JPH0759580A - ヒトカルシトニン前駆体ペプチドの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 バチルス・ブレビスを宿主として用いてヒト
カルシトニン前駆体ペプチドを経済的かつ大量に製造す
るための新規な製造法を提供することを目的とする。 【構成】 バチルス・ブレビス由来のプロモーター領域
を有するＤＮＡの３′末端にヒトカルシトニン前駆体ペ
プチドをコードするＤＮＡを１個または複数個結合たせ
たＤＮＡ；プロモーター領域を含有するＤＮＡの３′末
端にヒトカルシトニン前駆体ペプチドをコードするＤＮ
Ａを１個または複数個結合させたＤＮＡを保持するバチ
ルス・ブレビス；並びにこのバチルス・ブレビスを培地
に培養し、培養物中にヒトカルシトニン前駆体ペプチド
を生成させ、蓄積せしめ、これを採取することを特徴と
するヒトカルシトニン前駆体ペプチドの製造法を提供す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヒトカルシトニン（huma
n Ｃalcitonin ）前駆体ペプチド製造のための組換えＤ
ＮＡ技術に関し、さらに詳細には、ヒトカルシトニン前
駆体ペプチド遺伝子を含有するＤＮＡ、該ＤＮＡを保持
するバチルス・ブレビス（Ｂacillusbrevis）およびそ
れらを用いたヒトカルシトニン前駆体ペプチドの製造法
に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒトカルシトニンは、３２個のアミノ酸
からなる単鎖のポリペプチドで、そのアミノ酸配列はす
でに明らかにされており、１位と７位の位置にＣysがあ
り、これらはＳ−Ｓ結合で結ばれている。さらに、Ｃ末
端がアミド化されている。本物質は特に強い骨吸収抑制
作用および血中カルシウム濃度降下作用を持つことか
ら、高カルシウム血症や代謝性骨疾患の治療薬として用
いられている。

【０００３】現在治療用のカルシトニンとして市販され
ているものは、ブタ、サケおよびウナギのカルシトニン
であるが、これらは生体から抽出したりまたは化学的に
合成することによって得られている。しかしその生産量
はわずかでありまた高価である。さらに、ウナギやサケ
のカルシトニンは、その生理活性はヒトのカルシトニン
に比べて高いが、アミノ酸の一部がヒトのものと異なる
ために、人体に長時間投与した場合、抗体が産生され、
好ましくない結果をもたらすことが知られている。従っ
てヒトカルシトニンを経済的かつ大量に製造する方法が
望まれており、遺伝子操作技術を用いる方法が最も好ま
しい。

【０００４】今日まで多くの組換えＤＮＡの研究は大腸
菌（Ｅ．coli）を用いてなされており、特開昭５８−２
０３９５３および特開昭６２−２２６９９８にはヒトカ
ルシトニン前駆体ペプチドの化学合成遺伝子と大腸菌に
おけるその発現が記載されている。しかし、この方法で
は、発現された遺伝子産物が菌体内に蓄積されるため目
的とする遺伝子産物を純粋な形で取得するまでの過程
で、目的物の菌体からの抽出及び抽出液からの精製に多
大な時間と労力を要するだけでなく、目的とする物質を
完全な形で純粋に得ることが容易ではない。

【０００５】一方、バチルス（Ｂacillus ）属菌は古く
から種々の菌体外酵素の生産菌として工業的に利用され
ており、これら菌体外酵素の遺伝子のプロモーターおよ
びシグナルペプチドをコードするＤＮＡ領域をクローニ
ングし、その下流に目的とする蛋白質の製造遺伝子を連
結し、これをバチルス属に導入すれば、目的とする蛋白
質を遺伝子産物として菌体外へ分泌させることが可能に
なると考えられ、すでにバチルス・アミロリクエファシ
エンス（Ｂacillus amyloliquefaciens ）のα−アミラ
ーゼ遺伝子〔Ｉ．Ｐalvaら、Ｇene,２２，２２９（198
3) 〕、バチルス・サチルス（Ｂacillus subtilis）の
α−アミラーゼ遺伝子〔Ｈ．Ｙamazakiら、Ｊ．Ｂacter
iol.,１５６，３２７（1983）〕などがクローン化さ
れ、これらのシグナルペプチドを利用した異種蛋白質の
分泌が報告されている。

