JPS62501262A - セリンプロテア−ゼ阻害剤の生産のための遺伝子組み換え法と、同じ目的に有用なｄｎａ塩基配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 セリンプロテアーゼ阻害剤の生産のための逍伝子組み換え法と、同じ目的に有用 なりＮＡ塩基配列この出願は１９８４年１２月６日に出願されたＵ、Ｓ。

特許出願連続番号Ｎｏ、６７８，８２２の一部継続出願で内生タンパク分解酵素 は、侵入する生物体、抗原−抗体複合体と、生体に最早必要乃至は有用でないあ る特定の組織タンパクを分解するのに役立つ。正常に閤能している生物体では、 タンパク分解酵素は、限られた暑だけ生産され、一部はプロテアーゼの阻害剤の 合成を通じて制御されている。

多数の天然に存在するプロテアーゼ阻害剤は、その反応を場所的に及び時間的に イリ御することによって、内生プロテアーゼを制御している。その上、プロテア ーゼ阻害剤は、感染及び寄生生物によって身体の中に持ら込まれたプロテアーゼ を阻害することがある。特別にタンパクの加水分解の攻撃や感染を受け易い旧り 例えば、呼吸路の組織はプロテアーゼ阻害剤に富んでいる。

プロテアーゼ阻害剤は、と１へ血漿タンパクの約１０％を構成している。少くと も８種の阻害剤がこの材料源から単離され、文献中にその特性が記載されている 。これらの中には、α２−マクログロブリン（α２Ｍ）、α１−プロテアーゼ阻 害剤（α１ＰＩ）、α１−アンチキモトリプシン（α、Ａｃｈｙ）、β、−アン チコラゲナーゼ（β１ＡＣ）、及び、インター−α−トリプシン阻害剤（ＩαＩ ）がある。

プロテアーゼ／プロテアーゼ阻害剤のバランスの撹乱は、気腫、関節炎、糸球体 腎炎、歯周炎、筋ジストロフィー、Ｉｔｅｍの浸入及びさまざまな他の病理的状 態を包含するプロテアーゼを媒介とする組織の破壊へと導く。ある状況、例えば 、敗血症とか急性白血病のようなきびしい病理学的進行の場合には、存在する遊 離のタンパク分ｗＩ酵素の岱は、分泌細胞からの酵素の放出により増加する。そ れに加えて、他の状況下では、これとは別に生体の制御的な阻害剤の容ａが減少 するため、プロテアーゼ／プロテアーゼ阻害剤−バランスの変化が起きることも ある。このよえな制御的な阻害剤の容おが減少する例は、α１−プロテアーゼ阻 害剤の欠損であり、肺気腫の発生と大きく関わり合っている。

生体にこのように常規を逸脱した状態が存在すると、タンパク分解酵素を制御す るための方策を講じなければ、生体への深刻な傷害が起り１ｑる。したがって、 生体に投与すれば、タンパク分解酵素を制御することが出来るプロテアーゼ阻害 剤が探しめられてきた。

白血球エラスターゼは、病理学的見地からことのほか興味深いセリンプロテアー ゼの１つの例である。白血球エラスターゼは、細胞外に放出されると、結合Ｋｉ Ｆ３やその他のＩＡ田なタンパクを分解する。正常に典能している生体にとって 、ある一定日の結合組織や他のタンパクを分解することは必要であるが、過剰の 白血球エラス、ターゼの存在は、気腫やリューマチ様１３Ｑｍ炎のような様々な 病理的状態と関連づけられている。白血球エラスターゼが正常よりも大工に存在 する場合、その効果に対抗するため、白血球エラスタービ活性を阻害するプロテ アーゼ阻害剤が探しめられてきた。精製した形で薬剤として役立つに足るａを、 組み換えＤＮＡ法によって生産できるとしたら、このようなプロテアーゼ阻害剤 は特別に有用であろう。

文献によると、過去において、少くとも２日の白血球エラスターゼ阻害剤が同定 されている。“ヒト多形核白血球の中性プロテアーゼ”　（１ｌａｖｅｉａｎｎ ら（編）　ＵｒｂａｎとＳｃｈｗａｒｚｅｎｂｅｒｇ、　Ｉｎｃ、（１９７８） 　）中の“ヒト粘液性分泌物中の顆粒球中性プロテアーゼの酸に安定な阻害剤： 生化学と可能な生物学的機能”において、５ｃｈｉｅｉｓｌｅｒらが記述した１ つのタンパクがヒトの精液のプラズマ及び痰から単離され、Ｎ末端アミノ酸とし てチロシンを持つ、大きさが１１ｋｄａのタンパクとして性格づけられた。この タンパクの文献報告からは、部分的なアミノ酸配列しか提供されていないが、部 分的な配列からさえも、このタンパクは本発明のタンパク類とは実質的に異なっ ていることがわかる。このタンパクのアミノ酸配列の報告と、本発明のタンパク のアミノ酸配列データーから考えると、５ｃｈｉｅｓｓｌｅｒらによって配列が 決定されたものは、元来−末鎖のポリペブタイドではないタンパクの分解物であ ったかもしれないということが発明者らに示唆される。

１例において、ヒトの血漿から単離された２番目のタンハクハ、（Ｚ　１−　ｐ ｒｏｔ１３ａｓｅ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒと名付けられた。

このタンパクに関する業績は、Ｔｒａｖｉｓとｓａ＋ｖｅｓｅｎによって総説、 　Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　８ｉｏｃｈｅｉｉｓｔｒｙ　、巨−２： ６５５−７０９　（１９８３）にまとめられている。このタンパクのアミノ酸配 列のレポートは、それも本発明のタンパクから実質的に異なっていることを示し ている。

本発明の一重鎖ポリペブタイドのタンパク類が以前の技術による一末鎖ポリペプ タイドのセリンプロテアーゼ阻害剤のいずれとも著しく異なっているから、以前 に研究された、−末鎖ポリペブタイドのセリンプロテアーゼ阻害剤類は本発明の タンパク類とは“実質的に相同”ではない。

トリプシンは、病理学的見地から特別興味のあるもう１つのタンパクである。ト リプシンは、脛臓炎の、ような任々の急性症状のなかで、膵臓のような特定の軟 かい器官の組織の分解を始めることが知られている。これらの症状の治療を目的 として、トリプシンの作用を阻害するだろうと期待されたタンパク類の使用によ る秤々の努力がなされたが、目覚しい成功は得られなかった。このような努力の 実例は、ヒトの肝臓炎の治療に牛の外生トリプシン阻害剤を用いる試みである。

このような技術は、ヨーロッパで試みられたが、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）に よって効果があると認められなかった。したがって、種々の急性または慢性症状 中の、過剰のトリプシンを中和する効果のあるプロテアーゼ阻害剤が必要である 。上に論−１した白血球エラスターゼ阻害剤の場合にそうであったように、トリ プシン阻害剤は、もし、組み換えＤＮＡ法によって精製した形で、薬剤として役 立てるに足る母だけ単！ｆｉ製造できれば、ことのほか有用であろう。

カテプシンＧは、白血球に大作に存在するもう１つのプロテアーゼである。カテ プシンＧは、補足的経路のタンパクをはじめとする種々の価値のあるタンパクを 、１ｎＶｉｔｒＯで分解できることが知られている。膵臓のエラスターゼが、肝 臓炎で役割を果している可能性のあるもう１つのプロテアーゼである。したがっ て、これらのプロテアーゼに対する阻害剤も薬剤としての潜在的価値がある。

白血球エラスターゼ、トリプシン、カテプシンＧと膵臓のエラスターゼは、セリ ンプロテアーゼとして知られている一群のプロテアーゼの例であり、共通の構造 と作用機作の要素を持っている。それらの異なる基質に対する活性や、異なる阻 害剤への活性は、２．３のアミノ酸残基だけが異なっていることから生ずると信 じられている。類推によれば、やはり構造と作用機作の共通の要素を持っていて 、比較的少ないアミノ酸の変化が、異なったプロテアーゼの阻害を結果として生 ずるセリンプロテアーゼ阻害剤を想像することが可能であり、しかも、少くとも この群の１員は、前述の群中のセリンプロテアーゼのすべてを阻害するであろう 。そうであるとすれば、この群のセリンプロテアーゼ阻害剤は、大きな価値゛が あるであろう。

毘くべきことに、本発明者達は、このようなセリンプロテアーゼ阻害剤の合成を 尋き行なうことができるＤＮＡ配列を発見し、その阻害剤は、耳下腺分泌物から １１１ｍされたものと生物学的に等価である。組み換えＤＮＡ法によって作られ 、本特許に提出される本発明のプロテアーゼ阻害剤は、少くとも２箇所の活性部 位を持っている。すなわち、白血球エラスターゼ阻害の作置を示す１つの部位と 、トリプシンに対して阻害活性を示す２番目の部位である。

現在の発明によって生産された組み換え阻害剤は、熱Ａ５酸による変性に箸しく 抵抗性があり、また様々なタンパク分解酵素によるタンパク分解作用に対しても 抵抗性があると考えられる。この出願に用いられるように“組み換え阻害剤”は 、組み換えＤＮＡの方法論と技術によって生産されるプロテアーゼ阻害剤のこと を指すよう意図されている。さらに、本発明の組み換え阻害剤の活性形は、哺乳 動物の身体の細胞外の部位で普通に出会うような条件下では、熱力学的に安定で ある。組み換えプロテアーゼ阻害剤の変成した形はまた、ジスルフィド結合を形 成する能力も持っており、生化学的刺戟の存在しない状態で活性三次構造をとる のに必要な非共有結合的相互作用を成立させる能力がある。

より十分に、ここに以下に提示する本発明のＤＮＡ塩基配列は、発表されている 他の白血球エラスターゼ阻害剤のアミノ酸配列とは大きく異なっているところの タンパクの合成を導き行なう能力がある。したがって、本発明のＯＮＡ温基配列 の同定によって、本出願の中で明らかにされる。新規の組み換えプロテアーゼ阻 害剤の製造に関する組換えＤＮＡ法の本発明を可能とした。

このような組換え法は、セリンプロテアーゼ阻害活性を持っている経済的な碧剤 組成物を供給するために、Ｒ的にも、純度的にも、阻害剤の製造を可能にする。

さらに、ＤＮＡ塩基配列の同定により、上述のセリンプロテアーゼ阻害剤の類縁 体を製造する組み換えＤＮＡ法の発明を可能にした。

発明の総括 本発明は、プロテアーゼ阻害剤製造に関するものであり、一般、そして更に特定 的には、ヒト、多形核（ＰＭＮ）−顆粒球プロテアーゼを阻害対象とした組換え 阻害剤の製造である。特にこの発明は白血球エラスターゼやトリプシンを始めと するヒト・セリンプロテアーゼに対する阻害剤の製造のための組換えＤＮＡ法に 関するものである。

それに加えて、本発明は、本セリンプロテアーゼ阻害剤の類縁体の製造に関する 組み換えＤＮＡ法にも関連する。本発明はまた、以下に述べるような組み換えＤ ＮＡ法において有用な合成並びに天然のＤＮＡ塩基配列に関するものである。

セリンプロテアーゼ阻害活性を持つ一本鎖のポリペブタイドであるセリンプロテ アーゼ阻害剤の組み換えＤＮＡ合成法を提供することが本発明の目的である。こ れらの阻害剤は、ヒトの耳下腺分泌物から単離された天然の白血球エラスターゼ またはトリプシン阻害剤によって示される活性と生物学的に同等な活性を持って いる。

これらのセリンプロテアーゼ阻害剤の代替的組み換えＤＮＡ合成を容易にするた めに、等価の天然のＤＮＡ塩基配列と同様に、これらの組み換えプロテアーゼ阻 害剤の生産を導き行なうことができる合成りＮＡ塩基配列を供給することが、こ の発明のなおそれ以上の目的である。

このような自然のＤＮＡ塩基配列は、プロテアーゼの阻害剤の合成を導き行なう ことができる遺伝子が、そこがら単離、同定されうるＣＤＮＡもしくはジェノミ ツクライブラリ−から単離されうる。

さらに、先に検討したプロテアーゼ阻害剤の類縁体を製造する組み換えＤＮＡ法 及びこのような方法に役立つ、相当する類縁ＤＮＡ塩基配列を提供することが本 発明の目的である。

なおその他の本発明の目的と利点は、以下に続く記述においで一部出てくるであ ろう。そして一部は記述から明白であるか、発明の実施から学ばれることもあろ う。

その目的と利益は、添付した特許請求の範囲において特に指摘されている手段と 組合せによって了解され、達成されるであろう。

この目的を達成するため、そして本発明の目的に従って、セリンプロテアーゼ阻 害活性を示すところの、活性型で一末鎖ベブタイドのタンパクであるプロテアー ゼ阻害剤の組み換えＤＮＡ方法論による生産を導き行なうことができるＤＮＡ塩 基配列を発見した。これらの組み換えプロテアーゼ阻害剤は、熱や酸による変性 に対して著しく抵抗性である。さらに、これらのプロテアーゼ阻害剤は、キモト ドリブシンやマウスの顎下腺プロテアーゼやクロストリバインのような多くのタ ンパク分解酵素に接触した後でさえ、それらの生物活性を維持している。

これらの組み換えセリンプロテアーゼ阻害剤の製造を導き行なうために発見され た［）ＮＡ塩基配列の（選伝暗号鎖）コーディングストランドは以下の通りであ る。

５’　ＡＣＣＧ６　ＴＡＡＡＡ　ＧＣＴＴＣＡＡＡＧＣＴＧＧＣＧ　ＴＡＴＧＣ ＣＣＧＣＣＧＡＡＡＡ　ＡＡＴＣＣＧＣＧＣＡＧＴＧＴＣＴＧＣＧＧ　ＴＡＣＡ Ａ　ＡＡＡＡ（：ＣＧＧＡＡ　ＴＧ（ＣＡ　ＧＴＣＣＧ　ＡＣＴＧＧ　ＣＡＧＴ Ｇ　ＣＣＣＣＧ　ＧＴ′ＡＡＡＡｋＡＣＧ　ＴＴＧＴＴ　ＧＣＣＣＧ　ＧＡＣＡ ＣＣＴＧＣＧ　ＧＣＡＴＣＡＡＡＴＧＣＣＴＧＧ　ｋＴＣＣＧ　ＧＴＴＧＡ　Ｔ ＡＣＣＣＣＧＡＡＣＣ（ＧＡＣＴＣＧＴＣＧλλ人Ａ　ＣＣＣＧＧ　ＴＡＡＡＴ 　ＧＣＣＣＧ　ＧτＡＡＣＣＴＡＴＧ　ＧＣＣＡＧＴＧＴＣＴ　ＧＡＴＧＣＴＧ ＡＡＣＣＣ（：ＣｃＧＡＡＣＴ　ＴＣＴＧＣＧＡＡＡＴＧＧＡＣＧ　ＧＣＣＡＧ 　ＴＣ；Ｔ品Ａ（ＧＡＧ　ＡＴＣＴＧ　ＡＡＡＴＧ　ＣＴＧＴＡＴＧＧＧＴ　Ａ ＴＧＴＧ　ＣＧＧＣＡ　ＡＡＴＣＴ　ＴＧＴＧＴ　ＴＴＣＣＣ（ＧＧＴＡＡＡＡ ＧＣｋＴλＡ　コ′ 上述の略号によって表示されたヌクレオタイドは、提起された具象化の詳細な記 述において明らかになる。

これらの遺伝子組み換えセリンプロテアーゼ阻害剤、特に本発明の分必形白血球 プロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰＩ）の製造を導き行なうために発見した、２番目の 好ましいＯＮ’Ａ塩基配列に対するコーディングストランドは以下の如くである 。

５’　ＴＣＴＧＧ　Ｔ結晶　ＧＣπＣ思＝　ＴφＣａ　τＡＴＧＣＣＣ匡ＣＣＣ ＴＣＧ、、　ＡＴＣＣＧ　Ｇ’ｒでＯＡ　’ｌ’Ａｃｃ：（ＣＧＡＡＣＣＣＧＡ ＣＴαπＣさらに目的を達成するため、そして本発明の目的に従って、上に掲げ た天然または合成りＮＡ塩基配列を用いて、本セリンプロテアーゼ阻害剤の微生 物製造に帰着する組み換えＤＮＡ法を明らかにする。この組み換えＤＮＡ法は以 下の項目を包含する。

