JPH0568558A - モニターペプタイドのアミノ酸配列をコードする新規なｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 次のアミノ酸配列を有するモニターペプタイ
ドすなわち、 Gly Asn Pro Pro Ala Glu Val Asn Gly Lys Thr Pro Asn Cys Pro Lys Gln Ile Met Gly Cys Pro Arg Ile Tyr Asp Pro Val Cys Gly Thr Asn Gly Ile Thr Tyr Pro Ser Glu Cys Ser Leu Cys Phe Glu Asn Arg Lys Phe Gly Thr Ser Ile His Ile Gln Arg Arg Gly Thr Cys をコードするＤＮＡ配列を有する化学合成遺伝子。 【効果】 本化学合成遺伝子を宿主細胞に導入すること
によりモニターペプタイドを効果的に生産しうる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、モニターペプタイドの
アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する新規な化
学合成遺伝子と、この化学合成遺伝子をプラスミドベク
ターに挿入してなるプラスミド組換え体と、このプラス
ミド組換え体により形質転換された宿主細胞と、この宿
主細胞を培養してモニターペプタイドを発現させること
からなるモニターペプタイドの製造方法とに関する。

【０００２】

【従来の技術】摂取した食物に応答する、膵臓からの消
化酵素の分泌の調節機能については未だ解明されていな
い。伏木らはラットを用いてこの機構の解明に努め、彼
らがモニターペプタイドと名付けたペプタイドが膵臓か
らの消化酵素の分泌に関与していることを発見した。
(ＦＡＳＥＢ Ｊ．３；１２１〜１２６、１９８９）。本
ペプタイドは、ラット膵臓から単離、精製されており、
アミノ酸６１個から成っていること及び次の式

【０００３】 Gly Asn Pro Pro Ala Glu Val Asn Gly Lys Thr Pro Asn Cys Pro Lys Gln Ile Met Gly Cys Pro Arg Ile Tyr Asp Pro Val Cys Gly Thr Asn Gly Ile Thr Tyr Pro Ser Glu Cys Ser Leu Cys Phe Glu Asn Arg Lys Phe Gly Thr Ser Ile His Ile Gln Arg Arg Gly Thr Cys で示される一次構造を有するものであることが知られて
いる。

【０００４】モニターペプタイドの機能は以下のとおり
とされている。本ペプタイドは、膵臓から小腸に恒常的
に分泌されているが、空腹時においては腸内に存在する
消化酵素によって分解されている。しかし、食物が腸内
に存在し、消化酵素が食物の消化に携わるようになると
本ペプタイドは残存することになる。残存した本ペプタ
イドは腸管壁に作用し、膵酵素分泌促進活性、摂食抑制
活性を持つコレシストキニン(ＣＣＫ)の分泌を促す。以
上により本ペプタイドは、単純にはＣＣＫ放出促進活性
を有するものであり、個体全体として見れば腸管内の食
物の量をモニターして、消化に必要なだけの膵酵素の分
泌量、摂食行動を調節しているものと考えられている。
またこのような膵酵素の分泌調節機構は、ラットのみな
らずヒトでも存在することが予想される。その点におい
て、ラットをモデル動物として、消化酵素分泌機構を解
明することは有意義なことであり、同時にモニターペプ
タイドの入手が必要となる。

【０００５】しかしながら、本ペプタイドを得ることは
極めて困難であり、本ペプタイドを入手する技術の開発
が望まれている。

【０００６】また、本ペプタイドは、ヒトを含めた動物
の膵臓から分泌されている膵臓分泌トリプシン阻害剤
（ＰＳＴＩ）と似た配列を持ち、同様にトリプシン阻害
活性を示す。しかし、ＰＳＴＩについては、モニターペ
プタイドのようなＣＣＫ放出活性は報告されていない。

【０００７】更にまた、本ペプタイドが上皮成長因子
（Epidermal Growth Factor; EGF）のアミノ酸配列と相
同性の高い部分を持ち、ＥＧＦ様活性を示すことも報告
されている。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】上記したようなモニタ
ーペプタイドの活性の本質を解明しまた他の類似のペプ
タイドとの差異を明らかにすると共に、モニターペプタ
イドの用途および消化器病治療薬、潰瘍治療薬などとし
ての利用分野拡大のためにはこのペプタイドの大量入手
が求められる。

