JP2672088B2 - セリンプロテアーゼ阻害剤の生産のための遺伝子組み換え法と、同じ目的に有用なｄｎａ塩基配列 - Google Patents
セリンプロテアーゼ阻害剤の生産のための遺伝子組み換え法と、同じ目的に有用なｄｎａ塩基配列Info
- Publication number
- JP2672088B2 JP2672088B2 JP61500018A JP50001886A JP2672088B2 JP 2672088 B2 JP2672088 B2 JP 2672088B2 JP 61500018 A JP61500018 A JP 61500018A JP 50001886 A JP50001886 A JP 50001886A JP 2672088 B2 JP2672088 B2 JP 2672088B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lys
- cys
- pro
- inhibitor
- gly
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
この出願は1984年12月６日に出願されたU.S.特許出願
連続番号No.678,822の一部継続出願である。 発明の背景 内生タンパク分解酵素は、侵入する生物体、抗原−抗
体複合体と、生態に最早必要乃至は有用でないある特定
の組織タンパクを分解するのに役立つ。正常に機能して
いる生物体では、タンパク分解酵素は、限られた量だけ
生産され、一部はプロテアーゼの阻害剤の合成を通じて
制御されている。 多数の天然に存在するプロテアーゼ阻害剤は、その反
応を場所的に及び時間的に制御することによつて、内生
プロテアーゼを制御している。その上、プロテアーゼ阻
害剤は、感染及び寄生生物によって身体の中に持ち込ま
れたプロテアーゼを阻害することがある。特別にタンパ
クの加水分解の攻撃や感染を受け易い組織、例えば、呼
吸路の組織はプロテアーゼ阻害剤に富んでいる。 プロテアーゼ阻害剤は、ヒト血漿タンパクの約10％を
構成している。少くとも８種の阻害剤がこの材料源から
単離され、文献中にその特性が記載されている。これら
の中には、α２−マクログロブリン（α2M）、α１−プ
ロテアーゼ阻害剤（α1PI）、α１−アンチキモトリプ
シン（α1Achy）、β１−アンチコラゲナーゼ（β1A
C）、及び、インター−α−トリプシン阻害剤（Ｉα
Ｉ）がある。 プロテアーゼ／プロテアーゼ阻害剤のバランスの攪乱
は、気腫、関節炎、糸球体腎炎、歯周炎、筋ジストロフ
イー、腫瘍の侵入及びさまざまな他の病理的状態を包含
するプロテアーゼを媒介とする組織の破壊へと導く。あ
る状況、例えば、敗血症とか急性白血病のようなきびし
い病理学的進行の場合には、存在する遊離のタンパク分
解酵素の量は、分泌細胞からの酵素の放出により増加す
る。それに加えて、他の状況下では、これとは別に生体
の制御的な阻害剤の容量が減少するため、プロテアーゼ
／プロテアーゼ阻害剤−バランスの変化が起きることも
ある。このよえな制御的な阻害剤の容量が減少する例
は、α１−プロテアーゼ阻害剤の欠損であり、肺気腫の
発生と大きく関わり合つている。 生体にこのような常規を逸脱した状態が存在すると、
タンパク分解酵素を制御するための方策を講じなけれ
ば、生体への深刻な傷害が起り得る。したがつて、生体
に投与すれば、タンパク分解酵素を制御することが出来
るプロテアーゼ阻害剤が探し求められてきた。 白血球エラスターゼは、病理学的見地からことのほか
興味深いセリンプロテアーゼの１つの例である。白血球
エラスターゼは、細胞外に放出されると、結合組織やそ
の他の貴重なタンパクを分解する。正常に機能している
生体にとつて、ある一定量の結合組織や他のタンパクを
分解することは必要であるが、過剰の白血球エラスター
ゼの存在は、気腫やリユーマチ様関節炎のような様々な
病理的状態と関連づけられている。白血球エラスターゼ
が正常よりも大量に存在する場合、その効果に対抗する
ため、白血球エラスターゼ活性を阻害するプロテアーゼ
阻害剤が探し求められてきた。精製した形で薬剤として
役立つに足る量を、組み換えDNA法によつて生産できる
としたら、このようなプロテアーゼ阻害剤は特別に有用
であろう。 文献によると、過去において、少くとも２種の白血球
エラスターゼ阻害剤が同定されている。“ヒト多形核白
血球の中性プロテアーゼ”（Havemannら（編）UrbanとS
chwarzenberg,Inc.（1978））中の“ヒト粘液性分泌物
中の顆粒球中性プロテアーゼの酸に安定な阻害剤；生化
学と可能な生物学的機能”において、Schieislerらが記
述した１つのタンパクがヒトの精液のプラズマ及び痰か
ら単離され、Ｎ末端アミノ酸としてチロシンを持つ、大
きさが11kdaのタンパクとして性格づけられた。このタ
ンパクの文献報告からは、部分的なアミノ酸配列しか提
供されていないが、部分的な配列からさえも、このタン
パクは本発明のタンパク類とは実質的に異なつているこ
とがわかる。このタンパクのアミノ酸配列の報告と、本
発明のタンパクのアミノ酸配列データーから考えると、
Schiesslerらによつて配列が決定されたものは、元来一
本鎖のポリペプタイドではないタンパクの分解物であつ
たかもしれないということが発明者らに示唆される。 １例において、ヒトの血漿から単離された２番目のタ
ンパクは、α１−protease inhibitorと名付けられた。
このタンパクに関する業績は、TravisとSalvesenによつ
て総説、Annual Review of Biochemistry53:655−709
（1983）にまとめられている。このタンパクのアミノ酸
配列のレポートは、それも本発明のタンパクから実質的
に異なつていることを示している。 本発明の一本鎖ポリペプタイドのタンパク類が以前の
技術による一本鎖ポリペプタイドのセリンプロテアーゼ
阻害剤のいずれとも著しく異なつているから、以前に研
究された、一本鎖ポリペプタイドのセリンプロテアーゼ
阻害剤類は本発明のタンパク類とは“実質的に相同”で
はない。 トリプシンは、病理学的見地から特別興味のあるもう
１つのタンパクである。トリプシンは、膵臓炎のような
種々の急性症状のなかで、膵臓のような特定の軟かい器
官の組織の分解を始めることが知られている。これらの
症状の治療を目的として、トリプシンの作用を阻害する
だろうと期待されたタンパク類の使用による種々の努力
がなされたが、目覚しい成功は得られなかつた。このよ
うな努力の実例は、ヒトの膵臓炎の治療に牛の外生トリ
プシン阻害剤を用いる試みである。このような技術は、
ヨーロツパで試みられたが、米国食品医薬品局（FDA）
によつて効果があると認められなかつた。したがつて、
種々の急性または慢性症状中の、過剰のトリプシンを中
和する効果のあるプロテアーゼ阻害剤が必要である。上
に論議した白血球エラスターゼ阻害剤の場合にそうであ
つたように、トリプシン阻害剤は、もし、組み換えDNA
法によつて精製した形で、薬剤として役立てるに足る量
だげ単離製造できれば、ことのほか有用であろう。 カテプシンＧは、白血球に大量に存在するもう１つの
プロテアーゼである。カテプシンＧは、補足的経路のタ
ンパクをはじめとする種々の価値のあるタンパクを、in
vitroで分解できることが知られている。膵臓のエラス
ターゼが、膵臓炎で役割を果している可能性のあるもう
１つのプロテアーゼである。したがつて、これらのプロ
テアーゼに対する阻害剤も薬剤としての潜在的価値があ
る。 白血球エラスターゼ、トリプシン、カテプシンＧと膵
臓のエラスターゼは、セリンプロテアーゼとして知られ
ている一群のプロテアーゼの例であり、共通の構造と作
用機作の要素を持つている。それらの異なる基質に対す
る活性や、異なる阻害剤への活性は、２、３のアミノ酸
残基だげが異なつていることから生ずると信じられてい
る。類推によれば、やはり構造の作用機作の共通の要素
を持つていて、比較的少ないアミノ酸の変化が、異なつ
たプロテアーゼの阻害を結果として生ずるセリンプロテ
アーゼ阻害剤を想像することが可能であり、しかも、少
くともこの群の１員は、前述の群中のセリンプロテアー
ゼのすべてを阻害するであろう。そうであるとすれば、
この群のセリンプロテアーゼ阻害剤は、大きな価値があ
るであろう。 驚くべきことに、本発明者達は、このようなセリンプ
ロテアーゼ阻害剤の合成を導き行なうことができるDNA
配列を発見し、その阻害剤は、耳下腺分泌物から単離さ
れたものと生物学的に等価である。組み換えDNA法によ
つて作られ、本特許に提出される本発明のプロテアーゼ
阻害剤は、少くとも２箇所の活性部位を持つている。す
なわち、白血球エラスターゼ阻害の性質を示す１つの部
位と、トリプシンに対して阻害活性を示す２番目の部位
である。 現在の発明によつて生産された組み換え阻害剤は、熱
や酸による変性に著しく抵抗性があり、また様々なタン
パク分解酵素によるタンパク分解作用に対しても抵抗性
があると考えられる。この出願に用いられるように“組
み換え阻害剤”は、組み換えDNAの方法論と技術によつ
て生産されるプロテアーゼ阻害剤のことを指すよう意図
されている。さらに、本発明の組み換え阻害剤の活性形
は、哺乳動物の身体の細胞外の部位で普通に出会うよう
な条件下では、熱力学的に安定である。組み換えプロテ
アーゼ阻害剤の変成した形はまた、ジスルフイド結合を
形成する能力を持つており、生化学的刺戟の存在しない
状態で活性三次構造をとるのに必要な非共有結合的相互
作用を成立させる能力がある。 より十分に、ここに以下に提示する本発明のDNA塩基
配列は、発表されている他の白血球エラスターゼ阻害剤
のアミノ酸配列とは大きく異なつているところのタンパ
クの合成を導き行なう能力がある。したがつて、本発明
のDNA塩基配列の同定によつて、本出願の中で明らかに
される。新規の組み換えプロテアーゼ阻害剤の製造に関
する組換えDNA法の本発明を可能とした。 このような組換え法は、セリンプロテアーゼ阻害活性
を持つている経済的な薬剤組成物を供給するために、量
的にも、純度的にも、阻害剤の製造を可能にする。さら
に、DNA塩基配列の同定により、上述のセリンプロテア
ーゼ阻害剤の類縁体を製造する組み換えDNA法の発明を
可能にした。 発明の総括 本発明は、プロテアーゼ阻害剤製造に関するものであ
り、一般に、そして更に特定的には、ヒト、多形核（PM
N）−顆粒球プロテアーゼを阻害対象とした組換え阻害
剤の製造である。特にこの発明は白血球エラスターゼや
トリプシンを始めとするヒト・セリンプロテアーゼに対
する阻害剤の製造のための組換えDNA法に関するもので
ある。 それに加えて、本発明は、本セリンプロテアーゼ阻害
剤の類縁体の製造に関する組み換えDNA法にも関連す
る。本発明はまた、以下に述べるような組み換えDNA法
において有用な合成並びに天然のDNA塩基配列に関する
ものである。 セリンプロテアーゼ阻害活性を持つ一本鎖のポリペプ
タイドであるセリンプロテアーゼ阻害剤の組み換えDNA
合成法を提供することが本発明の目的である。これらの
阻害剤は、ヒトの耳下腺分泌物から単離された天然の白
血球エラスターゼまたはトリプシン阻害剤によつて示さ
れる活性と生物学的に同等な活性を持つている。 これらのセリンプロテアーゼ阻害剤の代替的組み換え
DNA合成を容易にするために、等価の天然のDNA塩基配列
と同様に、これらの組み換えプロテアーゼ阻害剤の生産
を導き行なうことができる合成DNA塩基配列を供給する
ことが、この発明のなおそれ以上の目的である。このよ
うな自然のDNA塩基配列は、プロテアーゼの阻害剤の合
成を導き行なうことができる遺伝子が、そこから単離、
同定されうるcDNAもしくはジエノミツクライブラリーか
ら単離されうる。 さらに、先に検討したプロテアーゼ阻害剤の類縁体を
製造する組み換えDNA法及びこのような方法に役立つ、
相当する類縁DNA塩基配列を提供することが本発明の目
的である。 なおその他の本発明の目的と利点は、以下に続く記述
において一部出てくるであろう。そして一部は記述から
明白であるか、発明の実施から学ばれることもあろう。
その目的と利益は、添付した特許請求の範囲において特
に指摘されている手段と組合せによつて了解され、達成
されるであろう。 この目的を達成するため、そして本発明の目的に従つ
て、セリンプロテアーゼ阻害活性を示すところの、活性
型で一本鎖ペプタイドのタンパクであるプロテアーゼ阻
害剤の組み換えDNA方法論による生産を導き行なうこと
ができるDNA塩基配列を発見した。これらの組み換えプ
ロテアーゼ阻害剤は、熱や酸による変性に対して著しく
抵抗性である。さらに、これらのプロテアーゼ阻害剤
は、キモトトリプシンやマウスの顎下腺プロテアーゼや
クロストリパインのような多くのタンパク分解酵素に接
触した後でさえ、それらの生物活性を維持している。 これらの組み換えセリンプロテアーゼ阻害剤の製造を
導き行なうために発見されたDNA塩基配列の（遺伝暗号
鎖）コーデイングストランドは以下の通りである。 上述の略号によつて表示されたヌクレオタイドは、提
起された具象化の詳細な記述において明らかになる。 これらの遺伝子組み換えセリンプロテアーゼ阻害型、
特に本発明の分泌形白血球プロテアーゼ阻害剤（SLPI）
の製造を導き行なうために発見した、２番目の好ましい
DNA塩基配列に対するコーデイングストランドは以下の
如くである。 さらに目的を達成するため、そして本発明の目的に従
つて、上に掲げた天然または合成DNA塩基配列を用い
て、本セリンプロテアーゼ阻害剤の微生物製造に帰着す
る組み換えDNA法を明らかにする。この組み換えDNA法は
以下の項目を包含する。 （ａ） 宿主微生物を導き、セリンプロテアーゼ阻害活
性、好ましくは白血球エラスターゼ阻害活性を持つタン
パクの製造を行なうことができるDNA配列の調製。 （ｂ） 宿主微生物の中に導入され、複製することがで
きるDNA塩基配列をクローニングすること。このような
ベクターはDNA塩基配列に対するオペレーシヨナルエレ
メント（操作要因）を含んでいる。 （ｃ） DNA塩基配列とオペレーシヨナルエレメントを
含むベクターをプロテアーゼ阻害タンパクを発現するこ
とができる宿主微生物の中に移すこと。 （ｄ） ベクターの増幅と阻害剤の発現のため適切な条
件下でその微生物を培養すること。 （ｅ） 阻害剤を収穫すること；そして （ｆ） 阻害剤がセリンプロテアーゼ阻害活性を有する
活性三次構造をとれるようにすることである。 本発明において使うための天然のDNA塩基配列の同定単
離を容易にするため、本発明者達はヒト耳下腺組織cDNA
ライブラリーを開発した。このライブラリーは、細胞が
本発明のセリンプロテアーゼ阻害剤を合成するようにし
むけることができる遺伝情報を含んでいる。ここに述べ
られた組み換えDNA法に用いられることがある他の天然D
NA塩基配列は、ヒト・ジエノミツクライブラリーから単
離することができる。 本発明の過程において役に立つ合成塩基配列は、ポリ
ヌクレオチドの合成と、この道の普通の技量を持つた人
人にとつて知られている配列を行なう技術によつて作る
ことができる。先に述べた過程において、有用な天然の
DNA塩基配列は、以下の項目を含む方法によつて同定・
単離することができる。 （ａ） 細胞から、好ましくは耳下腺の細胞からセリン
プロテアーゼ阻害剤を発生することができるヒトcDNAラ
イブラリーを調製すること。 （ｃ） プロテアーゼ阻害剤の遺伝子またはそのタンパ
ク生産物に結合することができる少なくとも１つのプロ
ーブでヒトDNAライブラリーをプローブすること。 （ｃ） クローンが遺伝子又はそのタンパク生成物に対
する、少くとも１つのプローブに結合する能力によつ
て、阻害剤をコードしている遺伝子を含む少なくとも１
つのクローンを同定すること。 （ｄ） 同定されたクローンから阻害剤をコードしてい
る遺伝子の単離、そして （ｅ） 遺伝子またはそれについての適切な断片を宿主
の微生物の遺伝子を維持し、表現することに必要なオペ
レーシヨナルエレメントにつなぐこと。 前に述べた過程において、有用な天然のDNA塩基配列
も、以下の項目を含む方法によつて同定・単離できる。 （ａ） 宿主rec A rec BC E.coliにおいて繁殖させた
ヒト・ジエノミツクDNAライブラリーを調製すること。 （ｂ） ヒト・ジエノミツクDNAライブラリーをセリン
プロテイン阻害剤遺伝子に結合することができるか、そ
のタンパク生成物に結合することができる少くとも１つ
のブローブでプローブすること。 （ｃ） 遺伝子又はそのタンパク産物に対する少くとも
１つのプローブに結合するクローンの能力によつて阻害
剤をコードする遺伝子を含む少くとも１つのクローンを
同定する。 （ｄ） 同定されたクローンから阻害剤をコードする遺
伝子を単離する。そして、 （ｅ） 遺伝子もしくは適当なその断片を宿主微生物中
の遺伝子を維持し発現するのに必要なオペレーシヨナル
エレメントにつなげること。 さらに、目的を達成するため、そして本発明の目的に
従つて、セリンプロテアーゼ阻害剤の薬剤的に有用なア
ナログは上に詳述した遺伝子組み換えDNA法により、適
切なベクターにクローニングを行なつて、適切な宿主微
生物に移した場合、欲しいアナログの発見を誘導できる
遺伝子をつくり出すために、上に列挙した組み換えDNA
技術を通じて合成的なDNA塩基配列もしくは天然DNA断片
を変えることにより生産することができる。 さらに、目的を達成するために、そして本発明の目的
に従つて、本発明に従つた組み換えプロテアーゼ阻害
剤、もしくは上に述べた、組み換えDNA法で生産された
生物活性を有するアナログを活性成分として含んでいる
薬剤組成物を明らかにする。 本発明に組み込まれていてこの出願の一部をなしてい
る添付されている図は、この発明に役立つ種々のプラス
ミツドを図解し、同時に、本発明の原理を説明するのに
役立つ記述を含んでいる。 図の簡単な記述 第１図は、プラスミドpSGE6の地図である。 第２図は、プラスミドpSGE8の地図である。 第３図は、プラスミドpGS285の地図である。 第４図は、プラスミドpGS485である。 好ましい実施態様に関する記述 現在において提出した発明の実施態様について、今、
詳細に述べよう。それらは、あとに続く実施例とともに
本発明の原理を説明するのに役に立つ。 上に記したように、本発明は精製した形で単離された
プロテアーゼ阻害剤に関するものである。望ましくは、
本発明のセリンプロテアーゼ阻害剤は、一本鎖ポリペプ
チドタンパクであり、ヒト・耳下腺分泌物から単離され
た天然のセリンプロテアーゼ阻害剤に実質的に同族であ
るかもつとも好ましくは生物学的に等価である。特許明
細と請求範囲を通じて使われている“生物学的に等価”
とは、組成物は、プロテアーゼによつて誘起された、同
じ型の組織の損傷を防ぐことができるが、必ずしも天然
プロテアーゼ阻害剤と同程度ではないということであ
る。あとに続く明細と請求範囲を通じて使用されている
“実質的に相同”とは、天然の耳下腺阻害剤に対して以
前に報告されている一本鎖ペプタイドセリンプロテアー
ゼ阻害剤によつて示された相同性以上の相同性のことで
ある。好ましくは、相同性の程度が40％より大きく、最
も好ましくは50％より大きく、特別に好ましい群のタン
パクは天然耳下腺阻害剤との相同性が60％より大きい。
上に記述したような百分率の相同性は、２つの配列のう
ちの小さい方に見出された成分の百分率として計算され
ており、２つの配列のうちの大きい方でも、同じことが
みつかるかもしれない。この成分は４つの続いたアミノ
酸の配列として理解されているものである。 本発明の組み換え法によつて製造される好ましいプロ
テアーゼ阻害剤は、Robert C. Tompson et.al．の“セ
リンプロテアーゼ阻害剤と同じものを単離する方法”と
題して、1984年12月６日に提出した米国特許出願連続番
号No.678,823及びこの出願と同期日に出願した、Robert
C. Tompsonらの“セリンプロテアーゼ阻害剤と同じも
のを単離する方法”と題する米国特許出願連続番号No._
に記述されている。このようなプロテアーゼ阻害剤は、
熱や酸による変性に対し、著しく抵抗性であり、又、キ
モトリプシン、マウス顎下腺プロテアーゼ、クロストリ
パインをはじめとする、多くのタンパク分解酵素に接触
した場合、活性喪失に対し抵抗性である。これらの阻害
剤は、必要なジスルフイド結合を形成する能力を持ち、
生化学的刺戟の存在しないところで、プロテアーゼ阻害
剤活性を表現することができる３次構造をとるべく適切
な非共有結合適相互作用を受ける。あるいは、ジスルフ
イド結合が切れて非共有結合的相互作用が破壊されても
このような結合を再生し、相互作用を取戻し、生化学的
刺戟のないところで、このような活性３次構造を再びと
ることができる。 これらの特性を持つている好ましいセリンプロテアー
ゼ阻害剤のアミノ酸の配列を検討し、その配列を以下の
如く決定した。 Ser−Gly−Lys−Ser−Phe−Lys−Ala−Gly−Val−Cys−
Pro−Pro−Lys−Lys−Ser−Ala−Gln−Cys−Leu−Arg−
Tyr−Lys−Lys−Pro−Glu−Cys−Gln−Ser−Asp−Trp−
Gln−Cys−Pro−Gly−Lys−Lys−Arg−Cys−Cys−Pro−
Asp−Thr−Cys−Gly−Ile−Lys−Cys−Leu−Asp−Pro−
Val−Asp−Thr−Pro−Asn−Pro−Thr−Arg−Arg−Lys−
Pro−Gly−Lys−Cys−Pro−Val−Thr−Tyr−Gly−Gln−
Cys−Leu−Met−Leu−Asn−Pro−Pro−Asn−Phe−Cys−
Glu−Met−Asp−Gly−Gln−Cys−Lys−Arg−Asp−Leu−
Lys−Cys−Cys−Met−Gly−Met−Cys−Gly−Lys−Ser−
Cys−Val−Ser−Pro−Val−Lys−Ala. 上記の略号は、ポリペプチド中のアミノ酸残基に次の
如く対応する。 アミノ酸 略 号 アラニン Ala バリン Val ロイシン Leu イソロイシン Ile プロリン Pro フエニールアラニン Phe トリプトフアン Trp メチオニン Met グリシン Gly セリン Ser スレオニン Thr システイン Cys チロシン Tyr アスパラギン Asn グラタミン Gln アスパラギン酸 Asp グラタミン酸 Glu リジン Lys アルギニン Arg ヒスチジン His ここに明らかにされた組み換えDNA法によつて製造さ
れたこれらのプロテアーゼ阻害剤は１つ以上の区別でき
るドメインを持つていることが発見された。１つ以上の
区別できるドメインとは、そのタンパクが異なる酵素に
対して機能する複数の活性部位を持つているということ
である。これらの場所の存在と位置つけは、プロテアー
ゼ阻害剤の少くとも２つの部分の間には、実質的な相同
性があることが発見されたことによつて決定された。区
別できるドメインの存在が、本プロテアーゼ阻害剤に白
血球エラスターゼもトリプシンも含む広い範囲のセリン
プロテアーゼを阻害する能力を与えていると考えられ
る。 さらに、これらプロテアーゼ阻害剤のはつきりしたド
メインの複数性のために、プロテアーゼ阻害剤が附加的
特性をもつプロテアーゼ阻害剤をつくるために、さまざ
まな他の活性部位がその上に構築されるような枠組みと
して役立つかもしれないということが注目された。好ま
しい本発明の具体化は、白血球エラスターゼ、カテプシ
ンＧ、膵臓のエラスターゼとトリプシンを阻害するプロ
テアーゼ阻害剤の生産を含んでいる。これらの酵素はす
べて共通のメカニズムと多くの構造的特徴を共有してい
るセリンプロテアーゼとして知られているプロテアーゼ
のクラスのメンバーである。本発明によつて生産された
プロテアーゼ阻害剤において、小数のアミノ酸側鎖を細
工することによつて阻害剤の複合性が創り出され、各々
が全体のクラスのセリンプロテアーゼの少くとも１員を
阻害することができると考えられる。その上、このよう
な側鎖の修飾は、上に述べたような特定のセリンプロテ
アーゼのクラスのメンバーに関して阻害活性が改善され
ている複数性の阻害剤を産出することが期待できる。 これらの目標を達成するのに必要なアミノ酸の側鎖の
変化は、本発明によつて生産された好ましい阻害剤と阻
害剤の重要な機能部分がＸ−線結晶学によつて解明され
た他のセリンプロテアーゼ阻害剤の間の構造類似性の特
定の要素によつて示唆される。構造的類似性のこれらの
要素は上述の本発明によつて製造された好ましいセリン
プロテアーゼ阻害剤のアミノ酸17から29及び70から83を
含んでいる。量的か質的かのいずれかにおいて、トリプ
シン様セリンプロテアーゼ阻害剤の活性を改良するため
に示唆された変化は、20番目のアミノ酸をArgからPhe、
TyrあるいはTrp、72あるいは74番目のアミノ酸をLeuか
ら、LysまたはArg、そして73番目のアミノ酸をMetからL
ysまたはArgへ変換することの１つもしくはそれ以上を
含んでいる。 カテプシンＧをはじめとするキモトリプシン様セリン
プロテアーゼに対する活性を、量的又は質的に改善する
べく示唆された変化は、アミノ酸20をArgからPne、Tyr
またはTrpへ、アミノ酸72または74をLeuからPhe、Tyrま
たはTrpへ、そしてアミノ酸73をMetからPhe、Tyrもしく
はTrpへ変換することを、１つもしくはそれ以上行なう
ことを含んでいる。 膵臓のエラスターゼ様セリンプロテアーゼに対する阻
害剤の活性を、量的もしくは質的に変えるべく示唆され
た変化は、アミノ酸20をArgからAalへ、72または74番目
のアミノ酸をLeuからAlaへ、そして73番目のアミノ酸を
MetからAlaへ変換することの１つ又はそれ以上を含んで
いる。 本発明の実施例にあたつては、本発明のタンパクに新
しいプロテアーゼ阻害活性を付与するためのアミノ酸の
変更は、白血球エラスターゼもしくはトリプシンに対す
る阻害剤の活性を破壊するかもしれないということを心
にとめておかねばならない。このような効果は本発明の
教えに従つて行なわれる型通りの実験によつて決定され
よう。 さらに、上に提出されたように、特定のアミノ酸もし
くは特定のアミノ酸の配列を置換すると、一方では強化
されないドメインの活性を幾分か犠牲にすることになる
が、本発明のプロテアーゼ阻害剤の白血球エラスターゼ
もしくは、トリプシン阻害活性のいずれかを増強するか
もしれないということが考えられる。事実：阻害タンパ
クの中のどの領域の活性も、適切なアミノ酸置換によつ
て完全に除去され、その際、それに対して通常そのタン
パクが活性がある１つか、もしくはいくつかの酵素のサ
ブセツトに対して、特異性のあるタンパクをつくるかも
しれない。例えば、73の位置のMetに対し、Glyを置換す
るか、もしくは、72か、74の位置のLeuに対してGlyを置
換すると、白血球エラスターゼ阻害ドメインを不活性化
するが、20の位置のArgに対しGlyを置換するとトリプシ
ン阻害ドメインを不活性化する。これらドメインはま
た、各々が望ましい阻害機能を保持する、別々のタンパ
クに分けることもできる。本発明の請求範囲は、これら
の手段によるこのような阻害剤を生産する他の工程に対
しても拡張される。 本発明者らは、上に議論したプロテアーゼ阻害剤の細
胞内生産を導き行なうことができる合成的DNA塩基配列
を発見した。この塩基配列は、次のような構造をもつて
いる。 この中で、ヌクレオチドは、下記のような略号で表さ
れている。 ヌクレオチド 略 号 デオキシアデニル酸 Ａ デオキシグアニル酸 Ｇ デオキシシチジル酸 Ｃ チミジル酸 Ｔ 本発明者らは、上に議論したプロテアーゼ阻害剤、と
りわけ、上述の分泌性白血球プロテアーゼ阻害剤（SLP
I）の細胞外生産を導き行なうことができる２番目の好
ましい合成DNA塩基配列を発見した。この塩基配列は次
のような構成をもつている。 上に注意したように、本プロテアーゼ阻害剤の複合的
ドメイン構造のため、上に議論したようなセリンプロテ
アーゼ阻害剤の類縁体生産を導くことができるDNA配列
を結果として生ずる、ここに提出する合成的DNA配列に
変化を与えることが考えられる。 特に本発明に従つて組み換えDNA技術によつて生産さ
れたセリンプロテアーゼ阻害剤の好ましい類縁体は、次
のアミノ酸配列をもつている。 R1−Gly−Lys−Ser−Phe−Lys−Ala−Gly−Val−Cys−P
ro−Pro−Lys−Lys−Ser−Ala−Gln−Cys−Leu−R2−Ty
r−Lys−Lys−Pro−Glu−Cys−Gln−Ser−Asp−Trp−Gl
n−Cys−Pro−Gly−Lys−Lys−Arg−Cys−Cys−Pro−As
p−Thr−Cys−Gly−Ile−Lys−Cys−Leu−Asp−Pro−Va
l−Asp−Thr−Pro−Asn−Pro−Thr−Arg−Arg−Lys−Pr
o−Gly−Lys−Cys−Pro−Val−Thr−Tyr−Gly−Gln−Cy
s−R8−R3−R9−Asn−Pro−Pro−Asn−Phe−Cys−Glu−
R4−Asp−Gly−Gln−Cys−Lys−Arg−Asp−Leu−Lys−C
ys−Cys−R5−Gly−R6−Cys−Gly−Lys−Ser−Cys−Val
−Ser−Pro−Val−Lys−R7, ここで R1とR7は同一か、異なったものであり、置換もしくは
無置換アミノ酸残基もしくはその誘導体から成立つ群か
ら選ばれている。そして R2、R3、R4、R5、R6、R8及びR9は同一か異なつたもの
であり、メチオニン、バリン、アラニン、フエニールア
ラニン、チロシン、トリプトフアン、リジン、グリシン
及びアルギニンからなる群から選ばれる。 上に示されたDNA塩基配列は、本発明の好ましい具象
化を表していることに注目すべきである。ジエネテイツ
クコードの縮重のためにヌクレオチドの多数の選択、本
プロテアーゼ阻害剤、もしくはその類縁体の生産を導き
行なうことができるDNA塩基配列の導く多数のヌクレオ
チドの選択がなされうるということが理解されるべきで
ある。上に提出した塩基配列に対し、機能的に同等であ
るDNA塩基配列もしくは上に提出したアミノ酸配列に従
つて生産されたプロテアーゼ阻害剤のアナログの生産を
導き行なうであろうところの配列に機能的に等価である
配列は、それ自体で本発明の中に包含されるものとす
る。以下の図式は、縮重したジエネテイツクコードの結
果として考えられるコドンの置換の例として、上に数え
上げた好ましいアミノ酸配列の製造のための本発明の範
囲に含めることを意図した追加のDNA配列である。この
タンパクの生産に対する等価DNA塩基配列を決定するた
めの例を辿ることによつて、この道の普通のわざを持つ
た人々なら、好ましいアミノ酸配列の類縁体の生産のた
めの等価なDNA塩基配列も決定できる。 上の配列においては、用いられる略号は下に示される
ヌクレオチドを表わすよう意図されている。ヌクレオチド 略 号 A,G,C,T Ｎ A,G Ｐ C,T Ｑ すぐ上にかかげたものを含め、本発明の合成DNA塩基
配列において用いられる遺伝暗号を選択する場合に、特
定のアミノ酸を指示するのに用いられる遺伝暗号は高度
に発現されるタンパクと関連するものであることが望ま
しい。これらの望ましい遺伝暗号は１部Granthan,R et
al．らの“Codon Catalog Usage Is a Genome Strategy
Modulated For Gene Expressivity"は、Nucleic Acids
Research ９:r43（1981）に出ている。本発明の好まし
いDNA配列は、縮重した配列のいずれに対しても、Esche
richia coliの配列遺伝暗号を選択することによつて選
ばれた。 さらに、本発明のプロテアーゼ阻害剤の類縁体の生産
を導き行なうことが出来る追加の合成DNA塩基配列をつ
くり上げるための合成DNA塩基配列の変換を容易にする
遺伝暗号を選ぶことが望ましい。特に、もし可能なら、
制限酵素、エンドヌクレアーゼの切断位置を、追加の遺
伝暗号を挿入することが望ましい合成DNAの位置の近く
に、もしくは類縁体が作られるように遺伝暗号を取り換
えることが望ましい位置に、もつてくることができるよ
うにヌクレオチド配列を選ぶことが望ましい。本発明の
DNA配列の望ましい実施態様においては、制限酵素の切
断位置が上に示したヌクレオチド配列の下に示してあ
る。 ここに考えられている合成DNA配列をつくり出す方法
は、一般的に、最近の報告によつて導かれたこの道の普
通のわざの１つによつて遂行される型通りの業務の範囲
内にある。ここで明らかにした合成DNA塩基配列を得る
ために用いられる適切な方法の例は、Matteacci,M,D,と
Caruthers,M.H.,J.AH.Chem.Soc.103:3185（1981）及
び、Beaucage,S.L.とCaruthers,M.H,Tetrahedron Lett.