（Ｑ　宿主微生物を導き、セリンプロテアーゼ阻害活性、好ましくは白血球エラ スターゼ阻害活性を持つタンパクの製造を行なうことができるＤＮＡ配列の：Ａ ＷＡ。

（ハ）宿主微生物の中に導入され、複製することができるＤＮＡ塩基配列をクロ ーニングすること。このようなベクターはＤＮＡ塩基配列に対するオペレーショ ナルエレメント（操作要因）を含んでいる。

（ハ）　ＤＮＡ塩基配列とオペレーショナルエレメントを含むベクターをプロテ アーゼ阻害タンパクを発現することができる宿主微生物の中に移すこと。

ゆ　ベクターの増幅と阻害剤の発現のため適切な条件下でその微生物を培養する こと。

（ｅ）　［害剤を収穫すること：そして０　阻害剤がセリンプロテアーゼ阻害活 性を有する活性三次構造をとれるようにすることである。

本発明において使うための天然のＤＮＡＪ！！基配列の同定単離を容易にするた め、本発明者達はヒト耳下腺組織ｃＤＮＡライブラリーを開発した。このライブ ラリーは、細胞が本発明のセリンプロテアーゼ阻害剤を合成するようにしむける ことができる遺伝情報を含んでいる。ここに述べられた組み換えＤＮＡ法に用い られることがある他の天然ＤＮＡ塩基配列は、ヒト・ジェノミツクライブラリ− から単離することができる。

本発明の過程において役に立つ合成塩基配列は、ポリヌクレオチドの合成と、こ の道の普通の技征を持った大人にとって知られている配列を行なう技術によって 作ることができる。先に述べた過程において、有用な天然のＤＮＡ塩基配列は、 以下の項目を含む方法によって同定・単離することができる。

（２）　細胞から、好ましくは耳下腺のａｍからセリンプロテアーゼ阻害剤を発 生することができるヒトＤＮＡライブラリーを調製すること。

（ハ）　プロテアーゼ阻害剤の遺伝子またはそのタンパク生産物に結合すること ができる少なくとも１つのプローブでヒトＤＮＡライブラリーをプローブするこ と。

Ｑ　クローンが遺伝子又はそのタンパク生成物に対する、少くとも１つのプロー ブに結合する能力によって、阻害剤をコードしている遺伝子を含む少なくとも１ つのクローンを同定すること。

ゆ　同定されたクローンから阻害剤をコードしている遺伝子の単離、そして （ｅ）　３３２伝子またはそれについての適切な断片を宿主の微生物の遺伝子を 維持し、表現することに必要なオペレーショナルエレメントにつなぐこと。

前に述べた過程において、有用な天然のＤＮＡ塩基配列も、以下の項目を含む方 法によって同定・甲随できる。

（２）　宿主ｒｅｃ　Ａ　ｒｅｃ　ＢＣＥ、ｃｏｌｉにおいて繁殖させたヒト・ ジェノミックＤＮＡライブラリーを調製すること。

０　ヒト・ジェノミックＤＮＡライブラリーをセリンプロティン阻害剤遺伝子に 結合することができるか、そのタンパク生成物に結合することができる少くとも １つのプローブでプローブすること。

（へ）　遺伝子又はそのタンパク産物に対する少くとも１つのプローブに結合す るクローンの能力によって阻害剤をコードする遺伝子を含む少くとも１つのクロ ーンを同定する。

（ロ）　同定されたクローンから阻害剤をコードする遺伝子を単離する。そして 、 （ｅ）　Ｗ転子もしくは適当なその断片を宿主微生物中の遺伝子を維持し発現す るのに必要なオペレーショナルエレメントにつなげること。

さらに、目的を達成するため、そして本発明の目的に従って、セリンプロテアー ゼ阻害剤の薬剤的に有用なアナログは上に詳述した遺伝子組み換えＤＮＡ法によ り、適切なベクターにクローニングを行なって、適切な宿主微生物に移した場合 、欲しいアナログの発見をＩＩできる遺伝子をつくり出すために、上に列挙した 組み換えＤＮＡ技術を通じて合成的なりＮＡ塩基配列もしくは天然ＤＮＡ断片を 変えることにより生産することができる。

さらに、目的を達成するために、そして本発明の目的に従って、本発明に従った 組み換えプロテアーゼ阻害剤、もしくは上に述べた、組み換えＤＮＡ法で生産さ れた生吻活性を有するアナログを活性成分として含んでいる薬剤組成物を明らか にする。

本発明に組み込まれていてこの出願の一部をなしている添付されている図は、こ の発明に役立つ種々のプラスミツドを図解し、同時に、本発明の詳細な説明する のに役立つ記述を含んでいる。

図の簡単な記述 第１図は、プラスミドｐｓＧＥ６の地図である。

第２図は、プラスミドｐｓＧＥ８の地図である。

第３図は、プラスミドＩ）ＧＳ２８５の地図である。

第４図は、プラスミドＤＧ３４８５である。

好ましい実施態様に関する記述 現在において提出した発明の実ＩＮ態様について、今、詳細に述べよう。それら は、あとに続〈実施例とともに本発明の詳細な説明するのに役に立つ。

上に記したように、本発明は精製した形で単離されたプロテアーゼ阻害剤に関す るものである。望ましくは、本発明のセリンプロテアーゼ阻害剤は、−末鎖ポリ ペプチドタンパクであり、ヒト・耳下腺分泌物からｌｆｉされた天然のセリンプ ロテアーゼ阻害剤に実質的に同族であるかもつとも好ましくは生物学的に等価で ある。特許明細と請求範囲を通じて使われている“生物学的に等価”とは、組成 物は、プロテアーゼによって誘起された。同じ型の組織のｌｆｉ　（Ｂを防ぐこ とができるが、必ずしも天然プロテアーゼ阻害剤と同程度ではないということで ある。

あとに続く明細と請求範囲を通じて使用されている“実質的に相同”とは、天然 の耳下腺阻害剤に対して１Ｊ、Ｉｙ＋に報告されている一末鎖ペブタイドセリン プロテアーゼ阻好ましくは、相同性の程度が４０％大きく、最も好ましくは５０ ％大きく、特別に好ましい群のタンパクは天然耳下腺阻害剤との相同性が６０％ 大きい。上に記述したような百分率の相同性は、２つの配列のうちの小さい方に 見出された成分の百分率として計算されており、２つの配列のうちの大きい方で も、同じことがみつかるかもしれない。この成分は４つの続いたアミノ酸の配列 として理解されているものである。

本発明の組み換え法によって２４造される好ましいプロテアーゼ阻害剤は、Ｒｏ ｂｅｒｔ　Ｃ，Ｔｏｍｐｓｏｎ　ｅｔ、　ａｔ、の“セリンプロテアーゼ阻害剤 と同じものを単離する方法パと題して、１９８４年１２月６日に提出した米国特 許出願連続番号Ｎｏ、　６７８　、８２３及びこの出願と同期日に出願した、Ｒ ｏｂｅｒｔ　Ｃ，Ｔｏｍｐｓｏｎらの“セリンプロテアーゼ阻害剤と同じものを 単離する方法“と題する米国特許出願連続番号Ｎｏ、　に記述されている。この ようなプロテアーゼ阻害剤は、熱や酸による変性に対し、著しく抵抗性であり、 又、キモトリプシン、マウス顎下腺プロテアーゼ、クロストリパインをはじめと する、多くのタンパク分解醇素に接触した場合、活性喪失に対し抵抗性である。

これらの阻害剤は、必要なジスルフィド結合を形成する能力を持ち、生化学的刺 戟の存在しないところで、プロテアーゼ阻害剤活性を表現することができる３次 構造をとるべく適切な非共有結合的相互作用を受ける。あるいは、ジスルフィド 結合が切れて非共有結合的相互作用が破壊されてもこのような結合を再生し、相 互作用を成度し、生化学的刺戟のないところで、このような活性３次構造を再び とることができる。

これらの特性を持っている好ましいセリンプロテアーゼ阻害剤のアミノ酸の配列 を検討し、その配列を以下の如く決定した。

Ｓａｒ−ＧＬｙ−Ｌｙｇ−５ｅｒ−Ｐｈａ−Ｌｙｓ−Ａ工ａ−ＧＬｙ−Ｖａｌ− （ｙｓ−Ｐｒｏ　−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−ＡＵａ−Ｇｉｎ−Ｃｙｓ −ｔ、ｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−ＧＬｕ−Ｃｙｓ＜４ｎ −５ａｒ−Ａｓｐ−τｒｐ−ＧＬｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−［、ｙ ｓ−Ａｒｇ−（ｙｓ−（ｙｓ−Ｐｒｏ−人ｉｐ−でｈｒ−（ｙｓ−ＧＬｙ−工Ｌ ａ−１，＋ｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌａｕ−Ａｓｐ−ＰｒローＶａＬ−Ａｓｐ−τｈｒ− ＰｒローＡｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ｆ、ｙｉ−！：’ｒローＧ ａｙ−Ｌｙｓ−（ｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−τｈｒ−Ｔｙｒ−ＧＬｙ−ＧＬｎ−（ ｙｓ−Ｌａｕ−Ｍ＠ｔ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｈ＠−Ｃ ｙｓ＜ｌｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−ＧＬｙ−Ｇｉｎ−（ｙツーＬｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓ 　ｐ−Ｌａｕ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−ＧＬｙ州ｓ　ｔ−Ｃｙｓ−Ｇ Ｌｙ−Ｌｙｓ　−５５ｒ−Ｃｙｓ−ＶａＬ−５＠ｒ−Ｐｒｏ−ＶａＬ−Ｌｙｉ− ＡＬａ。

上記の略号は、ポリペプチド中のアミノ酸残基に次の如く対応する。

フェニールアラニン　Ｐｈｅ トリプトファン　Ｔｒｐ メチオニン　Ｍｅｔ スレオニン　Ｔｈｒ アミノ酸　略　号 システィン　Ｃｙｓ チロシン　Ｔｙｒ アスパラギン　Ａｓｎ グルタミン　Ｇｌｎ アスパラギン酸　ＡＳＯ グルタミン酸　Ｇｌｕ リジン　Ｌｙｓ アルギニン　Ａｒｇ ヒスチジン　）−１ｉｓ ここに明らかにされた組み換えＤＮＡ法によって製造されたこれらのプロテアー ゼ阻害剤は１つ以上の区別できるドメインを持っていることが発見された。１つ 以上の区別できるドメインとは、そのタンパクが異なる醇素に対して機能する複 数の活性部位を持っているということである。これらの場所の存在と位置づけは 、プロテアーゼ阻害剤の少くとも２つの部分の間には、実質的な相同性があるこ とが発見されたことによって決定された。

区別できるドメインの存在が、本プロテアーゼ阻害剤に白血球エラスターゼもト リプシンも含む広い範囲のセリンプロテアーゼを阻害する能力を与えていると考 えられる。

さらに、これらプロテアーゼ阻害剤のはつきりしたドメインの複数性のために、 プロテア−ぜ阻害剤が附加的特性をもつプロテアーゼ阻害剤をつくるために、さ まざまな他の活性部位がその上に構築されるような枠組みとして役立つかもしれ ないということが注目された。好ましい本発明の具体化は、白血球エラスターゼ 、カテプシンＧ、膵臓のエラスターゼとトリプシンを阻害するプロテアーゼ阻害 剤の生産を含んでいる。これらの酵素はすべて共通のメカニズムと多くの構造的 特徴を共有しているセリンプロテアーゼとして知られているプロテアーゼのクラ スのメンバーである。本発明によって生産されたプロテアーゼ阻害剤において、 小数のアミノ酸側鎖を細工することによって阻害剤の複合性が創り出され、各々 が全体のクラスのセリンプロテアーゼの少くとも１員を阻害することができると 考えられる。その上、このような側鎖の［ｉは、上に述べたような特定のセリン プロテアーゼのクラスのメンバーに関して阻害活性が改善されている複数性の阻 害剤を産出することが期待できる。

これらの目標を達成するのに必要なアミノ酸の側鎖の変化は、本発明によって生 産された好ましい阻害剤と阻害剤の重要な！ｌ能部分がＸ−線結晶学によって解 明された他のセリンプロテアーゼ阻害剤の間の１造類似性の特定の要素によって 示唆される。構造的類似性のこれらの要素は上述の本発明によって製造された好 ましいセリンプロテアーゼ阻害剤のアミノ酸１７から２９及び７０から８３を含 んでいる。ｍ的か質的かのいずれかにおいて、トリプシン様セリンプロテアーゼ 阻害剤の活性を改良するために示唆された変化は、２０番目のアミノ酸をＡｒｇ からＰｈｅ、ＴｙｒあるいはＴｒｐ、７２あるいは°７４７４番目ミノ酸をｌｅ ｕから、Ｌ’ｌ／ＳまたはＡｒｇ、そして７３番目のアミノ酸をＭｅｔからＬｙ ＳまたはＡｒｌへ変換することの１つもしくはそれ以上を含んでいる。

カテプシンＧをはじめとするキモトリプシン様セリンプロテアーゼに対する活性 を、退的又は質的に改善するべく示唆された変化は、アミノ１ｔ２０をＡｒｃか らｐｎｅ、　ＴｙｒまたはＴｒｐへ、アミノ酸７２または７４をＬｅｕからｐｈ ｅ、　Ｔｙｒまたｌ；ｔＴｒｐＡ、、そジチアミノＭ７３をＭｅｔからＰｈｅ、 Ｔｙｒもしくは７ｒｐへ変換することを、１つもしくはそれ以上行なうことを含 んでいる。

膵臓のエラスターゼ様セリンプロテアーゼに対する阻害剤の活性を、匿的もしく は質的に変えるべく示唆された変化は、アミノ１２０をＡｒＱからＡａｌへ、７ ２または７４番目のアミノ酸を１．ｅｕからＡｈａへ、そして７３番目のアミノ 酸をＭｅｔから、６１１８へ変換することの１つ又はそれ以上を含んでいる。

本発明の実施例にあたっては、本発明のタンパクに新しいプロテアーゼ阻害活性 を付与するためのアミノ酸の変更は、白血球エラスターゼもしくはトリプシンに 対する阻害剤の活性を破壊するかもしれないということを心にとめておかねばな らない。このような効果は本発明の教えに従って行なわれる型通りの実験によっ て決定されよう。

さらに、上に提出されたように、特定のアミノ酸もしくは特定のアミノ酸の配列 を置換すると、一方では強化されないドメインの活性を幾分か犠牲にすることに なるが、本発明のプロテアーゼ阻害剤の白血球エラスターゼもしくは、トリプシ ン阻害活性のいずれかを増強するかもしれないということが考えられる。事実： 阻害タンパクの中のどの領域の活性も、適切なアミノ酸置換によって完全に除去 され、その際、それに対して通常そのタンパクが活性がある１つか、もしくはい くつかの酵素のサブセットに対して、特異性のあるタンパクをつくるかもしれな い。例えば、７３の位置のＭｅｔに対し、Ｇｌ’／を置換するか、もしくは、７ ２か、７４の位置のＬｅｕに対してＧｌｙを置換すると、白血球エラスターゼ阻 害ドメインを不活性化するが、２０の位置のＡｒＱに対しＧｌｙを置換するとト リプシン阻害ドメインを不活性化する。これらドメインはまた、各々が望ましい 阻害機能を保持する、別々のタンパクに２分けることもできる。本発明の請求範 囲は、これらの手段によるこのような阻害剤を生産する他の工程に対しても拡張 される。

本発明者らは、上に議論したプロテアーゼ阻害剤の細胞内生産を導き行なうこと ができる合成的ＤＮＡ塩基配列を発見した。この塩基配列は、次のような構造を もっている。

醒ζ土工 この中で、ヌクレオチドは、下記のような略号で表さデオキシアデニルＭ　Ａ デオキシグアニル酸　Ｇ デオキシシチジル酸　Ｃ チミジル酸　Ｔ 木発明者らは、上に議論したプロテアーゼ阻害剤、とりわけ、上述の分泌性白血 球プロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰＩ）の細胞外生産を導き行なうことができる２番 目の好ましい合成りＮＡ１！基配列分配列した。この塩基配列は次のような構成 をもっている。

上に注意したように、本プロテアーゼ阻害剤の複合的ドメインｖＡ造のため、上 に議論したようなセリンプロテアーゼ阻害剤の類縁体生産を導くことができるＤ ＮＡ配列を結果として生ずる、ここに提出する合成的ＤＮＡ配列に変化を与える ことが考えられる。