【０００６】一方、鵜高らはバチルス・ブレビス（Ｂac
ilus brevis ）にはプロテアーゼをほとんど生産しない
菌株が多いことを見いだし、その１菌株バチルス・ブレ
ビス４７〔ＦＥＲＭ Ｐ−７２２４；特開昭６０−５８
０７４号公報、特開昭６２−２０１５８３号公報参照〕
の主要菌体外蛋白質〔Ｈ．Ｙamagata ら, Ｊ．Ｂacteri
ol.,１６９，１２３９（1987）、塚越規弘、日本農芸化
学会誌，６１，６８（1987）および特開昭６２−２０１
５８３号公報にそれぞれ“outer wall proteinand midd
le wall protein”、“菌体外主要蛋白質”および“細
胞表層蛋白質”として記載されている。〕遺伝子のプロ
モーターおよび該主要蛋白質の一種であるＭＷ蛋白質
（middle wall protein ）のシグナルペプチドをコード
する領域を用いて分泌ベクターを作製し、本菌株を宿主
としてα−アミラーゼ〔特開昭６２−２０１５８３号公
報、Ｈ．Ｙamagata ら, Ｊ．Ｂacteriol.,１６９，１２
３９（1987）〕等の分泌生産に成功している。

【０００７】さらに、高木らは菌体外のプロテアーゼを
示さない菌株バチルス・ブレビスＨＰＤ３１を分離し、
これを宿主として耐熱性α−アミラーゼの高分泌生産に
成功している〔日本農芸化学会昭和６２年度大会講演要
旨集，ｐ２７〕。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】前記のとおり、バチル
ス・ブレビスを宿主として用いる異種蛋白質の分泌生産
および主に大腸菌を宿主として用いるヒトカルシトニン
前駆体ペプチドの生産について種々試みられているが、
本発明はバチルス・ブレビスを宿主として用いてヒトカ
ルシトニン前駆体ペプチドを経済的かつ大量に製造する
ための新規な製造法を提供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ヒトカル
シトニン前駆体ペプチドを効率良く生産させるために、
バチルス・ブレビスを宿主として用いてヒトカルシトニ
ン前駆体ペプチド遺伝子を発現させることにより、培養
物中にヒトカルシトニン前駆体ペプチドが生産されるこ
とを確認した。

【００１０】すなわち本発明は、（１）バチルス・ブレ
ビス由来のプロモーター領域を含有するＤＮＡの３′末
端にヒトカルシトニン前駆体ペプチドをコードするＤＮ
Ａを１個または複数個結合させたＤＮＡ、（２）プロモ
ーター領域を含有するＤＮＡの３′末端にヒトカルシト
ニン前駆体ペプチドをコードするＤＮＡを１個または複
数個結合させたＤＮＡ、並びに（３）上記（２）に記載
のバチルス・ブレビスを培地に培養し、培養物中にヒト
カルシトニン前駆体ペプチドを生成、蓄積せしめ、これ
を採取することを特徴とするヒトカルシトニン前駆体ペ
プチドの製造法、に関する。

【００１１】

【具体的な説明】ヒトカルシトニン前駆体ペプチドをコ
ードするＤＮＡ（カルシトニン前駆体構造遺伝子）とし
ては、ヒトカルシトニン前駆体ペプチドをコードするも
のであれば具体的な塩基配列は問わないが、例えば下記
のようなＤＮＡ（Ｉ）（配列番号：１）が挙げられる。

【００１２】ＤＮＡ（Ｉ）：ＴＧＣＧＧＴＡＡＣＣＴＧ
ＡＧＴＡＣＴＴＧＣＡＴＧＣＴＧＧＧＴＡＣＣＴＡＣＡ
ＣＴＣＡＡＧＡＣＴＴＣＡＡＣＡＡＡＴＴＣＣＡＣＡＣ
ＴＴＴＣＣＣＡＣＡＡＡＣＴＧＣＧＡＴＣＧＧＴＧＴＴ
ＧＧＡＧＣＴＣＣＡＧＧＴ プロモーターとしては、バチルス・ブレビス由来のもの
が好ましいが、バチルス・ブレビスで機能するものであ
ればいずれでもよい。さらに、プロモーター領域を含有
するＤＮＡは、プロモーター以外に、ＳＤ配列、翻訳開
始コドンなどを有していることが必要である。

【００１３】本発明において、ヒトカルシトニン前駆体
ペプチドの生産量を増加させるためには、菌体外にヒト
カルシトニン前駆体ペプチドを蓄積させることが望まし
く、この場合、プロモーター領域を含有するＤＮＡに
は、該ＤＮＡの３′末端側にシグナルペプチドをコード
する領域が含まれる。シグナルペプチドとしては、ヒト
カルシトニン前駆体ペプチドをバチルス・ブレビスの菌
体外に分泌発現させるものであればいずれでもよく、例
えば、バチルス・ブレビス４７あるいはバチルス・ブレ
ビスＨ１０２の主要菌体外蛋白質のシグナルペプチドな
どが挙げられるが、なかでもバチルス・ブレビス４７の
ＭＷ蛋白質（middle wall protein ）のシグナルペプチ
ドが好ましい。