22;1859（1981）、によつて提出されており、両方と
も、特別に参照事項としてこの中に組み込まれている。 本発明の代替的実施態様において、１つのDNA塩基配
列が、本発明の望ましい分泌白血球プロテアーゼ阻害剤
（SLPI）をコードするヒト・ジエノミツクライブラリー
から単離された。この４番目の遺伝暗号からコードさ
れ、現在発明者らに知られているイントロン（介在配
列）を含むこの塩基配列は以下の通りである。 この配列においては、アミノ酸残基に用いられた１文
字の略号は普通に用いられており、例えば、A.L.Lehnin
gerによるBiochemistry第２版、Worth Publisher,Inc.,
New York,New York（1976）72頁に出ている。 この塩基配列とここに含まれるアミノ酸配列データー
を用いて、上のジエノミツク配列に加えられた場合、全
プロテアーゼ阻害剤をコードする遺伝子に到達する合成
DNA配列が構築できる。そのかわりに、上に示したDNA塩
基配列を用いてプローブを作り、最初の３つのアミノ酸
に対するコドンを持つている、ヒトジエノミツクライブ
ラリーから、DNA断片を回収するのに用いた。 このようなプローブは、それに加えて適切なリーダー
配列を含むヒトジエノミツク配列を同定するのに用いら
れる。このリーダー配列、または、どの他の適切なリー
ダー配列も、DNAジエノミツク配列と併用して、哺乳動
物の発現システムに用いられると考えられる。 本発明のもう１つの別法としての具体化において、本
発明の好ましい分泌性白血球プロテアーゼ阻害剤の細胞
内生産を導き行なうことができるDNA配列をコードする
耳下腺ライブラリーからcDNAクローンを単離した。この
クローンはAccession No._の下に、Rockville,Maryland
のAmerican Type Culture Collectionに預けてある。 セリンプロテアーゼ阻害活性を有する少なくとも１つ
の活性部位をもつ１本鎖ポリペプタイドから構成されて
いる１つのプロテアーゼ阻害剤の製造に対する組み換え
DNA法が明らかとなつた。発明の１つの具体化におい
て、この活性部位は、ヒト・耳下腺分泌物から単離され
た天然の白血球エラスターゼ阻害剤の活性部位と生物学
的に等価な方法で機能する。天然又は合成DNA塩基配列
は、プロテアーゼ阻害剤の直接生産に用いることができ
る。この方法は、以下の工程を含む。 （ａ） 宿主微生物が、セリンプロテアーゼ阻害剤活性
をもつているタンパクを生産するよう導くDNA塩基配列
の調製。 （ｂ） DNA塩基配列を宿主に移し増殖することができ
るベクターにそのDNA塩基配列をクローニングするこ
と。このようなベクターは、そのDNA塩基配列に対して
オペレーシヨナルエレメントを含んでいる。 （ｆ） 合成DNA塩基配列とオペレーシヨナルエレメン
トを含むベクターをプロテアーゼ阻害剤を発現すること
ができる宿主微生物に移す。 （ｄ） その微生物をベクターの増殖と阻害剤の発現に
適切な条件下で培養すること。 （ｅ） 阻害剤を収穫すること。そして、 （ｆ） 阻害剤がセリンプロテアーゼ阻害活性を持つ、
活性３次構造をとれるようにすること。 この方法における使用のために考えられた合成DNA塩
基配列が、上に詳細に検討された。代替的実施態様にお
いて、この方法で天然のDNA塩基配列も使うことができ
るということが更に考えられる。これらの配列には、cD
NAもしくはジエノミツクDNA断片が用いられる。この実
施態様のより好ましい変形として天然のDNA配列は、以
下の項目を含む方法によつて得られる。 （ａ） セリンプロテアーゼ阻害剤を生成できる細胞、
さらに望ましくは、耳下腺の細胞からヒトのcDNAライブ
ラリーを調製する。 （ｂ） プロテアーゼ阻害剤遺伝子もしくはそのタンパ
ク産物に結合することができる少くとも１つのプローブ
で、ヒトDNAライブラリーを検索する。 （ｃ） そのクローンが遺伝子もしくはそのタンパク産
物に対する、少くとも１つのプローブと結合する能力に
よつて阻害剤をコードする遺伝子を含む少くとも１つの
クローンを同定する。 （ｄ） 選ばれた単一クローンもしくは複数のクローン
から阻害剤をコードする遺伝子の単離。 （ｅ） 遺伝子もしくはその適切な断片を宿主微生物中
の遺伝子を維持し、発現するために必要なオペレーシヨ
ナルエレメントにつなげること。 前出の工程において、有用な天然のDNA塩基配列も以
下の工程を経て同定単離される。 （ａ） より好ましくは、宿主rec A rec BC E.coli中
で繁殖させたヒト・ジエノミツクライブラリーを作る。 （ｂ） ヒトジエノミツクライブラリーをセリンプロテ
イン阻害剤遺伝子、もしくは、その生産物に結合するこ
とができる少なくとも１つのプローブを用いて検索す
る。 （ｃ） そのクローンが遺伝子またはタンパク産物に対
する少なくとも１つのプローブに結合するクローンの能
力によつて阻害剤をコードする遺伝子を含む少くとも１
つのクローンを同定する。 （ｄ） 同定されたクローンからの阻害剤をコードする
遺伝子を単離する。 （ｅ） 遺伝子もしくはその適当なフラグメントを宿主
微生物中の遺伝子を維持し、表現するのに必要なオペレ
ーシヨナルエレメントにつなげること。 上にかかげた方法を用いるのに、適切な天然のDNA遺
伝子を単離するにあたり、適当な遺伝子の両端部分、す
なわち遺伝子の断面の内側または最も近い部分に位置し
ている２つの制限酵素切断部位を同定することがより好
ましい。適切な遺伝子を含むDNA断片を次に適切な制限
エンドヌクレアーゼを用いて、ゲノム物質の残りから除
去する。切り出した後、セリンプロテアーゼ阻害剤タン
パクのＮ−及びＣ−末端にコードすることができ、また
そのDNA配列をそのオペレーシヨナルエレメントに融合
させることができるように、DNA配列の３′及び５′末
端は再構築される。 本発明において、使用のため考えられるベクターは、
優先されるか、もしくは、必要となるオペレーシヨナル
エレメントとともに、上の検討したようなDNA塩基配列
が挿入され、又そのベクターが、その後宿主微生物に移
され、その微生物中で複製出来るような、ベクターすべ
てを含む。より好ましいベクターは、その制限酵素切断
部位がよく報告されていて、DNA塩基配列の転写に、よ
り好まれるか、もしくは必要である、オペレーシナルエ
レメントを含んでいるようなベクターである。 ここで検討されるオペレーシヨナルエレメントには、
少なくとも１つのプロモーター、少くとも１つのオペレ
ーター、少くとも１つのリーダー配列、少くとも１つの
シヤイン−ダルガーノ配列、少くとも１つの停止コドン
及びベクターDNAの適切な転写とその次の翻訳に必要
か、より好ましい他のDNAはすべて含まれる。特に、こ
のようなベクターは、少くとも１つの選択可能なマーカ
ーとともに、宿主微生物によつて認識される複製の少く
とも１つの起点、及び合成DNAの塩基配列の転写を始め
ることが出来る少くとも１つのプロモーター塩基配列を
含んでいると予測されている。ベクターは、ある実施態
様においては、レギユレーターとして機能することがで
きるあるDNAを含み、レギユレータープロテインをコー
ドすることができる他のDNA塩基配列を含んでいること
が、さらに、より好ましい。これらのレギユレーター
は、１つの実施態様においては、ある環境条件の存在下
でDNA配列の発現を防ぐのに役立つ、他の環境条件では
転写と、続いて起る合成DNA塩基配列によつてコードさ
れたタンパクの発現が行なわれる。とりわけ、例えば、
イソプロピルチオー−ｄ−ガラクトシツドが存在しない
と、合成DNAの発現が起らないようなベクターのなかに
は調節断片が挿入されることがより好ましい。この状況
下では、合成DNAを含む形質転換した微生物は、プロテ
アーゼ阻害剤の発現がはじまる以前にある望ましい密度
まで育てられるかもしれない。この実施態様において
は、望ましいプロテアーゼ阻害剤の発現は、望ましい密
度が達された後にDNA塩基配列の発現を起すことができ
るある物質を微生物の環境に加えることにより誘導され
る。 それに加えて、ベクター中か、もしくは合成DNA配列
の５′末端に、適切な分泌リーダー配列が存在すること
がより望ましい。リーダー配列は、リーダー配列がプロ
テアーゼ阻害剤の発現を導くことができるヌクレオチド
配列のはじめの部分に、翻訳停止シグナルを間にはさま
ずに、すぐに隣りあつていることができるような位置に
ある。リーダー配列の存在は、一部には以下の理由のう
ち１つかそれ以上の理由から、望まれる。１）リーダー
阻害剤が存在すると、宿主が初期の生産物を成熟した組
み換えプロテアーゼ阻害剤に仕上げることを容易にする
かもしれない。２）リーダー配列の存在は、プロテアー
ゼ阻害剤を細胞質の外へ導くことにより、組み換えプロ
テアーゼ阻害剤の精製を容易にするかもしれない。３）
リーダー配列の存在は、組み換えプロテアーゼ阻害剤
が、プロテアーゼ阻害剤を細胞質の外へ導くことを通じ
てその活性構造へ組み込まれる能力に影響を与えるかも
しれない。 とりわけ、リーダー配列は、最初の産物をリーダーペ
プチダーゼによつて、リーダー配列を除去し、セリンプ
ロテアーゼ阻害活性の潜在力をもつより好ましいポリペ
プタイドを残すため、初期の翻訳産物の開裂を導く。宿
主微生物のある種においては、適切なリーダー配列の存
在によりEscherlichia coliの場合のように完成したタ
ンパクを細胞周辺腔に輸送できるようにする。ある酵母
や、BacilliやPseudomonasの場合には、適切なリーダー
配列は、タンパク細胞膜を通つて細胞外の培地への輸送
ができるようにする。この状況では、目的のタンパク
は、細胞外タンパクから精製できる。 ３番目に、本発明によつて調製されたプロテアーゼ阻
害剤の中のあるものの場合には、完成されたタンパクを
適切なエラスターゼ阻害剤活性をもつ活性性構造をとる
ように組み込まれる環境のなかに位置させることに、リ
ーダー配列の存在が必要である。 それ以上のオペレーシヨナルエレメントには、それば
かりではないが、リボゾーム結合部位と余所者タンパク
の微生物発現のために必要な他のDNA配列がふくまれ
る。本発明のより好ましい具体例においては、GAGGCGCA
AAAA（ATG）の配列がリボゾーム結合部位として用いら
れるであろう。この中で検討された、オペレーシヨナル
エレメントは、以前の文献や、ここに含まれている教訓
に照らしてバイオテクノロジーの普通の技能をもつた人
々によつて型通りに選ばれる。これらのオペレーシヨナ
ルエレメントの一般的例は、B.Lewin,Genes Wiley ＆ S
on,New York（1983）に出ており、これはこの中に参照
によつて特別に折り込まれている。この中で考察されて
いるようなベクターは、一部はプラスミツドpBR322そし
て／又はpIQの部分から組立てられる。 現在の発明のより好ましい実施態様において、プロテ
アーゼ阻害剤をコードする合成DNA配列のすぐ前に、さ
らにあらたなDNA配列が位置している。この追加のDNA配
列は、翻訳カツプラーとして機能することができる。即
ち、それはリボゾームをそれが隣り合つて並んでいるプ
ロテアーゼ阻害剤RNAのリボゾーム結合部位のすぐ隣り
にリボゾームを位置させるのに役立つRNAをコードして
いるDNAの配列である。本発明の１つの実施態様におい
て、翻訳カツプラーは、DNA配列TAACGAGGCGCAAAAAATGAA
AAAGACAGCTATCGCGATCGGAGTGTAAGAAATGを使用し、翻訳カ
ツプラーに関連したその道の普通のわざをもつた人々に
とつて現在知られている方法を使つて導き出すことがで
きる。２番目の好ましい翻訳カツプラーはTAACGAGGCGCA
AAAAATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCAAGGAGAAATAATG.のDNA配
列をもつている。 上に検討したベクターの、すべての必要なそして望ま
しい成分要素の合成と単離ができたところで、ベクター
はその道の普通の技能をもつ人々に一般に知られている
方法によつて組立てられる。このようなベクターの組立
ては、その道の普通の技能をもつた人々によつて遂行さ
れる義務的職務の範囲内にあると信じられており、そし
てそれ自体、特別むずかしい実験をしなくても遂行でき
る。例えば、参照として特別に本出願に加えたShonerら
Proceeding of the National Academy of Sciences U.