【０００９】ところで現在、モニターペプタイドを得る
ためには、多数のラットに外科手術を施して膵液を採取
し、更に各種クロマトグラフィーによる分離精製を行っ
ている。そのため、大量に得るには多くのラット、時
間、繁雑な操作を必要とし、標品調製は極めて困難であ
る。また、モニターペプタイドが組換えＤＮＡ技術を利
用して生産された例は全くなかった。

【００１０】更にまた、有機化学合成法でペプタイドを
合成することも可能と考えられるが、モニターペプタイ
ドにはジスルフィド結合が３カ所あるとされており、有
機化学合成による調製は容易ではない。しかし、組換え
ＤＮＡ技術により、生物体で生産すると天然と同等の物
が容易に得られると考えられるところから、組換えＤＮ
Ａ技術で用いうる、モニターペプタイドをコードした宿
主細胞によって最も効率的にモニターペプタイドを発現
させうる化学合成遺伝子と、同遺伝子をベクターに挿入
したプラスミド組換え体と、同組換え体により形質変換
された形質変換細胞と、同形質変換細胞を培養してモニ
ターペプタイドを発現させるモニターペプタイドの新規
な製法の解明が求められている。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、次のア
ミノ酸配列を有するモニターペプタイド、すなわち Gly Asn Pro Pro Ala Glu Val Asn Gly Lys Thr Pro Asn Cys Pro Lys Gln Ile Met Gly Cys Pro Arg Ile Tyr Asp Pro Val Cys Gly Thr Asn Gly Ile Thr Tyr Pro Ser Glu Cys Ser Leu Cys Phe Glu Asn Arg Lys Phe Gly Thr Ser Ile His Ile Gln Arg Arg Gly Thr Cys をコードするＤＮＡ配列を有する化学合成遺伝子、この
化学合成遺伝子をプラスミドベクターに挿入したプラス
ミド組換え体、このプラスミド組換え体によって形質転
換された宿主細胞、およびこの宿主細胞を培養して所望
のモニターペプタイドを発現させることによるモニター
ペプタイドの製法方法が提供される。

【００１２】モニターペプタイドの上記したアミノ酸配
列をコードするＤＮＡ配列は、そのアミノ酸配列を構成
する個々のアミノ酸に対応するＤＮＡに基づき種々のも
のを想定することができるが、この想定し得たＤＮＡ配
列を有するＤＮＡによって形質転換された宿主細胞によ
って所望のモニターペプタイドを発現させようとする場
合には、このＤＮＡ配列の設定に当っては次の諸点の考
慮が望まれる。すなわち、 (１) アミノ酸に対応するＤＮＡが複数存在する場合に
おいて宿主細胞（例えば大腸菌）での使用頻度が高く、
宿主細胞になじまれたコドンを選択する。

【００１３】(２) 設定されるＤＮＡ配列内およびその
両端の部位に特定の制限酵素認識部位を持たせ、他のＤ
ＮＡ配列またはプラスミドベクターへの挿入、連結を容
易なものとすると共に、組換え体中における設定された
ＤＮＡ配列が正しく維持されているか否かの検定を容易
なものとする。

【００１４】(３) ＤＮＡ断片の連結によって目的とす
るＤＮＡを化学合成する場合に、誤った連結が生ずるこ
とがないようなＤＮＡ断片の選択を行なう。

【００１５】(４) 設定されたＤＮＡ配列中に例えばス
トップコドンなどのペプチド合成上不都合なＤＮＡ配列
が生ずることがないように設計する。

【００１６】かかる配慮のもとに、本発明者らはモニタ
ーペプタイドを大腸菌に産生させる場合の遺伝子として
次のＤＮＡ配列を有する化学合成遺伝子を見出したので
ある。このＤＮＡ配列を対応するアミノ酸配列と共に記
述すると次のとおりである。

【００１７】

【化２】

【００１８】上記ＤＮＡ配列において、１〜６番の塩基
のＣＣＡＴＧＧはＮｃｏＩの認識部位としてＤＮＡ配列
中に導入された部分であり、その中のＡＴＧのメチオニ
ンから翻訳が開始され、＊＊＊で示される停止コドンを
２つ連続して現れるようにして目的のペプタイド合成が
中止されるようにした。