特に本発明に従って組み換えＤＮＡ技術によって生産されたセリンプロテアーゼ 阻害剤の好ましい類縁体は、次のアミノ酸配列をもっている。

Ｒ１−ＧＬｙ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ｐｈｅ−乙ｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−１／ａｉ− Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−ＧＬｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（ｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ− Ａｓｐ−でｈｒ−Ｃｙｓ−ＧＩＹ−ＺＬ＠−乙ｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌａｕ−人ｇｐ− Ｐｒｏ−Ｖａｔ−八ｓｐ−でｈｒ−ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ− Ａｒｇ−ＬＹ９−Ｐｒｏ−ＧＬｙ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｎ−Ｒ１と− Ｒ７は同一か、異なったものであり、置換もしくは無置換アミノ酸残基もしくは その誘導体から成立つ群から選ばれている。そして Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８及びＲ９は同一か異なったものであり、メ チオニン、バリン、アラニン、フェニールアラニン、チロシン、トリプトファン 、リジン、グリシン及びアルギニンからなる群から選ばれる。

上に示されたＤＮＡ塩基配列は、本発明の好ましい具象化を表していることに注 目すべきである。ジエネティツクコードの縮重のためにヌクレオチドの多数の選 択、本プロテアーゼ阻害剤、もしくはその類縁体の生産を導き行なうことができ るＤＮＡ塩基配列に導く多数のヌクレオチドの選択がなされつるということが理 解されるべきである。上に提出した塩基配列に対し、別離的に同等であるＤＮＡ 塩基配列もしくは上に提出したアミノ酸配列に従って生産されたプロテア−ぜ阻 害剤のアナログの生産を導き行なうであろうところの配列には能的に等価である 配列は、それ自体で本発明の中に包含されるものとする。以下の図式は、縮重し たジエネテイツクコードの結果として考えられるコドンの置換の例として、上に 数え上げた好ましいアミノ酸配列の製造のための本発明の範囲に含めることを意 図した追加のＤＮＡ配＋ＩＪである。

このタンパクの生産に対する等価ＤＮＡ塩基配列を決定するための列を辿ること によって、この道の言過のわざを持った人々なら、好ましいアミノ酸配列の類縁 体の生産のための等価なりＮＡ塩基配列も決定できる。

上の配列においては、用いられる略号は下に示されるヌクレオチドを表わすよう 意図されている。

すぐ上にかかげたものを含め、本発明の合成りＮＡ塩基配列において用いられる 遺伝暗号を選択する場合に、特定のアミノ酸を指示するのに用いられる運転Ｄｉ １号は腐度に発現されるタンパクと関連するものであることが望ましい。これら の望ましい遺伝暗号は１部ｃｒａｎｔｈａｎ、　Ｒｅｔ　ａｔ、らの“Ｃｏｄｏ ｎ　Ｃａｔａｌｏｇ　Ｕｓａｇｅ　Ｉｓ　ａ　ＧｅｎｏｍｅＳｔｒａｔｅｇｙ　 Ｍｏｄｕｌａｔｅｄ　Ｆｏｒ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｖｉｔｙ”は、Ｎｕ ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　９　：　ｒ４３　（１９８１）に 出ている。本発明の好ましいＤＮＡ配列は、縮重した配列のいずれに対しても、 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉの配列遺伝暗号を選択することによって選ば れた。

さらに、本発明のプロテアーゼ阻害剤の類縁体の生産を導き行なうことが出来る 追加の合成りＮＡｉ！！！配列をつくり上げるための合成りＮＡ塩基配列の変換 を容易にする遺伝暗号を選ぶことが望ましい。特に、もし可能なら、υ１限酵素 、エンドヌクレアーゼの切面位置を、追加の遺伝暗号を挿入することが望ましい 合成りＮＡの位置の近くに、もしくは類縁体が作られるように遺伝暗号を取り換 えることが望ましい位置に、もってくることができるようにヌクレオチド配列を 選ぶことが望ましい。本発明のＤＮＡ配列の望ましい実施態様においては、制限 酵素の切断位２が上に示したヌクレオチド配列の下に示しである。

ここに考えられている合成りＮＡ配列をつくり出す方法は、一般的に、最近の報 告によって導かれたこの道の普通のわざの１つによって遂行される型通りの業務 の範囲内にある。ここで明らかにした合成りＮＡ塩基配列を得るために用いられ る適切な方法の例は、Ｈａｔｔｅａｃｃｉ。

）１．　Ｄ、とＣａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｈ，Ｈ，、Ｊ、−ＡＨ，Ｃｈｅｍ、Ｓｏ ｃ、１０３　：３１８５　（１９８１）及び、８ｅａｕｃａｇｅ、　Ｓ、　Ｌ、 とＣａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｈ，ＩＩ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、　２２ 　：　１８５９（１９８１）、によって提出されており、両方とも、特別に参照 事項としてこの中に組み込まれている。

本発明の代替的実施＠様において、１つのＤＮＡ塩基配列が、本発明の望ましい 分壽白血球プロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰＩ）をコードするヒト・ジェノミツタラ イブラリ−から単離ぎれた。この４番目の遺伝暗号からコードされ、現在発明者 らに知られているイントロン（介在配列）を含むこの塩基配列は以下の通りであ る。

ＣＣＧＴＴＧＴＧＴＣＴＴＴＣＣＴＴＣτＧＣＴλＴττＴＧＴＣＴＣＴＧＴＣ ；ＣττＣＴＣＧＣＴＴＧＧＧＡτττＡＧＣＴＣτＣＬ２＋１］ＯＬコ００　 Ｌ３２０ ＣＧＣＧＧＧ（（ＴＧ入ＡＧＴＴＣＴＡＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＧＴＧ（：τ入τ ＣτττＣ（ｉＧＧＧｃｃＧｃｃττＡＧＧＧ入Ｇ入ＡＧ１コ４０　１コｇ０　 Ｌコ８０ ＡＣτＣτＡＡＡＡＡＧＴＧＧＧＱ入ＴＧＧＧＡＧＧＧＧττＧτ入ＴＡＡＡＧ τＡＣＡＡＧＧＣＣＴＣτＧＡＣＣＧＧＴＡＧＣＣτＣＡＣＴＣＴＣｋＣＣＣＡ ＡＣＣＣＪＧＣＡＡＧＧｋＧＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧ；１ＬＡＧＴＧＣＣＣＡＧＴ Ｇ入ＣττＡτＧＧＣＣＡＡτ−−−−−−−−−−−−−−−−−−ＲＲＫ　 Ｐ　Ｇ　Ｋ　ＣＰ　Ｖ　で　ＹＧＱ１日２０　１８４ＯＬ！３６０ でＧＡＴＴＣＴＡＴＴＣ’ｆ’ＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＣ；ＴＧＧＧＧＧＴｃｃ ＴＧＧＧｃλＡＧτＧ’ｌ’ＣＴＴＴＣτＧＡＧＴ（ＴＡＧs’Ｔ ＡＡＧＡＡＴτＡＴＴＡττＣＡＧＧＴＧＴ↑”Ｉ’ＣＣＡτＣＡＴＧＴτＴτ ＣＴＧＡＧＧτＧλＡＡＴＣＡＣλＡＡＧＧＡτＣＡＧＴ２１２０　２工４０　 ２１６０ ２１日０　２２００　２２２０ ＡＡＧＣＴＣＴＧＡＴＣＴＣ，ＡＴＴＴＴＣＴＣＴＣＡ（ＡＧＣＴ’Ｉ’Ｃ；Ａ ＴＴＣＣＴＧＣＣλτ入τ（ｃＧＡＣＯＡＧＧＣＴＣＴＧＣGλ ＥｔＴＤ　ＯＦ’　Ｘ’：ＴＴＲＯＮ この配列においては、アミノ改残基に用いられた１文字の略号は普通に用いられ ており、例えば、Ａ、［。

Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒによる　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　第２版、ＷｏｒｔｈＰ ｕｂｌｉｓｈｅｒ、　Ｉｎｃ、、Ｎｅｖ　Ｙｏｒｋ、　Ｈｅｗ　Ｙｏｒｋ　（ｉ 　９７５　）　７２頁に出ている。

この塩基配列とここに含まれるアミノ酸配列データーを用いて、上のジェノミッ ク配列に加えられた場合、全プロテアーゼ阻害剤をコートする遺伝子に到達する 合成りＮＡ配列が構築できる。そのかわりに、上に示したＤＮＡ塩基配列を用い てプローブを作り、最初の３つのアミノ酸に対するコドンを持っている、ヒトジ ェノミツタライブラリ−から、ＤＮＡ断片を回収するのに用いた。

このようなプローブは、それに加えて適切なリーダー配列を含むヒトジェノミッ ク配列を同定するのに用いられる。このリーダー配列、または、どの他の適切な リーダー配列も、ＤＮＡジェノミック配列と併用して、韻乳動物の発現システム に用いられると考えられる。

本発明のもう１つの別法としての具体化において、本発明の好ましい分泌性白血 球プロテアーゼ阻害剤の細胞内生産を導き行なうことができるＤＮＡ配列をコー ドする耳下腺ライブラリーからＣＤＮＡクローンを単離した。

このクローンは八ｃｃｅｓｓｔｏｎ　Ｎｏ、　（１）下に：、Ｒｏｃｋｖｉｌｌ ｅ、　ＭａｒｙｌａｎｄのＡａ＋ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏ ｌｌｅｃｔｉｏｎに預けである。

セリンプロテアーゼ阻害活性を有する少なくとも１つの活性部位をもつ１本鎮ポ リペブタイドから（育成されている１つのプロテアーゼ阻害剤の製造に対する組 み換えＤＮＡ法が明らかとなった。発明の１つの具体化において、この活性部位 は、ヒト・耳下腺分泌物から単離された天然の白血球エラスターゼ阻害剤の活性 部位と生物学的に等価な方法で１能する。天然又は合成りＮＡ塩基配列は、プロ テアーゼ阻害剤の直接生産に用いることができる。この方法は、以下の工程を含 む。

（２）　宿主微生物が、セリンプロテアーゼ阻害剤活性をもっているクンバクを 生産するよう導＜ＤＮＡ塩基配列の調製。

（ハ）　ＤＮＡ塩基配列を宿主に移し増殖することができるベクターにそのＤＮ Ａ塩基配列をクローニングすること。このようなベクターは、そのＤＮＡ塩基配 列に対してオペレーショナルエレメントを含んでいる。

（ハ）　合成りＮＡ塩基配列とオペレーショナルエレメントを含むベクターをプ ロテアーゼ阻害剤を発現することができる宿主微生物に移す。

（へ）その微生物をベクターの増殖と阻害剤の発現に適切な条件下で培養するこ と。

（ｅ）　阻害剤を収穫すること。そし−Ｃ１ｔｎ　阻害剤がセリンプロテアーゼ 阻害活性を持つ、活性３次構造をとれるようにすること。

この方法における使用のために考えられた合成りＮＡ塩基配列が、上に詳細に検 討された。代替的実施態様において、この方法で天然のＤＮＡ塩基配列も使うこ とができるということが更に考えられる。これらの配列には、ｃＤＮＡもしくは ジェノミックＯＮ７’Ｍ９ｉ片が用いられる。

この実１Ｍ態様のより好ましい変形として天然のＤＮＡ配列は、以下の項目を含 む方法によって得られる。

（ω　セリンプロテアーゼ阻害剤を生成できる細胞、さらに望ましくは、耳下腺 の細胞からヒトのＣＤＮＡライブラリーを調製する。

（へ）　プロテアーゼ阻害剤遺伝子もしくはそのタンパク産物に結合することが できる少くとも１つのプローブで、ヒトＤＮＡライブラリーを検索する。

（φ　そのクローンが遺伝子もしくはそのタンパク産物に対する、少くとも１つ のプローブと結合する能力によって阻害剤をコードする遺伝子を含む少くとも１ つのクローンを同定する。

＠　選ばれた単一クローンもしくは複数のクローンから阻害剤をコードする遺伝 子の単離。

（ｅ）　遺伝子もしくはその適切な断片を宿主微生物中の遺伝子を維持し、発現 するために必要なオペレーショナルエレメントにつなげること。

前出の工程において、有用な天然のＤＮＡ塩基配列も以下の工程を経て同定単離 される。

（２）　より好ましくは、宿主ｒｅｃ　Ａ　ｒｅｃ　ＢＣＥ、　ｃｏｌｉ中で繁 殖させたヒト・ジェノミツクライブラリ−を作る。

（ハ）　ヒトジェノミツクライブラリ−をセリンプロティン阻害剤遺伝子、もし くは、その生産物に結合することができる少なくとも１つのプローブを用いて検 索する。

（ロ）　そのクローンが遺伝子またはタンパク産物に対する少なくとも１つのプ ローブに結合するクローンの能力によって阻害剤をコードする遺伝子を含む少く とも１つのクローンを同定する。

ゆ　同定されたクローンからの阻害剤をコードする遺伝子を単離する。

（ｅ）　遺伝子もしくはその適当なフラグメントを宿主微生物中の遺伝子を維持 し、表現するのに必要なオペレーショナルエレメントにつなげること。

上にかかげた方法を用いるのに、適切な天然のＤＮＡ遺伝子を単離するにあたり 、適当な遺伝子の両端部分、すなわち遺伝子の断面の内側または最も近い部分に 位２している２つの制限酵素切断部位を同定することがより好ましい。適切な遺 伝子を含むＤＮＡ断片を次に適切なυ１限エンドヌクレアーゼを用いて、ゲノム 物質の残りから除去する。切り出した後、セリンプロテア−ぜ阻害剤タンパクの Ｎ−及びＣ−末端にコードすることができ、またそのＤＮＡ配列をそのオペレー ショナルエレメントに融合させることができるように、ＤＮＡ配列の３′及び５ ′末端は再構築される。

浸先されるか、もしくは、必要となるオペレーショナルエレメントとともに、上 の検討したようなりＮＡ塩基配列が挿入され、又そのベクターが、その後宿主微 生物に移され、その微生物中で複製出来るような、ベクターすべてを含む。より 好ましいベクターは、そのυ１限醇素切断部位がよく報告されていて、ＤＮＡ塩 基配列の転写に、より好まれるか、もしくは必要である、オペレージナルエレメ ントを含んでいるようなベクターである。

ここで検に寸されるオペレーショナルエレメントには、少なくとも１つのプロモ ーター、少くとも１つのオペレーター、少くとも１つのリーダー配列、少くとも １つのシャインーダルガーノ配列、少くとも１つの停止コドン及びベクターＤＮ Ａの適切な転写とその次の翻訳に必要か、より好ましい他のＤＮＡはすべて含ま れる。特に、このようなベクターは、少くとも１つの選択可能なマーカーととも に、宿主微生物によって認識される？！製の少くとも１つの起点、及び合成りＮ Ａの塩基配列の転写を始めることが出来る少くとも１つのプロモーター塩基配列 を含んでいると予測されている。ベクターは、ある実ｌｌＡ１様においては、レ ギュレーターとして機能することができるあるＤＮＡを含み、レギュレータープ ロティンをコードすることができる他のＤＮＡ塩基配列を含んでいることが、さ らに、より好ましい。これらのレギュレーターは、１つの実流態様においては、 ある環境条件の存在下でＤＮＡ配列の発現を防ぐのに役立ち、他の環境条件では 転写と、続いて起る合成りＮＡ塩基配列によってコードされたタンパクの発現が 行なわれる。とりわけ、例えば、イソプロピルチオー−ｄ−ガラク１−ジッドが 存在しないと、合成りＮＡの発現が起らないようなベクターのなかには調節断片 が挿入されることがより好ましい。

この状況下では、合成りＮＡを含む形質転換した微生物は、プロテアーゼ阻害剤 の発現がはじまる以前にある望ましい密度まで育てられるかもしれない。この実 施態様においては、望ましいプロテアーゼ阻害剤の発現は、望ましい密度が達さ れた後にＤＮＡ塩基配列の発現を起すことができるある物質を微生物の環境に加 えることにより誘導される。

それに加えて、ベクター中か、もしくは合成りＮＡ配列の５′末端に、適切な分 泌リーダー配列が存在することがより望ましい。リーダー配列は、リーダー配列 がプロテアーゼ阻害剤の発現を導くことができるヌクレオチド配列のはじめの部 分に、翻訳停止シグナルを間にはさまずに、すぐに隣りあっていることができる ような位置にある。リーダー配列の存在は、一部には以下の理由のうち１つかそ れ以上の理由から、望まれる。１）リーダー阻害剤が存在すると、宿主が初期の 生産物を成熟した組み換えプロテアーゼ阻害剤に仕上げることを容易にするかも しれない。２）リーダー配列の存在は、プロテアーゼ阻害剤を細胞質の外へ導く ことにより、組み換えプロテアーゼ阻害剤の精製を容易にするかもしれない。３ ）リーダー配列の存在は、組み換えプロテアーゼ阻害剤が、プロテアーゼ阻害剤 を細脂質の外へ導くことを通じてその活性構造へ組み込まれる能力にＦｌを与え るかもしれない。