S.A.,81;5403−5407（1984）、において、明らかなされ
ているように、類似のDNA配列が適切なクローニングベ
クターにつなげられている。 本発明のクローニングベクターの構築において、合成
DNA配列の多重コピーとその付随のオペレーシヨナルエ
レメントが各ベクターに挿入されるかもしれないという
ことが、つけ加えて注目されるべきである。このような
実施態様においては、宿主生物は、望まれるプロテアー
ゼのベクターあたりのより大きな量を生産するであろ
う。ベクターの中に挿入され得るDNA配列の複数のコピ
ーの数は、結果としてできたベクターは、その大きさの
ため、適切な宿主微生物に移されたり、その中で複製し
たり転写されたりする能力によつてのみ制限を受ける。 さらにつけ加えて、ベクターが、薬剤抵抗性マーカー
や宿主微生物による特性の発現の原因となる他のマーカ
ーのような選択可能なマーカーを含んでいることがより
望ましい。本発明の特に望ましい実施態様において、テ
トラサイクリン抵抗性に体する遺伝子のクローニングベ
クターに優先的に含まれている。 このような薬剤抵抗性や他の選択可能なマーカーは、
部分的にトランスフオーマントの選択を容易にすること
を意図している。それに加えて、クローニングベクター
の上の、このような選択可能なマーカーの存在は、混入
した微生物が培地中で増殖するのを防ぐのに役立つかも
しれない。この実施態様において、この形質転換した宿
主微生物の純粋な培養は、生き残るのに誘導した表現型
を必要とする条件下で微生物を培養することによつて得
られるであろう。 このようにして得られたベクターは、次に適切な宿主
微生物に移される。外生のDNAを取り込んで、それらの
遺伝子や付随するオペレーシヨナルエレメントを発現す
る能力を持つた微生物はすべて選ばれてよいと信じられ
ている。宿主微生物は、通性嫌気性または好気性菌であ
ることがより望ましい。この方法における使用に好まし
い特別な宿主は、酵母と細菌である。特定の酵母は、Sa
ccharomyces層の酵母であり、特に、Saccharomyces cer
visiaeである。特別の細菌は、Bacillus層、Escherichi
a属及びPseudomonas属の細菌、特に、Bacillus subtili
s及びEscherichia Coliである。 宿主微生物が選ばれた後、ベクターはその道の普通の
技能をもつ人々によつて、一般的に知られている方法を
用いて宿主微生物に移される。このような方法の例は、
R.W.Davis et al.，“細菌の遺伝の進歩”、Cold Sprin
g Harbor Press,Cold Spring Harbor,New York（1980）
に見出される。これは、特別に参照としてこの中にとり
込まれている。上に述べたようなオペレーシヨナルエレ
メントの使用を通じて、温度調節が、遺伝子発現を調節
する手段として考えられるので、１つの実施態様におい
て形質転換が低温で起ることがより好ましい。もう１つ
の実施態様において、滲透のレギユレーターがベクター
に挿入されたならば、形質転換を通じての塩の濃度の調
節が、合成遺伝子の適切なコントロールを確保するため
に必要となるであろう。 組み換えセリンプロテアーゼ阻害剤が終局的に酵母中
で発現される場合を考えると、クローニングベクター
を、まずEscherichia coliに最初に移すことがより望ま
しい。E.Coliにおいて、ベクターに増殖を行なわせ、培
増してから取り出し精製する。ベクターは、次にセリン
プロテアーゼ阻害剤の究極的表現のために酵母の中に移
されるであろう。 宿主微生物は、セリンプロテアーゼ阻害剤の発現に対
して適切な条件下で培養される。これらの条件は、一般
に宿主微生物にとつて特異的であり、例えば、Bergey′
s Manual of Determinative Bacteriology,8th Ed.,Wil
liams ＆ Wilkins Company,Baltimore,Marylandのよう
な微生物のための生育条件に関する出版された文献に照
らして、この道の普通の技能をもつた人人によつて容易
に決められる。この文献は参照としてここに特別に組み
込まれている。 ベクターの中に挿入された、又は存在するオペレーシ
ヨナルエレメントすべてに応じて、DNA配列の表現の調
節に必要な条件は、すべて形質転換と培養の段階で効果
をもつであろう。１つの実施態様においては、細胞はDN
A配列の発現の阻害する適切な調節条件において、高密
度迄育てられる。最適の細胞密度に近づいたとき、環境
条件は、合成DNA配列の発現に対して適切な条件に変え
られる。このようにして、プロテアーゼ阻害剤の生産条
件は、宿主の細胞がほゞ最適密度に近づいたあとの時期
で起り、そして結果として生ずるプロテアーゼ阻害剤
は、その発現に必要な調節条件が誘起された後、しばら
くしてから収穫されると考えられる。 本発明のより望ましい実施態様において、組み換えプ
ロテアーゼ阻害剤は、収穫の後、そしてその活性構造を
とる以前に精製される。発明者は、リフオルデイング済
みのタンパクの高収率回収は、タンパクが先ず精製され
る場合に、容易に得られると信じているので、この実施
態様がより望ましい。しかし、１つのより好ましい代替
的実施態様においては、プロテアーゼ阻害剤は、その活
性構造をとるべく、リフオルデイングするのにまかせて
から精製することがある。さらにもう１つのより好まし
い代りの実施態様においては、プロテアーゼ阻害剤は、
培養液から回収するとき、リフオルデイングの済んだ活
性な状態で存在している。 ある条件では、プロテアーゼ阻害剤は、宿主微生物で
の発現、そしてそのタンパクの細胞壁を通過しての輸送
又は膜を通つて細胞周辺腔への輸送の際に、そのしかる
べき活性な構造をとつている。これは、一般的に適切な
リーダー配列をコードするDNAが、組み換えプロテイン
をコードするDNAにつながつていると起る。プロテアー
ゼ阻害剤が、その適切な活性構造をとらない場合は、形
成したどのジスルフイド結合も、そして／または、どの
生じた非共有結合的相互作用も、変性試薬や還元試薬、
例えば、グアニジウムクロライド、−メルカプトエタノ
ールによつて先ず破壊してから、プロテアーゼ阻害剤を
コントロールした条件においての希釈及びこれらの試薬
の酸化に続いてその活性構造がとれるようにする。 本発明の教示を特定の問題や環境に応用することは、
ここに含まれた知見に照らして、この道の普通の技能を
もつた人の能力の範囲内にあるということが理解される
べきである。本発明の生産物とそれらの単離、製造に対
する代表的工程が以下の例にみられる。 例 １ 上記のアミノ酸配列、Escherichia Coliの高度に発現
性の遺伝子におけるコドンの使用、及び便利なエンドヌ
クレアーゼの開裂部位に基いて、以下のDNA配列が提案
された。 タンパク質をE.coliのペリプラズムに輸送するのに適
した形で、プロテインの発現を調節するため、以下の調
節要素が提案された。即ち、高いレベルにおける転写の
開始のためのtacプロモーター；転写の制御のためのlac
オペレーター；プラスミドの他の場所でコードされるべ
きlacレプレツサー（lac Iq）；高いレベルで翻訳をは
じめるOmpAシヤイン−ダルガーノ配列；産物のペリプラ
ズムへの輸送を容易にするOmpAリーダー、これらのオペ
レーターエレメントによつてコードされるタンパクと最
初の産物の開裂を指示し、成熟した白血球エラスターゼ
阻害剤を生ずる上述の構造遺伝子によつてコードされる
タンパクとの間のAla−Ser連結のAlaである。これらの
特徴はすべて、以下のDNA配列のなかに組み込まれた。 タンパクがE.coliの細胞質内に止まるような形でタン
パクの発現を調節するために、以下のオペレーシヨナル
エレメントが提供される。即ち、tacプロモーター;lac
オペレーター、そしてlacリプレツサー（lac Iq）；シ
ヤイン−ダルガーノ配列のコンセンサス；そして翻訳の
高いレベルを開始するため、翻訳カツプラーとして用い
られるべきOmpAリーダーペプタイドの断片である。翻訳
カツプリング配列はOmpA遺伝子の翻訳の開始領域、OmpA
リーダーペプタイドの最初の８箇のアミノ酸は、上述の
シヤイン−ダルガーノ配列認識及び翻訳停止を行なう配
列をコードするDNAを含む。翻訳カツプリング配列はプ
ロモーターとセリンプロテアーゼ阻害剤遺伝子の翻訳開
始部位の間に、後者と重なつて挿入されるべきである。
これらの特徴のすべては、以下のDNA配列に組み込まれ
ている。A. 遺伝子断片の構築 上の配列を組み立てるため、次のデオキシリボヌクレ
オチドがABI DNAシンセサイザー（Foster City,Califo
rnia）を用いて合成される。合成産物は、ABI instrum
ent manual中に記述してあるように、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動によつて精製される。それらを、標準の
方法に従つてT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５′
をリン酸化した。 以下のグループのオリゴヌクレオチド配列がフラグメ
ント（断片）Aaを組み立てるために使用される。 オリゴヌクレオチドAa1は： GCTGT TGACA ATTAA TCAT. オリゴヌクレオチドAa2は CGGCT CGTAT AATGT GTGGA ATTGT GAGCG GATAA CAATT T. オリゴヌクレオチドAa3は CACAC ATAAC GAGGC GCAAA AA. オリゴヌクレオチドAa4は ATGAA AAAGA CAGCT ATCGC GATCG. オリゴヌクレオチドAa5は CAGTG GCACT GGCTG GTTTC GCTAC CGTAG CGCAG GCCAG CG
GTA AA. オリゴヌクレオチドAa6は GAGCC GATGA TTAAT TGTCA ACAGC TGCA. オリゴヌクレオチドAa7は TCCGC TCACA ATTCC ACACA TTATA C. オリゴヌクレオチドAa8は CCTCG TTATG TGTGA AATTG TTA. オリゴヌクレオチドAa9は GCCAC TGCGA TCGCG ATAGC TGTCT TTTTC ATTTT TTGCG. オリゴヌクレオチドAa10は AGCTT TTACC GCTGG CCTGC GCTAC GGTAG CGAAA CCAGC CA
GT. 以下のオリゴヌクレオチド配列が、組み立てられ、断
片Abが作られる。 ヌクレオチドAb1は GCTGT TGACA ATTAA TCAT. ヌクレオチドAb2は CGGCT CGTAT AATGT GTGGA ATTGT GAGCG GATAA CAATT T. ヌクレオチドAb3は CACAC ATAAC GAGGC GCAAA AA. ヌクレオチドAb4は ATGAA AAAGA CAGCT ATCGC GATCG. ヌクレオチドAb5は GAGTG TAAGA AATGA GCGGT AAA. ヌクレオチドAb6は GAGCC GATGA TTAAT TGTCA ACAGC TGCA. ヌクレオチドAb7は TCCGC TCACA ATTCC ACACA TTATA C. ヌクレオチドAb8は CCTCG TTATG TGTGA AATTG TTA. ヌクレオチドAb9は AGCTT TTACC GCTCA TTTCT TACAC TCCGA TCGCG ATAGC TG
TCT TTTTC ATTTT TTGCG. 以下は、断片Ｂを構築するために組立てられるオリゴ
ヌクレオチド配列である。 オリゴヌクレオチドB1は AGCTT CAAAG CTGGC GTATG CCCGC CGAAA AAATC CGCG. オリゴヌクレオチドB2は CAGTG TCTGC GGTAC AAAAA ACCGG AATGC CAG. オリゴヌクレオチドB3は TCCGA CTGGC AGTGC CCGGG TAAAA AACGT TGTTG C. オリゴヌクレオチドB4は CCGGA CACCT GCGGC ATCAA ATGCC TG. オリゴヌクレオチドB5は GATCC AGGCA TTTGA TGCCG CAGGT GTCCG GGCAA CAACG TT
TTT TACCC GGGCA. オリゴヌクレオチドB6は CTGCC AGTCG GACTG GCATT CCGGT TTTTT GTACC G. オリゴヌクレオチドB7は CAGAC ACTGC GCGGA TTTTT TCGGC GGGCA TACGC CAGCT TT
GA. 以下は断片Ｃを構築するために用いられるオリゴヌク
レオチド配列である。 オリゴヌクレオチドC1は GATCC GGTTG ATACC CCGAA CCCG. オリゴヌクレオチドC2は ACTCG TCGAA AA. オリゴヌクレオチドC3は CCGGG TAAAT GCCCG GTAAC CTATG GC. オリゴヌクレオチドC4は CAGTG TCTGA TGCTG AACCC GCCGA AC. オリゴヌクレオチドC5は TTCTG CGAAA TGGAC GGCCA GTGTA AACGA GAT. オリゴヌクレオチドC6は CTAGA TCTCG TTTAC ACTGG CCGTC CATTT CGCAG AAGTT. オリゴヌクレオチドC7は CGGCG GGTTC AGCAT CAGAC ACTGG CCATA GGTTA CCGGG C
A. オリゴヌクレオチドC8は TTTAC CCGGT TTTCG ACGAG TCGGG TT. オリゴヌクレオチドC9は CGGGG TATCA ACCG. 以下のグループのオリゴヌクレオチド配列が組立てら
れて断片Ｄが作られる。 オリゴヌクレオチドD1は GATCT GAAAT GCTGT ATGGG TATGT GCGGC. オリゴヌクレオチドD2は AAATC TTGTG TTTCC CCGGT AAAAG CATAA G. オリゴヌクレオチドD3は TCGAC TTATG CTTTT ACCGG GGAAA CACAA GATTT GCCGC A. オリゴヌクレオチドD4は CATAC CCATA CAGCA TTTCA. 以下のグループのオリゴヌクレオチドを混合し、標準
条件下でアニーリングを行ない、T4DNAリガーゼを用い
て標準条件下で互い同志及び適切な制限酵素エンドヌク
レアーゼで切つたクローニング及びケーシングベクター
M13mp18及び19につなげる。出来上つたものを、E.Coli
JM105を形質転換するのに用い、目的のDNAを含むクロ
ーンをIPTG−Xgalプレート中での白いプラークから選択
し、アリーリングの段階に用いられたグループから選ば
れた32Pでラベルしたオリゴヌクレオチドとハイブリド
を作ることにより、さらにスクリーニングを行なう。挿
入構造は、クローン化されたDNAのダイデオキシ塩基配
列決定法で確かめた。 グループAaは、Pst１とHind IIIで切つたM13mp18と19
につなげられるオリゴヌクレオチドAa1−Aa10を含む。
グループAbは、オリゴヌクレオチドAb1−Ab9を含み、そ
れらは、Pst１とHind IIIで切つたM13mp18と19につなげ
られる。オリゴヌクレオチドB1からB7を含むグループＢ
は、Hind IIIはBamH Iで切つたM13mp18及び19につなげ
られる。オリゴヌクレオチドC1からC9迄を含んでいるグ
ループＣは、BamH IとXba Iで切つたM13mp18と19につな
げられる。グループＤは、オリゴヌクレオチドD1からD4
を含むが、BamH IとSal Iで切つたM13mp18と19につなげ
られる。 M13複数型のDNAを、標準的手法によつて目的とする挿
入DNAを持つているクローンから回収する。グループAa
に相当する挿入DNAを適切な制限酵素エンドヌクレアー
ゼで、M13DNAから切り取る。ポリアクリルアミドゲル電
気泳動によつて精製する。その構造は以下の通りであ
る。 グループAbに相当する挿入DNAを、制限酵素エンドヌ
クレアーゼEcoR IとHind IIIでDNAを切断することによ
り切り、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製する。
その構造は、以下の如くである。 グループＢに相当する挿入DNAを制限酵素、エンドヌ
クレアーゼ、HinD IIIとBamH IでDNAを切断することに
より切断することによつて切り取り、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動で精製する。その構造は以下の通りであ
る。 グループＣに相当する挿入DNAをBamH IとBgl IIでDNA
を切断することにより切り取り、ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で精製する。その構造は以下の如くである。 グループＤに相当する挿入DNAを制限酵素Sau III Aと
Sal IでDNAを切断することにより切り取り、アクリルア
ミドゲル電気泳動で精製する。その構造は以下の通りで
ある。 B. 遺伝子の構造 外部への輸送のための組み立てには、グループAa、
Ｂ、Ｃ及びＤを標準条件下で、T4DNAリガーゼを用い
て、EcoR IとSal Iで切つたM13mp18と19につなげる。目
的の遺伝子を含むクローンはXgalプレート上の、それら
の色で選択され、そしてさらに32Pでラベルされたオリ
ゴヌクレオチドとハイブリドを形成することによつてス
クリーニングする。選択された構造のクローンは、ユニ
バーサルプライマーを用いてDNAの挿入区域をダイデオ
キシ塩基配列決定法により確認する。 細胞質での発現のための組み立てにおいては、グルー
プAb、Ｂ、Ｃ、及びＤからの挿入配列を合せて、標準条
件下でT4DNAリガーゼを用いて、EcoR IとSal Iで切つた
M13mp18と19につながる目的の遺伝子を含むクローンをX
galプレート上のそれらの色で選び、更に、32Pでラベル
した挿入配列とハイブリドを形成することによつてスク
リーニングを行なう。選ばれたクローンの構造をユニバ
ーサルプライマーを使つてDNAの挿入区域をダイデオキ
シ塩基配列決定法で検べることによつて確める。 例 ２ 上に述べたアミノ酸配列、Escherichia Coliの高度に
発現された遺伝子におけるコドンの使用と便利な制限酵
素エンドヌクレアーゼの切断位置の規定にもとづいて、
以下のDNA配列が提案された。 E.Coliのペリプラズムへの輸送のための適切な形でタ
ンパクの発現を調節するために、以下の調節要素が提案
される。即ち、高いレベルでの転写の開始のためのプラ
スミドpKK223−３上の１つのtacプロモーター、転写の
制御のためのプラスミドpKK223−３上のlacオペレータ
ー、E.Coliの染色体上にコードされるべきlacリプレツ
サー（lac I9）、高レベルで翻訳を開始するOmpAシヤイ
ン−ダルガーノ配列、生産物のペリプラズムに運び出す
ことを助長するOmpAリーダー、これらのオペレーターエ
レメントによつてコードされるタンパク配列の間のAla
−Ser接合のAla、そして、最初の生産物の、成熟した白
血球エラスターゼ阻害剤を生じるべき開裂を指示する上
述の遺伝子によつてコードされるタンパク配列である。
OmpAエレメントは、以下のDNA配列に組み込まれる。 GAATT CGATA TCTCG TTGGA GATAT TCAT GACGT ATTTT GGA
TG ATAAC GAGGC GCAAA AAATG AAAAA GACAG CTATC GCGAT
CGCAG TGGCA CTGGC TGGTT TCGCT ACCGT AGCGC AGGCC. 生成タンパクが、E.coli細胞質に留まる形でのタンパ
クの発現を調節するために、次のオペレーシヨナルエレ
メントが提案される。即ち、プラスミツドpKK223−３上
のtacプロモーター、プラスミツドpKK223−３のlacオペ
レーターとE.coli strain JM107の染色体上のlacレプ
レツサー（lac Iq）、コンセンサスシヤイン−ダルガー
ノ配列、及び高いレベルの翻訳を開始するため、翻訳カ
ツプラーとして用いられるべきOmpAリーダーペプチタイ
ドの断片である。翻訳カツプリング配列は、OmpA遺伝子
の翻訳開始領域、OmpAリーダーペプチタイドの最初の８
個のアミノ酸、上に記述したコンセンサスシヤイン−ダ
ルガーノ配列及び翻訳読み終り暗号である。翻訳カツプ
リング配列は、lacオペレーターとセリンプロテアーゼ
阻害剤の翻訳開始位置の間に、後者を重ねて挿入される
べきである。翻訳カツプラーの特徴は、以下のDNA配列
に組み込まれている。即ち、 C. 遺伝子フラグメントの構築 上述の配列を組み立てるため、以下のデオキシリボヌ
クレオチドをABI DNAシンセサイザー（Foster City Ca
lifornia）を使つて合成した生成物を、ABIインスツル
メンタルマニユアルに記述されているように、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動によつて精製する。それらは、
標準的手段によつてT4ポリヌクレオチドキナーゼとATP
を用いて５′をリン酸化する。 以下のオリゴヌクレオチド配列をフラグメントAaを組
み立てるために用いる。 オリゴヌクレオチドAa1は AATTCGATATCTCGTTGGAGATATTCATGACGTATTTTGGATGATAACGA
GGCGCAAAA. オリゴヌクレオチドAa2は ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCG. オリゴヌクレオチドAa3は GATCCGATCGCGATAGCTGTCTTTTTCATTTTTTGC. オリゴヌクレオチドAa4は GCCTCGTTATCATCCAAAATACGTCATGAATATCTCCAACGAGATATCG. オリゴヌクレオチドAa5は GATCCGATCGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCCTC
TGGTAAA. オリゴヌクレオチドAa6は AGCTTTTACCAGAGGCCTGCGCTACGGTAGCGAAAACCAGCCAGTGCCAC
TGCGATCG. 以下の、オリゴヌクレオチド配列を組立て、断片Abを
つくり上げる。 オリゴヌクレオチドAb1は AATTCGATATCTCGTTGGAGATATTCATGACGTATTTTGGATGATAACGA
GGCGCAAA. オリゴヌクレオチドAb2は ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCG. オリゴヌクレオチドAb3は GATCCGATCGCGATAGCTGTCTTTTTCATTTTTTGC. オリゴヌクレオチドAb4は GCCTCGTTATCATCCAAAATACGTCATGAATATCTCCAACGAGATATCG. オリゴヌクレオチドAb5は CAAGGAGAAATAAATGAGCGGTAAA. オリゴヌクレオチドAb6は AGCTTTTACCGCTCATTTATTTCTCCTTGAT. 以下は、断片Ｂを構築するために組み立てられるヌク
レオチド配列である。 オリゴヌクレオチドB1は AGCTT CAAAG CTGGC GTATG CCGC CGAAA AAATC CGCG. オリゴヌクレオチドB2は CAGTG TCTGC GGTAC AAAAA ACCGG AATGC CAG. オリゴヌクレオチドB3は TCCGA CTGGC AGTGC CCGGG TAAAA AACGT TGTTG C. オリゴヌクレオチドB4は CCGGA CACCT GCGGC ATCAA ATGCC TG. オリゴヌクレオチドB5は GATCC AGGCA TTTGA TGCCG CAGGT GTCCG GGCAA CAACG TT
TTT TACCC GGGCA. オリゴヌクレオチドB6は CTGCC AGTCG GACTG GCATT CCGGT TTTTT GTACC G. オリゴヌクレオチドB7は CAGAC ACTGC GCGGA TTTTT TCGGC GGGCA TACGC CAGCT TT
GA. 以下は断片Ｃを組み立てるために使用されるヌクレオ
チド配列である。 オリゴヌクレオチドC1は GATCC GGTTG ATACC CCGAA CCG. オリゴヌクレオチドC2は ACTCG TCGAA AA. オリゴヌクレオチドC3は CCGGG TAAAT GCCCG GTAAC CTATG GC. オリゴヌクレオチドC4は CAGTG TCTGA TGCTG AACCC GCCGA AC. オリゴヌクレオチドC5は TTCTG CGAAA TGGAC GGCCA GTGTA AACGA GAT. オリゴヌクレオチドC6は CTAGA TCTCG TTTAC ACTGG CCGTC CATTT CGCAG AAGTT. オリゴヌクレオチドC7は CGGCG GGTTC AGCAT CAGAC ACTGG CCATA GGTTA CCGGG C
A. オリゴヌクレオチドC8は TTTAC CCGGT TTTCG ACGAG TCGGG TT. オリゴヌクレオチドC9は CGGGG TATCA ACCG. 以下のグループのヌクレオチドが断片Ｄを形成するた
めに組立てられる。 オリゴヌクレオチドD1は GATCT GAAAT GCTGT ATGGG TAGT GCGGC. オリゴヌクレオチドD2は AAATC TTGTG TTTCC CCGGT AAAAG CATAA G. オリゴヌクレオチドD3は TCGAC TTATG CTTTT ACCGG GGAAA CACAA GATTT GCCGC A. オリゴヌクレオチドD4は CATAC CCATA CAGCA TTTCA. 以下のグループのオリゴヌクレオチドを混合し、標準
条件下でアニーリングを行ない、互い同志で、又、適当
な制限酵素エンドヌクレアーゼで切つたクローニング及
び配列形成ベクターM13mp18と19に、標準条件下でT4DNA
リガーゼを用いてつなげる。この生成物は、E.coli JM
105を形質転換するのに用い、目的のDNAを含むクローン
のアニーリングの段階で用いられたグループから選ばれ
た32Pでラベルしたオリゴヌクレオチドとハイブリツド
を形成することによつて選ぶ。挿入構造は、ユニバーサ
ルプライマーを用いて、クローン化したDNAのダイオキ
シ塩基配列決定法により確める。 オリゴヌクレオチドAa1−Aa4を、EcoR IとBamH Iで切
つたM13mp18及びM13mp19につなげる。目的の挿入DNAを
持つM13複製型DNAを標準的手法によつて回収する。挿入
DNAは、M13DNAを制限酵素エンドヌクレアーゼEcoR IとP
vu１で切断することによりM13DNAから切り出し、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動で精製する。その構造は以下
の通りである。 AATTCGATATCTCGTTGGAGATATTCATGACGTATTTTGGATGATAACGA
GGCGCAAAAAATGA GCTATAGAGCAACCTCTATAAGTACTGCATAAAACCTACTATTGCTCCGC
GTTTTTTACT AAAAGACAGCTATCGCGAT TTTTCTGTCGATAGCGC オリゴヌクレオチドAa5とAa6は、BamH IとHind IIIで
切つたM13mp18とM13mp19につなげる。目的とする挿入DN
AをもつたM13複製型DNAは、標準的手法によつて回収さ
れる。挿入DNAを制限酵素Pvu IとHind IIIでDNAを切断
することによりM13DNAから切り出し、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動で精製する。その構造は以下の如くであ
る。 CGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCCTCTGGTAAA TAGCGTCACCGTGACCGACCAAAGCGATGGCATCGCGTCCGGAGACCATT
TTCGA このPvu I−Hind III断片をオリゴヌクレオチドAa1−
Aa4から調製した断片と結合させ、EcoR IとHind IIIで
切つたM13mp18またはM13mp19とつなぐ。目的の挿入DNA
を持つM13複製型DNAを標準的手法で回収し、挿入DNA
を、これはDNA断面Aaであるが、制限酵素EcoR IとHind
