｃｏｌｉに
おいて、ベクターに増殖を行なわせ、倍増してから取り
出し精製する。ベクターは、次にセリンプロテアーゼイ
ンヒビターの究極的表現のために酵母の中に移されるで
あろう。

【００８８】宿主微生物は、セリンプロテアーゼインヒ
ビターの発現に対して適切な条件下で培養される。これ
らの条件は、一般に宿主微生物にとって特異的であり、
例えば、Ｂｅｒｇｅｙ′ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅ
ｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，
８ｔｈ Ｅｄ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎ
ｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌ
ａｎｄのような微生物のための生育条件に関する出版さ
れた文献に照らして、この道の普通の技能をもった人々
によって容易に決められる。この文献は参照としてここ
に特別に組み込まれている。

【００８９】ベクターの中に挿入された、又は存在する
オペレーショナルエレメントすべてに応じて、ＤＮＡ配
列の表現の調節に必要な条件は、すべて形質転換と培養
の段階で効果をもつであろう。１つの実施態様において
は、細胞はＤＮＡ配列の発現を阻害する適切な調節条件
において、高密度迄育てられる。最適の細胞密度に近づ
いたとき、環境条件は、合成ＤＮＡ配列の発現に対して
適切な条件に変えられる。このようにして、プロテアー
ゼインヒビターの生産条件は、宿主の細胞がほぼ最適密
度に近づいたあとの時期で起り、そして結果として生ず
るプロテアーゼインヒビターは、その発現に必要な調節
条件が誘起された後、しばらくしてから収穫されると考
えられる。

【００９０】本発明のより望ましい実施態様において、
組み換えプロテアーゼインヒビターは、収穫の後、そし
てその活性構造をとる以前に精製される。本発明者は、
リフォルディング済みのタンパクの高収率回収は、タン
パクが先ず精製される場合に、容易に得られると信じて
いるので、この実施態様がより望ましい。しかし、１つ
のより好ましい別の実施態様においては、プロテアーゼ
インヒビターは、その活性構造をとるべく、リフォルデ
ィングするのにまかせてから精製することがある。さら
にもう１つのより好ましい代りの実施態様においては、
プロテアーゼインヒビターは、培養液から回収すると
き、リフォルディングの済んだ活性な状態で存在してい
る。

【００９１】ある条件では、プロテアーゼインヒビター
は、宿主微生物での発現、次いでそのタンパクの細胞壁
を通過しての輸送又は膜を通って細胞周辺腔への輸送の
際に、そのしかるべき活性な構造をとっている。これ
は、一般的に適切なリーダー配列をコードするＤＮＡ
が、組み換えタンパク質をコードするＤＮＡにつながっ
ていると起る。プロテアーゼインヒビターが、その適切
な活性構造をとらない場合は、形成したどのジスルフィ
ド結合も、そして／または、どの生じた非共有結合的相
互作用も、変性試薬や還元試薬、例えば、グアニジウム
クロライド、−メルカプトエタノールによって先ず破壊
してから、プロテアーゼインヒビターをコントロールし
た条件においての希釈及びこれらの試薬の酸化に続いて
その活性構造がとれるようにする。

【００９２】

【実施例】本発明の教示を特定の問題や環境に応用する
ことは、ここに含まれた知見に照らして、この道の普通
の技能をもった人の能力の範囲内にあるということが理
解されるべきである。本発明の生産物とそれらの単離、
製造に対する代表的工程が以下の例にみられる。例 １ 上記のアミノ酸配列、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌ
ｉの高度に発現性の遺伝子におけるコドンの使用、及び
便利な制限エンドヌクレアーゼの開裂部位に基いて、以
下のＤＮＡ配列が提案された：

【００９３】

【化２３】

【００９４】タンパク質をＥ．ｃｏｌｉのペリプラズム
に輸送するのに適した形で、プロテインの発現を調節す
るため、以下の調節要素が提案された。即ち、高いレベ
ルにおける転写の開始の開始のためのｔａｃプロモータ
ー；転写の制御のためのｌａｃオペレーター：プラスミ
ドの他の場所でコードされるべきｌａｃリプレッサー
（ｌａｃＩ^q ）；高いレベルで翻訳をはじめるＯｍｐＡ
シャイン−ダルガーノ配列；産物のペリプラズムへの輸
送を容易にするＯｍｐＡリーダー、これらのオペレータ
ーエレメントによってコードされるタンパクと最初の産
物の開裂を指示し、成熟した白血球エラスターゼ阻害剤
を生ずる上述の構造遺伝子によってコードされるタンパ
クとの間のＡｌａ−Ｓｅｒ連結のＡｌａである。

【００９５】これらの特徴はすべて、以下のＤＮＡ配列
のなかに組みこまれている：

【化２４】

【００９６】タンパクがＥ．ｃｏｌｉの細胞質内にとど
まるような形でタンパクの発現を調節するために、以下
のオペレーショナルエレメントが提供される。即ち、ｔ
ａｃプロモーター：ｌａｃオペレーター、そしてｌａｃ
リプレッサー（ｌａｃＩ^q ）；シャイン−ダルガーノ配
列のコンセンサス；そして翻訳の高いレベルを開始する
ため、翻訳カップラーとして用いられるべきＯｍｐＡリ
ーダーペプタイドの断片である。翻訳カップリング配列
はＯｍｐＡ遺伝子の翻訳の開始領域、ＯｍｐＡリーダー
ペプタイドの最初の８箇のアミノ酸は、上述のシャイン
−ダルガーノ配列認識及び翻訳停止を行なう配列をコー
ドするＤＮＡを含む。翻訳カップリング配列はプロモー
ターとセリンプロテアーゼインヒビター遺伝子の翻訳開
始部位の間に、後者と重なって挿入されるべきである。

【００９７】これらの特徴のすべては、以下のＤＮＡ配
列に組み込まれている：

【化２５】

【００９８】Ａ． 遺伝子断片の構築 上の配列を組み立てるため、次のデオキシリボヌクレオ
チドがＡＢＩ ＤＮＡシンセサイザー（Ｆｏｓｔｅｒ
Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて合成され
る。合成産物は、ＡＢＩ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｍａ
ｎｕａｌ中に記述してあるように、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動によって精製される。それらを、標準の方
法に従ってＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５′
をリン酸化した。以下のグループのオリゴヌクレオチド
配列がフラグメント（断片）Ａａを組み立てるために使
用される：

【００９９】オリゴヌクレオチドＡａ１は： GCTGT TGACA ATTAA TCAT. オリゴヌクレオチドＡａ２は CGGCT CGTAT AATGT GTGGA ATTGT GAGCG GATAA CAATT T. オリゴヌクレオチドＡａ３は CACAC ATAAC GAGGC GCAAA AA. オリゴヌクレオチドＡａ４は ATGAA AAAGA CAGCT ATCGC GATCG. オリゴヌクレオチドＡａ５は CAGTG GCACT GGCTG GTTTC GCTAC CGTAG CGCAG GCCAG CG
GTA AA. オリゴヌクレオチドＡａ６は GAGCC GATGA TTAAT TGTCA ACAGC TGCA. オリゴヌクレオチドＡａ７は TCCGC TCACA ATTCC ACACA TTATA C. オリゴヌクレオチドＡａ８は CCTCG TTATG TGTGA AATTG TTA. オリゴヌクレオチドＡａ９は GCCAC TGCGA TCGCG ATAGC TGTCT TTTTC ATTTT TTGCG. オリゴヌクレオチドＡａ１０は AGCTT TTACC GCTGG CCTGC GCTAC GGTAG CGAAA CCAGC CA
GT.