【００１４】上記したプロモーター領域およびシグナル
ペプチドをコードする領域を含有するＤＮＡとしては、
例えば図１（配列番号：２）に示すベクターｐＮＵ２０
０中の５７４bp ＡluＩ−Ｆnu４ＨＩ断片が挙げられ
る。遺伝子の発現に用いる発現ベクターとしては、バチ
ルス・ブレビスで機能するものであればいずれでもよ
く、後述の参考例１で示すｐＮＵ２１０などが挙げられ
る。

【００１５】上記のＤＮＡを用いて作製したヒトカルシ
トニン前駆体ペプチド発現プラスミドとしては、バチル
ス・ブレビスで発現するものであればいずれでもよく、
具体的には後述の実施例１で得られるプラスミドｐＮＵ
２１０−ＣＴ、実施例２で得られるプラスミド、ｐＮＵ
２１０−ＣＴ２、ｐＮＵ２１０−ＣＴ３、ｐＮＵ４００
−ＣＴ３、ｐＮＵ４００−ＣＴ５などが挙げられる。

【００１６】本発明においては、ヒトカルシトニン前駆
体の生産量を増加するために１個の発現ベクター中に複
数個のカルシトニン前駆体構造遺伝子をタンデムに挿入
してもよい。これらの複数個の構造遺伝子に１個のプロ
モーターのもとに置かれてもよく、また各構造遺伝子の
上流にプロモーターを配置してもよい。ヒトカルシトニ
ン前駆体の分泌のためには、各構造遺伝子の上流にシグ
ナル配列を連結する必要があり、さらに各シグナル配列
の上流にＳＤ配列を配置するのが好ましい。

【００１７】前記発現プラスミドの内、ｐＮＵ２１０−
ＣＴはカルシトニン前駆体構造遺伝子を１個含有し、ｐ
ＮＵ２１０−ＣＴ２は構造遺伝子を２個含有し、ｐＮＵ
２１０−ＣＴ３およびｐＮＵ４００−ＣＴ３は構造遺伝
子を３個含有し、そしてｐＮＵ４００−ＣＴ５は構造遺
伝子を５個含有する。１個の発現プラスミド中にさらに
多くの、例えば、７個まで、１０個まで、又は１５個ま
での構造遺伝子を含有させることもできる。

【００１８】これらのプラスミドを構築する方法として
は、例えばモレキュラー・クローニング．ア・ラボラト
リーマニュアル，コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー（Ｍolecular Ｃloning. Ａ Ｌaboratory
Ｍanual. Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory ）（19
82）に記載の方法などが挙げられる。一方、プラスミド
の構築に用いられる宿主としては、大腸菌（Ｅ．coli）
またはバチルス・ブレビス（Ｂacillus brevis）に属す
る微生物であればいずれでもよく、例えば、大腸菌ＸＬ
Ｉ−blue、バチルス・ブレビス４７−５（ＦＥＲＭＢＰ
−１６６４，ＩＦＯ １４６９８）、バチルス・ブレビ
ス４７−５Ｑなどが挙げられる。

【００１９】さらに、遺伝子の発現に用いる宿主として
は、バチルス・ブレビスであればいずれでもよく、バチ
ルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ Ｐ−７２２４）、バチ
ルス・ブレビス４７−５、バチルス・ブレビスＨ１０２
（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）などが挙げられる。バチ
ルス・ブレビスを形質転換する方法は公知の方法でよ
く、例えばＴakahashiらの方法〔Ｊ．Ｂacteriol.,１５
６，１１３０（1983）〕などが挙げられる。

【００２０】得られた形質転換体の培養に用いる培地は
形質転換体が生育して目的とする蛋白質を生産しうるも
のであればいかなるものでもよく、炭素源、窒素源、無
機塩類、栄養要求性の菌株の場合にはその生育に必要な
栄養物質、さらに培養に際して必要があれば培地に抗生
物質等を加えた培地が挙げられる。培養終了後、公知の
方法である遠心分離法などで菌体と上清を分離する。菌
体内に産生されたヒトカルシトニン前駆体ペプチドは、
公知の方法である物理的破砕法（超音波破砕法など）や
化学的破砕法（細胞壁溶解酵素など）などにより菌体を
破砕し、必要ならば界面活性剤（Ｔriton −Ｘ１００な
ど）を加えて抽出される。

【００２１】このようにして得られた培養上清、さらに
抽出液中に含まれるヒトカルシトニン前駆体ペプチド
は、通常の蛋白質精製法であるゲルろ過、イオン交換ク
ロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどに
より分離精製され、目的とするヒトカルシトニン前駆体
ペプチドを得ることができる。さらに、ヒトカルシトニ
ン前駆体ペプチドはアミド化酵素により、ヒトカルシト
ニンに変換される。