IIIでM13DNAを切断することによりM13DNAから切り出
し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製する。その
構造は以下の如くである。 AATTCGATATCTCGTTGGAGATATTCATGACGTATTTTGGATGATAACGA
GGCGCAAAAAATGA GCTATAGAGCAACCTCTATAAGTACTGCATAAAACCTACTATTGCTCCGC
GTTTTTTACT AAAAGACAGCTATCGCGATCGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTA
GCGCAGGCCTCTGGTA TTTTCTGTCGATAGCGCTAGCGTCACCGTGACCGACCAAAGCGATGGCAT
CGCGTCCGGAGACCAT AA TTTCGA オリゴヌクレオチドAb1−Ab4をEcoR IとBamH Iで切つ
たM13mp18とM13mp19につなぐ。目的の挿入DNAを持つたM
13複製型DNAを標準的手法で回収する。挿入DNAを制限酵
素EcoR IとPvu IでM13DNAから切り取りポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で精製する。その構造は以下の如くで
ある。 AATTCGATATCTCGTTGGAGATATTCATGACGTATTTTGGATGATAACGA
GGCGCAAAAAATGA GCTATAGAGCAACCTCTATAAGTACTGCATAAAACCTACTATTGCTCCGC
GTTTTTTACT AAAAGACAGCTATCGCGAT TTTTCTGTCGATAGCGC このEcoR I−Pvu I断片をオリゴヌクレオチドAb5−Ab
6と合し、EcoR IとHind IIIで切つたM13mp18またはM13m
p19とつなぐ。目的の挿入DNAを持つたM13複製型DNAを、
標準的手法により回収する。断片Abである挿入DNAを、
制限酵素EcoR IとHind IIIでDNAを切断することによつ
てM13DNAから切出す。そして、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動により精製する。その構造は以下の如くであ
る。 AATTCGATATCTCGTTGGAGATATTCATGACGTATTTTGGATGATAACGA
GGCGCAAAAAATGA GCTATAGAGCAACCTCTATAAGTACTGCATAAAACCTACTATTGCTCCGC
GTTTTTTACT AAAAGACAGCTATCGCGATCAAGGAGAAATAAATGAGCGGTAAA TTTTCTGTCGATAGCGCTAGTTCCTCTTTACTCGCCATTTTCGA オリゴヌクレオチドB1からB7までを含むグループＢを
Hind IIIとBamH Iで切つたM13mp18と19につなぐ。グル
ープＢに相当する挿入DNAを制限酵素、エンドヌクレア
ーゼHind IIIとBamH IでDNAを切断することにより切出
し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によつて精製す
る。その構造は以下の通りである。 AGCTTCAAAGCTGGCGTATGCCCGCCG AGTTTCGACCGCATACGGGCGGC AAAAAATCCGCGCAGTGTCTGCGGTACAAA TTTTTTAGGCGCGTCACAGACGCCATGTTT AAACCGGAATGCCAGTCCGACTGGCAGTGC TTTGGCCTTACGGTCAGGCTGACCGTCACG CCGGGTAAAAAACGTTGTTGCCCGGACACC GGCCCATTTTTTGCAACAACGGGCCTGTGG TGCGGCATCAAATGCCTG ACGCCGTAGTTTACGGACCTAG オリゴヌクレオチドC1からC9を含むグループＣをBamH
IとXba Iで切つたM13mp18と19につなぐ。グループＣに
相当する挿入DNAを制限エンドヌクレアーゼBamH IとBgl
IIでDNAを切断することにより切り出し、ポリアクリル
アミドゲル電気泳動で精製する。その構造は以下の如く
である。 GATCCGGTTGATACCCCGAACCCGACT GCCAACTATGGGGCTTGGGCTGA CGTCGAAAACCGGGTAAATGCCCGGTA GCAGCTTTTGGCCCATTTACGGGCCAT ACCTATGGCCAGTGTCTGATGCTGAACCCG TGGATACCGGTCACAGACTACGACTTGGGC CCGAACTTCTGCGAAATGGACGGCCAGTGT GGCTTGAAGACGCTTTACCTGCCGGTCACA AAACGA TTTGCTCTAG オリゴヌクレオチドD1からD4までを含むグループＤを
BamH IとSal Iで切つたM13mp18と19につなぐ。グループ
Ｄに相当する挿入DNAを、制限酵素、エンドヌクレアー
ゼSal IでDNAを切断することにより切り出し、アクリル
アミドゲル電気泳動で精製する。その構造は以下の如く
である。 GATCTGAAATGCTGTATGGGTATG ACTTTOTCGACATACCCATAC TGCGGCAAATCTTGTGTTTCCCCG ACGCCGTTTAGAACACAAAGGGGC GTAAAAGCATAAG CATTTTCGTATTCAGCT D. 遺伝子の構築 外部への輸送のための組み立てにおいては、グループ
Aa,B,C及びＤからの挿入配列を合し、EcoR IとSal Iで
切つたM13mp18と19にT4DNAリガーゼを用いて、標準条件
下でつなぐ。細胞質中での発現のための組み立てにおい
ては、Ab,B,C及びＤからの挿入配列を合し、EcoR IとSa
l Iで切つたM13mp18及び19とT4DNAリガーゼを用いて、
標準状態でつなぐ。目的の遺伝子を含むクローンを、そ
れらのXgalプレート上での色で選び、さらに32Pにラベ
ルしたオリゴヌクレオチドとハイフリドを作ることによ
りスクリーニングを行なう。選んだクローンの構造を、
ユニバーサルプライマーを用いてDNAの挿入領域のダイ
デオキシ塩基配列決定法を行なうことにより確かめる。 例 ３ 発現ベクターの組み立て 外部への輸出用と細胞質内発現用の組み立てに対する
挿入配列を、次の如く発現プラスミドに移す。所用の挿
入DNAをもつたM13増殖型DNAを、上述の如く標準型手法
で回収する。適切な挿入DNAを制限酵素、エンドヌクレ
アーゼ、EcoR IとPst Iで切つて取り出し、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で精製する。次に、それを制限酵
素、エンドヌクレアーゼEcoR IとPst Iで切つたpKK223
−３につなぎ、その結果に生じたプラスミドをE.coli
JM107にクローニングする。外部輸送用の例４と５にお
ける使用のための構造は、PSGE6であり、原形質発現用
の例７における使用のための構造は、pSGE8である。例
4,5における外部への輸送に対するE.coliの株はSGE10で
あり、例６における細胞質発現に対する株は、SGE30で
ある。 A. pSGE6の編成 プラスミドpSGE6をpKK223−３のEcoR IとPst Iの位置
の間のDNAを、OmpASLPIをコードするDNAを含むEcoR I/P
st I断片で置きかえることによつて組立てた。OmpA−SL
PIのDNA配列は次の如くである。 これから後、“ompA−SLPI″と呼ぶ配列は、上に述べ
た外部への輸送のためのM13mp18の最終構造からのDNAで
ある。プラスミドpSGE6は、図１に描かれている。図１
において、ompAss−SLPIに対する最初のコドンは、“om
pA−SLPI″と呼ばれるDNA配列の62−64の位置にある。
成熟したSLPIに対する最初のコドンは、125−127に位置
している。Ptacは、tacプロモーター、lacオペレーター
及びベーターガラクトーゼShine/Dalgarno配列のための
DNAを含んでいる。略号、RI,Pst及びBamは、制限酵素、
EcoR I,Pst I及びBamH Iに対する認識配列である。Tetr
は、テトラサイクリンに耐性を附与するpBR322の遺伝子
の一部であり、amprは、アンピシリンに耐性を附与し位
置6416から6840までのrrnBオペロンからのDNAを、Tetr
は含んでいる。矢印は転写の方向を示している。 B. pCJ−ompA−SLPIの編成 プラスミドpCJ−ompA−SLPIは、部分的でなく完全な
テトラサイクリン遺伝子およびプロモーターを含んでい
ることを除いては、pSGE6と同じである。このプラスミ
ドは、E.coliに挿入すると、テトラサイクリン耐性を附
与し、omp ASLPIをコードするDNAを含むEcoR I/Pst I
断片が、ベクターpKK223−３ではなく、ベクターpCJ1に
クローニングされるということを除いて、pSGE6に対す
るのと類似のやり方で組立てられる。ベクターpCJ1は以
下の如く構築される。プラスミドpKK223−３をSph Iで
完全に、BamH Iで部分的に酵素分解した。4,4Kbp断片を
ゲルで精製し、合成アダプター GATCTAGAATTGTCATGTTTGACAGCTTATCAT ATCTTAACAGTACAAACTGTCGAATAGTAGC 及び、pBR322（PL Biochemicals,27−4891−01）のtet
r遺伝子のCla I Sph Iによる消化物からのDNAの539bp
の断片と組み合せた。 C. pSGE8の構造 EcoR IとPst部位の間のDNAが、上に述べたように、細
胞質における発現のための最終的なM13mp18構造物に由
来するompA−tc−met−SLPIと呼ばれる配列を含んでい
ることを例外として、プラスミドpSGE8は、pSGE6と同一
遺伝子組成である。この配列は、E.coliの細胞質の中に
メチオニル−SLPIの合成を導く。pSGE8の部分的図式
は、図２の中に含まれている。“ompA−tc−met−SLPI"
と呼ばれるその配列において、ompAに対する開始コドン
は、62−64の位置にあり、停止コドンは95−97にある。
そして、メチオニル−SLPIに対する開始コドンは、98−
100にある。ompA−tc−met−SLPIのDNA配列は次の如く
である。 D. pCJ−met−SLPIの編成 プラスミドpCJ−met−SLPIは、それが（部分的ではな
く）完全なテトラサイクリン耐性遺伝子を含んでいるこ
とを除けば、pSGE8と同じである。プラスミドCJ−met−
SLPIは、ompA−tc−met−SLPIをコードするEcoR I/Pst
I断片がベクターpKK223−３ではなく、ベクターpCJ1に
クローニングされたことを除けば、pSGE8と同様に組立
てられた。 E. 酵母発現用プラスミドの組立て プラスミドpUC8をHind IIIで酵素分解し、Hind III/S
ma Iアダプターにつげた（Amershan,Cat.No.DA1006から
得た）。このアダプターをHind IIIサイトに加えても、
Hind IIIサイトを再組み立てしない。DNAを次にSma Iで
酵素分解し、希薄溶液中でつなぎ、続いて、E.coli JM
83の形質転換を行なつた。正しいプラスミド、即ちHind
IIIの位置からSma Iの間のポリリンカーにおいて制限
酵素による切断の位置を欠いているプラスミツドが、ト
ランスフオーマントから単離したプラスミツドDNAを、E
coR I、Sma IもしくはHind IIIで消化することによつて
同定された。Hind III部位を欠いていたが、EcoR I部位
とSma I部位を含んでいたプラスミドを含んでいるトラ
ンスフオーマントがこの方法で同定された。このプラス
ミドがpGS185である。 酵母のMF1遺伝子を含有しているEcoR I断片を、この
中に特に参照文献として加えてある、J.Kurjan ＆ I.He
rskowitz in Cell30:933（1982）によつて記述されたよ
うに、プラスミドpCY17からゲル電気泳動で精製され、E
coR Iによつて切つたpGS185につなげた。プラスミドのD
NAをトランスフオーマントから単離した、正しい挿入DN
Aの存在は、EcoR IでDNAを消化することによつて確かめ
られた。これが、プラスミドpGS285であり、図３に描か
れている。 Kurjan ＆ Herskowitz、（同前）によつて認められた
ように、MF1遺伝子中の内部の４個のHind III部位の中
の３箇を除去するために、プラスミドpGS285をHind III
で完全に消化し、そして再びつなげた。正しい構成は、
上に述べたように選ばれた。これが、プラスミドpGS385
である。 例２において記述したように、合成SLPI遺伝子の４か
ら107迄のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列にな
つえいるM13AaBCDを、Hind IIIで消化した。このDNAを
以下のオリゴヌクレオチドアダプターにつなげた。 ５′GCT GAA GCT TCA GGT AAG CGA CTT CGA AGT CCA TTC TCGA. このアダプターは、２つのオリゴヌクレオチドのアニ
ーリングによつて形成し、５′GCT GAA GCT TCA GGT AA
G及び５′AGC TCT TAC CTG AAG CTT CAGC先づ２分間70
℃に保ち、続いて、一夜かかつて徐々に冷す。 このアダプターをHind IIIで切つたM13AaBCDにつなげ
た後、結合混合物は、Hind IIIとSal Iで消化して、ア
ガロースゲル電気泳動とエレエクトロリユーシヨンによ
つて精製した１つの断片を与えた。この断片を、もう一
度Hind IIIで消化し、それからHind IIIとSal Iで切つ
ておいたpGS385につないだ。E.coli HB101を結合混合
物で形質転換し、アンピシリン耐性トランスフオーマン
トを選んだ。正しい挿入DNAを持つたプラスミドを含む
トランスフオーマントを、プラスミドDNAを調整し、そ
れをHind IIIとSal Iで消化することにより同定した。
この方法で組み立て、単離したプラスミドをpGS485と命
名した。そして、これは図４に描かれている。このプラ
スミドは、構成成分としてMF1遺伝子の最初のスペーサ
ー領域におけるHind III切断部位において合成SLPI遺伝
子に融合したMF1遺伝子を含んでいる。このような構造
体は、酵母に入れた場合、特別に参照としてここに加え
た。A.J.BakeらPNAS（USA）81:4642によつて示されたよ
うに、異種タンパクの合成、プロセシング、分泌を導く
ことが示された。MF １遺伝子とSLPIの融合が、pGS485
中のEcoR I断片に含まれている。このEcoR I断片を実施
例８に記したように、ベクターYIp5の中へクローニング
した。 例 ４ プラスミドpSGE6を用いての分泌白血球プロテアーゼ
阻害剤（SLPI）の発現と精製。 プラスミドpSGE6（SGE10細胞）を含でいるE.coli細胞
を、２％トリプトン、0.5％酵母エキス、20g/グルコ
ース、200mg/ビタミンB1及び100mg/アンピシリンを
加えた10のM9培地中で、６時間培養した。IPTGを0.2m
M加え、更に６時間培養を続けた。E.coli SGE10の細胞
10を18,000×ｇで遠心してペレットにして8g/を得
て、50mMトリス−塩酸（pH7.5）4mM EDTA緩衝液（今後
T50E4と略称する）に再び懸濁してからペレツトにし
た。このペレツトを2.7のT50E4に再び懸濁し、150ml
のロツトずつ凍結した。これらのロツト８箇（細胞36g
に相当する）をまとめて12,000psi、４℃でフレンチプ
レスを１回通してペレツトをくずした。くずしたもの
を、20,000×ｇで1.5時間遠心分離した。細胞からなる
不溶物（6gの細胞に等しい）を含むペレツト1/6を125ml
のT50E4で２度洗い、残つた物質を一夜凍結した。 凍結ペレツトを、20mMのDTT（Sigma,Cat.No.D−0632
から入手）、4mMのPMSF（Sigma,Cat.No.P−7626）及び8
M尿素（超高純度、BRL、Cat.No.5505UA）を含む25mlの1
00mMトリス−塩酸（pH8.0）と4mMのEDTA（今後、T100E4
と略称する）で、37℃、１時間抽出し、10,000×ｇで10
分遠心した。得られた上澄みを、あらかじめ20mMのDTT
と8M尿素を含む抽出緩衝液T100E4で平衡処理（Pre−equ
ibrated）しておいた10mlの上澄みを除いたセフアデツ
クスsp−c25（Pharmaciaから入手）と混ぜ、ローラーの
上で37℃で10分混合し、SLPIをSP−セフアデツクスに吸
収させる。 吸収させたSLPIを含んだ樹脂を10分間3,000×ｇで遠
心してペレツトとし、上澄みをデカントした。残つたセ
フアデツクスを20mMのDTTと8M尿素を含む25mlのT100E4
で２回洗つてから20mMのDTTを含む、25mlのT100E4で２
回洗つた。次にセフアデツクスを１回、20mMのDTTと0.3
Mの食塩を含む25mlのT100E4で抽出した。この抽出物
は、約0.15mg/mlのタンパクと、0.04mg/ml以上のSLPIを
含んでいた。この方法で得たSLPIは、高圧液体クロマト
グラフイーにより70％以上の純度であることが確定され
た。 例 ５ 例４の方法を用いて、２番目の凍結ペレツトを最初の
T100E4/DTT/PMSF/尿素の代りに、１％Triton Ｘ−100
（Sigma,Cat.No.T−6878から入手）を含むT100E4で抽出
した。得られたSLPIは、例４で得られたものより僅かに
純度が高く、例６において述べるリフオルデイング・ア
ツセイにおいて、より高い活性があつた。 例 ６ 精製SLPIのリフオルデイング 例４または５からの約40μｇの部分的に精製したSLPI
を尿素中8M、もしくはグアニジン塩酸塩中5M（Pierce C
hemical Co.,＃24110）、そしてDTT中4mMとして、室温
で１時間温置した。酸化型グルタチオン（Sigma,Cat.N
o.G−4626）を13.5mMになる迄加え、混合物を再び室温
で１時間温置した。混合物をpH10.7の50mMトリス溶液で
10倍稀釈し、更に室温で４時間温置した。 それから、混合物をpH8.0の50mMトリスと0.15M食塩で
５倍に稀釈し、pH8.0の50mMトリスと、0.25M塩化ナトリ
ウムで前もつて平衡させた、セフアデツクスSP−C25の
１×2cmカラムにかけた。 樹脂を0.25Mの塩化ナトリウムを含むpH8.0の50mMトリ
スで洗い、それから0.5Mの塩化ナトリウムを含む、pH8.
0の50mMトリスで洗つた。0.5Mの塩の洗滌で溶出する区
分は、十分に活性であり、カラムにかけたSLPIの約30％
を呈している。 例 ７ SGE30細胞融解物の可溶区分不溶区分からのSLPIの精
製。 E.coli SGE30細胞中のプラスミドpSGE8の発現によ
り、細胞融解物の可溶及び不溶の両区分において、SLPI
を生産した。SLPIは全細胞タンパクの１％を占め、可溶
区に約80％、不溶区に約20％分布していた。 A. 不溶区からのSLPIの精製 pSGE8を含むE.coli SGE30細胞を、振盪フラスコで50
μg/mlアンピシリンを含むLB培地でOD600が0.7になる迄
培養し、IPTGを0.2mM迄加えて誘導した。３時間後に、
細胞をペレツトとし、その２倍の重量の50mMトリス−塩
酸（pH7.5）と4mMのEDTA（今後は、T50E4と称する）に
懸濁した。細胞を４℃で超音波をかけて破壊し、抽出物
を12,000×ｇで、40℃で20分間遠心分離した。 ペレツトを３倍容量のT50E4で洗い、10M尿素か6Mグア
ニジン塩酸塩のいずれか、及び5mMの還元型DTTを含む溶
液で、室温で溶解させた。室温で１時間温置した後酸化
型グルタチオンを17.5mMの濃度で加え、混合物をもう１
時間温置した。それから混合物をpH10.7の10倍容積量の
50mMトリス−塩酸で希釈した。希釈混合物を室温で４時
間放置後、5N塩酸を加えてpHを８に調節した。この混合
物を遠心分離して、沈殿したタンパクを除いた。 このようにしてできた上澄みは、分泌性白血球プロテ
アーゼ阻害剤活性を示すSLPIを含んでいた。このタンパ
クを上に述べたようなセフアデツクスSP−C25カラム上
のクロマトグラフイーで精製した。 B. 可溶区分からのSLPIの精製 プラスミドpSGE8を含むE.coli SGE30細胞を振盪フラ
スコ中でOD600が0.7になる迄培養し、IPTGを0.2mM迄加
えて誘導した。OD600が1.1で、細胞を25,000×ｇで15分
間遠心分離してペレツトとした。ペレツトをT50E4に再
び懸濁し、４℃で20,000psiでフレンチプレスによつて
くずした。くずしたものを25,000×ｇで15分間遠心分離
した。 上澄みをDTT中で25mMとし、この混合物を０℃で１時
間温置し最終濃度が５％になる迄十分量の塩酸を加え
た。０℃で30分間温置した後、混合物を25,000×ｇで15
分間遠心分離し、上澄みを除き次の工程にかけた。10M
の水酸化ナトリウムで上澄みのpHを8.0に調整し、SDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動、逆相HPLCクロマトグ
ラフイー及びエライサ（ELISA）法によつて精製及び分
析を行ない、その結果、全タンパク130UGあたり少くと
も0.7UGのSLPIが示された。それについて、例６に従つ
てリフオルデイングを行なつた。 例 ８ 癒合SLPI−MF1遺伝子（例3E参照）を含むEcoR I断片
を酵母ベクターYIp5のEcoR I部位に、この出願中に参照
文献として特別に加えてあるBotsteinとR.W.Davisによ
るThe Molecular Biology of the Yeast Saccharomyce
s,Cold Spring Harbor Laboratory pp.607−636（198
2）に記述されているようしてつなぎ、YIpSLPI−１を生
成させ、本出願に特別に参照文献として加えてある、T.
Orr−WeaverらMethods in Enzymology101:228（1983）
に記されてあるような位置志向的組み換えによつてS.ce
revisiae BS214（MAT,Ura3−52,pep 4 prbl）のURA３
遺伝子の中に組み込んだ。この株、S.cerevisiae SGY
−１は完全に活性なSLPIを培養上澄み中に分泌する。 ２番目の株、SGY−３も活性SLPIを生産し、分泌す
る。この株は複製性酵母プラスミツドpGS585上にMF1:
:SLPI癒合をもつている。このプラスミドは、本出
願に特別に参照文献として加えた、J.R.Broach,Methods
in Enzymology101:307（1983）によつて記述されたよ
うに、pJDB207から、また本出願中に特別に参照文献と
して加えたD.BotsteinとR.W.Davis,the Molecular Biol
ogy of the Yeast Saccharomyces,Cold Spring Harbor
Laboratory,pp.607−636に記述されたように、プラスミ
ツドY24から単離された酵母URA３遺伝子を添加すること
により構築され、そしてpJDB207のHind IIIの切断位置
にクローニングを行ない、pGS585を構築した。EcoR I断
片に含まれるMF1: :SLPI癒合遺伝子をEcoR I−Xho
Iアダプター（Amersham.Cat.No.DA1007から得た）を用
いて、pGS585のSal I切断位置にクローニングして、YEp
SLPI−１を生成した。特別にこの出願に参照文献として
加えたJ.Bacteriology153:163（1983）において、Itoら
によつて記述された、形質転換によつてこのプラスミド
をS.cerevisiae DBY746（MAT,Ura3−52,leu2−3,his3
1,trp1−289）に導入した。 Saccharomyces cerevisiae菌株SGY−１とSGY−３を、
特別に本出願中参照文献として取り入れた、Method in
Yeast Genetice p.62,Cold Spring Harbor Laboratorie
s,Cold Spring Harbor,New York（1981）に記述され
た、F.Shermanらの方法に従つて、Uracilの欠けているS
D培地で、30℃で定常期迄培養した。細胞を遠心分離に
よつて培地から除き、培養上澄みを（１）プロテアーゼ
阻害活性と、（２）エライサ法によつて、抗−SLPI抗体
と特異的に反応する物質の量を測定することによつて、
SLPIの活性について検定した。精製の体系は、本出願に
おいて記述された、以前の方法に類似のやり方で展開で
きる。 本発明と工程や生産物について、さまざまな改変を行
なつたり変化を与えたりすることができることは、この
道で技能をもつた人々にとつては明白である。したがつ
て、本発明は、附帯の請求範囲及びそれらの同等の範囲
内にあるならば、その修飾や改変を包含することを意図
するものである。
連続番号No.678,822の一部継続出願である。 発明の背景 内生タンパク分解酵素は、侵入する生物体、抗原−抗
体複合体と、生態に最早必要乃至は有用でないある特定
の組織タンパクを分解するのに役立つ。正常に機能して
いる生物体では、タンパク分解酵素は、限られた量だけ
生産され、一部はプロテアーゼの阻害剤の合成を通じて
制御されている。 多数の天然に存在するプロテアーゼ阻害剤は、その反
応を場所的に及び時間的に制御することによつて、内生
プロテアーゼを制御している。その上、プロテアーゼ阻
害剤は、感染及び寄生生物によって身体の中に持ち込ま
れたプロテアーゼを阻害することがある。特別にタンパ
クの加水分解の攻撃や感染を受け易い組織、例えば、呼
吸路の組織はプロテアーゼ阻害剤に富んでいる。 プロテアーゼ阻害剤は、ヒト血漿タンパクの約10％を
構成している。少くとも８種の阻害剤がこの材料源から
単離され、文献中にその特性が記載されている。これら
の中には、α２−マクログロブリン（α2M）、α１−プ
ロテアーゼ阻害剤（α1PI）、α１−アンチキモトリプ
シン（α1Achy）、β１−アンチコラゲナーゼ（β1A
C）、及び、インター−α−トリプシン阻害剤（Ｉα
Ｉ）がある。 プロテアーゼ／プロテアーゼ阻害剤のバランスの攪乱
は、気腫、関節炎、糸球体腎炎、歯周炎、筋ジストロフ
イー、腫瘍の侵入及びさまざまな他の病理的状態を包含
するプロテアーゼを媒介とする組織の破壊へと導く。あ
る状況、例えば、敗血症とか急性白血病のようなきびし
い病理学的進行の場合には、存在する遊離のタンパク分
解酵素の量は、分泌細胞からの酵素の放出により増加す
る。それに加えて、他の状況下では、これとは別に生体
の制御的な阻害剤の容量が減少するため、プロテアーゼ
／プロテアーゼ阻害剤−バランスの変化が起きることも
ある。このよえな制御的な阻害剤の容量が減少する例
は、α１−プロテアーゼ阻害剤の欠損であり、肺気腫の
発生と大きく関わり合つている。 生体にこのような常規を逸脱した状態が存在すると、
タンパク分解酵素を制御するための方策を講じなけれ
ば、生体への深刻な傷害が起り得る。したがつて、生体
に投与すれば、タンパク分解酵素を制御することが出来
るプロテアーゼ阻害剤が探し求められてきた。 白血球エラスターゼは、病理学的見地からことのほか
興味深いセリンプロテアーゼの１つの例である。白血球
エラスターゼは、細胞外に放出されると、結合組織やそ
の他の貴重なタンパクを分解する。正常に機能している
生体にとつて、ある一定量の結合組織や他のタンパクを
分解することは必要であるが、過剰の白血球エラスター
ゼの存在は、気腫やリユーマチ様関節炎のような様々な
病理的状態と関連づけられている。白血球エラスターゼ
が正常よりも大量に存在する場合、その効果に対抗する
ため、白血球エラスターゼ活性を阻害するプロテアーゼ
阻害剤が探し求められてきた。精製した形で薬剤として
役立つに足る量を、組み換えDNA法によつて生産できる
としたら、このようなプロテアーゼ阻害剤は特別に有用
であろう。 文献によると、過去において、少くとも２種の白血球