【０１００】以下のオリゴヌクレオチド配列が、組み立
てられ、断片Ａｂが作られる： ヌクレオチドＡｂ１は GCTGT TGACA ATTAA TCAT. ヌクレオチドＡｂ２は CGGCT CGTAT AATGT GTGGA ATTGT GAGCG GATAA CAATT T. ヌクレオチドＡｂ３は CACAC ATAAC GAGGC GCAAA AA. ヌクレオチドＡｂ４は ATGAA AAAGA CAGCT ATCGC GATCG. ヌクレオチドＡｂ５は CAGTG TAAGA AATGA GCGGT AAA. ヌクレオチドＡｂ６は GAGCC GATGA TTAAT TGTCA ACAGC TGCA. ヌクレオチドＡｂ７は TCCGC TCACA ATTCC ACACA TTATA C. ヌクレオチドＡｂ８は CCTCG TTATG TGTGA AATTG TTA. ヌクレオチドＡｂ９は AGCTT TTACC GCTCA TTTCT TACAC TCCGA TCGCG ATAGC TGTCT TTTTC ATTTT TTGCG.

【０１０１】以下は、断片Ｂを構築するために組立てら
れるオリゴヌクレオチド配列である： オリゴヌクレオチドＢ１は AGCTT CAAAG CTGGC GTATG CCCGC CGAAA AAATC CGCG. オリゴヌクレオチドＢ2 は CAGTG TCTGC GGTAC AAAAA ACCGG AATGC CAG. オリゴヌクレオチドＢ３は TCCGA CTGGC AGTGC CCGGG TAAAA AACGT TGTTG C. オリゴヌクレオチドＢ４は CCGGA CACCT GCGGC ATCAA ATGCC TG. オリゴヌクレオチドＢ５は GATCC AGGCA TTTGA TGCCG CAGGT GTCCG GGCAA CAACG TT
TTT TACCC GGGCA. オリゴヌクレオチドＢ６は CTGCC AGTCG GACTG GCATT CCGGT TTTTT CTACC G. オリゴヌクレオチドＢ７は CAGAC ACTGC GCGGA TTTTT TCGGC GGGCA TACGC CAGCT TT
GA.

【０１０２】以下は断片Ｃを構築するために用いられる
オリゴヌクレオチド配列である： オリゴヌクレオチドＣ１は GATCC GGTTG ATACC CCGAA CCCG. オリゴヌクレオチドＣ２は ACTCG TCGAA AA. オリゴヌクレオチドＣ３は CCGGG TAAAT GCCCG GTAAC CTATG GC. オリゴヌクレオチドＣ４は CAGTG TCTGA TGCTG AACCC GCCGA AC. オリゴヌクレオチドＣ５は TTCTG CGAAA TGGAC GGCCA GTGTA AACGA GAT. オリゴヌクレオチドＣ６は CTAGA TCTCG TTTAC ACTGG CCGTC CATTT CGCAG AAGTT. オリゴヌクレオチドＣ７は CGGCG GGTTC AGCAT CAGAC ACTGG CCATA GGTTA CCGGG C
A. オリゴヌクレオチドＣ８は TTTAC CCGGT TTTCG ACGAG TCGGG TT. オリゴヌクレオチドＣ９は CGGGG TATCA ACCG.

【０１０３】以下のグループのオリゴヌクレオチド配列
が組立てられて断片Ｄが作られる： オリゴヌクレオチドＤ１は GATCT GAAAT GCTGT ATGGG TATGT GCGGC. オリゴヌクレオチドＤ２は AAATC TTGTG TTTCC CCGGT AAAAG CATAA G. オリゴヌクレオチドＤ３は TCGAC TTATG CTTTT ACCGG GGAAA CACAA GATTT GCCGC A. オリゴヌクレオチドＤ４は CATAC CCATA CAGCA TTTCA.

【０１０４】以下のグループのオリゴヌクレオチドを混
合し、標準条件下でアニーリングを行ない、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて標準条件下で互い同志及び適切な制限
酵素エンドヌクレアーゼで切ったクローニング及びケー
シングベクターＭ１３ｍｐ１８及び１９につなげる。出
来上ったものを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５を形質転換
するのに用い、目的のＤＮＡを含むクローンをＩＰＴＧ
−Ｘｇａｌプレート中での白いプラークから選択し、ア
ニーリングの段階に用いられたグループから選ばれた³²
Ｐでラベルしたオリゴヌクレオチドとハイブリドを作る
ことにより、さらにスクリーニングを行なう。挿入構造
は、クローン化されたＤＮＡのダイデオキシ塩基配列決
定法で確かめた。

【０１０５】グループＡａは、Ｐｓｔ１とＨｉｎｄＩＩ
Ｉで切ったＭ１３ｍｐ１８と１９につなげられるオリゴ
ヌクレオチドＡａ１−Ａａ１０を含む。グループＡｂ
は、オリゴヌクレオチドＡｂ１−Ａｂ９を含み、それら
は、Ｐｓｔ１とＨｉｎｄＩＩＩで切ったＭ１３ｍｐ１８
と１９につなげられる。オリゴヌクレオチドＢ１からＢ
７を含むグループＢは、ＨｉｎｄＩＩＩはＢａｍＨＩで
切ったＭ１３ｍｐ１８及び１９につなげられる。オリゴ
ヌクレオチドＣ１からＣ９迄を含んでいるグループＣ
は、ＢａｍＨＩとＸｂａＩで切ったＭ１３ｍｐ１８と１
９につなげられる。グループＤは、オリゴヌクレオチド
Ｄ１からＤ４を含むが、ＢａｍＨＩとＳａｌＩで切った
Ｍ１３ｍｐ１８と１９につなげられる。

【０１０６】Ｍ１３複製型のＤＮＡを、標準的手法によ
って目的とする挿入ＤＮＡを持っているクローンから回
収する。グループＡａに相当する挿入ＤＮＡを適切な制
限酵素エンドヌクレアーゼで、Ｍ１３ＤＮＡから切り取
る。ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製す
る。その構造は以下の通りである：

【０１０７】

【化２６】

【０１０８】グループＡｂに相当する挿入ＤＮＡを、制
限酵素エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩ
でＤＮＡを切断することにより切り、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動で精製する。その構造は、以下の如くで
ある：

【化２７】

【０１０９】グループＢに相当する挿入ＤＮＡを制限酵
素、エンドヌクレアーゼ、ＨｉｎＤＩＩＩとＢａｍＨＩ
でＤＮＡを切断することにより切断することによって切
り取り、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製する。
その構造は、以下の通りである：

【化２８】

【０１１０】グループＣに相当する挿入ＤＮＡをＢａｍ
ＨＩとＢｇｌＩＩでＤＮＡを切断することにより切り取
り、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製する。その
構造は、以下の如くである：

【化２９】

【０１１１】グループＤに相当する挿入ＤＮＡを制限酵
素ＳａｕＩＩＩＡとＳａｌＩでＤＮＡを切断することに
り切り取り、アクリルアミドゲル電気泳動で精製する。
その構造は以下の通りである：

【化３０】

【０１１２】Ｂ． 遺伝子の構造 外部への輸送のための組み立てには、グループＡａ、
Ｂ、Ｃ及びＤを標準条件下で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用
いて、ＥｃｏＲＩとＳａｌＩで切ったＭ１３ｍｐ１８と
１９につなげる。目的の遺伝子を含むクローンはＸｇａ
ｌプレート上の、それらの色で選択され、そしてさらに
³²Ｐでラベルされたオリゴヌクレオチドとハイブリドを
形成することによってスクリーニングする。選択された
構造のクローンは、ユニバーサルプライマーを用いてＤ
ＮＡの挿入区域をダイデオキシ塩基配列決定法に確認す
る。