【００１９】すなわち、このＤＮＡ配列では宿主細胞と
して大腸菌を使用する場合の大腸菌における使用頻度の
高いコドンを選択しかつ、アンピシリン耐性遺伝子とｔ
ｒｃプロモーターとを有する、市販されていて容易に入
手できる大腸菌用発現ベクターであるｐＫＫ２３３−２
のプロモーターの下流部分に容易に挿入できるようにＮ
末端側にＮｃｏＩ認識部位、Ｃ末端側にＨｉｎｄ III認
識部位を設けてなるものである。また、後の遺伝子の人
為的変換を容易にするため、約３０塩基毎に制限酵素認
識部位を設けた。特に翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の直後
にＢｓｔＥ II部位を設け、別のベクターへの変換や別
の遺伝子との融合遺伝子の構築をしてもフレームがずれ
にくいようにした。また、ほぼ中央にＫｐｎＩ部位を設
け、融合遺伝子が容易に構築出来るようにした。

【００２０】このような構成を有するＤＮＡ配列を有す
る化学合成遺伝子としての本発明の遺伝子を上記特徴点
と共に記述すると次のとおりである。

【００２１】

【化３】

【００２２】上記した化学合成遺伝子はモニターペプタ
イドを合成する遺伝子として一本鎖の構造のものとして
示したが、宿主細胞を形質転換するためのプラスミドベ
クターにこの化学合成遺伝子を挿入するためには上記一
本鎖のＤＮＡ配列とは互に相補的なＤＮＡとの二重鎖の
ＤＮＡが必要とされ、この二重鎖のＤＮＡは次の配列を
有する。

【００２３】

【化４】

【００２４】上記したＤＮＡ配列を有する化学合成遺伝
子はこのものをプラスミドベクターへ接続することを考
慮したベクターへの接続部分を含むＤＮＡ配列を下記す
る表１に示す５個のオリゴヌクレオチド断片すなわち、
断片１、２、３、４および５に分け、これらのオリゴヌ
クレオチドとは相補的な断片すなわち断片６、７、８、
９および１０と共に、すなわち合計１０個のオリゴヌク
レオチドを合成的な手段で製造したのである。

【００２５】

【表１】

【００２６】このオリゴヌクレオチドの断片の夫々は通
常この技術分野において知られたＤＮＡ合成手段を用い
て合成することができ、このためにＤＮＡ合成機が用い
られ、例えばこの合成機としてはファルマシア社製のジ
ーンアセンブラーがある。

【００２７】得られたオリゴヌクレオチド断片のうち断
片２〜５、７〜１０は５′末端をリン酸化し、リン酸化
していない断片１および６と共にアニーリングを行ない
引き続いてリガーゼを作用させて次の式で示される二重
鎖のＤＮＡが得られた。

【００２８】

【化５】

【００２９】この二重鎖のＤＮＡはその構造中にさきに
述べた本発明のモニターペプタイドを大腸菌に産生させ
るための遺伝子部分と、その両末端に次のベクターＤＮ
Ａへ連結する際の付着端としてのＮｃｏＩおよびＨｉｎ
ｄ III部位に結合可能な末端をそなえている。

【００３０】このようにして得られたモニターペプタイ
ドの遺伝子を含むＤＮＡ配列は次いで適当なプラスミド
ベクターに連結される。この場合上記したようにこのＤ
ＮＡ配列はその両末端にＮｃｏＩおよびＨｉｎｄ III部
位に結合可能な付着端を有することから、プラスミドベ
クターはＮｃｏＩおよびＨｉｎｄ IIIによって消化され
うるものが用いられる。しかしてこのプラスミドベクタ
ーは爾後の遺伝子情報の発現のために必要なプロモータ
ー部位をそなえておりかつ抗生物質耐性遺伝子部位のよ
うな形質転換された宿主細胞のマーカーとなる遺伝子を
そなえたものであることが好ましい。

【００３１】そして本発明者らはこの目的のためにプラ
スミドｐＫＫ２３３−２を用いることが好適であること
を見出している。

【００３２】しかしながらプラスミドｐＫＫ２３３−２
の他にモニターペプタイドをコードする遺伝子を運搬す
るベクターとしては、一般に大腸菌の形質転換に用いら
れるベクターを使用することが出来る。例えば、ｐＢＲ
３２２、ｐＫＫ２２３−３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、
などのプラスミド、Ｍ１３ｍｐ１８、Ｍ１３ｍｐ１９な
どのファージから構築されるベクターなどが挙げられる
が、これらに限定されるものではなく、モニターペプタ
イド遺伝子を運搬し、大腸菌に導入し、大腸菌内で複製
され、かつ発現させることが可能なものであれば良い。
ベクター全体あるいはその一部が化学合成により得られ
たものでも、或るいは天然から得られたものでも使用可
能である。