エラスターゼ阻害剤が同定されている。“ヒト多形核白
血球の中性プロテアーゼ”（Havemannら（編）UrbanとS
chwarzenberg,Inc.（1978））中の“ヒト粘液性分泌物
中の顆粒球中性プロテアーゼの酸に安定な阻害剤；生化
学と可能な生物学的機能”において、Schieislerらが記
述した１つのタンパクがヒトの精液のプラズマ及び痰か
ら単離され、Ｎ末端アミノ酸としてチロシンを持つ、大
きさが11kdaのタンパクとして性格づけられた。このタ
ンパクの文献報告からは、部分的なアミノ酸配列しか提
供されていないが、部分的な配列からさえも、このタン
パクは本発明のタンパク類とは実質的に異なつているこ
とがわかる。このタンパクのアミノ酸配列の報告と、本
発明のタンパクのアミノ酸配列データーから考えると、
Schiesslerらによつて配列が決定されたものは、元来一
本鎖のポリペプタイドではないタンパクの分解物であつ
たかもしれないということが発明者らに示唆される。 １例において、ヒトの血漿から単離された２番目のタ
ンパクは、α１−protease inhibitorと名付けられた。
このタンパクに関する業績は、TravisとSalvesenによつ
て総説、Annual Review of Biochemistry53:655−709
（1983）にまとめられている。このタンパクのアミノ酸
配列のレポートは、それも本発明のタンパクから実質的
に異なつていることを示している。 本発明の一本鎖ポリペプタイドのタンパク類が以前の
技術による一本鎖ポリペプタイドのセリンプロテアーゼ
阻害剤のいずれとも著しく異なつているから、以前に研
究された、一本鎖ポリペプタイドのセリンプロテアーゼ
阻害剤類は本発明のタンパク類とは“実質的に相同”で
はない。 トリプシンは、病理学的見地から特別興味のあるもう
１つのタンパクである。トリプシンは、膵臓炎のような
種々の急性症状のなかで、膵臓のような特定の軟かい器
官の組織の分解を始めることが知られている。これらの
症状の治療を目的として、トリプシンの作用を阻害する
だろうと期待されたタンパク類の使用による種々の努力
がなされたが、目覚しい成功は得られなかつた。このよ
うな努力の実例は、ヒトの膵臓炎の治療に牛の外生トリ
プシン阻害剤を用いる試みである。このような技術は、
ヨーロツパで試みられたが、米国食品医薬品局（FDA）
によつて効果があると認められなかつた。したがつて、
種々の急性または慢性症状中の、過剰のトリプシンを中
和する効果のあるプロテアーゼ阻害剤が必要である。上
に論議した白血球エラスターゼ阻害剤の場合にそうであ
つたように、トリプシン阻害剤は、もし、組み換えDNA
法によつて精製した形で、薬剤として役立てるに足る量
だげ単離製造できれば、ことのほか有用であろう。 カテプシンＧは、白血球に大量に存在するもう１つの
プロテアーゼである。カテプシンＧは、補足的経路のタ
ンパクをはじめとする種々の価値のあるタンパクを、in
vitroで分解できることが知られている。膵臓のエラス
ターゼが、膵臓炎で役割を果している可能性のあるもう
１つのプロテアーゼである。したがつて、これらのプロ
テアーゼに対する阻害剤も薬剤としての潜在的価値があ
る。 白血球エラスターゼ、トリプシン、カテプシンＧと膵
臓のエラスターゼは、セリンプロテアーゼとして知られ
ている一群のプロテアーゼの例であり、共通の構造と作
用機作の要素を持つている。それらの異なる基質に対す
る活性や、異なる阻害剤への活性は、２、３のアミノ酸
残基だげが異なつていることから生ずると信じられてい
る。類推によれば、やはり構造の作用機作の共通の要素
を持つていて、比較的少ないアミノ酸の変化が、異なつ
たプロテアーゼの阻害を結果として生ずるセリンプロテ
アーゼ阻害剤を想像することが可能であり、しかも、少
くともこの群の１員は、前述の群中のセリンプロテアー
ゼのすべてを阻害するであろう。そうであるとすれば、
この群のセリンプロテアーゼ阻害剤は、大きな価値があ
るであろう。 驚くべきことに、本発明者達は、このようなセリンプ
ロテアーゼ阻害剤の合成を導き行なうことができるDNA
配列を発見し、その阻害剤は、耳下腺分泌物から単離さ
れたものと生物学的に等価である。組み換えDNA法によ
つて作られ、本特許に提出される本発明のプロテアーゼ
阻害剤は、少くとも２箇所の活性部位を持つている。す
なわち、白血球エラスターゼ阻害の性質を示す１つの部
位と、トリプシンに対して阻害活性を示す２番目の部位
である。 現在の発明によつて生産された組み換え阻害剤は、熱
や酸による変性に著しく抵抗性があり、また様々なタン
パク分解酵素によるタンパク分解作用に対しても抵抗性
があると考えられる。この出願に用いられるように“組
み換え阻害剤”は、組み換えDNAの方法論と技術によつ
て生産されるプロテアーゼ阻害剤のことを指すよう意図
されている。さらに、本発明の組み換え阻害剤の活性形
は、哺乳動物の身体の細胞外の部位で普通に出会うよう
な条件下では、熱力学的に安定である。組み換えプロテ
アーゼ阻害剤の変成した形はまた、ジスルフイド結合を
形成する能力を持つており、生化学的刺戟の存在しない
状態で活性三次構造をとるのに必要な非共有結合的相互
作用を成立させる能力がある。 より十分に、ここに以下に提示する本発明のDNA塩基
配列は、発表されている他の白血球エラスターゼ阻害剤
のアミノ酸配列とは大きく異なつているところのタンパ
クの合成を導き行なう能力がある。したがつて、本発明
のDNA塩基配列の同定によつて、本出願の中で明らかに
される。新規の組み換えプロテアーゼ阻害剤の製造に関
する組換えDNA法の本発明を可能とした。 このような組換え法は、セリンプロテアーゼ阻害活性
を持つている経済的な薬剤組成物を供給するために、量
的にも、純度的にも、阻害剤の製造を可能にする。さら
に、DNA塩基配列の同定により、上述のセリンプロテア
ーゼ阻害剤の類縁体を製造する組み換えDNA法の発明を
可能にした。 発明の総括 本発明は、プロテアーゼ阻害剤製造に関するものであ
り、一般に、そして更に特定的には、ヒト、多形核（PM
N）−顆粒球プロテアーゼを阻害対象とした組換え阻害
剤の製造である。特にこの発明は白血球エラスターゼや
トリプシンを始めとするヒト・セリンプロテアーゼに対
する阻害剤の製造のための組換えDNA法に関するもので
ある。 それに加えて、本発明は、本セリンプロテアーゼ阻害
剤の類縁体の製造に関する組み換えDNA法にも関連す
る。本発明はまた、以下に述べるような組み換えDNA法
において有用な合成並びに天然のDNA塩基配列に関する
ものである。 セリンプロテアーゼ阻害活性を持つ一本鎖のポリペプ
タイドであるセリンプロテアーゼ阻害剤の組み換えDNA
合成法を提供することが本発明の目的である。これらの
阻害剤は、ヒトの耳下腺分泌物から単離された天然の白
血球エラスターゼまたはトリプシン阻害剤によつて示さ
れる活性と生物学的に同等な活性を持つている。 これらのセリンプロテアーゼ阻害剤の代替的組み換え
DNA合成を容易にするために、等価の天然のDNA塩基配列
と同様に、これらの組み換えプロテアーゼ阻害剤の生産
を導き行なうことができる合成DNA塩基配列を供給する
ことが、この発明のなおそれ以上の目的である。このよ
うな自然のDNA塩基配列は、プロテアーゼの阻害剤の合
成を導き行なうことができる遺伝子が、そこから単離、
同定されうるcDNAもしくはジエノミツクライブラリーか
ら単離されうる。 さらに、先に検討したプロテアーゼ阻害剤の類縁体を
製造する組み換えDNA法及びこのような方法に役立つ、
相当する類縁DNA塩基配列を提供することが本発明の目
的である。 なおその他の本発明の目的と利点は、以下に続く記述
において一部出てくるであろう。そして一部は記述から
明白であるか、発明の実施から学ばれることもあろう。
その目的と利益は、添付した特許請求の範囲において特
に指摘されている手段と組合せによつて了解され、達成
されるであろう。 この目的を達成するため、そして本発明の目的に従つ
て、セリンプロテアーゼ阻害活性を示すところの、活性
型で一本鎖ペプタイドのタンパクであるプロテアーゼ阻
害剤の組み換えDNA方法論による生産を導き行なうこと
ができるDNA塩基配列を発見した。これらの組み換えプ
ロテアーゼ阻害剤は、熱や酸による変性に対して著しく
抵抗性である。さらに、これらのプロテアーゼ阻害剤
は、キモトトリプシンやマウスの顎下腺プロテアーゼや
クロストリパインのような多くのタンパク分解酵素に接
触した後でさえ、それらの生物活性を維持している。 これらの組み換えセリンプロテアーゼ阻害剤の製造を
導き行なうために発見されたDNA塩基配列の（遺伝暗号
鎖）コーデイングストランドは以下の通りである。 上述の略号によつて表示されたヌクレオタイドは、提
起された具象化の詳細な記述において明らかになる。 これらの遺伝子組み換えセリンプロテアーゼ阻害型、
特に本発明の分泌形白血球プロテアーゼ阻害剤（SLPI）
の製造を導き行なうために発見した、２番目の好ましい
DNA塩基配列に対するコーデイングストランドは以下の
如くである。 さらに目的を達成するため、そして本発明の目的に従
つて、上に掲げた天然または合成DNA塩基配列を用い
て、本セリンプロテアーゼ阻害剤の微生物製造に帰着す
る組み換えDNA法を明らかにする。この組み換えDNA法は
以下の項目を包含する。 （ａ） 宿主微生物を導き、セリンプロテアーゼ阻害活
性、好ましくは白血球エラスターゼ阻害活性を持つタン
パクの製造を行なうことができるDNA配列の調製。 （ｂ） 宿主微生物の中に導入され、複製することがで
きるDNA塩基配列をクローニングすること。このような
ベクターはDNA塩基配列に対するオペレーシヨナルエレ
メント（操作要因）を含んでいる。 （ｃ） DNA塩基配列とオペレーシヨナルエレメントを
含むベクターをプロテアーゼ阻害タンパクを発現するこ
とができる宿主微生物の中に移すこと。 （ｄ） ベクターの増幅と阻害剤の発現のため適切な条
件下でその微生物を培養すること。 （ｅ） 阻害剤を収穫すること；そして （ｆ） 阻害剤がセリンプロテアーゼ阻害活性を有する
活性三次構造をとれるようにすることである。 本発明において使うための天然のDNA塩基配列の同定単
離を容易にするため、本発明者達はヒト耳下腺組織cDNA
ライブラリーを開発した。このライブラリーは、細胞が
本発明のセリンプロテアーゼ阻害剤を合成するようにし
むけることができる遺伝情報を含んでいる。ここに述べ
られた組み換えDNA法に用いられることがある他の天然D
NA塩基配列は、ヒト・ジエノミツクライブラリーから単
離することができる。 本発明の過程において役に立つ合成塩基配列は、ポリ
ヌクレオチドの合成と、この道の普通の技量を持つた人
人にとつて知られている配列を行なう技術によつて作る
ことができる。先に述べた過程において、有用な天然の
DNA塩基配列は、以下の項目を含む方法によつて同定・
単離することができる。 （ａ） 細胞から、好ましくは耳下腺の細胞からセリン
プロテアーゼ阻害剤を発生することができるヒトcDNAラ
イブラリーを調製すること。 （ｃ） プロテアーゼ阻害剤の遺伝子またはそのタンパ
ク生産物に結合することができる少なくとも１つのプロ
ーブでヒトDNAライブラリーをプローブすること。 （ｃ） クローンが遺伝子又はそのタンパク生成物に対
する、少くとも１つのプローブに結合する能力によつ
て、阻害剤をコードしている遺伝子を含む少なくとも１
つのクローンを同定すること。 （ｄ） 同定されたクローンから阻害剤をコードしてい
る遺伝子の単離、そして （ｅ） 遺伝子またはそれについての適切な断片を宿主
の微生物の遺伝子を維持し、表現することに必要なオペ
レーシヨナルエレメントにつなぐこと。 前に述べた過程において、有用な天然のDNA塩基配列
も、以下の項目を含む方法によつて同定・単離できる。 （ａ） 宿主rec A rec BC E.coliにおいて繁殖させた
ヒト・ジエノミツクDNAライブラリーを調製すること。 （ｂ） ヒト・ジエノミツクDNAライブラリーをセリン
プロテイン阻害剤遺伝子に結合することができるか、そ
のタンパク生成物に結合することができる少くとも１つ
のブローブでプローブすること。 （ｃ） 遺伝子又はそのタンパク産物に対する少くとも
１つのプローブに結合するクローンの能力によつて阻害
剤をコードする遺伝子を含む少くとも１つのクローンを
同定する。 （ｄ） 同定されたクローンから阻害剤をコードする遺
伝子を単離する。そして、 （ｅ） 遺伝子もしくは適当なその断片を宿主微生物中
の遺伝子を維持し発現するのに必要なオペレーシヨナル
エレメントにつなげること。 さらに、目的を達成するため、そして本発明の目的に
従つて、セリンプロテアーゼ阻害剤の薬剤的に有用なア
ナログは上に詳述した遺伝子組み換えDNA法により、適
切なベクターにクローニングを行なつて、適切な宿主微
生物に移した場合、欲しいアナログの発見を誘導できる
遺伝子をつくり出すために、上に列挙した組み換えDNA
技術を通じて合成的なDNA塩基配列もしくは天然DNA断片
を変えることにより生産することができる。 さらに、目的を達成するために、そして本発明の目的
に従つて、本発明に従つた組み換えプロテアーゼ阻害
剤、もしくは上に述べた、組み換えDNA法で生産された
生物活性を有するアナログを活性成分として含んでいる
薬剤組成物を明らかにする。 本発明に組み込まれていてこの出願の一部をなしてい
る添付されている図は、この発明に役立つ種々のプラス
ミツドを図解し、同時に、本発明の原理を説明するのに
役立つ記述を含んでいる。 図の簡単な記述 第１図は、プラスミドpSGE6の地図である。 第２図は、プラスミドpSGE8の地図である。 第３図は、プラスミドpGS285の地図である。 第４図は、プラスミドpGS485である。 好ましい実施態様に関する記述 現在において提出した発明の実施態様について、今、
詳細に述べよう。それらは、あとに続く実施例とともに
本発明の原理を説明するのに役に立つ。 上に記したように、本発明は精製した形で単離された
プロテアーゼ阻害剤に関するものである。望ましくは、
本発明のセリンプロテアーゼ阻害剤は、一本鎖ポリペプ
チドタンパクであり、ヒト・耳下腺分泌物から単離され
た天然のセリンプロテアーゼ阻害剤に実質的に同族であ
るかもつとも好ましくは生物学的に等価である。特許明
細と請求範囲を通じて使われている“生物学的に等価”
とは、組成物は、プロテアーゼによつて誘起された、同
じ型の組織の損傷を防ぐことができるが、必ずしも天然
プロテアーゼ阻害剤と同程度ではないということであ
る。あとに続く明細と請求範囲を通じて使用されている
“実質的に相同”とは、天然の耳下腺阻害剤に対して以
前に報告されている一本鎖ペプタイドセリンプロテアー
ゼ阻害剤によつて示された相同性以上の相同性のことで
ある。好ましくは、相同性の程度が40％より大きく、最
も好ましくは50％より大きく、特別に好ましい群のタン
パクは天然耳下腺阻害剤との相同性が60％より大きい。
上に記述したような百分率の相同性は、２つの配列のう
ちの小さい方に見出された成分の百分率として計算され
ており、２つの配列のうちの大きい方でも、同じことが
みつかるかもしれない。この成分は４つの続いたアミノ
酸の配列として理解されているものである。 本発明の組み換え法によつて製造される好ましいプロ
テアーゼ阻害剤は、Robert C. Tompson et.al．の“セ
リンプロテアーゼ阻害剤と同じものを単離する方法”と
題して、1984年12月６日に提出した米国特許出願連続番
号No.678,823及びこの出願と同期日に出願した、Robert
C. Tompsonらの“セリンプロテアーゼ阻害剤と同じも
のを単離する方法”と題する米国特許出願連続番号No._
に記述されている。このようなプロテアーゼ阻害剤は、
熱や酸による変性に対し、著しく抵抗性であり、又、キ
モトリプシン、マウス顎下腺プロテアーゼ、クロストリ
パインをはじめとする、多くのタンパク分解酵素に接触
した場合、活性喪失に対し抵抗性である。これらの阻害
剤は、必要なジスルフイド結合を形成する能力を持ち、
生化学的刺戟の存在しないところで、プロテアーゼ阻害
剤活性を表現することができる３次構造をとるべく適切
な非共有結合適相互作用を受ける。あるいは、ジスルフ
イド結合が切れて非共有結合的相互作用が破壊されても
このような結合を再生し、相互作用を取戻し、生化学的
刺戟のないところで、このような活性３次構造を再びと
ることができる。 これらの特性を持つている好ましいセリンプロテアー
ゼ阻害剤のアミノ酸の配列を検討し、その配列を以下の
如く決定した。 Ser−Gly−Lys−Ser−Phe−Lys−Ala−Gly−Val−Cys−
Pro−Pro−Lys−Lys−Ser−Ala−Gln−Cys−Leu−Arg−
Tyr−Lys−Lys−Pro−Glu−Cys−Gln−Ser−Asp−Trp−
Gln−Cys−Pro−Gly−Lys−Lys−Arg−Cys−Cys−Pro−
Asp−Thr−Cys−Gly−Ile−Lys−Cys−Leu−Asp−Pro−
Val−Asp−Thr−Pro−Asn−Pro−Thr−Arg−Arg−Lys−
Pro−Gly−Lys−Cys−Pro−Val−Thr−Tyr−Gly−Gln−
Cys−Leu−Met−Leu−Asn−Pro−Pro−Asn−Phe−Cys−
Glu−Met−Asp−Gly−Gln−Cys−Lys−Arg−Asp−Leu−
Lys−Cys−Cys−Met−Gly−Met−Cys−Gly−Lys−Ser−
Cys−Val−Ser−Pro−Val−Lys−Ala. 上記の略号は、ポリペプチド中のアミノ酸残基に次の
如く対応する。 アミノ酸 略 号 アラニン Ala バリン Val ロイシン Leu イソロイシン Ile プロリン Pro フエニールアラニン Phe トリプトフアン Trp メチオニン Met グリシン Gly セリン Ser スレオニン Thr システイン Cys チロシン Tyr アスパラギン Asn グラタミン Gln アスパラギン酸 Asp グラタミン酸 Glu リジン Lys アルギニン Arg ヒスチジン His ここに明らかにされた組み換えDNA法によつて製造さ
れたこれらのプロテアーゼ阻害剤は１つ以上の区別でき
るドメインを持つていることが発見された。１つ以上の
区別できるドメインとは、そのタンパクが異なる酵素に
対して機能する複数の活性部位を持つているということ
である。これらの場所の存在と位置つけは、プロテアー
ゼ阻害剤の少くとも２つの部分の間には、実質的な相同
性があることが発見されたことによつて決定された。区
別できるドメインの存在が、本プロテアーゼ阻害剤に白
血球エラスターゼもトリプシンも含む広い範囲のセリン
プロテアーゼを阻害する能力を与えていると考えられ
る。 さらに、これらプロテアーゼ阻害剤のはつきりしたド
メインの複数性のために、プロテアーゼ阻害剤が附加的
特性をもつプロテアーゼ阻害剤をつくるために、さまざ
まな他の活性部位がその上に構築されるような枠組みと
して役立つかもしれないということが注目された。好ま
しい本発明の具体化は、白血球エラスターゼ、カテプシ
ンＧ、膵臓のエラスターゼとトリプシンを阻害するプロ
テアーゼ阻害剤の生産を含んでいる。これらの酵素はす
べて共通のメカニズムと多くの構造的特徴を共有してい
るセリンプロテアーゼとして知られているプロテアーゼ
のクラスのメンバーである。本発明によつて生産された
プロテアーゼ阻害剤において、小数のアミノ酸側鎖を細
工することによつて阻害剤の複合性が創り出され、各々
が全体のクラスのセリンプロテアーゼの少くとも１員を
阻害することができると考えられる。その上、このよう
な側鎖の修飾は、上に述べたような特定のセリンプロテ
アーゼのクラスのメンバーに関して阻害活性が改善され
ている複数性の阻害剤を産出することが期待できる。 これらの目標を達成するのに必要なアミノ酸の側鎖の
変化は、本発明によつて生産された好ましい阻害剤と阻
害剤の重要な機能部分がＸ−線結晶学によつて解明され
た他のセリンプロテアーゼ阻害剤の間の構造類似性の特
定の要素によつて示唆される。構造的類似性のこれらの
要素は上述の本発明によつて製造された好ましいセリン
プロテアーゼ阻害剤のアミノ酸17から29及び70から83を
含んでいる。量的か質的かのいずれかにおいて、トリプ
シン様セリンプロテアーゼ阻害剤の活性を改良するため
に示唆された変化は、20番目のアミノ酸をArgからPhe、
TyrあるいはTrp、72あるいは74番目のアミノ酸をLeuか
ら、LysまたはArg、そして73番目のアミノ酸をMetからL
ysまたはArgへ変換することの１つもしくはそれ以上を
含んでいる。 カテプシンＧをはじめとするキモトリプシン様セリン
プロテアーゼに対する活性を、量的又は質的に改善する
べく示唆された変化は、アミノ酸20をArgからPne、Tyr
またはTrpへ、アミノ酸72または74をLeuからPhe、Tyrま
たはTrpへ、そしてアミノ酸73をMetからPhe、Tyrもしく
はTrpへ変換することを、１つもしくはそれ以上行なう
ことを含んでいる。 膵臓のエラスターゼ様セリンプロテアーゼに対する阻
害剤の活性を、量的もしくは質的に変えるべく示唆され
た変化は、アミノ酸20をArgからAalへ、72または74番目
のアミノ酸をLeuからAlaへ、そして73番目のアミノ酸を
MetからAlaへ変換することの１つ又はそれ以上を含んで
いる。 本発明の実施例にあたつては、本発明のタンパクに新
しいプロテアーゼ阻害活性を付与するためのアミノ酸の
変更は、白血球エラスターゼもしくはトリプシンに対す
る阻害剤の活性を破壊するかもしれないということを心
にとめておかねばならない。このような効果は本発明の
教えに従つて行なわれる型通りの実験によつて決定され
よう。 さらに、上に提出されたように、特定のアミノ酸もし
くは特定のアミノ酸の配列を置換すると、一方では強化
されないドメインの活性を幾分か犠牲にすることになる
が、本発明のプロテアーゼ阻害剤の白血球エラスターゼ
もしくは、トリプシン阻害活性のいずれかを増強するか
もしれないということが考えられる。事実：阻害タンパ
クの中のどの領域の活性も、適切なアミノ酸置換によつ
て完全に除去され、その際、それに対して通常そのタン
パクが活性がある１つか、もしくはいくつかの酵素のサ
ブセツトに対して、特異性のあるタンパクをつくるかも
しれない。例えば、73の位置のMetに対し、Glyを置換す
るか、もしくは、72か、74の位置のLeuに対してGlyを置
換すると、白血球エラスターゼ阻害ドメインを不活性化
するが、20の位置のArgに対しGlyを置換するとトリプシ
ン阻害ドメインを不活性化する。これらドメインはま
た、各々が望ましい阻害機能を保持する、別々のタンパ
クに分けることもできる。本発明の請求範囲は、これら
の手段によるこのような阻害剤を生産する他の工程に対
しても拡張される。 本発明者らは、上に議論したプロテアーゼ阻害剤の細
胞内生産を導き行なうことができる合成的DNA塩基配列
を発見した。この塩基配列は、次のような構造をもつて
いる。 この中で、ヌクレオチドは、下記のような略号で表さ
れている。 ヌクレオチド 略 号 デオキシアデニル酸 Ａ デオキシグアニル酸 Ｇ デオキシシチジル酸 Ｃ チミジル酸 Ｔ 本発明者らは、上に議論したプロテアーゼ阻害剤、と
りわけ、上述の分泌性白血球プロテアーゼ阻害剤（SLP
I）の細胞外生産を導き行なうことができる２番目の好
ましい合成DNA塩基配列を発見した。この塩基配列は次
のような構成をもつている。 上に注意したように、本プロテアーゼ阻害剤の複合的
ドメイン構造のため、上に議論したようなセリンプロテ
アーゼ阻害剤の類縁体生産を導くことができるDNA配列
を結果として生ずる、ここに提出する合成的DNA配列に
変化を与えることが考えられる。 特に本発明に従つて組み換えDNA技術によつて生産さ
れたセリンプロテアーゼ阻害剤の好ましい類縁体は、次
のアミノ酸配列をもつている。 R1−Gly−Lys−Ser−Phe−Lys−Ala−Gly−Val−Cys−P
ro−Pro−Lys−Lys−Ser−Ala−Gln−Cys−Leu−R2−Ty
r−Lys−Lys−Pro−Glu−Cys−Gln−Ser−Asp−Trp−Gl
n−Cys−Pro−Gly−Lys−Lys−Arg−Cys−Cys−Pro−As
p−Thr−Cys−Gly−Ile−Lys−Cys−Leu−Asp−Pro−Va
l−Asp−Thr−Pro−Asn−Pro−Thr−Arg−Arg−Lys−Pr
o−Gly−Lys−Cys−Pro−Val−Thr−Tyr−Gly−Gln−Cy
s−R8−R3−R9−Asn−Pro−Pro−Asn−Phe−Cys−Glu−
R4−Asp−Gly−Gln−Cys−Lys−Arg−Asp−Leu−Lys−C
ys−Cys−R5−Gly−R6−Cys−Gly−Lys−Ser−Cys−Val
−Ser−Pro−Val−Lys−R7, ここで R1とR7は同一か、異なったものであり、置換もしくは
無置換アミノ酸残基もしくはその誘導体から成立つ群か
ら選ばれている。そして R2、R3、R4、R5、R6、R8及びR9は同一か異なつたもの
であり、メチオニン、バリン、アラニン、フエニールア
ラニン、チロシン、トリプトフアン、リジン、グリシン
及びアルギニンからなる群から選ばれる。 上に示されたDNA塩基配列は、本発明の好ましい具象
化を表していることに注目すべきである。ジエネテイツ
クコードの縮重のためにヌクレオチドの多数の選択、本
プロテアーゼ阻害剤、もしくはその類縁体の生産を導き
行なうことができるDNA塩基配列の導く多数のヌクレオ
チドの選択がなされうるということが理解されるべきで
ある。上に提出した塩基配列に対し、機能的に同等であ
るDNA塩基配列もしくは上に提出したアミノ酸配列に従
つて生産されたプロテアーゼ阻害剤のアナログの生産を
導き行なうであろうところの配列に機能的に等価である
配列は、それ自体で本発明の中に包含されるものとす
る。以下の図式は、縮重したジエネテイツクコードの結
果として考えられるコドンの置換の例として、上に数え
上げた好ましいアミノ酸配列の製造のための本発明の範
囲に含めることを意図した追加のDNA配列である。この
タンパクの生産に対する等価DNA塩基配列を決定するた
めの例を辿ることによつて、この道の普通のわざを持つ
た人々なら、好ましいアミノ酸配列の類縁体の生産のた
めの等価なDNA塩基配列も決定できる。 上の配列においては、用いられる略号は下に示される
ヌクレオチドを表わすよう意図されている。ヌクレオチド 略 号 A,G,C,T Ｎ A,G Ｐ C,T Ｑ すぐ上にかかげたものを含め、本発明の合成DNA塩基
配列において用いられる遺伝暗号を選択する場合に、特
定のアミノ酸を指示するのに用いられる遺伝暗号は高度
に発現されるタンパクと関連するものであることが望ま
しい。これらの望ましい遺伝暗号は１部Granthan,R et
al．らの“Codon Catalog Usage Is a Genome Strategy
Modulated For Gene Expressivity"は、Nucleic Acids
Research ９:r43（1981）に出ている。本発明の好まし
いDNA配列は、縮重した配列のいずれに対しても、Esche
richia coliの配列遺伝暗号を選択することによつて選
ばれた。 さらに、本発明のプロテアーゼ阻害剤の類縁体の生産
を導き行なうことが出来る追加の合成DNA塩基配列をつ
くり上げるための合成DNA塩基配列の変換を容易にする
遺伝暗号を選ぶことが望ましい。特に、もし可能なら、
制限酵素、エンドヌクレアーゼの切断位置を、追加の遺
伝暗号を挿入することが望ましい合成DNAの位置の近く
に、もしくは類縁体が作られるように遺伝暗号を取り換
えることが望ましい位置に、もつてくることができるよ
うにヌクレオチド配列を選ぶことが望ましい。本発明の
DNA配列の望ましい実施態様においては、制限酵素の切
断位置が上に示したヌクレオチド配列の下に示してあ
る。 ここに考えられている合成DNA配列をつくり出す方法
は、一般的に、最近の報告によつて導かれたこの道の普
通のわざの１つによつて遂行される型通りの業務の範囲
内にある。ここで明らかにした合成DNA塩基配列を得る
ために用いられる適切な方法の例は、Matteacci,M,D,と
Caruthers,M.H.,J.AH.Chem.Soc.103:3185（1981）及
び、Beaucage,S.L.とCaruthers,M.H,Tetrahedron Lett.