【０１１３】細胞質での発現のための組み立てにおいて
は、グループＡｂ、Ｂ、Ｃ、及びＤからの挿入配列を合
せて、標準条件下でＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて、Ｅｃ
ｏＲＩとＳａｌＩで切ったＭ１３ｍｐ１８と１９につな
げる目的の遺伝子を含むクローンをＸｇａｌプレート上
のそれらの色で選び、更に、³²Ｐでラベルした挿入配列
とハイブリドを形成されることによってスクリーニング
を行なう。選ばれたクローンの構造をユニバーサルプラ
イマーを使ってＤＮＡの挿入区域をダイデオキシ塩基配
列決定法で検べることによって確める。

【０１１４】例 ２ 上に述べたアミノ酸配列、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃ
ｏｌｉの高度に発現された遺伝子におけるコドンの使用
と便利な制限酵素エンドヌクレアーゼの切断位置の規定
にもとづいて、以下のＤＮＡ配列が提案された：

【０１１５】

【化３１】

【０１１６】Ｅ．Ｃｏｌｉのペリプラズムへの輸送のた
めの適切な形でタンパクの発現を調節するために、以下
の調節要素が提案される。即ち、高いレベルでの転写の
開始のためのプラスミドｐＫＫ２２３−３上の１つのｔ
ａｃプロモーター、転写の制御のためのプラスミッドｐ
ＫＫ２２３−３上のｌａｃオペレーター、Ｅ．Ｃｏｌｉ
の染色体上にコードされるべきｌａｃリプレッサー（ｌ
ａｃＩ⁹ ）、高レベルで翻訳を開始するＯｍｐＡシャイ
ン−ダルガーノ配列、生産物をペリプラズムに運び出す
ことを助長するＯｍｐＡリーダー、これらのオペレータ
ーエレメントによってコードされるタンパク配列の間の
Ａｌａ−Ｓｅｒ接合のＡｌａ、そして、最初の生産物
の、成熟した白血球エラスターゼインヒビターを生じる
べき開裂を指示する上述の遺伝子によってコードされる
タンパク配列である。

【０１１７】ＯｍｐＡエレメントは、以下のＤＮＡ配列
に組み込まれる。

【化３２】

【０１１８】生成タンパクが、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞質に留
まる形でのタンパクの発現を調節するために、以下のオ
ペレーショナルエレメントが提供される。即ち、プラス
ミッドｐＫＫ２２３−３上のｔａｃプロモーター、プラ
スミッドｐＫＫ２２３−３のｌａｃオペレーターとＥ．
ｃｏｌｉ ｓｔｒａｉｎ ＪＭ１０７の染色体上のｌａ
ｃレプレッサー（ｌａｃＩ^q ）、コンセンサスシャイン
−ダルガーノ配列、及び高いレベルの翻訳を開始するた
め、翻訳カップラーとして用いられるべきＯｍｐＡリー
ダーペプチタイドの断片である。翻訳カップリング配列
は、ＯｍｐＡ遺伝子の翻訳開始領域、ＯｍｐＡリーダー
ペプチドの最初の８箇のアミノ酸、上に記述したコンセ
ンサスシャイン−ダルガーノ配列及び翻訳読み終り暗号
である。翻訳カップリング配列は、ｌａｃオペレーター
とセリンプロテアーゼインヒビターの翻訳開始位置の間
に、後者を重ねて挿入されるべきである。翻訳カップラ
ーの特徴は、以下のＤＮＡ配列に組み込まれている。

【０１１９】即ち、

【化３３】

【０１２０】Ｃ． 遺伝子フラグメントの構築 上述の配列を組み立てるため、以下のデオキシリボヌク
レオチドをＡＢＩ ＤＮＡシンセサイザー（Ｆｏｓｔｅ
ｒ Ｃｉｔｙ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使って合成し
た生成物を、ＡＢＩ インスツルメンタルマニュアルに
記述されているように、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動によって精製する。それらは、標準的手段によってＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼとＡＴＰを用いて５′をリ
ン酸化する。以下のオリゴヌクレオチド配列をフラグメ
ントＡａを組み立てるために用いる：

【０１２１】オリゴヌクレオチドＡａ１は AATTCGATATCTCGTTGGAGATATTCATGACGTATTTTGGATGATAACGA
GGCGCAAAA. オリゴヌクレオチドＡａ２は ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCG. オリゴヌクレオチドＡａ３は GATCCGATCGCGATAGCTGTCTTTTTCATTTTTTGC. オリゴヌクレオチドＡａ４は GCCTCGTTATCATCCAAAAATACGTCATGAATATCTCCAACGAGATATC
G. オリゴヌクレオチドＡａ５は GATCCGATCGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCCTC
TGGTAAA. オリゴヌクレオチドＡａ６は AGCTTTTACCAGAGGCCTGCGCTACGGTAGCGAAACCAGCCAGTGCCACT
GCGATCG.

【０１２２】以下の、オリゴヌクレオチド配列を組立
て、断片Ａｂをつくり上げる： オリゴヌクレオチドＡｂ１は AATTCGATATCTCGTTGGAGATATTCATGACGTATTTTGGATGATAACGA
GGCGCAAAA. オリゴヌクレオチドＡｂ２は ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCG. オリゴヌクレオチドＡｂ３は GATCCGATCGCGATAGCTGTCTTTTTCATTTTTTGC. オリゴヌクレオチドＡｂ４は GCCTCGTTATCATCGAAAATACGTCATGAATATCTCCAACGAGATATCG. オリゴヌクレオチドＡｂ５は CAAGGAGAAATAAATGAGCGGTAAA. オリゴヌクレオチドＡｂ６は AGCTTTTACCGCTCATTTATTTCTCCTTGAT.

【０１２３】以下は、断片Ｂを構築するために組み立て
られるヌクレオチド配列である： オリゴヌクレオチドＢ１は AGCTT CAAAG CTGGC GTATG CCCGC CGAAA AAATC CGCG. オリゴヌクレオチドＢ2 は CAGTG TCTGC GGTAC AAAAA ACCGG AATGC CAG. オリゴヌクレオチドＢ３は TCCGA CTGGC AGTGC CCGGG TAAAA AACGT TGTTG C. オリゴヌクレオチドＢ４は CCGGA CACCT GCGGC ATCAA ATGCC TG. オリゴヌクレオチドＢ５は GATCC AGGCA TTTGA TGCCG CAGGT GTCCG GGCAA CAACG TT
TTT TACCC GGGCA. オリゴヌクレオチドＢ６は CTGCC AGTCG GACTG GCATT CCGGT TTTTT CTACC G. オリゴヌクレオチドＢ７は CAGAC ACTGC GCGGA TTTTT TCGGC GGGCA TACGC CAGCT TT
GA.

【０１２４】以下は断片Ｃを組み立てるために使用され
るヌクレオチド配列である： オリゴヌクレオチドＣ１は GATCC GGTTG ATACC CCGAA CCCG. オリゴヌクレオチドＣ２は ACTCG TCGAA AA. オリゴヌクレオチドＣ３は CCGGG TAAAT GCCCG GTAAC CTATG GC. オリゴヌクレオチドＣ４は CAGTG TCTGA TGCTG AACCC GCCGA AC. オリゴヌクレオチドＣ５は TTCTG CGAAA TGGAC GGCCA GTGTA AACGA GAT. オリゴヌクレオチドＣ６は CTAGA TCTCG TTTAC ACTGG CCGTC CATTT CGCAG AAGTT. オリゴヌクレオチドＣ７は CGGCG GGTTC AGCAT CAGAC ACTGG CCATA GGTTA CCGGG C
A. オリゴヌクレオチドＣ８は TTTAC CCGGT TTTCG ACGAG TCGGG TT. オリゴヌクレオチドＣ９は CGGGG TATCA ACCG.