とりわけ、リーダー配列は、最初の産物をリーダーペプチダーゼによって、リー ダー配列を除去し、セリンプロテアーゼ阻害活性の潜在力をもつより好ましいポ リペブタイドを歿すため、初期の翻訳産物の開裂を導く。宿主微生物のある秤に おいては、適切なリーダー配列の存在によりＥｓｃｈｅｒｌｉｃｈｉａ　ｃｏｌ ｉの場合のように完成したタンパクを細胞周辺腔に輸送できるようにする。ある Ｉ１５母や、ＢａｃｉｌｌｉやＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの場合には、適切なリー ダー配列は、タンパク細胞膜を通って細胞外の培地への輸送ができるようにする 。この状況では、目的のタンパクは、細胞外タンパクから精製できる。

３番目に、本発明によって調装されたプロテアーゼ阻害剤の中のあるものの場合 には、完成されたタンパクを適切なエラスターゼ阻害剤活性をもつ活性性構造を とるように組み込まれる環境のなか、に位置させることに、リーダー配列の存在 が必要である。

それ以上のオペレーショナルエレメントには、そればかりではないが、リボゾー ム結合部位と余所者タンパクの微生物発現のために必要な他のＤＮＡ配列がふく まれる。本発明のより好ま【ノい具体例においては、ＧＡＧＧＣＧＣＡＡＡＡＡ 　（ＡＴＧ　）の配列がリボゾーム結合部位として用いられるであろう。この中 で検討された、オペレーショナルエレメントは、以前の文臥や、ここに含まれて いる教訓に照らしてバイオテクノロジーの普通の技能をもった人々によって至適 りに選ばれる。これらのオペレーショナルエレメントの一般的例は、Ｂ、　Ｌｅ ｗｉｎ、　ＧｅｎｅｓＷｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎ、　Ｎｅｖ　Ｙｏｒｋ　（１９８ ３）に出ており、コレはこの中に参照によって特別に折り込まれている。この中 で考察されているようなベクターは、一部はプラスミツドｐＢＲ３２２そして／ 又はｐＸＱの部分から組立てられる。

現在の発明のより好ましい実ＦＭ態様において、プロテアーゼ阻害剤をコードす る合成りＮＡ配列のすぐ前に、さらにあらたなりＮＡ配列が位置している。この 追加のＤＮＡ配列は、翻訳カップラーとして機能することができる。即ち、それ はりボゾームをそれが隣り合って並んでいるプロテアーゼ阻害剤ＲＮＡのリボゾ ーム結合部位のすぐ隣りにリボゾームを位置させるのに役立つＲＮＡをコードし ているＤＮＡの配列である。本発明の１つの実脳態様において、翻訳カップラー は、ＤＮＡ配列ＴＡＡＣＧＡＧＧＣＧＣＡＡＡＡＡＡＴＧ＾八ＡへＡＧＡＣＡＧ ＣＴ＾ＴＣＧＣＧＡ丁ＣＧＧＡＧＴＧＴＡＡＧＡＡＡＴＧを使用し、翻訳カップ ラーに関連したその道の離退のわざをもった人々にとって現在知られている方法 を使って導き出すことができる。２番目の好ましい翻訳力　−ツブラーはＴＡＡ 　ＣＧＡ　ＧＧ　ＣＧＣＡＡ　Ａ　Ａ　ＡＡ　Ｔ　ＧＡＡ　ＡＡ　Ａ　ＧＡ　Ｃ ＡＧＣＴＡ　Ｔ　ＣＧＣＧＡ　Ｔ　ＣＡＡＧＧＡＧＡＡＡＴＡＡＡＴＧ、のＤＮ Ａ配列をもっている。

上に検討したベクターの、すべての必要なそして望ましい成分要素の合成と単列 ができたところで、ベクターはその道の普通の技能をもつ人々に一般に知られて いる方法によって組立てられる。このようなベクターの組立ては、その道の普通 の技能をもった人々によって遂行される義務的職務の範囲内にあると信じられて おり、そしてそれ自体、特別むずかしい実験をしなくても遂行できる。例えば、 参照として特別に本出願に加えた５ｈｏｎｅｒらＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　 ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　八ｃａｄｅｍｙ　ｏｒ　５ｃｉｅｎｃｅｓＵ、Ｓ、 Ａ、、８１：５４０３−５４０７（１９８４）、において、明らかにされている ように、類似のＤＮＡ配列が適切なりローニングベクターにつなげられている。

本発明のクローニングベクターの溝築において、合成りＮＡ配列の多重コピーと その付随のオペレーショナルエレメントが各ベクターに挿入されるかもしれない ということが、つけ加えて注目されるべきである。このような実ＩＮ態様におい ては、宿主生物は、望まれるプロテアーゼのベクターあたりのより大きな量を生 産するであろう。ベクターの中に挿入され得るＤＮＡ配列の複数のコピーの数は 、結果としてできたベクターは、その大きさのため、適切な宿主微生物に移され たり、その中で複製したり転写されたりする能力によってのみυ１限を受ける。

さらにつけ加えて、ベクターが、薬剤抵抗性マーカーや宿主微生物による特性の 発現の原因となる他のマーカーのような選択可能なマーカーを含んでいることが より望ましい。本発明の特に望ましい実施態様において、テトラサイクリン抵抗 性に対する遺伝子がクローニングベクターに優先的に含まれている。

このような薬剤抵抗性や他の選択可能なマーカーは、部分的にトランスフォーマ ントの選択を容易にすることを意図している。それに加えて、クローニングベク ターの上の、このような選択可能なマーカーの存在は、沢入した微生物が培地中 で増殖するのを防ぐのに役立つかもしれない。この実施態様において、この形質 転換した宿主微生物の純粋な培養は゛、生き残るのにＸ　５４した表現型を必要 とする条件下で微生物を培養することによって１ｑられるであろう。

このようにして得られたベクターは、次に適切な宿主微生物に移される。外生の ＤＮＡを取り込んで、それらの遺伝子や付随するオペレーショナルエレメントを 発現する能力を持った微生物はすべて選ばれてよいと信じられている。宿主微生 物は、油性嫌気性または好気性菌であることがより望ましい。この方法における 使用に好ましい特別な宿主は、酵母と細菌である。特定の酵母は、５ａｃｃｈａ ｒｏＢｃｅｓ　ｍの酵母であり、持に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｖｉ ｓｉａｅである。特別の細菌は、８ａｃｉｌｌｕＪ３、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ 　Ｉａ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｆｊ、のＨＵｉｌ、特に、Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　Ｃｏ１１である。

宿主微生物が選ばれた後、ベクターはその道の普通の技能をもつ人々によって、 一般的に知られている方法を用いて宿主微生物に移される。このような方法の例 は、Ｒ，Ｗ、　Ｄａｖｉｓ　ｅｔ　ａｔ、、”＠菌の遺伝の進歩”、ＣｏｌｄＳ ｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ ｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８０）に見出される。これは、特別に参照として この中にとり込まれている。上に述べたようなオペレーショナルエレメントの使 用を通じて、温度調節が、遺伝子発現を調節する手段として考えられるので、１ つの実施態様において形質転換が低温で起ることがより好ましい。もう１つの実 ｓ態様において、滲透のレギュレーターがベクターに挿入されたならば、形質転 換を通じての塩の濃度の調節が、合成遺伝子の適切なコントロールを確保するた めに必要となるであろう。

組み換えセリンプロテアーゼ阻害剤が終局的に酵母中で発現される場合を考える と、クローニングベクターを、まずＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉに最初に 移すことがより望ましい。

Ｅ、　Ｃｏ１１において、ベクターに増殖を行なわせ、倍増してから取り出し精 製する。ベクターは、次にセリンプロテアーゼ阻害剤の究極的表現のために酵母 の中に移されるであろう。

宿主微生物は、セリンプロテアーゼ阻害剤の発現に対して適切な条件下で培養さ れる。これらの条件は、一般に宿主微生物にとって特異的であり、例えば、Ｂｅ ｒｇｅｙ’　ｓ　Ｈａｎｕａｌ　ｏｒ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａ口ｖｅ　８ａｃｔｅ ｒｉｏｌｏＱＶ、８ｔｈ　Ｅｄ、、　ＷｉｌｌｔａＩＩｌｓ　＆　Ｗｉｌｋｉｎ ｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　ＢａｌＮｍｏｒｅ。

Ｈａｒｙｌａｎｄのような微生物のための生育条件に関する出版された文献に照 らして、この道の普通の技能をもった大人によって容易に決められる。この文献 は参照としてここに特別に組み込まれている。

ベクターの中に挿入された、又は存在するオペレーショナルエレメントすべてに 応じて、ＤＮＡ配列の表現の調節に必要な条件は、すべて形質転換と培養の設問 で効果をもつであろう。１つの実ｍ　ｆｆｆｌ様においては、細胞はＤＮＡ配列 の発現を阻害する適切な調節条件において、高密度迄育てられる。最適の細胞密 度に近づいたとき、環境条件は、合成りＮＡ配列の発現に対して適切な条件に変 えられる。このようにして、プロテアーゼ阻害剤の生産条件は、宿主の細胞がほ ず最適回度に近づいたあとの時期で起り、そして結果として生ずるプロテア−ぜ 阻害剤は、その発現に必要な調節条件が誘起された後、しばらくしてから収穫さ れると考えられる。

本発明のより望ましい実施態様において、組み換えプロテアーゼ阻害剤は、収穫 の後、そしてその活性構造をとる以前に精製される。発明者は、リフオルディン グ済みのタンパクの高収率回収は、タンパクが先ず精製される場合に、容易に得 られると信じているので、この実施態様がより望ましい。しかし、１つのより好 ましい代替的実ｍ態様においては、プロテアーゼ阻害剤は、その活性構造をとる べく、リフオルディングするのにまかせてから精製することがある。ざらにもう １つのより好ましい代りの実施態様においては、プロテアーゼ阻害剤は、培養液 から回収するとき、リフオルディングの済んだ活性な状態で存在している。

ある条件では、プロテアーゼ阻害剤は、宿主微生物での発現、そしてそのタンパ クの細胞壁を通過しての輸送又は膜を通って細胞周辺腔への輸送の際に、そのし かるべき活性な構造をとっている。これは、一般的に適切なリーダー配列をコー ドするＤＮＡが、組み換えプロティンをコードするＤＮＡにつながっていると起 る。プロテアーゼ阻害剤が、その適切な活性構造をとらない場合は、形成したど のジスルフィド結合も、モして／または、どの生じた非共有結合的相互作用も、 変性試薬や還元試薬、例えば、グアニジウムクロライド、−メルカプトエタノー ルによって先ず破壊してから、プロテアーゼ阻害剤をコントロールした条件にお いての希釈及びこれらの試薬の酸化に続いてその活性構造がとれるようにする。

本発明の教示を特定の問題や環境辷応用することは、ここに含まれた知見に照ら して、この道の普通の技能をもった人の能力の範囲内にあるということが理解さ れるべきである。本発明の生産物とそれらの単離、製造に対する代表的工程が以 下の例にみられる。

例　１ 上記のアミノ酸配列、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　Ｃｏ１１の高度に発現性の遺伝 子におけるコドンの使用、及び便利なエンドヌクレアーゼの開裂部位に基いて、 以下のＤＮＡ配列が提案された。

タンパク質をＥ、ｃｏｌｉのペリプラズムに輸送するのに適した形で、プロティ ンの発現を調節するため、以下の調節要素が提案された。即ち、高いレベルにお ける転写のれるべきＩａｃリプレッサー（ｌａｃｌ’）：高いレベルで翻訳をは じめるＯｍＤＡシャインーダルガーノ配列：産物のペリプラズムへの輸送を容易 にするＯｍＤＡリーダー、これらのオペレーターエレメントによってコードされ るタンパクと最初の産物の開裂を指示し、成熟した白血球エラスターゼ阻害剤を 生ずる上述の構造遺伝子によってコードされるタンパクとの間のＡｌａ−３ｅｒ ｆ結のＡｌａである。これらの特徴はすべて、以下のＤＮＡ配列のなかに組みこ まれた。

Ｃ″＝Ｃ＝λ　ＧこτＧＴ　でＧＡＣ入　入ττλＡ　ＴＣＡＴＣＧＣＣＴＣＧ ＴＣτＣＧでλＴλ　Ａ％τＣｉ　ＡＴ入ＡＣＧＡＧＧＣＧＣλＡＡ　ＡＡＡＴ Ｇ　入λλＡＡＣ入ＣλＧ　ＣＴＡＴＣＣ＜ＧＡＹ　ＣＧＧＡＧ　ＴＧＧＣＡ（ ＴＣＧＣＴＧＧＴＴ　ＴＣＧＣＴ　Ａ（Ｃ２ｋＧｃＧｃ　ＡＣＧＣＣ。

タンパクがＥ、　ｃｏｌｉのＩｌ胞質内に止まるような形でタンパクの発現を調 節するために、以下のオペレーショナルエレメントが提供される。即ち、ｔａｃ プロモーター；ｌａｃオペレーター、モしてｌａｃリプレッサー（ｌａｃＩｑ） ：シャインーダルガーノ配列のコンセンサス；そして翻訳の高いレベルを開始す るため、翻訳カップラーとして用いられるべき０ｍ１）Ａリーダーペブタイドの 断片であるａ翻訳カップリング配列は○ｍｐＡ遺伝子の翻訳の開始領域、Ｏｍｐ Ａリーダーペブタイドの最初の５８箇のアミノ酸は、上述のシャインーダルガー ノ配列認識及び翻訳停止を行なう配列をコードするＤＮＡを含む。ｉｌ！訳カッ プリング配列はプロモーターとセリンプロテアーゼ阻害剤遺伝子の翻訳開始部位 の間に、後者と重なって挿入されるべきである。これらの特徴のすべては、以下 のＤＮＡ配列に組み込まれている。

ＣＴＧＣ入　（ｉ（ＴＧτ　ＴＧＡＣＡ　Ａττ入Ａ　ＴＣＡＴＣＧＣＣＴＣＧ ＴＣ’ｆ’ＣＧＴＡＴ入　ＡＴＧτＣＡＴ入ＡＣＧ入ＣａＣＧ（ＡＡλ　ＡＡＡ ＴＧ　ＡＡＡＡＡ　ＧＡＣＡＧ　ＣＴＡＴＣＧＣＧλＴ　ＣＧＧＡＧ　τＧＴＡ Ａ　ＧＡＡＡＴ　Ｇ。

Ａ、　遺伝子断片の溝築 上の配グ１を組み立てるため、次のデオキシリボヌクレオチドがＡＢＩ　’ＤＮ Ａシンセサイザー（Ｆｏｓｔｅｒ　ｃｉｔｙ。

Ｃａ１Ｂｏｒｎｉａ　）を用いて合成される。合成産物は、Ａ　Ｂ　Ｉ　ｉｎｓ ｔｒｕｍｅｎｔ　ｍａｎｕａｌ中に記述しであるように、ポリアクリルアミドゲ ル電気泳肋によって精製される。

それらを、標準の方法に従ってＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５′をリ ン酸化した。

次下のグループのオリゴヌクレオチド配列がフラグメント（断片）Ａａを組み立 てるために使用される。

オリゴヌクレオチドＡａｌは： ＧＣＴＣ；Ｔ　ＴＧＡＣＡ　ＡＴτλＡＴＣλＴ。

オリゴヌクレオチドＡａ２は ＣＧＧＣＴ　ＣＣτλＴ　λ入ＴＧＴ　Ｇ？ＧＧＡ　ＡττＧＴ　ＧＡＧＣＧ　 Ｇ入ＴλＡＣλＡＴτ　で。

オリゴヌクレオチドＡ、ａ３は オリゴヌクレオチドＡａ４は オリゴヌクレオチドＡａ５は ＣλＧＴＧ　ＧＣλＣＴ　ＧＧＣＴＧ　Ｃ；ＴＴＴＣＧＣ”、％ＣＣ’５ＴＡＧ 　Ｃ０ＣｋＧ　ＧＣＣＡＧ　ＣＧＧＴＡ　ＡＡ。