【００３３】こうしてモニターペプタイドの遺伝子を連
結したプラスミド組換え体は宿主細胞を形質転換するた
めに用いられる。この形質転換された宿主細胞によって
所望のモニターペプタイドを産生させることも可能であ
る。またこの形質転換体によってモニターペプタイドの
遺伝子を連結した組換えプラスミドをクローニングして
大量調製することも可能である。

【００３４】本発明者らによる本発明の実施の具体例に
おいては、プラスミドｐＫＫ２３３−２をＮｃｏＩおよ
びＨｉｎｄ IIIで切断し、本発明による上記したモニタ
ーペプタイドをコードしたＤＮＡ配列を有する化学合成
遺伝子をこの切断されたプラスミド中に挿入しかくして
ｐＫＭ１と命名したプラスミドを得、これを用いて大腸
菌を形質転換し、この大腸菌の培養によってｐＫＭ１を
クローニングした。

【００３５】このようにして得られたプラスミドｐＫＭ
１をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ IIIで消化すると、モニ
ターペプタイド遺伝子のＤＮＡ配列の上流にプロモータ
ーＰｔｒｃを有する断片が得られる。そしてこのように
して得られた断片を例えばｐＭＪＲ９６と命名したプラ
スミドをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ IIIで消化して得ら
れたベクター断片とライゲーションしてプラスミドｐＭ
ＯＮ８を得る。

【００３６】なお、ここで用いられるプラスミドｐＭＪ
Ｒ９６は、プラスミドｐＭＪＲ１５６０をＫｐｎＩおよ
びＰｓｔＩで消化し、両末端にＫｐｎＩおよびＰｓｔＩ
部位に結合可能な付着末端を有するｌａｃＩ^Q 断片
（１.２Ｋｂｐ）を取出し、これにＫｐｎＩ部位をＥｃ
ｏＯ１０９Ｉ部位に変換する合成オリゴヌクレオチド、
並びにＰｓｔＩ部位をＳｓｐＩ部位に変換する合成オリ
ゴヌクレオチドを結合させて末端にＥｃｏＯ１０９Ｉ部
位およびＳｓｐＩ部位を有するｌａｃＩ^Q 遺伝子を得、
一方、マルチクローニングサイトを有するベクターｐＵ
Ｃ１８をＥｃｏＯ１０９ＩおよびＳｓｐＩで消化して得
られるベクターＤＮＡ断片（２.５Ｋｂｐ）を取り出
し、これと上記ｌａｃＩ^Q 遺伝子とをライゲーションし
て構築されたものである。

【００３７】このようにして得られたプラスミドｐＭＯ
Ｎ８を用いて大腸菌を形質転換することによってきわめ
て効率的にモニターペプタイドを生産することができ
る。

【００３８】宿主としては、モニターペプタイド発現ベ
クターを複製出来ること、およびモニターペプタイド発
現ベクターにコードされるモニターペプタイドを発現さ
せる機能を有すること、という条件を満たす大腸菌であ
ればいずれも使用可能である。例えばＨＢ１０１、Ｗ３
１１０、Ｃ６００、ＪＭ１０９などの大腸菌株があげら
れるが、これらに限らず上の条件を満たすものならば、
本発明に適用可能である。

【００３９】培養方法は通常に微生物を培養する場合の
常法に従うことが可能であり、多くの文献や成書を参考
にして実施することが出来る。培地は、通常大腸菌の培
養に使用し得るもの、例えばＬＢ培地やＭ９ＣＡ培地な
どを使用することが出来る。培養温度は大腸菌が増殖或
は成育出来る温度であれば良い。培養の形態は振とう培
養、或いはジャーファーメンターによる培養が好ましい
が、モニターペプタイドを生産するための培養方法はこ
れらに限定されるものではない。

【００４０】モニターペプタイドの精製法は公知の精製
手段を用いて行うことが可能であり、多くの文献や成書
を参考にして実施することが出来る。精製方法として
は、例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニテ
ィクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル
濾過、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、遠心
分離操作、電気泳動などの精製手段あるいはこれらを組
み合わせた方法があり、適当な方法を選択して精製する
ことが可能である。

【００４１】本発明で得られるモニターペプタイドは、
組換えＤＮＡ技術を利用した微生物培養系により生産さ
れ、ラットから抽出されたモニターペプタイドに対応す
る活性を有し、ラットに由来する他の蛋白質を実質的に
含有しないものである。