【０１２５】以下のグループのオリゴヌクレオチドが断
片Ｄを形成するために組立てられる： オリゴヌクレオチドＤ１は GATCT GAAAT GCTGT ATGGG TATGT GCGGC. オリゴヌクレオチドＤ２は AAATC TTGTG TTTCC CCGGT AAAAG CATAA G. オリゴヌクレオチドＤ３は TCGAC TTATG CTTTT ACCGG GGAAA CACAA GATTT GCCGC A. オリゴヌクレオチドＤ４は CATAC CCATA CAGCA TTTCA.

【０１２６】以下のグループのオリゴヌクレオチドを混
合し、標準条件下でアニーリングを行ない、互い同志
で、又、適当な制限酵素エンドヌクレアーゼで切ったク
ローニング及び配列形成ベクターＭ１３ｍｐ１８と１９
に、標準条件下でＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてつなげ
る。この生成物は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５を形質転
換するのに用い、目的のＤＮＡを含むクローンをアニー
リングの段階で用いられたグループから選ばれた³²Ｐで
ラベルされたオリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成
することによって選ぶ。挿入構造は、ユニバーサルプラ
イマーを用いて、クローン化したＤＮＡのダイオキシ塩
基配列決定法により確める。

【０１２７】オリゴヌクレオチドＡａ１−Ａａ４を、Ｅ
ｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切ったＭ１３ｍｐ１８及びＭ１
３ｍｐ１９につなげる。目的の挿入ＤＮＡを持つＭ１３
複製型ＤＮＡを標準的手法によって回収する。挿入ＤＮ
Ａは、Ｍ１３ＤＮＡを制限酵素エンドヌクレアーゼＥｃ
ｏＲＩとＰｖｕ１で切断することによりＭ１３ＤＮＡか
ら切り出し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製す
る。その構造は以下の通りである。

【０１２８】

【化３４】

【０１２９】オリゴヌクレオチドＡａ５とＡａ６は、Ｂ
ａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで切ったＭ１３ｍｐ１８とＭ
１３ｍｐ１９につなげる。目的とする挿入ＤＮＡをもっ
たＭ１３複製型ＤＮＡは、標準的手法によって回収され
る。挿入ＤＮＡを制限酵素Ｐｖｕ１とＨｉｎｄＩＩＩで
ＤＮＡを切断することによりＭ１３ＤＮＡから切り出
し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製する。その
構造は以下の如くである。

【０１３０】

【化３５】

【０１３１】このＰｖｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をオリ
ゴヌクレオチドＡａ１−Ａａ４から調製した断片と結合
させ、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切ったＭ１３ｍｐ
１８またはＭ１３ｍｐ１９とつなぐ。目的の挿入ＤＮＡ
を持つＭ１３複製型ＤＮＡを標準的手法で回収する。挿
入ＤＮＡを、これはＤＮＡ断片Ａａであるが、制限酵素
ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩでＭ１３ＤＮＡを切断する
ことによりＭ１３ＤＮＡから切り出し、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で精製する。その構造は以下の如くで
ある。

【０１３２】

【化３６】

【０１３３】オリゴヌクレオチドＡｂ１−Ａｂ４をＥｃ
ｏＲＩとＢａｍＨＩで切ったＭ１３ｍｐ１８とＭ１３ｍ
ｐ１９につなぐ。目的の挿入ＤＮＡを持ったＭ１３複製
型ＤＮＡを標準的手法で回収する。挿入ＤＮＡを制限酵
素ＥｃｏＲＩとＰｖｕＩでＭ１３ＤＮＡから切り取りポ
リアクリルアミドゲル電気泳動で精製する。その構造は
以下の如くである。

【０１３４】

【化３７】

【０１３５】このＥｃｏＲＩ−ＰｖｕＩ断片をオリゴヌ
クレオチドＡｂ５−Ａｂ６と合し、ＥｃｏＲＩとＨｉｎ
ｄＩＩＩで切ったＭ１３ｍｐ１８またはＭ１３ｍｐ１９
とつなぐ。目的の挿入ＤＮＡを持ったＭ１３複製型ＤＮ
Ａを、標準的手法により回収する。断片Ａｂである挿入
ＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩでＤＮ
Ａを切断することによってＭ１３ＤＮＡから切り出す。
そして、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製する。
その構造は以下のとおりである：

【０１３６】

【化３８】

【０１３７】オリゴヌクレオチドＢ１からＢ７までを含
むグループＢをＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで切ったＭ
１３ｍｐ１８と１９につなぐ。グループＢに相当する挿
入ＤＮＡを制限酵素、エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩ
ＩとＢａｍＨＩでＤＮＡを切断することにより切出し、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製する。そ
の構造は以下の通りである。

【０１３８】

【化３９】

【０１３９】オリゴヌクレオチドＣ１からＣ９を含むグ
ループＣをＢａｍＨＩとＸｂａＩで切ったＭ１３ｍｐ１
８と１９につなぐ。グループＣに相当する挿入ＤＮＡを
制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩでＤＮ
Ａを切断することにより切り出し、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動で精製する。その構造は以下の如くであ
る：

【０１４０】

【化４０】

【０１４１】オリゴヌクレオチドＤ１からＤ４までを含
むグループＤをＢａｍＨＩとＳａｌＩで切ったＭ１３ｍ
ｐ１８と１９につなぐ。グループＤに相当する挿入ＤＮ
Ａを、制限酵素、エンドヌクレアーゼＳａｌＩでＤＮＡ
を切断することにより切り出し、アクリルアミドゲル電
気泳動で精製する。その構造は以下の如くである：

【０１４２】

【化４１】

【０１４３】Ｄ． 遺伝子の構築 外部への輸送のための組み立てにおいては、グループＡ
ａ、Ｂ、Ｃ及びＤからの挿入配列を合し、ＥｃｏＲＩと
ＳａｌＩで切ったＭ１３ｍｐ１８と１９にＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて、標準条件下でつなぐ。細胞質中での発
現のための組み立てにおいては、Ａｂ、Ｂ、Ｃ及びＤか
らの挿入配列を合し、ＥｃｏＲＩとＳａｌＩで切ったＭ
１３ｍｐ１８及び１９とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて、
標準状態でつなぐ。目的の遺伝子を含むクローンを、そ
れらのＸｇａｌプレート上での色で選び、さらに³²Ｐに
ラベルしたオリゴヌクレオチドとハイブリドを作ること
によりスクリーニングを行なう。選んだクローンの構造
を、ユニバーサルプライマーを用いてＤＮＡの挿入領域
のダイデオキシ塩基配列決定法を行なうことにより確か
める。

【０１４４】例 ３ 発現ベクターの組み立て 外部への輸出用と細胞質内発現用の組み立てに対する挿
入配列を、次の如く発現プラスミドに移す。所用の挿入
ＤＮＡをもったＭ１３増殖型ＤＮＡを、上述の如く標準
型手法で回収する。適切な挿入ＤＮＡを制限酵素、エン
ドヌクレアーゼ、ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで切って取り出
し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製する。次
に、それを制限酵素、エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩと
ＰｓｔＩで切ったｐＫＫ２２３−３につなぎ、その結果
生じたプラスミドをＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０７にクローニ
ングする。外部輸送用の例４と５における使用のための
構造は、ＰＳＧＥ６であり、原形質発現用の例７におけ
る使用のための構造は、ｐＳＧＥ８である。例４，５に
おける外部への輸送に対するＥ．ｃｏｌｉの株はＳＧＥ
１０であり、例６における細胞質発現に対する株は、Ｓ
ＧＥ３０である。