オリゴヌクレオチドＡａ６は ＧＡＧＣ：ｌ：　ＣＡτＧλ　ＴＴＡＡＴ　ＴＧＴ’Ｃλ　ＡＣ，ＡＧＣＴＧご λ。

オリゴヌクレオチドＡａ７は ＴＯＣＧＧ　ＴＣλＣλ　λττＣ′：　ζＣ入Ｃ入　ττ入τλ　Ｃ、オリゴ ヌクレオチドＡａ８は Ｃ；τＣ＝　ττλτＧ　−、’Ｓ？Ｇλ　λＡＴτり　ττλ。

オリゴヌクレオチドＡａ９は ＧＣ’Ｃ，ＩＣ％ＣＣＡ　τＣ５ＣＧ　Ａτ；ｖＧＣＴＧ’ＴＣτ：：　、４： τ７　−ＣＣＧ。

オリゴヌクレオチドＡａ１０は ＡＧＣＴｒ　ＴＴＡＣ’：　ＧＣＴＧＧ　ＣＣＴＧご　ＧＣＴＡＣＧＧＴＡＧ　 ＣＣＡＡＡ　Ｃ：ｌＧＣＣＡＧＴ。

以下のオリゴヌクレオチド配列が、組み立てられ、阿片ＡｂＩｆｉ作られる。

ヌクレオチドＡｂ１は ＧＣＴＧ？　ＴＧＡＣλ　ＡτＴλλτＣｋで。

ヌクレオチドＡｂ２は ＣＣ０（”ｆ’　ＣＧＴＡτ　λへτＣで　ＧＴＧＧ入　λＴＴ（Ｔ　ＧＡＧＣ Ｃｃ、λτλλ　ＣλＡτＴ　τ５ヌクレオチドＡｂ３は （ＡＣＡＣＡＴＡＡＣＣ，λｃｃｃ　ａｗ入＾、　八人。

ヌクレオチドＡｂ４は 入Ｔ（、八人　入λＡＧＡ　ＣＡＣＣＴ　入ＴＣＧＣＣ入ＴＣＧ。

ヌクレオチド△ｂ５は ＣＡＧ’ＴＧ　ＴＡＡＧＡ　ＡＡＴ’ＧＡ　ＧＣＧＧＴ’　ＡＡＡ。

ヌクレオチドＡｂ６は ＧＡＧＣＣ（：ｓ入τＧＡ　ＴＴＡＡＴ　ＴＧＴＣＡ　ＡＣＡＧＣＴＧＣＡ。

ヌクレオチドＡｂ７は ＴＣＧ（ｉＣＴ（ＡＣＡ　ＡＴＴＣＣＡ（ＡＣＡ　Ｔ’ｆ’ＡＴＡ　Ｃ。

ヌクレオチドＡｂ８は ｅｃＴｃＧ　τＴ入τＧ　ＴＧＴＣｉλ　八人ττワ　ττＡ１ヌクレオチドＡ ｂ９は 、λＧＣＴ”　τて、’＋Ｃ”−ＧこτＣＡ　Ｔ”’τＣで　Ｔ、”ｔＣＡ　Ｃ ｉＣにλ　τ二ここＧ　八でＡＧこτＧＴＣτ　ＴＴＴＴＣＡＴττフττＣご Ｃ０以下は、断片Ｂを溝築するために組立てられるオリゴヌクレオチド配列であ る。

オリゴヌクレオチドＢ１は ＡＧＣフτ　ＣＡＡＡＧ　ＣＴ（ＧＣＣＴＡＴＧ　ＣＣＣＣ（：　ＣＣＡＡＡ　 ＡＡＡＴＣＣ’５ＣＧ−オリゴヌクレオチドＢ２は ＣＡＧＴＧ　ＴＣＴＧＣＧＣＴＡＣんυいＡ　ＡＣＣＧｃｓ　入ＡＴＧＣＣＡＧ 。

オリゴヌクレオチドＢ３は τ（（ＣＡ　ＣＴＧＧＣ入ＧτＧＣ（ＣＧＧＧ　τλλＡ入　λＡＣσＴ　τ６ ττＧ（。

オリゴヌクレオチドＢ４は ｃｃｃａ入　ＣＡＣＣＴ　ＧＣＧＧＣＡ”ＣＡＡ　ＡＴＧＣＣＴＯ。

τＡＣＣＣＧＧＧＣＡ。

オリゴヌクレオチドＢ６は ＣＴＧＣＣＡｃ；ＴＣＧ　（ｉＡ（ＴＧ　ＧＣスτＴ　（：（ＣＧＴ　Ｔ’ｆ” １？！”　ＧＴＡＣＣＧ。

オリゴヌクレオチドＢ７は ＣＡＧＡＣＡＣＴＣＣＧＣＣＧＡ　ＴＴ”ｒ’ｒ”τＣＧＧζＧにＧＧ（ＡＴＡ （ＣＣＣＡＧ（τ買ＧＡ。

以下は断片Ｃ’ｅ構築するために用いられるオリゴヌクレオチド配列である。

オリゴヌクレオチドＣ１は ＧＡＴ（ＣＧＧＴ’！’（ｌｉ　ＡＴＡ（ＣＣＣＧＡＡ　ＣＣＣＧ。

オリゴヌクレオチドＣ２は ＡＣＴＣに　ＴＧＣＡ入　八Ａ。

オリゴヌクレオチドＣ３は ＣＣＣ！ＧＧ　ＴＡＡＡτ　ＧＣＣＣＧ　ＧＴＡＡＣＣＴＡＴＧ　ＧＣ。

オリゴヌクレオチドＣ４は ＣＡＧでＧ　ＴＣＴＣ人　τ〔ζτＣ入Ａ（ＣＣＧＣ（ＣＡ　ＡＣ。

オリゴヌクレオチドＣ５は ττＣＴＧ　（Ｇ入λ入　ＴＣＧＡＣＧＧ（口λ　ＧＴＧＴＡ　入ＡＧＯ入　Ｇ ＡＴ。

オリゴヌクレオチドＣ６は ＣＴＡＣＡ　ＴＣＴＧＣＴＴＴＡＣＡ（ＴＣＧ　ＣＣＧＴＣＣＡτＴτ　ＣＧ（ ：ＡＧ　ＡＡＧτで。

オリゴヌクレオチドＣ７は ＣＧＧＣＧ　ＧＧＴＴＣＡＧＣＡＴ　（ＡＣＡＣＡＣＴＧＧ　ＣＣＡＴＡ　ＧＧ ＴＴＡ　ＣＣＣＧＧ　ＣＡ。

オリゴヌクレオチドＣ８は ＴＴＴＡＣＣＣＧＧＴ　ｒｌＴＴＣＧ　Ａ（ＧＡＧ　ＴＯＣＧＧ　ＴＴ。

オリゴヌクレオチドＣ９は ＣＧＧＧＧ　ＴＡＴＣＡ　Ａ（：ＣＧ。

以下のグループのオリゴヌクレオチド配列が組立てられて断片りが作られる。

オリゴヌクレオチドＤ１は Ｃ入τＣτ　６人λＡＴ　Ｇ（：ＴＧτ　入ＴＧＧＧ　ＴλＴＧτ　ｃｃｃａｃ 　。

オリゴヌクレオチドＤ２は ＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧ　ＴＴＴＣＣＣＣＧＧＴ　ＡＡＡＡＧ　ｅＡＴＡＡ　Ｇ。

オリゴヌクレオチドＤ３は ＴＣＧＡＣＴＴＡ’ｒＧ　（Ｔτττ　ＡＣＣＧＧ　ＧＧＡＡＡ　ＣＡＣＡＡ　 ＣＡＴτＴ　ＧＣＣＧＣＡ。

オリゴヌクレオチドＤ４は ＣＡでＡＣＣＣＡＴＡ　（ＡＧＣＡ　ＴＴＴＣＡ。

以下のグループのオリゴヌクレオチドを混合し、標準条件下で７二−リングを行 ない、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて標準条件下で互い同志及び３Ｂ　”ＪＪな制 限酵素エンドヌクレアーゼで切ったクローニング及びケーシングベクターｆｖｌ 　１３　ｍ　ｌ）　１８及び１９につなげる。出来上ったものを、Ｅ、Ｃｏ１１ 　ＪＭ１０５を形質転換するのに用い、目的のＤ　Ｎ　Ａを含むクローンをｆＰ ＴＧ−Ｘｇａｌプレート中での白いプラークから選択し、７二−リングの段落に 用いられたグループから選ばれた３２Ｐでラベルしたオリゴヌクレオチドとバイ ブリドを作ることにより、ざらにスクリーニングを行なう、、挿入ｈ′４造は、 クローン化されたＤＮＡのダイデオキシＪ？ＡＭ配列決定法で確かめた。

グループＡａは、Ｐｓｔｌとｌ−４ｉｎｄｔＩｌで切ったＭ１３ｍｏ１８と１９ につなげられるオリゴヌクレオチドＡａｌ−Ａａ１０を含む。グループＡｂは、 オリゴヌクレオチドＡｂｌ−Ａｂ９を含み、それら番よ、ＰＳｔｌと）ｌｉｎｄ ｌｌｌで切ったＭ１３ｍｐ１８と１９につなげられる。オリゴヌクレオチドＢ１ からＢ７を含むグループＢは、ＨｉｎｃｌｌｌｌはＢａｍＨｆで切ったＭ１３ｍ ｐ１８及び１９につなげられる。オリゴヌクレオチドＣ１から０９迄を含んでい るグループＣは、ＢａｍＨＩとＸｂａｌで切ったＭｌ、３ｍｐ１８と１９につな げられる。グループＤは、オリゴヌクレオチドＤ１からＤ４を含むが、Ｂａｍｔ −１１と３ａｌｌｒ切ったＭ１３ｍｐ１８と１９につなげられる。

Ｍ１３複製型のＤＮＡを、標準的手法によって目的とする挿入ＤＮＡを持ってい るクローンから回収する。グループＡａに相当する挿入ＤＮＡを適切な制限酵素 エンドヌクレアーゼで、Ｍｌ　３ＤＮＡから切り取る。ポリアクリルアミドゲル 電気泳動によって精製する。その構造は以下の通りである。

グループＡｂに相当する挿入ＤＮＡを、制限酵素エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ と）（ｉｎｄｒｆＩ′ｃ″［）ＮＡを切断することにより切り、ポリアクリルア ミドゲル電気泳動で［１する。その構造は、以下の如くである。

ＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴｋＴ）ＪＬＴＧＴＧＴＧＧＡＡττＧＴＧ入ＧＴＡＧＣＣ ＧＡＧＣＡＴＡＴＴＡＣＡＣＡＣＣＴＴλＡＣＡＣＴＣグループＢに相当する挿 入ＤＮＡを♂り限Ｍ素、エンドヌクレアーゼ、ＨｉｎＤＩＩＩと３ａｍＨＩでＤ ＮＡを切断することにより切断することによって切り取り、ポリアクリルアミド ゲル電気泳動で精製する。その構造は以下の通りである。

グループＣに相当する挿入ＤＮＡを３ａｍＨＩと８０１１１でＤＮＡを切断する ことにより切り取り、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製する。その構造は 以下の如くである。

Ｇ入ＴＣＣＧＧＴＴＧＡＴＡＣ（：ＣＣＧＡＡＣＣＣｔｌｌ；ＡＣ？ＧＣＣＡＡ ＣＴＡＴＧＧにＧＣτてＧＧＯＣＴＯＡグループＤに相当する挿入ＤＮＡを制限 酵素Ｓａｕ　ｒ　Ｉ　ｒＡと５ａｌ（でＤＮＡを切断することにより切り取り、 アクリルアミドゲル電気泳動で精製する。

その構造は以下の通りである。

８、　遺伝子の構造 外部への輸送のための粗み立てには、グループＡａ。

Ｂ、Ｃ及びＤを標準条件下で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、Ｌ旦ユＲＩと３ａ ｌｉで切ったＭ１３ｍｌ）１８と１９につなげる。目的の遺伝子を含むクローン はｘｇａ　ｌプレート上の、それらの色で選択され、そしてさらに３２ｐでラベ ルされたオリゴヌクレオチドとバイブリドを形成することによってスクリーニン グする。選択された構造のクローンは、ユニバーサルブライマーを用いてＤＮＡ の挿入区域をダイデオキシ塩基配列決定法により確認する。

細胞質での発現のための組み立てにおいては、グループＡｂ、Ｂ、Ｃ１及びＤか らの挿入配列を合せて、標準条件下でＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて、ＥｃｏＲＴ と５ａｌｌで切ったＭ１３ｍｐ１８と１９につなげる目的の遺伝子を含むりＯ− ンをＸ　ｇａ　ｌプレート上のそれらの色で選び、更に、３２Ｐでラベルした挿 入配列とバイブリドを形成されることによってスクリーニングを行なう。

選ばれたクローンの構造をユニバーサルプライマーを使ってのＤＮＡの挿入区域 をダイデオキシ塩基配列決定法で検へることによって確める。

例　２ 上に述べたアミノ酸配列、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　Ｃｏ１１の高度に発現され た遺伝子におけるコドンの使用と便利な制限酵素エンドヌクレアーゼの切断位置 の規定にもとづいて、以下のＤＮＡ配列が提案された。

ＮｃｉＺ タンパクの発現を調節するために、以下の調節要素が提案される。即ち、高いレ ベルでの転写の開始のためのプラスミドｐＫＫ２２３−３上の１つのｔａｃブＯ モーター、転写のルリ御のためのプラスミツドＤＫＫ２２３−３上の一１ａｃオ ペレーター、Ｅ、　Ｃｏ１ｔの染色体上にコードされるべきｌａｃリプレッサー （ＩａｃＩ９）、高レベルで翻訳を開始する○ｒｎｐＡシャインーダルガーノ配 列、生産物をペリプラズムに運び出すことを助長する○ｍｐＡリーダー、これら のオペレーターエレメントによってコードされるタンパク配列の間のＡｌａ−５ ｅｒ接合のＡｌａ、そして、最初の生産物の、成熟した白血球エラスターゼ阻害 剤を生じるべき開裂を指示する上述の遺伝子によってコードされるタンパク配列 である。

０ｍ　ｌ）　Ａエレメントは、以下のＤＮＡ配列に組み込まれる。

Ｇ入Ａττ　ＣＧＡＴ入　τＣＴＣＧ　Ｔ’ｒＧＧ入　ＧλτＡ’ｆ’　ＴＣＡ で　ｃＡＣ，ＧＴ　ＡＴＴτて　ＧＧＡＴＧ　Ａ丁ＭＣｉ３■fＧＣ ＧＣＡＡＡ　ＡＡＡＴＧ　ＡＡＡＡＡ　ＧＡＣ，ｌＧ　ＧＴＡＴＧ　ＧＣＣ入Ｔ 　ＣＧＣＡＧ　ＴＧＧＣ入ＣＴＧＧＣＴＧＧＴτ　ＴＣＣＣＴ　ＡＣＣＧＩ”　 ＡＧＣＧＣＡＧＧＣＣ。

生成タンパクが、ｌ：、　ｃｏｌｉ　褐朧質に留まる形でのタンパクの発現を調 節するために、次のオペレーショナルエレメントが提案される。即ち、プラスミ ツドＩ）ＫＫ２２３−３上のｔａｃプロモーター、プラスミツドｐＫＫ２２３− ３のｌａｃオペレーターとＥ、　ｃｏｌｉ　５ｔｒａｉｎ　ＪＭ１０７の染色体 上のｌａｃレプレッサー（ｌａｃＩｑ）、コンセンサスシャインーダルガーノ配 列、及び高いレベルの翻訳を開始するため、翻訳カップラーとして用いられるべ きＯｍＤＡリーダーペブチタイドの断片である。

翻訳カップリング配列は、ＯｍＤＡ遺伝子の翻訳開始領域、０ｍ１）Ａリーダー ペプチドの最初の８箇のアミノ酸、上に記述したコンセンサスシャインーダルガ ーノ配列及び９訳読み終り暗号である。翻訳カップリング配列は、ｌａｃオペレ ーターとセリンプロテアーゼ阻害剤のＩ訳開始位置の間に、後者をｉｂて挿入さ れるべきである。

