JP2683500C - - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明はプロテアーゼインヒビターおよびその類縁体の合成方法およびこの方
法に有用なＤＮＡ塩基配列、組換えベクターおよび形質転換宿主細胞に関するも
のである。 本出願は１９８４年１２月６日に出願されたＵ．Ｓ．特許出願連続番号Ｎｏ．
６７８，８２２の一部継続出願である。 【０００２】 【従来の技術】 発明の背景 内生タンパク分解酵素は、侵入する生物体、抗原−抗体複合体と、生体に最早 必要乃至は有用でないある特定の組織タンパクを分解するのに役立つ。正常に機
能している生物体では、タンパク分解酵素は、限られた量だけ生産され、一部は
プロテアーゼのインヒビターの合成を通じて制御されている。 【０００３】 多数の天然に存在するプロテアーゼインヒビターは、その反応を場所的に及び
時間的に制御することによって、内生プロテアーゼを制御している。その上、プ
ロテアーゼインヒビターは、感染及び寄生生物によって身体の中に持ち込まれた
プロテアーゼを阻害することがある。特別にタンパクの加水分解の攻撃や感染を
受け易い組織、例えば、呼吸路の組織はプロテアーゼインヒビターに富んでいる
。 【０００４】 プロテアーゼインヒビターは、ヒト血漿タンパクの約１０％を構成している。
少くとも８種のインヒビターがこの材料源から単離され、文献中にその特性が記
載されている。これらの中には、α2−マクログロブリン（α2Ｍ）、α1−プロ
テアーゼインヒビター（α1ＰＩ）、α1−アンチキモトリプシン（α1Ａｃｈｙ
）、β1−アンチコラゲナーゼ（β1ＡＣ）、及び、インター−α−トリプシンイ
ンヒビター（ＩαＩ）がある。 【０００５】 プロテアーゼ／プロテアーゼインヒビターのバランスの攪乱は、気腫、関節炎
、糸球体腎炎、歯周炎、筋ジストロフィー、腫瘍の侵入及びさまざまな他の病理
的状態を包含するプロテアーゼを媒介とする組織の破壊へと導く。ある状況、例
えば、敗血症とか急性白血病のようなきびしい病理学的進行の場合には、存在す
る遊離のタンパク分解酵素の量は、分泌細胞からの酵素の放出により増加する。
それに加えて、他の状況下では、これとは別に生体の制御的なインヒビターの容
量が減少するため、プロテアーゼ／プロテアーゼインヒビター−バランスの変化
が起きることもある。このような制御的なインヒビターの容量が減少する例は、
α1−プロテアーゼインヒビターの欠損であり、肺気腫の発生と大きく関わり合
っている。 【０００６】 生体にこのような常規を逸脱した状態が存在すると、タンパク分解酵素を制御
するための方策を講じなければ、生体への深刻な傷害が起り得る。したがって、
生体に投与すれば、タンパク分解酵素を制御することが出来るプロテアーゼイン
ヒビターが探し求められてきた。 【０００７】 白血球エラスターゼは、病理学的見地からことのほか興味深いセリンプロテア
ーゼの１つの例である。白血球エラスターゼは、細胞外に放出されると、結合組
織やその他の貴重なタンパクを分解する。正常に機能している生体にとって、あ
る一定量の結合組織や他のタンパクを分解することは必要であるが、過剰の白血
球エラスターゼの存在は、気腫やリューマチ様関節炎のような様々な病理的状態
と関連づけられている。白血球エラスターゼが正常よりも大量に存在する場合、
その効果に抵抗するため、白血球エラスターゼ活性を阻害するプロテアーゼイン
ヒビターが探し求められてきた。精製した形で薬剤として役立つに足る量を、組
み換えＤＮＡ法によって生産できるとしたら、このようなプロテアーゼインヒビ
ターは特別に有用であろう。 【０００８】 文献によると、過去において、少くとも２種の白血球エラスターゼインヒビタ
ーが同定されている。“ヒト多形核白血球の中性プロテアーゼ”（Ｈａｖｅｍａ
ｎｎら（編）ＵｒｂａｎとＳｃｈｗａｒｚｅｎｂｅｒｇ，Ｉｎｃ．（１９７８）
）中の“ヒト粘液性分泌物中の顆粒球中性プロテアーゼの酸に安定なインヒビタ
ー；生化学と可能な生物学的機能”において、Ｓｃｈｉｅｉｓｌｅｒらが記述し
た１つのタンパクがヒトの精液のプラズマ及び痰から単離され、Ｎ末端アミノ酸
としてチロシンを持つ、大きさが１１ｋｄａのタンパクとして特徴づけられた。
このタンパクの文献報告からは、部分的なアミノ酸配列しか提供されていないが
、部分的な配列からさえも、このタンパクは本発明のタンパク類とは実質的に異
なっていることがわかる。このタンパクのアミノ酸配列の報告と、本発明のタン
パクのアミノ酸配列データーから考えると、Ｓｃｈｉｅｓｓｌｅｒらによって配
列が決定されたものは、元来一本鎖のポリペプタイドではないタンパクの分解物
であったかもしれないということが発明者らに示唆される。 【０００９】 １例において、ヒトの血漿から単離された２番目のタンパク、α1−ｐｒｏｔ
ｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒと名付けられた。このタンパクに関する業績は、
ＴｒａｖｉｓとＳａｌｖｅｓｅｎによつて総説、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ
ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ５２：６５５−７０９（１９８３）にまとめら
れている。このタンパクのアミノ酸配列のレポートは、これも本発明のタンパク
から実質的に異なっていることを示している。 【００１０】 本発明の一本鎖ポリペプチドのタンパク類が以前の技術による一本鎖ポリペプ
チドのセリンプロテアーゼインヒビターのいずれとも著しく異なっているから、
以前に研究された、一本鎖ポリペプチドのセリンプロテアーゼインヒビター類は
本発明のタンパク類とは“実質的に相同”ではない。 【００１１】 トリプシンは、病理学的見地から特別興味のあるもう１つのタンパクである。
トリプシンは、膵臓炎のような種々の急性症状のなかで、膵臓のような特定の軟
かい器管の組織の分解を始めることが知られている。これらの症状の治療を目的
として、トリプシンの作用を阻害するだろうと期待されたタンパク類の使用によ
る種々の努力がなされたが、目覚しい成功は得られなかった。このような努力の
実例は、ヒトの膵臓炎の治療に牛の外生トリプシンインヒビターを用いる試みで
ある。このような技術は、ヨーロッパで試みられたが、米国食品医薬品局（ＦＤ
Ａ）によって効果があると認められなかった。 【００１２】 したがって、種々の急性または慢性症状中の、過剰のトリプシンを中和する効
果のあるプロテアーゼインヒビターが必要である。上記で論議した白血球エラス
ダーゼインヒビターの場合にもそうであったように、トリプシンインヒビターは
、もし、組み換えＤＮＡ法によって精製した形で、薬剤として役立てるに足る量
だけ単離製造できれば、ことのほか有用であろう。 カテプシンＧは、白血球に大量に存在するもう１つのプロテアーゼである。カ
テプシンＧは、補足的経路のタンパクをはじめとする種々の価値のあるタンパク をｉｎ ｖｉｔｒｏで分解できることが知られている。膵臓のエラスターゼが、
膵臓炎で役割を果している可能性のあるもう１つのプロテアーゼである。したが
って、これらのプロテアーゼに対する阻害剤も薬剤としての潜在的価値がある。 【００１３】 白血球エラスターゼ、トリプシン、カテプシンＧと膵臓のエラスターゼは、セ
リンプロテアーゼとして知られている一群のプロテアーゼの例であり、共通の構
造と作用機作の要素を持っている。それらの異なる基質に対する活性や、異なる
インヒビターへの活性は、２、３のアミノ酸残基だけが異なっていることから生
ずると信じられている。類推によれば、やはり構造と作用機作の共通の要素を持
っていて、比較的少ないアミノ酸の変化が、異なったプロテアーゼの阻害を結果
として生ずるセリンプロテアーゼインヒビターを想像することが可能であり、し
かも、少くともこの群の１員は、前述の群中のセリンプロテアーゼのすべてを阻
害するであろう。そうであるとすれば、この群のセリンプロテアーゼインヒビタ
ーは、大きな価値があるであろう。 【００１４】 【発明の開示】 驚くべきことに、本発明者達は、このようなセリンプロテアーゼインヒビター
の合成を導き、合成を行なうことができるＤＮＡ配列を発見した。このインヒビ
ターは、耳下腺分泌物から単離されたものと生物学的に等価である。組み換えＤ
ＮＡ法によって作られ、本明細書に記載の本発明のプロテアーゼインヒビターは
、少くとも２箇所の活性部位を持っている。すなわち、白血球エラスターゼ阻害
の性質を示す１つの部位と、トリプシンに対して阻害活性を示す２番目の部位で
ある。 【００１５】 本発明によって生産される組み換えインヒビターは、熱や酸による変性に著し
く抵抗性があり、また様々なタンパク分解酵素によるタンパク分解作用に対して
も抵抗性があると考えられる。この出願に用いられるように“組み換えインヒビ
ター”は、組み換えＤＮＡの方法論と技術によって生産されるプロテアーゼイン
ヒビターのことを指すよう意図されている。さらに、本発明の組み換えインヒビ ターの活性形は、哺乳動物の身体の細胞外の部位で普通に出会うような条件下で
は、熱力学的に安定である。組み換えプロテアーゼインヒビターの変成した形は
また、ジスルフィド結合を形成する能力も持っており、生化学的刺激の存在しな
い状態で活性三次構造をとるのに必要な非共有結合的相互作用を成立させる能力
がある。 【００１６】 より十分に、以下に示す本発明のＤＮＡ塩基配列は、発表されている他の白血
球エラスターゼインヒビターのアミノ酸配列とは大きく異なっているところのタ
ンパクの合成を導き行なう能力がある。したがって、本発明のＤＮＡ塩基配列の
同定によって、本出願の中で明らかにされる。新規の組み換えプロテアーゼイン
ヒビターの製造に関する組換えＤＮＡ法の本発明を可能とした。 このような組換え法は、セリンプロテアーゼ阻害活性を持っている経済的な薬
剤組成物を供給するために、量的にも、純度的にも、阻害剤の製造を可能にする
。さらに、ＤＮＡ塩基配列の同定により、上述のセリンプロテアーゼ阻害剤の類
縁体を製造する組み換えＤＮＡ法の発明を可能にした。 【００１７】発明の要旨 本発明は、プロテアーゼインヒビターの製造に関するものであり、一般、そし
て更に特定的には、ヒト、多形核（ＰＭＮ）−顆粒球プロテアーゼを阻害対象と
した組換えインヒビターの製造に関するものである。特に本発明は白血球エラス
ターゼやトリプシンを始めとするヒト・セリンプロテアーゼに対するインヒビタ
ーの製造のための組換えＤＮＡ法に関するものである。 それに加えて、本発明は、当該セリンプロテアーゼインヒビターの類縁体の製
造に関する組み換えＤＮＡ法にも関連する。本発明はまた、以下に述べるような
組み換えＤＮＡ法において有用な合成並びに天然のＤＮＡ塩基配列に関するもの
である。 【００１８】 セリンプロテアーゼ阻害活性を持つ一本鎖のポリペプチドであるセリンプロテ
アーゼインヒビターの組み換えＤＮＡ合成法を提供することが本発明の目的の一 つである。これらのインヒビターは、ヒトの耳下腺分泌物から単離された天然の
白血球エラスターゼまたはトリプシンインヒビターによって示される活性と生物
学的に同等な活性を持っている。 【００１９】 これらのセリンプロテアーゼインヒビターの代替組み換えＤＮＡ合成を容易に
するために、等価の天然のＤＮＡ塩基配列と同様に、これらの組み換えプロテア
ーゼインヒビターの産生を導き行なうことができる合成ＤＮＡ塩基配列を供給す
ることが、この発明のなおそれ以上の目的である。このような自然のＤＮＡ塩基
配列は、プロテアーゼインヒビターの合成を導き行なうことができる遺伝子が、
そこから単離、同定されうるｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリーから単離され
うる。 【００２０】 さらに、先に検討したプロテアーゼインヒビターの類縁体を製造する組み換え
ＤＮＡ法及びこのような方法に役立つ、相当する類縁ＤＮＡ塩基配列を提供する
ことが本発明の目的である。 なおその他の本発明の目的と利点は、以下に続く記述において一部出てくるで
あろう。そして一部は記述から明白であるか、発明の実施から学ばれることもあ
ろう。その目的と利益は、添付した特許請求の範囲において特に指摘されている
手段と組合せによって了解され、達成されるであろう。 【００２１】 この目的を達成するため、そして本発明の目的に従って、セリンプロテアーゼ
阻害活性を示すところの、活性型で一本鎖ペプタイドのタンパクであるプロテア
ーゼインヒビターの組み換えＤＮＡ方法論による産生を導き行なうことができる
ＤＮＡ塩基配列を発見した。これらの組み換えプロテアーゼインヒビターは、熱
や酸による変性に対して著しく耐性である。さらに、これらのプロテアーゼイン
ヒビターは、キモトトリプシンやマウスの顎下腺プロテアーゼやクロストリパイ
ンのような多くのタンパク分解酵素に接触した後でさえ、それらの生物活性を維
持している。 【００２２】 これらの組み換えセリンプロテアーゼインヒビターの製造を導き行なうために
発見されたＤＮＡ塩基配列の（遺伝暗号鎖）コーディングストランドは以下の通
りである。 【化１３】 【００２３】 上述の略号によって表示されているヌクレオタイドは、提起された具体的態様
に係る詳細な記述において明らかになる。 これらの遺伝子組み換えセリンプロテアーゼインヒビター、特に本発明の分泌
形白血球プロテアーゼインヒビター（ＳＬＰＩ）の製造を導き行なうために発見
した、２番目の好ましいＤＮＡ塩基配列に対するコーディングストランドは以下
の如くである。 【００２４】 【化１４】 【００２５】 さらに目的を達成するため、そして本発明の目的に従って、上述の天然または
合成ＤＮＡ塩基配列を用いて、セリンプロテアーゼインヒビターの微生物におけ
る製造に帰着する組み換えＤＮＡ法を明らかにする。この組み換えＤＮＡ法は以
下の項目を包含する。 （ａ）宿主微生物を導き、セリンプロテアーゼ阻害活性、好ましくは白血球エ
ラスターゼ阻害活性を持つタンパクの製造を行なうことができるＤＮＡ配列の調
製。 （ｂ）宿主微生物の中に導入され、複製することができるＤＮＡ塩基配列をク
ローニングすること。このようなベクターＤＮＡ塩基配列に対するオペレーショ
ナルエレメント（操作要因）を含んでいる。 （ｃ）ＤＮＡ塩基配列とオペレーショナルエレメントを含むベクターをプロテ
アーゼ阻害タンパクを発現することができる宿主微生物の中に移すこと。 （ｄ）ベクターの増幅とインヒビターの発現のため適切な条件下でその微生物
を培養すること。 （ｅ）インヒビターを収穫すること；そして （ｆ）インヒビターがセリンプロテアーゼ阻害活性を有する活性三次構造をと
れるようにすることである。 【００２６】 本発明において使うための天然のＤＮＡ塩基配列の同定単離を容易にするため
、本発明者達はヒト耳下腺組織ｃＤＮＡライブラリーを開発した。このライブラ
リーは、細胞が本発明のセリンプロテアーゼインヒビターを合成するようにしむ
けることができる遺伝情報を含んでいる。ここに述べられた組み換えＤＮＡ法に
用いられることがある他の天然ＤＮＡ塩基配列は、ヒト・ゲノムライブラリーか
ら単離することができる。 【００２７】 本発明の方法において役に立つ合成塩基配列は、ポリヌクレオチドの合成と、
この道の普通の技量を持った人々にとって知られている配列を行なう技術によっ
て作ることができる。先に述べた過程において、有用な天然のＤＮＡ塩基配列は
、以下の項目を含む方法によって同定・単離することができる： （ａ）細胞から、好ましくは耳下腺の細胞からセリンプロテアーゼインヒビタ
ーを誘発させることができるヒトｃＤＮＡライブラリーを調製すること。 【００２８】 （ｂ）プロテアーゼ阻害剤の遺伝子またはそのタンパク生産物に結合すること
ができる少なくとも１つのプローブでヒトＤＮＡライブラリーをプローブするこ
と。 （ｃ）クローンが遺伝子又はそのタンパク生成物に対する、少くとも１つのプ
ローブに結合する能力によって、阻害剤をコードしている遺伝子を含む少なくと
も１つのクローンを同定すること。 （ｄ）同定されたクローンから阻害剤をコードしている遺伝子の単離、そして （ｅ）遺伝子またはそれについての適切な断片を宿主の微生物の遺伝子を維持
し、表現することに必要なオペレーショナルエレメントにつなぐこと。 【００２９】 上述の工程において、有用な天然のＤＮＡ塩基配列も、以下の項目を含む方法
によって同定・単離できる。 （ａ）宿主ｒｅｃ Ａ ｒｅｃ ＢＣ Ｅ．ｃｏｌｉにおいて繁殖させたヒト
・ジェノミックＤＮＡライブラリーを調製すること。 （ｂ）ヒト・ゲノムＤＮＡライブラリーをセリンプロティンインヒビター遺伝
子に結合することができるか、そのタンパク生成物に結合することができる少く
とも１つのブローブでプローブすること。 【００３０】 （ｃ）遺伝子又はそのタンパク産物に対する少くとも１つのプローブに結合す
るクローンの能力によってインヒビターをコードする遺伝子を含む少くとも１つ
のクローンを同定する。 （ｄ）同定されたクローンからインヒビターをコードする遺伝子を単離する。 そして、 （ｅ）遺伝子もしくは適当なその断片を宿主微生物中の遺伝子を維持し発現す
るのに必要なオペレーショナルエレメントにつなぐこと。 【００３１】 さらに、目的を達成するため、そして本発明の目的に従って、セリンプロテア
ーゼインヒビターの医薬として有用な類縁体は上記で詳述した遺伝子組み換えＤ
ＮＡ法により、適切なベクターにクローニングを行なって、適切な宿主微生物に
移した場合、欲しい類縁体の発見を誘導できる遺伝子をつくり出すために、上に
列挙した組み換えＤＮＡ技術を通じて合成的なＤＮＡ塩基配列もしくは天然ＤＮ
Ａ断片を変えることにより生産することができる。 【００３２】 さらに、目的を達成するために、そして本発明の目的に従って、本発明に従っ
た組み換えプロテアーゼインヒビター、もしくは上に述べた、組み換えＤＮＡ法
で生産された生物活性を有するアナログを活性成分として含んでいる薬剤組成物
を明らかにする。 本発明に組み込まれていてこの出願の一部をなしている添付されている図面は
、この発明に役立つ種々のプラスミドを図解し、同時に、本発明の原理を説明す
るのに役立つ記述を含んでいる。 【００３３】 図１は、プラスミドｐＳＧＥ６の地図である。 図２は、プラスミドｐＳＧＥ８の地図である。 図３は、プラスミドｐＧＳ２８５の地図である。 図４は、プラスミドｐＧＳ４８５の地図である。 【００３４】好適態様に関する説明 現在において提出した発明の実施態様について、今、詳細に述べよう。それら
は、あとに続く実施例とともに本発明の原理を説明するのに役に立つ。 上記したように、本発明は精製した形で単離されたプロテアーゼインヒビター
に関するものである。望ましくは、本発明のセリンプロテアーゼインヒビターは
、一本鎖ポリペプチドタンパクであり、ヒト・耳下腺分泌物から単離された天然
のセリンプロテアーゼインヒビターと実質的に同族であるかもっとも好ましくは
生物学的に等価である。 【００３５】 本明細書および請求範囲を通じて使われている“生物学的に等価”とは、組成
物は、プロテアーゼによって誘起された、同じ型の組織の損傷を防ぐことができ
るが、必ずしも天然プロテアーゼインヒビターと同程度ではないということであ
る。あとに続く明細書の記載および請求の範囲を通じて使用されている“実質的
に相同”とは、天然の耳下腺インヒビターに対して以前に報告されている一本鎖
ペプタイドセリンプロテアーゼインヒビターによって示された相同性以上の相同
性のことである。好ましくは、相同性の程度が４０％より大きく、最も好ましく
は５０％より大きく、特別に好ましい群のタンパクは天然耳下腺インヒビターと
の相同性が６０％より大きい。上に記述したような百分率の相同性は、２つの配
列のうちの小さい方に見出された成分の百分率として計算されており、２つの配
列のうちの大きい方でも、同じことがみつかるかもしれない。この成分は４つの
続いたアミノ酸の配列として理解されているものである。 【００３６】 本発明の組み換え法によって製造される好ましいプロテアーゼインヒビターは
、Ｒｏｂｅｒｔ Ｃ．Ｔｏｍｐｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．の“セリンプロテアーゼイ
ンヒビターと同じものを単離する方法”と題して、１９８４年１２月６日に提出
した米国特許出願連続番号Ｎｏ．６７８，８２３及びこの出願と同日付けで出願 された、Ｒｏｂｅｒｔ Ｃ．Ｔｏｍｐｓｏｎらの“セリンプロテアーゼ阻害剤と
同じものを単離する方法”と題する米国特許出願連続番号Ｎｏ．
に記述されている。 【００３７】 このようなプロテアーゼインヒビターは、熱や酸による変性に対し、著しく耐
性であり、又、キモトリプシン、マウス顎下腺プロテアーゼ、クロストリパイン
をはじめとする、多くのタンパク分解酵素に接触した場合、活性喪失に対し抵抗
性である。これらのインヒビターは、必要なジスルフィド結合を形成する能力を
持ち、生化学的刺激の存在しないところで、プロテアーゼインヒビター活性を表
わすことができる３次構造をとるべく適切な非共有結合的相互作用を受ける。あ
るいは、ジスルフィド結合が切れて非共有結合的相互作用が破壊されてもこのよ
うな結合を再生し、相互作用を取戻し、生化学的刺激のないところで、このよう
な活性３次構造を再びとることができる。 【００３８】 これらの特性を持っている好ましいセリンプロテアーゼインヒビターのアミノ
酸の配列を検討し、その配列を以下の如く決定した。 【化１５】 【００３９】 上記の略号は、ポリペプチド中の下記のとおりにアミノ酸残基に対応する。 アミノ酸 略 号 アラニン Ａｌａ バリン Ｖａｌ ロイシン Ｌｅｕ イソロイシン Ｉｌｅ プロリン Ｐｒｏ フェニールアラニン Ｐｈｅ トリプトファン Ｔｒｐ メチオニン Ｍｅｔ グリシン Ｇｌｙ セリン Ｓｅｒ スレオニン Ｔｈｒ 【００４０】 アミノ酸 略 号 システィン Ｃｙｓ チロシン Ｔｙｒ アスパラギン Ａｓｎ グルタミン Ｇｌｎ アスパラギン酸 Ａｓｐ グルタミン酸 Ｇｌｕ リジン Ｌｙｓ アルギニン Ａｒｇ ヒスチジン Ｈｉｓ 【００４１】 本発明により明らかにされた組み換えＤＮＡ法によって製造されるこれらのプ
ロテアーゼインヒビターは１つ以上の区別できるドメインを持っていることが発
見された。１つ以上の区別できるドメインとは、そのタンパクが異なる酵素に対
して機能する複数の活性部位を持っているということである。これらの場所の存
在と位置づけは、プロテアーゼインヒビターの少くとも２つの部分の間には、実 質的な相同性があることが発見されたことによって決定された。区別できるドメ
インの存在が、本発明のプロテアーゼインヒビターに対して白血球エラスターゼ
もトリプシンも含む広い範囲のセリンプロテアーゼを阻害する能力を与えている
と考えられる。 【００４２】 さらに、これらプロテアーゼインヒビターのはっきりしたドメインの複数性の
ために、プロテアーゼインヒビターが附加的特性をもつプロテアーゼインヒビタ
ーをつくるために、さまざまな他の活性部位がその上に構築されるような枠組み