【００２２】

【実施例】以下に、本発明の実施例を述べるが、本発明
を限定するものではない。参考例１．プラスミドｐＢＲ−ＡＮの構築 プラスミドｐＢＲ３２２を制限酵素ＮruＩおよびＢamＨ
Ｉで切断した。一方、図７に示す塩基配列を有する２個
の一本鎖オリゴヌクレオチド（配列番号１３および１
４）を合成し、それぞれの５′末端をＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼによりリン酸化した。さらにこれらにアニ
ーリング操作を行った後（一方が、付着末端で、他方が
平滑末端になる）、プラスミドｐＢＲ３２２（ＮruＩ−
ＢamＨＩ断片）とＴ４ＤＮＡリガーゼにて連結すること
により、プラスミドｐＢＲ−ＡＮを得た。

【００２３】参考例２．発現ベクターｐＮＵ２１０の構
築 発現ベクターｐＮＵ２００〔鵜高重三、農芸化学会誌、
６１，６６９（1987）〕を制限酵素ＡpaＬＩ，ＨindIII
で切断した。一方、図８に示した塩基配列（配列番号１
５および１６）を有する２個の一本鎖オリゴヌクレオチ
ドを合成し、それぞれの５′末端をＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼによりリン酸化した。さらに、これらにアニ
ーリング操作を行った後、発現ベクターｐＮＵ２００
（ＡpaＬＩ−ＨindIII断片）とＴ４ＤＮＡリガーゼにて
連結させることにより、発現ベクターｐＮＵ２１０を得
た。

【００２４】実施例１．ヒトカルシトニン前駆体ペプチ
ド発現プラスミドｐＮＵ２１０−ＣＴの構築と形質転換
体の調製 （Ａ）ヒトカルシトニン前駆体ペプチド遺伝子の調製 ヒトカルシトニン前駆体ペプチドをコードする遺伝子の
塩基配列を図２に示す８個の一本鎖オリゴヌクレオチド
（フラグメント）（フラグメント１〜８をそれぞれ配列
番号３〜１０に示す）に分け、ホスホアミダイト法にて
それぞれのフラグメントを合成した。このＤＮＡ配列
（フラグメント１）の５′末端は、バチルス・ブレビス
の菌体外に分泌発現させるためのシグナルペプチドの一
部をコードする配列を含んでいる。

【００２５】化学合成されたフラグメントの内、図２に
示す１と５を除いた各フラグメントの５′末端をＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。さらに、
これらのフラグメントの内、１と８、２と７、３と６、
４と５を混合し、４つの溶液とし、次のようにしてアニ
ーリング操作を行った。すなわち、４つの溶液を９５℃
に１０分間加温し、３時間かけて徐々に室温に戻し、さ
らに４つの溶液を混合し、６５℃に１０分加温してから
徐々に室温に戻した。このようなアニーリング操作をし
て得られたフラグメントにＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、
反応させることにより、５′末端にシグナルペプチド配
列の一部を含むヒトカルシトニン前駆体ペプチド遺伝子
（ＣＴ）を得た。

【００２６】（Ｂ）ベクターＤＮＡの調製および大腸菌
の形質転換（図３） プラスミドベクターｐＢＲ−ＡＮを制限酵素ＮcoＩおよ
びＢamＨＩで完全に切断し、（Ａ）にて調製したＤＮＡ
と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え反応させ、そして
この反応液を大腸菌の形質転換に供した。大腸菌の形質
転換は、Ｈanahanの方法〔Ｊ．Ｍol．Ｂiol., １６６，
５５７，（1983）〕により行った。得られたアンピシリ
ン耐性の形質転換体よりプラスミドを単離し、これをｐ
ＢＲ−ＡＮ−ＣＴと命名した。

【００２７】（Ｃ）ヒトカルシトニン前駆体ペプチド発
現プラスミドｐＮＵ２１０−ＣＴの構築と形質転換体の
調製（図３） （Ｂ）で得られたプラスミドｐＢＲ−ＡＮ−ＣＴより、
シグナルペプチドの中間付近以後からヒトカルシトニン
前駆体ペプチドまでをコードする１４２bpのＡpaＬＩ−
ＢamＨＩ断片を単離した。