【０１４５】Ａ． ｐＳＧＥ６の編成 プラスミドｐＳＧＥ６をｐＫＫ２２３−３のＥｃｏＲＩ
とＰｓｔＩの位置の間のＤＮＡを、ＯｍｐＡＳＬＰＩを
コードするＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ断片で置
きかえることによって組立てた。ＯｍｐＡ−ＳＬＰＩの
ＤＮＡ配列は次の如くである：

【０１４６】

【化４２】

【０１４７】これから後、“ｏｍｐＡ−ＳＬＰＩ”と呼
ぶ配列は、上に述べた外部への輸送のためのＭ１３ｍｐ
１８の最終構造からのＤＮＡである。プラスミドｐＳＧ
Ｅ６は、図１に描かれている。図１において、ｏｍｐＡ
ｓｓ−ＳＬＰＩに対する最初のコドンは、“ｏｍｐＡ−
ＳＬＰＩ”と呼ばれるＤＮＡ配列の６２−６４の位置に
ある。成熟したＳＬＰＩに対する最初のコドンは、１２
５−１２７に位置している。

【０１４８】Ｐｔａｃは、ｔａｃプロモーター、ｌａｃ
オペレーター及びベーターガラクトーゼＳｈｉｎｅ／Ｄ
ａｌｇａｒｎｏ配列のためのＤＮＡを含んでいる。略
号、ＲＩ，Ｐｓｔ及びＢａｍは、制限酵素、ＥｃｏＲ
Ｉ、ＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩに対する認識配列である。
Ｔｅｔ^r は、テトラサイクリンに耐性を附与するｐＢＲ
３２２の遺伝子の一部であり、ａｍｐ^r は、アンピシリ
ンに耐性を附与し位置６４１６から６８４０までのｒｒ
ｎＢオペロンからのＤＮＡを、Ｔｅｔ^r は含んでいる。
矢印は転写の方向を示している。

【０１４９】Ｂ． ｐＣＪ−ｏｍｐＡ−ＳＬＰＩの編成 プラスミドｐＣＪ−ｏｍｐＡ−ＳＬＰＩは、部分的でな
く完全なテトラサイクリン遺伝子およびプロモーターを
含んでいることを除いては、ｐＳＧＥ６と同じである。
このプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉに挿入すると、テトラ
サイクリン耐性を附与し、ｏｍｐ ＡＳＬＰＩをコード
するＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ断片が、ベクタ
ーｐＫＫ２３３−３ではなく、ベクターｐＣＪ１にクロ
ーニングされるということを除いて、ｐＳＧＥ６に対す
るのと類似のやり方で組立てられる。ベクターｐＣＪ１
は以下の如く構築される。プラスミドｐＫＫ２２３−３
をＳｐｈＩで完全に、ＢａｍＨＩで部分的に酵素分解し
た。

【０１５０】４．４Ｋｂｐ断片をゲルで精製し、合成ア
ダプター GATCTAGAATTGTCATGTTTGACAGCTTATCAT ATCTTAACAGTACAAACTGTCGAATAGTAGC 及び、ｐＢＲ３２２（ＰＬ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ，２７−４８９１−０１）のｔｅｔ^r 遺伝子のＣｌａ
Ｉ ＳｐｈＩによる消化物からのＤＮＡの５３９ｂｐの
断片と組み合せた。

【０１５１】Ｃ． ｐＳＧＥ８の構造 Ｅｃｏ ＲＩとＰｓｔ部位の間のＤＮＡが、上に述べたよ
うに、細胞質における発現のための最終的なＭ１３ｍｐ
１８構造物に由来するｏｍｐＡ−ｔｃ−ｍｅｔ−ＳＬＰ
Ｉと呼ばれる配列を含んでいることを例外として、プラ
スミドｐＳＧＥ８は、ｐＳＧＥ６と同一遺伝子組成であ
る。この配列は、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞質の中にメチオニ
ル−ＳＬＰＩの合成を導く。ｐＳＧＥ８の部分的図式
は、図２の中に含まれている。“ｏｍｐＡ−ｔｃ−ｍｅ
ｔ−ＳＬＰＩ”と呼ばれるその配列において、ｏｍｐＡ
に対する開始コドンは、６２−６４の位置にあり、停止
コドンは９５−９７にある。そして、メチオニル−ＳＬ
ＰＩに対する開始コドンは、９８−１００にある。ｏｍ
ｐＡ−ｔｃ−ｍｅｔ−ＳＬＰＩのＤＮＡ配列は次の如く
である。

【０１５２】

【化４３】

【０１５３】Ｄ． ｐＣＪ−ｍｅｔ−ＳＬＰＩの編成 プラスミドｐＣＪ−ｍｅｔ−ＳＬＰＩは、それが（部分
的ではなく）完全なテトラサイクリン耐性遺伝子を含ん
でいることを除けば、ｐＳＧＥ８と同じである。プラス
ミドＣＪ−ｍｅｔ−ＳＬＰＩは、ｏｍｐＡ−ｔｃ−ｍｅ
ｔ−ＳＬＰＩをコードするＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ断片が
ベクターｐＫＫ２２３−３ではなく、ベクターｐＣＪ１
にクローニングされたことを除けば、ｐＳＧＥ８と同様
に組立てられた。

【０１５４】Ｅ． 酵母発現用プラスミドの組立て プラスミドｐＵＣ８をＨｉｎｄＩＩＩで酵素分解し、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩアダプターにつなげた（Ａｍｅ
ｒｓｈａｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ． ＤＡ１００６から得
た）。このアダプターをＨｉｎｄＩＩＩサイトに加えて
も、ＨｉｎｄＩＩＩサイトを再組み立てしない。ＤＮＡ
を次にＳｍａＩで酵素分解し、希薄溶液中でつなぎ、続
いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ８３の形質転換を行なった。
正しいプラスミド、即ちＨｉｎｄＩＩＩの位置からＳｍ
ａＩの間のポリリンカーにおいて制限酵素による切断の
位置を欠いているプラスミッドが、トランスフォーマン
トから単離したプラスミッドＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ、Ｓ
ｍａＩもしくはＨｉｎｄＩＩＩで消化することによって
同定された。ＨｉｎｄＩＩＩ部位を欠いていたが、Ｅｃ
ｏＲＩ部位とＳｍａＩ部位を含んでいたプラスミドを含
んでいるトランスフォーマントがこの方法で同定され
た。このプラスミドがｐＧＳ１８５である。

【０１５５】酵母のＭＦ１遺伝子を含有しているＥｃｏ
ＲＩ断片を、この中に参照文献として加えてある、Ｊ．
Ｋｕｒｊａｎ ＆ Ｉ．Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ ｉｎ
Ｃｅｌｌ ３０：９３３（１９８２）によって記述され
たように、プラスミドｐＣＹ１７からゲル電気泳動で精
製され、ＥｃｏＲＩによって切ったｐＧＳ１８５につな
げた。プラスミドのＤＮＡをトランスフォーマントから
単離した、正しい挿入ＤＮＡの存在は、ＥｃｏＲＩでＤ
ＮＡを消化することによって確かめられた。これが、プ
ラスミドｐＧＳ２８５であり、図３に描かれている。