翻訳カップラーの特徴は、以下のＤＮＡ配列に組み込まれている。即ち、 Ｃ入ＡＴＴ　ＣＧＧＴＡ　τＣτＣＧ　ＴＴＧＧＡ　Ｃ入τ、ζτ　’ｒ”ｒｃ ｘτ　ＧλＣＧＴ　ＡＴτＴＴ　ＧＧＡＴＧ　ＡＴＡＡＣＧ`ＧＧＣ ＧＣλ入Ａ　入ＡＡＴＧ　ＡＡＡＡＡ　ＧＡＣλＧ　ＣＴ入τｃｃｒ＝ｃλＴＣ λＡＧＧ　ＡＧλＡＡ　で入ＡＡＴ　Ｇ。

Ｃ９遭伝子フラグメントの構築 上述の配列を組み立てるため、以下のデオキシリボヌクレオチドをＡＢＩ　ＤＮ Ａシンセサイザー（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ　Ｃａ１Ｈｏｒｎｉａ）を使って合成 した生成物を、ＡＢＩインスツルメンタルマニュアルに記述されているように、 ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってＩＩする。それらは、標準的手段によ ってＴ４ポリヌクレオチドキナーゼとＡＴＰを用いて５′をリン酸化する。

以下のオリゴヌクレオチド配列をフラグメント△ａを組み立てるために用いる。

オリゴヌクレオチドＡａ１は ｋｋＴＴＣＧＡＴＡＴＣＴＣＧＴＴＣＧＡＧＡＴＡＴＴＣＡ丁ＧＡＣ’１７ＡＴ ＴＴＴＧＧＡ％λ？ＡＡＣＧ入ＧＧＣＧＣＪＡＡＡ。

オリゴヌクレオチドＡａ２は オリゴヌクレオチドＡ、　ａ　３は ＧＡＴＣＣＩ：ＡＴＣＣＣＧＡτλＧＣＴＧ？ＣＴＴＴＴＴＣＡＴ？”、ＴＴＴ ＧＣ。

オリゴヌクレオチドＡａ４は ＧＣＣＴＣＧＴＴＡＴＣＡＴＣＣλ入ＡＡＴＡＣＧＴＣλＴＧ入ＡＴＡτＣτＣ ＣＡＡＣＧＡＧＡＴＡＴＣＧ。

オリゴヌクレオチドＡａ５は Ｇ八でＧＧＧ入でＣＧＣＡＣＴＧＧＣ入ＣＴＧＧＣＴＧＧτττＣＧＣ’：入Ｃ ＣＧＴ入ＧＣＣＣ八へＧＣＣτＣτＧＧτλλＡ。

オリゴヌクレオチドＡａ６は λＧＯＴτＴτλＣＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＣ（：ＣＴＡＣＧＧＴＡＧＣＧＡＡＡ ＣＣＡＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＣＴＧＣＧＡＴＣＧ−以下の、オリゴヌクレオチド 配列を組立て、断片Ａｂをつくり上げる。

オリゴヌクレオチドＡＩ）１は ＡＡＴＴＣＧＡＴ−％ＴＣＴ（ＧＴＴＧＧＡＧＡＴ八ＴＴＣＡＴＧＡへＧＴＡＴ ＴＴＴＧＧＡＴＧＡＴＡＡＣＣｉＡＧＧＣＧＣＡＡＡＡ、オリゴヌクレオチドＡ ｂ２は 入ＴＧＡＡＡＡＡＧＡＣＡＧＣＴＡＴＣＧＣＣＡＴＣＧ。

オリゴヌクレオチド八ｂ３は ＧＡ’ｌ’ＣＣＧＡＴＣＧＣＧＡＴＡＧＣ＋ｒＧＴＣＴＴ’ｌ’ＴＴＣλＴＴＴ τττ（６゜オリゴヌクレオチドＡｂ４は ＧＣＣＴＣＧＴＴＡＴＣＡτ（ＣλＡＡＡＴＡＣσＴＣＡＴＧ入ＡＴλＴＣτＣ ＣλＡＧＧ入ＧＡ？ＡでＣＧ。

オリゴヌクレオチドＡｂ５は Ｃ入ＡＧＧＡＧＡＡＡＴ、ｖＩＡＴＧＡＧＣＧＧＴＡＡＡ。

オリゴヌクレオチドＡｂ６は ＡＧＣτττＴＡＣＣＧＣＴＣＡＴＴＴＡττＴＣＴＣＣＴＴＧＡＴ。

以下は、断片Ｂを構築するために組み立てられるヌクレオチド配列である。

オリゴヌクレオチドＢ１は ＡＧＣＴＴ　ＣＡＡＡＧ　ＣＴＧＧＣＧＴＡＴＧ　ＣＣＣＧＣＣＧＡＡＡ　ＡＡ ＡＴＣＣＧＣＧ。

オリゴヌクレオチドＢ２は ＣＡＧＴＧ　ＴＣ−、ＧＣＧＧＴＡＣＡ）ｊ’−Ａ入　ＡＣＣＧＧ　ｋＡＴＧＣ ＣＡＧ。

オリゴヌクレオチドＢ３は τＣＣＧＡ　ＣＴＧＧＣＩＧＴＧｃ　ＣＣ：ＧＧＧ　τ％Ａ；Ｄ　ＡＡＣＧでＴ （、ＴＴＧ　Ｃ。

オリゴヌクレオチドＢ４は ｃｃｃａＡ　ｃｘｃｃτ　ＧＣＧＧＣＡＴＣＡＡ　ＡＴＣ（Ｃ７Ｇ。

オリゴヌクレオチドＢ５は ＧＡＴＣ（：　ＡＧＧＣＡ　ＴＴＴＧ入　ＴＧＣＣＧ　ＣＡＧＧＴ　ＣＴＧＣＣ ＧＧＣＭ　ＣＭ（：Ｇ　τＴＴＴτオリゴヌクレオチドＢ６は ＣＴＧＣＣＡＧＴＣＧ　ＧＡＣＴＧ　ＧＣλτＴ　（ＣＧＧＴ　τ曹ゴ”ＴＧで ＡＣＣＧ。

オリゴヌクレオチドＢ７は ＣＡＧＡＣＡＣＴＧＣＧＣＧＧＡ　τＴττＴ　’Ｉ”（ＧＧＣＧＧＧＣＡ　Ｔ ＡＣＧ（ＣｋＧＣＴ　ＴＴＧ入。

以下は断片Ｃを組み立てるために使用されるヌクレオチド配列である。

オリゴヌクレオチドＣ１は オリゴヌクレオチドＣ２は オリゴヌクレオチドＣ３は ＣＣＧＧＧ　ＴＡＡＡτ　ＧＣＣＣＧ　ＧＴＡＡＣＣＴＡＴＧ　ＧＣ。

オリゴヌクレオチドＣ４は オリゴヌクレオチドＣ５は Ｔτ（ＴＯＣＧＡＡＡ　ＴＧＧＡＣＧＧＣ（Ａ　ＧＴＯでＡ　ＡＡＣＧ入　ＧＡ τ。

オリゴヌクレオチドＣ６は ＣＴＡＧＡ　Ｔ（Ｔ（ＣＴＩ’ＴＡＣＡＣＴＧＧ　ＣＣＧ’Ｉ’（ＣＡτττ　 （：ＧＣＡＧ　入ＡＧＴτ。

オリゴヌクレオチドＣ７は ＣＧＧＣＧ　ＧＧＴＴＣＡＧＣ入Ｔ　ＣＡＧＡＣＡＣＴＧＧ　（：（Ａτ入　Ｇ ＧττＡ　ＣＣＧＧＧ　ＣＡ。

オリゴヌクレオチドＣ８は τＴτλＣＣＣＧＧＴ　ＴＴＴＣＧ　ＡＣＧλｃ　’ｒｃｃｃｃ　ττ。

オリゴヌクレオチドＣ９は 以下のグループのオリゴヌクレオチドが断片りを形成するために組立てられる。

オリゴヌクレオチドＤ１は ＧＡＴＣＴ　ＧＡＡＡＴ　ＧＣＴＧＴ　ＡＴＧＧＧ　ＴＡＴＧＴ　ＧＣＧＧＣ− オリゴヌクレオチドＤ２は ＡＡＡＴＣでτＧＴＧ　ＴＴＴＣＧ　（：ＣＧＧ”ｌ”　ＡＡＡＡＧ　ＣＡＴＡ Ａ　Ｇ。

オリゴヌクレオチドＤ３は ＴＣＧＡ（：　Ｔ？Ａ？Ｇ　ＣＴＴ’ｆ’Ｔ　ＡＣＣＧＧ　ＧＧＡＡＡ　ＣＡＣ ＡＡ　ＧＡＴ’ｌ”Ｉ’　ＧＣＣＧＣＡ。

オリゴヌクレオチドＤ４は （ＡＴＡＣＣＣＡＴＡ　ＣＡＧＣ入τＴＴＣＡ。

以下のグループのオリゴヌクレオチドを混合し、標準条件下で７二−リングを行 ない、互い同志で、又、適当な制限酵素エンドヌクレアーゼで切ったクローニン グ及び配列形成ベクター〜１１３ｍｐ１８と１９に、標準条件下で７４ＤＮＡリ ガーゼを用いてつなげる。この生成物は、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０５を形質転換 するのに用い、目的のＤＮＡを含むクローンをアニーリングの段階で用いられた グループから選ばれた３２ｐでラベルされたオリゴヌクレオチドとハイブリッド を形成することによって選ぶ。挿入構造は、ユニバーサルプライマーを用いて、 り□ローン化したＤＮＡのダイオキシ塩基配列決定法により確める。

オリゴヌクレオチドＡａｌ−Ａａ４を、ＥｃｏＲＩとにつなげる。目的の挿入Ｄ ＮＡを持つＭ１３複製型ＤＮＡを標準的手法によって回収する。、挿入ＤＮＡは 、Ｍ　１３　Ｄ　Ｎ　Ａを制限酵素エンドヌクレアーゼＥＣ０ＲＩとＰｖＵ　１ で切断することによりＭ　１３　Ｄ　Ｎ　Ａから切り出し、ポリアクリルアミド ゲル電気泳動で精製する。その構造は以下の通りである。

ＡＡＴ’ＴＣＧＡＴ八τＣＴＣＧＴτへＧＡＧＡＴＡＴＴ（ＡτＧＡｃｃＴ′Ａ τＴＴＭＧＡＴＧ入ＴＡＡＣＧ入ＧＧＣＧＣｋｆｉＡｋＡＡsＧλ ＧＣＴＡＴＡＧＡＧＣＡＡ（ＣＴＣＴＡＴＡＡＧＴ入ＣＴＧＣＡＴＡＡＡＡＣＣ ＴＡＣＴＡＴＴｃ（τＣＣＧＣＧττττＴＴＡＣでＨｉｎｄｌｌｌで切ったＭ １３ｍＤ１８とＭ１３ｍｌ）１９につなげる。目的とする挿入ＤＮＡをもったＭ １３複製型ＤＮＡは、標準的手法によって回収される。挿入ＤＮＡを制限酵素ｐ ｖｕ）とＨｉ　ｎｄ　Ｉ　Ｉ　ＩでＤＮＡを切断することによりＭｌ　３ＤＮＡ から切り出し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製する。その構造は以下の 如くである。

ＴＡＧＣＧＴＣＡ（ＣＧ丁ＧＡＣＣＧＡＣＣλ入ｋＧＣＧλ’ｒａＧｅ入τＣＧ ＣＧＴＣＣＧＧ入ＣＡＣ（：λでττＴ（ＧＡこのＰｖｕ　Ｉ−Ｈｔ　ｎｄ　Ｉ 　Ｉ　ＩＩ片をオリゴヌクレオチドＡａｌ−Ａａ４から調製した断片と結合させ 、ＥＣ０ＲＩとＨｉｎｄＴＩＩで切ったＭｌ　３ｍｌ　８またはＭ１３ｍｐ’１ ９とつなぐ、目的の挿入ＤＮＡを持つＭ１３複製型ＤＮＡを標準的手法で回収す る。挿入ＤＮＡを、これはＤＮＡ断片Ａａであるが、制限酵素ＥＣＯＲ１とＨｉ ｎｄＩＩＩでＭ１３ＤＮＡを切断することによりＭｌ　３ＤＮＡから切り出し、 ポリアクリルアミドゲル電気泳動゛で精製する。その間道は以下の如くである。

ＡＡＴτＣＣＡＴＡ’ｌ’（：ＴＣ（ｉＴＴＧＧＡＧＡＴＡττＣＡτＧＡＣ（ ７１’ＡＴＴでτＧＧＡＴＧ入ＴＡＡｃｃＡｃａｃｃｃ入Ｍ`ＡＡＴｃ ＧＣＴｋＴＡＧλＧＣＭＣＣτＣτＡＴＡＡＧＴＡＣＴＧ（λＴ入入ＡＡ（：Ｃ τ入Ｃτ入丁τＱＣτＣ（ＧＣＧＴτＴＴτでＡＣオリゴヌクレオチドＡｂｌ− Ａｂ４をＥＣＯＲＩと比立皿ＨＩで切ったＭ１３ｍ１８とＭ１３ｍｌ）１９につ なぐ。目的の挿入ＤＮＡを持ったＭ１３複製型ＤＮＡを標準的手法で回収する。

挿入ＤＮＡを制限酵素ＥＣＯＲＩとｐｖｕ　ｌでＭ１３ＤＮＡから切り取リポリ アクリルアミドゲル電気泳動で精製する。その構造は以下の如くである。

このＥｃｏＲＩ−Ｐｖｕ　Ｉ断片をオリゴヌクレオチドへｂ５−八ｂ６と合し、 ＥＣ０ＲＩとＨｉｎｄｌＩＩで切ったＭ１３ｍｐ１８またはＭ１３ｍＤ１９とつ なぐ。

目的の挿入ＤＮＡを持ったＭ　１３辺製型ＤＮＡを、標準的手法により回収する 。断片Ａｂである挿入ＤＮＡを、制限酵素ＥＣ０ＲＩとＨｉｎｄｌｌｌ″ｒＤＮ Ａを切断することによってＭｌ　３ＤＮＡから切出す。そして、ポリアクリルア ミドゲル電気泳動により精製する。その構造は如何の如くである。

ＡＡＡＡＧＡＣλＧＣ’ｌ”ＡＴＣＧＣＧ入τＣＭＧＧ入ＧλＡＡτ入ＡＡτＣ 入ＧＣＧＧτＡＡＡ？Ｔ’ｔ”ＴＣＴＧ”Ｉ’ＣＧＡ？ＡＧＣＧＣτλＣττＣ ＣτＣＴ−τへτＴＴへＣＴＣＧＣＣ入τ’ＴＴτＣＧ入オリゴヌクレオチドＢ １から８７までを含むグループ８を）−１ｉｎｄ［ＩＩと１３ａｍＨｆで切った ｆｖ１１３ｍｌ）１８と１９につなぐ。グループＢに相当する挿入ＤＮＡを制限 酊素、エンドヌクレアーゼＨｉ　ｎｄ　ｒ　ｒ　ＩとＢａｍＨＩでＤＮＡを切断 することにより切出し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製する。そ の構造は以下の通りである。

）ＡＧＣＴＴＣＡＡＡＧＣＴＧＧＣＧＴｋＴＧＣＣＣＧＣＣＧ入ＡＡｃｃｃａ入 ＡＴＧＣＣＡＧτＣＣ（ｉＡｃτＣＧ（ＡＧτＣＣτ’Ｉ’ＴＣＧ（ＣＴ’！’ ＡＣＣＧＴ（ＡＧＧＣＴ（ｉＡｃｃｉｃＡｃＧＣＣＧＧσシυす訊ＡＡＣＧＴτ ＧＴ’ｒＧ（ＣＣＧＧＡＣＡ（：（ＧＧ（ＣＣＡ２ＧＣＡＡＣＡＡＣＧＧＧＣＣ ＴにＴＧＧτａｃｃｃｃ入τＣＡＡＡτＧＣＣＴＧＡＣＧＣＣＧＴＡにＴττＡ ＣＣＧＡＣ（：ＴＡＧオリゴヌクレオチドＣ１からＣ９を含・むグループＣを３ ａｍＨ１とＸｂａ　Ｉで切ったＭ１３ｍＤ”１８と１９につなぐ。グループＣに 相当する挿入ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨｒとＢａｆＩＩでＤＮＡ ＠切断することにより切り出し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製する。