【００２８】一方、発現ベクターｐＮＵ２１０を制限酵
素ＡpaＬＩとＢamＨＩで切断し、これに上記の１４２bp
のＡpaＬＩ−ＢamＨＩ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結
し、その反応液を用いてＴakahashiらの方法〔Ｊ．Ｂac
teriol.,１５６，１１３０（1983）〕によってバチルス
・ブレビスの形質転換を行った。得られたエリスロマイ
シン耐性の形質転換体からプラスミドを単離し、これを
ｐＮＵ２１０−ＣＴと命名した。このｐＮＵ２１０−Ｃ
Ｔの構築手順を図３に示す。形質転換体の中から安定株
バチルス・ブレビス（ｐＮＵ２１０−ＣＴ）〔ＢＢ４７
−５Ｑ−ＣＴ１の名称のもとに微工研菌寄第１２９６４
号（ＦＥＲＭＰ−１２９６４）として寄託されている〕
を分離し、実施例３の培養に用いた。

【００２９】実施例２．ヒトカルシトニン前駆体ペプチ
ド発現プラスミドｐＮＵ４００−ＣＴ５の構築と形質転
換体の調製（図５および図６） （Ａ）タンデム化遺伝子の調製 ヒトカルシトニン前駆体ペプチドの発現量を増加させる
ためにタンデム化（多copy化）を行った。これには、図
１に示したプロモーター領域からＳＤ配列、さらにヒト
カルシトニン前駆体ペプチドをコードする遺伝子までを
セットにしてタンデム化する方法と、ひとつのプロモー
ターの下でＳＤ配列からヒトカルシトニン前駆体ペプチ
ドをコードする遺伝子までをセットにしてタンデム化す
る方法とが考えられたが、今回は後者のひとつのプロモ
ーターの下でＳＤ配列からヒトカルシトニン前駆体ペプ
チドをコードする遺伝子までをセットにしてタンデム化
を図った。

【００３０】具体的には、図４に示す２つのＤＮＡ配列
（配列番号１１および１２）に基づきホスホアミダイト
法にて一本鎖オリゴヌクレオチド（プライマー）を合成
した。プライマー１は制限酵素ＢamＨＩサイトができる
ような配列とＳＤ１配列以降を含む２８bpのＤＮＡであ
る。プライマー２は制限酵素ＢglIIサイトができるよう
な配列とヒトカルシトニン前駆体ペプチド遺伝子の３′
末端と終止コドンを含む２９bpのＤＮＡである。

【００３１】プライマー１および２とｐＮＵ２１０−Ｃ
ＴおよびＤＮＡポリメラーゼを使って反応させ、５′末
端近傍にＢamＨＩサイト、３′末端近傍にＢglIIサイト
を持ち、間にＳＤ配列、シグナルペプチドおよびヒトカ
ルシトニン前駆体ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含
む３００bpのＤＮＡ断片を得た。さらに、このＤＮＡ断
片を制限酵素ＢamＨＩおよびＢglIIで切断し、5 ′末端
がＢamＨＩ、３′末端がＢglIIサイトの２８８bpのＤＮ
Ａ断片を得た。

【００３２】（Ｂ）ヒトカルシトニン前駆体ペプチド発
現プラスミドｐＮＵ２１０−ＣＴ３の構築と形質転換体
の調製（図５） 実施例１にて得られたヒトカルシトニン前駆体ペプチド
発現プラスミドｐＮＵ２１０−ＣＴを制限酵素ＢamＨＩ
で切断し、これに上記の２８８bpのＢamＨＩ−ＢglII断
片をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し、その反応液を用いて
前記のＴakahashiらの方法によってバチルス・ブレビス
の形質転換を行った。得られたエリスロマイシン耐性の
形質転換体からプラスミドを単離し、このうち順方向に
ＤＮＡ断片が挿入されたものをｐＮＵ２１０−ＣＴ２と
命名し、形質転換体の中から安定株を分離した。

【００３３】さらに、このｐＮＵ２１０−ＣＴ２を制限
酵素ＢamＨＩで切断し、これに２８８bpのＢamＨＩ−Ｂ
glII断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し、その反応液を
用いて前記のＴakahashiらの方法によってバチルス・ブ
レビスの形質転換を行った。得られたエリスロマイシン
耐性の形質転換体からプラスミドを単離し、このうち順
方向にＤＮＡ断片が挿入されたものをｐＮＵ２１０−Ｃ
Ｔ３と命名し、形質転換体の中から安定株を分離した。

【００３４】今回のタンデム化は、２８８bpのＢamＨＩ
−ＢglII断片を一つずつ挿入したが、前もってＢamＨＩ
−ＢglII断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結しておき、そ
の中から目的の連結数でかつ方向性の正しいＤＮＡ断片
を取り出し、これとｐＮＵ２１０−ＣＴを制限酵素Ｂam
ＨＩで切断したものとをＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し、
その反応液を用いてＴakahashiらの方法によってバチル
ス・ブレビスの形質転換を行っても同様の結果が得られ
る。