22;1859（1981）、によつて提出されており、両方と
も、特別に参照事項としてこの中に組み込まれている。 本発明の代替的実施態様において、１つのDNA塩基配
列が、本発明の望ましい分泌白血球プロテアーゼ阻害剤
（SLPI）をコードするヒト・ジエノミツクライブラリー
から単離された。この４番目の遺伝暗号からコードさ
れ、現在発明者らに知られているイントロン（介在配
列）を含むこの塩基配列は以下の通りである。 この配列においては、アミノ酸残基に用いられた１文
字の略号は普通に用いられており、例えば、A.L.Lehnin
gerによるBiochemistry第２版、Worth Publisher,Inc.,
New York,New York（1976）72頁に出ている。 この塩基配列とここに含まれるアミノ酸配列データー
を用いて、上のジエノミツク配列に加えられた場合、全
プロテアーゼ阻害剤をコードする遺伝子に到達する合成
DNA配列が構築できる。そのかわりに、上に示したDNA塩
基配列を用いてプローブを作り、最初の３つのアミノ酸
に対するコドンを持つている、ヒトジエノミツクライブ
ラリーから、DNA断片を回収するのに用いた。 このようなプローブは、それに加えて適切なリーダー
配列を含むヒトジエノミツク配列を同定するのに用いら
れる。このリーダー配列、または、どの他の適切なリー
ダー配列も、DNAジエノミツク配列と併用して、哺乳動
物の発現システムに用いられると考えられる。 本発明のもう１つの別法としての具体化において、本
発明の好ましい分泌性白血球プロテアーゼ阻害剤の細胞
内生産を導き行なうことができるDNA配列をコードする
耳下腺ライブラリーからcDNAクローンを単離した。この
クローンはAccession No._の下に、Rockville,Maryland
のAmerican Type Culture Collectionに預けてある。 セリンプロテアーゼ阻害活性を有する少なくとも１つ
の活性部位をもつ１本鎖ポリペプタイドから構成されて
いる１つのプロテアーゼ阻害剤の製造に対する組み換え
DNA法が明らかとなつた。発明の１つの具体化におい
て、この活性部位は、ヒト・耳下腺分泌物から単離され
た天然の白血球エラスターゼ阻害剤の活性部位と生物学
的に等価な方法で機能する。天然又は合成DNA塩基配列
は、プロテアーゼ阻害剤の直接生産に用いることができ
る。この方法は、以下の工程を含む。 （ａ） 宿主微生物が、セリンプロテアーゼ阻害剤活性
をもつているタンパクを生産するよう導くDNA塩基配列
の調製。 （ｂ） DNA塩基配列を宿主に移し増殖することができ
るベクターにそのDNA塩基配列をクローニングするこ
と。このようなベクターは、そのDNA塩基配列に対して
オペレーシヨナルエレメントを含んでいる。 （ｆ） 合成DNA塩基配列とオペレーシヨナルエレメン
トを含むベクターをプロテアーゼ阻害剤を発現すること
ができる宿主微生物に移す。 （ｄ） その微生物をベクターの増殖と阻害剤の発現に
適切な条件下で培養すること。 （ｅ） 阻害剤を収穫すること。そして、 （ｆ） 阻害剤がセリンプロテアーゼ阻害活性を持つ、
活性３次構造をとれるようにすること。 この方法における使用のために考えられた合成DNA塩
基配列が、上に詳細に検討された。代替的実施態様にお
いて、この方法で天然のDNA塩基配列も使うことができ
るということが更に考えられる。これらの配列には、cD
NAもしくはジエノミツクDNA断片が用いられる。この実
施態様のより好ましい変形として天然のDNA配列は、以
下の項目を含む方法によつて得られる。 （ａ） セリンプロテアーゼ阻害剤を生成できる細胞、
さらに望ましくは、耳下腺の細胞からヒトのcDNAライブ
ラリーを調製する。 （ｂ） プロテアーゼ阻害剤遺伝子もしくはそのタンパ
ク産物に結合することができる少くとも１つのプローブ
で、ヒトDNAライブラリーを検索する。 （ｃ） そのクローンが遺伝子もしくはそのタンパク産
物に対する、少くとも１つのプローブと結合する能力に
よつて阻害剤をコードする遺伝子を含む少くとも１つの
クローンを同定する。 （ｄ） 選ばれた単一クローンもしくは複数のクローン
から阻害剤をコードする遺伝子の単離。 （ｅ） 遺伝子もしくはその適切な断片を宿主微生物中
の遺伝子を維持し、発現するために必要なオペレーシヨ
ナルエレメントにつなげること。 前出の工程において、有用な天然のDNA塩基配列も以
下の工程を経て同定単離される。 （ａ） より好ましくは、宿主rec A rec BC E.coli中
で繁殖させたヒト・ジエノミツクライブラリーを作る。 （ｂ） ヒトジエノミツクライブラリーをセリンプロテ
イン阻害剤遺伝子、もしくは、その生産物に結合するこ
とができる少なくとも１つのプローブを用いて検索す
る。 （ｃ） そのクローンが遺伝子またはタンパク産物に対
する少なくとも１つのプローブに結合するクローンの能
力によつて阻害剤をコードする遺伝子を含む少くとも１
つのクローンを同定する。 （ｄ） 同定されたクローンからの阻害剤をコードする
遺伝子を単離する。 （ｅ） 遺伝子もしくはその適当なフラグメントを宿主
微生物中の遺伝子を維持し、表現するのに必要なオペレ
ーシヨナルエレメントにつなげること。 上にかかげた方法を用いるのに、適切な天然のDNA遺
伝子を単離するにあたり、適当な遺伝子の両端部分、す
なわち遺伝子の断面の内側または最も近い部分に位置し
ている２つの制限酵素切断部位を同定することがより好
ましい。適切な遺伝子を含むDNA断片を次に適切な制限
エンドヌクレアーゼを用いて、ゲノム物質の残りから除
去する。切り出した後、セリンプロテアーゼ阻害剤タン
パクのＮ−及びＣ−末端にコードすることができ、また
そのDNA配列をそのオペレーシヨナルエレメントに融合
させることができるように、DNA配列の３′及び５′末
端は再構築される。 本発明において、使用のため考えられるベクターは、
優先されるか、もしくは、必要となるオペレーシヨナル
エレメントとともに、上の検討したようなDNA塩基配列
が挿入され、又そのベクターが、その後宿主微生物に移
され、その微生物中で複製出来るような、ベクターすべ
てを含む。より好ましいベクターは、その制限酵素切断
部位がよく報告されていて、DNA塩基配列の転写に、よ
り好まれるか、もしくは必要である、オペレーシナルエ
レメントを含んでいるようなベクターである。 ここで検討されるオペレーシヨナルエレメントには、
少なくとも１つのプロモーター、少くとも１つのオペレ
ーター、少くとも１つのリーダー配列、少くとも１つの
シヤイン−ダルガーノ配列、少くとも１つの停止コドン
及びベクターDNAの適切な転写とその次の翻訳に必要
か、より好ましい他のDNAはすべて含まれる。特に、こ
のようなベクターは、少くとも１つの選択可能なマーカ
ーとともに、宿主微生物によつて認識される複製の少く
とも１つの起点、及び合成DNAの塩基配列の転写を始め
ることが出来る少くとも１つのプロモーター塩基配列を
含んでいると予測されている。ベクターは、ある実施態
様においては、レギユレーターとして機能することがで
きるあるDNAを含み、レギユレータープロテインをコー
ドすることができる他のDNA塩基配列を含んでいること
が、さらに、より好ましい。これらのレギユレーター
は、１つの実施態様においては、ある環境条件の存在下
でDNA配列の発現を防ぐのに役立つ、他の環境条件では
転写と、続いて起る合成DNA塩基配列によつてコードさ
れたタンパクの発現が行なわれる。とりわけ、例えば、
イソプロピルチオー−ｄ−ガラクトシツドが存在しない
と、合成DNAの発現が起らないようなベクターのなかに
は調節断片が挿入されることがより好ましい。この状況
下では、合成DNAを含む形質転換した微生物は、プロテ
アーゼ阻害剤の発現がはじまる以前にある望ましい密度
まで育てられるかもしれない。この実施態様において
は、望ましいプロテアーゼ阻害剤の発現は、望ましい密
度が達された後にDNA塩基配列の発現を起すことができ
るある物質を微生物の環境に加えることにより誘導され
る。 それに加えて、ベクター中か、もしくは合成DNA配列
の５′末端に、適切な分泌リーダー配列が存在すること
がより望ましい。リーダー配列は、リーダー配列がプロ
テアーゼ阻害剤の発現を導くことができるヌクレオチド
配列のはじめの部分に、翻訳停止シグナルを間にはさま
ずに、すぐに隣りあつていることができるような位置に
ある。リーダー配列の存在は、一部には以下の理由のう
ち１つかそれ以上の理由から、望まれる。１）リーダー
阻害剤が存在すると、宿主が初期の生産物を成熟した組
み換えプロテアーゼ阻害剤に仕上げることを容易にする
かもしれない。２）リーダー配列の存在は、プロテアー
ゼ阻害剤を細胞質の外へ導くことにより、組み換えプロ
テアーゼ阻害剤の精製を容易にするかもしれない。３）
リーダー配列の存在は、組み換えプロテアーゼ阻害剤
が、プロテアーゼ阻害剤を細胞質の外へ導くことを通じ
てその活性構造へ組み込まれる能力に影響を与えるかも
しれない。 とりわけ、リーダー配列は、最初の産物をリーダーペ
プチダーゼによつて、リーダー配列を除去し、セリンプ
ロテアーゼ阻害活性の潜在力をもつより好ましいポリペ
プタイドを残すため、初期の翻訳産物の開裂を導く。宿
主微生物のある種においては、適切なリーダー配列の存
在によりEscherlichia coliの場合のように完成したタ
ンパクを細胞周辺腔に輸送できるようにする。ある酵母
や、BacilliやPseudomonasの場合には、適切なリーダー
配列は、タンパク細胞膜を通つて細胞外の培地への輸送
ができるようにする。この状況では、目的のタンパク
は、細胞外タンパクから精製できる。 ３番目に、本発明によつて調製されたプロテアーゼ阻
害剤の中のあるものの場合には、完成されたタンパクを
適切なエラスターゼ阻害剤活性をもつ活性性構造をとる
ように組み込まれる環境のなかに位置させることに、リ
ーダー配列の存在が必要である。 それ以上のオペレーシヨナルエレメントには、それば
かりではないが、リボゾーム結合部位と余所者タンパク
の微生物発現のために必要な他のDNA配列がふくまれ
る。本発明のより好ましい具体例においては、GAGGCGCA
AAAA（ATG）の配列がリボゾーム結合部位として用いら
れるであろう。この中で検討された、オペレーシヨナル
エレメントは、以前の文献や、ここに含まれている教訓
に照らしてバイオテクノロジーの普通の技能をもつた人
々によつて型通りに選ばれる。これらのオペレーシヨナ
ルエレメントの一般的例は、B.Lewin,Genes Wiley ＆ S
on,New York（1983）に出ており、これはこの中に参照
によつて特別に折り込まれている。この中で考察されて
いるようなベクターは、一部はプラスミツドpBR322そし
て／又はpIQの部分から組立てられる。 現在の発明のより好ましい実施態様において、プロテ
アーゼ阻害剤をコードする合成DNA配列のすぐ前に、さ
らにあらたなDNA配列が位置している。この追加のDNA配
列は、翻訳カツプラーとして機能することができる。即
ち、それはリボゾームをそれが隣り合つて並んでいるプ
ロテアーゼ阻害剤RNAのリボゾーム結合部位のすぐ隣り
にリボゾームを位置させるのに役立つRNAをコードして
いるDNAの配列である。本発明の１つの実施態様におい
て、翻訳カツプラーは、DNA配列TAACGAGGCGCAAAAAATGAA
AAAGACAGCTATCGCGATCGGAGTGTAAGAAATGを使用し、翻訳カ
ツプラーに関連したその道の普通のわざをもつた人々に
とつて現在知られている方法を使つて導き出すことがで
きる。２番目の好ましい翻訳カツプラーはTAACGAGGCGCA
AAAAATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCAAGGAGAAATAATG.のDNA配
列をもつている。 上に検討したベクターの、すべての必要なそして望ま
しい成分要素の合成と単離ができたところで、ベクター
はその道の普通の技能をもつ人々に一般に知られている
方法によつて組立てられる。このようなベクターの組立
ては、その道の普通の技能をもつた人々によつて遂行さ
れる義務的職務の範囲内にあると信じられており、そし
てそれ自体、特別むずかしい実験をしなくても遂行でき
る。例えば、参照として特別に本出願に加えたShonerら
Proceeding of the National Academy of Sciences U.
S.A.,81;5403−5407（1984）、において、明らかなされ
ているように、類似のDNA配列が適切なクローニングベ
クターにつなげられている。 本発明のクローニングベクターの構築において、合成
DNA配列の多重コピーとその付随のオペレーシヨナルエ
レメントが各ベクターに挿入されるかもしれないという
ことが、つけ加えて注目されるべきである。このような
実施態様においては、宿主生物は、望まれるプロテアー
ゼのベクターあたりのより大きな量を生産するであろ
う。ベクターの中に挿入され得るDNA配列の複数のコピ
ーの数は、結果としてできたベクターは、その大きさの
ため、適切な宿主微生物に移されたり、その中で複製し
たり転写されたりする能力によつてのみ制限を受ける。 さらにつけ加えて、ベクターが、薬剤抵抗性マーカー
や宿主微生物による特性の発現の原因となる他のマーカ
ーのような選択可能なマーカーを含んでいることがより
望ましい。本発明の特に望ましい実施態様において、テ
トラサイクリン抵抗性に体する遺伝子のクローニングベ
クターに優先的に含まれている。 このような薬剤抵抗性や他の選択可能なマーカーは、
部分的にトランスフオーマントの選択を容易にすること
を意図している。それに加えて、クローニングベクター
の上の、このような選択可能なマーカーの存在は、混入
した微生物が培地中で増殖するのを防ぐのに役立つかも
しれない。この実施態様において、この形質転換した宿
主微生物の純粋な培養は、生き残るのに誘導した表現型
を必要とする条件下で微生物を培養することによつて得
られるであろう。 このようにして得られたベクターは、次に適切な宿主
微生物に移される。外生のDNAを取り込んで、それらの
遺伝子や付随するオペレーシヨナルエレメントを発現す
る能力を持つた微生物はすべて選ばれてよいと信じられ
ている。宿主微生物は、通性嫌気性または好気性菌であ
ることがより望ましい。この方法における使用に好まし
い特別な宿主は、酵母と細菌である。特定の酵母は、Sa
ccharomyces層の酵母であり、特に、Saccharomyces cer
visiaeである。特別の細菌は、Bacillus層、Escherichi
a属及びPseudomonas属の細菌、特に、Bacillus subtili
s及びEscherichia Coliである。 宿主微生物が選ばれた後、ベクターはその道の普通の
技能をもつ人々によつて、一般的に知られている方法を
用いて宿主微生物に移される。このような方法の例は、
R.W.Davis et al.，“細菌の遺伝の進歩”、Cold Sprin
g Harbor Press,Cold Spring Harbor,New York（1980）
に見出される。これは、特別に参照としてこの中にとり
込まれている。上に述べたようなオペレーシヨナルエレ
メントの使用を通じて、温度調節が、遺伝子発現を調節
する手段として考えられるので、１つの実施態様におい
て形質転換が低温で起ることがより好ましい。もう１つ
の実施態様において、滲透のレギユレーターがベクター
に挿入されたならば、形質転換を通じての塩の濃度の調
節が、合成遺伝子の適切なコントロールを確保するため
に必要となるであろう。 組み換えセリンプロテアーゼ阻害剤が終局的に酵母中
で発現される場合を考えると、クローニングベクター
を、まずEscherichia coliに最初に移すことがより望ま
しい。E.Coliにおいて、ベクターに増殖を行なわせ、培
増してから取り出し精製する。ベクターは、次にセリン
プロテアーゼ阻害剤の究極的表現のために酵母の中に移
されるであろう。 宿主微生物は、セリンプロテアーゼ阻害剤の発現に対
して適切な条件下で培養される。これらの条件は、一般
に宿主微生物にとつて特異的であり、例えば、Bergey′
s Manual of Determinative Bacteriology,8th Ed.,Wil
liams ＆ Wilkins Company,Baltimore,Marylandのよう
な微生物のための生育条件に関する出版された文献に照
らして、この道の普通の技能をもつた人人によつて容易
に決められる。この文献は参照としてここに特別に組み
込まれている。 ベクターの中に挿入された、又は存在するオペレーシ
ヨナルエレメントすべてに応じて、DNA配列の表現の調
節に必要な条件は、すべて形質転換と培養の段階で効果
をもつであろう。１つの実施態様においては、細胞はDN
A配列の発現の阻害する適切な調節条件において、高密
度迄育てられる。最適の細胞密度に近づいたとき、環境
条件は、合成DNA配列の発現に対して適切な条件に変え
られる。このようにして、プロテアーゼ阻害剤の生産条
件は、宿主の細胞がほゞ最適密度に近づいたあとの時期
で起り、そして結果として生ずるプロテアーゼ阻害剤
は、その発現に必要な調節条件が誘起された後、しばら
くしてから収穫されると考えられる。 本発明のより望ましい実施態様において、組み換えプ
ロテアーゼ阻害剤は、収穫の後、そしてその活性構造を
とる以前に精製される。発明者は、リフオルデイング済
みのタンパクの高収率回収は、タンパクが先ず精製され
る場合に、容易に得られると信じているので、この実施
態様がより望ましい。しかし、１つのより好ましい代替
的実施態様においては、プロテアーゼ阻害剤は、その活
性構造をとるべく、リフオルデイングするのにまかせて
から精製することがある。さらにもう１つのより好まし
い代りの実施態様においては、プロテアーゼ阻害剤は、
培養液から回収するとき、リフオルデイングの済んだ活
性な状態で存在している。 ある条件では、プロテアーゼ阻害剤は、宿主微生物で
の発現、そしてそのタンパクの細胞壁を通過しての輸送
又は膜を通つて細胞周辺腔への輸送の際に、そのしかる
べき活性な構造をとつている。これは、一般的に適切な
リーダー配列をコードするDNAが、組み換えプロテイン
をコードするDNAにつながつていると起る。プロテアー
ゼ阻害剤が、その適切な活性構造をとらない場合は、形
成したどのジスルフイド結合も、そして／または、どの
生じた非共有結合的相互作用も、変性試薬や還元試薬、
例えば、グアニジウムクロライド、−メルカプトエタノ
ールによつて先ず破壊してから、プロテアーゼ阻害剤を
コントロールした条件においての希釈及びこれらの試薬
の酸化に続いてその活性構造がとれるようにする。 本発明の教示を特定の問題や環境に応用することは、
ここに含まれた知見に照らして、この道の普通の技能を
もつた人の能力の範囲内にあるということが理解される
べきである。本発明の生産物とそれらの単離、製造に対
する代表的工程が以下の例にみられる。 例 １ 上記のアミノ酸配列、Escherichia Coliの高度に発現
性の遺伝子におけるコドンの使用、及び便利なエンドヌ
クレアーゼの開裂部位に基いて、以下のDNA配列が提案
された。 タンパク質をE.coliのペリプラズムに輸送するのに適
した形で、プロテインの発現を調節するため、以下の調
節要素が提案された。即ち、高いレベルにおける転写の
開始のためのtacプロモーター；転写の制御のためのlac
オペレーター；プラスミドの他の場所でコードされるべ
きlacレプレツサー（lac Iq）；高いレベルで翻訳をは
じめるOmpAシヤイン−ダルガーノ配列；産物のペリプラ
ズムへの輸送を容易にするOmpAリーダー、これらのオペ
レーターエレメントによつてコードされるタンパクと最
初の産物の開裂を指示し、成熟した白血球エラスターゼ
阻害剤を生ずる上述の構造遺伝子によつてコードされる
タンパクとの間のAla−Ser連結のAlaである。これらの
特徴はすべて、以下のDNA配列のなかに組み込まれた。 タンパクがE.coliの細胞質内に止まるような形でタン
パクの発現を調節するために、以下のオペレーシヨナル
エレメントが提供される。即ち、tacプロモーター;lac
オペレーター、そしてlacリプレツサー（lac Iq）；シ
ヤイン−ダルガーノ配列のコンセンサス；そして翻訳の
高いレベルを開始するため、翻訳カツプラーとして用い
られるべきOmpAリーダーペプタイドの断片である。翻訳
カツプリング配列はOmpA遺伝子の翻訳の開始領域、OmpA
リーダーペプタイドの最初の８箇のアミノ酸は、上述の
シヤイン−ダルガーノ配列認識及び翻訳停止を行なう配
列をコードするDNAを含む。翻訳カツプリング配列はプ
ロモーターとセリンプロテアーゼ阻害剤遺伝子の翻訳開
始部位の間に、後者と重なつて挿入されるべきである。
これらの特徴のすべては、以下のDNA配列に組み込まれ
ている。A. 遺伝子断片の構築 上の配列を組み立てるため、次のデオキシリボヌクレ
オチドがABI DNAシンセサイザー（Foster City,Califo
rnia）を用いて合成される。合成産物は、ABI instrum
ent manual中に記述してあるように、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動によつて精製される。それらを、標準の
方法に従つてT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５′
をリン酸化した。 以下のグループのオリゴヌクレオチド配列がフラグメ
ント（断片）Aaを組み立てるために使用される。 オリゴヌクレオチドAa1は： GCTGT TGACA ATTAA TCAT. オリゴヌクレオチドAa2は CGGCT CGTAT AATGT GTGGA ATTGT GAGCG GATAA CAATT T. オリゴヌクレオチドAa3は CACAC ATAAC GAGGC GCAAA AA. オリゴヌクレオチドAa4は ATGAA AAAGA CAGCT ATCGC GATCG. オリゴヌクレオチドAa5は CAGTG GCACT GGCTG GTTTC GCTAC CGTAG CGCAG GCCAG CG
GTA AA. オリゴヌクレオチドAa6は GAGCC GATGA TTAAT TGTCA ACAGC TGCA. オリゴヌクレオチドAa7は TCCGC TCACA ATTCC ACACA TTATA C. オリゴヌクレオチドAa8は CCTCG TTATG TGTGA AATTG TTA. オリゴヌクレオチドAa9は GCCAC TGCGA TCGCG ATAGC TGTCT TTTTC ATTTT TTGCG. オリゴヌクレオチドAa10は AGCTT TTACC GCTGG CCTGC GCTAC GGTAG CGAAA CCAGC CA
GT. 以下のオリゴヌクレオチド配列が、組み立てられ、断
片Abが作られる。 ヌクレオチドAb1は GCTGT TGACA ATTAA TCAT. ヌクレオチドAb2は CGGCT CGTAT AATGT GTGGA ATTGT GAGCG GATAA CAATT T. ヌクレオチドAb3は CACAC ATAAC GAGGC GCAAA AA. ヌクレオチドAb4は ATGAA AAAGA CAGCT ATCGC GATCG. ヌクレオチドAb5は GAGTG TAAGA AATGA GCGGT AAA. ヌクレオチドAb6は GAGCC GATGA TTAAT TGTCA ACAGC TGCA. ヌクレオチドAb7は TCCGC TCACA ATTCC ACACA TTATA C. ヌクレオチドAb8は CCTCG TTATG TGTGA AATTG TTA. ヌクレオチドAb9は AGCTT TTACC GCTCA TTTCT TACAC TCCGA TCGCG ATAGC TG
TCT TTTTC ATTTT TTGCG. 以下は、断片Ｂを構築するために組立てられるオリゴ
ヌクレオチド配列である。 オリゴヌクレオチドB1は AGCTT CAAAG CTGGC GTATG CCCGC CGAAA AAATC CGCG. オリゴヌクレオチドB2は CAGTG TCTGC GGTAC AAAAA ACCGG AATGC CAG. オリゴヌクレオチドB3は TCCGA CTGGC AGTGC CCGGG TAAAA AACGT TGTTG C. オリゴヌクレオチドB4は CCGGA CACCT GCGGC ATCAA ATGCC TG. オリゴヌクレオチドB5は GATCC AGGCA TTTGA TGCCG CAGGT GTCCG GGCAA CAACG TT
TTT TACCC GGGCA. オリゴヌクレオチドB6は CTGCC AGTCG GACTG GCATT CCGGT TTTTT GTACC G. オリゴヌクレオチドB7は CAGAC ACTGC GCGGA TTTTT TCGGC GGGCA TACGC CAGCT TT
GA. 以下は断片Ｃを構築するために用いられるオリゴヌク
レオチド配列である。 オリゴヌクレオチドC1は GATCC GGTTG ATACC CCGAA CCCG. オリゴヌクレオチドC2は ACTCG TCGAA AA. オリゴヌクレオチドC3は CCGGG TAAAT GCCCG GTAAC CTATG GC. オリゴヌクレオチドC4は CAGTG TCTGA TGCTG AACCC GCCGA AC. オリゴヌクレオチドC5は TTCTG CGAAA TGGAC GGCCA GTGTA AACGA GAT. オリゴヌクレオチドC6は CTAGA TCTCG TTTAC ACTGG CCGTC CATTT CGCAG AAGTT. オリゴヌクレオチドC7は CGGCG GGTTC AGCAT CAGAC ACTGG CCATA GGTTA CCGGG C
A. オリゴヌクレオチドC8は TTTAC CCGGT TTTCG ACGAG TCGGG TT. オリゴヌクレオチドC9は CGGGG TATCA ACCG. 以下のグループのオリゴヌクレオチド配列が組立てら
れて断片Ｄが作られる。 オリゴヌクレオチドD1は GATCT GAAAT GCTGT ATGGG TATGT GCGGC. オリゴヌクレオチドD2は AAATC TTGTG TTTCC CCGGT AAAAG CATAA G. オリゴヌクレオチドD3は TCGAC TTATG CTTTT ACCGG GGAAA CACAA GATTT GCCGC A. オリゴヌクレオチドD4は CATAC CCATA CAGCA TTTCA. 以下のグループのオリゴヌクレオチドを混合し、標準
条件下でアニーリングを行ない、T4DNAリガーゼを用い
て標準条件下で互い同志及び適切な制限酵素エンドヌク
レアーゼで切つたクローニング及びケーシングベクター
M13mp18及び19につなげる。出来上つたものを、E.Coli
JM105を形質転換するのに用い、目的のDNAを含むクロ
ーンをIPTG−Xgalプレート中での白いプラークから選択
し、アリーリングの段階に用いられたグループから選ば
れた32Pでラベルしたオリゴヌクレオチドとハイブリド
を作ることにより、さらにスクリーニングを行なう。挿
入構造は、クローン化されたDNAのダイデオキシ塩基配
列決定法で確かめた。 グループAaは、Pst１とHind IIIで切つたM13mp18と19
につなげられるオリゴヌクレオチドAa1−Aa10を含む。
グループAbは、オリゴヌクレオチドAb1−Ab9を含み、そ
れらは、Pst１とHind IIIで切つたM13mp18と19につなげ
られる。オリゴヌクレオチドB1からB7を含むグループＢ
は、Hind IIIはBamH Iで切つたM13mp18及び19につなげ
られる。オリゴヌクレオチドC1からC9迄を含んでいるグ
ループＣは、BamH IとXba Iで切つたM13mp18と19につな
げられる。グループＤは、オリゴヌクレオチドD1からD4
を含むが、BamH IとSal Iで切つたM13mp18と19につなげ
られる。 M13複数型のDNAを、標準的手法によつて目的とする挿
入DNAを持つているクローンから回収する。グループAa
に相当する挿入DNAを適切な制限酵素エンドヌクレアー
ゼで、M13DNAから切り取る。ポリアクリルアミドゲル電
気泳動によつて精製する。その構造は以下の通りであ
る。 グループAbに相当する挿入DNAを、制限酵素エンドヌ
クレアーゼEcoR IとHind IIIでDNAを切断することによ
り切り、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製する。
その構造は、以下の如くである。 グループＢに相当する挿入DNAを制限酵素、エンドヌ
クレアーゼ、HinD IIIとBamH IでDNAを切断することに
より切断することによつて切り取り、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動で精製する。その構造は以下の通りであ
る。 グループＣに相当する挿入DNAをBamH IとBgl IIでDNA
を切断することにより切り取り、ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で精製する。その構造は以下の如くである。 グループＤに相当する挿入DNAを制限酵素Sau III Aと
Sal IでDNAを切断することにより切り取り、アクリルア
ミドゲル電気泳動で精製する。その構造は以下の通りで
ある。 B. 遺伝子の構造 外部への輸送のための組み立てには、グループAa、
Ｂ、Ｃ及びＤを標準条件下で、T4DNAリガーゼを用い
て、EcoR IとSal Iで切つたM13mp18と19につなげる。目
的の遺伝子を含むクローンはXgalプレート上の、それら
の色で選択され、そしてさらに32Pでラベルされたオリ
ゴヌクレオチドとハイブリドを形成することによつてス
クリーニングする。選択された構造のクローンは、ユニ
バーサルプライマーを用いてDNAの挿入区域をダイデオ
キシ塩基配列決定法により確認する。 細胞質での発現のための組み立てにおいては、グルー
プAb、Ｂ、Ｃ、及びＤからの挿入配列を合せて、標準条
件下でT4DNAリガーゼを用いて、EcoR IとSal Iで切つた
M13mp18と19につながる目的の遺伝子を含むクローンをX
galプレート上のそれらの色で選び、更に、32Pでラベル
した挿入配列とハイブリドを形成することによつてスク
リーニングを行なう。選ばれたクローンの構造をユニバ
ーサルプライマーを使つてDNAの挿入区域をダイデオキ
シ塩基配列決定法で検べることによつて確める。 例 ２ 上に述べたアミノ酸配列、Escherichia Coliの高度に
発現された遺伝子におけるコドンの使用と便利な制限酵
素エンドヌクレアーゼの切断位置の規定にもとづいて、
以下のDNA配列が提案された。 E.Coliのペリプラズムへの輸送のための適切な形でタ
ンパクの発現を調節するために、以下の調節要素が提案
される。即ち、高いレベルでの転写の開始のためのプラ
スミドpKK223−３上の１つのtacプロモーター、転写の
制御のためのプラスミドpKK223−３上のlacオペレータ
ー、E.Coliの染色体上にコードされるべきlacリプレツ
サー（lac I9）、高レベルで翻訳を開始するOmpAシヤイ
ン−ダルガーノ配列、生産物のペリプラズムに運び出す
ことを助長するOmpAリーダー、これらのオペレーターエ
レメントによつてコードされるタンパク配列の間のAla
−Ser接合のAla、そして、最初の生産物の、成熟した白
血球エラスターゼ阻害剤を生じるべき開裂を指示する上