【０１５６】Ｋｕｒｊａｎ ＆ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔ
ｚ、（同前）によって認められたように、ＭＦ１遺伝子
中の内部の４個のＨｉｎｄＩＩＩ部位の中の３箇を除去
するために、プラスミドｐＧＳ２８５をＨｉｎｄＩＩＩ
で完全に消化し、そして再びつなげた。正しい構成は、
上に述べたように選ばれた。これが、プラスミドｐＧＳ
３８５である。例２において記述したように、合成ＳＬ
ＰＩ遺伝子の４から１０７迄のアミノ酸をコードするヌ
クレオチド配列になっているＭ１３ＡａＢＣＤを、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩで消化した。このＤＮＡを以下のオリゴヌク
レオチドアダプターにつなげた。

【０１５７】

【化４４】 このアダプターは、２つのオリゴヌクレオチドのアニー
リングによって形成し、 5′GCT GAA GCT TCA GGT AAG
及び 5′AGC TCT TAC CTG AAG CTT CAGC 先づ２分間７
０℃に保ち、続いて、一夜かかって徐々に冷す。

【０１５８】このアダプターをＨｉｎｄＩＩＩで切った
Ｍ１３ＡａＢＣＤにつなげた後、結合混合物は、Ｈｉｎ
ｄＩＩＩとＳａｌＩで消化して、アガロースゲル電気泳
動とエレエクトロリューションによって精製した１つの
断片を与えた。この断片を、もう一度ＨｉｎｄＩＩＩで
消化し、それからＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩで切ってお
いたｐＧＳ２８５につないだ。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０
１を結合混合物で形質転換し、アンピシリン耐性トラン
スフォーマントを選んだ。正しい挿入ＤＮＡを持ったプ
ラスミドを含むトランスフォーマントを、プラスミドＤ
ＮＡを調整し、それをＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩで消化
することにより同定した。この方法で組み立て、単離し
たプラスミドをｐＧＳ４８５と命名した。

【０１５９】これは図４に描かれている。このプラスミ
ドは、構成成分としてＭＦ１遺伝子の最初のスペーサー
領域におけるＨｉｎｄＩＩＩ切断部位において合成ＳＬ
ＰＩ遺伝子に融合したＭＦ１遺伝子を含んでいる。この
ような構造体は、酵母に入れた場合、特別に参照として
ここに加えた。Ａ．Ｊ．ＢａｋｅらＰＮＡＳ（ＵＳＡ）
８１：４６４２によって示されたように、異種タンパク
の合成、プロセシング、分泌を導くことが示された。Ｍ
Ｆ１遺伝子とＳＬＰＩの融合が、ｐＧＳ４８５中のＥｃ
ｏＲＩ断片に含まれている。このＥｃｏＲＩ断片を実施
例８に記したように、ベクターＹＩｐ５の中へクローニ
ングした。

【０１６０】例 ４ プラスミドｐＳＧＥ６を用いての分泌白血球プロテアー
ゼインヒビター（ＳＬＰＩ）の発現と精製。プラスミド
ｐＳＧＥ６（ＳＧＥ１０細胞）を含んでいるＥ．ｃｏｌ
ｉ細胞を、２％トリプトン、０．５％酵母エキス、２０
ｇ／ｌグルコース、２００ｍｇ／ｌビタミンＢ₁ 及び１
００ｍｇ／ｌアンピシリンを加えた１０リットルのＭ９
培地中で、６時間培養した。ＩＰＴＧを０．２ｍＭ加
え、更に６時間培養を続けた。Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＧＥ１
０の細胞１０リットルを１８，０００ｘｇで遠心してペ
レットにして８ｇ／ｌを得て、５０ｍＭトリス−塩酸
（ｐＨ７．５）４ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液（今後Ｔ５０Ｅ
４と略称する）に再び懸濁してからペレットにした。

【０１６１】このペレットを２．７リットルのＴ５０Ｅ
４に再び懸濁し、１５０ｍｌのロットずつ凍結した。こ
れらのロット８箇（細胞３６ｇに相当する）をまとめて
１２，０００ｐｓｉ、４℃でフレンチプレスを１回通し
てペレットをくずした。くずしたものを、２０，０００
ｘｇで１．５時間遠心分離した。細胞からなる不溶物
（６ｇの細胞に等しい）を含むペレット１／６を１２５
ｍｌのＴ５０Ｅ４で２度洗い、残った物質を一夜凍結し
た。

【０１６２】凍結ペレットを、２０ｍＭのＤＴＴ（Ｓｉ
ｇｍａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｄ−０６３２から入手）、４ｍ
ＭのＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ−７６２
６）及び８Ｍ尿素（超高純度、ＢＲＬ、Ｃａｔ．Ｎｏ．
５５０５ＵＡ）を含む２５ｍｌの１００ｍＭトリス−塩
酸（ｐＨ８．０）と４ｍＭのＥＤＴＡ（今後、Ｔ１００
Ｅ４と略称する）で、３７℃、１時間抽出し、１０，０
００ｘｇで１０分遠心した。得られた上澄みを、あらか
じめ２０ｍＭのＤＴＴと８Ｍ尿素を含む抽出緩衝液Ｔ１
００Ｅ４で平衡処理（Ｐｒｅ−ｅｑｕｉｂｒａｔｅｄ）
しておいた１０ｍｌの上澄みを除いたセファデックスｓ
ｐ−ｃ２５（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手）と混ぜ、ロ
ーラーの上で３７℃で１０分混合し、ＳＬＰＩをＳＰ−
セファデックスに吸収させる。

【０１６３】吸収させたＳＬＰＩを含んだ樹脂を１０分
間３，０００ｘｇで遠心してペレットとし、上澄みをデ
カントした。残ったセファデックスを２０ｍＭのＤＴＴ
と８Ｍ尿素を含む２５ｍｌのＴ１００Ｅ４で２回洗って
から２０ｍＭのＤＴＴを含む、２５ｍｌのＴ１００Ｅ４
で２回洗った。次にセファデックスを１回、２０ｍＭの
ＤＴＴと０．３Ｍの食塩を含む２５ｍｌのＴ１００Ｅ４
で抽出した。この抽出物は、約０．１５ｍｇ／ｍｌのタ
ンパクと、０．０４ｍｇ／ｍｌ以上のＳＬＰＩを含んで
いた。この方法で得たＳＬＰＩは、高圧液体クロマトグ
ラフィーにより７０％以上の純度であることが確定され
た。

【０１６４】例 ５ 例４の方法を用い、２番目の凍結ペレットを最初のＴ１
００Ｅ４／ＤＴＴ／ＰＭＳＦ／尿素の代りに、１％Ｔｒ
ｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｔ
−６８７８から入手）を含むＴ１００Ｅ４で抽出した。
得られたＳＬＰＩは、例４で得られたものより僅かに純
度が高く、例６において述べるリフォルディング・アッ
セイにおいて、より高い活性があった。

【０１６５】例 ６ 精製ＳＬＰＩのリフォルディング 例４または５からの約４０μｇの部分的に精製したＳＬ
ＰＩを尿素中８Ｍ、もしくはグアニジン塩酸塩中５Ｍ
（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，＃２４１
１０）、そしてＤＴＴ中４ｍＭとして、室温で１時間温
置した。酸化型グルタチオン（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｎ
ｏ．Ｇ−４６２６）を１３．５ｍＭになる迄加え、混合
物を再び室温で１時間温置した。混合物をｐＨ１０．７
の５０ｍＭトリス溶液で１０倍稀釈し、更に室温で４時
間温置した。