その構造は以下の如くである。

Ｇ；ＡＴＣＣＧＧＴＴＧＡＴＡＣＣＣＣＧｋＡＣＣＣＧＡＣＴＧＣＣＡＡＣＴＡ でＧＣＧＯＣＴ？ＣＧＯＣＴ（、ｔＣＧＴＣＧＡＭＡＣＣＧＧＧＴＡＡＡＴＧＣ ＣＣＧＧＴｋＧＣＡＧＣＴτττＧＧＣＣＣＡＴＴＴＡＣＧＧＧＣＣＡτＡＣＣ ＴＡＴＧＧＣＣＡＧＴＧ？ＣＴＣＡＴＧ（ＴＧＡＡＣＣＣＧτＧＧＡＴＡ（（Ｇ ＧＴＣＡＣＡ（ｌｉＡＣＴＡＣＧＡＣＴ？ＧＧＧＣＣＣｃλＡ（’！’ＴＣτＣ ＣＣλλλτＧＧＡＣＧＧＣＣＡＧτＧτＧＧＣττＣλλＣλＣＧＣτττ入 ＣＣτｃｃｃａｃτＣ入ＣＡオリゴヌクレオチドＤ１からＤ４までを含むグルー プＤをＢａｍＨＩと５ａｌｔで切ったＭｌ　３ｍｐ１８と１９につなぐ。グルー プＤに相当する挿入ＤＮＡを、♂１１限醪素、エンドヌクレアーゼ５ａｌｌでＤ ＮＡを切断することにより切り出し、アクリルアミドゲル電気泳動で精製する。

その構造は以下の如くである。

ＡＣＧＣＣＧ’ＴＴＴＡＧＡＡＣＡＣＡＡＡＧＧＧＧＣＧＴＡＡＡＡＧＣＡＴＡ ＡＧ ＣＡ丁τττＣＣｆｆＴ入ＴＴＣλＧＣτＤ、遺伝子の構築 外部への輸送のための組み立てにおいては、グループＡａ、Ｂ、Ｃ及びＤからの 挿入配列を合し、ＥＣＯＲＩとＳａｌ［で切ったＭ１３ｍｐ１Ｂと１９にＴ４Ｄ ＮＡリガーゼを用いて、標準条件下でつなぐ。細胞質中での発現のための組み立 てにおいては、Ａｔ）、Ｂ、Ｃ及びＤからの挿入配列を合し、ＥｃｏＲ１，！： Ｓａ　Ｉ　Ｉで切ったＭ１３ｍｐ１８及び１９とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて、 標準状態でつなぐ。目的の遺伝子を含むクローンを、それらのＸｇａ＋プレート 上での色で選び、さらに３２Ｐにラベルしたオリゴヌクレオチドとバイブリドを 作ることによりスクリーニングを行なう。選んだクローンのＩ　３ｉｆｆを、ユ ニバーサルプライマーを用いてＤＮＡの挿入領域のダイデオキシ塩基配列決定法 を行なうことにより確か発現ベクターの組み立て 外部への輸出用と細胞質内発現用の組み立てに対する挿入配列を、次の如く発現 プラスミドに８ｔ０所用の挿入ＤＮＡをもった〜ド３増殖型ＤＮＡを、上述の如 く標準型手法で回収する。適切な挿入ＤＮＡをゐり限醪素、エンドヌクレアーゼ 、ＥＣＯＲＩとＰｓｔｌで切って取り出し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で 精製する。次に、それを制限ＶｔＮ、エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＪとＰｓｔｌ で切ったｐＫＫ２２３−３につなぎ、その結果生じたプラスミドをＥ、Ｃ０１ｌ 　Ｊ〜１１０７にクローニングする。外部輸送用の例４と５における使用のため の構造は、ＰＳＧ巳６であり、原形質発現用の例７における　”使用のための構 造は、ｐｓＧＥ８である。例４，５における外部への輸送に対するＥ、　ｃｏｌ ｉの株はＳＧＥ　１０であり、ｌＷ６における細胞質発現に対する株は、５ＧＥ ３０である。

Ａ、ｏｓＧＥ６の編成 プラスミドｐＳＧＥ６をｐＫＫ２２３−３のｉ旦ユＲｒとＰＳｔ［の位置の間の ＤＮＡを、○ｍｐＡｓＬＰＩをコードするＤＮＡを含むＥＣＯＲＩ／ＰＳｔｌ断 片で置きかえることによって組立てた。

０ｍ１）Ａ−３ＬＰ　［のＤＮＡ配列は次の如くである。

４コ０　４４０　４５０　４６０ コレカラ後、”　Ｏｍ　ｐＡ　−Ｓ　Ｌ　Ｐ　Ｉ　″と呼ぶ配列は、上に）ホベ た外部への輸送のためのＭ１３ｍ１８の最柊冶造からのＤＮＡである。プラスミ ドｐｓＧＥ６は、図１に描かれている。図１において、ＯｍｐＡＳＳ−８ＬＰＩ に対する最初のコドンは、ｏｍｐＡ−３ＬＰＩ“と呼ばれるＤＮＡ配列の６２− ６４の位置にある。成熟した５ＬＰＩに対する最初のコドンは、１２５−１２７ に位置している。ｐｔａＧは、ｔａｃプロモーター、ｌａｃオペレーター及びベ ーターガラクトーゼ５ｈｉｎｅ　／　Ｄａ１ｇａｒｎｏ配列のためのＤＮＡを含 んでいる。

略号、Ｒ１，ＰＳｔ及びＢａｍは、制限酵素、ＥｃｏＲＩ、Ｐｓｔｌ及びＢａｍ ＨＩに対するＨ　、１配列である。７ｅｔ’は、テトラサイタリンに耐性を附与 するｐＢＲ３２２の遺伝子の一部であり、ａｍｐ　は、アンピシリンに耐性を附 与し位ｆｆ１６４１６から６８４０までのｒｒｎＢオペロンからのＤＮＡを、Ｔ ｅｔ’は含んでいる。矢印は転写の方向を示している。

Ｂ、　ｐＣＪ−ｏｍｐＡ−３ＬＰＩの編成プラスミドＤＣＪ−ｏｍｐＡ−５ＬＰ 　Ｉは、部分的でなく完全なテトラサイクリン遺伝子およびプロモーターを含ん でいることを除いては、ｐｓＧＥ６と同じである。

このプラスミドは、　Ｅ、　ｃｏｌｉに挿入すると、テトラサイクリン耐性を附 与し、Ｏｍｐ　ＡＳＬＰＩをコードするＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ／Ｐｓｔ　Ｉ断 片が、ベクターＤＫＫ２２３−３ではなく、ベクターｐＣＪ　１にクローニング されるということを除いて、ｐｓＧＥ６に対するのと履似のやり方で組立てられ る。ベクター１）ＣＪｌは以下の如＜ｈｌｉされる。プラスミドＣＩＫＫ２２３ −３をＳｐｈ　Ｉで完全に、ＢａｍＨＩで部分的に酵素分解した。

４．４Ｋｂｐ断片をゲルで精製し、合成アダプターＧＡＴＣＴＡＧＡＡＴＴＧＴ ＣＡＴＧ丁ＴＴＧＡＣＡＧＣＴＴＡＴＣＡ丁ＡＴＣＴＴＡＡＣＡＧＴＡＣＡＡＡ ＣＴＧＴＣＧＡＡＴＡＧＴＡＧＣ及ヒ、ｐＢＲ３２２（ＰＬ　８ｉｏｃｈｅｍｉ ｃａｌｓ、　２７−４８９１−０１）のｔｅｔ　遺伝子のＣ１ａｌ比且１１によ る消化物からのＤＮＡの５３９ｂｐの断片と組み合せた。

ように、ｉｌｌ胞賀における発現のための最終的なＭ１３ｍｐ１８構造物に由来 する。ｍｐＡ−ｔｃ−ｍｅｔ−３ＬＰＴと呼ばれる配列を含んでいることを例遺 転子組成である。この配列は、Ｅ、　ｃｏｌｉの細胞質の中にメチオニル−８Ｌ ＰＩの合成を導く。ｐｓＧＥ８の部分的図式は、図２の中に含まれている。”Ｏ ｍｐＡ−ｔｃ−ｍｅｔ−３ＬＰＩ“と呼ばれるその配列において、ｏｍｐＡに対 する開始コドンは、６２−６４の位置にあり、停止コドンは９５−９７にある。

そして、メチオニル−３ＬＰＩに対する開始コドンは、９８−１００にある。ｏ ｒｒｒｐＡ−ｔｃ−ｍｅ　ｔ−８ＬＰ　ＩのＤＮＡ配列は次の如くである。

プラスミドｐｃＪ−ｍｅｔ−３ＬＰ　Ｉは、それが（部・９的ではなく）完全な テトラサイクリン耐性遺伝子を含んでいることを除けば、１）ＳＧＥ８と同じで ある。ブラミドＣＪ−ｍｅｔ−３ＬＰｌは、ｏｍｏＡ−ｔｃ−ｍｅｔ−３ＬＰＩ をコードするＥｃｏＲＩ／Ｐｓｔ　ｌｌｌｌｉ片がベクターｐＫＫ２２３−３で はなく、ベクターｐｃＪ　１にクローニングされたことを除けば、１）ＳＧＥ８ と同様に組立てられた。

プラスミドｐＵＣ８をＨｉｎｄｌｌｌで醇素分解し、比重ｎｄ　Ｉ　Ｉ　［／Ｓ 二旦■アダプターにつなげた（Ａｍｅｒｓｈａｎ、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、ＤＡｌ　 ００６から得た）。このアダプターを１４ｉ二ｄｌｌＩサイトに加えても、スミ ド、即ちＨｉ　ｎｄ　Ｉ　Ｔ　■の位置から１Ｑｕｌの間のポリリンカーにおい て制限酵素による切断の位置を欠いているプラスミツドが、トランスフォーマン トから単離したプラスミツトＤＮＡを、ＥｃｏＲ［、Ｓｍａ　１もり、。

くはＨｉｎｄＩｒｌで消化することによって同定された。

Ｈｉｎｄｌ１１部位を欠いていたが、ＥＣＯＲ１部位とＳｍａ１部位を含んでい たプラスミドを含んでいるトランスフォーマントがこの方法で同定された。この プラスミドがｐＧＳ１８５である。

酵母のＭ　Ｆ’ｌ遺伝子を含有しているＥＣ０ＲＩ断片を、この中に特に参照文 献として加えである、Ｊ、　Ｋｕｒｊａｎ　＆１、　Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ　ｉ ｎ　Ｃｅ１ｌ　３０　：　９３３　（１９８２）によって記述されたように、プ ラスミドｐＣＹ１７からゲル電気泳動でｖＩ製され、ＥＣＯＲ［によって切った １）ＧＳ１８５につなげた。プラスミドのＤＮＡをトランスフォーマントから単 離した、正しい挿入ＤＮＡの存在は、ＥＣ０ＲＩでＤＮＡを消化することによっ て確かめられた。これが、プラスミドｐＧｓ２８５であり、図３に描かれている 。

Ｋｕｒｊａｎ　＆　Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ　１（同前）によって認められたよう に、ＭＦ１ｍ仏子中の内部の４個のＨｉｎｄｌｌＩ部位の中の３箇を除去するた めに、プラスミドｐＧＳ２８５をＨｉｎｄｌｌｌで完全に消化し、そして再びつ なげた。正しい構成は、上に述べたように選ばれた。これが、プラスミドｐＧｓ ３８５である。

例２において記述したように、合成ＳＬＰＩｍ伝子の４転子１０７迄のアミノ酸 をコードするヌクレオチド配列になっているＭ１３ＡａＢＣＤを、）ｌｉｎｄＩ Ｉ［ｔ’消化した。このＤＮＡを以下のオリゴヌクレオチドアダプターにつなげ た。

５°　ＧＣＴ　ＧＡＡ　ＧＣＴ　ＴＣＡ　ＧＧＴ　ＡＡＧＣＧＡ　ＣＴＴ　ＣＧ Ａ　ＡＧＴ　ＣＣＡ　丁ＴＣＴＣＧＡ。

このアダプターは、２つのオリゴヌクレオチドのアニーリングによって形成し、 ５’　ＧＣＴ　ＧＡＡ　ＧＣＴ　ＴＣＡ　ＧＧＴ　ＡＡＧ及び５°ＡＧＣＴＣＴ 　ＴＡＣＣＴＧ　ＡＡＧ　ＣＴＴ　ＣＡＧＣ先づ２分間７０℃に保ち、続いて、 −夜かかつて徐々に冷す。

このアダプターをＨｉｎｄｌｌｌで切ったＭ１３ＡａＢＣＤにつなげた後、結合 混合物は、Ｈｉ　ｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉと５ａｌｌで消化して、アガロースゲル電気 泳動とエレエクトロリューションによってｆｉｌした１つの断片を与えた。この 断片を、もう一度比重二ｄｌｌ＋で消化し、それから比重二ｄｌｌｌど５ａｌｌ で切っておいたＤＯ３３８５につないだ。

［、ｃｏｌｉ　ＨＢｌｏｌを結合混合物で形質転換し、アンピシリン耐性トラン スフォーマントを選んだ。正しい挿入ＤＮＡを持ったプラスミドを含むトランス フォーマントを、プラスミドＤＮＡを調整し、それをＨｉｎｄｌｌｌと５エａｌ ｌで消化することにより同定した。この方法で組み立て、単離したプラスミドを ｏＧｓ４８５と命名した。そして、これは図４に描かれている。このプラスミド は、構成成分としてＭＦ　１ｍ伝転子最初のスペーサー領域におけるＨｉｎｄｌ ｌ！切断部位において合成ＳＬＰＩｍ伝子に融転子たＭＦ１遺伝子を含んでいる 。このような構造体は、ｆｇ母に入れた場合、特別に参照としてここに加えた。

Ａ、　Ｊ、　ＢａｋｅらＰＮＡＳ　ｌｌ５Ａ）　８１　：　４６４２によって示 されたように、異秤タンパクの合成、プロセシング、分泌を導くことが示された 。ＭＦ　１ｍ伝転子５ＬＰＩの融合が、ＤＧＳ４８５中の１旦ＯＲ１断片に含ま れている。このＥＣ０ＲＩ断片を実施例８に記したように、ベクターＹＩｐ５の 中へクローニングした。

λ−Ａ プラスミドｐｓＧＥ６を用いての分泌白血球プロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰ［）の 発現とＩ’ＦＪ。

プラスミドｐｓＧＥ６　（ＳＧＥｌ　０１１胞）を含んでいるＥ、　ｃｏｌｉ細 胞を、２％トリプトン、０．５％醇母エキス、２０！Ｊ／ｆｆｌグルコース、２ ００ＩＲｇ／ＪビタミンＢ１及び１ｏＯη／１アンピシリンを加えた１０１の〜 １９培地中で、６時間培養した。Ｉ　ＰＴＧを０．２１１１８加え、更に６時間 培養を続けた。Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＳＧＥ　１０の細胞１０１を１８，０ＯＯＸ！ ７で遠心してベレットにして８ｇ／ｌを＋ｉで、５０ｍＨトリスー塩Ｗ　（１） ８７　、５　＞　４ｍＨＥＤＴＡ緩衝液（今後７５０Ｅ４と略称する）に再び懸 濁してからベレットにした。このベレットを２．７１のＴ５０Ｅ４に再び息濁し 、１５０ｄのロットずっ凍結した。これらのロット８箇（ｌ胞３６ｇに相当する ）をまとめて１２．ｏｏｏｐｓ＋　、４℃でフレンチプレスを１回通してベレッ トをくずした。くずしたものを、２０，０００ｘｇで１．５時間遠心分離した。

細胞からなる不溶物（６ｇの細胞に等しい）を含むベレット　１／６を１２５ｄ のＴ５０Ｅ４で２度洗い、残った物質を一夜凍結した。

凍結ベレットを、２０１ＨのＤ　Ｔ　Ｔ　（Ｓｉｇｍａ、　Ｃａｔ、　Ｎｏ。

Ｄ−０６３２から入手）、４ｍＨのＰ　Ｍ　Ｓ　Ｆ　（Ｓｔｇｍａ、　Ｃａｔ。

Ｎｏ、Ｐ−７６２６）及び８Ｍ尿素（超高純度、ＢＲＬ。

Ｃａｔ、Ｎｏ、　５５０５　Ｕ　Ａ　）を含む２５ｍの１００ｍＭｔ−リス−塩 酸＜ｌ（Ｂ、０＞と４１のＥＤＴへ（今後、Ｔｌ　００Ｅ４と略称する）で、３ ７℃、１時間抽出し、１０，０００ｘｒｉで１０分遠心した。得られた上澄みを 、あらかじめ２０＋１４のＤＴＴと８Ｍ尿素を含む抽出緩衝液Ｔ１００Ｅ４で平 衡処理（Ｐｒｅ−ｅｑｔｌｉｌｌｒａｔｅｄ）　Ｌ　Ｔおいた１ｏｍｌの上澄み を除いたセファデックス５ｐ−ｃ２５（ＰｈａｒｍａＣｉａから入手）と混ぜ、 ローラーの上で３７℃で１０分混合し、ＳＬＰ　ＩをＳＰ−セファデックスに吸 収させる。