【００３５】（Ｃ）ヒトカルシトニン前駆体ペプチド発
現プラスミドｐＮＵ４００−ＣＴ５の構築と形質転換体
の調製（図６） 上記（Ｂ）にて得られた発現プラスミドｐＮＵ２１０−
ＣＴ３を制限酵素ＳpeI およびＨindIIIで切断し、９４
９bpのＤＮＡ断片を得た。一方、発現プラスミドｐＮＵ
４００（ｐＮＵ２１０に対し、８３bpのＮsp７５２４Ｖ
−ＥcoＲＩ断片を欠失）を制限酵素ＳpeＩ，ＨindIIIで
切断し、これに上記の９４９bpのＳpeＩ−ＨindIII断片
をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し、その反応液を用いてＴ
akahashiらの方法によってバチルス・ブレビスの形質転
換を行った。得られたエリスロマイシン耐性の形質転換
体からプラスミドを単離し、これをｐＮＵ４００−ＣＴ
３と命名した。

【００３６】また、ｐＮＵ２１０−ＣＴ３を制限酵素Ｂ
amＨＩおよびＢglIIで切断し、６０６bpＤＮＡ断片を得
た。そして、上記にて得られたｐＮＵ４００−ＣＴ３を
制限酵素ＢamＨＩで切断し、これに６０６bpのＢamＨＩ
−ＢglII断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し、その反応
液を用いてＴakahashiらの方法によってバチルス・ブレ
ビスの形質転換を行った。得られたエリスロマイシン耐
性の形質転換体からプラスミドを単離し、このうち順方
向にＤＮＡ断片が挿入されたものをｐＮＵ４００−ＣＴ
５と命名した。このｐＮＵ４００−ＣＴ５の構築手順を
図６に示す。形質転換体の中から安定株バチルス・ブレ
ビス（ｐＮＵ４００−ＣＴ５）を分離し、実施例３の培
養に用いた。

【００３７】実施例３．形質転換体の培養及びヒトカル
シトニン前駆体ペプチドの生産 （１）実施例１および実施例２で得られた形質転換体バ
チルス・ブレビス（ｐＮＵ２１０−ＣＴ）およびバチル
ス・ブレビス（ｐＮＵ４００−ＣＴ５）並びにその対照
となるバチルス・ブレビス（ｐＮＵ２１０）をポリペプ
トン２％、酵母エキス０．４％、肉エキス０．５％、グ
ルコース１％、ＭｇＣｌ₂ ５ｍＭ、ウラシル１００μｇ
／ｍｌおよびエリスロマイシン１０μｇ／ｍｌからなる
培地（ｐＨ７．０）で３０℃、３日間振とう培養した。

【００３８】上記の培養液を遠心分離し、その培養上清
をＳchagger,Ｈ．らの方法〔Ａnal.Ｂiochem.,１６６，
３６８（1987）〕に準じて、トリシン−ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動にかけたのち、抗ヒトカルシ
トニン抗血清（CAMBRIDGE MEDICAL TECHNOLOGY CORPORA
TION製）を用いてウエスタンブロッティングを行った。
その結果、バチルス・ブレビス（ｐＮＵ２１０−Ｃ
Ｔ）、およびバチルス・ブレビス（ｐＮＵ４００−ＣＴ
５）の培養上清にはヒトカルシトニン前駆体ペプチドが
認められ、その分子量は標準品（ヒトカルシトニン）の
それとほぼ一致した。

【００３９】（２）実施例２で得られた形質転換体バチ
ルス・ブレビス（ｐＮＵ４００−ＣＴ３）、バチルス・
ブレビス（ｐＮＵ４００−ＣＴ５）、およびその対照と
なるバチルス・ブレビス（ｐＮＵ２１０）をプロテオー
スペプトンＰ１ ４％、グルコース５％、酵母エキス
０．５％、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０．０１％、ＦｅＳＯ
₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０．００１％、ＭｎＳＯ₄ ・４Ｈ₂ Ｏ０．
００１％、ＺｎＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０．０００１％、ＨＥ
ＰＥＳ０．１Ｍ（ｐＨ７．０）、ウラシル１００μｇ／
ｍｌ、エリスロマイシン１０μｇ／ｍｌからなる培地に
て３０℃、３日間振とう培養した。

【００４０】上記の培養上清を遠心分離し、その培養上
清をＳchagger.Ｈ．らの方法に準じて、トリシン−ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミド電気泳動にかけたのち、抗カル
シトニン抗血清を用いてウエスタンブロッティングを行
った。その結果、培養上清中のヒトカルシトニン前駆体
ペプチドの濃度は２ｍｇ／１であった。ｐＮＵ２１０
（レーン３）、ｐＮＵ４００−ＣＴ３（レーン１）及び
ｐＮＵ４００−ＣＴ５（レーン２）からのカルシトニン
前駆体の生産量を電気泳動により比較した結果を図９に
示す。プラスミド当りのカルシトニン遺伝子の数を増加
することにより生産量が増加することが明らかである。