【００４２】以下に実施例を示すが、本発明はこれらの
実施例に限定されるものではない。本発明に関わる諸実
験は内閣総理大臣の定める『組換えＤＮＡ実験指針』に
従って行った。また実施例中のプラスミド、ＤＮＡ、種
々の酵素、大腸菌などを扱う諸操作は以下にあげる書
籍、製造業者、供給業者の添付資料を参考にして実施し
た。

【００４３】 １ 遺伝子操作実験法、高木康敬編著（1980）講談社 ２ 遺伝子操作マニュアル、高木康敬編著（1980）講談
社 ３ Molecular Cloning. a laboratory manual T. Man
iatisら編(1982)ColdSpring Harbor Laboratory ４ Basic Methods in Molecular Biology L.G. Davis
ら編(1986) Elsevier

【００４４】モニターペプタイドの遺伝情報をコードす
るＤＮＡ断片の合成および精製 遺伝子を構成するオリゴヌクレオチドを固相合成法で調
製した。すべての工程はジーンアセンブラー（Gene Ass
embler^TM）合成機（ファルマシア社製）により、β−シ
アノエチルフォスフォアミダイド方法で行った。

【００４５】出発ヌクレオチドをあらかじめ結合してあ
る固相支持体、保護したヌクレオチド、溶媒、試薬を製
造業者から入手し、合成装置の製造業者の操作の指示に
従って自動化した方法で実施した。ある種の修正は、製
造業者の操作の指示および使用の報告に従って、導入し
た。

【００４６】合成が終了した時、支持体を合成装置から
取り外し、濃アンモニア水と共に５０℃に１６時間密閉
容器中で加熱することにより、固体の支持体からオリゴ
マーを切り離し、溶液として回収した。

【００４７】オリゴマーを含むアンモニア液は、ＦＰＬ
Ｃ^TM装置を用い、ＭｏｎｏＱ^TMカラム（いずれもファル
マシア社）において１０mM ＮａＯＨ中ＮａＣｌの濃度
勾配を用いたイオン交換クロマトグラフィーにかけた。
溶出されてきたオリゴマーを含む液は、あらかじめ１０
０mMトリエチルアミン酢酸緩衝液（ｐＨ７.０）で平衡
化したＮＡＰ−２５^TMカラム（ファルマシア社）で脱塩
し、減圧乾固した。残留物を蒸留水に溶解し、更にその
４倍量の酢酸を加えて室温で２０分放置し、オリゴヌク
レオチドから保護基を外した。反応後、エーテルで酢酸
を除き、先に述べたＦＰＬＣ^TM装置、およびＭｏｎｏＱ
^TMカラムで同様のイオン交換クロマトグラフィー、ＮＡ
Ｐ−２５^TMカラムでの脱塩を行い、さらに減圧乾固し
て、精製オリゴヌクレオチドとした。設計した１０種の
ＤＮＡ断片についてはすべて上記と同じ方法で精製品が
得られた。

【００４８】水溶性の２６０nmでの吸光度を測定するこ
とより、３０から２００μｇの精製物を得たことが判っ
た。

【００４９】オリゴヌクレオチドの２本鎖ＤＮＡへの結
合 等モル量（３００pmole）の精製された各オリゴヌクレ
オチドを、５０mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.５）、１
０mM塩化マグネシウム、１mM ＡＴＰ，１０mMジチオス
レイトールおよび１０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼから成る反応液５０μｌ中で３７℃９０分反応さ
せ、５′−ヒドロキシ末端をリン酸化した。なお、断片
１と６はリン酸化しなかった。各断片のリン酸化反応終
了後、これら１０個の断片を混合し、９５℃で１５分間
加熱して酵素を不活性化した。そのままの容器で３時間
かけて３０℃まで冷却し、各断片のアニーリングを行っ
た。次いでこの液をフェノール／クロロホルムで除蛋白
処理し、エタノール沈殿で濃縮した。得られた沈殿を１
００mMトリス塩酸緩衝液(ｐＨ７.６）、５mM塩化マグネ
シウムから成る液に溶かし、Ｅ.ｃｏｌｉ ＤＮＡリガー
ゼを含むライゲーションキット（宝酒造株式会社）によ
り１６℃にて一夜ライゲーション反応を行った。反応
後、エタノール沈殿で濃縮した後、１.５％アガロース
ゲル電気泳動にかけて目的の１９０bpのＤＮＡ断片を分
離、回収した。得られた断片を先に述べたと同じ反応系
で５′−ヒドロキシ末端をリン酸化した。