吸収させた５ＬＰＩを含んだ樹脂を１０分間３．０００Ｘ９で遠心してベレット とし、上澄みをデカントした。

残ったセファデックスを２０偏ＨのＤＴＴと８Ｍ尿素を含む２５−のＴ１００Ｅ ４で２回洗ってから２０偏ＨのＤＴＴを含む、２５ｄのＴ１００Ｅ４で２回洗っ た。次にセファデックスを１回、２Ｑｍ）ＩのＤＴＴと０．３Ｍの食塩を含む２ ５ｄの７１００Ｅ４で抽出した。この抽出物は、約０．１５η／ｄのタンパクと 、０．０４η／ｄ以上の５ＬＰＩを含んでいた。この方法で得た５ＬＰＴは、高 圧液体クロマトグラフィーにより７０％以上の純度であることが確定された。

例　５ 例４の方法を用い、２番目の凍結ペレットを最初のＴ１００Ｅ４／ＤＴＴ／ＰＭ ＳＦ／尿素の代りに、１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ　Ｃａｔ、Ｎ ａＴ−６８７８から入手）を含む７１００Ｅ４で抽出した。（７られたＳＬＰ　 ［は、例４でｑられたものより僅かに純度が高く、例６において述べるリフオル ディング・アッセイにおいて、より高い活性があった。

例　６ 精製ＳＬＰ　ｒのリフオルディング 例４または５からの約４０μｓの部分的に精製した５ＬＰＩを尿素中８Ｍ、もし くはグアニジン１！酸塩中５Ｍ　（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、＋ ’　＃２４１１０）、そしてＤＴＴ中４ｍＨとして、室温で１時間装置した。酸 化型グルタチオン（Ｓｉｇｍａ、　Ｃａｔ、　ＮαＧ　−４６２６）を１３．５ ｍＭになる迄加え、混合物を再び室温で１時間温買した。混合物をａｌｌｌｏ、 ７の５０ＩｌｌＨトリス溶液で１０倍稀釈し、更に室温で４時間装置した。

それから、混合物をｐＨ８，０の５０１１１Ｈトリスと０．１５Ｍ食塩で５倍に 稀釈し、Ｉ）Ｈ８，Ｏの５０ＩＩＩＨトリスと、０．２５Ｍ塩化ナトリウムで前 もって平衡させた、セファデックス５Ｐ−０２５の１×２ｃｒ１１カラムにかけ た。

樹脂を０．２５Ｍの塩化ナトリウムを含むｐＨ８，０の５Ｏｎｌｌリスで洗い、 それから０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む、ｐＨ８，０の５０ｍＨトリスで洗っ た。０．５Ｍの塩の洗滌で溶出する区分は、十分に活性であり、カラムにかけた ＳＬＰ　ｒの約３０％を呈している。

例　７ ＳＧＥ３０細胞融解物の可溶区分不溶区分からの５ＬＰＩの精製。

Ｅ、ｃｏｌｉ　ＳＧＥ３０ｍ胞中のプラスミドｐＳＧＥ８の発現により、細胞融 解物の可溶及び不溶の両区弁において、ＳＬＰ　Ｉを生産した。５ＬＰＴは全細 胞タンパクの１％を占め、可溶区に約８０％、不溶区に約２０％分布していた。

Ａ、不溶区からの５ＬＰＩの精製 ｐＳＧＥ８を含ムＥ、　ｃｏｌｉ　５ＧＥ３０４ａｆｆｌヲ、振ｍフラスコで５ ０Ｍｇ／−アンピシリンを含むＬＢ培地で０Ｄ６Ｃ）６が０．７になる迄培養し 、Ｉ　ＰＴＧを　□Ｑ、２ｍＨ迄加えて諺、導した。３時間後に、細胞をベレッ トとし、その２倍の重ムの５０ｍＨトリスー塩酸（ｐＨ７，５）と４ｍＭのＥＤ ＴＡ（今後は、Ｔ５０Ｅ４と称する）に懸濁した。細胞を４℃で超音波をかけて 破壊し、抽出物を１２．０ＯＯＸ９で、４０℃で２０分間遠心分離した。

・′ベレットを３倍容量の７５０Ｅ４で洗い、１０Ｍ尿素か６Ｍグアニジン塩酸 塩のいずれか、及び５ｍＭの還元型ＤＴＴを含む溶液で、室温で溶解させた。室 温で１時間装置した後酸化型グルタチオンを１７．５ｆｆｉＨの濃度で加え、混 合物をもう１時間装置した。それから混合物をａｌｌｌｏ、７の１０倍容８Ｎ計 の５０１ＤＨトリス−ｊ：ＡＢで希釈した。希釈混合物を室温で４時間放置後、 ５Ｎ塩酸を加えてｆｊＮを８に調節した。この混合物を遠心分離して、沈殿した タンパクを除いた。

このようにしてできた上澄みは、分泌性白血球プロテアーゼ阻害剤活性を示す５ ＬＰＩを含んでいた。このタンパクを上に述べたようなセファデックス５Ｐ−０ ２５カラム上のクロマトグラフィーで精製した。

８８可溶区　からの５ＬＰＴの精製 プラスミドｐＳＧＥ８を含むＥ、　ｃｏｌｔ　５ＧＥ３０１１胞をＷｘ揖フラス コ中で０Ｄ８００が０．７になる迄培養し、ｒＰＴＧを０．２ｍＨ迄加えて誘導 した。００６００が１．１で、細胞を２５，０ＯＯｘｙで１５分間遠心分列して ベレットとした。、ベレットをＴ５０Ｅ４に再び懸濁し、４℃で２０．０ＯＯｐ ｓｉでフレンチプレスによってくずした。くずしたちのを２５．ＯＯＯｘｇで１ ５分間遠心分離した。

上澄みをＤＴＴ中で２５ｍＭとし、この混合物を０℃で１時間装置し最終濃度が ５％になる迄十分遣の塩酸を加えた。０℃で３０分間温装した後、混合物を２５ ．０００Ｘｇで１５分遠心分離し、上澄みを除き次の工程にかけた。１０Ｍの水 酸化ナトリウムで上澄みの１１８を８．０に調整し、５ＤＳ−ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー及びエライザ（ＥＬＩＳＡ） 法によって１ｔｔＪ及び分析を行ない、その結果、全タンパク１３０ＬＪＧあた り少くとも０．７１ＪＧの５ＬＰＩが示された。それについて、例６に従ってリ フオルディングを行なった。

例　８ 癒合ＳＬＰＩ−ＭＦ１遺伝子（例３Ｅ参照）を含む旦且旦Ｒ１断片を酵母ベクタ ーＹＩｐ５の旦旦旦Ｒ，Ｉ部位に、この出願中に参照文献として特別に加えであ るＢＯｔＳｔｅｉｎとＲ，Ｗ、口ａｖｉｓによるＴｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　 ＢｉｏｌｏｇｙＯｆ　ｔｈｅ　ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、　Ｃ ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒｃａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｐｐ、６０７−６ ３６　（１９８２）に記述されているようにしてつなぎ、ＹＩＤＳＬＰＩ−１を 生成させ、本出願に特別に参照文献として加えである、■、０ｒｒ−ＷｅａＶｅ ｒらＨｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥｎｚｙｍｏＩＯＱｙ　１０１　：　２２８　（１ ９８３）に記されであるような位置志向的組み換えによってＳ、ｃｅｒｅｖｉｓ ｉａｅ　Ｂ５２１４　（ＭＡＴ、　ＬＪｒ’ａ３−５２゜Ｄｅｐ４　ｐｒｂ＋　 ）のＵＲＡ３遺伝子の中に組み込んだ。この株、Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｓ 　Ｇ　Ｙ　−１は完全に活性な５ＬＰＩを培養上澄み中に分泌する。

２番目の株、５ＧＹ−３も活性５ＬＰＩを生産し、分泌する。この株は複製性酵 母プラスミツドＤＧＳ５８５上にＭＦｌ：　：５ＬＰＩＦ［合をもっている。こ のプラスミドは、本出願に特別に参照文献として加えた、Ｊ。

Ｒ，Ｂｒｏａｃｈ、　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　ＥｎｚｙＩＩｏｌｏσｙ　１０１　 ：３０７　（１９８３）によって記述されたように、ｏＪＤＢ２０７から、また 本出願中に゛特別に参照文献として加えたり。

Ｂｏｔｓｔｅｉｎと　Ｒ，Ｗ、Ｄａｖｉｓ、ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉ ｏｌｏｇｙ　ｏｒｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、　Ｃｏ１ ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｄｌｌ、　６’０７ −６３６に記述されたように、プラスミツドＹ２４から単離された酵母ＵＲＡ３ ｍ伝子を添転子ることにより構築され、そしてＤＪＤＢ２０７のＨｉｎｄｌＴＩ の切断位置にクローニングを行ない、１）ＧＳ５８５を構築した。ＥＣ０ＲＩ断 片に含まれるＭＦｌ：　：５ＬＰ１１！合遺伝子をに旦Ｒ１−及ユ旦１アダプタ ー（Ａｍｅｒｓｈａｍ、　Ｃａｔ、Ｎｃ　Ｄ　Ａ　１００７から得た）を用いて １．１）ＧＳ５８５のＳａ　ｌ　Ｉｔ７Ｊ断位ＥにりＯ−ニングして、ＹＥｐＳ ＬｒＩ−１を生成した。特別にこの出願に参照文献として加えたＪ、　Ｂａｃｔ ｅｒｉｏｌｏｇｙｌ　５３　：　１６３　（１９８３）において、ＩｔＯらによ って記述された、形質転換によってこのプラスミドをＳ、ｃｅｒｅｖｔｓｉａｅ 　ＤＢＹ７４６　（ＭＡＴ、　Ｕｒａ３−５２゜１ｅｕ２−３．ｈｉｓ３１．ｔ ｒｐｌ−２８９）に導入した。

５ａｃｃｈａｒｏＩＩｌｙｃｅｓ　ｃａｒｅｖｉｓｉａｅ菌株５ＧＹ−１と５Ｇ Ｙ−３を、特別に本出願中参照文献として取り入れた、Ｈｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｙ ｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏ、ｆ３　２　、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒ ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ 、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８１）に記述された、Ｆ、　ｓｈｅｒｔｍａｎらの 方法に従って、ｕｒａｃ　＋　＋の欠けているＳＯ培地で、３０℃で定常期迄培 養した。ｍ胞を遠心分離によって培地から除き、培養上澄みを（１）ブＯテアー ゼ阻害活性と、（′２Ｊエライザ法によって、抗−８ＬＰＩ抗体と特異的に反応 する物質のωを副定することによって、５ＬＰＩの活性について検定した。精製 の体系は、水出゛願において記述された、以前の方法に類似のやり方で展間でき る。

本発明の工程や生産物について、さまざまな改変を行なったり変化を与えたりす ることができることは、この道で技能をもった人々にとっては明白である。した がって、本発明は、附帯の請求範囲及びそれらの同等の範囲内にあるならば、そ の修飾や改変を包含することを意図するものである。

国際調査報告 １ｍｗｍ＠″′Ａ１ｗＭｓ　崗Ｐ（７７ＵＳ８　Ｓ　１０２！８５

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．セリンプロテアーゼインヒビター活性を有する少くとも１つの活性部位を持 つ一本鎖ポリペプチドのセリンプロテアーゼインヒビターの組み換えＤＮＡ合成 方法であって、 （ａ）宿主微生物を、セリンプロテアーゼインヒビター活性を持つタンパクを生 産するようにしむけることができるＤＮＡ配列を調製し、前記のインヒビターは 、耳下腺分泌物から得られた天然のセリンプロテアーゼインヒビターに対する実 質的な相同性を示し；（ｂ）宿主微生物中に移され、その中で複製することがで きるベクターの中に該ＤＮＡ配列をクローニングし、このようなベクターは、該 ＤＮＡ配列のためのオペレーシヨナルエレメントを含んでおり； （ｃ）該ＤＮＡ配列とオペレーショナルエレメントを含むベクターを該プロテア ーゼ阻害タンパクを発現することができる宿主微生物のなかに移し； （ｄ）該宿主微生物をベクターの増幅とインヒビターの発現に適切な条件下で培 養し； （ｅ）該インヒビターを採取し、そして、（ｆ）該インヒビターが、セリンプロ テアーゼインヒビター活性を持つ活性３次構造をとれるようにすることからなる 方法。
2. ２．該ＤＮＡ配列が合成配列である請求の範囲第１項に記載の方法。
3. ３．該ＤＮＡ配列が天然ＤＮＡ配列である場合の請求の範囲第１項に記載の方法 。
4. ４．該方法が更にインヒビターの精製を含む請求の範囲第１項に記載の方法。
5. ５．該精製を該インヒビターが活性形をとれるようにする前に行う請求の範囲第 ４項に記載の方法。
6. ６．該精製を、該インヒビターが活性形をとれるようにしてから行う請求の範囲 第４項に記載の方法。
7. ７．該ベクターをＰＢＲ３２２とＰＩＱからなるグループから選ばれたベクター の部品から組み立てている請求の範囲第１項に記載の方法。
8. ８．該宿主微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ及びＳａｃｃｈ ａｒｏｍｙｃｅｓ属の微生物により構成される群から選ばれる請求の範囲第１項 に記載の方法。
9. ９．該宿主微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉである場合の請求の範囲 第８項に記載の方法。
10. １０．該宿主微生物がＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｕｓである場合の請求の 範囲第８項に記載の方法。
11. １１．該宿主微生物がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであ る場合の請求の範囲第８項に記載の方法。
12. １２．（ａ）セリンプロテアーゼインヒビターを精製することができる細胞から のヒトｃＤＮＡライブラリーの調製。 （ｂ）該プロテアーゼインヒビター遺伝子、もしくは、そのタンパク産物と結合 することができる少くとも１つのプローブで、ヒトＤＮＡライブラリーをプロー ブすること。 （ｃ）そのクローンが遺伝子、もしくはそのタンパク生産のための１つのプロー ブに結合する能力によってインヒビターをコードする遺伝子を含む少とくも１つ のクローンを同定すること。 （ｄ）同定した１つ以上のクローンからインヒビターをコードする遺伝子を単離 すること。 （ｅ）該遺伝子、もしくは、その適切な断片を宿主微生物においてその遺伝子を 維持し、発現するのに必要なオペレーショナルエレメントにつなぐこと。を包含 する方法により該天然ＤＮＡ塩基配列が得られる請求の範囲第３項に記載の方法 。
13. １３．該細胞がヒト耳下腺細胞である場合の請求の範囲第１２項に記載の方法。
14. １４．（ａ）ヒトゲノムＤＮＡライブラリーの調製；（ｂ）セリンプロテインイ ンヒビター遺伝子、もしくは、そのタンパク産物に結合することができる少くと も１つのプローブで該ヒトゲノムＤＮＡライブラリーをプローブすること； （ｃ）該インヒビターをコードする該遺伝子を含む少くとも１つのクローンを、 そのクローンが、遺伝子、もしくは、そのタンパク生成物に対する少くとも１つ のプローブと結合する能力によって同定すること；（ｄ）同定した１つ以上の該 クローンから、インヒビターをコードする該遺伝子を単離すること；（ｅ）該遺 伝子、もしくはその適切な断片を宿主微生物中で維持し、発現するのに必要な、 オペレーショナルエレメントにつなぐこと；の方法により該天然ＤＮＡ塩基配列 が得られる請求の範囲第３項に記載の方法。
15. １５．セリンプロテアーゼ阻害活性を有する少くとも１つの活性部位を持ってい る一本鎖ポリペプタイドセリンプロテアーゼインヒビターの微生物合成を導き行 うことができる合成ＤＮＡ塩基配列。該タンパクは、耳下腺分泌物から単離した 天然セリンプロテアーゼユダズイビターとの実質的な相同性を示す。
16. １６．該塩基配列が（１）から成立っているグループから選ばれるような請求の 範囲第１５項に記載のＤＮＡ塩基配列、 ５′【配列があります】３′もしくは、（２）同じタンパクの生産をコードする 遺伝的に等価な塩基配列。
17. １７．以下のヌクレオチド配列を持つ翻訳カップラー。 配列があります。