【００４１】実施例４．ヒトカルシトニン前駆体ペプチ
ドのアミド化 実施例３にて得られた培養上清をＳep−Ｐak Ｃ₁₈カー
トリッジ（Ｗaters 製）で前処理した後、逆相ＨＰＬＣ
（ＴＳＫ−１２０Ｔ東ソー製）にてヒトカルシトニン前
駆体ペプチドの粗精製品を得た。本品にペプチドＣ末端
アミド化酵素（資生堂製）を反応させて、反応液をＨＰ
ＬＣにかけ、直線濃度勾配にて溶出し、２１５nmの紫外
部吸収によりモニターした。このときヒトカルシトニン
前駆体ペプチドと思われるピークは、反応前のヒトカル
シトニン前駆体ペプチドのピークとはずれて、ヒトカル
シトニンの標準品（CAMBRIDGE RESEARCH BIOCHEMICALS
製）のピーク位置と一致した。すなわち、培養上清中の
ヒトカルシトニン前駆体ペプチドのＣ末端は、ペプチド
Ｃ末端アミド化酵素により正しくアミド化され、ヒトカ
ルシトニンに変換した。

【００４２】

【発明の効果】本発明によれば、カルシトニン前駆体の
製造のために従来使用されていないバチルス・ブレビス
細菌を用いてカルシトニン前駆体を製造することができ
る。さらに発現プラスミド中に複数のカルシトニン前駆
体構造遺伝子を挿入することにより、カルシトニン前駆
体の発現量を増加せしめることができる。

【００４３】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：９９ 配列の型：核酸 配列の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： TGCGGTAACC TGAGTACTTG CATGCTGGGT ACCTACACTC AAGACTTCAA 50 CAAATTCCAC ACTTTCCCAC AAACTGCGAT CGGTGTTGGA GCTCCAGGT 99

【００４４】配列番号：２ 配列の長さ：６００ 配列の型：核酸 配列の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： 起源：プラスミドｐＮＵ２００ 配列： AAAGCTATCC TGTCTTACAA CTTGGCTGTT GTAAACTTTG AAAATGCATT 50 AGGAAATTAA CCTAATTCAA GCAAGATTAT GAGGTTTTGA ACCAAATTGG 100 AAAAAGGTTC AGTCGTGACA GCCCGCCATA TGTCCCCTAT AATACGGATT 150 GTGGCGGATG TCACTTCGTA CATAATGGAC AGGTGAATAA CGAACCACGA 200 AAAAAACTTT AAATTTTTTT CGAAGGCGCC GCAACTTTTG ATTCGCTCAG 250 GCGTTTAATA GGATGTCACA CGAAAAACGG GGAATTGTGT AAAAAAGATT 300 CACGAATTCT AGCAGTTGTG TTACACTAGT GATTGTTGCA TTTTACACAA 350 TACTGAATAT ACTAGAGATT TTTAACACAA AAAGCGAGGC TTTCCTGCGA 400 AAGGAGGTGA CACGCGC TTG CAG GAT TCG GGC TTT AAA AAG AAA GAT 447 fMet Gln Asp Ser Gly Phe Lys Lys Lys Asp 5 10 AGA TTA ACA ACA AAT ATT CCC CAA GAA CAA TTT GTT TAT ACT AGA 492 Arg Leu Thr Thr Asn Ile Pro Gln Glu Gln Phe Val Tyr Thr Arg 15 20 25 GGA GGA GAA CAC AAG GTT ATG AAA AAG GTC GTT AAC AGT GTA TTG 537 Gly Gly Glu His Lys Val Met Lys Lys Val Val Asn Ser Val Leu 30 35 40 GCT AGT GCA CTC GCA CTT ACT GTT GCT CCC ATG GCT TTC GCT 579 Ala Ser Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala Pro Met Ala Phe Ala 45 50 GCAGGATCCG TCGACTCTAG A 600

【００４５】配列番号：３ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 配列の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： CATGGCTTTC GCTTGCGGTA AC 22

【００４６】配列番号：４ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 配列の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： CTGAGTACTT GCATGCTGGG TACCTACACT CA 32

【００４７】配列番号：５ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 配列の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： AGACTTCAAC AAATTCCACA CTTTCCCACA AA 32

【００４８】配列番号：６ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 配列の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： CTGCGATCGG TGTTGGAGCT CCAGGTTAAT AG 32

【００４９】配列番号：７ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 配列の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： GATCCTATTA ACCTGGAGCT CC 22