【００５０】なお、この項目およびこれ以降で述べるエ
タノール沈殿とは以下の操作を言う。沈殿させようとす
る溶液にその体積の１０分の１量の３Ｍ酢酸ナトリウム
（pH４.６）、２.５倍量のエタノールを加え、−８０℃
に１５分以上放置する。その後、遠心分離して沈殿を
得、７０％エタノールで洗浄した後、真空乾燥する。

【００５１】クローニング 調製したＤＮＡ断片は５′−末端にＮｃｏＩ部位、３′
−末端にＨｉｎｄIII部位を持つので、ＮｃｏＩ、Ｈｉ
ｎｄ III制限プラスミドｐＫＫ２３３−２にクローニン
グし、ｐＫＭ１を得た（図１）。

【００５２】精製したｐＫＫ２３３−２のＤＮＡを、Ｎ
ｃｏＩおよびＨｉｎｄIIIで供給業者の指示する消化条
件により消化し、アガロースゲル電気泳動で展開した
後、エチジウムブロマイドで染色し、検出されたバンド
のうち約４ＫｂのＮｃｏＩ、Ｈｉｎｄ III断片を分離、
回収した。この調製物６００ngとモニターペプタイドを
コードするＤＮＡ断片２０ngとを混合し、Ｅ.ｃｏｌｉ
ＤＮＡリガーゼを用い、供給業者の指示する条件で反応
させて結合した。このＤＮＡ反応液を用い、一般に行わ
れている塩化カルシウム法に従ってコンピテントセルを
調製した、Ｅ.ｃｏｌｉ mH３株を宿主として形質転換を
行った。

【００５３】５０μｇ／m1のアンピシリンに耐性の形質
転換体１００個を得、うち６０個の形質転換体につい
て、アルカリ／ＳＤＳ法による迅速プラスミド抽出法で
プラスミドを抽出し、得られたプラスミドＤＮＡを、Ｋ
ｐｎＩ、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄ IIIで消化した。ここ
に述べた３つの酵素の認識部位は合成したモニターペプ
タイド遺伝子の中に設計してあり、３つの酵素認識部位
の有無、および消化して得られたＤＮＡ断片の大きさで
スクリーニングした。

【００５４】その結果、５クローンにＫｐｎＩ部位があ
り、かつＮｃｏＩとＨｉｎｄ IIIの二重消化で目的とす
る約１８０ｂｐの断片が認められた。これらのプラスミ
ドを更に大量に調製し、ジデオキシ法によるＤＮＡ塩基
配列決定法によって配列を決定した。その結果、目的と
するラットモニターペプタイド合成遺伝子を持つクロー
ンが１個得られ、これをｐＫＭ１とした。

【００５５】ｐＭＪＲ９６の構築 モニターペプタイドを発現させるための発現用ベクター
ｐＭＪＲ９６を構築した。手順は以下のとおりである
（図２）。

【００５６】ｌａｃプロモーターを制御する遺伝子、ｌ
ａｃＩ^Q を持つプラスミドｐＭＪＲ１５６０（アマシャ
ム社）を制限酵素ＫｐｎＩおよびＰｓｔＩで消化して得
られる断片のうち、ｌａｃＩ^Q 遺伝子を含む１２００ｂ
ｐの断片をアガロースゲル電気泳動で回収、精製した。
次にＫｐｎＩ部位側にＥｃｏＯ１０９Ｉ部位に変換する
合成オリゴヌクレオチドを、またＰｓｔＩ部位側にはＳ
ｓｐＩ部位に変換する合成オリゴヌクレオチドを結合さ
せ、ＥｃｏＯ１０９ＩおよびＳｓｐＩを各端に持つｌａ
ｃＩ^Q 遺伝子断片を作成した。また、ベクターとして、
ｐＵＣ１９を制限酵素ＥｃｏＯ１０９ＩとＳｓｐＩで消
化して、２５００bpの断片をアガロースゲル電気泳動で
回収、精製した。

【００５７】以上のようにして得たＩａｃＩ^Q 遺伝子断
片とＥｃｏＯ１０９Ｉ、ＳｓｐＩ制限プラスミドｐＵＣ
１９とを常法に従ってＥ.ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼで連
結反応させ、一般に行われている塩化カルシウム法で調
製したＥ.ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株のコンピテントセルに
導入した。アンピシリン５０μｇ／m1に耐性のコロニー
からプラスミドを抽出し、ｐＵＣ１９とｌａｃＩ^Q 遺伝
子がＥｃｏＯ１０９ＩおよびＳｓｐｌで連結されたプラ
スミドを得たことを確認し、これをｐＭＪＲ９６と名付
けた。

【００５８】このプラスミドはｐＵＣ１９由来の複製起
点、アンピシリン耐性遺伝子、ｌａｃプロモーター、そ
の下流のマルチクローニング部位、およびｌａｃプロモ
ーターを制御するためのｌａｃＩ^Q 遺伝子を持つ３.７K
bのプラスミドである。

【００５９】ｐＭＯＮ８の構築 ｐＫＭ１を大量に調製し、これをＥｃｏＲＩおよびＨｉ
ｎｄ IIIで消化してアガロースゲル電気泳動で分離し、
プロモーター部分、モニターペプタイド遺伝子部分を含
む約５００bpの断片を単離、回収した。またベクターと
して、ｐＭＪＲ９６を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎ
ｄ IIIで順次消化し、アガロースゲル電気泳動で３.７K
bの断片を回収、精製した。

【００６０】以上述べた断片とＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄ I
II制限プラスミドとを結合し、ｐＭＯＮ８を作成した
（図３）。

【００６１】ベクター２０ngとｐＫＭ１由来のモニター
ペプタイド遺伝子をコードする断片１００ngとを混合
し、Ｅ.ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼにより結合した。反応
液をそのまま用いて、一般に行われている塩化カルシウ
ム法でコンピテントセルを調製したＥ.ｃｏｌｉ ＪＭ１
０９株を形質転換し、多数のアンピシリン（５０μｇ／
m1）耐性形質転換体を得た。複数の形質転換体からプラ
スミドを迅速抽出法で抽出し、ＫｐｎＩ部位、ＢｓｔＰ
Ｉ部位、ＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ III二重消化による５０
０bp断片を確認し、このプラスミドをｐＭＯＮ８とし
た。

【００６２】ｐＭＯＮ８を大量に調製し、Ｅ.ｃｏｌｉ
ＹＫ３３４０株の形質転換に用いた。形質転換は、塩化
カルシウム法で調製したコンピテントセルにＤＮＡ溶液
を作成させて導入するという、標準の方法によって行
い、アンピシリン５０μｇ／m1に耐性の形質転換体を得
た。この形質転換体をＭ１３５株とした。この形質転換
体は微工研菌寄第１２０３０号として工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託された。

【００６３】尚、Ｅ.ｃｏｌｉ ＹＫ３３４０株は、Ｅ.
ｃｏｌｉ Ｃ６００Ｓ株の１クローンであり、Ｃ６００
Ｓの遺伝学的性質については文献（Sato, K., et al. V
irology, ３４，６３７〜６４９、１９６８）に次のよ
うに記載されている。（Ｔ１、Ｔ５^S、ｌｅｕＹ、ｔｈ
ｒ⁺、ｌｅｕ⁺、ｓｕｐＥ）

【００６４】培養 モニターペプタイドを得るために、Ｍ１３５株を１０ｇ
／１のバクトトリプトン、５ｇ／１の酵母エキス、５ｇ
／１の塩化ナトリウム、およびアンピシリン５０μｇ／
m1を含有する培地中で培養し、さらに培養途中に発現を
誘導した。試験管に５m1ずつ分注した上記の培地に、Ｍ
１３５株を接種し、３７℃で一晩培養した。このブロス
１０m1を１ｌの新鮮な培地に移植し、さらに３〜４時間
３７℃で培養し、６６０nmでの吸光度０.８に達した所
で、発現誘導剤であるＩＰＴＧ（ＩＰＴＧ：isopropyl
−β−thiogalactopyranoside）溶液を最終濃度１mMに
なるよう添加した。ＩＰＴＧ添加後３時間で培養を終了
し、４℃において４８００×ｇ、１０分間の遠心分離で
菌体を集めた。

【００６５】モニターペプタイドの精製 収集した菌体８ｇを氷冷した６Ｍグアニジン塩酸、ｐＨ
７.５の溶液８０m1で懸濁し、超音波破砕装置で菌体を
破壊した。遠心分離で固形物を沈殿させて上澄みを得、
これを１０倍量の０.１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）
水溶液で希釈した。再び遠心分離で固形物を除いた後、
上澄み約８００m1を得た。この溶液をあらかじめ０.１
％ＴＦＡで平衡化したＰＲＥＰＡＲＡＴＩＶＥ Ｃ１８
（ウォーターズ社）カラム（１.８×１０cm）にかけ、
０.１％ＴＦＡ溶液中でアセトニトリルの濃度勾配で溶
出した。減圧濃縮機で溶出画分からアセトニトリルを除
いた後、凍結乾燥した。凍結乾燥標品を１０mM酢酸ナト
リウム、ｐＨ４.５に溶かし、ＦＰＬＣ^TM装置でＭｏｎ
ｏＳ^TMカラム（いずれもファルマシア社）に供し、塩化
ナトリウムの濃度勾配で溶出した。得られた画分を「ウ
ェスタンブロット」として知られている方法で分析し、
モニターペプタイドを含む画分を検出した。すなわち、
分析したいサンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気
泳動で展開し、ニトロセルロース膜に電気的に転写し
た。１次抗体に本ペプタイドのアミノ末端側１８アミノ
酸に対するウサギ抗体、２次抗体に西洋ワサビパーオキ
シダーゼで標識された、ウサギ抗体に対するヤギ抗体を
用いた。最終的にパーオキシダーゼによる発色で、モニ
ターペプタイドと思われるバンドを確認した。更にＨＰ
ＬＣのＣ１８カラムにかけ、アセトニトリルの濃度勾配
で溶出し、先に述べたウェスタンブロットおよびトリプ
シン阻害活性を有するペプタイドを得た。

【００６６】同様の方法で１０ｌ分の培養を行い、上記
と同様の方法で１２２μｇのモニターペプタイドの標品
を得、うち１９μｇを６Ｎ塩酸中で１１０℃２４時間加
水分解した。加水分解物を日立アミノ酸分析計３７５型
により分析した。得られたモニターペプタイドのアミノ
酸組成は下の表２のようになり、ラット膵液から得られ
た天然のものとよく一致した。

【００６７】

【表２】

【００６８】また、アミノ酸配列を気相式プロテインシ
ーケンサー（ＰＳＱ−１：島津製作所）で決定したとこ
ろ、アミノ末端のＧｌｙからカルボキシ末端のＣｙｓま
で６１アミノ酸の配列が、天然のモニターペプタイドと
一致した。

【図面の簡単な説明】

【図１】モニターペプタイドをコードする合成ＤＮＡの
二重鎖と、プラスミドｐＫＫ２３３−２をＮｃｏＩとＨ
ｉｎｄ IIIで消化して得られたものとのライゲーション
によるプラスミドｐＫＭＩの構築を模式的に示す図であ
る。

【図２】プラスミドｐＭＪＲ１５６０とプラスミドｐＵ
Ｃ１８とからのプラスミドｐＭＪＲ９６の構築を模式的
に示す図である。

【図３】プラスミドｐＭＪＲ９６とプラスミドｐＫＭ１
とからのプラスミドｐＭＯＮ８の構築を模式的に示す図
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/70 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次のアミノ酸配列を有するモニターペプ
   タイドすなわち、 Gly Asn Pro Pro Ala Glu Val Asn Gly Lys Thr Pro Asn Cys Pro Lys Gln Ile Met Gly Cys Pro Arg Ile Tyr Asp Pro Val Cys Gly Thr Asn Gly Ile Thr Tyr Pro Ser Glu Cys Ser Leu Cys Phe Glu Asn Arg Lys Phe Gly Thr Ser Ile His Ile Gln Arg Arg Gly Thr Cys をコードするＤＮＡ配列を有する化学合成遺伝子。
2. 【請求項２】 モニターペプタイドをコードするＤＮＡ
   配列が 【化１】 である請求項１記載の化学合成遺伝子。
3. 【請求項３】 請求項１記載の化学合成遺伝子をプラス
   ミドベクターに挿入したプラスミド組換え体。
4. 【請求項４】 請求項１記載の化学合成遺伝子をプラス
   ミドベクターに挿入したプラスミド組換え体により形質
   転換された宿主細胞。
5. 【請求項５】 宿主細胞が大腸菌である請求項４記載の
   形質転換された宿主細胞。
6. 【請求項６】 請求項５記載の形質転換された宿主細胞
   を培養してモニターペプタイドを発現させることからな
   る、モニターペプタイドの製造方法。
7. 【請求項７】 形質転換された宿主細胞が大腸菌である
   請求項６記載の方法。