【０１６６】それから、混合物をｐＨ８．０の５０ｍＭ
トリスと０．１５Ｍ食塩で５倍に稀釈し、ｐＨ８．０の
５０ｍＭトリスと、０．２５Ｍ塩化ナトリウムで前もっ
て平衡させた、セファデックスＳＰ−Ｃ２５の１×２ｃ
ｍカラムにかけた。樹脂を０．２５Ｍの塩化ナトリウム
を含むｐＨ８．０の５０ｍＭトリスで洗い、それから
０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む、ｐＨ８．０の５０ｍ
Ｍトリスで洗った。０．５Ｍの塩の洗滌で溶出する区分
は、十分に活性であり、カラムにかけたＳＬＰＩの約３
０％を呈している。

【０１６７】例 ７ ＳＧＥ３０細胞融解物の可溶区分不溶区分からのＳＬＰ
Ｉの精製。Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＧＥ３０細胞中のプラスミ
ドｐＳＧＥ８の発現により、細胞融解物の可溶及び不溶
の両区分において、ＳＬＰＩを生産した。ＳＬＰＩは全
細胞タンパクの１％を占め、可溶区に約８０％、不溶区
に約２０％分布していた。

【０１６８】Ａ．不溶区からのＳＬＰＩの精製 ｐＳＧＥ８を含むＥ．ｃｏｌｉ ＳＧＥ３０細胞を、振
盪フラスコで５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培
地でＯＤ６００が０．７になる迄培養し、ＩＰＴＧを
０．２ｍＭ迄加えて誘導した。３時間後に、細胞をペレ
ットとし、その２倍の重量の５０ｍＭトリス−塩酸（ｐ
Ｈ７．５）と４ｍＭのＥＤＴＡ（今後は、Ｔ５０Ｅ４と
称する）に懸濁した。細胞を４℃で超音波をかけて破壊
し、抽出物を１２，０００ｘｇで、４０℃で２０分間遠
心分離した。

【０１６９】ペレットを３倍容量のＴ５０Ｅ４で洗い、
１０Ｍ尿素か６Ｍグアニジン塩酸塩のいずれか、及び５
ｍＭの還元型ＤＴＴを含む溶液で、室温で溶解させた。
室温で１時間温置した後に、酸化型グルタチオンを１
７．５ｍＭの濃度で加え、混合物をもう１時間温置し
た。それから混合物をｐＨ１０．７の１０倍容積量の５
０ｍＭトリス−塩酸で希釈した。希釈混合物を室温で４
時間放置後、５Ｎ塩酸を加えてｐＨを８に調節した。こ
の混合物を遠心分離して、沈殿したタンパクを除いた。
このようにしてできた上澄みは、分泌性白血球プロテア
ーゼインヒビター活性を示すＳＬＰＩを含んでいた。こ
のタンパクを上に述べたようなセファデックスＳＰ−Ｃ
２５カラム上のクロマトグラフィーで精製した。

【０１７０】Ｂ．可溶区分からのＳＬＰＩの精製 プラスミドｐＳＧＥ８を含むＥ．ｃｏｌｉ ＳＧＥ３０
細胞を振盪フラスコ中でＯＤ６００が０．７になる迄培
養し、ＩＰＴＧを０．２ｍＭ迄加えて誘導した。ＯＤ６
００が１．１で、細胞を２５，０００ｘｇで１５分間遠
心分離してペレットとした。ペレットをＴ５０Ｅ４に再
び懸濁し、４℃で２０，０００ｐｓｉでフレンチプレス
によってくずした。くずしたものを２５，０００ｘｇで
１５分間遠心分離した。

【０１７１】上澄みをＤＴＴ中で２５ｍＭとし、この混
合物を０℃で１時間温置し最終濃度が５％になる迄十分
量の塩酸を加えた。０℃で３０分間温置した後、混合物
を２５，０００ｘｇで１５分遠心分離し、上澄みを除き
次の工程にかけた。１０Ｍの水酸化ナトリウムで上澄み
のｐＨを８．０に調整し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー及びエ
ライサ（ＥＬＩＳＡ）法によって精製及び分析を行な
い、その結果、全タンパク１３０ＵＧあたり少くとも
０．７ＵＧのＳＬＰＩが示された。それについて、例６
に従ってリフォルディングを行なった。

【０１７２】例 ８ 癒合ＳＬＰＩ−ＭＦ１遺伝子（例３Ｅ参照）を含むＥｃ
ｏＲＩ断片を酵母ベクターＹＩｐ５のＥｃｏＲＩ部位
に、この出願中に参照文献として特別に加えてあるＢｏ
ｔｓｔｅｉｎとＲ．Ｗ．ＤａｖｉｓによるＴｈｅ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａ
ｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｐ．
６０７−６３６（１９８２）に記述されているようにし
てつなぎ、ＹＩｐＳＬＰＩ−１を生成させ、本出願に特
別に参照文献として加えてある、Ｔ．Ｏｒｒ−Ｗｅａｖ
ｅｒらＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
１０１：２２８（１９８３）に記されてあるような位置
志向的組み換えによってＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＢＳ
２１４（ＭＡＴ，Ｕｒａ３−５２，ｐｅｐ ４ ｐｒｂ
ｌ）のＵＲＡ３遺伝子の中に組み込んだ。この株、Ｓ．
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＧＹ−１は完全に活性なＳＬ
ＰＩを培養上澄み中に分泌する。

【０１７３】２番目の株、ＳＧＹ−３も活性ＳＬＰＩを
生産し、分泌する。この株は複製性酵母プラスミッドｐ
ＧＳ５８５上にＭＦ１： ：ＳＬＰＩ癒合をもって
いる。このプラスミドは、本出願に特別に参照文献とし
て加えた、Ｊ．Ｒ．Ｂｒｏａｃｈ，Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：３０７（１９８３）
によって記述されたように、ｐＪＤＢ２０７から、また
本出願中に特別に参照文献として加えたＤ．Ｂｏｔｓｔ
ｅｉｎとＲ．Ｗ．Ｄａｖｉｓ，ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｐｐ．６０７−
６３６に記述されたように、プラスミッドＹ２４から単
離された酵母ＵＲＡ３遺伝子を添加することにより構築
され、そしてｐＪＤＢ２０７のＨｉｎｄＩＩＩの切断部
位にクローニングを行ない、ｐＧＳ５８５を構築した。

【０１７４】ＥｃｏＲＩ断片に含まれるＭＦ１：
：ＳＬＰＩ癒合遺伝子をＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩアダプ
ター（Ａｍｅｒｓｈａｍ．Ｃａｔ．Ｎｏ．ＤＡ１００７
から得た）を用いて、ｐＧＳ５８５のＳａｌＩ切断位置
にクローニングして、ＹＥｐＳＬＰＩ−１を生成した。
特別にこの出願に参照文献として加えたＪ．Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ １５３：１６３（１９８３）におい
て、Ｉｔｏらによって記述された、形質転換によってこ
のプラスミドをＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＤＢＹ７４
６（ＭＡＴ，Ｕｒａ３−５２，ｌｅｕ２−３，ｈｉｓ３
１，ｔｒｐ１−２８９）に導入した。

【０１７５】Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ菌株ＳＧＹ−１とＳＧＹ−３を、特別に本出
願中参照文献として取り入れた、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ
Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｐ．６２，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹ
ｏｒｋ（１９８１）に記述された、Ｆ．Ｓｈｅｒｍａｎ
らの方法に従って、Ｕｒａｃｉｌの欠けているＳＤ培地
で、３０℃で定常期迄培養した。細胞を遠心分離によっ
て培地から除き、培養上澄みを（１）プロテアーゼ阻害
活性と、（２）エライサ法によって、抗−ＳＬＰＩ抗体
と特異的に反応する物質の量を測定することによって、
ＳＬＰＩの活性について検定した。精製の体系は、本出
願において記述された、以前の方法に類似のやり方で展
開できる。

【０１７６】本発明の工程や生産物について、さまざま
な改変を行なったり変化を与えたりすることができるこ
とは、当業者にとっては明白である。したがって、本発
明は、附帯の請求範囲及びそれらの同等の範囲内にある
ならば、その修飾や改変を包含することを意図するもの
である。

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＳＧＥ６の模式図。

【図２】プラスミドｐＳＧＥ８の模式図。

【図３】プラスミドｐＧＳ２８５の模式図。

【図４】プラスミドｐＧＳ４８５の模式図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 13/00 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 9/99 9359−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 エイゼンバーグ，スチーブン ピー. アメリカ合衆国 80302 コロラド州，ボ ウルダー，パノラマ アベニユー 2325 (72)発明者 ステツトラー，ゲイリイ エル. アメリカ合衆国 80302 コロラド州，ボ ウルダー，パノラマ アベニユー 2325 (72)発明者 トムソン，ロバート シー. アメリカ合衆国 80303 コロラド州，ボ ウルダー，ドレクセル ストリート 1120

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 断片化されていない１本のポリペプチド
   鎖からなるセリンプロテアーゼインヒビターの微生物合
   成を指示し得る合成ＤＮＡ配列または単離された天然の
   ＤＮＡ配列であって、前記インヒビターはセリンプロテ
   アーゼインヒビター活性を有する少なくとも１つの活性
   部位を有し、かつ耳下腺分泌物から単離された天然のセ
   リンプロテアーゼインヒビターと少なくとも４０％の相
   同性を示し、前記天然のセリンプロテアーゼインヒビタ
   ーは次のアミノ酸配列を有する上記ＤＮＡ配列： 【化１】
2. 【請求項２】 配列が（１）下記の配列： 【化２】 または（２）遺伝子コードの縮重の結果として（１）に
   均等な配列である請求項１のＤＮＡ配列。
3. 【請求項３】 単離された天然のＤＮＡ配列である請求
   項１のＤＮＡ配列。
4. 【請求項４】 ｃＤＮＡである請求項３のＤＮＡ配列。
5. 【請求項５】 ゲノムＤＮＡである請求項３のＤＮＡ配
   列。
6. 【請求項６】 ポリペプチドがセリンプロテアーゼイン
   ヒビター活性を有する少なくとも１つの活性部位を有
   し、次のアミノ酸配列： 【化３】 （但し、Ｒ₁ およびＲ₇ は同一または異り、置換または
   非置換アミノ酸残基またはその誘導体からなる群から選
   択され、かつＲ₂ 、Ｒ₃ 、Ｒ₄ 、Ｒ₅ 、Ｒ₆ 、Ｒ ₈ およ
   びＲ₉ は同一または異り、メチオニン、バリン、アラニ
   ン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、リ
   ジン、グリシン、ロイシンおよびアルギニンからなる群
   から選択される）からなる請求項１のＤＮＡ配列。
7. 【請求項７】 セリンプロテアーゼインヒビターが次の
   アミノ酸配列： 【化４】 またはその断片からなり、前記断片がセリンプロテアー
   ゼインヒビター活性を有する少なくとも１つの活性部位
   を有する請求項６のＤＮＡ配列。
8. 【請求項８】 断片化されていない１本のポリペプチド
   鎖からなるセリンプロテアーゼインヒビターの微生物合
   成を指示し得る合成ＤＮＡ配列または単離された天然の
   ＤＮＡ配列において、前記インヒビターはセリンプロテ
   アーゼインヒビター活性を有する少なくとも１つの活性
   部位を有し、かつ耳下腺分泌物から単離された天然のセ
   リンプロテアーゼインヒビターと少なくとも４０％の相
   同性を示し、前記天然のセリンプロテアーゼインヒビタ
   ーは次のアミノ酸配列を有する上記ＤＮＡ配列からなる
   組換えベクター： 【化５】
9. 【請求項９】 配列が（１）次の配列： 【化６】 または（２）遺伝子コードの縮重の結果として（１）に
   均等な配列である請求項８の組換えベクター。
10. 【請求項１０】 ＤＮＡ配列が単離された天然のＤＮＡ
    配列である請求項８のベクター。
11. 【請求項１１】 ＤＮＡ配列がｃＤＮＡである請求項８
    のベクター。
12. 【請求項１２】 ＤＮＡ配列がゲノムＤＮＡである請求
    項８のベクター。
13. 【請求項１３】 ポリペプチドがセリンプロテアーゼイ
    ンヒビター活性を有する少なくとも１つの活性部位を有
    し、次のアミノ酸配列： 【化７】 （但し、Ｒ₁ およびＲ₇ は同一または異り、置換または
    非置換アミノ酸残基またはその誘導体からなる群から選
    択され、かつＲ₂ 、Ｒ₃ 、Ｒ₄ 、Ｒ₅ 、Ｒ₆ 、Ｒ ₈ およ
    びＲ₉ は同一または異り、メチオニン、バリン、アラニ
    ン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、リ
    ジン、グリシン、ロイシンおよびアルギニンからなる群
    から選択される）からなる請求項８のベクター。
14. 【請求項１４】 セリンプロテアーゼインヒビターが次
    のアミノ酸配列： 【化８】 またはその断片からなり、前記断片がセリンプロテアー
    ゼインヒビター活性を有する少なくとも１つの活性部位
    を有する請求項１３のベクター。
15. 【請求項１５】 断片化されていない１本のポリペプチ
    ド鎖からなるセリンプロテアーゼインヒビターの微生物
    合成を指示し得る合成ＤＮＡ配列または単離された天然
    のＤＮＡ配列からなる組換えベクターにおいて、前記イ
    ンヒビターはセリンプロテアーゼインヒビター活性を有
    する少なくとも１つの活性部位を有し、かつ耳下腺分泌
    物から単離された天然のセリンプロテアーゼインヒビタ
    ーと少なくとも４０％の相同性を示し、前記天然のセリ
    ンプロテアーゼインヒビターは次のアミノ酸配列を有す
    る上記ＤＮＡ配列からなる組換えベクターを含有する形
    質転換宿主細胞： 【化９】
16. 【請求項１６】 配列が（１）次の配列： 【化１０】 または（２）遺伝子コードの縮重の結果として（１）に
    均等な配列である請求項１５の細胞。
17. 【請求項１７】 ＤＮＡ配列が単離された天然のＤＮＡ
    配列である請求項１５の細胞。
18. 【請求項１８】 ＤＮＡ配列がｃＤＮＡである請求項１
    ７の細胞。
19. 【請求項１９】 ＤＮＡ配列がゲノムＤＮＡである請求
    項１７の細胞。
20. 【請求項２０】 ポリペプチドがセリンプロテアーゼイ
    ンヒビター活性を有する少なくとも１つの活性部位を有
    し、次のアミノ酸配列： 【化１１】 （但し、Ｒ₁ およびＲ₇ は同一または異り、置換または
    非置換アミノ酸残基またはその誘導体からなる群から選
    択され、かつＲ₂ 、Ｒ₃ 、Ｒ₄ 、Ｒ₅ 、Ｒ₆ 、Ｒ ₈ およ
    びＲ₉ は同一または異り、メチオニン、バリン、アラニ
    ン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、リ
    ジン、グリシン、ロイシンおよびアルギニンからなる群
    から選択される）からなる請求項１５の細胞。
21. 【請求項２１】 セリンプロテアーゼインヒビターが次
    のアミノ酸配列： 【化１２】 またはその断片からなり、前記断片がセリンプロテアー
    ゼインヒビター活性を有する少なくとも１つの活性部位
    を有する請求項２０の細胞。