【００５０】配列番号：８ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 配列の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： AACACCGATC GCAGTTTGTG GGAAAGTGTG GA 32

【００５１】配列番号：９ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 配列の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： ATTTGTTGAA GTCTTGAGTG TAGGTACCCA GC 32

【００５２】配列番号：１０ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 配列の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： ATGCAAGTAC TCAGGTTACC GCAAGCGAAA GC 32

【００５３】配列番号：１１ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 配列の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： CTTGGATCCG AAAGGAGGTG ACACGCGC 28

【００５４】配列番号：１２ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 配列の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： GGAAGATCTT AACCTGGAGC TCCAACACC 29

【００５５】配列番号：１３ 配列の長さ：４３ 配列の型：核酸 配列の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： AGTGCACTCG CACTTACTGT TGCTCCCATG GCTTTCGCTG CAG 43

【００５６】配列番号：１４ 配列の長さ：４７ 配列の型：核酸 配列の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： GATCCTGCAG CGAAAGCCAT GGGAGCAACA GTAAGTGCGA GTGCACT 47

【００５７】配列番号：１５ 配列の長さ：８３ 配列の型：核酸 配列の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： TGCACTCGCA CTTACTGTTG CTCCCATGGC TTTCGCTGCA GGATCCGTCG 50 ACTCTAGAGG TACCAGATCT CTCGAGGAGC TCA 83

【００５８】配列番号：１６ 配列の長さ：８３ 配列の型：核酸 配列の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： AGCTTGAGCT CCTCGAGAGA TCTGGTACCT CTAGAGTCGA CGGATCCTGC 50 AGCGAAAGCC ATGGGAGCAA CAGTAAGTGC GAG 83

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、実施例１などに示したバチルス・ブレ
ビス４７の主要菌体外蛋白質遺伝子のプロモーターおよ
びバチルス・ブレビス４７のＭＷ（middle wall ）蛋白
質のシグナルペプチドと成熟蛋白のＮ末端側の一部をコ
ードする領域を含有するＤＮＡの塩基配列とアミノ酸配
列を示す。（Ｐはプロモーターを示し、↑はシグナルペ
プチダーゼで切断される部位を示す。）

【図２】図２は、本発明の方法のヒトカルシトニン前駆
体ペプチドを生産するための塩基配列の一例を示す。こ
の配列にはシグナルペプチドの塩基配列の一部も含む。

【図３】図３は、実施例１に示したヒトカルシトニン前
駆体ペプチド発現プラスミドｐＮＵ２１０−ＣＴの構築
図を示す。

【図４】図４は、ヒトカルシトニン前駆体ペプチド遺伝
子のタンデム化のために新しく制限酵素サイトを作るた
めのプライマーの塩基配列を示す。

【図５】図５は、実施例２に示したヒトカルシトニン前
駆体ペプチド発現プラスミドｐＮＵ２００−ＣＴ３の構
築図を示す。

【図６】図６は、実施例２に示したヒトカルシトニン前
駆体ペプチド発現プラスミドｐＮＵ４００−ＣＴ５の構
築図を示す。

【図７】図７は、参考例１においてプラスミドｐＢＲ−
ＡＮを構築するために化学合成したオリゴヌクレオチド
の塩基配列を示す。

【図８】図８は、参考例２においてプラスミドｐＮＵ２
１０の構築のために使用した、マルチクローニング部位
を含む合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。

【図９】図９は、発現プラスミドｐＮＵ４００−ＣＴ３
およびｐＮＵ−ＣＴ５並びに対照プラスミドｐＮＵ２１
０からの発現生成物を比較したウエスタンブロッティン
グの結果を示す電気泳動図であって、図面に代わる写真
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:08） Ｃ０７Ｋ 99:46 (72)発明者 山形 秀夫 愛知県名古屋市千種区園山町２丁目22番地 園山住宅１−305号 (72)発明者 柴川 高広 愛知県刈谷市昭和町１丁目１番地 日本電 装株式会社内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 バチルス・ブレビス由来のプロモーター
   領域を有するＤＮＡの３′末端にヒトカルシトニン前駆
   体ペプチドをコードするＤＮＡを１個または複数個結合
   させたＤＮＡ。
2. 【請求項２】 プロモーター領域を含有するＤＮＡの
   ３′末端にヒトカルシトニン前駆体ペプチドをコードす
   るＤＮＡを１個または複数個結合させたＤＮＡを保持す
   るバチルス・ブレビス。
3. 【請求項３】 請求項２記載のバチルス・ブレビスを培
   地に培養し、培養物中にヒトカルシトニン前駆体ペプチ
   ドを生成させ、蓄積せしめ、これを採取することを特徴
   とするヒトカルシトニン前駆体ペプチドの製造法。