として役立つかもしれないということが注目された。本発明の好適態様では、白
血球エラスターゼ、カテプシンＧ、膵臓のエラスターゼとトリプシンを阻害する
プロテアーゼインヒビターの産生が含まれている。これらの酵素はすべて共通の
メカニズムと多くの構造的特徴を共有しているセリンプロテアーゼとして知られ
ているプロテアーゼのクラスのメンバーである。 【００４３】 本発明によって生産されたプロテアーゼインヒビターにおいて、小数のアミノ
酸側鎖を細工することによってインヒビターの複合性が創り出され、各々が全体
のクラスのセリンプロテアーゼの少くとも１員を阻害することができると考えら
れる。その上、このような側鎖の修飾は、上に述べたような特定のセリンプロテ
アーゼのクラスのメンバーに関して阻害活性が改善されている複合性のインヒビ
ターを産生することが期待できる。 【００４４】 これらの目標を達成するのに必要なアミノ酸の側鎖の変化は、本発明によって
生産された好ましいインヒビターとこのインヒビターの重要な機能部分がＸ−線
結晶学によって解明された他のセリンプロテアーゼ阻害剤の間の構造類似性の特
定の要素によって示唆される。構造的類似性のこれらの要素は上述の本発明によ
って製造された好ましいセリンプロテアーゼインヒビターのアミノ酸１７から２
９及び７０から８３を含んでいる。量的か質的かのいずれかにおいて、トリプシ
ン様セリンプロテアーゼインヒビターの活性を改良するために示唆された変化は
、２０番目のアミノ酸をＡｒｇからＰｈｅ、ＴｙｒあるいはＴｒｐ、７２あるい は７４番目のアミノ酸をＬｅｕから、ＬｙｓまたはＡｒｇ、そして７３番目のア
ミノ酸をＭｅｔからＬｙｓまたはＡｒｇへ変換することの１つもしくはそれ以上
を含んでいる。 【００４５】 カテプシンＧをはじめとするキモトリプシン様セリンプロテアーゼに対する活
性を、量的又は質的に改善するべく示唆された変化は、アミノ酸２０をＡｒｇか
らＰｈｅ、ＴｙｒまたはＴｒｐへ、アミノ酸７２または７４をＬｅｕからＰｈｅ
、ＴｙｒまたはＴｒｐへ、そしてアミノ酸７３をＭｅｔからＰｈｅ、Ｔｙｒもし
くはＴｒｐへ変換することを、１つもしくはそれ以上行なうことを含んでいる。 【００４６】 膵臓のエラスターゼ様セリンプロテアーゼに対する阻害活性を、量的もしくは
質的に変えるべく示唆された変化は、アミノ酸２０をＡｒｇからＡａｌへ、７２
または７４番目のアミノ酸をＬｅｕからＡｌａへ、そして７３番目のアミノ酸を
ＭｅｔからＡｌａへ変換することの１つ又はそれ以上を含んでいる。 本発明の実施にあたっては、本発明のタンパクに新しいプロテアーゼ阻害活性
を付与するためのアミノ酸の変更が、白血球エラスターゼもしくはトリプシンに
対するインヒビターの活性を破壊するかもしれないということに心にとめておか
ねばならない。このような効果は本発明の教示に従って行なわれる型通りの実験
によって決定されよう。 【００４７】 さらに、上に提出されたように、特定のアミノ酸もしくは特定のアミノ酸の配
列を置換すると、一方では強化されないドメインの活性を幾分か犠牲にすること
になるが、本発明のプロテアーゼインヒビターの白血球エラスターゼもしくは、
トリプシン阻害活性のいずれかを増強するかもしれないということが考えられる
。事実：阻害タンパクの中のどの領域の活性も、適切なアミノ酸置換によって完
全に除去され、その際、それに対して通常そのタンパクが活性がある１つか、も
しくはいくつかの酵素のサブセットに対して、特異性のあるタンパクをつくるか
もしれない。 【００４８】 例えば、７３位置のＭｅｔに対し、Ｇｌｙを置換するか、もしくは、７２か、
７４の位置のＬｅｕに対してＧｌｙを置換すると、白血球エラスターゼ阻害ドメ
インを不活性化するが、２０の位置のＡｒｇに対しＧｌｙを置換するとトリプシ
ン阻害ドメインを不活性化する。これらドメインはまた、各々が望ましい阻害機
能を保持する、別々のタンパクに分けることもできる。本発明の請求範囲は、こ
れらの手段によるこのようなインヒビターを産生する他の工程に対しても拡張さ
れる。 本発明者らは、前記で議論したプロテアーゼインヒビターの細胞内生産を導き
行なうことができる合成的ＤＮＡ塩基配列を発見した。この塩基配列は、次のよ
うな構造をもっている： 【００４９】 【化１６】 【００５０】 この中で、ヌクレオチドは、下記のとおりの略号で表されている： ヌクレオチド 略 号 デオキシアデニル酸 Ａ デオキシグアニル酸 Ｇ デオキシシチジル酸 Ｃ チミジル酸 Ｔ 本発明者らは、前記で議論したプロテアーゼインヒビター、とりわけ、上述の
分泌性白血球プロテアーゼインヒビター（ＳＬＰＩ）の細胞外産生を導き行なう
ことができる２番目の好ましい合成ＤＮＡ塩基配列を発見した。この塩基配列は
次のような構成をもっている： 【００５１】 【化１７】 【００５２】 上記で注意したように、本プロテアーゼインヒビターの複合的ドメイン構造の ため、上に議論したようなセリンプロテアーゼインヒビターの類縁体生産を導く
ことができるＤＮＡ配列を結果として生ずる、ここに提出する合成的ＤＮＡ配列
に変化を与えることが考えられる。 特に本発明に従って組み換えＤＮＡ技術によって生産されたセリンプロテアー
ゼインヒビターの好ましい類縁体は、次のアミノ酸配列をもっている： 【００５３】 【化１８】 ここで Ｒ1とＲ7は同一か、異なったものであり、置換もしくは無置換のアミノ酸残基
もしくはその誘導体からなる群から選ばれ；そして Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ8及びＲ9は同一か異なったものであり、メチオ
ニン、バリン、アラニン、フェニールアラニン、チロシン、トリプトファン、リ
ジン、グリシン及びアルギニンからなる群から選ばれる。 【００５４】 上記のＤＮＡ塩基配列は、本発明の好ましい具体例を表していることに留意す
べきである。ジェネティックコードの縮重のためにヌクレオチドの多数の選択、
当該プロテアーゼインヒビター、もしくはその類縁体の生産を導き、行なうこと
ができるＤＮＡ塩基配列に導く多数のヌクレオチドの選択がなされうるというこ
とが理解されるべきである。上記した塩基配列に対し、機能的に同等であるＤＮ Ａ塩基配列もしくは上に提出したアミノ酸配列に従って生産されたプロテアーゼ
インヒビターの類縁体の産生を導き行なうであろうところの配列に機能的に等価
である配列は、それ自体で本発明の中に包含されるものとする。 【００５５】 以下の図式は、縮重した遺伝暗号の結果として考えられるコドンの置換の例と
して、上記に数え上げた好ましいアミノ酸配列の製造のための本発明の範囲に含
めることを意図した追加のＤＮＡ配列である。このタンパクの生産に対する等価
ＤＮＡ塩基配列を決定するための例を辿ることによって、当業者ならば、好まし
いアミノ酸配列の類縁体の生産のための等価なＤＮＡ塩基配列も決定できる。 【００５６】 【化１９】 【００５７】 上記の配列において、使用されている略号は下記のヌクレオチドを表わすもの
である： ヌクレオチド 略 号 Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔ Ｎ Ａ，Ｇ Ｐ Ｃ，Ｔ Ｑ 【００５８】 直前に挙げたものを含め、本発明の合成ＤＮＡ塩基配列において用いられる遺
伝暗号を選択する場合に、特定のアミノ酸を指示するのに用いられる遺伝暗号は
高度に発現されるタンパクと関連するものであることが望ましい。これらの望ま
しい遺伝暗号は１部Ｇｒａｎｔｈａｎ，Ｒ ｅｔ ａｌ．らの“Ｃｏｄｏｎ Ｃ
ａｔａｌｏｇ Ｕｓａｇｅ Ｉｓ ａ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｔｒａｔｅｇｙ Ｍｏ
ｄｕｌａｔｅｄ Ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｖｉｔｙ”は、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９：ｒ４３（１９８１）に出ている。
本発明の好ましいＤＮＡ配列は、縮重した配列のいずれに対しても、Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの配列遺伝暗号を選択することによって選ばれた。 【００５９】 さらに、本発明のプロテアーゼインヒビターの類縁体の産生を導き行なうこと
が出来る追加の合成ＤＮＡ塩基配列をつくり上げるための合成ＤＮＡ塩基配列の
変換を容易にする遺伝暗号を選ぶことが望ましい。特に、もし可能なら、制限酵
素、エンドヌクレアーゼの切断位置を、追加の遺伝暗号を挿入することが望まし
い合成ＤＮＡの位置の近くに、もしくは類縁体か作られるように遺伝暗号を取り
換えることが望ましい位置に、もってくることができるようにヌクレオチド配列
を選ぶことが望ましい。本発明のＤＮＡ配列の望ましい実施態様においては、制
限酵素の切断位置が上に示したヌクレオチド配列の下に示してある。 【００６０】 本発明において考えられている合成ＤＮＡ配列をつくり出す方法は、一般的に
、最近の報告によって導かれたこの道の普通のわざの１つによって遂行される型
通りの業務の範囲内にある。本発明において明らかにした合成ＤＮＡ塩基配列を 得るために用いられる適切な方法の例は、Ｍａｔｔｅａｃｃｉ，Ｍ，Ｄ，とＣａ
ｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｊ．ＡＭ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５（
１９８１）及び、Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．とＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．
，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２２；１８５９（１９８１）、によって
提出されており、両方とも、特別に参照事項としてこの中に組み込まれている。 本発明の別の実施態様において、１つのＤＮＡ塩基配列が、本発明の望ましい
分泌白血球プロテアーゼインヒビター（ＳＬＰＩ）をコードするヒト・ジェノミ
ックライブラリーから単離された。この４番目の遺伝暗号からコードされ、現在
発明者らに知られているイントロン（介在配列）を含むこの塩基配列は以下の通
りである： 【００６１】 【化２０】 【００６２】 【化２１】 【００６３】 【化２２】 【００６４】 これらの配列において使用されているアミノ酸残基を表わす１文字の略号は慣
用のものであり、例えば、Ａ．Ｌ．ＬｅｈｎｉｎｇｅｒによるＢｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ 第２版、Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ（１９７６）７２頁に出ている。 この塩基配列とここに含まれるアミノ酸配列データーを用いて、上のゲノム配
列に加えられた場合、全プロテアーゼインヒビター剤をコードする遺伝子に到達
する合成ＤＮＡ配列が構築できる。そのかわりに、上に示したＤＮＡ塩基配列を
用いてプローブを作り、最初の３つのアミノ酸に対するコドンを持っている、ヒ
トゲノムライブラリーから、ＤＮＡ断片を回収するのに用いた。 【００６５】 このようなプローブは、それに加えて適切なリーダー配列を含むヒトゲノム配
列を同定するのに用いられる。このリーダー配列、または、どの他の適切なリー
ダー配列も、ＤＮＡゲノム配列と併用して、哺乳動物の発現システムに用いられ
ると考えられる。 本発明のもう１つの別法としての具体的態様において、本発明の好ましい分泌
性白血球プロテアーゼインヒビターの細胞内生産を導き、行なうことができるＤ
ＮＡ配列をコードする耳下腺ライブラリーからｃＤＮＡクローンを単離した。こ
のクローンはＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． の下に、Ｒｏｃｋｖ
ｉｌｌｅ，ＭａｒｙｌａｎｄのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されている。 【００６６】 セリンプロテアーゼ阻害活性を有する少なくとも１つの活性部位をもつ１本鎖
ポリペプタイドから構成されている１つのプロテアーゼインヒビターの製造に対
する組み換えＤＮＡ法が明らかとなった。本発明の態様の１つにおいて、この活
性部位は、ヒト・耳下腺分泌物から単離された天然の白血球エラスターゼインヒ
ビターの活性部位と生物学的に等価な方法で機能する。天然又は合成ＤＮＡ塩基
配列は、プロテアーゼインヒビターの直接生産に用いることができる。 【００６７】 この方法は、以下の工程を含む： （ａ）宿主微生物が、セリンプロテアーゼインヒビター活性をもっているタン
パクを生産するよう導くＤＮＡ塩基配列の調製。 （ｂ）ＤＮＡ塩基配列を宿主に移し増殖することができるベクターにそのＤＮ
Ａ塩基配列をクローニングすること。このようなベクターは、そのＤＮＡ塩基配
列に対してオペレーショナルエレメントを含んでいる。 （ｃ）合成ＤＮＡ塩基配列とオペレーショナルエレメントを含むベクターをプ
ロテアーゼインヒビターを発現することができる宿主微生物に移す。 （ｄ）その微生物をベクターの増殖とインヒビターの発現に適切な条件下で培
養すること。 （ｅ）インヒビターを収穫すること。そして、 （ｆ）インヒビターがセリンプロテアーゼ阻害活性を持つ、活性３次構造をと
れるようにすること。 【００６８】 この方法における使用のために考えられた合成ＤＮＡ塩基配列が、上に詳細に
検討された。別の実施態様において、この方法で天然のＤＮＡ塩基配列も使うこ
とができるということが更に考えられる。これらの配列には、ｃＤＮＡもしくは
ゲノムＤＮＡ断片が用いられる。この実施態様のより好ましい変形として天然の
ＤＮＡ配列は、以下の項目を含む方法によって得られる。 （ａ）セリンプロテアーゼインヒビターを産生できる細胞、さらに望ましくは
、耳下腺の細胞からヒトのｃＤＮＡライブラリーを調製する。 【００６９】 （ｂ）プロテアーゼインヒビター遺伝子もしくはそのタンパク産物に結合する
ことができる少くとも１つのプローブで、ヒトＤＮＡライブラリーを検索する。 （ｃ）そのクローンが遺伝子もしくはそのタンパク産物に対する、少くとも１
つのプローブと結合する能力によってインヒビターをコードする遺伝子を含む少
くとも１つのクローンを同定する。 （ｄ）選ばれた単一クローンもしくは複数のクローンからインヒビターをコー
ドする遺伝子の単離。 （ｅ）遺伝子もしくはその適切な断片を宿主微生物中の遺伝子を維持し、発現
するために必要なオペレーショナルエレメントにつなげること。 【００７０】 前出の方法において、有用な天然のＤＮＡ塩基配列もまた以下の工程を経て同
定単離できる： （ａ）より好ましくは、宿主ｒｅｃ Ａ ｒｅｃ ＢＣ Ｅ．ｃｏｌｉ中で繁
殖させたヒト・ジェノミックライブラリーを作る。 （ｄ）ヒトジェノミックライブラリーをセリンプロテインインヒビター遺伝子
、もしくは、その生産物に結合することができる少なくとも１つのプローブを用
いて検索する。 【００７１】 （ｃ）そのクローンが遺伝子またはタンパク産物に対する少なくとも１つのプ
ローブに結合するクローンの能力によってインヒビターをコードする遺伝子を含
む少くとも１つのクローンを同定する。 （ｄ）同定されたクローンからのインヒビターをコードする遺伝子を単離する
。 （ｅ）遺伝子もしくはその適当なフラグメントを宿主微生物中の遺伝子を維持
し、表現するのに必要なオペレーショナルエレメントにつなげること。 【００７２】 上記に挙げた方法を用いるのに、適切な天然のＤＮＡ遺伝子を単離するにあた
り、適当な遺伝子の両端部分、すなわち遺伝子の断面の内側または最も近い部分
に位置している２つの制限酵素切断部位を同定することがより好ましい。適切な
遺伝子を含むＤＮＡ断片を次に適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて、ゲノム
物質の残りから除去する。切り出した後、セリンプロテアーゼインヒビタータン
パクのＮ−及びＣ−末端にコードすることができ、またそのＤＮＡ配列をそのオ
ペレーショナルエレメントに融合させることができるように、ＤＮＡ配列の３′
及び５′末端は再構築される。 【００７３】 本発明における、使用のため考えられるベクターは、優先されるか、もしくは 、必要となるオペレーショナルエレメントとともに、前記で検討したようなＤＮ
Ａ塩基配列が挿入され、又そのベクターが、その後宿主微生物に移され、その微
生物中で複製出来るような、ベクターすべてを含む。より好ましいベクターは、
その制限酵素切断部位がよく報告されていて、ＤＮＡ塩基配列の転写に、より好
まれるか、もしくは必要である、オペレーショナルエレメントを含んでいるよう
なベクターである。 【００７４】 本明細書に記載のオペレーショナルエレメントの用語には、少なくとも１つの
プロモーター、少くとも１つのオペレーター、少くとも１つのリーダー配列、少
くとも１つのシャイン−ダルガーノ配列、少くとも１つの停止コドン及びベクタ
ーＤＮＡの適切な転写とその次の翻訳に必要か、より好ましい他のＤＮＡのすべ
てが含まれる。特に、このようなベクターは、少くとも１つの選択可能なマーカ
ーとともに、宿主微生物によって認識される複製の少くとも１つの起点、及び合
成ＤＮＡの塩基配列の転写を始めることが出来る少くとも１つのプロモーター塩
基配列を含んでいると予測されている。ある実施態様においては、ベクターは、
レギュレーターとして機能することができるあるＤＮＡを含み、レギュレーター
プロテインをコードすることができる他のＤＮＡ塩基配列を含んでいることが、
さらに、より好ましい。 【００７５】 これらのレギュレーターは、１つの実施態様においては、ある環境条件の存在
下でＤＮＡ配列の発現を防ぐのに役立ち、他の環境条件では転写と、続いて起る
合成ＤＮＡ塩基配列によってコードされたタンパクの発現が行なわれる。とりわ
け、例えば、イソプロピルチオー−ｄ−ガラクトシッドが存在しないと、合成Ｄ
ＮＡの発現が起らないようなベクターのなかには調節断片が挿入されることがよ
り好ましい。この状況下では、合成ＤＮＡを含む形質転換した微生物は、プロテ
アーゼインヒビターの発現がはじまる以前にある望ましい密度まで育てられるか
もしれない。この実施態様においては、望ましいプロテアーゼインヒビターの発
現は、望ましい密度が達された後にＤＮＡ塩基配列の発現を起すことができるあ
る物質を微生物の環境に加えることにより誘導される。 【００７６】 それに加えて、ベクター中か、もしくは合成ＤＮＡ配列の５′末端に、適切な
分泌リーダー配列が存在することがより望ましい。リーダー配列は、リーダー配
列がプロテアーゼインヒビターの発現を導くことができるヌクレオチド配列のは
じめの部分に、翻訳停止シグナルを間にはさまずに、すぐに隣りあっていること
ができるような位置にある。リーダー配列の存在は、一部には以下の理由のうち
１つかそれ以上の理由から、望まれる：１）リーダーインヒビターが存在すると
、宿主が初期の生産物を成熟した組み換えプロテアーゼインヒビターに仕上げる
ことを容易にするかもしれないこいと；２）リーダー配列の存在は、プロテアー
ゼインヒビターを細胞質の外へ導くことにより、組み換えプロテアーゼインヒビ
ターの精製を容易にするかもしれないこと。３）リーダー配列の存在は、組み換
えプロテアーゼインヒビターが、プロテアーゼインヒビターを細胞質の外へ導く
ことを通じてその活性構造へ組み込まれる能力に影響を与えるかもしれないこと
。 【００７７】 とりわけ、リーダー配列は、最初の産物をリーダーペプチダーゼによって、リ
ーダー配列を除去し、セリンプロテアーゼ阻害活性の潜在力をもつより好ましい
ポリペプタイドを残すため、初期の翻訳産物の開裂を導く。宿主微生物のある種
においては、適切なリーダー配列の存在によりＥｓｃｈｅｒｌｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉの場合のように完成したタンパクを細胞周辺腔に輸送できるようにする。あ
る酵母や、ＢａｃｉｌｌｉやＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの場合には、適切なリーダ
ー配列は、タンパク細胞膜を通って細胞外の培地への輸送ができるようにする。
この状況では、目的のタンパクは、細胞外タンパクから精製できる。 【００７８】 ３番目に、本発明によって調製されるプロテアーゼインヒビターの中のあるも
のの場合には、完成されたタンパクを適切なエラスターゼ阻害剤活性をもつ活性
性構造をとるように組み込まれる環境のなかに位置させることに、リーダー配列
の存在が必要である。 それ以上のオペレーショナルエレメントには、そればかりではないが、リボゾ ーム結合部位と余所者タンパクの微生物発現のために必要な他のＤＮＡ配列がふ
くまれる。 【００７９】 本発明のより好ましい態様においては、GAGGCGCAAAAA(ATG)の配列がリボゾー
ム結合部位として用いられるであろう。この中で検討された、オペレーショナル
エレメントは、以前の文献や、ここに含まれている教訓に照らしてバイオテクノ
ロジーの普通の技能をもった人々によって型通りに選ばれる。これらのオペレー
ショナルエレメントの一般的例は、Ｂ．Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｗｉｌｅｙ
＆ Ｓｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８３）に出ており、これはこの中に参照に
よって特別に折り込まれている。この中で考察されているようなベクターは、一
部はプラスミッドｐＢＲ３２２そして／又はｐＩＱの部分から組立てられる。 【００８０】 本発明のより好ましい実施態様において、プロテアーゼインヒビターをコード
する合成ＤＮＡ配列のすぐ前に、さらにあらたなＤＮＡ配列が位置している。こ
の追加のＤＮＡ配列は、翻訳カップラーとして機能することができる。即ち、そ
れはリボゾームをそれが隣り合って並んでいるプロテアーゼインヒビターＲＮＡ
のリボゾーム結合部位のすぐ隣りにリボゾームを位置させるのに役立つＲＮＡを
コードしているＤＮＡの配列である。本発明の１つの実施態様において、翻訳カ
ップラーは、ＤＮＡ配列TAACGAGGCGCAAAAAATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCGGAGTGTAAG
AAATG を使用し、翻訳カップラーに関連したその道の普通のわざをもった人々に
とって現在知られている方法を使って導き出すことができる。２番目の好ましい
翻訳カップラーはTAACGAGGCGCAAAAAATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCAAGGAGAAATAAATG.
のＤＮＡ配列をもっている。 【００８１】 前記したベクターの、すべての必要なそして望ましい成分要素の合成と単離が
できたところで、ベクターはその道の普通の技能をもつ人々に一般に知られてい
る方法によって組立てられる。このようなベクターの組立ては、その道の普通の
技能をもった人々によって遂行される義務的職務の範囲内にあると信じられてお
り、そしてそれ自体、特別むずかしい実験をしなくても遂行できる。例えば、参 照として特別に本出願に加えたＳｈｏｎｅｒらＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔ
ｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．
Ａ．，８１；５４０３−５４０７（１９８４）、において、明らかにされている
ように、類似のＤＮＡ配列が適切なクローニングベクターにつなげられている。 【００８２】 本発明のクローニングベクターの構築において、合成ＤＮＡ配列の多重コピー
とその付随のオペレーショナルエレメントが各ベクターに挿入されるかもしれな
いということが、つけ加えて注目されるべきである。このような実施態様におい
ては、宿主生物は、望まれるプロテアーゼのベクターあたりのより大きな量を生
産するであろう。ベクターの中に挿入され得るＤＮＡ配列の複数のコピーの数は
、結果としてできたベクターは、その大きさのため、適切な宿主微生物に移され
たり、その中で複製したり転写されたりする能力によってのみ制限を受ける。 【００８３】 さらにつけ加えて、ベクターが、薬剤抵抗性マーカーや宿主微生物による特性
の発現の原因となる他のマーカーのような選択可能なマーカーを含んでいること
がより望ましい。本発明の特に望ましい実施態様において、テトラサイクリン抵
抗性に対する遺伝子がクローニングベクターに優先的に含まれている。 【００８４】 このような薬剤抵抗性や他の選択可能なマーカーは、部分的にトランスフォー
マントの選択を容易にすることを意図している。それに加えて、クローニングベ
クターの上の、このような選択可能なマーカーの存在は、混入した微生物が培地
中で増殖するのを防ぐのに役立つかもしれない。この実施態様において、この形
質転換した宿主微生物の純粋な培養は、生き残るのに誘導した表現型を必要とす
る条件下で微生物を培養することによって得られるであろう。 【００８５】 このようにして得られたベクターは、次に適切な宿主微生物に移される。外生
のＤＮＡを取り込んで、それらの遺伝子や付随するオペレーショナルエレメント
を発現する能力を持った微生物はすべて選ばれてよいと信じられている。宿主微
生物は、通性嫌気性または好気性菌であることがより望ましい。この方法におけ る使用に好ましい特別な宿主は、酵母と細菌である。特定の酵母は、Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ層の酵母であり、特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｖｉｓｉａｅである。特別の細菌は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ層、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ層及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ層の細菌、特に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉである。 【００８６】 宿主微生物が選ばれた後、ベクターはその道の普通の技能をもつ人々によって
、一般的に知られている方法を用いて宿主微生物に移される。このような方法の
例は、Ｒ．Ｗ．Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，“細菌の遺伝の進歩”、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）に見出される。これは、特別に参照として
この中にとり込まれている。上に述べたようなオペレーショナルエレメントの使
用を通じて、温度調節が、遺伝子発現を調節する手段として考えられるので、１
つの実施態様において形質転換が低温で起ることがより好ましい。もう１つの実
施態様において、滲透のレギュレーターがベクターに挿入されたならば、形質転
換を通じての塩の濃度の調節が、合成遺伝子の適切なコントロールを確保するた
めに必要となるであろう。 【００８７】 組み換えセリンプロテアーゼインヒビターが終局的に酵母中で発現される場合
を考えると、クローニングベクターを、まずＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
に最初に移すことがより望ましい。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、ベクターに増殖を行
なわせ、倍増してから取り出し精製する。ベクターは、次にセリンプロテアーゼ
インヒビターの究極的表現のために酵母の中に移されるであろう。 【００８８】 宿主微生物は、セリンプロテアーゼインヒビターの発現に対して適切な条件下
で培養される。これらの条件は、一般に宿主微生物にとって特異的であり、例え
ば、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，８ｔｈ Ｅｄ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉ
ｎｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄのような微生物 のための生育条件に関する出版された文献に照らして、この道の普通の技能をも
った人々によって容易に決められる。この文献は参照としてここに特別に組み込
まれている。 【００８９】 ベクターの中に挿入された、又は存在するオペレーショナルエレメントすべて
に応じて、ＤＮＡ配列の表現の調節に必要な条件は、すべて形質転換と培養の段
階で効果をもつであろう。１つの実施態様においては、細胞はＤＮＡ配列の発現
を阻害する適切な調節条件において、高密度迄育てられる。最適の細胞密度に近
づいたとき、環境条件は、合成ＤＮＡ配列の発現に対して適切な条件に変えられ
る。このようにして、プロテアーゼインヒビターの生産条件は、宿主の細胞がほ
ぼ最適密度に近づいたあとの時期で起り、そして結果として生ずるプロテアーゼ
インヒビターは、その発現に必要な調節条件が誘起された後、しばらくしてから
収穫されると考えられる。 【００９０】 本発明のより望ましい実施態様において、組み換えプロテアーゼインヒビター
は、収穫の後、そしてその活性構造をとる以前に精製される。本発明者は、リフ
ォルディング済みのタンパクの高収率回収は、タンパクが先ず精製される場合に
、容易に得られると信じているので、この実施態様がより望ましい。しかし、１
つのより好ましい別の実施態様においては、プロテアーゼインヒビターは、その
活性構造をとるべく、リフォルディングするのにまかせてから精製することがあ
る。さらにもう１つのより好ましい代りの実施態様においては、プロテアーゼイ
ンヒビターは、培養液から回収するとき、リフォルディングの済んだ活性な状態
で存在している。 【００９１】 ある条件では、プロテアーゼインヒビターは、宿主微生物での発現、次いでそ
のタンパクの細胞壁を通過しての輸送又は膜を通って細胞周辺腔への輸送の際に
、そのしかるべき活性な構造をとっている。これは、一般的に適切なリーダー配
列をコードするＤＮＡが、組み換えタンパク質をコードするＤＮＡにつながって
いると起る。プロテアーゼインヒビターが、その適切な活性構造をとらない場合 は、形成したどのジスルフィド結合も、そして／または、どの生じた非共有結合
的相互作用も、変性試薬や還元試薬、例えば、グアニジウムクロライド、−メル
カプトエタノールによって先ず破壊してから、プロテアーゼインヒビターをコン
トロールした条件においての希釈及びこれらの試薬の酸化に続いてその活性構造
がとれるようにする。 【００９２】 【実施例】 本発明の教示を特定の問題や環境に応用することは、ここに含まれた知見に照
らして、この道の普通の技能をもった人の能力の範囲内にあるということが理解
されるべきである。本発明の生産物とそれらの単離、製造に対する代表的工程が
以下の例にみられる。 例１ 上記のアミノ酸配列、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉの高度に発現性の遺
伝子におけるコドンの使用、及び便利な制限エンドヌクレアーゼの開裂部位に基
いて、以下のＤＮＡ配列が提案された： 【００９３】 【化２３】 【００９４】 タンパク質をＥ．ｃｏｌｉのペリプラズムに輸送するのに適した形で、プロテ
インの発現を調節するため、以下の調節要素が提案された。即ち、高いレベルに
おける転写の開始の開始のためのｔａｃプロモーター；転写の制御のためのｌａ
ｃオペレーター：プラスミドの他の場所でコードされるべきｌａｃリプレッサー
（ｌａｃＩq）；高いレベルで翻訳をはじめるＯｍｐＡシャイン−ダルガーノ配
列；産物のペリプラズムへの輸送を容易にするＯｍｐＡリーダー、これらのオペ レーターエレメントによってコードされるタンパクと最初の産物の開裂を指示し
、成熟した白血球エラスターゼ阻害剤を生ずる上述の構造遺伝子によってコード
されるタンパクとの間のＡｌａ−Ｓｅｒ連結のＡｌａである。 【００９５】 これらの特徴はすべて、以下のＤＮＡ配列のなかに組みこまれている： 【化２４】 【００９６】 タンパクがＥ．ｃｏｌｉの細胞質内にとどまるような形でタンパクの発現を調
節するために、以下のオペレーショナルエレメントが提供される。即ち、ｔａｃ
プロモーター：ｌａｃオペレーター、そしてｌａｃリプレッサー（ｌａｃＩq）
；シャイン−ダルガーノ配列のコンセンサス；そして翻訳の高いレベルを開始す
るため、翻訳カップラーとして用いられるべきＯｍｐＡリーダーペプタイドの断
片である。翻訳カップリング配列はＯｍｐＡ遺伝子の翻訳の開始領域、ＯｍｐＡ
リーダーペプタイドの最初の８箇のアミノ酸は、上述のシャイン−ダルガーノ配
列認識及び翻訳停止を行なう配列をコードするＤＮＡを含む。翻訳カップリング
配列はプロモーターとセリンプロテアーゼインヒビター遺伝子の翻訳開始部位の
間に、後者と重なって挿入されるべきである。 【００９７】 これらの特徴のすべては、以下のＤＮＡ配列に組み込まれている： 【化２５】 【００９８】 Ａ． 遺伝子断片の構築 上の配列を組み立てるため、次のデオキシリボヌクレオチドがＡＢＩ ＤＮＡ
シンセサイザー（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて合
成される。合成産物は、ＡＢＩ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｍａｎｕａｌ中に記述
してあるように、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製される。それら
を、標準の方法に従ってＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５′をリン酸化
した。 以下のグループのオリゴヌクレオチド配列がフラグメント（断片）Ａａを組み
立てるために使用される： 【００９９】 オリゴヌクレオチドＡａｌは： GCTGT TGACA ATTAA TCAT. オリゴヌクレオチドＡａ２は CGGCT CGTAT AATGT GTGGA ATTGT GAGCG GATAA CAATT T. オリゴヌクレオチドＡａ３は CACAC ATAAC GAGGC GCAAA AA. オリゴヌクレオチドＡａ４は ATGAA AAAGA CAGCT ATCGC GATCG. オリゴヌクレオチドＡａ５は CAGTG GCACT GGCTG GTTTC GCTAC CGTAG CGCAG GCCAG CGGTA AA. オリゴヌクレオチドＡａ６は GAGCC GATGA TTAAT TGTCA ACAGC TGCA. オリゴヌクレオチドＡａ７は TCCGC TCACA ATTCC ACACA TTATA C. オリゴヌクレオチドＡａ８は CCTCG TTATG TGTGA AATTG TTA. オリゴヌクレオチドＡａ９は GCCAC TGCGA TCGCG ATAGC TGTCT TTTTC ATTTT TTGCG. オリゴヌクレオチドＡａ１０は AGCTT TTACC GCTGG CCTGC GCTAC GGTAG CGAAA CCAGC CAGT. 【０１００】 以下のオリゴヌクレオチド配列が、組み立てられ、断片Ａｂが作られる： ヌクレオチドＡｂ１は GCTGT TGACA ATTAA TCAT. ヌクレオチドＡｂ２は CGGCT CGTAT AATGT GTGGA ATTGT GAGCG GATAA CAATT T. ヌクレオチドＡｂ３は CACAC ATAAC GAGGC GCAAA AA. ヌクレオチドＡｂ４は ATGAA AAAGA CAGCT ATCGC GATCG. ヌクレオチドＡｂ５は CAGTG TAAGA AATGA GCGGT AAA. ヌクレオチドＡｂ６は GAGCC GATGA TTAAT TGTCA ACAGC TGCA. ヌクレオチドＡｂ７は TCCGC TCACA ATTCC ACACA TTATA C. ヌクレオチドＡｂ８は CCTCG TTATG TGTGA AATTG TTA. ヌクレオチドＡｂ９は AGCTT TTACC GCTCA TTTCT TACAC TCCGA TCGCG ATAGC TGTCT TTTTC ATTTT TTGCG. 【０１０１】 以下は、断片Ｂを構築するために組立てられるオリゴヌクレオチド配列である
： オリゴヌクレオチドＢ１は AGCTT CAAAG CTGGC GTATG CCCGC CGAAA AAATC CGCG. オリゴヌクレオチドＢ２は CAGTG TCTGC GGTAC AAAAA ACCGG AATGC CAG. オリゴヌクレオチドＢ３は TCCGA CTGGC AGTGC CCGGG TAAAA AACGT TGTTG C. オリゴヌクレオチドＢ４は CCGGA CACCT GCGGC ATCAA ATGCC TG. オリゴヌクレオチドＢ５は GATCC AGGCA TTTGA TGCCG CAGGT GTCCG GGCAA CAACG TTTTT TACCC GGGCA. オリゴヌクレオチドＢ６は CTGCC AGTCG GACTG GCATT CCGGT TTTTT CTACC G. オリゴヌクレオチドＢ７は CAGAC ACTGC GCGGA TTTTT TCGGC GGGCA TACGC CAGCT TTGA. 【０１０２】 以下は断片Ｃを構築するために用いられるオリゴヌクレオチド配列である： オリゴヌクレオチドＣ１は GATCC GGTTG ATACC CCGAA CCCG. オリゴヌクレオチドＣ２は ACTCG TCGAA AA. オリゴヌクレオチドＣ３は CCGGG TAAAT GCCCG GTAAC CTATG GC. オリゴヌクレオチドＣ４は CAGTG TCTGA TGCTG AACCC GCCGA AC. オリゴヌクレオチドＣ５は TTCTG CGAAA TGGAC GGCCA GTGTA AACGA GAT. オリゴヌクレオチドＣ６は CTAGA TCTCG TTTAC ACTGG CCGTC CATTT CGCAG AAGTT. オリゴヌクレオチドＣ７は CGGCG GGTTC AGCAT CAGAC ACTGG CCATA GGTTA CCGGG CA. オリゴヌクレオチドＣ８は TTTAC CCGGT TTTCG ACGAG TCGGG TT. オリゴヌクレオチドＣ９は CGGGG TATCA ACCG. 【０１０３】 以下のグループのオリゴヌクレオチド配列が組立てられて断片Ｄが作られる： オリゴヌクレオチドＤ１は GATCT GAAAT GCTGT ATGGG TATGT GCGGC. オリゴヌクレオチドＤ２は AAATC TTGTG TTTCC CCGGT AAAAG CATAA G. オリゴヌクレオチドＤ３は TCGAC TTATG CTTTT ACCGG GGAAA CACAA GATTT GCCGC A. オリゴヌクレオチドＤ４は CATAC CCATA CAGCA TTTCA. 【０１０４】 以下のグループのオリゴヌクレオチドを混合し、標準条件下でアニーリングを
行ない、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて標準条件下で互い同志及び適切な制限酵素
エンドヌクレアーゼで切ったクローニング及びケーシングベクターＭ１３ｍｐ１
８及び１９につなげる。出来上ったものを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５を形質転
換するのに用い、目的のＤＮＡを含むクローンをＩＰＴＧ−Ｘｇａｌプレート中
での白いプラークから選択し、アニーリングの段階に用いられたグループから選
ばれた32Ｐでラベルしたオリゴヌクレオチドとハイブリドを作ることにより、さ
らにスクリーニングを行なう。挿入構造は、クローン化されたＤＮＡのダイデオ
キシ塩基配列決定法で確かめた。 【０１０５】 グループＡａは、ＰｓｔｌとＨｉｎｄＩＩＩで切ったＭ１３ｍｐ１８と１９に
つなげられるオリゴヌクレオチドＡａ１−Ａａ１０を含む。グループＡｂは、オ
リゴヌクレオチドＡｂ１−Ａｂ９を含み、それらは、ＰｓｔｌとＨｉｎｄＩＩＩ
で切ったＭ１３ｍｐ１８と１９につなげられる。オリゴヌクレオチドＢ１からＢ
７を含むグループＢは、ＨｉｎｄＩＩＩはＢａｍＨＩで切ったＭ１３ｍｐ１８及 び１９につなげられる。オリゴヌクレオチドＣ１からＣ９迄を含んでいるグルー
プＣは、ＢａｍＨＩとＸｂａＩで切ったＭ１３ｍｐ１８と１９につなげられる。
グループＤは、オリゴヌクレオチドＤ１からＤ４を含むが、ＢａｍＨＩとＳａｌ
Ｉで切ったＭ１３ｍｐ１８と１９につなげられる。 【０１０６】 Ｍ１３複製型のＤＮＡを、標準的手法によって目的とする挿入ＤＮＡを持って
いるクローンから回収する。グループＡａに相当する挿入ＤＮＡを適切な制限酵
素エンドヌクレアーゼで、Ｍ１３ＤＮＡから切り取る。ポリアクリルアミドゲル
電気泳動によって精製する。その構造は以下の通りである： 【０１０７】 【化２６】 【０１０８】 グループＡｂに相当する挿入ＤＮＡを、制限酵素エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ
ＩとＨｉｎｄＩＩＩでＤＮＡを切断することにより切り、ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で精製する。その構造は、以下の如くである： 【化２７】 【０１０９】 グループＢに相当する挿入ＤＮＡを制限酵素、エンドヌクレアーゼ、ＨｉｎＤ
ＩＩＩとＢａｍＨＩでＤＮＡを切断することにより切断することによって切り取
り、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製する。その構造は、以下の通りであ
る： 【化２８】 【０１１０】 グループＣに相当する挿入ＤＮＡをＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩでＤＮＡを切断す ることにより切り取り、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製する。その構造
は、以下の如くである： 【化２９】 【０１１１】 グループＤに相当する挿入ＤＮＡを制限酵素ＳａｕＩＩＩＡとＳａｌＩでＤＮ
Ａを切断することにり切り取り、アクリルアミドゲル電気泳動で精製する。その
構造は以下の通りである： 【化３０】 【０１１２】 Ｂ． 遺伝子の構造 外部への輸送のための組み立てには、グループＡａ、Ｂ、Ｃ及びＤを標準条件
下で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、ＥｃｏＲＩとＳａｌＩで切ったＭ１３ｍｐ １８と１９につなげる。目的の遺伝子を含むクローンはＸｇａｌプレート上の、
それらの色で選択され、そしてさらに32Ｐでラベルされたオリゴヌクレオチドと
ハイブリドを形成することによってスクリーニングする。選択された構造のクロ
ーンは、ユニバーサルプライマーを用いてＤＮＡの挿入区域をダイデオキシ塩基
配列決定法に確認する。 【０１１３】 細胞質での発現のための組み立てにおいては、グループＡｂ、Ｂ、Ｃ、及びＤ
からの挿入配列を合せて、標準条件下でＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて、ＥｃｏＲ
ＩとＳａｌＩで切ったＭ１３ｍｐ１８と１９につなげる目的の遺伝子を含むクロ
ーンをＸｇａｌプレート上のそれらの色で選び、更に、32Ｐでラベルした挿入配
列とハイブリドを形成されることによってスクリーニングを行なう。選ばれたク
ローンの構造をユニバーサルプライマーを使ってＤＮＡの挿入区域をダイデオキ
シ塩基配列決定法で検べることによって確める。 【０１１４】 例２ 上に述べたアミノ酸配列、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉの高度に発現さ
れた遺伝子におけるコドンの使用と便利な制限酵素エンドヌクレアーゼの切断位
置の規定にもとづいて、以下のＤＮＡ配列が提案された： 【０１１５】 【化３１】 【０１１６】 Ｅ．Ｃｏｌｉのペリプラズムへの輸送のための適切な形でタンパクの発現を調
節するために、以下の調節要素が提案される。即ち、高いレベルでの転写の開始
のためのプラスミドｐＫＫ２２３−３上の１つのｔａｃプロモーター、転写の制
御のためのプラスミッドｐＫＫ２２３−３上のｌａｃオペレーター、Ｅ．Ｃｏｌ
ｉの染色体上にコードされるべきｌａｃリプレッサー（ｌａｃＩ9）、高レベル
で翻訳を開始するＯｍｐＡシャイン−ダルガーノ配列、生産物をペリプラズムに 運び出すことを助長するＯｍｐＡリーダー、これらのオペレーターエレメントに
よってコードされるタンパク配列の間のＡｌａ−Ｓｅｒ接合のＡｌａ、そして、
最初の生産物の、成熟した白血球エラスターゼインヒビターを生じるべき開裂を
指示する上述の遺伝子によってコードされるタンパク配列である。 【０１１７】 ＯｍｐＡエレメントは、以下のＤＮＡ配列に組み込まれる。 【化３２】 【０１１８】 生成タンパクが、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞質に留まる形でのタンパクの発現を調節す
るために、以下のオペレーショナルエレメントが提供される。即ち、プラスミッ
ドｐＫＫ２２３−３上のｔａｃプロモーター、プラスミッドｐＫＫ２２３−３の
ｌａｃオペレーターとＥ．ｃｏｌｉ ｓｔｒａｉｎ ＪＭ１０７の染色体上のｌ
ａｃレプレッサー（ｌａｃＩq）、コンセンサスシャイン−ダルガーノ配列、及
び高いレベルの翻訳を開始するため、翻訳カップラーとして用いられるべきＯｍ
ｐＡリーダーペプチタイドの断片である。翻訳カップリング配列は、ＯｍｐＡ遺
伝子の翻訳開始領域、ＯｍｐＡリーダーペプチドの最初の８箇のアミノ酸、上に
記述したコンセンサスシャイン−ダルガーノ配列及び翻訳読み終り暗号である。
翻訳カップリング配列は、ｌａｃオペレーターとセリンプロテアーゼインヒビタ
ーの翻訳開始位置の間に、後者を重ねて挿入されるべきである。翻訳カップラー
の特徴は、以下のＤＮＡ配列に組み込まれている。 【０１１９】 即ち、 【化３３】 【０１２０】 Ｃ． 遺伝子フラグメントの構築 上述の配列を組み立てるため、以下のデオキシリボヌクレオチドをＡＢＩ Ｄ
ＮＡシンセサイザー（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使っ
て合成した生成物を、ＡＢＩ インスツルメンタルマニュアルに記述されている
ように、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製する。それらは、標準的
手段によってＴ４ポリヌクレオチドキナーゼとＡＴＰを用いて５′をリン酸化す
る。 以下のオリゴヌクレオチド配列をフラグメントＡａを組み立てるために用いる
： 【０１２１】 オリゴヌクレオチドＡａ１は AATTCGATATCTCGTTGGAGATATTCATGACGTATTTTGGATGATAACGAGGCGCAAAA. オリゴヌクレオチドＡａ２は ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCG. オリゴヌクレオチドＡａ３は GATCCGATCGCGATAGCTGTCTTTTTCATTTTTTGC. オリゴヌクレオチドＡａ４は GCCTCGTTATCATCCAAAAATACGTCATGAATATCTCCAACGAGATATCG. オリゴヌクレオチドＡａ５は GATCCGATCGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCCTCTGGTAAA. オリゴヌクレオチドＡａ６は AGCTTTTACCAGAGGCCTGCGCTACGGTAGCGAAACCAGCCAGTGCCACTGCGATCG. 【０１２２】 以下の、オリゴヌクレオチド配列を組立て、断片Ａｂをつくり上げる： オリゴヌクレオチドＡｂ１は AATTCGATATCTCGTTGGAGATATTCATGACGTATTTTGGATGATAACGAGGCGCAAAA. オリゴヌクレオチドＡｂ２は ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCG. オリゴヌクレオチドＡｂ３は GATCCGATCGCGATAGCTGTCTTTTTCATTTTTTGC. オリゴヌクレオチドＡｂ４は GCCTCGTTATCATCGAAAATACGTCATGAATATCTCCAACGAGATATCG. オリゴヌクレオチドＡｂ５は CAAGGAGAAATAAATGAGCGGTAAA. オリゴヌクレオチドＡｂ６は AGCTTTTACCGCTCATTTATTTCTCCTTGAT. 【０１２３】 以下は、断片Ｂを構築するために組み立てられるヌクレオチド配列である： オリゴヌクレオチドＢ１は AGCTT CAAAG CTGGC GTATG CCCGC CGAAA AAATC CGCG. オリゴヌクレオチドＢ２は CAGTG TCTGC GGTAC AAAAA ACCGG AATGC CAG. オリゴヌクレオチドＢ３は TCCGA CTGGC AGTGC CCGGG TAAAA AACGT TGTTG C. オリゴヌクレオチドＢ４は CCGGA CACCT GCGGC ATCAA ATGCC TG. オリゴヌクレオチドＢ５は GATCC AGGCA TTTGA TGCCG CAGGT GTCCG GGCAA CAACG TTTTT TACCC GGGCA. オリゴヌクレオチドＢ６は CTGCC AGTCG GACTG GCATT CCGGT TTTTT CTACC G. オリゴヌクレオチドＢ７は CAGAC ACTGC GCGGA TTTTT TCGGC GGGCA TACGC CAGCT TTGA. 【０１２４】 以下は断片Ｃを組み立てるために使用されるヌクレオチド配列である： オリゴヌクレオチドＣ１は GATCC GGTTG ATACC CCGAA CCCG. オリゴヌクレオチドＣ２は ACTCG TCGAA AA. オリゴヌクレオチドＣ３は CCGGG TAAAT GCCCG GTAAC CTATG GC. オリゴヌクレオチドＣ４は CAGTG TCTGA TGCTG AACCC GCCGA AC. オリゴヌクレオチドＣ５は TTCTG CGAAA TGGAC GGCCA GTGTA AACGA GAT. オリゴヌクレオチドＣ６は CTAGA TCTCG TTTAC ACTGG CCGTC CATTT CGCAG AAGTT. オリゴヌクレオチドＣ７は CGGCG GGTTC AGCAT CAGAC ACTGG CCATA GGTTA CCGGG CA. オリゴヌクレオチドＣ８は TTTAC CCGGT TTTCG ACGAG TCGGG TT. オリゴヌクレオチドＣ９は CGGGG TATCA ACCG. 【０１２５】 以下のグループのオリゴヌクレオチドが断片Ｄを形成するために組立てられる
： オリゴヌクレオチドＤ１は GATCT GAAAT GCTGT ATGGG TATGT GCGGC. オリゴヌクレオチドＤ２は AAATC TTGTG TTTCC CCGGT AAAAG CATAA G. オリゴヌクレオチドＤ３は TCGAC TTATG CTTTT ACCGG GGAAA CACAA GATTT GCCGC A. オリゴヌクレオチドＤ４は CATAC CCATA CAGCA TTTCA. 【０１２６】 以下のグループのオリゴヌクレオチドを混合し、標準条件下でアニーリングを
行ない、互い同志で、又、適当な制限酵素エンドヌクレアーゼで切ったクローニ
ング及び配列形成ベクターＭ１３ｍｐ１８と１９に、標準条件下でＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いてつなげる。この生成物は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５を形質転換
するのに用い、目的のＤＮＡを含むクローンをアニーリングの段階で用いられた
グループから選ばれた32Ｐでラベルされたオリゴヌクレオチドとハイブリッドを
形成することによって選ぶ。挿入構造は、ユニバーサルプライマーを用いて、ク
ローン化したＤＮＡのダイオキシ塩基配列決定法により確める。 【０１２７】 オリゴヌクレオチドＡａ１−Ａａ４を、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切ったＭ１
３ｍｐ１８及びＭ１３ｍｐ１９につなげる。目的の挿入ＤＮＡを持つＭ１３複製
型ＤＮＡを標準的手法によって回収する。挿入ＤＮＡは、Ｍ１３ＤＮＡを制限酵
素エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩとＰｖｕ１で切断することによりＭ１３ＤＮＡ
から切り出し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製する。その構造は以下の
通りである。 【０１２８】 【化３４】 【０１２９】 オリゴヌクレオチドＡａ５とＡａ６は、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで切った
Ｍ１３ｍｐ１８とＭ１３ｍｐ１９につなげる。目的とする挿入ＤＮＡをもったＭ １３複製型ＤＮＡは、標準的手法によって回収される。挿入ＤＮＡを制限酵素Ｐ
ｖｕｌとＨｉｎｄＩＩＩでＤＮＡを切断することによりＭ１３ＤＮＡから切り出
し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製する。その構造は以下の如くである
。 【０１３０】 【化３５】 【０１３１】 このＰｖｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をオリゴヌクレオチドＡａ１−Ａａ４から
調製した断片と結合させ、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切ったＭ１３ｍｐ１８
またはＭ１３ｍｐ１９とつなぐ。目的の挿入ＤＮＡを持つＭ１３複製型ＤＮＡを
標準的手法で回収する。挿入ＤＮＡを、これはＤＮＡ断片Ａａであるが、制限酵
素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩでＭ１３ＤＮＡを切断することによりＭ１３ＤＮ
Ａから切り出し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製する。その構造は以下
の如くである。 【０１３２】 【化３６】 【０１３３】 オリゴヌクレオチドＡｂ１−Ａｂ４をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切ったＭ１３ ｍｐ１８とＭ１３ｍｐ１９につなぐ。目的の挿入ＤＮＡを持ったＭ１３複製型Ｄ
ＮＡを標準的手法で回収する。挿入ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｖｕＩでＭ
１３ＤＮＡから切り取りポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製する。その構造
は以下の如くである。 【０１３４】 【化３７】 【０１３５】 このＥｃｏＲＩ−ＰｖｕＩ断片をオリゴヌクレオチドＡｂ５−Ａｂ６と合し、
ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切ったＭ１３ｍｐ１８またはＭ１３ｍｐ１９とつ
なぐ。目的の挿入ＤＮＡを持ったＭ１３複製型ＤＮＡを、標準的手法により回収
する。断片Ａｂである挿入ＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩでＤ
ＮＡを切断することによってＭ１３ＤＮＡから切り出す。そして、ポリアクリル
アミドゲル電気泳動で精製する。その構造は以下のとおりである： 【０１３６】 【化３８】 【０１３７】 オリゴヌクレオチドＢ１からＢ７までを含むグループＢをＨｉｎｄＩＩＩとＢ ａｍ ＨＩで切ったＭ１３ｍｐ１８と１９につなぐ。グループＢに相当する挿入Ｄ
ＮＡを制限酵素、エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩでＤＮＡを切
断することにより切出し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製する。
その構造は以下の通りである。 【０１３８】 【化３９】 【０１３９】 オリゴヌクレオチドＣ１からＣ９を含むグループＣをＢａｍＨＩとＸｂａＩで
切ったＭ１３ｍｐ１８と１９につなぐ。グループＣに相当する挿入ＤＮＡを制限
エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩでＤＮＡを切断することにより切り
出し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製する。その構造は以下の如くであ
る： 【０１４０】 【化４０】 【０１４１】 オリゴヌクレオチドＤ１からＤ４までを含むグループＤをＢａｍＨＩとＳａｌ
Ｉで切ったＭ１３ｍｐ１８と１９につなぐ。グループＤに相当する挿入ＤＮＡを
、制限酵素、エンドヌクレアーゼＳａｌＩでＤＮＡを切断することにより切り出
し、アクリルアミドゲル電気泳動で精製する。その構造は以下の如くである： 【０１４２】 【化４１】 【０１４３】 Ｄ． 遺伝子の構築 外部への輸送のための組み立てにおいては、グループＡａ、Ｂ、Ｃ及びＤから
の挿入配列を合し、ＥｃｏＲＩとＳａｌＩで切ったＭ１３ｍｐ１８と１９にＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて、標準条件下でつなぐ。細胞質中での発現のための組み
立てにおいては、Ａｂ、Ｂ、Ｃ及びＤからの挿入配列を合し、ＥｃｏＲＩとＳａ
ｌＩで切ったＭ１３ｍｐ１８及び１９とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて、標準状態
でつなぐ。目的の遺伝子を含むクローンを、それらのＸｇａｌプレート上での色
で選び、さらに32Ｐにラベルしたオリゴヌクレオチドとハイブリドを作ることに
よりスクリーニングを行なう。選んだクローンの構造を、ユニバーサルプライマ
ーを用いてＤＮＡの挿入領域のダイデオキシ塩基配列決定法を行なうことにより
確かめる。 【０１４４】 例３ 発現ベクターの組み立て 外部への輸出用と細胞質内発現用の組み立てに対する挿入配列を、次の如く発
現プラスミドに移す。所用の挿入ＤＮＡをもったＭ１３増殖型ＤＮＡを、上述の
如く標準型手法で回収する。適切な挿入ＤＮＡを制限酵素、エンドヌクレアーゼ
、ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで切って取り出し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
精製する。次に、それを制限酵素、エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで
切ったｐＫＫ２２３−３につなぎ、その結果生じたプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ
ＪＭ１０７にクローニングする。外部輸送用の例４と５における使用のための構
造は、ＰＳＧＥ６であり、原形質発現用の例７における使用のための構造は、ｐ
ＳＧＥ８である。例４，５における外部への輸送に対するＥ．ｃｏｌｉの株はＳ
ＧＥ１０であり、例６における細胞質発現に対する株は、ＳＧＥ３０である。 【０１４５】 Ａ． ｐＳＧＥ６の編成 プラスミドｐＳＧＥ６をｐＫＫ２２３−３のＥｃｏＲＩとＰｓｔＩの位置の間
のＤＮＡを、ＯｍｐＡＳＬＰＩをコードするＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ
断片で置きかえることによって組立てた。ＯｍｐＡ−ＳＬＰＩのＤＮＡ配列は次
の如くである： 【０１４６】 【化４２】 【０１４７】 これから後、“ｏｍｐＡ−ＳＬＰＩ”と呼ぶ配列は、上に述べた外部への輸送
のためのＭ１３ｍｐ１８の最終構造からのＤＮＡである。プラスミドｐＳＧＥ６
は、図１に描かれている。図１において、ｏｍｐＡｓｓ−ＳＬＰＩに対する最初
のコドンは、“ｏｍｐＡ−ＳＬＰＩ”と呼ばれるＤＮＡ配列の６２−６４の位置
にある。成熟したＳＬＰＩに対する最初のコドンは、１２５−１２７に位置して
いる。 【０１４８】 Ｐｔａｃは、ｔａｃプロモーター、ｌａｃオペレーター及びベーターガラクト ーゼＳｈｉｎｅ／Ｄａｌｇａｒｎｏ配列のためのＤＮＡを含んでいる。略号、Ｒ
Ｉ，Ｐｓｔ及びＢａｍは、制限酵素、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩに対
する認識配列である。Ｔｅｔrは、テトラサイクリンに耐性を附与するｐＢＲ３
２２の遺伝子の一部であり、ａｍｐrは、アンピシリンに耐性を附与し位置６４
１６から６８４０までのｒｒｎＢオペロンからのＤＮＡを、Ｔｅｔrは含んでい
る。矢印は転写の方向を示している。 【０１４９】 Ｂ． ｐＣＪ−ｏｍｐＡ−ＳＬＰＩの編成 プラスミドｐＣＪ−ｏｍｐＡ−ＳＬＰＩは、部分的でなく完全なテトラサイク
リン遺伝子およびプロモーターを含んでいることを除いては、ｐＳＧＥ６と同じ
である。このプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉに挿入すると、テトラサイクリン耐性
を附与し、ｏｍｐ ＡＳＬＰＩをコードするＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ
断片が、ベクターｐＫＫ２３３−３ではなく、ベクターｐＣＪ１にクローニング
されるということを除いて、ｐＳＧＥ６に対するのと類似のやり方で組立てられ
る。ベクターｐＣＪ１は以下の如く構築される。プラスミドｐＫＫ２２３−３を
ＳｐｈＩで完全に、ＢａｍＨＩで部分的に酵素分解した。 【０１５０】 ４．４Ｋｂｐ断片をゲルで精製し、合成アダプター GATCTAGAATTGTCATGTTTGACAGCTTATCAT ATCTTAACAGTACAAACTGTCGAATAGTAGC 及び、ｐＢＲ３２２（ＰＬ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，２７−４８９１−０１
）のｔｅｔr遺伝子のＣｌａＩ ＳｐｈＩによる消化物からのＤＮＡの５３９ｂ
ｐの断片と組み合せた。 【０１５１】 Ｃ． ｐＳＧＥ８の構造 ＥｃｏＲＩとｐｓｔ部位の間のＤＮＡが、上に述べたように、細胞質における
発現のための最終的なＭ１３ｍｐ１８構造物に由来するｏｍｐＡ−ｔｃ−ｍｅｔ
−ＳＬＰＩと呼ばれる配列を含んでいることを例外として、プラスミドｐＳＧＥ
８は、ｐＳＧＥ６と同一遺伝子組成である。この配列は、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞質 の中にメチオニル−ＳＬＰＩの合成を導く。ｐＳＧＥ８の部分的図式は、図２の
中に含まれている。“ｏｍｐＡ−ｔｃ−ｍｅｔ−ＳＬＰＩ”と呼ばれるその配列
において、ｏｍｐＡに対する開始コドンは、６２−６４の位置にあり、停止コド
ンは９５−９７にある。そして、メチオニル−ＳＬＰＩに対する開始コドンは、
９８−１００にある。ｏｍｐＡ−ｔｃ−ｍｅｔ−ＳＬＰＩのＤＮＡ配列は次の如
くである。 【０１５２】 【化４３】 【０１５３】 Ｄ． ｐＣＪ−ｍｅｔ−ＳＬＰＩの編成 プラスミドｐＣＪ−ｍｅｔ−ＳＬＰＩは、それが（部分的ではなく）完全なテ トラサイクリン耐性遺伝子を含んでいることを除けば、ｐＳＧＥ８と同じである
。プラスミドＣＪ−ｍｅｔ−ＳＬＰＩは、ｏｍｐＡ−ｔｃ−ｍｅｔ−ＳＬＰＩを
コードするＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ断片がベクターｐＫＫ２２３−３ではなく、ベ
クターｐＣＪ１にクローニングされたことを除けば、ｐＳＧＥ８と同様に組立て
られた。 【０１５４】 Ｅ． 酵母発現用プラスミドの組立て プラスミドｐＵＣ８をＨｉｎｄＩＩＩで酵素分解し、ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｓｍａ
Ｉアダプターにつなげた（Ａｍｅｒｓｈａｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ． ＤＡ１００６か
ら得た）。このアダプターをＨｉｎｄＩＩＩサイトに加えても、ＨｉｎｄＩＩＩ
サイトを再組み立てしない。ＤＮＡを次にＳｍａＩで酵素分解し、希薄溶液中で
つなぎ、続いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ８３の形質転換を行なった。正しいプラス
ミド、即ちＨｉｎｄＩＩＩの位置からＳｍａＩの間のポリリンカーにおいて制限
酵素による切断の位置を欠いているプラスミッドが、トランスフォーマントから
単離したプラスミッドＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩもしくはＨｉｎｄＩＩＩ
で消化することによって同定された。ＨｉｎｄＩＩＩ部位を欠いていたが、Ｅｃ
ｏＲＩ部位とＳｍａＩ部位を含んでいたプラスミドを含んでいるトランスフォー
マントがこの方法で同定された。このプラスミドがｐＧＳ１８５である。 【０１５５】 酵母のＭＦ１遺伝子を含有しているＥｃｏＲＩ断片を、この中に参照文献とし
て加えてある、Ｊ．Ｋｕｒｊａｎ ＆ Ｉ．Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ ｉｎ Ｃｅ
ｌｌ ３０：９３３（１９８２）によって記述されたように、プラスミドｐＣＹ
１７からゲル電気泳動で精製され、ＥｃｏＲＩによって切ったｐＧＳ１８５につ
なげた。プラスミドのＤＮＡをトランスフォーマントから単離した、正しい挿入
ＤＮＡの存在は、ＥｃｏＲＩでＤＮＡを消化することによって確かめられた。こ
れが、プラスミドｐＧＳ２８５であり、図３に描かれている。 【０１５６】 Ｋｕｒｊａｎ ＆ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、（同前）によって認められたよう
に、ＭＦ１遺伝子中の内部の４個のＨｉｎｄＩＩＩ部位の中の３箇を除去するた めに、プラスミドｐＧＳ２８５をＨｉｎｄＩＩＩで完全に消化し、そして再びつ
なげた。正しい構成は、上に述べたように選ばれた。これが、プラスミドｐＧＳ
３８５である。 例２において記述したように、合成ＳＬＰＩ遺伝子の４から１０７迄のアミノ
酸をコードするヌクレオチド配列になっているＭ１３ＡａＢＣＤを、ＨｉｎｄＩ
ＩＩで消化した。このＤＮＡを以下のオリゴヌクレオチドアダプターにつなげた
。 【０１５７】 【化４４】 このアダプターは、２つのオリゴヌクレオチドのアニーリングによって形成し
、5′GCT GAA GCT TCA GGT AAG 及び 5′AGC TCT TAC CTG AAG CTT CAGC 先づ
２分間７０℃に保ち、続いて、一夜かかって徐々に冷す。 【０１５８】 このアダプターをＨｉｎｄＩＩＩで切ったＭ１３ＡａＢＣＤにつなげた後、結
合混合物は、ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩで消化して、アガロースゲル電気泳動と
エレエクトロリューションによって精製した１つの断片を与えた。この断片を、
もう一度ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、それからＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩで切って
おいたｐＧＳ２８５につないだ。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を結合混合物で形質
転換し、アンピシリン耐性トランスフォーマントを選んだ。正しい挿入ＤＮＡを
持ったプラスミドを含むトランスフォーマントを、プラスミドＤＮＡを調整し、
それをＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩで消化することにより同定した。この方法で組
み立て、単離したプラスミドをｐＧＳ４８５と命名した。 【０１５９】 これは図４に描かれている。このプラスミドは、構成成分としてＭＦ１遺伝子
の最初のスペーサー領域におけるＨｉｎｄＩＩＩ切断部位において合成ＳＬＰＩ 遺伝子に融合したＭＦＩ遺伝子を含んでいる。このような構造体は、酵母に入れ
た場合、特別に参照としてここに加えた。Ａ．Ｊ．ＢａｋｅらＰＮＡＳ（ＵＳＡ
）８１：４６４２によって示されたように、異種タンパクの合成、プロセシング
、分泌を導くことが示された。ＭＦＩ遺伝子とＳＬＰＩの融合が、ｐＧＳ４８５
中のＥｃｏＲＩ断片に含まれている。このＥｃｏＲＩ断片を実施例８に記したよ
うに、ベクターＹＩｐ５の中へクローニングした。 【０１６０】 例４ プラスミドｐＳＧＥ６を用いての分泌白血球プロテアーゼインヒビター（ＳＬ
ＰＩ）の発現と精製。 プラスミドｐＳＧＥ６（ＳＧＥ１０細胞）を含んでいるＥ．ｃｏｌｉ細胞を、
２％トリプトン、０．５％酵母エキス、２０ｇ／ｌグルコース、２００ｍｇ／ｌ
ビタミンＢ，及び１００ｍｇ／ｌアンピシリンを加えた１０リットルのＭ９培地
中で、６時間培養した。ＩＰＴＧを０．２ｍＭ加え、更に６時間培養を続けた。
Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＧＥ１０の細胞１０リットルを１８，０００ｘｇで遠心してペ
レットにして８ｇ／ｌを得て、５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）４ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ緩衝液（今後Ｔ５０Ｅ４と略称する）に再び懸濁してからペレットにした
。 【０１６１】 このペレットを２．７リットルのＴ５０Ｅ４に再び懸濁し、１５０ｍｌのロッ
トずつ凍結した。これらのロット８箇（細胞３６ｇに相当する）をまとめて１２
，０００ｐｓｉ、４℃でフレンチプレスを１回通してペレットをくずした。くず
したものを、２０，０００ｘｇで１．５時間遠心分離した。細胞からなる不溶物
（６ｇの細胞に等しい）を含むペレット１／６を１２５ｍｌのＴ５０Ｅ４で２度
洗い、残った物質を一夜凍結した。 【０１６２】 凍結ペレットを、２０ｍＭのＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｄ−０６３
２から入手）、４ｍＭのＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ−７６２６）
及び８Ｍ尿素（超高純度、ＢＲＬ、Ｃａｔ．Ｎｏ．５５０５ＵＡ）を含む２５ｍ ｌの１００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）と４ｍＭのＥＤＴＡ（今後、Ｔ１０
０Ｅ４と略称する）で、３７℃、１時間抽出し、１０，０００ｘｇで１０分遠心
した。得られた上澄みを、あらかじめ２０ｍＭのＤＴＴと８Ｍ尿素を含む抽出緩
衝液Ｔ１００Ｅ４で平衡処理（Ｐｒｅ−ｅｑｕｉｂｒａｔｅｄ）しておいた１０
ｍｌの上澄みを除いたセファデックスｓｐ−ｃ２５（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入
手）と混ぜ、ローラーの上で３７℃で１０分混合し、ＳＬＰＩをＳＰ−セファデ
ックスに吸収させる。 【０１６３】 吸収させたＳＬＰＩを含んだ樹脂を１０分間３，０００ｘｇで遠心してペレッ
トとし、上澄みをデカントした。残ったセファデックスを２０ｍＭのＤＴＴと８
Ｍ尿素を含む２５ｍｌのＴ１００Ｅ４で２回洗ってから２０ｍＭのＤＴＴを含む
、２５ｍｌのＴ１００Ｅ４で２回洗った。次にセファデックスを１回、２０ｍＭ
のＤＴＴと０．３Ｍの食塩を含む２５ｍｌのＴ１００Ｅ４で抽出した。この抽出
物は、約０．１５ｍｇ／ｍｌのタンパクと、０．０４ｍｇ／ｍｌ以上のＳＬＰＩ
を含んでいた。この方法で得たＳＬＰＩは、高圧液体クロマトグラフィーにより
７０％以上の純度であることが確定された。 【０１６４】 例５ 例４の方法を用い、２番目の凍結ペレットを最初のＴ１００Ｅ４／ＤＴＴ／Ｐ
ＭＳＦ／尿素の代りに、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．
Ｎｏ．Ｔ−６８７８から入手）を含むＴ１００Ｅ４で抽出した。得られたＳＬＰ
Ｉは、例４で得られたものより僅かに純度が高く、例６において述べるリフォル
ディング・アッセイにおいて、より高い活性があった。 【０１６５】 例６ 精製ＳＬＰＩのリフォルディング 例４または５からの約４０μｇの部分的に精製したＳＬＰＩを尿素中８Ｍ、も
しくはグアニジン塩酸塩中５Ｍ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，＃
２４１１０）、そしてＤＴＴ中４ｍＭとして、室温で１時間温置した。酸化型グ ルタチオン（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ−４６２６）を１３．５ｍＭになる
迄加え、混合物を再び室温で１時間温置した。混合物をｐＨ１０．７の５０ｍＭ
トリス溶液で１０倍稀釈し、更に室温で４時間温置した。 【０１６６】 それから、混合物をｐＨ８．０の５０ｍＭトリスと０．１５Ｍ食塩で５倍に稀
釈し、ｐＨ８．０の５０ｍＭトリスと、０．２５Ｍ塩化ナトリウムで前もって平
衡させた、セファデックスＳＰ−Ｃ２５の１×２ｃｍカラムにかけた。 樹脂を０．２５Ｍの塩化ナトリウムを含むｐＨ８．０の５０ｍＭトリスで洗い
、それから０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む、ｐＨ８．０の５０ｍＭトリスで洗
った。０．５Ｍの塩の洗滌で溶出する区分は、十分に活性であり、カラムにかけ
たＳＬＰＩの約３０％を呈している。 【０１６７】 例７ ＳＧＥ３０細胞融解物の可溶区分不溶区分からのＳＬＰＩの精製。 Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＧＥ３０細胞中のプラスミドｐＳＧＥ８の発現により、細胞
融解物の可溶及び不溶の両区分において、ＳＬＰＩを生産した。ＳＬＰＩは全細
胞タンパクの１％を占め、可溶区に約８０％、不溶区に約２０％分布していた。 【０１６８】 Ａ．不溶区からのＳＬＰＩの精製 ｐＳＧＥ８を含むＥ．ｃｏｌｉ ＳＧＥ３０細胞を、振盪フラスコで５０μｇ
／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地でＯＤ６００が０．７になる迄培養し、ＩＰ
ＴＧを０．２ｍＭ迄加えて誘導した。３時間後に、細胞をペレットとし、その２
倍の重量の５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）と４ｍＭのＥＤＴＡ（今後は、
Ｔ５０Ｅ４と称する）に懸濁した。細胞を４℃で超音波をかけて破壊し、抽出物
を１２，０００ｘｇで、４０℃で２０分間遠心分離した。 【０１６９】 ペレットを３倍容量のＴ５０Ｅ４で洗い、１０Ｍ尿素か６Ｍグアニジン塩酸塩
のいずれか、及び５ｍＭの還元型ＤＴＴを含む溶液で、室温で溶解させた。室温
で１時間温置した後に、酸化型グルタチオンを１７．５ｍＭの濃度で加え、混合 物をもう１時間温置した。それから混合物をｐＨ１０．７の１０倍容積量の５０
ｍＭトリス−塩酸で希釈した。希釈混合物を室温で４時間放置後、５Ｎ塩酸を加
えてｐＨを８に調節した。この混合物を遠心分離して、沈殿したタンパクを除い
た。 このようにしてできた上澄みは、分泌性白血球プロテアーゼインヒビター活性
を示すＳＬＰＩを含んでいた。このタンパクを上に述べたようなセファデックス
ＳＰ−Ｃ２５カラム上のクロマトグラフィーで精製した。 【０１７０】 Ｂ．可溶区分からのＳＬＰＩの精製 プラスミドｐＳＧＥ８を含むＥ．ｃｏｌｉ ＳＧＥ３０細胞を振盪フラスコ中
でＯＤ６００が０．７になる迄培養し、ＩＰＴＧを０．２ｍＭ迄加えて誘導した
。ＯＤ６００が１．１で、細胞を２５，０００ｘｇで１５分間遠心分離してペレ
ットとした。ペレットをＴ５０Ｅ４に再び懸濁し、４℃で２０，０００ｐｓｉで
フレンチプレスによってくずした。くずしたものを２５，０００ｘｇで１５分間
遠心分離した。 【０１７１】 上澄みをＤＴＴ中で２５ｍＭとし、この混合物を０℃で１時間温置し最終濃度
が５％になる迄十分量の塩酸を加えた。０℃で３０分間温置した後、混合物を２
５，０００ｘｇで１５分遠心分離し、上澄みを除き次の工程にかけた。１０Ｍの
水酸化ナトリウムで上澄みのｐＨを８．０に調整し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー及びエライサ（ＥＬＩＳＡ）
法によって精製及び分析を行ない、その結果、全タンパク１３０ＵＧあたり少く
とも０．７ＵＧのＳＬＰＩが示された。それについて、例６に従ってリフォルデ
ィングを行なった。 【０１７２】例８ 癒合ＳＬＰＩ−ＭＦＩ遺伝子（例３Ｅ参照）を含むＥｃｏＲＩ断片を酵母ベク
ターＹＩｐ５のＥｃｏＲＩ部位に、この出願中に参照文献として特別に加えてあ
るＢｏｔｓｔｅｉｎとＲ．Ｗ．ＤａｖｉｓによるＴｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｐ．６０７−
６３６（１９８２）に記述されているようにしてつなぎ、ＹＩｐＳＬＰＩ−１を
生成させ、本出願に特別に参照文献として加えてある、Ｔ．Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅ
ｒらＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：２２８（１９８３
）に記されてあるような位置志向的組み換えによってＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ＢＳ２１４（ＭＡＴ，Ｕｒａ３−５２，ｐｅｐ ４ ｐｒｂｌ）のＵＲＡ３遺伝
子の中に組み込んだ。この株、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＧＹ−１は完全に
活性なＳＬＰＩを培養上澄み中に分泌する。 【０１７３】 ２番目の株、ＳＧＹ−３も活性ＳＬＰＩを生産し、分泌する。この株は複製性
酵母プラスミッドｐＧＳ５８５上にＭＦ１： ：ＳＬＰＩ癒合をもっている
。このプラスミドは、本出願に特別に参照文献として加えた、Ｊ．Ｒ．Ｂｒｏａ
ｃｈ，Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：３０７（１９８３
）によって記述されたように、ｐＪＤＢ２０７から、また本出願中に特別に参照
文献として加えたＤ．ＢｏｔｓｔｅｉｎとＲ．Ｗ．Ｄａｖｉｓ，ｔｈｅ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，
ｐｐ．６０７−６３６に記述されたように、プラスミッドＹ２４から単離された
酵母ＵＲＡ３遺伝子を添加することにより構築され、そしてｐＪＤＢ２０７のＨ
ｉｎｄＩＩＩの切断部位にクローニングを行ない、ｐＧＳ５８５を構築した。 【０１７４】 ＥｃｏＲＩ断片に含まれるＭＦＩ： ：ＳＬＰＩ癒合遺伝子をＥｃｏＲＩ
−ＸｈｏＩアダプター（Ａｍｅｒｓｈａｍ．Ｃａｔ．Ｎｏ．ＤＡ１００７から得
た）を用いて、ｐＧＳ５８５のＳａｌＩ切断位置にクローニングして、ＹＥｐＳ
ＬＰＩ−１を生成した。特別にこの出願に参照文献として加えたＪ．Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ １５３：１６３（１９８３）において、Ｉｔｏらによって記述
された、形質転換によってこのプラスミドをＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＤＢＹ
７４６（ＭＡＴ，Ｕｒａ３−５２，ｌｅｕ２−３，ｈｉｓ３１，ｔｒｐ１−２８ ９）に導入した。 【０１７５】 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株ＳＧＹ−１とＳＧＹ
−３を、特別に本出願中参照文献として取り入れた、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｙｅ
ａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｐ．６２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ（１９８１）に記述された、Ｆ．Ｓｈｅｒｍａｎらの方法に従って、Ｕ
ｒａｃｉｌの欠けているＳＤ培地で、３０℃で定常期迄培養した。細胞を遠心分
離によって培地から除き、培養上澄みを（１）プロテアーゼ阻害活性と、（２）
エライサ法によって、抗−ＳＬＰＩ抗体と特異的に反応する物質の量を測定する
ことによって、ＳＬＰＩの活性について検定した。精製の体系は、本出願におい
て記述された、以前の方法に類似のやり方で展開できる。 【０１７６】 本発明の工程や生産物について、さまざまな改変を行なったり変化を与えたり
することができることは、当業者にとっては明白である。したがって、本発明は
、附帯の請求範囲及びそれらの同等の範囲内にあるならば、その修飾や改変を包
含することを意図するものである。
法に有用なＤＮＡ塩基配列、組換えベクターおよび形質転換宿主細胞に関するも
のである。 本出願は１９８４年１２月６日に出願されたＵ．Ｓ．特許出願連続番号Ｎｏ．
６７８，８２２の一部継続出願である。 【０００２】 【従来の技術】 発明の背景 内生タンパク分解酵素は、侵入する生物体、抗原−抗体複合体と、生体に最早 必要乃至は有用でないある特定の組織タンパクを分解するのに役立つ。正常に機
能している生物体では、タンパク分解酵素は、限られた量だけ生産され、一部は
プロテアーゼのインヒビターの合成を通じて制御されている。 【０００３】 多数の天然に存在するプロテアーゼインヒビターは、その反応を場所的に及び
時間的に制御することによって、内生プロテアーゼを制御している。その上、プ
ロテアーゼインヒビターは、感染及び寄生生物によって身体の中に持ち込まれた
プロテアーゼを阻害することがある。特別にタンパクの加水分解の攻撃や感染を
受け易い組織、例えば、呼吸路の組織はプロテアーゼインヒビターに富んでいる
。 【０００４】 プロテアーゼインヒビターは、ヒト血漿タンパクの約１０％を構成している。
少くとも８種のインヒビターがこの材料源から単離され、文献中にその特性が記
載されている。これらの中には、α2−マクログロブリン（α2Ｍ）、α1−プロ
テアーゼインヒビター（α1ＰＩ）、α1−アンチキモトリプシン（α1Ａｃｈｙ
）、β1−アンチコラゲナーゼ（β1ＡＣ）、及び、インター−α−トリプシンイ
ンヒビター（ＩαＩ）がある。 【０００５】 プロテアーゼ／プロテアーゼインヒビターのバランスの攪乱は、気腫、関節炎
、糸球体腎炎、歯周炎、筋ジストロフィー、腫瘍の侵入及びさまざまな他の病理
的状態を包含するプロテアーゼを媒介とする組織の破壊へと導く。ある状況、例
えば、敗血症とか急性白血病のようなきびしい病理学的進行の場合には、存在す
る遊離のタンパク分解酵素の量は、分泌細胞からの酵素の放出により増加する。
それに加えて、他の状況下では、これとは別に生体の制御的なインヒビターの容
量が減少するため、プロテアーゼ／プロテアーゼインヒビター−バランスの変化
が起きることもある。このような制御的なインヒビターの容量が減少する例は、
α1−プロテアーゼインヒビターの欠損であり、肺気腫の発生と大きく関わり合
っている。 【０００６】 生体にこのような常規を逸脱した状態が存在すると、タンパク分解酵素を制御
するための方策を講じなければ、生体への深刻な傷害が起り得る。したがって、
生体に投与すれば、タンパク分解酵素を制御することが出来るプロテアーゼイン
ヒビターが探し求められてきた。 【０００７】 白血球エラスターゼは、病理学的見地からことのほか興味深いセリンプロテア
ーゼの１つの例である。白血球エラスターゼは、細胞外に放出されると、結合組
織やその他の貴重なタンパクを分解する。正常に機能している生体にとって、あ
る一定量の結合組織や他のタンパクを分解することは必要であるが、過剰の白血
球エラスターゼの存在は、気腫やリューマチ様関節炎のような様々な病理的状態
と関連づけられている。白血球エラスターゼが正常よりも大量に存在する場合、
その効果に抵抗するため、白血球エラスターゼ活性を阻害するプロテアーゼイン
ヒビターが探し求められてきた。精製した形で薬剤として役立つに足る量を、組
み換えＤＮＡ法によって生産できるとしたら、このようなプロテアーゼインヒビ
ターは特別に有用であろう。 【０００８】 文献によると、過去において、少くとも２種の白血球エラスターゼインヒビタ
ーが同定されている。“ヒト多形核白血球の中性プロテアーゼ”（Ｈａｖｅｍａ
ｎｎら（編）ＵｒｂａｎとＳｃｈｗａｒｚｅｎｂｅｒｇ，Ｉｎｃ．（１９７８）
）中の“ヒト粘液性分泌物中の顆粒球中性プロテアーゼの酸に安定なインヒビタ
ー；生化学と可能な生物学的機能”において、Ｓｃｈｉｅｉｓｌｅｒらが記述し
た１つのタンパクがヒトの精液のプラズマ及び痰から単離され、Ｎ末端アミノ酸
としてチロシンを持つ、大きさが１１ｋｄａのタンパクとして特徴づけられた。
このタンパクの文献報告からは、部分的なアミノ酸配列しか提供されていないが
、部分的な配列からさえも、このタンパクは本発明のタンパク類とは実質的に異
なっていることがわかる。このタンパクのアミノ酸配列の報告と、本発明のタン
パクのアミノ酸配列データーから考えると、Ｓｃｈｉｅｓｓｌｅｒらによって配
列が決定されたものは、元来一本鎖のポリペプタイドではないタンパクの分解物
であったかもしれないということが発明者らに示唆される。 【０００９】 １例において、ヒトの血漿から単離された２番目のタンパク、α1−ｐｒｏｔ
ｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒと名付けられた。このタンパクに関する業績は、
ＴｒａｖｉｓとＳａｌｖｅｓｅｎによつて総説、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ
ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ５２：６５５−７０９（１９８３）にまとめら
れている。このタンパクのアミノ酸配列のレポートは、これも本発明のタンパク
から実質的に異なっていることを示している。 【００１０】 本発明の一本鎖ポリペプチドのタンパク類が以前の技術による一本鎖ポリペプ
チドのセリンプロテアーゼインヒビターのいずれとも著しく異なっているから、
以前に研究された、一本鎖ポリペプチドのセリンプロテアーゼインヒビター類は
本発明のタンパク類とは“実質的に相同”ではない。 【００１１】 トリプシンは、病理学的見地から特別興味のあるもう１つのタンパクである。
トリプシンは、膵臓炎のような種々の急性症状のなかで、膵臓のような特定の軟
かい器管の組織の分解を始めることが知られている。これらの症状の治療を目的
として、トリプシンの作用を阻害するだろうと期待されたタンパク類の使用によ
る種々の努力がなされたが、目覚しい成功は得られなかった。このような努力の
実例は、ヒトの膵臓炎の治療に牛の外生トリプシンインヒビターを用いる試みで
ある。このような技術は、ヨーロッパで試みられたが、米国食品医薬品局（ＦＤ
Ａ）によって効果があると認められなかった。 【００１２】 したがって、種々の急性または慢性症状中の、過剰のトリプシンを中和する効
果のあるプロテアーゼインヒビターが必要である。上記で論議した白血球エラス
ダーゼインヒビターの場合にもそうであったように、トリプシンインヒビターは
、もし、組み換えＤＮＡ法によって精製した形で、薬剤として役立てるに足る量
だけ単離製造できれば、ことのほか有用であろう。 カテプシンＧは、白血球に大量に存在するもう１つのプロテアーゼである。カ
テプシンＧは、補足的経路のタンパクをはじめとする種々の価値のあるタンパク をｉｎ ｖｉｔｒｏで分解できることが知られている。膵臓のエラスターゼが、
膵臓炎で役割を果している可能性のあるもう１つのプロテアーゼである。したが
って、これらのプロテアーゼに対する阻害剤も薬剤としての潜在的価値がある。 【００１３】 白血球エラスターゼ、トリプシン、カテプシンＧと膵臓のエラスターゼは、セ
リンプロテアーゼとして知られている一群のプロテアーゼの例であり、共通の構
造と作用機作の要素を持っている。それらの異なる基質に対する活性や、異なる
インヒビターへの活性は、２、３のアミノ酸残基だけが異なっていることから生
ずると信じられている。類推によれば、やはり構造と作用機作の共通の要素を持
っていて、比較的少ないアミノ酸の変化が、異なったプロテアーゼの阻害を結果
として生ずるセリンプロテアーゼインヒビターを想像することが可能であり、し
かも、少くともこの群の１員は、前述の群中のセリンプロテアーゼのすべてを阻
害するであろう。そうであるとすれば、この群のセリンプロテアーゼインヒビタ
ーは、大きな価値があるであろう。 【００１４】 【発明の開示】 驚くべきことに、本発明者達は、このようなセリンプロテアーゼインヒビター
の合成を導き、合成を行なうことができるＤＮＡ配列を発見した。このインヒビ
ターは、耳下腺分泌物から単離されたものと生物学的に等価である。組み換えＤ
ＮＡ法によって作られ、本明細書に記載の本発明のプロテアーゼインヒビターは
、少くとも２箇所の活性部位を持っている。すなわち、白血球エラスターゼ阻害
の性質を示す１つの部位と、トリプシンに対して阻害活性を示す２番目の部位で
ある。 【００１５】 本発明によって生産される組み換えインヒビターは、熱や酸による変性に著し
く抵抗性があり、また様々なタンパク分解酵素によるタンパク分解作用に対して
も抵抗性があると考えられる。この出願に用いられるように“組み換えインヒビ
ター”は、組み換えＤＮＡの方法論と技術によって生産されるプロテアーゼイン
ヒビターのことを指すよう意図されている。さらに、本発明の組み換えインヒビ ターの活性形は、哺乳動物の身体の細胞外の部位で普通に出会うような条件下で
は、熱力学的に安定である。組み換えプロテアーゼインヒビターの変成した形は
また、ジスルフィド結合を形成する能力も持っており、生化学的刺激の存在しな
い状態で活性三次構造をとるのに必要な非共有結合的相互作用を成立させる能力
がある。 【００１６】 より十分に、以下に示す本発明のＤＮＡ塩基配列は、発表されている他の白血
球エラスターゼインヒビターのアミノ酸配列とは大きく異なっているところのタ
ンパクの合成を導き行なう能力がある。したがって、本発明のＤＮＡ塩基配列の
同定によって、本出願の中で明らかにされる。新規の組み換えプロテアーゼイン
ヒビターの製造に関する組換えＤＮＡ法の本発明を可能とした。 このような組換え法は、セリンプロテアーゼ阻害活性を持っている経済的な薬
剤組成物を供給するために、量的にも、純度的にも、阻害剤の製造を可能にする
。さらに、ＤＮＡ塩基配列の同定により、上述のセリンプロテアーゼ阻害剤の類
縁体を製造する組み換えＤＮＡ法の発明を可能にした。 【００１７】発明の要旨 本発明は、プロテアーゼインヒビターの製造に関するものであり、一般、そし
て更に特定的には、ヒト、多形核（ＰＭＮ）−顆粒球プロテアーゼを阻害対象と
した組換えインヒビターの製造に関するものである。特に本発明は白血球エラス
ターゼやトリプシンを始めとするヒト・セリンプロテアーゼに対するインヒビタ
ーの製造のための組換えＤＮＡ法に関するものである。 それに加えて、本発明は、当該セリンプロテアーゼインヒビターの類縁体の製
造に関する組み換えＤＮＡ法にも関連する。本発明はまた、以下に述べるような
組み換えＤＮＡ法において有用な合成並びに天然のＤＮＡ塩基配列に関するもの
である。 【００１８】 セリンプロテアーゼ阻害活性を持つ一本鎖のポリペプチドであるセリンプロテ
アーゼインヒビターの組み換えＤＮＡ合成法を提供することが本発明の目的の一 つである。これらのインヒビターは、ヒトの耳下腺分泌物から単離された天然の
白血球エラスターゼまたはトリプシンインヒビターによって示される活性と生物
学的に同等な活性を持っている。 【００１９】 これらのセリンプロテアーゼインヒビターの代替組み換えＤＮＡ合成を容易に
するために、等価の天然のＤＮＡ塩基配列と同様に、これらの組み換えプロテア
ーゼインヒビターの産生を導き行なうことができる合成ＤＮＡ塩基配列を供給す
ることが、この発明のなおそれ以上の目的である。このような自然のＤＮＡ塩基
配列は、プロテアーゼインヒビターの合成を導き行なうことができる遺伝子が、
そこから単離、同定されうるｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリーから単離され
うる。 【００２０】 さらに、先に検討したプロテアーゼインヒビターの類縁体を製造する組み換え
ＤＮＡ法及びこのような方法に役立つ、相当する類縁ＤＮＡ塩基配列を提供する
ことが本発明の目的である。 なおその他の本発明の目的と利点は、以下に続く記述において一部出てくるで
あろう。そして一部は記述から明白であるか、発明の実施から学ばれることもあ
ろう。その目的と利益は、添付した特許請求の範囲において特に指摘されている
手段と組合せによって了解され、達成されるであろう。 【００２１】 この目的を達成するため、そして本発明の目的に従って、セリンプロテアーゼ
阻害活性を示すところの、活性型で一本鎖ペプタイドのタンパクであるプロテア
ーゼインヒビターの組み換えＤＮＡ方法論による産生を導き行なうことができる
ＤＮＡ塩基配列を発見した。これらの組み換えプロテアーゼインヒビターは、熱
や酸による変性に対して著しく耐性である。さらに、これらのプロテアーゼイン
ヒビターは、キモトトリプシンやマウスの顎下腺プロテアーゼやクロストリパイ
ンのような多くのタンパク分解酵素に接触した後でさえ、それらの生物活性を維
持している。 【００２２】 これらの組み換えセリンプロテアーゼインヒビターの製造を導き行なうために
発見されたＤＮＡ塩基配列の（遺伝暗号鎖）コーディングストランドは以下の通
りである。 【化１３】 【００２３】 上述の略号によって表示されているヌクレオタイドは、提起された具体的態様
に係る詳細な記述において明らかになる。 これらの遺伝子組み換えセリンプロテアーゼインヒビター、特に本発明の分泌
形白血球プロテアーゼインヒビター（ＳＬＰＩ）の製造を導き行なうために発見
した、２番目の好ましいＤＮＡ塩基配列に対するコーディングストランドは以下
の如くである。 【００２４】 【化１４】 【００２５】 さらに目的を達成するため、そして本発明の目的に従って、上述の天然または
合成ＤＮＡ塩基配列を用いて、セリンプロテアーゼインヒビターの微生物におけ
る製造に帰着する組み換えＤＮＡ法を明らかにする。この組み換えＤＮＡ法は以
下の項目を包含する。 （ａ）宿主微生物を導き、セリンプロテアーゼ阻害活性、好ましくは白血球エ
ラスターゼ阻害活性を持つタンパクの製造を行なうことができるＤＮＡ配列の調
製。 （ｂ）宿主微生物の中に導入され、複製することができるＤＮＡ塩基配列をク
ローニングすること。このようなベクターＤＮＡ塩基配列に対するオペレーショ
ナルエレメント（操作要因）を含んでいる。 （ｃ）ＤＮＡ塩基配列とオペレーショナルエレメントを含むベクターをプロテ
アーゼ阻害タンパクを発現することができる宿主微生物の中に移すこと。 （ｄ）ベクターの増幅とインヒビターの発現のため適切な条件下でその微生物
を培養すること。 （ｅ）インヒビターを収穫すること；そして （ｆ）インヒビターがセリンプロテアーゼ阻害活性を有する活性三次構造をと
れるようにすることである。 【００２６】 本発明において使うための天然のＤＮＡ塩基配列の同定単離を容易にするため
、本発明者達はヒト耳下腺組織ｃＤＮＡライブラリーを開発した。このライブラ
リーは、細胞が本発明のセリンプロテアーゼインヒビターを合成するようにしむ
けることができる遺伝情報を含んでいる。ここに述べられた組み換えＤＮＡ法に
用いられることがある他の天然ＤＮＡ塩基配列は、ヒト・ゲノムライブラリーか
ら単離することができる。 【００２７】 本発明の方法において役に立つ合成塩基配列は、ポリヌクレオチドの合成と、
この道の普通の技量を持った人々にとって知られている配列を行なう技術によっ
て作ることができる。先に述べた過程において、有用な天然のＤＮＡ塩基配列は
、以下の項目を含む方法によって同定・単離することができる： （ａ）細胞から、好ましくは耳下腺の細胞からセリンプロテアーゼインヒビタ
ーを誘発させることができるヒトｃＤＮＡライブラリーを調製すること。 【００２８】 （ｂ）プロテアーゼ阻害剤の遺伝子またはそのタンパク生産物に結合すること
ができる少なくとも１つのプローブでヒトＤＮＡライブラリーをプローブするこ
と。 （ｃ）クローンが遺伝子又はそのタンパク生成物に対する、少くとも１つのプ
ローブに結合する能力によって、阻害剤をコードしている遺伝子を含む少なくと
も１つのクローンを同定すること。 （ｄ）同定されたクローンから阻害剤をコードしている遺伝子の単離、そして （ｅ）遺伝子またはそれについての適切な断片を宿主の微生物の遺伝子を維持
し、表現することに必要なオペレーショナルエレメントにつなぐこと。 【００２９】 上述の工程において、有用な天然のＤＮＡ塩基配列も、以下の項目を含む方法
によって同定・単離できる。 （ａ）宿主ｒｅｃ Ａ ｒｅｃ ＢＣ Ｅ．ｃｏｌｉにおいて繁殖させたヒト
・ジェノミックＤＮＡライブラリーを調製すること。 （ｂ）ヒト・ゲノムＤＮＡライブラリーをセリンプロティンインヒビター遺伝
子に結合することができるか、そのタンパク生成物に結合することができる少く
とも１つのブローブでプローブすること。 【００３０】 （ｃ）遺伝子又はそのタンパク産物に対する少くとも１つのプローブに結合す
るクローンの能力によってインヒビターをコードする遺伝子を含む少くとも１つ
のクローンを同定する。 （ｄ）同定されたクローンからインヒビターをコードする遺伝子を単離する。 そして、 （ｅ）遺伝子もしくは適当なその断片を宿主微生物中の遺伝子を維持し発現す
るのに必要なオペレーショナルエレメントにつなぐこと。 【００３１】 さらに、目的を達成するため、そして本発明の目的に従って、セリンプロテア
ーゼインヒビターの医薬として有用な類縁体は上記で詳述した遺伝子組み換えＤ
ＮＡ法により、適切なベクターにクローニングを行なって、適切な宿主微生物に
移した場合、欲しい類縁体の発見を誘導できる遺伝子をつくり出すために、上に
列挙した組み換えＤＮＡ技術を通じて合成的なＤＮＡ塩基配列もしくは天然ＤＮ
Ａ断片を変えることにより生産することができる。 【００３２】 さらに、目的を達成するために、そして本発明の目的に従って、本発明に従っ
た組み換えプロテアーゼインヒビター、もしくは上に述べた、組み換えＤＮＡ法
で生産された生物活性を有するアナログを活性成分として含んでいる薬剤組成物
を明らかにする。 本発明に組み込まれていてこの出願の一部をなしている添付されている図面は
、この発明に役立つ種々のプラスミドを図解し、同時に、本発明の原理を説明す
るのに役立つ記述を含んでいる。 【００３３】 図１は、プラスミドｐＳＧＥ６の地図である。 図２は、プラスミドｐＳＧＥ８の地図である。 図３は、プラスミドｐＧＳ２８５の地図である。 図４は、プラスミドｐＧＳ４８５の地図である。 【００３４】好適態様に関する説明 現在において提出した発明の実施態様について、今、詳細に述べよう。それら
は、あとに続く実施例とともに本発明の原理を説明するのに役に立つ。 上記したように、本発明は精製した形で単離されたプロテアーゼインヒビター
に関するものである。望ましくは、本発明のセリンプロテアーゼインヒビターは
、一本鎖ポリペプチドタンパクであり、ヒト・耳下腺分泌物から単離された天然
のセリンプロテアーゼインヒビターと実質的に同族であるかもっとも好ましくは
生物学的に等価である。 【００３５】 本明細書および請求範囲を通じて使われている“生物学的に等価”とは、組成
物は、プロテアーゼによって誘起された、同じ型の組織の損傷を防ぐことができ
るが、必ずしも天然プロテアーゼインヒビターと同程度ではないということであ
る。あとに続く明細書の記載および請求の範囲を通じて使用されている“実質的
に相同”とは、天然の耳下腺インヒビターに対して以前に報告されている一本鎖
ペプタイドセリンプロテアーゼインヒビターによって示された相同性以上の相同
性のことである。好ましくは、相同性の程度が４０％より大きく、最も好ましく
は５０％より大きく、特別に好ましい群のタンパクは天然耳下腺インヒビターと
の相同性が６０％より大きい。上に記述したような百分率の相同性は、２つの配
列のうちの小さい方に見出された成分の百分率として計算されており、２つの配
列のうちの大きい方でも、同じことがみつかるかもしれない。この成分は４つの
続いたアミノ酸の配列として理解されているものである。 【００３６】 本発明の組み換え法によって製造される好ましいプロテアーゼインヒビターは
、Ｒｏｂｅｒｔ Ｃ．Ｔｏｍｐｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．の“セリンプロテアーゼイ
ンヒビターと同じものを単離する方法”と題して、１９８４年１２月６日に提出
した米国特許出願連続番号Ｎｏ．６７８，８２３及びこの出願と同日付けで出願 された、Ｒｏｂｅｒｔ Ｃ．Ｔｏｍｐｓｏｎらの“セリンプロテアーゼ阻害剤と
同じものを単離する方法”と題する米国特許出願連続番号Ｎｏ．
に記述されている。 【００３７】 このようなプロテアーゼインヒビターは、熱や酸による変性に対し、著しく耐
性であり、又、キモトリプシン、マウス顎下腺プロテアーゼ、クロストリパイン
をはじめとする、多くのタンパク分解酵素に接触した場合、活性喪失に対し抵抗
性である。これらのインヒビターは、必要なジスルフィド結合を形成する能力を
持ち、生化学的刺激の存在しないところで、プロテアーゼインヒビター活性を表
わすことができる３次構造をとるべく適切な非共有結合的相互作用を受ける。あ
るいは、ジスルフィド結合が切れて非共有結合的相互作用が破壊されてもこのよ
うな結合を再生し、相互作用を取戻し、生化学的刺激のないところで、このよう
な活性３次構造を再びとることができる。 【００３８】 これらの特性を持っている好ましいセリンプロテアーゼインヒビターのアミノ
酸の配列を検討し、その配列を以下の如く決定した。 【化１５】 【００３９】 上記の略号は、ポリペプチド中の下記のとおりにアミノ酸残基に対応する。 アミノ酸 略 号 アラニン Ａｌａ バリン Ｖａｌ ロイシン Ｌｅｕ イソロイシン Ｉｌｅ プロリン Ｐｒｏ フェニールアラニン Ｐｈｅ トリプトファン Ｔｒｐ メチオニン Ｍｅｔ グリシン Ｇｌｙ セリン Ｓｅｒ スレオニン Ｔｈｒ 【００４０】 アミノ酸 略 号 システィン Ｃｙｓ チロシン Ｔｙｒ アスパラギン Ａｓｎ グルタミン Ｇｌｎ アスパラギン酸 Ａｓｐ グルタミン酸 Ｇｌｕ リジン Ｌｙｓ アルギニン Ａｒｇ ヒスチジン Ｈｉｓ 【００４１】 本発明により明らかにされた組み換えＤＮＡ法によって製造されるこれらのプ
ロテアーゼインヒビターは１つ以上の区別できるドメインを持っていることが発
見された。１つ以上の区別できるドメインとは、そのタンパクが異なる酵素に対
して機能する複数の活性部位を持っているということである。これらの場所の存
在と位置づけは、プロテアーゼインヒビターの少くとも２つの部分の間には、実 質的な相同性があることが発見されたことによって決定された。区別できるドメ
インの存在が、本発明のプロテアーゼインヒビターに対して白血球エラスターゼ
もトリプシンも含む広い範囲のセリンプロテアーゼを阻害する能力を与えている
と考えられる。 【００４２】 さらに、これらプロテアーゼインヒビターのはっきりしたドメインの複数性の
ために、プロテアーゼインヒビターが附加的特性をもつプロテアーゼインヒビタ
ーをつくるために、さまざまな他の活性部位がその上に構築されるような枠組み
として役立つかもしれないということが注目された。本発明の好適態様では、白
血球エラスターゼ、カテプシンＧ、膵臓のエラスターゼとトリプシンを阻害する
プロテアーゼインヒビターの産生が含まれている。これらの酵素はすべて共通の
メカニズムと多くの構造的特徴を共有しているセリンプロテアーゼとして知られ
ているプロテアーゼのクラスのメンバーである。 【００４３】 本発明によって生産されたプロテアーゼインヒビターにおいて、小数のアミノ
酸側鎖を細工することによってインヒビターの複合性が創り出され、各々が全体
のクラスのセリンプロテアーゼの少くとも１員を阻害することができると考えら
れる。その上、このような側鎖の修飾は、上に述べたような特定のセリンプロテ
アーゼのクラスのメンバーに関して阻害活性が改善されている複合性のインヒビ
ターを産生することが期待できる。 【００４４】 これらの目標を達成するのに必要なアミノ酸の側鎖の変化は、本発明によって
生産された好ましいインヒビターとこのインヒビターの重要な機能部分がＸ−線
結晶学によって解明された他のセリンプロテアーゼ阻害剤の間の構造類似性の特
定の要素によって示唆される。構造的類似性のこれらの要素は上述の本発明によ
って製造された好ましいセリンプロテアーゼインヒビターのアミノ酸１７から２
９及び７０から８３を含んでいる。量的か質的かのいずれかにおいて、トリプシ
ン様セリンプロテアーゼインヒビターの活性を改良するために示唆された変化は
、２０番目のアミノ酸をＡｒｇからＰｈｅ、ＴｙｒあるいはＴｒｐ、７２あるい は７４番目のアミノ酸をＬｅｕから、ＬｙｓまたはＡｒｇ、そして７３番目のア
ミノ酸をＭｅｔからＬｙｓまたはＡｒｇへ変換することの１つもしくはそれ以上
を含んでいる。 【００４５】 カテプシンＧをはじめとするキモトリプシン様セリンプロテアーゼに対する活
性を、量的又は質的に改善するべく示唆された変化は、アミノ酸２０をＡｒｇか
らＰｈｅ、ＴｙｒまたはＴｒｐへ、アミノ酸７２または７４をＬｅｕからＰｈｅ
、ＴｙｒまたはＴｒｐへ、そしてアミノ酸７３をＭｅｔからＰｈｅ、Ｔｙｒもし
くはＴｒｐへ変換することを、１つもしくはそれ以上行なうことを含んでいる。 【００４６】 膵臓のエラスターゼ様セリンプロテアーゼに対する阻害活性を、量的もしくは
質的に変えるべく示唆された変化は、アミノ酸２０をＡｒｇからＡａｌへ、７２
または７４番目のアミノ酸をＬｅｕからＡｌａへ、そして７３番目のアミノ酸を
ＭｅｔからＡｌａへ変換することの１つ又はそれ以上を含んでいる。 本発明の実施にあたっては、本発明のタンパクに新しいプロテアーゼ阻害活性
を付与するためのアミノ酸の変更が、白血球エラスターゼもしくはトリプシンに
対するインヒビターの活性を破壊するかもしれないということに心にとめておか
ねばならない。このような効果は本発明の教示に従って行なわれる型通りの実験
によって決定されよう。 【００４７】 さらに、上に提出されたように、特定のアミノ酸もしくは特定のアミノ酸の配
列を置換すると、一方では強化されないドメインの活性を幾分か犠牲にすること
になるが、本発明のプロテアーゼインヒビターの白血球エラスターゼもしくは、
トリプシン阻害活性のいずれかを増強するかもしれないということが考えられる
。事実：阻害タンパクの中のどの領域の活性も、適切なアミノ酸置換によって完
全に除去され、その際、それに対して通常そのタンパクが活性がある１つか、も
しくはいくつかの酵素のサブセットに対して、特異性のあるタンパクをつくるか
もしれない。 【００４８】 例えば、７３位置のＭｅｔに対し、Ｇｌｙを置換するか、もしくは、７２か、
７４の位置のＬｅｕに対してＧｌｙを置換すると、白血球エラスターゼ阻害ドメ
インを不活性化するが、２０の位置のＡｒｇに対しＧｌｙを置換するとトリプシ
ン阻害ドメインを不活性化する。これらドメインはまた、各々が望ましい阻害機
能を保持する、別々のタンパクに分けることもできる。本発明の請求範囲は、こ
れらの手段によるこのようなインヒビターを産生する他の工程に対しても拡張さ
れる。 本発明者らは、前記で議論したプロテアーゼインヒビターの細胞内生産を導き
行なうことができる合成的ＤＮＡ塩基配列を発見した。この塩基配列は、次のよ
うな構造をもっている： 【００４９】 【化１６】 【００５０】 この中で、ヌクレオチドは、下記のとおりの略号で表されている： ヌクレオチド 略 号 デオキシアデニル酸 Ａ デオキシグアニル酸 Ｇ デオキシシチジル酸 Ｃ チミジル酸 Ｔ 本発明者らは、前記で議論したプロテアーゼインヒビター、とりわけ、上述の
分泌性白血球プロテアーゼインヒビター（ＳＬＰＩ）の細胞外産生を導き行なう
ことができる２番目の好ましい合成ＤＮＡ塩基配列を発見した。この塩基配列は
次のような構成をもっている： 【００５１】 【化１７】 【００５２】 上記で注意したように、本プロテアーゼインヒビターの複合的ドメイン構造の ため、上に議論したようなセリンプロテアーゼインヒビターの類縁体生産を導く
ことができるＤＮＡ配列を結果として生ずる、ここに提出する合成的ＤＮＡ配列
に変化を与えることが考えられる。 特に本発明に従って組み換えＤＮＡ技術によって生産されたセリンプロテアー
ゼインヒビターの好ましい類縁体は、次のアミノ酸配列をもっている： 【００５３】 【化１８】 ここで Ｒ1とＲ7は同一か、異なったものであり、置換もしくは無置換のアミノ酸残基
もしくはその誘導体からなる群から選ばれ；そして Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ8及びＲ9は同一か異なったものであり、メチオ
ニン、バリン、アラニン、フェニールアラニン、チロシン、トリプトファン、リ
ジン、グリシン及びアルギニンからなる群から選ばれる。 【００５４】 上記のＤＮＡ塩基配列は、本発明の好ましい具体例を表していることに留意す
べきである。ジェネティックコードの縮重のためにヌクレオチドの多数の選択、
当該プロテアーゼインヒビター、もしくはその類縁体の生産を導き、行なうこと
ができるＤＮＡ塩基配列に導く多数のヌクレオチドの選択がなされうるというこ
とが理解されるべきである。上記した塩基配列に対し、機能的に同等であるＤＮ Ａ塩基配列もしくは上に提出したアミノ酸配列に従って生産されたプロテアーゼ
インヒビターの類縁体の産生を導き行なうであろうところの配列に機能的に等価
である配列は、それ自体で本発明の中に包含されるものとする。 【００５５】 以下の図式は、縮重した遺伝暗号の結果として考えられるコドンの置換の例と
して、上記に数え上げた好ましいアミノ酸配列の製造のための本発明の範囲に含
めることを意図した追加のＤＮＡ配列である。このタンパクの生産に対する等価
ＤＮＡ塩基配列を決定するための例を辿ることによって、当業者ならば、好まし
いアミノ酸配列の類縁体の生産のための等価なＤＮＡ塩基配列も決定できる。 【００５６】 【化１９】 【００５７】 上記の配列において、使用されている略号は下記のヌクレオチドを表わすもの
である： ヌクレオチド 略 号 Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔ Ｎ Ａ，Ｇ Ｐ Ｃ，Ｔ Ｑ 【００５８】 直前に挙げたものを含め、本発明の合成ＤＮＡ塩基配列において用いられる遺
伝暗号を選択する場合に、特定のアミノ酸を指示するのに用いられる遺伝暗号は
高度に発現されるタンパクと関連するものであることが望ましい。これらの望ま
しい遺伝暗号は１部Ｇｒａｎｔｈａｎ，Ｒ ｅｔ ａｌ．らの“Ｃｏｄｏｎ Ｃ
ａｔａｌｏｇ Ｕｓａｇｅ Ｉｓ ａ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｔｒａｔｅｇｙ Ｍｏ
ｄｕｌａｔｅｄ Ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｖｉｔｙ”は、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９：ｒ４３（１９８１）に出ている。
本発明の好ましいＤＮＡ配列は、縮重した配列のいずれに対しても、Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの配列遺伝暗号を選択することによって選ばれた。 【００５９】 さらに、本発明のプロテアーゼインヒビターの類縁体の産生を導き行なうこと
が出来る追加の合成ＤＮＡ塩基配列をつくり上げるための合成ＤＮＡ塩基配列の
変換を容易にする遺伝暗号を選ぶことが望ましい。特に、もし可能なら、制限酵
素、エンドヌクレアーゼの切断位置を、追加の遺伝暗号を挿入することが望まし
い合成ＤＮＡの位置の近くに、もしくは類縁体か作られるように遺伝暗号を取り
換えることが望ましい位置に、もってくることができるようにヌクレオチド配列
を選ぶことが望ましい。本発明のＤＮＡ配列の望ましい実施態様においては、制
限酵素の切断位置が上に示したヌクレオチド配列の下に示してある。 【００６０】 本発明において考えられている合成ＤＮＡ配列をつくり出す方法は、一般的に
、最近の報告によって導かれたこの道の普通のわざの１つによって遂行される型
通りの業務の範囲内にある。本発明において明らかにした合成ＤＮＡ塩基配列を 得るために用いられる適切な方法の例は、Ｍａｔｔｅａｃｃｉ，Ｍ，Ｄ，とＣａ
ｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｊ．ＡＭ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５（
１９８１）及び、Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．とＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．
，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２２；１８５９（１９８１）、によって
提出されており、両方とも、特別に参照事項としてこの中に組み込まれている。 本発明の別の実施態様において、１つのＤＮＡ塩基配列が、本発明の望ましい
分泌白血球プロテアーゼインヒビター（ＳＬＰＩ）をコードするヒト・ジェノミ
ックライブラリーから単離された。この４番目の遺伝暗号からコードされ、現在
発明者らに知られているイントロン（介在配列）を含むこの塩基配列は以下の通
りである： 【００６１】 【化２０】 【００６２】 【化２１】 【００６３】 【化２２】 【００６４】 これらの配列において使用されているアミノ酸残基を表わす１文字の略号は慣
用のものであり、例えば、Ａ．Ｌ．ＬｅｈｎｉｎｇｅｒによるＢｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ 第２版、Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ（１９７６）７２頁に出ている。 この塩基配列とここに含まれるアミノ酸配列データーを用いて、上のゲノム配
列に加えられた場合、全プロテアーゼインヒビター剤をコードする遺伝子に到達
する合成ＤＮＡ配列が構築できる。そのかわりに、上に示したＤＮＡ塩基配列を
用いてプローブを作り、最初の３つのアミノ酸に対するコドンを持っている、ヒ
トゲノムライブラリーから、ＤＮＡ断片を回収するのに用いた。 【００６５】 このようなプローブは、それに加えて適切なリーダー配列を含むヒトゲノム配
列を同定するのに用いられる。このリーダー配列、または、どの他の適切なリー
ダー配列も、ＤＮＡゲノム配列と併用して、哺乳動物の発現システムに用いられ
ると考えられる。 本発明のもう１つの別法としての具体的態様において、本発明の好ましい分泌
性白血球プロテアーゼインヒビターの細胞内生産を導き、行なうことができるＤ
ＮＡ配列をコードする耳下腺ライブラリーからｃＤＮＡクローンを単離した。こ
のクローンはＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． の下に、Ｒｏｃｋｖ
ｉｌｌｅ，ＭａｒｙｌａｎｄのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されている。 【００６６】 セリンプロテアーゼ阻害活性を有する少なくとも１つの活性部位をもつ１本鎖
ポリペプタイドから構成されている１つのプロテアーゼインヒビターの製造に対
する組み換えＤＮＡ法が明らかとなった。本発明の態様の１つにおいて、この活
性部位は、ヒト・耳下腺分泌物から単離された天然の白血球エラスターゼインヒ
ビターの活性部位と生物学的に等価な方法で機能する。天然又は合成ＤＮＡ塩基
配列は、プロテアーゼインヒビターの直接生産に用いることができる。 【００６７】 この方法は、以下の工程を含む： （ａ）宿主微生物が、セリンプロテアーゼインヒビター活性をもっているタン
パクを生産するよう導くＤＮＡ塩基配列の調製。 （ｂ）ＤＮＡ塩基配列を宿主に移し増殖することができるベクターにそのＤＮ
Ａ塩基配列をクローニングすること。このようなベクターは、そのＤＮＡ塩基配
列に対してオペレーショナルエレメントを含んでいる。 （ｃ）合成ＤＮＡ塩基配列とオペレーショナルエレメントを含むベクターをプ
ロテアーゼインヒビターを発現することができる宿主微生物に移す。 （ｄ）その微生物をベクターの増殖とインヒビターの発現に適切な条件下で培
養すること。 （ｅ）インヒビターを収穫すること。そして、 （ｆ）インヒビターがセリンプロテアーゼ阻害活性を持つ、活性３次構造をと
れるようにすること。 【００６８】 この方法における使用のために考えられた合成ＤＮＡ塩基配列が、上に詳細に
検討された。別の実施態様において、この方法で天然のＤＮＡ塩基配列も使うこ
とができるということが更に考えられる。これらの配列には、ｃＤＮＡもしくは
ゲノムＤＮＡ断片が用いられる。この実施態様のより好ましい変形として天然の
ＤＮＡ配列は、以下の項目を含む方法によって得られる。 （ａ）セリンプロテアーゼインヒビターを産生できる細胞、さらに望ましくは
、耳下腺の細胞からヒトのｃＤＮＡライブラリーを調製する。 【００６９】 （ｂ）プロテアーゼインヒビター遺伝子もしくはそのタンパク産物に結合する
ことができる少くとも１つのプローブで、ヒトＤＮＡライブラリーを検索する。 （ｃ）そのクローンが遺伝子もしくはそのタンパク産物に対する、少くとも１
つのプローブと結合する能力によってインヒビターをコードする遺伝子を含む少
くとも１つのクローンを同定する。 （ｄ）選ばれた単一クローンもしくは複数のクローンからインヒビターをコー
ドする遺伝子の単離。 （ｅ）遺伝子もしくはその適切な断片を宿主微生物中の遺伝子を維持し、発現
するために必要なオペレーショナルエレメントにつなげること。 【００７０】 前出の方法において、有用な天然のＤＮＡ塩基配列もまた以下の工程を経て同
定単離できる： （ａ）より好ましくは、宿主ｒｅｃ Ａ ｒｅｃ ＢＣ Ｅ．ｃｏｌｉ中で繁
殖させたヒト・ジェノミックライブラリーを作る。 （ｄ）ヒトジェノミックライブラリーをセリンプロテインインヒビター遺伝子
、もしくは、その生産物に結合することができる少なくとも１つのプローブを用
いて検索する。 【００７１】 （ｃ）そのクローンが遺伝子またはタンパク産物に対する少なくとも１つのプ
ローブに結合するクローンの能力によってインヒビターをコードする遺伝子を含
む少くとも１つのクローンを同定する。 （ｄ）同定されたクローンからのインヒビターをコードする遺伝子を単離する
。 （ｅ）遺伝子もしくはその適当なフラグメントを宿主微生物中の遺伝子を維持
し、表現するのに必要なオペレーショナルエレメントにつなげること。 【００７２】 上記に挙げた方法を用いるのに、適切な天然のＤＮＡ遺伝子を単離するにあた
り、適当な遺伝子の両端部分、すなわち遺伝子の断面の内側または最も近い部分
に位置している２つの制限酵素切断部位を同定することがより好ましい。適切な
遺伝子を含むＤＮＡ断片を次に適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて、ゲノム
物質の残りから除去する。切り出した後、セリンプロテアーゼインヒビタータン
パクのＮ−及びＣ−末端にコードすることができ、またそのＤＮＡ配列をそのオ
ペレーショナルエレメントに融合させることができるように、ＤＮＡ配列の３′
及び５′末端は再構築される。 【００７３】 本発明における、使用のため考えられるベクターは、優先されるか、もしくは 、必要となるオペレーショナルエレメントとともに、前記で検討したようなＤＮ
Ａ塩基配列が挿入され、又そのベクターが、その後宿主微生物に移され、その微
生物中で複製出来るような、ベクターすべてを含む。より好ましいベクターは、
その制限酵素切断部位がよく報告されていて、ＤＮＡ塩基配列の転写に、より好
まれるか、もしくは必要である、オペレーショナルエレメントを含んでいるよう
なベクターである。 【００７４】 本明細書に記載のオペレーショナルエレメントの用語には、少なくとも１つの
プロモーター、少くとも１つのオペレーター、少くとも１つのリーダー配列、少
くとも１つのシャイン−ダルガーノ配列、少くとも１つの停止コドン及びベクタ
ーＤＮＡの適切な転写とその次の翻訳に必要か、より好ましい他のＤＮＡのすべ
てが含まれる。特に、このようなベクターは、少くとも１つの選択可能なマーカ
ーとともに、宿主微生物によって認識される複製の少くとも１つの起点、及び合
成ＤＮＡの塩基配列の転写を始めることが出来る少くとも１つのプロモーター塩
基配列を含んでいると予測されている。ある実施態様においては、ベクターは、
レギュレーターとして機能することができるあるＤＮＡを含み、レギュレーター
プロテインをコードすることができる他のＤＮＡ塩基配列を含んでいることが、
さらに、より好ましい。 【００７５】 これらのレギュレーターは、１つの実施態様においては、ある環境条件の存在
下でＤＮＡ配列の発現を防ぐのに役立ち、他の環境条件では転写と、続いて起る
合成ＤＮＡ塩基配列によってコードされたタンパクの発現が行なわれる。とりわ
け、例えば、イソプロピルチオー−ｄ−ガラクトシッドが存在しないと、合成Ｄ
ＮＡの発現が起らないようなベクターのなかには調節断片が挿入されることがよ
り好ましい。この状況下では、合成ＤＮＡを含む形質転換した微生物は、プロテ
アーゼインヒビターの発現がはじまる以前にある望ましい密度まで育てられるか
もしれない。この実施態様においては、望ましいプロテアーゼインヒビターの発
現は、望ましい密度が達された後にＤＮＡ塩基配列の発現を起すことができるあ
る物質を微生物の環境に加えることにより誘導される。 【００７６】 それに加えて、ベクター中か、もしくは合成ＤＮＡ配列の５′末端に、適切な
分泌リーダー配列が存在することがより望ましい。リーダー配列は、リーダー配
列がプロテアーゼインヒビターの発現を導くことができるヌクレオチド配列のは
じめの部分に、翻訳停止シグナルを間にはさまずに、すぐに隣りあっていること
ができるような位置にある。リーダー配列の存在は、一部には以下の理由のうち
１つかそれ以上の理由から、望まれる：１）リーダーインヒビターが存在すると
、宿主が初期の生産物を成熟した組み換えプロテアーゼインヒビターに仕上げる
ことを容易にするかもしれないこいと；２）リーダー配列の存在は、プロテアー
ゼインヒビターを細胞質の外へ導くことにより、組み換えプロテアーゼインヒビ
ターの精製を容易にするかもしれないこと。３）リーダー配列の存在は、組み換
えプロテアーゼインヒビターが、プロテアーゼインヒビターを細胞質の外へ導く
ことを通じてその活性構造へ組み込まれる能力に影響を与えるかもしれないこと
。 【００７７】 とりわけ、リーダー配列は、最初の産物をリーダーペプチダーゼによって、リ
ーダー配列を除去し、セリンプロテアーゼ阻害活性の潜在力をもつより好ましい
ポリペプタイドを残すため、初期の翻訳産物の開裂を導く。宿主微生物のある種
においては、適切なリーダー配列の存在によりＥｓｃｈｅｒｌｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉの場合のように完成したタンパクを細胞周辺腔に輸送できるようにする。あ
る酵母や、ＢａｃｉｌｌｉやＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの場合には、適切なリーダ
ー配列は、タンパク細胞膜を通って細胞外の培地への輸送ができるようにする。
この状況では、目的のタンパクは、細胞外タンパクから精製できる。 【００７８】 ３番目に、本発明によって調製されるプロテアーゼインヒビターの中のあるも
のの場合には、完成されたタンパクを適切なエラスターゼ阻害剤活性をもつ活性
性構造をとるように組み込まれる環境のなかに位置させることに、リーダー配列
の存在が必要である。 それ以上のオペレーショナルエレメントには、そればかりではないが、リボゾ ーム結合部位と余所者タンパクの微生物発現のために必要な他のＤＮＡ配列がふ
くまれる。 【００７９】 本発明のより好ましい態様においては、GAGGCGCAAAAA(ATG)の配列がリボゾー
ム結合部位として用いられるであろう。この中で検討された、オペレーショナル
エレメントは、以前の文献や、ここに含まれている教訓に照らしてバイオテクノ
ロジーの普通の技能をもった人々によって型通りに選ばれる。これらのオペレー
ショナルエレメントの一般的例は、Ｂ．Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｗｉｌｅｙ
＆ Ｓｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８３）に出ており、これはこの中に参照に
よって特別に折り込まれている。この中で考察されているようなベクターは、一
部はプラスミッドｐＢＲ３２２そして／又はｐＩＱの部分から組立てられる。 【００８０】 本発明のより好ましい実施態様において、プロテアーゼインヒビターをコード
する合成ＤＮＡ配列のすぐ前に、さらにあらたなＤＮＡ配列が位置している。こ
の追加のＤＮＡ配列は、翻訳カップラーとして機能することができる。即ち、そ
れはリボゾームをそれが隣り合って並んでいるプロテアーゼインヒビターＲＮＡ
のリボゾーム結合部位のすぐ隣りにリボゾームを位置させるのに役立つＲＮＡを
コードしているＤＮＡの配列である。本発明の１つの実施態様において、翻訳カ
ップラーは、ＤＮＡ配列TAACGAGGCGCAAAAAATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCGGAGTGTAAG
AAATG を使用し、翻訳カップラーに関連したその道の普通のわざをもった人々に
とって現在知られている方法を使って導き出すことができる。２番目の好ましい
翻訳カップラーはTAACGAGGCGCAAAAAATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCAAGGAGAAATAAATG.
のＤＮＡ配列をもっている。 【００８１】 前記したベクターの、すべての必要なそして望ましい成分要素の合成と単離が
できたところで、ベクターはその道の普通の技能をもつ人々に一般に知られてい
る方法によって組立てられる。このようなベクターの組立ては、その道の普通の
技能をもった人々によって遂行される義務的職務の範囲内にあると信じられてお
り、そしてそれ自体、特別むずかしい実験をしなくても遂行できる。例えば、参 照として特別に本出願に加えたＳｈｏｎｅｒらＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔ
ｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．
Ａ．，８１；５４０３−５４０７（１９８４）、において、明らかにされている
ように、類似のＤＮＡ配列が適切なクローニングベクターにつなげられている。 【００８２】 本発明のクローニングベクターの構築において、合成ＤＮＡ配列の多重コピー
とその付随のオペレーショナルエレメントが各ベクターに挿入されるかもしれな
いということが、つけ加えて注目されるべきである。このような実施態様におい
ては、宿主生物は、望まれるプロテアーゼのベクターあたりのより大きな量を生
産するであろう。ベクターの中に挿入され得るＤＮＡ配列の複数のコピーの数は
、結果としてできたベクターは、その大きさのため、適切な宿主微生物に移され
たり、その中で複製したり転写されたりする能力によってのみ制限を受ける。 【００８３】 さらにつけ加えて、ベクターが、薬剤抵抗性マーカーや宿主微生物による特性
の発現の原因となる他のマーカーのような選択可能なマーカーを含んでいること
がより望ましい。本発明の特に望ましい実施態様において、テトラサイクリン抵
抗性に対する遺伝子がクローニングベクターに優先的に含まれている。 【００８４】 このような薬剤抵抗性や他の選択可能なマーカーは、部分的にトランスフォー
マントの選択を容易にすることを意図している。それに加えて、クローニングベ
クターの上の、このような選択可能なマーカーの存在は、混入した微生物が培地
中で増殖するのを防ぐのに役立つかもしれない。この実施態様において、この形
質転換した宿主微生物の純粋な培養は、生き残るのに誘導した表現型を必要とす
る条件下で微生物を培養することによって得られるであろう。 【００８５】 このようにして得られたベクターは、次に適切な宿主微生物に移される。外生
のＤＮＡを取り込んで、それらの遺伝子や付随するオペレーショナルエレメント
を発現する能力を持った微生物はすべて選ばれてよいと信じられている。宿主微
生物は、通性嫌気性または好気性菌であることがより望ましい。この方法におけ る使用に好ましい特別な宿主は、酵母と細菌である。特定の酵母は、Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ層の酵母であり、特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｖｉｓｉａｅである。特別の細菌は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ層、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ層及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ層の細菌、特に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉである。 【００８６】 宿主微生物が選ばれた後、ベクターはその道の普通の技能をもつ人々によって
、一般的に知られている方法を用いて宿主微生物に移される。このような方法の
例は、Ｒ．Ｗ．Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，“細菌の遺伝の進歩”、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）に見出される。これは、特別に参照として
この中にとり込まれている。上に述べたようなオペレーショナルエレメントの使
用を通じて、温度調節が、遺伝子発現を調節する手段として考えられるので、１
つの実施態様において形質転換が低温で起ることがより好ましい。もう１つの実
施態様において、滲透のレギュレーターがベクターに挿入されたならば、形質転
換を通じての塩の濃度の調節が、合成遺伝子の適切なコントロールを確保するた
めに必要となるであろう。 【００８７】 組み換えセリンプロテアーゼインヒビターが終局的に酵母中で発現される場合
を考えると、クローニングベクターを、まずＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
に最初に移すことがより望ましい。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、ベクターに増殖を行
なわせ、倍増してから取り出し精製する。ベクターは、次にセリンプロテアーゼ
インヒビターの究極的表現のために酵母の中に移されるであろう。 【００８８】 宿主微生物は、セリンプロテアーゼインヒビターの発現に対して適切な条件下
で培養される。これらの条件は、一般に宿主微生物にとって特異的であり、例え
ば、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，８ｔｈ Ｅｄ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉ
ｎｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄのような微生物 のための生育条件に関する出版された文献に照らして、この道の普通の技能をも
った人々によって容易に決められる。この文献は参照としてここに特別に組み込
まれている。 【００８９】 ベクターの中に挿入された、又は存在するオペレーショナルエレメントすべて
に応じて、ＤＮＡ配列の表現の調節に必要な条件は、すべて形質転換と培養の段
階で効果をもつであろう。１つの実施態様においては、細胞はＤＮＡ配列の発現
を阻害する適切な調節条件において、高密度迄育てられる。最適の細胞密度に近
づいたとき、環境条件は、合成ＤＮＡ配列の発現に対して適切な条件に変えられ
る。このようにして、プロテアーゼインヒビターの生産条件は、宿主の細胞がほ
ぼ最適密度に近づいたあとの時期で起り、そして結果として生ずるプロテアーゼ
インヒビターは、その発現に必要な調節条件が誘起された後、しばらくしてから
収穫されると考えられる。 【００９０】 本発明のより望ましい実施態様において、組み換えプロテアーゼインヒビター
は、収穫の後、そしてその活性構造をとる以前に精製される。本発明者は、リフ
ォルディング済みのタンパクの高収率回収は、タンパクが先ず精製される場合に
、容易に得られると信じているので、この実施態様がより望ましい。しかし、１
つのより好ましい別の実施態様においては、プロテアーゼインヒビターは、その
活性構造をとるべく、リフォルディングするのにまかせてから精製することがあ
る。さらにもう１つのより好ましい代りの実施態様においては、プロテアーゼイ
ンヒビターは、培養液から回収するとき、リフォルディングの済んだ活性な状態
で存在している。 【００９１】 ある条件では、プロテアーゼインヒビターは、宿主微生物での発現、次いでそ
のタンパクの細胞壁を通過しての輸送又は膜を通って細胞周辺腔への輸送の際に
、そのしかるべき活性な構造をとっている。これは、一般的に適切なリーダー配
列をコードするＤＮＡが、組み換えタンパク質をコードするＤＮＡにつながって
いると起る。プロテアーゼインヒビターが、その適切な活性構造をとらない場合 は、形成したどのジスルフィド結合も、そして／または、どの生じた非共有結合
的相互作用も、変性試薬や還元試薬、例えば、グアニジウムクロライド、−メル
カプトエタノールによって先ず破壊してから、プロテアーゼインヒビターをコン
トロールした条件においての希釈及びこれらの試薬の酸化に続いてその活性構造
がとれるようにする。 【００９２】 【実施例】 本発明の教示を特定の問題や環境に応用することは、ここに含まれた知見に照
らして、この道の普通の技能をもった人の能力の範囲内にあるということが理解
されるべきである。本発明の生産物とそれらの単離、製造に対する代表的工程が
以下の例にみられる。 例１ 上記のアミノ酸配列、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉの高度に発現性の遺
伝子におけるコドンの使用、及び便利な制限エンドヌクレアーゼの開裂部位に基
いて、以下のＤＮＡ配列が提案された： 【００９３】 【化２３】 【００９４】 タンパク質をＥ．ｃｏｌｉのペリプラズムに輸送するのに適した形で、プロテ
インの発現を調節するため、以下の調節要素が提案された。即ち、高いレベルに
おける転写の開始の開始のためのｔａｃプロモーター；転写の制御のためのｌａ
ｃオペレーター：プラスミドの他の場所でコードされるべきｌａｃリプレッサー
（ｌａｃＩq）；高いレベルで翻訳をはじめるＯｍｐＡシャイン−ダルガーノ配
列；産物のペリプラズムへの輸送を容易にするＯｍｐＡリーダー、これらのオペ レーターエレメントによってコードされるタンパクと最初の産物の開裂を指示し
、成熟した白血球エラスターゼ阻害剤を生ずる上述の構造遺伝子によってコード
されるタンパクとの間のＡｌａ−Ｓｅｒ連結のＡｌａである。 【００９５】 これらの特徴はすべて、以下のＤＮＡ配列のなかに組みこまれている： 【化２４】 【００９６】 タンパクがＥ．ｃｏｌｉの細胞質内にとどまるような形でタンパクの発現を調
節するために、以下のオペレーショナルエレメントが提供される。即ち、ｔａｃ
プロモーター：ｌａｃオペレーター、そしてｌａｃリプレッサー（ｌａｃＩq）
；シャイン−ダルガーノ配列のコンセンサス；そして翻訳の高いレベルを開始す
るため、翻訳カップラーとして用いられるべきＯｍｐＡリーダーペプタイドの断
片である。翻訳カップリング配列はＯｍｐＡ遺伝子の翻訳の開始領域、ＯｍｐＡ
リーダーペプタイドの最初の８箇のアミノ酸は、上述のシャイン−ダルガーノ配
列認識及び翻訳停止を行なう配列をコードするＤＮＡを含む。翻訳カップリング
配列はプロモーターとセリンプロテアーゼインヒビター遺伝子の翻訳開始部位の
間に、後者と重なって挿入されるべきである。 【００９７】 これらの特徴のすべては、以下のＤＮＡ配列に組み込まれている： 【化２５】 【００９８】 Ａ． 遺伝子断片の構築 上の配列を組み立てるため、次のデオキシリボヌクレオチドがＡＢＩ ＤＮＡ
シンセサイザー（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて合
成される。合成産物は、ＡＢＩ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｍａｎｕａｌ中に記述
してあるように、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製される。それら
を、標準の方法に従ってＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５′をリン酸化
した。 以下のグループのオリゴヌクレオチド配列がフラグメント（断片）Ａａを組み
立てるために使用される： 【００９９】 オリゴヌクレオチドＡａｌは： GCTGT TGACA ATTAA TCAT. オリゴヌクレオチドＡａ２は CGGCT CGTAT AATGT GTGGA ATTGT GAGCG GATAA CAATT T. オリゴヌクレオチドＡａ３は CACAC ATAAC GAGGC GCAAA AA. オリゴヌクレオチドＡａ４は ATGAA AAAGA CAGCT ATCGC GATCG. オリゴヌクレオチドＡａ５は CAGTG GCACT GGCTG GTTTC GCTAC CGTAG CGCAG GCCAG CGGTA AA. オリゴヌクレオチドＡａ６は GAGCC GATGA TTAAT TGTCA ACAGC TGCA. オリゴヌクレオチドＡａ７は TCCGC TCACA ATTCC ACACA TTATA C. オリゴヌクレオチドＡａ８は CCTCG TTATG TGTGA AATTG TTA. オリゴヌクレオチドＡａ９は GCCAC TGCGA TCGCG ATAGC TGTCT TTTTC ATTTT TTGCG. オリゴヌクレオチドＡａ１０は AGCTT TTACC GCTGG CCTGC GCTAC GGTAG CGAAA CCAGC CAGT. 【０１００】 以下のオリゴヌクレオチド配列が、組み立てられ、断片Ａｂが作られる： ヌクレオチドＡｂ１は GCTGT TGACA ATTAA TCAT. ヌクレオチドＡｂ２は CGGCT CGTAT AATGT GTGGA ATTGT GAGCG GATAA CAATT T. ヌクレオチドＡｂ３は CACAC ATAAC GAGGC GCAAA AA. ヌクレオチドＡｂ４は ATGAA AAAGA CAGCT ATCGC GATCG. ヌクレオチドＡｂ５は CAGTG TAAGA AATGA GCGGT AAA. ヌクレオチドＡｂ６は GAGCC GATGA TTAAT TGTCA ACAGC TGCA. ヌクレオチドＡｂ７は TCCGC TCACA ATTCC ACACA TTATA C. ヌクレオチドＡｂ８は CCTCG TTATG TGTGA AATTG TTA. ヌクレオチドＡｂ９は AGCTT TTACC GCTCA TTTCT TACAC TCCGA TCGCG ATAGC TGTCT TTTTC ATTTT TTGCG. 【０１０１】 以下は、断片Ｂを構築するために組立てられるオリゴヌクレオチド配列である
： オリゴヌクレオチドＢ１は AGCTT CAAAG CTGGC GTATG CCCGC CGAAA AAATC CGCG. オリゴヌクレオチドＢ２は CAGTG TCTGC GGTAC AAAAA ACCGG AATGC CAG. オリゴヌクレオチドＢ３は TCCGA CTGGC AGTGC CCGGG TAAAA AACGT TGTTG C. オリゴヌクレオチドＢ４は CCGGA CACCT GCGGC ATCAA ATGCC TG. オリゴヌクレオチドＢ５は GATCC AGGCA TTTGA TGCCG CAGGT GTCCG GGCAA CAACG TTTTT TACCC GGGCA. オリゴヌクレオチドＢ６は CTGCC AGTCG GACTG GCATT CCGGT TTTTT CTACC G. オリゴヌクレオチドＢ７は CAGAC ACTGC GCGGA TTTTT TCGGC GGGCA TACGC CAGCT TTGA. 【０１０２】 以下は断片Ｃを構築するために用いられるオリゴヌクレオチド配列である： オリゴヌクレオチドＣ１は GATCC GGTTG ATACC CCGAA CCCG. オリゴヌクレオチドＣ２は ACTCG TCGAA AA. オリゴヌクレオチドＣ３は CCGGG TAAAT GCCCG GTAAC CTATG GC. オリゴヌクレオチドＣ４は CAGTG TCTGA TGCTG AACCC GCCGA AC. オリゴヌクレオチドＣ５は TTCTG CGAAA TGGAC GGCCA GTGTA AACGA GAT. オリゴヌクレオチドＣ６は CTAGA TCTCG TTTAC ACTGG CCGTC CATTT CGCAG AAGTT. オリゴヌクレオチドＣ７は CGGCG GGTTC AGCAT CAGAC ACTGG CCATA GGTTA CCGGG CA. オリゴヌクレオチドＣ８は TTTAC CCGGT TTTCG ACGAG TCGGG TT. オリゴヌクレオチドＣ９は CGGGG TATCA ACCG. 【０１０３】 以下のグループのオリゴヌクレオチド配列が組立てられて断片Ｄが作られる： オリゴヌクレオチドＤ１は GATCT GAAAT GCTGT ATGGG TATGT GCGGC. オリゴヌクレオチドＤ２は AAATC TTGTG TTTCC CCGGT AAAAG CATAA G. オリゴヌクレオチドＤ３は TCGAC TTATG CTTTT ACCGG GGAAA CACAA GATTT GCCGC A. オリゴヌクレオチドＤ４は CATAC CCATA CAGCA TTTCA. 【０１０４】 以下のグループのオリゴヌクレオチドを混合し、標準条件下でアニーリングを
行ない、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて標準条件下で互い同志及び適切な制限酵素
エンドヌクレアーゼで切ったクローニング及びケーシングベクターＭ１３ｍｐ１
８及び１９につなげる。出来上ったものを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５を形質転
換するのに用い、目的のＤＮＡを含むクローンをＩＰＴＧ−Ｘｇａｌプレート中
での白いプラークから選択し、アニーリングの段階に用いられたグループから選
ばれた32Ｐでラベルしたオリゴヌクレオチドとハイブリドを作ることにより、さ
らにスクリーニングを行なう。挿入構造は、クローン化されたＤＮＡのダイデオ
キシ塩基配列決定法で確かめた。 【０１０５】 グループＡａは、ＰｓｔｌとＨｉｎｄＩＩＩで切ったＭ１３ｍｐ１８と１９に
つなげられるオリゴヌクレオチドＡａ１−Ａａ１０を含む。グループＡｂは、オ
リゴヌクレオチドＡｂ１−Ａｂ９を含み、それらは、ＰｓｔｌとＨｉｎｄＩＩＩ
で切ったＭ１３ｍｐ１８と１９につなげられる。オリゴヌクレオチドＢ１からＢ
７を含むグループＢは、ＨｉｎｄＩＩＩはＢａｍＨＩで切ったＭ１３ｍｐ１８及 び１９につなげられる。オリゴヌクレオチドＣ１からＣ９迄を含んでいるグルー
プＣは、ＢａｍＨＩとＸｂａＩで切ったＭ１３ｍｐ１８と１９につなげられる。
グループＤは、オリゴヌクレオチドＤ１からＤ４を含むが、ＢａｍＨＩとＳａｌ
Ｉで切ったＭ１３ｍｐ１８と１９につなげられる。 【０１０６】 Ｍ１３複製型のＤＮＡを、標準的手法によって目的とする挿入ＤＮＡを持って
いるクローンから回収する。グループＡａに相当する挿入ＤＮＡを適切な制限酵
素エンドヌクレアーゼで、Ｍ１３ＤＮＡから切り取る。ポリアクリルアミドゲル
電気泳動によって精製する。その構造は以下の通りである： 【０１０７】 【化２６】 【０１０８】 グループＡｂに相当する挿入ＤＮＡを、制限酵素エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ
ＩとＨｉｎｄＩＩＩでＤＮＡを切断することにより切り、ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で精製する。その構造は、以下の如くである： 【化２７】 【０１０９】 グループＢに相当する挿入ＤＮＡを制限酵素、エンドヌクレアーゼ、ＨｉｎＤ
ＩＩＩとＢａｍＨＩでＤＮＡを切断することにより切断することによって切り取
り、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製する。その構造は、以下の通りであ
る： 【化２８】 【０１１０】 グループＣに相当する挿入ＤＮＡをＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩでＤＮＡを切断す ることにより切り取り、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製する。その構造
は、以下の如くである： 【化２９】 【０１１１】 グループＤに相当する挿入ＤＮＡを制限酵素ＳａｕＩＩＩＡとＳａｌＩでＤＮ
Ａを切断することにり切り取り、アクリルアミドゲル電気泳動で精製する。その
構造は以下の通りである： 【化３０】 【０１１２】 Ｂ． 遺伝子の構造 外部への輸送のための組み立てには、グループＡａ、Ｂ、Ｃ及びＤを標準条件
下で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、ＥｃｏＲＩとＳａｌＩで切ったＭ１３ｍｐ １８と１９につなげる。目的の遺伝子を含むクローンはＸｇａｌプレート上の、
それらの色で選択され、そしてさらに32Ｐでラベルされたオリゴヌクレオチドと
ハイブリドを形成することによってスクリーニングする。選択された構造のクロ
ーンは、ユニバーサルプライマーを用いてＤＮＡの挿入区域をダイデオキシ塩基
配列決定法に確認する。 【０１１３】 細胞質での発現のための組み立てにおいては、グループＡｂ、Ｂ、Ｃ、及びＤ
からの挿入配列を合せて、標準条件下でＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて、ＥｃｏＲ
ＩとＳａｌＩで切ったＭ１３ｍｐ１８と１９につなげる目的の遺伝子を含むクロ
ーンをＸｇａｌプレート上のそれらの色で選び、更に、32Ｐでラベルした挿入配
列とハイブリドを形成されることによってスクリーニングを行なう。選ばれたク
ローンの構造をユニバーサルプライマーを使ってＤＮＡの挿入区域をダイデオキ
シ塩基配列決定法で検べることによって確める。 【０１１４】 例２ 上に述べたアミノ酸配列、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉの高度に発現さ
れた遺伝子におけるコドンの使用と便利な制限酵素エンドヌクレアーゼの切断位
置の規定にもとづいて、以下のＤＮＡ配列が提案された： 【０１１５】 【化３１】 【０１１６】 Ｅ．Ｃｏｌｉのペリプラズムへの輸送のための適切な形でタンパクの発現を調
節するために、以下の調節要素が提案される。即ち、高いレベルでの転写の開始
のためのプラスミドｐＫＫ２２３−３上の１つのｔａｃプロモーター、転写の制
御のためのプラスミッドｐＫＫ２２３−３上のｌａｃオペレーター、Ｅ．Ｃｏｌ
ｉの染色体上にコードされるべきｌａｃリプレッサー（ｌａｃＩ9）、高レベル
で翻訳を開始するＯｍｐＡシャイン−ダルガーノ配列、生産物をペリプラズムに 運び出すことを助長するＯｍｐＡリーダー、これらのオペレーターエレメントに
よってコードされるタンパク配列の間のＡｌａ−Ｓｅｒ接合のＡｌａ、そして、
最初の生産物の、成熟した白血球エラスターゼインヒビターを生じるべき開裂を
指示する上述の遺伝子によってコードされるタンパク配列である。 【０１１７】 ＯｍｐＡエレメントは、以下のＤＮＡ配列に組み込まれる。 【化３２】 【０１１８】 生成タンパクが、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞質に留まる形でのタンパクの発現を調節す
るために、以下のオペレーショナルエレメントが提供される。即ち、プラスミッ
ドｐＫＫ２２３−３上のｔａｃプロモーター、プラスミッドｐＫＫ２２３−３の
ｌａｃオペレーターとＥ．ｃｏｌｉ ｓｔｒａｉｎ ＪＭ１０７の染色体上のｌ
ａｃレプレッサー（ｌａｃＩq）、コンセンサスシャイン−ダルガーノ配列、及
び高いレベルの翻訳を開始するため、翻訳カップラーとして用いられるべきＯｍ
ｐＡリーダーペプチタイドの断片である。翻訳カップリング配列は、ＯｍｐＡ遺
伝子の翻訳開始領域、ＯｍｐＡリーダーペプチドの最初の８箇のアミノ酸、上に
記述したコンセンサスシャイン−ダルガーノ配列及び翻訳読み終り暗号である。
翻訳カップリング配列は、ｌａｃオペレーターとセリンプロテアーゼインヒビタ
ーの翻訳開始位置の間に、後者を重ねて挿入されるべきである。翻訳カップラー
の特徴は、以下のＤＮＡ配列に組み込まれている。 【０１１９】 即ち、 【化３３】 【０１２０】 Ｃ． 遺伝子フラグメントの構築 上述の配列を組み立てるため、以下のデオキシリボヌクレオチドをＡＢＩ Ｄ
ＮＡシンセサイザー（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使っ
て合成した生成物を、ＡＢＩ インスツルメンタルマニュアルに記述されている
ように、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製する。それらは、標準的
手段によってＴ４ポリヌクレオチドキナーゼとＡＴＰを用いて５′をリン酸化す
る。 以下のオリゴヌクレオチド配列をフラグメントＡａを組み立てるために用いる
： 【０１２１】 オリゴヌクレオチドＡａ１は AATTCGATATCTCGTTGGAGATATTCATGACGTATTTTGGATGATAACGAGGCGCAAAA. オリゴヌクレオチドＡａ２は ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCG. オリゴヌクレオチドＡａ３は GATCCGATCGCGATAGCTGTCTTTTTCATTTTTTGC. オリゴヌクレオチドＡａ４は GCCTCGTTATCATCCAAAAATACGTCATGAATATCTCCAACGAGATATCG. オリゴヌクレオチドＡａ５は GATCCGATCGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCCTCTGGTAAA. オリゴヌクレオチドＡａ６は AGCTTTTACCAGAGGCCTGCGCTACGGTAGCGAAACCAGCCAGTGCCACTGCGATCG. 【０１２２】 以下の、オリゴヌクレオチド配列を組立て、断片Ａｂをつくり上げる： オリゴヌクレオチドＡｂ１は AATTCGATATCTCGTTGGAGATATTCATGACGTATTTTGGATGATAACGAGGCGCAAAA. オリゴヌクレオチドＡｂ２は ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCG. オリゴヌクレオチドＡｂ３は GATCCGATCGCGATAGCTGTCTTTTTCATTTTTTGC. オリゴヌクレオチドＡｂ４は GCCTCGTTATCATCGAAAATACGTCATGAATATCTCCAACGAGATATCG. オリゴヌクレオチドＡｂ５は CAAGGAGAAATAAATGAGCGGTAAA. オリゴヌクレオチドＡｂ６は AGCTTTTACCGCTCATTTATTTCTCCTTGAT. 【０１２３】 以下は、断片Ｂを構築するために組み立てられるヌクレオチド配列である： オリゴヌクレオチドＢ１は AGCTT CAAAG CTGGC GTATG CCCGC CGAAA AAATC CGCG. オリゴヌクレオチドＢ２は CAGTG TCTGC GGTAC AAAAA ACCGG AATGC CAG. オリゴヌクレオチドＢ３は TCCGA CTGGC AGTGC CCGGG TAAAA AACGT TGTTG C. オリゴヌクレオチドＢ４は CCGGA CACCT GCGGC ATCAA ATGCC TG. オリゴヌクレオチドＢ５は GATCC AGGCA TTTGA TGCCG CAGGT GTCCG GGCAA CAACG TTTTT TACCC GGGCA. オリゴヌクレオチドＢ６は CTGCC AGTCG GACTG GCATT CCGGT TTTTT CTACC G. オリゴヌクレオチドＢ７は CAGAC ACTGC GCGGA TTTTT TCGGC GGGCA TACGC CAGCT TTGA. 【０１２４】 以下は断片Ｃを組み立てるために使用されるヌクレオチド配列である： オリゴヌクレオチドＣ１は GATCC GGTTG ATACC CCGAA CCCG. オリゴヌクレオチドＣ２は ACTCG TCGAA AA. オリゴヌクレオチドＣ３は CCGGG TAAAT GCCCG GTAAC CTATG GC. オリゴヌクレオチドＣ４は CAGTG TCTGA TGCTG AACCC GCCGA AC. オリゴヌクレオチドＣ５は TTCTG CGAAA TGGAC GGCCA GTGTA AACGA GAT. オリゴヌクレオチドＣ６は CTAGA TCTCG TTTAC ACTGG CCGTC CATTT CGCAG AAGTT. オリゴヌクレオチドＣ７は CGGCG GGTTC AGCAT CAGAC ACTGG CCATA GGTTA CCGGG CA. オリゴヌクレオチドＣ８は TTTAC CCGGT TTTCG ACGAG TCGGG TT. オリゴヌクレオチドＣ９は CGGGG TATCA ACCG. 【０１２５】 以下のグループのオリゴヌクレオチドが断片Ｄを形成するために組立てられる
： オリゴヌクレオチドＤ１は GATCT GAAAT GCTGT ATGGG TATGT GCGGC. オリゴヌクレオチドＤ２は AAATC TTGTG TTTCC CCGGT AAAAG CATAA G. オリゴヌクレオチドＤ３は TCGAC TTATG CTTTT ACCGG GGAAA CACAA GATTT GCCGC A. オリゴヌクレオチドＤ４は CATAC CCATA CAGCA TTTCA. 【０１２６】 以下のグループのオリゴヌクレオチドを混合し、標準条件下でアニーリングを
行ない、互い同志で、又、適当な制限酵素エンドヌクレアーゼで切ったクローニ
ング及び配列形成ベクターＭ１３ｍｐ１８と１９に、標準条件下でＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いてつなげる。この生成物は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５を形質転換
するのに用い、目的のＤＮＡを含むクローンをアニーリングの段階で用いられた
グループから選ばれた32Ｐでラベルされたオリゴヌクレオチドとハイブリッドを
形成することによって選ぶ。挿入構造は、ユニバーサルプライマーを用いて、ク
ローン化したＤＮＡのダイオキシ塩基配列決定法により確める。 【０１２７】 オリゴヌクレオチドＡａ１−Ａａ４を、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切ったＭ１
３ｍｐ１８及びＭ１３ｍｐ１９につなげる。目的の挿入ＤＮＡを持つＭ１３複製
型ＤＮＡを標準的手法によって回収する。挿入ＤＮＡは、Ｍ１３ＤＮＡを制限酵
素エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩとＰｖｕ１で切断することによりＭ１３ＤＮＡ
から切り出し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製する。その構造は以下の
通りである。 【０１２８】 【化３４】 【０１２９】 オリゴヌクレオチドＡａ５とＡａ６は、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで切った
Ｍ１３ｍｐ１８とＭ１３ｍｐ１９につなげる。目的とする挿入ＤＮＡをもったＭ １３複製型ＤＮＡは、標準的手法によって回収される。挿入ＤＮＡを制限酵素Ｐ
ｖｕｌとＨｉｎｄＩＩＩでＤＮＡを切断することによりＭ１３ＤＮＡから切り出
し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製する。その構造は以下の如くである
。 【０１３０】 【化３５】 【０１３１】 このＰｖｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をオリゴヌクレオチドＡａ１−Ａａ４から
調製した断片と結合させ、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切ったＭ１３ｍｐ１８
またはＭ１３ｍｐ１９とつなぐ。目的の挿入ＤＮＡを持つＭ１３複製型ＤＮＡを
標準的手法で回収する。挿入ＤＮＡを、これはＤＮＡ断片Ａａであるが、制限酵
素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩでＭ１３ＤＮＡを切断することによりＭ１３ＤＮ
Ａから切り出し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製する。その構造は以下
の如くである。 【０１３２】 【化３６】 【０１３３】 オリゴヌクレオチドＡｂ１−Ａｂ４をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切ったＭ１３ ｍｐ１８とＭ１３ｍｐ１９につなぐ。目的の挿入ＤＮＡを持ったＭ１３複製型Ｄ
ＮＡを標準的手法で回収する。挿入ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｖｕＩでＭ
１３ＤＮＡから切り取りポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製する。その構造
は以下の如くである。 【０１３４】 【化３７】 【０１３５】 このＥｃｏＲＩ−ＰｖｕＩ断片をオリゴヌクレオチドＡｂ５−Ａｂ６と合し、
ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切ったＭ１３ｍｐ１８またはＭ１３ｍｐ１９とつ
なぐ。目的の挿入ＤＮＡを持ったＭ１３複製型ＤＮＡを、標準的手法により回収
する。断片Ａｂである挿入ＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩでＤ
ＮＡを切断することによってＭ１３ＤＮＡから切り出す。そして、ポリアクリル
アミドゲル電気泳動で精製する。その構造は以下のとおりである： 【０１３６】 【化３８】 【０１３７】 オリゴヌクレオチドＢ１からＢ７までを含むグループＢをＨｉｎｄＩＩＩとＢ ａｍ ＨＩで切ったＭ１３ｍｐ１８と１９につなぐ。グループＢに相当する挿入Ｄ
ＮＡを制限酵素、エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩでＤＮＡを切
断することにより切出し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製する。
その構造は以下の通りである。 【０１３８】 【化３９】 【０１３９】 オリゴヌクレオチドＣ１からＣ９を含むグループＣをＢａｍＨＩとＸｂａＩで
切ったＭ１３ｍｐ１８と１９につなぐ。グループＣに相当する挿入ＤＮＡを制限
エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩでＤＮＡを切断することにより切り
出し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製する。その構造は以下の如くであ
る： 【０１４０】 【化４０】 【０１４１】 オリゴヌクレオチドＤ１からＤ４までを含むグループＤをＢａｍＨＩとＳａｌ
Ｉで切ったＭ１３ｍｐ１８と１９につなぐ。グループＤに相当する挿入ＤＮＡを
、制限酵素、エンドヌクレアーゼＳａｌＩでＤＮＡを切断することにより切り出
し、アクリルアミドゲル電気泳動で精製する。その構造は以下の如くである： 【０１４２】 【化４１】 【０１４３】 Ｄ． 遺伝子の構築 外部への輸送のための組み立てにおいては、グループＡａ、Ｂ、Ｃ及びＤから
の挿入配列を合し、ＥｃｏＲＩとＳａｌＩで切ったＭ１３ｍｐ１８と１９にＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて、標準条件下でつなぐ。細胞質中での発現のための組み
立てにおいては、Ａｂ、Ｂ、Ｃ及びＤからの挿入配列を合し、ＥｃｏＲＩとＳａ
ｌＩで切ったＭ１３ｍｐ１８及び１９とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて、標準状態
でつなぐ。目的の遺伝子を含むクローンを、それらのＸｇａｌプレート上での色
で選び、さらに32Ｐにラベルしたオリゴヌクレオチドとハイブリドを作ることに
よりスクリーニングを行なう。選んだクローンの構造を、ユニバーサルプライマ
ーを用いてＤＮＡの挿入領域のダイデオキシ塩基配列決定法を行なうことにより
確かめる。 【０１４４】 例３ 発現ベクターの組み立て 外部への輸出用と細胞質内発現用の組み立てに対する挿入配列を、次の如く発
現プラスミドに移す。所用の挿入ＤＮＡをもったＭ１３増殖型ＤＮＡを、上述の
如く標準型手法で回収する。適切な挿入ＤＮＡを制限酵素、エンドヌクレアーゼ
、ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで切って取り出し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
精製する。次に、それを制限酵素、エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで
切ったｐＫＫ２２３−３につなぎ、その結果生じたプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ
ＪＭ１０７にクローニングする。外部輸送用の例４と５における使用のための構
造は、ＰＳＧＥ６であり、原形質発現用の例７における使用のための構造は、ｐ
ＳＧＥ８である。例４，５における外部への輸送に対するＥ．ｃｏｌｉの株はＳ
ＧＥ１０であり、例６における細胞質発現に対する株は、ＳＧＥ３０である。 【０１４５】 Ａ． ｐＳＧＥ６の編成 プラスミドｐＳＧＥ６をｐＫＫ２２３−３のＥｃｏＲＩとＰｓｔＩの位置の間
のＤＮＡを、ＯｍｐＡＳＬＰＩをコードするＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ
断片で置きかえることによって組立てた。ＯｍｐＡ−ＳＬＰＩのＤＮＡ配列は次
の如くである： 【０１４６】 【化４２】 【０１４７】 これから後、“ｏｍｐＡ−ＳＬＰＩ”と呼ぶ配列は、上に述べた外部への輸送
のためのＭ１３ｍｐ１８の最終構造からのＤＮＡである。プラスミドｐＳＧＥ６
は、図１に描かれている。図１において、ｏｍｐＡｓｓ−ＳＬＰＩに対する最初
のコドンは、“ｏｍｐＡ−ＳＬＰＩ”と呼ばれるＤＮＡ配列の６２−６４の位置
にある。成熟したＳＬＰＩに対する最初のコドンは、１２５−１２７に位置して
いる。 【０１４８】 Ｐｔａｃは、ｔａｃプロモーター、ｌａｃオペレーター及びベーターガラクト ーゼＳｈｉｎｅ／Ｄａｌｇａｒｎｏ配列のためのＤＮＡを含んでいる。略号、Ｒ
Ｉ，Ｐｓｔ及びＢａｍは、制限酵素、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩに対
する認識配列である。Ｔｅｔrは、テトラサイクリンに耐性を附与するｐＢＲ３
２２の遺伝子の一部であり、ａｍｐrは、アンピシリンに耐性を附与し位置６４
１６から６８４０までのｒｒｎＢオペロンからのＤＮＡを、Ｔｅｔrは含んでい
る。矢印は転写の方向を示している。 【０１４９】 Ｂ． ｐＣＪ−ｏｍｐＡ−ＳＬＰＩの編成 プラスミドｐＣＪ−ｏｍｐＡ−ＳＬＰＩは、部分的でなく完全なテトラサイク
リン遺伝子およびプロモーターを含んでいることを除いては、ｐＳＧＥ６と同じ
である。このプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉに挿入すると、テトラサイクリン耐性
を附与し、ｏｍｐ ＡＳＬＰＩをコードするＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ
断片が、ベクターｐＫＫ２３３−３ではなく、ベクターｐＣＪ１にクローニング
されるということを除いて、ｐＳＧＥ６に対するのと類似のやり方で組立てられ
る。ベクターｐＣＪ１は以下の如く構築される。プラスミドｐＫＫ２２３−３を
ＳｐｈＩで完全に、ＢａｍＨＩで部分的に酵素分解した。 【０１５０】 ４．４Ｋｂｐ断片をゲルで精製し、合成アダプター GATCTAGAATTGTCATGTTTGACAGCTTATCAT ATCTTAACAGTACAAACTGTCGAATAGTAGC 及び、ｐＢＲ３２２（ＰＬ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，２７−４８９１−０１
）のｔｅｔr遺伝子のＣｌａＩ ＳｐｈＩによる消化物からのＤＮＡの５３９ｂ
ｐの断片と組み合せた。 【０１５１】 Ｃ． ｐＳＧＥ８の構造 ＥｃｏＲＩとｐｓｔ部位の間のＤＮＡが、上に述べたように、細胞質における
発現のための最終的なＭ１３ｍｐ１８構造物に由来するｏｍｐＡ−ｔｃ−ｍｅｔ
−ＳＬＰＩと呼ばれる配列を含んでいることを例外として、プラスミドｐＳＧＥ
８は、ｐＳＧＥ６と同一遺伝子組成である。この配列は、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞質 の中にメチオニル−ＳＬＰＩの合成を導く。ｐＳＧＥ８の部分的図式は、図２の
中に含まれている。“ｏｍｐＡ−ｔｃ−ｍｅｔ−ＳＬＰＩ”と呼ばれるその配列
において、ｏｍｐＡに対する開始コドンは、６２−６４の位置にあり、停止コド
ンは９５−９７にある。そして、メチオニル−ＳＬＰＩに対する開始コドンは、
９８−１００にある。ｏｍｐＡ−ｔｃ−ｍｅｔ−ＳＬＰＩのＤＮＡ配列は次の如
くである。 【０１５２】 【化４３】 【０１５３】 Ｄ． ｐＣＪ−ｍｅｔ−ＳＬＰＩの編成 プラスミドｐＣＪ−ｍｅｔ−ＳＬＰＩは、それが（部分的ではなく）完全なテ トラサイクリン耐性遺伝子を含んでいることを除けば、ｐＳＧＥ８と同じである
。プラスミドＣＪ−ｍｅｔ−ＳＬＰＩは、ｏｍｐＡ−ｔｃ−ｍｅｔ−ＳＬＰＩを
コードするＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ断片がベクターｐＫＫ２２３−３ではなく、ベ
クターｐＣＪ１にクローニングされたことを除けば、ｐＳＧＥ８と同様に組立て
られた。 【０１５４】 Ｅ． 酵母発現用プラスミドの組立て プラスミドｐＵＣ８をＨｉｎｄＩＩＩで酵素分解し、ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｓｍａ
Ｉアダプターにつなげた（Ａｍｅｒｓｈａｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ． ＤＡ１００６か
ら得た）。このアダプターをＨｉｎｄＩＩＩサイトに加えても、ＨｉｎｄＩＩＩ
サイトを再組み立てしない。ＤＮＡを次にＳｍａＩで酵素分解し、希薄溶液中で
つなぎ、続いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ８３の形質転換を行なった。正しいプラス
ミド、即ちＨｉｎｄＩＩＩの位置からＳｍａＩの間のポリリンカーにおいて制限
酵素による切断の位置を欠いているプラスミッドが、トランスフォーマントから
単離したプラスミッドＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩもしくはＨｉｎｄＩＩＩ
で消化することによって同定された。ＨｉｎｄＩＩＩ部位を欠いていたが、Ｅｃ
ｏＲＩ部位とＳｍａＩ部位を含んでいたプラスミドを含んでいるトランスフォー
マントがこの方法で同定された。このプラスミドがｐＧＳ１８５である。 【０１５５】 酵母のＭＦ１遺伝子を含有しているＥｃｏＲＩ断片を、この中に参照文献とし
て加えてある、Ｊ．Ｋｕｒｊａｎ ＆ Ｉ．Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ ｉｎ Ｃｅ
ｌｌ ３０：９３３（１９８２）によって記述されたように、プラスミドｐＣＹ
１７からゲル電気泳動で精製され、ＥｃｏＲＩによって切ったｐＧＳ１８５につ
なげた。プラスミドのＤＮＡをトランスフォーマントから単離した、正しい挿入
ＤＮＡの存在は、ＥｃｏＲＩでＤＮＡを消化することによって確かめられた。こ
れが、プラスミドｐＧＳ２８５であり、図３に描かれている。 【０１５６】 Ｋｕｒｊａｎ ＆ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、（同前）によって認められたよう
に、ＭＦ１遺伝子中の内部の４個のＨｉｎｄＩＩＩ部位の中の３箇を除去するた めに、プラスミドｐＧＳ２８５をＨｉｎｄＩＩＩで完全に消化し、そして再びつ
なげた。正しい構成は、上に述べたように選ばれた。これが、プラスミドｐＧＳ
３８５である。 例２において記述したように、合成ＳＬＰＩ遺伝子の４から１０７迄のアミノ
酸をコードするヌクレオチド配列になっているＭ１３ＡａＢＣＤを、ＨｉｎｄＩ
ＩＩで消化した。このＤＮＡを以下のオリゴヌクレオチドアダプターにつなげた
。 【０１５７】 【化４４】 このアダプターは、２つのオリゴヌクレオチドのアニーリングによって形成し
、5′GCT GAA GCT TCA GGT AAG 及び 5′AGC TCT TAC CTG AAG CTT CAGC 先づ
２分間７０℃に保ち、続いて、一夜かかって徐々に冷す。 【０１５８】 このアダプターをＨｉｎｄＩＩＩで切ったＭ１３ＡａＢＣＤにつなげた後、結
合混合物は、ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩで消化して、アガロースゲル電気泳動と
エレエクトロリューションによって精製した１つの断片を与えた。この断片を、
もう一度ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、それからＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩで切って
おいたｐＧＳ２８５につないだ。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を結合混合物で形質
転換し、アンピシリン耐性トランスフォーマントを選んだ。正しい挿入ＤＮＡを
持ったプラスミドを含むトランスフォーマントを、プラスミドＤＮＡを調整し、
それをＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩで消化することにより同定した。この方法で組
み立て、単離したプラスミドをｐＧＳ４８５と命名した。 【０１５９】 これは図４に描かれている。このプラスミドは、構成成分としてＭＦ１遺伝子
の最初のスペーサー領域におけるＨｉｎｄＩＩＩ切断部位において合成ＳＬＰＩ 遺伝子に融合したＭＦＩ遺伝子を含んでいる。このような構造体は、酵母に入れ
た場合、特別に参照としてここに加えた。Ａ．Ｊ．ＢａｋｅらＰＮＡＳ（ＵＳＡ
）８１：４６４２によって示されたように、異種タンパクの合成、プロセシング
、分泌を導くことが示された。ＭＦＩ遺伝子とＳＬＰＩの融合が、ｐＧＳ４８５
中のＥｃｏＲＩ断片に含まれている。このＥｃｏＲＩ断片を実施例８に記したよ
うに、ベクターＹＩｐ５の中へクローニングした。 【０１６０】 例４ プラスミドｐＳＧＥ６を用いての分泌白血球プロテアーゼインヒビター（ＳＬ
ＰＩ）の発現と精製。 プラスミドｐＳＧＥ６（ＳＧＥ１０細胞）を含んでいるＥ．ｃｏｌｉ細胞を、
２％トリプトン、０．５％酵母エキス、２０ｇ／ｌグルコース、２００ｍｇ／ｌ
ビタミンＢ，及び１００ｍｇ／ｌアンピシリンを加えた１０リットルのＭ９培地
中で、６時間培養した。ＩＰＴＧを０．２ｍＭ加え、更に６時間培養を続けた。
Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＧＥ１０の細胞１０リットルを１８，０００ｘｇで遠心してペ
レットにして８ｇ／ｌを得て、５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）４ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ緩衝液（今後Ｔ５０Ｅ４と略称する）に再び懸濁してからペレットにした
。 【０１６１】 このペレットを２．７リットルのＴ５０Ｅ４に再び懸濁し、１５０ｍｌのロッ
トずつ凍結した。これらのロット８箇（細胞３６ｇに相当する）をまとめて１２
，０００ｐｓｉ、４℃でフレンチプレスを１回通してペレットをくずした。くず
したものを、２０，０００ｘｇで１．５時間遠心分離した。細胞からなる不溶物
（６ｇの細胞に等しい）を含むペレット１／６を１２５ｍｌのＴ５０Ｅ４で２度
洗い、残った物質を一夜凍結した。 【０１６２】 凍結ペレットを、２０ｍＭのＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｄ−０６３
２から入手）、４ｍＭのＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ−７６２６）
及び８Ｍ尿素（超高純度、ＢＲＬ、Ｃａｔ．Ｎｏ．５５０５ＵＡ）を含む２５ｍ ｌの１００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）と４ｍＭのＥＤＴＡ（今後、Ｔ１０
０Ｅ４と略称する）で、３７℃、１時間抽出し、１０，０００ｘｇで１０分遠心
した。得られた上澄みを、あらかじめ２０ｍＭのＤＴＴと８Ｍ尿素を含む抽出緩
衝液Ｔ１００Ｅ４で平衡処理（Ｐｒｅ−ｅｑｕｉｂｒａｔｅｄ）しておいた１０
ｍｌの上澄みを除いたセファデックスｓｐ−ｃ２５（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入
手）と混ぜ、ローラーの上で３７℃で１０分混合し、ＳＬＰＩをＳＰ−セファデ
ックスに吸収させる。 【０１６３】 吸収させたＳＬＰＩを含んだ樹脂を１０分間３，０００ｘｇで遠心してペレッ
トとし、上澄みをデカントした。残ったセファデックスを２０ｍＭのＤＴＴと８
Ｍ尿素を含む２５ｍｌのＴ１００Ｅ４で２回洗ってから２０ｍＭのＤＴＴを含む
、２５ｍｌのＴ１００Ｅ４で２回洗った。次にセファデックスを１回、２０ｍＭ
のＤＴＴと０．３Ｍの食塩を含む２５ｍｌのＴ１００Ｅ４で抽出した。この抽出
物は、約０．１５ｍｇ／ｍｌのタンパクと、０．０４ｍｇ／ｍｌ以上のＳＬＰＩ
を含んでいた。この方法で得たＳＬＰＩは、高圧液体クロマトグラフィーにより
７０％以上の純度であることが確定された。 【０１６４】 例５ 例４の方法を用い、２番目の凍結ペレットを最初のＴ１００Ｅ４／ＤＴＴ／Ｐ
ＭＳＦ／尿素の代りに、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．
Ｎｏ．Ｔ−６８７８から入手）を含むＴ１００Ｅ４で抽出した。得られたＳＬＰ
Ｉは、例４で得られたものより僅かに純度が高く、例６において述べるリフォル
ディング・アッセイにおいて、より高い活性があった。 【０１６５】 例６ 精製ＳＬＰＩのリフォルディング 例４または５からの約４０μｇの部分的に精製したＳＬＰＩを尿素中８Ｍ、も
しくはグアニジン塩酸塩中５Ｍ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，＃
２４１１０）、そしてＤＴＴ中４ｍＭとして、室温で１時間温置した。酸化型グ ルタチオン（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ−４６２６）を１３．５ｍＭになる
迄加え、混合物を再び室温で１時間温置した。混合物をｐＨ１０．７の５０ｍＭ
トリス溶液で１０倍稀釈し、更に室温で４時間温置した。 【０１６６】 それから、混合物をｐＨ８．０の５０ｍＭトリスと０．１５Ｍ食塩で５倍に稀
釈し、ｐＨ８．０の５０ｍＭトリスと、０．２５Ｍ塩化ナトリウムで前もって平
衡させた、セファデックスＳＰ−Ｃ２５の１×２ｃｍカラムにかけた。 樹脂を０．２５Ｍの塩化ナトリウムを含むｐＨ８．０の５０ｍＭトリスで洗い
、それから０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む、ｐＨ８．０の５０ｍＭトリスで洗
った。０．５Ｍの塩の洗滌で溶出する区分は、十分に活性であり、カラムにかけ
たＳＬＰＩの約３０％を呈している。 【０１６７】 例７ ＳＧＥ３０細胞融解物の可溶区分不溶区分からのＳＬＰＩの精製。 Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＧＥ３０細胞中のプラスミドｐＳＧＥ８の発現により、細胞
融解物の可溶及び不溶の両区分において、ＳＬＰＩを生産した。ＳＬＰＩは全細
胞タンパクの１％を占め、可溶区に約８０％、不溶区に約２０％分布していた。 【０１６８】 Ａ．不溶区からのＳＬＰＩの精製 ｐＳＧＥ８を含むＥ．ｃｏｌｉ ＳＧＥ３０細胞を、振盪フラスコで５０μｇ
／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地でＯＤ６００が０．７になる迄培養し、ＩＰ
ＴＧを０．２ｍＭ迄加えて誘導した。３時間後に、細胞をペレットとし、その２
倍の重量の５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）と４ｍＭのＥＤＴＡ（今後は、
Ｔ５０Ｅ４と称する）に懸濁した。細胞を４℃で超音波をかけて破壊し、抽出物
を１２，０００ｘｇで、４０℃で２０分間遠心分離した。 【０１６９】 ペレットを３倍容量のＴ５０Ｅ４で洗い、１０Ｍ尿素か６Ｍグアニジン塩酸塩
のいずれか、及び５ｍＭの還元型ＤＴＴを含む溶液で、室温で溶解させた。室温
で１時間温置した後に、酸化型グルタチオンを１７．５ｍＭの濃度で加え、混合 物をもう１時間温置した。それから混合物をｐＨ１０．７の１０倍容積量の５０
ｍＭトリス−塩酸で希釈した。希釈混合物を室温で４時間放置後、５Ｎ塩酸を加
えてｐＨを８に調節した。この混合物を遠心分離して、沈殿したタンパクを除い
た。 このようにしてできた上澄みは、分泌性白血球プロテアーゼインヒビター活性
を示すＳＬＰＩを含んでいた。このタンパクを上に述べたようなセファデックス
ＳＰ−Ｃ２５カラム上のクロマトグラフィーで精製した。 【０１７０】 Ｂ．可溶区分からのＳＬＰＩの精製 プラスミドｐＳＧＥ８を含むＥ．ｃｏｌｉ ＳＧＥ３０細胞を振盪フラスコ中
でＯＤ６００が０．７になる迄培養し、ＩＰＴＧを０．２ｍＭ迄加えて誘導した
。ＯＤ６００が１．１で、細胞を２５，０００ｘｇで１５分間遠心分離してペレ
ットとした。ペレットをＴ５０Ｅ４に再び懸濁し、４℃で２０，０００ｐｓｉで
フレンチプレスによってくずした。くずしたものを２５，０００ｘｇで１５分間
遠心分離した。 【０１７１】 上澄みをＤＴＴ中で２５ｍＭとし、この混合物を０℃で１時間温置し最終濃度
が５％になる迄十分量の塩酸を加えた。０℃で３０分間温置した後、混合物を２
５，０００ｘｇで１５分遠心分離し、上澄みを除き次の工程にかけた。１０Ｍの
水酸化ナトリウムで上澄みのｐＨを８．０に調整し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー及びエライサ（ＥＬＩＳＡ）
法によって精製及び分析を行ない、その結果、全タンパク１３０ＵＧあたり少く
とも０．７ＵＧのＳＬＰＩが示された。それについて、例６に従ってリフォルデ
ィングを行なった。 【０１７２】例８ 癒合ＳＬＰＩ−ＭＦＩ遺伝子（例３Ｅ参照）を含むＥｃｏＲＩ断片を酵母ベク
ターＹＩｐ５のＥｃｏＲＩ部位に、この出願中に参照文献として特別に加えてあ
るＢｏｔｓｔｅｉｎとＲ．Ｗ．ＤａｖｉｓによるＴｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｐ．６０７−
６３６（１９８２）に記述されているようにしてつなぎ、ＹＩｐＳＬＰＩ−１を
生成させ、本出願に特別に参照文献として加えてある、Ｔ．Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅ
ｒらＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：２２８（１９８３
）に記されてあるような位置志向的組み換えによってＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ＢＳ２１４（ＭＡＴ，Ｕｒａ３−５２，ｐｅｐ ４ ｐｒｂｌ）のＵＲＡ３遺伝
子の中に組み込んだ。この株、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＧＹ−１は完全に
活性なＳＬＰＩを培養上澄み中に分泌する。 【０１７３】 ２番目の株、ＳＧＹ−３も活性ＳＬＰＩを生産し、分泌する。この株は複製性
酵母プラスミッドｐＧＳ５８５上にＭＦ１： ：ＳＬＰＩ癒合をもっている
。このプラスミドは、本出願に特別に参照文献として加えた、Ｊ．Ｒ．Ｂｒｏａ
ｃｈ，Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：３０７（１９８３
）によって記述されたように、ｐＪＤＢ２０７から、また本出願中に特別に参照
文献として加えたＤ．ＢｏｔｓｔｅｉｎとＲ．Ｗ．Ｄａｖｉｓ，ｔｈｅ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，
ｐｐ．６０７−６３６に記述されたように、プラスミッドＹ２４から単離された
酵母ＵＲＡ３遺伝子を添加することにより構築され、そしてｐＪＤＢ２０７のＨ
ｉｎｄＩＩＩの切断部位にクローニングを行ない、ｐＧＳ５８５を構築した。 【０１７４】 ＥｃｏＲＩ断片に含まれるＭＦＩ： ：ＳＬＰＩ癒合遺伝子をＥｃｏＲＩ
−ＸｈｏＩアダプター（Ａｍｅｒｓｈａｍ．Ｃａｔ．Ｎｏ．ＤＡ１００７から得
た）を用いて、ｐＧＳ５８５のＳａｌＩ切断位置にクローニングして、ＹＥｐＳ
ＬＰＩ−１を生成した。特別にこの出願に参照文献として加えたＪ．Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ １５３：１６３（１９８３）において、Ｉｔｏらによって記述
された、形質転換によってこのプラスミドをＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＤＢＹ
７４６（ＭＡＴ，Ｕｒａ３−５２，ｌｅｕ２−３，ｈｉｓ３１，ｔｒｐ１−２８ ９）に導入した。 【０１７５】 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株ＳＧＹ−１とＳＧＹ
−３を、特別に本出願中参照文献として取り入れた、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｙｅ
ａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｐ．６２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ（１９８１）に記述された、Ｆ．Ｓｈｅｒｍａｎらの方法に従って、Ｕ
ｒａｃｉｌの欠けているＳＤ培地で、３０℃で定常期迄培養した。細胞を遠心分
離によって培地から除き、培養上澄みを（１）プロテアーゼ阻害活性と、（２）
エライサ法によって、抗−ＳＬＰＩ抗体と特異的に反応する物質の量を測定する
ことによって、ＳＬＰＩの活性について検定した。精製の体系は、本出願におい
て記述された、以前の方法に類似のやり方で展開できる。 【０１７６】 本発明の工程や生産物について、さまざまな改変を行なったり変化を与えたり
することができることは、当業者にとっては明白である。したがって、本発明は
、附帯の請求範囲及びそれらの同等の範囲内にあるならば、その修飾や改変を包
含することを意図するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
プラスミドｐＳＧＥ６の模式図。
【図２】
プラスミドｐＳＧＥ８の模式図。
【図３】
プラスミドｐＧＳ２８５の模式図。
【図４】
プラスミドｐＧＳ４８５の模式図。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【請求項１】 断片化されていない１本のポリペプチド鎖からなるセリンプロ
テアーゼインヒビターの微生物合成を指示し得る合成ＤＮＡまたは単離された天
然のＤＮＡであって、同インヒビターはセリンプロテアーゼインヒビター活性を
有する少なくとも１つの活性部位を有し、そして同インヒビターは以下のアミノ
酸配列を有するポリペプチドよりなる、ＤＮＡ。 【化７４】 （但し、Ｒ1およびＲ7は同一または異り、置換または非置換アミノ酸残基からな
る群から選択され、かつＲ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ8およびＲ9は同一または
異り、メチオニン、バリン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプト
ファン、リジン、グリシン、ロイシンおよびアルギニンからなる群から選択され
る） 【請求項２】 （1） 【化７５】 および（２）遺伝子コードの縮重の結果として（１）に均等なＤＮＡからなる群
から選択される請求項１のＤＮＡ。 【請求項３】 単離された天然のＤＮＡである請求項１のＤＮＡ。 【請求項４】 ｃＤＮＡである請求項１のＤＮＡ。 【請求項５】 ゲノムＤＮＡである請求項３のＤＮＡ。 【請求項６】 ポリペプチドがアミノ酸配列： 【化７６】よりなる請求項１のＤＮＡ。 【請求項７】 断片化されていない１本のポリペプチド鎖からなるセリンプロ
テアーゼインヒビターの微生物合成を指示し得る合成ＤＮＡまたは単離された天
然のＤＮＡであって、同インヒビターはセリンプロテアーゼインヒビター活性を
有する少なくとも１つの活性部位を有し、そして同インヒビターは以下のアミノ
酸配列を有するポリペプチドよりなる、ＤＮＡからなる組換えベクター。 【化７７】 （式中、Ｒ1およびＲ7は同一または異り、置換または非置換アミノ酸残基からな
る群から選択され、そしてＲ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ8およびＲ9は同一また
は異り、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、
ＧｌｙおよびＡｒｇからなる群から選択される） 【請求項８】 ＤＮＡが（１） 【化７８】 および（２）遺伝子コードの縮重の結果として（１）に均等なＤＮＡからなる群
から選択される請求項７の組換えベクター。 【請求項９】 ＤＮＡが単離された天然のＤＮＡである請求項７のベクター。 【請求項１０】 ＤＮＡがｃＤＮＡである請求項７のベクター。 【請求項１１】 ＤＮＡがゲノムＤＮＡである請求項７のベクター。 【請求項１２】 ポリペプチドがアミノ酸配列： 【化７９】からなる請求項７のベクター。 【請求項１３】 断片化されていない１本のポリペプチド鎖からなるセリンプ
ロテアーゼインヒビターの微生物合成を指示し得る合成ＤＮＡまたは単離された
天然のＤＮＡであって、同インヒビターはセリンプロテアーゼインヒビター活性
を有する少なくとも１つの活性部位を有し、そして同インヒビターは以下のアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドよりなる、ＤＮＡを含有する形質転換宿主細胞 。 【化８０】（式中、Ｒ1およびＲ7は同一または異り、置換または非置換アミノ酸残基からな
る群から選択され、そしてＲ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ8およびＲ9は同一また
は異り、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、
ＧｌｙおよびＡｒｇからなる群から選択される） 【請求項１４】 ＤＮＡが（１） 【化８１】 および（２）遺伝子コードの縮重の結果として（１）に均等なＤＮＡからなる群
から選択される請求項１３の宿主細胞。 【請求項１５】 ＤＮＡが単離された天然のＤＮＡである請求項１３の宿主細
胞。 【請求項１６】 ＤＮＡがｃＤＮＡである請求項１３の宿主細胞。 【請求項１７】 ＤＮＡがゲノムＤＮＡである請求項１５の宿主細胞。 【請求項１８】 ポリペプチドがアミノ酸配列： 【化８２】 からなる請求項１３の宿主細胞。
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