述の遺伝子によつてコードされるタンパク配列である。
OmpAエレメントは、以下のDNA配列に組み込まれる。 GAATT CGATA TCTCG TTGGA GATAT TCAT GACGT ATTTT GGA
TG ATAAC GAGGC GCAAA AAATG AAAAA GACAG CTATC GCGAT
CGCAG TGGCA CTGGC TGGTT TCGCT ACCGT AGCGC AGGCC. 生成タンパクが、E.coli細胞質に留まる形でのタンパ
クの発現を調節するために、次のオペレーシヨナルエレ
メントが提案される。即ち、プラスミツドpKK223−３上
のtacプロモーター、プラスミツドpKK223−３のlacオペ
レーターとE.coli strain JM107の染色体上のlacレプ
レツサー（lac Iq）、コンセンサスシヤイン−ダルガー
ノ配列、及び高いレベルの翻訳を開始するため、翻訳カ
ツプラーとして用いられるべきOmpAリーダーペプチタイ
ドの断片である。翻訳カツプリング配列は、OmpA遺伝子
の翻訳開始領域、OmpAリーダーペプチタイドの最初の８
個のアミノ酸、上に記述したコンセンサスシヤイン−ダ
ルガーノ配列及び翻訳読み終り暗号である。翻訳カツプ
リング配列は、lacオペレーターとセリンプロテアーゼ
阻害剤の翻訳開始位置の間に、後者を重ねて挿入される
べきである。翻訳カツプラーの特徴は、以下のDNA配列
に組み込まれている。即ち、 C. 遺伝子フラグメントの構築 上述の配列を組み立てるため、以下のデオキシリボヌ
クレオチドをABI DNAシンセサイザー（Foster City Ca
lifornia）を使つて合成した生成物を、ABIインスツル
メンタルマニユアルに記述されているように、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動によつて精製する。それらは、
標準的手段によつてT4ポリヌクレオチドキナーゼとATP
を用いて５′をリン酸化する。 以下のオリゴヌクレオチド配列をフラグメントAaを組
み立てるために用いる。 オリゴヌクレオチドAa1は AATTCGATATCTCGTTGGAGATATTCATGACGTATTTTGGATGATAACGA
GGCGCAAAA. オリゴヌクレオチドAa2は ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCG. オリゴヌクレオチドAa3は GATCCGATCGCGATAGCTGTCTTTTTCATTTTTTGC. オリゴヌクレオチドAa4は GCCTCGTTATCATCCAAAATACGTCATGAATATCTCCAACGAGATATCG. オリゴヌクレオチドAa5は GATCCGATCGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCCTC
TGGTAAA. オリゴヌクレオチドAa6は AGCTTTTACCAGAGGCCTGCGCTACGGTAGCGAAAACCAGCCAGTGCCAC
TGCGATCG. 以下の、オリゴヌクレオチド配列を組立て、断片Abを
つくり上げる。 オリゴヌクレオチドAb1は AATTCGATATCTCGTTGGAGATATTCATGACGTATTTTGGATGATAACGA
GGCGCAAA. オリゴヌクレオチドAb2は ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCG. オリゴヌクレオチドAb3は GATCCGATCGCGATAGCTGTCTTTTTCATTTTTTGC. オリゴヌクレオチドAb4は GCCTCGTTATCATCCAAAATACGTCATGAATATCTCCAACGAGATATCG. オリゴヌクレオチドAb5は CAAGGAGAAATAAATGAGCGGTAAA. オリゴヌクレオチドAb6は AGCTTTTACCGCTCATTTATTTCTCCTTGAT. 以下は、断片Ｂを構築するために組み立てられるヌク
レオチド配列である。 オリゴヌクレオチドB1は AGCTT CAAAG CTGGC GTATG CCGC CGAAA AAATC CGCG. オリゴヌクレオチドB2は CAGTG TCTGC GGTAC AAAAA ACCGG AATGC CAG. オリゴヌクレオチドB3は TCCGA CTGGC AGTGC CCGGG TAAAA AACGT TGTTG C. オリゴヌクレオチドB4は CCGGA CACCT GCGGC ATCAA ATGCC TG. オリゴヌクレオチドB5は GATCC AGGCA TTTGA TGCCG CAGGT GTCCG GGCAA CAACG TT
TTT TACCC GGGCA. オリゴヌクレオチドB6は CTGCC AGTCG GACTG GCATT CCGGT TTTTT GTACC G. オリゴヌクレオチドB7は CAGAC ACTGC GCGGA TTTTT TCGGC GGGCA TACGC CAGCT TT
GA. 以下は断片Ｃを組み立てるために使用されるヌクレオ
チド配列である。 オリゴヌクレオチドC1は GATCC GGTTG ATACC CCGAA CCG. オリゴヌクレオチドC2は ACTCG TCGAA AA. オリゴヌクレオチドC3は CCGGG TAAAT GCCCG GTAAC CTATG GC. オリゴヌクレオチドC4は CAGTG TCTGA TGCTG AACCC GCCGA AC. オリゴヌクレオチドC5は TTCTG CGAAA TGGAC GGCCA GTGTA AACGA GAT. オリゴヌクレオチドC6は CTAGA TCTCG TTTAC ACTGG CCGTC CATTT CGCAG AAGTT. オリゴヌクレオチドC7は CGGCG GGTTC AGCAT CAGAC ACTGG CCATA GGTTA CCGGG C
A. オリゴヌクレオチドC8は TTTAC CCGGT TTTCG ACGAG TCGGG TT. オリゴヌクレオチドC9は CGGGG TATCA ACCG. 以下のグループのヌクレオチドが断片Ｄを形成するた
めに組立てられる。 オリゴヌクレオチドD1は GATCT GAAAT GCTGT ATGGG TAGT GCGGC. オリゴヌクレオチドD2は AAATC TTGTG TTTCC CCGGT AAAAG CATAA G. オリゴヌクレオチドD3は TCGAC TTATG CTTTT ACCGG GGAAA CACAA GATTT GCCGC A. オリゴヌクレオチドD4は CATAC CCATA CAGCA TTTCA. 以下のグループのオリゴヌクレオチドを混合し、標準
条件下でアニーリングを行ない、互い同志で、又、適当
な制限酵素エンドヌクレアーゼで切つたクローニング及
び配列形成ベクターM13mp18と19に、標準条件下でT4DNA
リガーゼを用いてつなげる。この生成物は、E.coli JM
105を形質転換するのに用い、目的のDNAを含むクローン
のアニーリングの段階で用いられたグループから選ばれ
た32Pでラベルしたオリゴヌクレオチドとハイブリツド
を形成することによつて選ぶ。挿入構造は、ユニバーサ
ルプライマーを用いて、クローン化したDNAのダイオキ
シ塩基配列決定法により確める。 オリゴヌクレオチドAa1−Aa4を、EcoR IとBamH Iで切
つたM13mp18及びM13mp19につなげる。目的の挿入DNAを
持つM13複製型DNAを標準的手法によつて回収する。挿入
DNAは、M13DNAを制限酵素エンドヌクレアーゼEcoR IとP
vu１で切断することによりM13DNAから切り出し、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動で精製する。その構造は以下
の通りである。 AATTCGATATCTCGTTGGAGATATTCATGACGTATTTTGGATGATAACGA
GGCGCAAAAAATGA GCTATAGAGCAACCTCTATAAGTACTGCATAAAACCTACTATTGCTCCGC
GTTTTTTACT AAAAGACAGCTATCGCGAT TTTTCTGTCGATAGCGC オリゴヌクレオチドAa5とAa6は、BamH IとHind IIIで
切つたM13mp18とM13mp19につなげる。目的とする挿入DN
AをもつたM13複製型DNAは、標準的手法によつて回収さ
れる。挿入DNAを制限酵素Pvu IとHind IIIでDNAを切断
することによりM13DNAから切り出し、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動で精製する。その構造は以下の如くであ
る。 CGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCCTCTGGTAAA TAGCGTCACCGTGACCGACCAAAGCGATGGCATCGCGTCCGGAGACCATT
TTCGA このPvu I−Hind III断片をオリゴヌクレオチドAa1−
Aa4から調製した断片と結合させ、EcoR IとHind IIIで
切つたM13mp18またはM13mp19とつなぐ。目的の挿入DNA
を持つM13複製型DNAを標準的手法で回収し、挿入DNA
を、これはDNA断面Aaであるが、制限酵素EcoR IとHind
IIIでM13DNAを切断することによりM13DNAから切り出
し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製する。その
構造は以下の如くである。 AATTCGATATCTCGTTGGAGATATTCATGACGTATTTTGGATGATAACGA
GGCGCAAAAAATGA GCTATAGAGCAACCTCTATAAGTACTGCATAAAACCTACTATTGCTCCGC
GTTTTTTACT AAAAGACAGCTATCGCGATCGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTA
GCGCAGGCCTCTGGTA TTTTCTGTCGATAGCGCTAGCGTCACCGTGACCGACCAAAGCGATGGCAT
CGCGTCCGGAGACCAT AA TTTCGA オリゴヌクレオチドAb1−Ab4をEcoR IとBamH Iで切つ
たM13mp18とM13mp19につなぐ。目的の挿入DNAを持つたM
13複製型DNAを標準的手法で回収する。挿入DNAを制限酵
素EcoR IとPvu IでM13DNAから切り取りポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で精製する。その構造は以下の如くで
ある。 AATTCGATATCTCGTTGGAGATATTCATGACGTATTTTGGATGATAACGA
GGCGCAAAAAATGA GCTATAGAGCAACCTCTATAAGTACTGCATAAAACCTACTATTGCTCCGC
GTTTTTTACT AAAAGACAGCTATCGCGAT TTTTCTGTCGATAGCGC このEcoR I−Pvu I断片をオリゴヌクレオチドAb5−Ab
6と合し、EcoR IとHind IIIで切つたM13mp18またはM13m
p19とつなぐ。目的の挿入DNAを持つたM13複製型DNAを、
標準的手法により回収する。断片Abである挿入DNAを、
制限酵素EcoR IとHind IIIでDNAを切断することによつ
てM13DNAから切出す。そして、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動により精製する。その構造は以下の如くであ
る。 AATTCGATATCTCGTTGGAGATATTCATGACGTATTTTGGATGATAACGA
GGCGCAAAAAATGA GCTATAGAGCAACCTCTATAAGTACTGCATAAAACCTACTATTGCTCCGC
GTTTTTTACT AAAAGACAGCTATCGCGATCAAGGAGAAATAAATGAGCGGTAAA TTTTCTGTCGATAGCGCTAGTTCCTCTTTACTCGCCATTTTCGA オリゴヌクレオチドB1からB7までを含むグループＢを
Hind IIIとBamH Iで切つたM13mp18と19につなぐ。グル
ープＢに相当する挿入DNAを制限酵素、エンドヌクレア
ーゼHind IIIとBamH IでDNAを切断することにより切出
し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によつて精製す
る。その構造は以下の通りである。 AGCTTCAAAGCTGGCGTATGCCCGCCG AGTTTCGACCGCATACGGGCGGC AAAAAATCCGCGCAGTGTCTGCGGTACAAA TTTTTTAGGCGCGTCACAGACGCCATGTTT AAACCGGAATGCCAGTCCGACTGGCAGTGC TTTGGCCTTACGGTCAGGCTGACCGTCACG CCGGGTAAAAAACGTTGTTGCCCGGACACC GGCCCATTTTTTGCAACAACGGGCCTGTGG TGCGGCATCAAATGCCTG ACGCCGTAGTTTACGGACCTAG オリゴヌクレオチドC1からC9を含むグループＣをBamH
IとXba Iで切つたM13mp18と19につなぐ。グループＣに
相当する挿入DNAを制限エンドヌクレアーゼBamH IとBgl
IIでDNAを切断することにより切り出し、ポリアクリル
アミドゲル電気泳動で精製する。その構造は以下の如く
である。 GATCCGGTTGATACCCCGAACCCGACT GCCAACTATGGGGCTTGGGCTGA CGTCGAAAACCGGGTAAATGCCCGGTA GCAGCTTTTGGCCCATTTACGGGCCAT ACCTATGGCCAGTGTCTGATGCTGAACCCG TGGATACCGGTCACAGACTACGACTTGGGC CCGAACTTCTGCGAAATGGACGGCCAGTGT GGCTTGAAGACGCTTTACCTGCCGGTCACA AAACGA TTTGCTCTAG オリゴヌクレオチドD1からD4までを含むグループＤを
BamH IとSal Iで切つたM13mp18と19につなぐ。グループ
Ｄに相当する挿入DNAを、制限酵素、エンドヌクレアー
ゼSal IでDNAを切断することにより切り出し、アクリル
アミドゲル電気泳動で精製する。その構造は以下の如く
である。 GATCTGAAATGCTGTATGGGTATG ACTTTOTCGACATACCCATAC TGCGGCAAATCTTGTGTTTCCCCG ACGCCGTTTAGAACACAAAGGGGC GTAAAAGCATAAG CATTTTCGTATTCAGCT D. 遺伝子の構築 外部への輸送のための組み立てにおいては、グループ
Aa,B,C及びＤからの挿入配列を合し、EcoR IとSal Iで
切つたM13mp18と19にT4DNAリガーゼを用いて、標準条件
下でつなぐ。細胞質中での発現のための組み立てにおい
ては、Ab,B,C及びＤからの挿入配列を合し、EcoR IとSa
l Iで切つたM13mp18及び19とT4DNAリガーゼを用いて、
標準状態でつなぐ。目的の遺伝子を含むクローンを、そ
れらのXgalプレート上での色で選び、さらに32Pにラベ
ルしたオリゴヌクレオチドとハイフリドを作ることによ
りスクリーニングを行なう。選んだクローンの構造を、
ユニバーサルプライマーを用いてDNAの挿入領域のダイ
デオキシ塩基配列決定法を行なうことにより確かめる。 例 ３ 発現ベクターの組み立て 外部への輸出用と細胞質内発現用の組み立てに対する
挿入配列を、次の如く発現プラスミドに移す。所用の挿
入DNAをもつたM13増殖型DNAを、上述の如く標準型手法
で回収する。適切な挿入DNAを制限酵素、エンドヌクレ
アーゼ、EcoR IとPst Iで切つて取り出し、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で精製する。次に、それを制限酵
素、エンドヌクレアーゼEcoR IとPst Iで切つたpKK223
−３につなぎ、その結果に生じたプラスミドをE.coli
JM107にクローニングする。外部輸送用の例４と５にお
ける使用のための構造は、PSGE6であり、原形質発現用
の例７における使用のための構造は、pSGE8である。例
4,5における外部への輸送に対するE.coliの株はSGE10で
あり、例６における細胞質発現に対する株は、SGE30で
ある。 A. pSGE6の編成 プラスミドpSGE6をpKK223−３のEcoR IとPst Iの位置
の間のDNAを、OmpASLPIをコードするDNAを含むEcoR I/P
st I断片で置きかえることによつて組立てた。OmpA−SL
PIのDNA配列は次の如くである。 これから後、“ompA−SLPI″と呼ぶ配列は、上に述べ
た外部への輸送のためのM13mp18の最終構造からのDNAで
ある。プラスミドpSGE6は、図１に描かれている。図１
において、ompAss−SLPIに対する最初のコドンは、“om
pA−SLPI″と呼ばれるDNA配列の62−64の位置にある。
成熟したSLPIに対する最初のコドンは、125−127に位置
している。Ptacは、tacプロモーター、lacオペレーター
及びベーターガラクトーゼShine/Dalgarno配列のための
DNAを含んでいる。略号、RI,Pst及びBamは、制限酵素、
EcoR I,Pst I及びBamH Iに対する認識配列である。Tetr
は、テトラサイクリンに耐性を附与するpBR322の遺伝子
の一部であり、amprは、アンピシリンに耐性を附与し位
置6416から6840までのrrnBオペロンからのDNAを、Tetr
は含んでいる。矢印は転写の方向を示している。 B. pCJ−ompA−SLPIの編成 プラスミドpCJ−ompA−SLPIは、部分的でなく完全な
テトラサイクリン遺伝子およびプロモーターを含んでい
ることを除いては、pSGE6と同じである。このプラスミ
ドは、E.coliに挿入すると、テトラサイクリン耐性を附
与し、omp ASLPIをコードするDNAを含むEcoR I/Pst I
断片が、ベクターpKK223−３ではなく、ベクターpCJ1に
クローニングされるということを除いて、pSGE6に対す
るのと類似のやり方で組立てられる。ベクターpCJ1は以
下の如く構築される。プラスミドpKK223−３をSph Iで
完全に、BamH Iで部分的に酵素分解した。4,4Kbp断片を
ゲルで精製し、合成アダプター GATCTAGAATTGTCATGTTTGACAGCTTATCAT ATCTTAACAGTACAAACTGTCGAATAGTAGC 及び、pBR322（PL Biochemicals,27−4891−01）のtet
r遺伝子のCla I Sph Iによる消化物からのDNAの539bp
の断片と組み合せた。 C. pSGE8の構造 EcoR IとPst部位の間のDNAが、上に述べたように、細
胞質における発現のための最終的なM13mp18構造物に由
来するompA−tc−met−SLPIと呼ばれる配列を含んでい
ることを例外として、プラスミドpSGE8は、pSGE6と同一
遺伝子組成である。この配列は、E.coliの細胞質の中に
メチオニル−SLPIの合成を導く。pSGE8の部分的図式
は、図２の中に含まれている。“ompA−tc−met−SLPI"
と呼ばれるその配列において、ompAに対する開始コドン
は、62−64の位置にあり、停止コドンは95−97にある。
そして、メチオニル−SLPIに対する開始コドンは、98−
100にある。ompA−tc−met−SLPIのDNA配列は次の如く
である。 D. pCJ−met−SLPIの編成 プラスミドpCJ−met−SLPIは、それが（部分的ではな
く）完全なテトラサイクリン耐性遺伝子を含んでいるこ
とを除けば、pSGE8と同じである。プラスミドCJ−met−
SLPIは、ompA−tc−met−SLPIをコードするEcoR I/Pst
I断片がベクターpKK223−３ではなく、ベクターpCJ1に
クローニングされたことを除けば、pSGE8と同様に組立
てられた。 E. 酵母発現用プラスミドの組立て プラスミドpUC8をHind IIIで酵素分解し、Hind III/S
ma Iアダプターにつげた（Amershan,Cat.No.DA1006から
得た）。このアダプターをHind IIIサイトに加えても、
Hind IIIサイトを再組み立てしない。DNAを次にSma Iで
酵素分解し、希薄溶液中でつなぎ、続いて、E.coli JM
83の形質転換を行なつた。正しいプラスミド、即ちHind
IIIの位置からSma Iの間のポリリンカーにおいて制限
酵素による切断の位置を欠いているプラスミツドが、ト
ランスフオーマントから単離したプラスミツドDNAを、E
coR I、Sma IもしくはHind IIIで消化することによつて
同定された。Hind III部位を欠いていたが、EcoR I部位
とSma I部位を含んでいたプラスミドを含んでいるトラ
ンスフオーマントがこの方法で同定された。このプラス
ミドがpGS185である。 酵母のMF1遺伝子を含有しているEcoR I断片を、この
中に特に参照文献として加えてある、J.Kurjan ＆ I.He
rskowitz in Cell30:933（1982）によつて記述されたよ
うに、プラスミドpCY17からゲル電気泳動で精製され、E
coR Iによつて切つたpGS185につなげた。プラスミドのD
NAをトランスフオーマントから単離した、正しい挿入DN
Aの存在は、EcoR IでDNAを消化することによつて確かめ
られた。これが、プラスミドpGS285であり、図３に描か
れている。 Kurjan ＆ Herskowitz、（同前）によつて認められた
ように、MF1遺伝子中の内部の４個のHind III部位の中
の３箇を除去するために、プラスミドpGS285をHind III
で完全に消化し、そして再びつなげた。正しい構成は、
上に述べたように選ばれた。これが、プラスミドpGS385
である。 例２において記述したように、合成SLPI遺伝子の４か
ら107迄のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列にな
つえいるM13AaBCDを、Hind IIIで消化した。このDNAを
以下のオリゴヌクレオチドアダプターにつなげた。 ５′GCT GAA GCT TCA GGT AAG CGA CTT CGA AGT CCA TTC TCGA. このアダプターは、２つのオリゴヌクレオチドのアニ
ーリングによつて形成し、５′GCT GAA GCT TCA GGT AA
G及び５′AGC TCT TAC CTG AAG CTT CAGC先づ２分間70
℃に保ち、続いて、一夜かかつて徐々に冷す。 このアダプターをHind IIIで切つたM13AaBCDにつなげ
た後、結合混合物は、Hind IIIとSal Iで消化して、ア
ガロースゲル電気泳動とエレエクトロリユーシヨンによ
つて精製した１つの断片を与えた。この断片を、もう一
度Hind IIIで消化し、それからHind IIIとSal Iで切つ
ておいたpGS385につないだ。E.coli HB101を結合混合
物で形質転換し、アンピシリン耐性トランスフオーマン
トを選んだ。正しい挿入DNAを持つたプラスミドを含む
トランスフオーマントを、プラスミドDNAを調整し、そ
れをHind IIIとSal Iで消化することにより同定した。
この方法で組み立て、単離したプラスミドをpGS485と命
名した。そして、これは図４に描かれている。このプラ
スミドは、構成成分としてMF1遺伝子の最初のスペーサ
ー領域におけるHind III切断部位において合成SLPI遺伝
子に融合したMF1遺伝子を含んでいる。このような構造
体は、酵母に入れた場合、特別に参照としてここに加え
た。A.J.BakeらPNAS（USA）81:4642によつて示されたよ
うに、異種タンパクの合成、プロセシング、分泌を導く
ことが示された。MF １遺伝子とSLPIの融合が、pGS485
中のEcoR I断片に含まれている。このEcoR I断片を実施
例８に記したように、ベクターYIp5の中へクローニング
した。 例 ４ プラスミドpSGE6を用いての分泌白血球プロテアーゼ
阻害剤（SLPI）の発現と精製。 プラスミドpSGE6（SGE10細胞）を含でいるE.coli細胞
を、２％トリプトン、0.5％酵母エキス、20g/グルコ
ース、200mg/ビタミンB1及び100mg/アンピシリンを
加えた10のM9培地中で、６時間培養した。IPTGを0.2m
M加え、更に６時間培養を続けた。E.coli SGE10の細胞
10を18,000×ｇで遠心してペレットにして8g/を得
て、50mMトリス−塩酸（pH7.5）4mM EDTA緩衝液（今後
T50E4と略称する）に再び懸濁してからペレツトにし
た。このペレツトを2.7のT50E4に再び懸濁し、150ml
のロツトずつ凍結した。これらのロツト８箇（細胞36g
に相当する）をまとめて12,000psi、４℃でフレンチプ
レスを１回通してペレツトをくずした。くずしたもの
を、20,000×ｇで1.5時間遠心分離した。細胞からなる
不溶物（6gの細胞に等しい）を含むペレツト1/6を125ml
のT50E4で２度洗い、残つた物質を一夜凍結した。 凍結ペレツトを、20mMのDTT（Sigma,Cat.No.D−0632
から入手）、4mMのPMSF（Sigma,Cat.No.P−7626）及び8
M尿素（超高純度、BRL、Cat.No.5505UA）を含む25mlの1
00mMトリス−塩酸（pH8.0）と4mMのEDTA（今後、T100E4
と略称する）で、37℃、１時間抽出し、10,000×ｇで10
分遠心した。得られた上澄みを、あらかじめ20mMのDTT
と8M尿素を含む抽出緩衝液T100E4で平衡処理（Pre−equ
ibrated）しておいた10mlの上澄みを除いたセフアデツ
クスsp−c25（Pharmaciaから入手）と混ぜ、ローラーの
上で37℃で10分混合し、SLPIをSP−セフアデツクスに吸
収させる。 吸収させたSLPIを含んだ樹脂を10分間3,000×ｇで遠
心してペレツトとし、上澄みをデカントした。残つたセ
フアデツクスを20mMのDTTと8M尿素を含む25mlのT100E4
で２回洗つてから20mMのDTTを含む、25mlのT100E4で２
回洗つた。次にセフアデツクスを１回、20mMのDTTと0.3
Mの食塩を含む25mlのT100E4で抽出した。この抽出物
は、約0.15mg/mlのタンパクと、0.04mg/ml以上のSLPIを
含んでいた。この方法で得たSLPIは、高圧液体クロマト
グラフイーにより70％以上の純度であることが確定され
た。 例 ５ 例４の方法を用いて、２番目の凍結ペレツトを最初の
T100E4/DTT/PMSF/尿素の代りに、１％Triton Ｘ−100
（Sigma,Cat.No.T−6878から入手）を含むT100E4で抽出
した。得られたSLPIは、例４で得られたものより僅かに
純度が高く、例６において述べるリフオルデイング・ア
ツセイにおいて、より高い活性があつた。 例 ６ 精製SLPIのリフオルデイング 例４または５からの約40μｇの部分的に精製したSLPI
を尿素中8M、もしくはグアニジン塩酸塩中5M（Pierce C
hemical Co.,＃24110）、そしてDTT中4mMとして、室温
で１時間温置した。酸化型グルタチオン（Sigma,Cat.N
o.G−4626）を13.5mMになる迄加え、混合物を再び室温
で１時間温置した。混合物をpH10.7の50mMトリス溶液で
10倍稀釈し、更に室温で４時間温置した。 それから、混合物をpH8.0の50mMトリスと0.15M食塩で
５倍に稀釈し、pH8.0の50mMトリスと、0.25M塩化ナトリ
ウムで前もつて平衡させた、セフアデツクスSP−C25の
１×2cmカラムにかけた。 樹脂を0.25Mの塩化ナトリウムを含むpH8.0の50mMトリ
スで洗い、それから0.5Mの塩化ナトリウムを含む、pH8.
0の50mMトリスで洗つた。0.5Mの塩の洗滌で溶出する区
分は、十分に活性であり、カラムにかけたSLPIの約30％
を呈している。 例 ７ SGE30細胞融解物の可溶区分不溶区分からのSLPIの精
製。 E.coli SGE30細胞中のプラスミドpSGE8の発現によ
り、細胞融解物の可溶及び不溶の両区分において、SLPI
を生産した。SLPIは全細胞タンパクの１％を占め、可溶
区に約80％、不溶区に約20％分布していた。 A. 不溶区からのSLPIの精製 pSGE8を含むE.coli SGE30細胞を、振盪フラスコで50
μg/mlアンピシリンを含むLB培地でOD600が0.7になる迄
培養し、IPTGを0.2mM迄加えて誘導した。３時間後に、
細胞をペレツトとし、その２倍の重量の50mMトリス−塩
酸（pH7.5）と4mMのEDTA（今後は、T50E4と称する）に
懸濁した。細胞を４℃で超音波をかけて破壊し、抽出物
を12,000×ｇで、40℃で20分間遠心分離した。 ペレツトを３倍容量のT50E4で洗い、10M尿素か6Mグア
ニジン塩酸塩のいずれか、及び5mMの還元型DTTを含む溶
液で、室温で溶解させた。室温で１時間温置した後酸化
型グルタチオンを17.5mMの濃度で加え、混合物をもう１
時間温置した。それから混合物をpH10.7の10倍容積量の
50mMトリス−塩酸で希釈した。希釈混合物を室温で４時
間放置後、5N塩酸を加えてpHを８に調節した。この混合
物を遠心分離して、沈殿したタンパクを除いた。 このようにしてできた上澄みは、分泌性白血球プロテ
アーゼ阻害剤活性を示すSLPIを含んでいた。このタンパ
クを上に述べたようなセフアデツクスSP−C25カラム上
のクロマトグラフイーで精製した。 B. 可溶区分からのSLPIの精製 プラスミドpSGE8を含むE.coli SGE30細胞を振盪フラ
スコ中でOD600が0.7になる迄培養し、IPTGを0.2mM迄加
えて誘導した。OD600が1.1で、細胞を25,000×ｇで15分
間遠心分離してペレツトとした。ペレツトをT50E4に再
び懸濁し、４℃で20,000psiでフレンチプレスによつて
くずした。くずしたものを25,000×ｇで15分間遠心分離
した。 上澄みをDTT中で25mMとし、この混合物を０℃で１時
間温置し最終濃度が５％になる迄十分量の塩酸を加え
た。０℃で30分間温置した後、混合物を25,000×ｇで15
分間遠心分離し、上澄みを除き次の工程にかけた。10M
の水酸化ナトリウムで上澄みのpHを8.0に調整し、SDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動、逆相HPLCクロマトグ
ラフイー及びエライサ（ELISA）法によつて精製及び分
析を行ない、その結果、全タンパク130UGあたり少くと
も0.7UGのSLPIが示された。それについて、例６に従つ
てリフオルデイングを行なつた。 例 ８ 癒合SLPI−MF1遺伝子（例3E参照）を含むEcoR I断片
を酵母ベクターYIp5のEcoR I部位に、この出願中に参照
文献として特別に加えてあるBotsteinとR.W.Davisによ
るThe Molecular Biology of the Yeast Saccharomyce
s,Cold Spring Harbor Laboratory pp.607−636（198
2）に記述されているようしてつなぎ、YIpSLPI−１を生
成させ、本出願に特別に参照文献として加えてある、T.
Orr−WeaverらMethods in Enzymology101:228（1983）
に記されてあるような位置志向的組み換えによつてS.ce
revisiae BS214（MAT,Ura3−52,pep 4 prbl）のURA３
遺伝子の中に組み込んだ。この株、S.cerevisiae SGY
−１は完全に活性なSLPIを培養上澄み中に分泌する。 ２番目の株、SGY−３も活性SLPIを生産し、分泌す
る。この株は複製性酵母プラスミツドpGS585上にMF1:
:SLPI癒合をもつている。このプラスミドは、本出
願に特別に参照文献として加えた、J.R.Broach,Methods
in Enzymology101:307（1983）によつて記述されたよ
うに、pJDB207から、また本出願中に特別に参照文献と
して加えたD.BotsteinとR.W.Davis,the Molecular Biol
ogy of the Yeast Saccharomyces,Cold Spring Harbor
Laboratory,pp.607−636に記述されたように、プラスミ
ツドY24から単離された酵母URA３遺伝子を添加すること
により構築され、そしてpJDB207のHind IIIの切断位置
にクローニングを行ない、pGS585を構築した。EcoR I断
片に含まれるMF1: :SLPI癒合遺伝子をEcoR I−Xho
Iアダプター（Amersham.Cat.No.DA1007から得た）を用
いて、pGS585のSal I切断位置にクローニングして、YEp
SLPI−１を生成した。特別にこの出願に参照文献として
加えたJ.Bacteriology153:163（1983）において、Itoら
によつて記述された、形質転換によつてこのプラスミド
をS.cerevisiae DBY746（MAT,Ura3−52,leu2−3,his3
1,trp1−289）に導入した。 Saccharomyces cerevisiae菌株SGY−１とSGY−３を、
特別に本出願中参照文献として取り入れた、Method in
Yeast Genetice p.62,Cold Spring Harbor Laboratorie
s,Cold Spring Harbor,New York（1981）に記述され
た、F.Shermanらの方法に従つて、Uracilの欠けているS
D培地で、30℃で定常期迄培養した。細胞を遠心分離に
よつて培地から除き、培養上澄みを（１）プロテアーゼ
阻害活性と、（２）エライサ法によつて、抗−SLPI抗体
と特異的に反応する物質の量を測定することによつて、
SLPIの活性について検定した。精製の体系は、本出願に
おいて記述された、以前の方法に類似のやり方で展開で
きる。 本発明と工程や生産物について、さまざまな改変を行
なつたり変化を与えたりすることができることは、この
道で技能をもつた人々にとつては明白である。したがつ
て、本発明は、附帯の請求範囲及びそれらの同等の範囲
内にあるならば、その修飾や改変を包含することを意図
するものである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 エイゼンバーグ，スチーブン ピー
アメリカ合衆国 80302 コロラド州,
ボウルダ−，パノラマ アベニユー
2325
(72)発明者 ステツトラー，ゲイリイ エル
アメリカ合衆国 80302 コロラド州,
ボウルダ−，パノラマ アベニユー
2325
(72)発明者 トムソン，ロバート シー
アメリカ合衆国 80302 コロラド州,
ボウルダ−，ドレクセル ストリート
1120
(56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．78，Ｎｏ．11
（1981） Ｐ．6826−6830
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．断片化されていない１本のポリペプチド鎖からなる
組換えセリンプロテアーゼインヒビターの製造方法であ
って、同インヒビターはセリンプロテアーゼインヒビタ
ー活性を有する少なくとも１つの活性部位を有し、そし
て同インヒビターは以下の（ｉ）または（ii）のポリペ
プチドよりなるセリンプロテアーゼインヒビターの製造
方法において、 （ｉ） Ser−Gly−Lys−Ser−Phe−Lys−Ala−Gly−Val−Cys−
Por−Por−Lys−Lys−Ser−Ala−Gln−Cys−Leu−Arg−
Tyr−Lys−Lys−Pro−Glu−Cys−Gln−Ser−Asp−Trp−
Gln−Cys−Pro−Gly−Lys−Lys−Arg−Cys−Cys−Pro−
Asp−Thr−Cys−Gly−Ile−Lys−Cys−Leu−Asp−Pro−
Val−Asp−Thr−Pro−Asn−Pro−Thr−Arg−Arg−Lys−
Pro−Gly−Lys−Cys−Pro−Val−Thr−Tyr−Gly−Gln−
Cys−Leu−Met−Leu−Asn−Pro−Pro−Asn−Phe−Cys−
Glu−Met−Asp−Gly−Gln−Cys−Lys−Arg−Asp−Leu−
Lys−Cys−Cys−Met−Gly−Met−Cys−Gly−Lys−Ser−
Cys−Val−Ser−Pro−Val−Lys−Ala, で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、 （ii）アミノ酸配列（ｉ）において１または２個以上の
アミノ酸が付加、挿入、欠失または置換されたアミノ酸
配列からなり、かつセリンプロテアーゼインヒビター活
性を有するポリペプチド、 （ａ） セリンプロテアーゼインヒビターの産生を指示
しうるDNA配列で形質転換した宿主細胞をDNA配列の発現
に適した条件下に培養し、そして （ｂ） このインヒビターを採取する ことからなる方法。 ２．アミノ酸配列 （式中、R1およびR7は同一または異り、置換または非置
換アミノ酸残基からなる群から選択され、そしてR2、
R3、R4、R5、R6、R8およびR9は同一または異り、Met、V
al、Ala、Phe、Tyr、Trp、Lys、Leu、GlyおよびArgから
なる群から選択される） を有するセリンプロテアーゼインヒビターを製造する請
求の範囲第１項の方法。 ３．インヒビターにセリンプロテアーゼインヒビター活
性を有する活性な三次構造をとらしめる工程をさらに包
含する請求の範囲第１項の方法。 ４．DNA配列が合成DNA配列である請求の範囲第１項の方
法。 ５．DNA配列が天然のDNA配列である請求の範囲第１項の
方法。 ６．さらにインヒビターの精製を包含する請求の範囲第
１項の方法。 ７．精製をインヒビターに活性形をとらしめる前に行う
請求の範囲第６項の方法。 ８．精製をインヒビターに活性形をとらしめた後に行う
請求の範囲第６項の方法。 ９．DNA配列がpBR322およびpIQからなる群から選択され
るベクターの部分からなるベクターに担持される請求の
範囲第１項の方法。 １０．宿主細胞がEscherichia,BacillusおよびSaccharo
myces属の微生物からなる群から選択される微生物であ
る請求の範囲第１項の方法。 １１．宿主微生物がEscherichia coliである請求の範囲
第10項の方法。 １２．宿主微生物がBacillus subtilisである請求の範
囲第10項の方法。 １３．宿主微生物がSaccharomyces cerevisiaeである請
求の範囲第10項の方法。 １４．天然のDNA配列が、 （ａ） 天然のセリンプロテアーゼインヒビターを発現
することができる細胞からヒトcDNAライブラリーを調製
し、 （ｂ） このインヒビターをコードするcDNAとハイブリ
ダイズすることができる少なくとも１つの核酸プローブ
でまたはこのcDNAライブラリーのクローンにより発現さ
れるプロテアーゼインヒビタータンパクに結合すること
ができる少なくとも１つのプローブでこのcDNAライブラ
リーをプローブし、 （ｃ） このインヒビターをコードするcDNAを含有する
少なくとも１つのクローンを同定し、そして場合によ
り、 （ｄ） このインヒビターをコードするcDNAをこのクロ
ーンから単離し、そして （ｅ） このcDNAまたはその断片を、宿主微生物におい
てcDNAを維持し、発現させるオペレーショナルエレメン
トに結合する 工程からなる方法により得られる 請求の範囲第５項の方法。 １５．細胞がヒト耳下腺細胞である請求の範囲第14項の
方法。 １６．天然のDNA配列が、 （ａ） ヒトゲノムDNAライブラリーを調製し、 （ｂ） このゲノムDNAライブラリーを、インヒビター
をコードするゲノムDNAとハイブリダイズすることがで
きる少なくとも１つの核酸プローブで、またはこのゲノ
ムDNAライブラリーのクローンにより発現されるプロテ
アーゼインヒビタータンパクに結合することができる少
なくとも１つのプローブでプローブし、 （ｃ） このインヒビターをコードするゲノムDNAを含
有する少なくとも１つのクローンを同定し、そして場合
により、 （ｄ） このインヒビターをコードするゲノムDNAをク
ローンから単離し、そして （ｅ） このゲノムDNA、またはその断片を、宿主微生
物においてDNAを維持し、発現するオペレーショナルエ
レメントに結合する工程からなる方法により得られる、
請求の範囲第５項の方法。 １７．（ａ） アミノ酸配列 R1−Gly−Lys−Ser−Phe−Lys−Ala−Gly−Val−Cys−P
ro−Pro−Lys−Lys−Ser−Ala−Gln−Cys−Leu−R2−Tr
y−Lys−Lys−Pro−Glu−Cys−Gln−Ser−Asp−Trp−Gl
n−Cys−Pro−Gly−Lys−Lys−Arg−Cys−Cys−Pro−As
p−Thr−Cys−Gly−Ile−Lys−Cys−Leu−Asp−Pro−Va
l−Asp−Thr−Pro−Asn−Pro−Thr−Arg−Arg−Lys−Pr
o−Gly−Lys−Cys−Pro−Val−Thr−Tyr−Gly−Gln−Cy
s−R8−R3−R9−Asn−Pro−Pro−Asn−Phe−Cys−Glu−
R4−Asp−Gly−Gln−Cys−Lys−Arg−Asp−Leu−Lys−C
ys−Cys−R5−Gly−R6−Cys−Gly−Lys−Ser−Cys−Val
−Ser−Pro−Val−Lys−R7, （但し、R1および７は同一または異り、置換または非置
換アミノ酸残基またはその誘導体からなる群から選択さ
れ、かつR2、R3、R4、R5、R6、R8およびR9は同一または
異り、メチオニン、バリン、アラニン、フェニルアラニ
ン、チロシン、トリプトファン、リジン、グリシン、ロ
イシンおよびアルギニンからなる群から選択される）か
らなるポリペプチドを製造するように宿主微生物に指示
することができるDNA配列、またはセリンプロテアーゼ
インヒビター活性を有する少なくとも１つの活性部位を
有するポリペプチドをコードする前記DNAの断片を調製
し、 （ｂ） このDNA配列を、宿主微生物内に転移、かつ複
製することができるベクターにクローン化し、そしてこ
のベクターはDNA配列のオペレーショナルエレメントを
含有し、 （ｃ） DNA配列およびオペレーショナルエレメントを
含有するベクターをセリンプロテアーゼインヒビターを
発現することができる宿主微生物内に転移し、 （ｄ） この宿主微生物をベクターの増幅およびインヒ
ビターの発現に適した条件で培養し、 （ｅ） インヒビターを採取し、そして （ｆ） インヒビターをセリンプロテアーゼインヒビタ
ー活性を有する活性三次構造をとるようにすることから
なる、断片化されていない１本のポリペプチド鎖からな
る組換えセリンプロテアーゼインヒビターを製造する、
請求の範囲第１項の方法。 １８．断片化されていない１本のポリペプチド鎖セリン
プロテアーゼインヒビターがアミノ酸配列 Ser−Gly−Lys−Ser−Phe−Lys−Ala−Gly−Val−Cys−
Pro−Pro−Lys−Lys−Ser−Ala−Gln−Cys−Leu−Arg−
Tyr−Lys−Lys−Pro−Glu−Cys−Gln−Ser−Asp−Trp−
Gln−Cys−Pro−Gly−Lys−Lys−Arg−Cys−Cys−Pro−
Asp−Thr−Cys−Gly−Ile−Lys−Cys−Leu−Asp−Pro−
Val−Asp−Thr−Pro−Asn−Pro−Thr−Arg−Arg−Lys−
Pro−Gly−Lys−Cys−Pro−Val−Thr−Tyr−Gly−Gln−
Cys−Leu−Met−Leu−Asn−Pro−Pro−Asn−Phe−Cys−
Glu−Met−Asp−Gly−Gln−Cys−Lys−Arg−Asp−Leu−
Lys−Cys−Cys−Met−Gly−Met−Cys−Gly−Lys−Ser−
Cys−Val−Ser−Pro−Val−Lys−Ala, またはその断片からなり、前記断片がセリンプロテアー
ゼインヒビター活性を有する少なくとも１つの活性部位
を有する請求の範囲第17項の方法。 １９．断片化されていない１本のポリペプチド鎖からな
るセリンプロテアーゼインヒビターであって、同インヒ
ビターはセリンプロテアーゼインヒビター活性を有する
少なくとも１つの活性部位を有し、そして同インヒビタ
ーは以下のアミノ酸配列において１個または２個以上の
アミノ酸が付加、挿入、欠失または置換されたアミノ酸
配列からなり、かつセリンプロテアーゼインヒビター活
性を有するポリペプチドよりなるセリンプロテアーゼイ
ンヒビター、 Ser−Gly−Lys−Ser−Phe−Lys−Ala−Gly−Val−Cys−
Pro−Pro−Lys−Lys−Ser−Ala−Gln−Cys−Leu−Arg−
Tyr−Lys−Lys−Pro−Glu−Cys−Gln−Ser−Asp−Trp−
Gln−Cys−Pro−Gly−Lys−Lys−Arg−Cys−Cys−Pro−
Asp−Thr−Cys−Gly−Ile−Lys−Cys−Leu−Asp−Pro−
Val−Asp−Thr−Pro−Asn−Pro−Thr−Arg−Arg−Lys−
Pro−Gly−Lys−Cys−Pro−Val−Thr−Tyr−Gly−Gln−
Cys−Leu−Met−Leu−Asn−Pro−Pro−Asn−Phe−Cys−
Glu−Met−Asp−Gly−Gln−Cys−Lys−Arg−Asp−Leu−
Lys−Cys−Cys−Met−Gly−Met−Cys−Gly−Lys−Ser−
Cys−Val−Ser−Pro−Val−Lys−Ala。 ２０．アミノ酸配列 （式中、R1およびR7は同一または異り、置換または非置
換アミノ酸残基からなる群から選択され、そしてR2、
R3、R4、R5、R6、R8およびR9は同一または異り、Met、V
al、Ala、Phe、Tyr、Trp、Lys、Leu、GlyおよびArgから
なる群から選択され、但し、R1がSer、R2がArg、R3〜R6
がMet、R7がAla、そしてR8−R9がLeuである場合を除
く） を有するポリペプチドよりなる請求の範囲第19項のイン
ヒビター。 ２１．R2およびR3がメチオニンである請求の範囲第20項
のインヒビター。 ２２．R2およびR3がアルギニンである請求の範囲第20項
のインヒビター。 ２３．R2がアルギニンであり、R3がメチオニンである請
求の範囲第20項のインヒビター。 ２４．R2、R3、R4、R5およびR6がメチオニンであり、そ
してR8およびR9がロイシンである請求の範囲第20項のイ
ンヒビター。 ２５．R2、R3、R4、R5、R8またはR9の一つまたは二つ以
上がバリンであり、酸化的不活性化に対して改良された
抵抗性を有する請求の範囲第20項のインヒビター。 ２６．R2、R3、R4、R5、R6、R8またはR9の一つまたは二
つ以上がアラニンであり、膵エラスターゼを阻害する改
良された能力を有する請求の範囲第20項のインヒビタ
ー。 ２７．R2、R3、R4、R5、R6、R8またはR9の一つまたは二
つ以上がフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトフ
ァンからなる群から選択され、カテプシンＧを阻害する
改良された能力を有する請求の範囲第20項のインヒビタ
ー。 ２８．R2、R3、R4、R5、R6、R8またはR9の一つまたは二
つ以上がリジンまたはアルギニンからなる群から選択さ
れ、トリプシンを阻害する改良された能力を有する請求
の範囲第20項のインヒビター。 ２９．セリンプロテアーゼインヒビター活性が白血球エ
ラスターゼ阻害活性、カテプシンＧ阻害活性、トリプシ
ン阻害活性、膵エラスターゼ阻害活性およびキモトリプ
シン阻害活性からなる群の少なくとも一つから選択され
る請求の範囲第19項のインヒビター。 ３０．セリンプロテアーゼインヒビター活性が白血球エ
ラスターゼ阻害活性である請求の範囲第29項のインヒビ
ター。 ３１．セリンプロテアーゼインヒビターが少なくとも二
つのセリンプロテアーゼのプロテアーゼ活性を阻害する
請求の範囲第29項のインヒビター。 ３２．セリンプロテアーゼインヒビターがトリプシンお
よび白血球エラスターゼのプロテアーゼ活性を阻害する
請求の範囲第19項のインヒビター。 ３３．約60のアミノ酸残基からなり、少なくとも８のシ
ステイン残基を含み、そしてキモトリプシンおよび（ま
たは）白血球エラスターゼを阻害するが、トリプシンを
有意に阻害することはない請求の範囲第19項のインヒビ
ター。 ３４．以下のアミノ酸配列を有する請求の範囲第33項の
インヒビター： （式中、R7は置換または非置換アミノ酸残基からなる群
から選択され、そしてR3、R4、R5、R6、R8およびR9は同
一または異り、Met、Val、Ala、Phe、Tyr、Trp、Lys、L
eu、GlyおよびArgからなる群から選択される）。 ３５．以下のアミノ酸配列を有する請求の範囲第34項の
インヒビター。 ３６．天然のセリンプロテアーゼインヒビターに比べて
１個または２個以上のアミノ酸置換を有し、該置換は１
個または２個以上のアミノ酸１、17−29、70−83、94、
96または107で生じ、そして天然のセリンプロテアーゼ
インヒビターに比べて変化したプロテアーゼ阻害活性を
示す請求の範囲第19項のインヒビター。 ３７．アミノ酸残基20としてグリシンを有し、白血球エ
ラスターゼを阻害するが、トリプシンを阻害しない請求
の範囲第36項のインヒビター。 ３８．アミノ酸残基72、73および74の少なくとも一つと
してグリシンを有し、トリプシンを阻害するが、白血球
エラスターゼを阻害しない請求の範囲第36項のインヒビ
ター。 ３９．さらにセリンプロテアーゼインヒビターのＣ末端
またはＮ末端に縮合したポリペプチドからなり、この縮
合ポリペプチドがセリンプロテアーゼインヒビターの高
められた薬理効果を示す請求の範囲第19項〜第38項のい
ずれか一つのインヒビター。 ４０．活性成分として、断片化されていない１本のポリ
ペプチド鎖からなるセリンプロテアーゼインヒビターで
あって、同インヒビターはセリンプロテアーゼインヒビ
ター活性を有する少なくとも１つの活性部位を有し、そ
して同インヒビターは以下のアミノ酸配列において１個
または２個以上のアミノ酸が付加、挿入、欠失または置
換されたアミノ酸配列からなり、かつセリンプロテアー
ゼインヒビター活性を有するポリペプチドよりなるセリ
ンプロテアーゼインヒビター、 Ser−Gly−Lys−Ser−Phe−Lys−Ala−Gly−Val−Cys−
Pro−Pro−Lys−Lys−Ser−Ala−Gln−Cys−Leu−Arg−
Tyr−Lys−Lys−Pro−Glu−Cys−Gln−Ser−Asp−Trp−
Gln−Cys−Pro−Gly−Lys−Lys−Arg−Cys−Cys−Pro−
Asp−Thr−Cys−Gly−Ile−Lys−Cys−Leu−Asp−Pro−
Val−Asp−Thr−Pro−Asn−Pro−Thr−Arg−Arg−Lys−
Pro−Gly−Lys−Cys−Pro−Val−Thr−Tyr−Gly−Gln−
Cys−Leu−Met−Leu−Asn−Pro−Pro−Asn−Phe−Cys−
Glu−Met−Asp−Gly−Gln−Cys−Lys−Arg−Asp−Leu−
Lys−Cys−Cys−Met−Gly−Met−Cys−Gly−Lys−Ser−
Cys−Val−Ser−Pro−Val−Lys−Ala。 を含有する医薬組成物。 ４１．セリンプロテアーゼインヒビターがアミノ酸配列 （式中、R1およびR7は同一または異り、置換または非置
換アミノ酸残基からなる群から選択され、そしてR2、
R3、R4、R5、R6、R8およびR9は同一または異り、Met、V
al、Ala、Phe、Tyr、Trp、Lys、Leu、GlyおよびArgから
なる群から選択され、但し、R1がSer、R2がArg、R3〜R6
がMet、R7がAla、そしてR8−R9がLeuである場合を除
く） を有するポリペプチドよりなる請求の範囲第40項の医薬
組成物。 ４２．経口投与、非経口投与、局所投与およびエーロゾ
ル投与からなる群から選択される経路による投与に適し
た形態の請求の範囲第40項の組成物。 ４３．呼吸疾患の改善のための請求の範囲第40項の組成
物。 ４４．気道障害の改善のための請求の範囲第40項の組成
物。 ４５．エーロゾル投与に適当な請求の範囲第42項または
43項のいずれか一つの組成物。 ４６．炎症の改善のための請求の範囲第40項の組成物。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US67882284A | 1984-12-06 | 1984-12-06 | |
| US678822 | 1984-12-06 | ||
| US803471 | 1985-12-02 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6057872A Division JP2683500B2 (ja) | 1984-12-06 | 1994-03-28 | セリンプロテアーゼインヒビターの産生のための遺伝子組み換え法と、同じ目的に有用なｄｎａ塩基配列 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62501262A JPS62501262A (ja) | 1987-05-21 |
| JP2672088B2 true JP2672088B2 (ja) | 1997-11-05 |
Family
ID=24724427
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61500018A Expired - Lifetime JP2672088B2 (ja) | 1984-12-06 | 1985-12-04 | セリンプロテアーゼ阻害剤の生産のための遺伝子組み換え法と、同じ目的に有用なｄｎａ塩基配列 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2672088B2 (ja) |
| KR (1) | KR940011339B1 (ja) |
| ES (1) | ES8700691A1 (ja) |
| ZA (1) | ZA859363B (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1340877C (en) * | 1987-12-28 | 2000-01-18 | Takashi Sugiyama | Elastase inhibitory polypeptide and process for production thereof by recombinant gene technology |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5318398A (en) * | 1976-08-03 | 1978-02-20 | Sumitomo Bakelite Co | Liquid crystal display unit |
| JPS5848698U (ja) * | 1981-09-24 | 1983-04-01 | 津田 勝一 | 高所作業用バスケツト |
-
1985
- 1985-12-04 JP JP61500018A patent/JP2672088B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-04 KR KR1019860700537A patent/KR940011339B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1985-12-05 ES ES549630A patent/ES8700691A1/es not_active Expired
- 1985-12-06 ZA ZA859363A patent/ZA859363B/xx unknown
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７８，Ｎｏ．１１ （１９８１） Ｐ．６８２６−６８３０ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62501262A (ja) | 1987-05-21 |
| ZA859363B (en) | 1987-04-29 |
| KR940011339B1 (ko) | 1994-12-05 |
| ES8700691A1 (es) | 1986-10-16 |
| KR870700093A (ko) | 1987-02-28 |
| ES549630A0 (es) | 1986-10-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2683500B2 (ja) | セリンプロテアーゼインヒビターの産生のための遺伝子組み換え法と、同じ目的に有用なｄｎａ塩基配列 | |
| AU614933B2 (en) | Functional DNA block and plasmid coding for hirudin, transformed yeast, method for preparing hirudin, hirudin obtained and its pharmaceutical use | |
| JP2004518444A (ja) | 重要なタンパク質の細菌培養上清中への分泌のための融合タンパク質 | |
| FI104724B (fi) | Menetelmä aprotiniinivarianttien valmistamiseksi | |
| WO2007112677A1 (fr) | Procédé de préparation d'hormone parathyroïdienne humaine 1-34 | |
| US5218093A (en) | EGF variants and pharmaceutical use thereof | |
| US6342374B1 (en) | Human collagenase inhibitor, recombinant vector system for using same and recombinant-DNA method for the manufacture of same | |
| JPH02501027A (ja) | 組換えｄｎａ法により生産されるヒト膵臓分泌トリプシンインヒビターおよびその生産方法 | |
| JP2862870B2 (ja) | 新規ペプチド | |
| JP2672088B2 (ja) | セリンプロテアーゼ阻害剤の生産のための遺伝子組み換え法と、同じ目的に有用なｄｎａ塩基配列 | |
| US6291662B1 (en) | Recombinant methods for production of serine protease inhibitors and DNA sequences | |
| US5871956A (en) | Recombinant methods for production of serine inhibitors and DNA sequences useful for same | |
| US5231010A (en) | Recombinant aprotinin variants genetically engineered process for the microbial preparation of homogeneously processed aprotinin variants and the therapeutic use thereof | |
| US6132990A (en) | Recombinant methods for production of serine protease inhibitors and DNA sequences useful for same | |
| JP2683500C (ja) | ||
| JP2798573B2 (ja) | ヒト好中球エラスターゼ阻害活性を有する天然型ポリペプチドおよびそれを含有する医薬製剤 | |
| CN101851626A (zh) | 绒山羊4E-BP1基因cDNA编码区核苷酸序列 | |
| JPH06253838A (ja) | ヒト・膵臓エラスターゼｉｉｉｂ | |
| TW200411053A (en) | Nucleic acid encoding recombinant salmon calcitionin, expression vector thereof, and method for producing recombinant salmon calcitonin therewith | |
| JPH0286777A (ja) | サル膵臓エラスターゼｉ | |
| JPH04112791A (ja) | トリプスタチン構造遺伝子及びその用途 | |
| JPH06102023B2 (ja) | ブタ・膵臓エラスタ−ゼ−２ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |