JPH10295378A - 新規発現プラスミドベクター及び該発現 プラスミドベクターを保有するバチルス 属細菌を用いた異種遺伝子産物の製造法 - Google Patents
新規発現プラスミドベクター及び該発現 プラスミドベクターを保有するバチルス 属細菌を用いた異種遺伝子産物の製造法Info
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- JPH10295378A JPH10295378A JP12157597A JP12157597A JPH10295378A JP H10295378 A JPH10295378 A JP H10295378A JP 12157597 A JP12157597 A JP 12157597A JP 12157597 A JP12157597 A JP 12157597A JP H10295378 A JPH10295378 A JP H10295378A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 プラスミドｐＵＢ１１０の複製開始点、
複製開始タンパク質遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子以
外の部分に、バチルス属細菌由来のプロモーター及びＳ
Ｄ配列を含む発現調節領域遺伝子を１つ以上保持させる
ことのできる、新規発現プラスミドベクターｐＮＹ。 【効果】 本プラスミドベクターに異種遺伝子を結合し
てなる発現プラスミドで細菌を形質転換し、該形質転換
体を培養することにより、該異種遺伝子産物を効率よく
製造できる。
複製開始タンパク質遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子以
外の部分に、バチルス属細菌由来のプロモーター及びＳ
Ｄ配列を含む発現調節領域遺伝子を１つ以上保持させる
ことのできる、新規発現プラスミドベクターｐＮＹ。 【効果】 本プラスミドベクターに異種遺伝子を結合し
てなる発現プラスミドで細菌を形質転換し、該形質転換
体を培養することにより、該異種遺伝子産物を効率よく
製造できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、バイオテクノロジ
ーに関するものであり、更に詳細には、本発明は新規発
現プラスミドベクター及び異種遺伝子を結合した該発現
プラスミドでバチルス属細菌を形質転換し、該形質転換
体を培養し、培養物中に異種遺伝子産物を生成蓄積せし
めこれを採取することを特徴とする該異種遺伝子産物の
製造法に関する。
ーに関するものであり、更に詳細には、本発明は新規発
現プラスミドベクター及び異種遺伝子を結合した該発現
プラスミドでバチルス属細菌を形質転換し、該形質転換
体を培養し、培養物中に異種遺伝子産物を生成蓄積せし
めこれを採取することを特徴とする該異種遺伝子産物の
製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】現在、食品、薬品、化粧品その他の産業
において、遺伝子組換え技術及び組換え体を用いて生産
した異種遺伝子産物が広く利用されている。遺伝子組換
えの宿主としては、大腸菌（Escherichia coli）、枯草
菌（Bacillus subtilis）、バチルス・ブレビス（Bacil
lus brevis）などの細菌や酵母、糸状菌または動物細胞
などが使用されているが、遺伝子組換え技術は大腸菌の
系を中心に発展してきたため、大腸菌が宿主菌として最
も頻繁に用いられている。
において、遺伝子組換え技術及び組換え体を用いて生産
した異種遺伝子産物が広く利用されている。遺伝子組換
えの宿主としては、大腸菌（Escherichia coli）、枯草
菌（Bacillus subtilis）、バチルス・ブレビス（Bacil
lus brevis）などの細菌や酵母、糸状菌または動物細胞
などが使用されているが、遺伝子組換え技術は大腸菌の
系を中心に発展してきたため、大腸菌が宿主菌として最
も頻繁に用いられている。
【０００３】しかし大腸菌を宿主とする系では、生産さ
れる異種遺伝子産物は細胞質中またはペリプラズム空間
にとどまり、培地中へ分泌生産させることは困難であっ
た。また、細胞内の異種遺伝子産物の蓄積は量的に限界
があり、その上菌体を破砕して回収しなければならず、
菌体内成分である核酸などの共存物質から目的とする異
種遺伝子産物を分離、精製することが必要であった。さ
らに、生産されたペプチドやタンパク質が封入体（incl
usion body）を形成するものもあり、封入体が形成され
た場合再生操作を行って活性型にする必要があるなどの
欠点があった。
れる異種遺伝子産物は細胞質中またはペリプラズム空間
にとどまり、培地中へ分泌生産させることは困難であっ
た。また、細胞内の異種遺伝子産物の蓄積は量的に限界
があり、その上菌体を破砕して回収しなければならず、
菌体内成分である核酸などの共存物質から目的とする異
種遺伝子産物を分離、精製することが必要であった。さ
らに、生産されたペプチドやタンパク質が封入体（incl
usion body）を形成するものもあり、封入体が形成され
た場合再生操作を行って活性型にする必要があるなどの
欠点があった。
【０００４】バチルス属細菌には酵素タンパク質を大量
に分泌生産するものが多く、この性質を利用した宿主ベ
クター系の開発が活発に行われている。バチルス属細
菌、なかでも枯草菌は、遺伝学的にも生化学的にもよく
研究され、異種遺伝子産物の分泌生産に関する研究も数
多くなされている。しかし、枯草菌を宿主とする系では
菌体内外の強いプロテアーゼにより生産したペプチドや
タンパク質などの異種遺伝子産物が分解されてしまうな
どの問題があった。
に分泌生産するものが多く、この性質を利用した宿主ベ
クター系の開発が活発に行われている。バチルス属細
菌、なかでも枯草菌は、遺伝学的にも生化学的にもよく
研究され、異種遺伝子産物の分泌生産に関する研究も数
多くなされている。しかし、枯草菌を宿主とする系では
菌体内外の強いプロテアーゼにより生産したペプチドや
タンパク質などの異種遺伝子産物が分解されてしまうな
どの問題があった。
【０００５】これらの欠点を解消し、異種遺伝子産物を
効率的に生産する宿主を求めて鋭意研究を行ったとこ
ろ、鵜高らは、バチルス・ブレビスには菌体外にプロテ
アーゼを生産しない菌株が多いことを見いだし、その１
菌株バチルス・ブレビス４７（S. Udaka and H. Yamaga
ta, Methods in Enzymology、217 23-33(1993)）の主要
菌体外蛋白質（H. Yamagata et al, J. Bacteriol., 16
9, 1239(1987)；塚越規弘、日本農芸化学会誌、61, 68
(1987)にそれぞれ“outer wall protein and middle wa
ll protein”、“主要菌体外蛋白質”として記載されて
いる。）遺伝子のプロモーター及び該主要菌体外蛋白質
の１種であるＭＷタンパク質（middle wall protein：M
WP）のシグナルペプチドをコードする領域を用いて分泌
ベクターを作製し、本菌株を宿主としてα−アミラーゼ
（H. Yamagata et al, J. Bacteriol., 169, 1239(198
7)）やブタペプシノーゲン（鵜高重三、日本農芸化学会
昭和６２年度大会講演要旨集、ｐ８３７−８３８；塚越
規弘、日本農芸化学会誌、61, 68(1987)）の分泌生産に
成功した。
効率的に生産する宿主を求めて鋭意研究を行ったとこ
ろ、鵜高らは、バチルス・ブレビスには菌体外にプロテ
アーゼを生産しない菌株が多いことを見いだし、その１
菌株バチルス・ブレビス４７（S. Udaka and H. Yamaga
ta, Methods in Enzymology、217 23-33(1993)）の主要
菌体外蛋白質（H. Yamagata et al, J. Bacteriol., 16
9, 1239(1987)；塚越規弘、日本農芸化学会誌、61, 68
(1987)にそれぞれ“outer wall protein and middle wa
ll protein”、“主要菌体外蛋白質”として記載されて
いる。）遺伝子のプロモーター及び該主要菌体外蛋白質
の１種であるＭＷタンパク質（middle wall protein：M
WP）のシグナルペプチドをコードする領域を用いて分泌
ベクターを作製し、本菌株を宿主としてα−アミラーゼ
（H. Yamagata et al, J. Bacteriol., 169, 1239(198
7)）やブタペプシノーゲン（鵜高重三、日本農芸化学会
昭和６２年度大会講演要旨集、ｐ８３７−８３８；塚越
規弘、日本農芸化学会誌、61, 68(1987)）の分泌生産に
成功した。
【０００６】また、高木らは、プロテアーゼを菌体外に
生産しない菌株バチルス・ブレビスＨＰＤ３１（なお、
この菌株はバチルス・ブレビスＨ１０２（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−１０８７）と同一菌株である）を分離し、そしてこ
のバチルス・ブレビスＨＰＤ３１を宿主として耐熱性α
−アミラーゼの高分泌生産（H. Takagi et al, Agric,
Biol. Chem., 53, 2279-2280(1989)）に成功した。さら
に、山形らは、ヒト上皮細胞増殖因子（human Epiderma
l Growth Factor：h-EGF）の高分泌生産（H. Yamagata
et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 86, 3589-3593(1
989))にも成功している。
生産しない菌株バチルス・ブレビスＨＰＤ３１（なお、
この菌株はバチルス・ブレビスＨ１０２（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−１０８７）と同一菌株である）を分離し、そしてこ
のバチルス・ブレビスＨＰＤ３１を宿主として耐熱性α
−アミラーゼの高分泌生産（H. Takagi et al, Agric,
Biol. Chem., 53, 2279-2280(1989)）に成功した。さら
に、山形らは、ヒト上皮細胞増殖因子（human Epiderma
l Growth Factor：h-EGF）の高分泌生産（H. Yamagata
et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 86, 3589-3593(1
989))にも成功している。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】このバチルス・ブレビ
スをはじめ、バチルス属細菌を宿主とする異種遺伝子産
物の生産系に用いる発現プラスミドベクターは、バチル
ス属細菌で複製可能なプラスミドを用い、発現調節領域
として適合するプロモーター及びＳＤ配列を組み込み、
さらにその下流には翻訳開始コドンから始まる分泌シグ
ナル配列、異種遺伝子、ターミネーターを接続してい
る。この時に使用される発現プラスミドベクターは、ス
タフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureu
s）由来のプラスミドｐＵＢ１１０（T. McKenzie, et a
l., Plasmid. 15, 95-103(1986))をベースに構築された
ものが多い。
スをはじめ、バチルス属細菌を宿主とする異種遺伝子産
物の生産系に用いる発現プラスミドベクターは、バチル
ス属細菌で複製可能なプラスミドを用い、発現調節領域
として適合するプロモーター及びＳＤ配列を組み込み、
さらにその下流には翻訳開始コドンから始まる分泌シグ
ナル配列、異種遺伝子、ターミネーターを接続してい
る。この時に使用される発現プラスミドベクターは、ス
タフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureu
s）由来のプラスミドｐＵＢ１１０（T. McKenzie, et a
l., Plasmid. 15, 95-103(1986))をベースに構築された
ものが多い。
【０００８】ｐＮＨ２００、ｐＮＨ４００（Ishihara,
T., et al. J. Bacteriol., 177, 745-749(1995))、ｐ
ＮＨ３００は、ｐＵＢ１１０をベースに構築された発現
プラスミドベクターで、バチルス・ブレビスを宿主菌と
する系で頻繁に利用されている。このｐＮＨ系の発現プ
ラスミドベクターは前記したＭＷＰのプロモーター（配
列番号１）を使用しているが、従来５個タンデムに存在
するＭＷＰプロモーターをそのまま用いたものがｐＮＨ
２００であり、５個から３個に減少させたものがｐＮＨ
４００、１個に減少させたものがｐＮＨ３００である。
異種遺伝子の発現においては必ずしも強いプロモーター
を有することが高生産性を示すとは限らず、高生産形質
転換株を得るためにプロモーター活性の強弱の異なるど
のベクターを使用するかを検討することは重要である。
T., et al. J. Bacteriol., 177, 745-749(1995))、ｐ
ＮＨ３００は、ｐＵＢ１１０をベースに構築された発現
プラスミドベクターで、バチルス・ブレビスを宿主菌と
する系で頻繁に利用されている。このｐＮＨ系の発現プ
ラスミドベクターは前記したＭＷＰのプロモーター（配
列番号１）を使用しているが、従来５個タンデムに存在
するＭＷＰプロモーターをそのまま用いたものがｐＮＨ
２００であり、５個から３個に減少させたものがｐＮＨ
４００、１個に減少させたものがｐＮＨ３００である。
異種遺伝子の発現においては必ずしも強いプロモーター
を有することが高生産性を示すとは限らず、高生産形質
転換株を得るためにプロモーター活性の強弱の異なるど
のベクターを使用するかを検討することは重要である。
【０００９】しかし、これらｐＮＨ系で代表されるｐＵ
Ｂ１１０系の発現プラスミドベクターは、その分子内に
ｐＵＢ１１０由来のブレオマイシン（Bleomycin）耐性
遺伝子を保有しており、このブレオマイシン耐性遺伝子
から翻訳された蛋白質の発現量が多く、目的とする異種
遺伝子産物の発現の阻害要因の１つになっている可能性
があった。
Ｂ１１０系の発現プラスミドベクターは、その分子内に
ｐＵＢ１１０由来のブレオマイシン（Bleomycin）耐性
遺伝子を保有しており、このブレオマイシン耐性遺伝子
から翻訳された蛋白質の発現量が多く、目的とする異種
遺伝子産物の発現の阻害要因の１つになっている可能性
があった。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らはこのような
現状に鑑み、バチルス属細菌で安定かつ高発現が可能な
発現プラスミドベクターを開発すべく鋭意検討を行っ
た。
現状に鑑み、バチルス属細菌で安定かつ高発現が可能な
発現プラスミドベクターを開発すべく鋭意検討を行っ
た。
【００１１】本発明者らは、ｐＮＨ系で代表されるｐＵ
Ｂ１１０系の発現プラスミドベクターからブレオマイシ
ン耐性遺伝子を除去した新規発現プラスミドベクターｐ
ＮＹを構築し、バチルス・ブレビスを形質転換して異種
遺伝子産物を生産させたところ異種遺伝子産物の生産量
がｐＮＨ系の発現プラスミドベクターに比べて増加する
ことを確認し本発明を完成した。
Ｂ１１０系の発現プラスミドベクターからブレオマイシ
ン耐性遺伝子を除去した新規発現プラスミドベクターｐ
ＮＹを構築し、バチルス・ブレビスを形質転換して異種
遺伝子産物を生産させたところ異種遺伝子産物の生産量
がｐＮＨ系の発現プラスミドベクターに比べて増加する
ことを確認し本発明を完成した。
【００１２】すなわち本発明は、バチルス属細菌で安定
かつ高発現が可能な新規発現プラスミドベクターに関す
るものである。また本発明は、この発現プラスミドベク
ターに目的とするペプチドやタンパク質などの異種遺伝
子産物をコードする遺伝子を連結した発現プラスミドで
バチルス属細菌を形質転換し、該形質転換体を培養する
ことによる異種遺伝子産物の製造方法に関するものであ
る。以下、本発明について詳しく説明する。
かつ高発現が可能な新規発現プラスミドベクターに関す
るものである。また本発明は、この発現プラスミドベク
ターに目的とするペプチドやタンパク質などの異種遺伝
子産物をコードする遺伝子を連結した発現プラスミドで
バチルス属細菌を形質転換し、該形質転換体を培養する
ことによる異種遺伝子産物の製造方法に関するものであ
る。以下、本発明について詳しく説明する。
【００１３】本発明発現プラスミドベクターは、ブレオ
マイシン耐性遺伝子を除去したｐＵＢ１１０由来のプラ
スミドに関するものであり、その分子内にはバチルス属
細菌の遺伝子より調製した発現調節領域の遺伝子を保有
させることができる。発現調節領域は、転写開始部位で
あるプロモーター及びリボソーム結合領域（ＳＤ配列）
を含むが、本発明プラスミドベクターの発現調節領域の
プロモーターとしては、バチルス属細菌の遺伝子より調
製し、バチルス属細菌内で機能するプロモーターであれ
ばどのプロモーターを使用してもよい。
マイシン耐性遺伝子を除去したｐＵＢ１１０由来のプラ
スミドに関するものであり、その分子内にはバチルス属
細菌の遺伝子より調製した発現調節領域の遺伝子を保有
させることができる。発現調節領域は、転写開始部位で
あるプロモーター及びリボソーム結合領域（ＳＤ配列）
を含むが、本発明プラスミドベクターの発現調節領域の
プロモーターとしては、バチルス属細菌の遺伝子より調
製し、バチルス属細菌内で機能するプロモーターであれ
ばどのプロモーターを使用してもよい。
【００１４】例えば、バチルス・ブレビスのＭＷＰプロ
モーター（配列番号１：前述）やＨＷＰプロモーター
（配列番号２：特公平８−４５１１）、バチルス・ズブ
チリスのＳｐａｃプロモーター（Methods in enzymolog
y, 185, 199-228(1990))やレバンスクラーゼプロモータ
ー(Appl. Environ. Microbiol., 55,2739-2744(198
9))、バチルス・アミロリキファシエンス（B. amyloliq
uefaciens）のアルカリプロテアーゼプロモーター（Met
hods in enzymology, 185, 1992-228(1990))やα−アミ
ラーゼプロモーター（J. Bacteriol., 165, 796-804(19
86)）または中性プロテアーゼプロモーター（J. Biotec
hnol., 3, 73-84(1985))、バチルス・sp.KSM-64のエン
ドヌクレアーゼプロモーター（Biosci. Biotech. Bioch
em., 59, 2172-2175(1995)）そしてバチルス・ステアロ
サーモフィラス（B. stearothermophilus）の耐熱性枝
つくり酵素プロモーター（Appl. Environ. Microbiol.,
60, 3096-3104(1994))などバチルス属細菌の遺伝子よ
り調製したプロモーターを使用することができる。
モーター（配列番号１：前述）やＨＷＰプロモーター
（配列番号２：特公平８−４５１１）、バチルス・ズブ
チリスのＳｐａｃプロモーター（Methods in enzymolog
y, 185, 199-228(1990))やレバンスクラーゼプロモータ
ー(Appl. Environ. Microbiol., 55,2739-2744(198
9))、バチルス・アミロリキファシエンス（B. amyloliq
uefaciens）のアルカリプロテアーゼプロモーター（Met
hods in enzymology, 185, 1992-228(1990))やα−アミ
ラーゼプロモーター（J. Bacteriol., 165, 796-804(19
86)）または中性プロテアーゼプロモーター（J. Biotec
hnol., 3, 73-84(1985))、バチルス・sp.KSM-64のエン
ドヌクレアーゼプロモーター（Biosci. Biotech. Bioch
em., 59, 2172-2175(1995)）そしてバチルス・ステアロ
サーモフィラス（B. stearothermophilus）の耐熱性枝
つくり酵素プロモーター（Appl. Environ. Microbiol.,
60, 3096-3104(1994))などバチルス属細菌の遺伝子よ
り調製したプロモーターを使用することができる。
【００１５】これらのプロモーターはこれらのプロモー
ターを保持する細胞から遺伝子組換え法によって調製し
てもよいし化学的に合成したものを用いてもよい。遺伝
子組換えによって調製する場合には、例えばプロモータ
ーを保有する細胞のゲノムＤＮＡを鋳型とし、プロモー
ターの塩基配列を基に調製したプライマーＤＮＡを用い
ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）法
（Molecular Cloning 2nd ed., A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory, 1989）で調製するこ
とができる。
ターを保持する細胞から遺伝子組換え法によって調製し
てもよいし化学的に合成したものを用いてもよい。遺伝
子組換えによって調製する場合には、例えばプロモータ
ーを保有する細胞のゲノムＤＮＡを鋳型とし、プロモー
ターの塩基配列を基に調製したプライマーＤＮＡを用い
ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）法
（Molecular Cloning 2nd ed., A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory, 1989）で調製するこ
とができる。
【００１６】一方、化学合成法としては、例えば、１０
０塩基以下の長鎖のＤＮＡを合成する場合にはホスホア
ミダイト法（Methods Enzymol., 154, 287-313(1987))
によって市販のＤＮＡ合成機で合成することができる。
１００塩基以上のＤＮＡの場合には、塩基配列を１００
塩基未満の長さに区切り、それぞれのＤＮＡ断片を前記
のように化学合成した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて
これらのＤＮＡ断片を連結すればよい。
０塩基以下の長鎖のＤＮＡを合成する場合にはホスホア
ミダイト法（Methods Enzymol., 154, 287-313(1987))
によって市販のＤＮＡ合成機で合成することができる。
１００塩基以上のＤＮＡの場合には、塩基配列を１００
塩基未満の長さに区切り、それぞれのＤＮＡ断片を前記
のように化学合成した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて
これらのＤＮＡ断片を連結すればよい。
【００１７】ＳＤ配列もバチルス属細菌の遺伝子より調
製したものを使用すればよい。例えばバチルス・ブレビ
スや枯草菌の１６ＳｒＲＮＡの配列に対応して合成した
配列を使用すればよく、具体的には図２及び図３に示し
たＳＤ１やＳＤ２などを用いることが出来る。
製したものを使用すればよい。例えばバチルス・ブレビ
スや枯草菌の１６ＳｒＲＮＡの配列に対応して合成した
配列を使用すればよく、具体的には図２及び図３に示し
たＳＤ１やＳＤ２などを用いることが出来る。
【００１８】このバチルス属細菌由来のプロモーター及
びＳＤ配列を含む発現調節領域遺伝子は、ブレオマイシ
ン耐性遺伝子を除去したｐＵＢ１１０由来の分子内のＯ
ｒｉ領域（複製開始点）、Ｒｅｐ領域（複製開始タンパ
ク質遺伝子）、Ｎｍ r領域（ネオマイシン耐性遺伝子）
以外のどの部分に組み込んでもよく、その数も特に制限
されない。例えば、図１に示すブレオマイシン耐性遺伝
子を除去したプラスミドｐＵＢ１１０由来のプラスミド
ベクターにおいて、Ａ、Ｂ、及び／又はＣで示した領域
に発現調節領域遺伝子を保有させることができる。
びＳＤ配列を含む発現調節領域遺伝子は、ブレオマイシ
ン耐性遺伝子を除去したｐＵＢ１１０由来の分子内のＯ
ｒｉ領域（複製開始点）、Ｒｅｐ領域（複製開始タンパ
ク質遺伝子）、Ｎｍ r領域（ネオマイシン耐性遺伝子）
以外のどの部分に組み込んでもよく、その数も特に制限
されない。例えば、図１に示すブレオマイシン耐性遺伝
子を除去したプラスミドｐＵＢ１１０由来のプラスミド
ベクターにおいて、Ａ、Ｂ、及び／又はＣで示した領域
に発現調節領域遺伝子を保有させることができる。
【００１９】また、発現調節領域の下流には各種制限酵
素切断部位を設けたマルチクローニングサイトを組み込
んでおけば、各種異種遺伝子のクローニングが容易であ
る。マルチクローニングサイトとしては図２及び図３に
示した配列などを用いることが出来る。さらにペプチド
やタンパク質などの異種遺伝子産物をコードする遺伝子
の下流、すなわち３′側に転写終了遺伝子であるターミ
ネーターを連結してもよい。ターミネーターは特に限定
されず、例えば、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１株より
単離したＨＳ遺伝子（図２、図３）等のターミネーター
を用いればよい。
素切断部位を設けたマルチクローニングサイトを組み込
んでおけば、各種異種遺伝子のクローニングが容易であ
る。マルチクローニングサイトとしては図２及び図３に
示した配列などを用いることが出来る。さらにペプチド
やタンパク質などの異種遺伝子産物をコードする遺伝子
の下流、すなわち３′側に転写終了遺伝子であるターミ
ネーターを連結してもよい。ターミネーターは特に限定
されず、例えば、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１株より
単離したＨＳ遺伝子（図２、図３）等のターミネーター
を用いればよい。
【００２０】本発明の発現プラスミドベクターの構築に
はスタフィロコッカス・アウレウス由来のｐＵＢ１１０
系の発現プラスミドベクターを用いることができる。ｐ
ＮＨ系の発現プラスミドベクターは、ｐＵＢ１１０にＭ
ＷＰのプロモーターを組み込んだ発現プラスミドベクタ
ーであり、本発明発現プラスミドベクターの構築に利用
できる。具体的にはプロモーターの数が１個のｐＮＨ３
００シリーズ（後述）やプロモーターの数が３個のｐＮ
Ｈ４００シリーズ（Ishihara, T., et al. J.Bacterio
l., 177, 745-749(1995))やプロモーターの数が５個の
ｐＮＨ２００シリーズを用いることができる。
はスタフィロコッカス・アウレウス由来のｐＵＢ１１０
系の発現プラスミドベクターを用いることができる。ｐ
ＮＨ系の発現プラスミドベクターは、ｐＵＢ１１０にＭ
ＷＰのプロモーターを組み込んだ発現プラスミドベクタ
ーであり、本発明発現プラスミドベクターの構築に利用
できる。具体的にはプロモーターの数が１個のｐＮＨ３
００シリーズ（後述）やプロモーターの数が３個のｐＮ
Ｈ４００シリーズ（Ishihara, T., et al. J.Bacterio
l., 177, 745-749(1995))やプロモーターの数が５個の
ｐＮＨ２００シリーズを用いることができる。
【００２１】このｐＮＨ系の発現プラスミドベクターの
中のｐＵＢ１１０由来のブレオマイシン耐性遺伝子以外
の部分をプライマーＤＮＡを用いてＰＣＲ法によって増
幅、回収した後ライゲーションを行えば、ブレオマイシ
ン耐性遺伝子が除去された新規発現プラスミドベクター
ｐＮＹを得ることができる。例えば、ｐＮＨ３００シリ
ーズの発現プラスミドベクターを鋳型にＰＣＲを行えば
ＭＷＰプロモーターが１個の発現プラスミドベクターｐ
ＮＹ３００シリーズを得ることが出来、ｐＮＨ４００シ
リーズの発現プラスミドベクターを鋳型にＰＣＲを行え
ばプロモーターが３個の発現プラスミドベクターｐＮＹ
４００シリーズを、ｐＮＨ２００シリーズの発現プラス
ミドベクターを鋳型にＰＣＲを行えばプロモーターが５
個の発現プラスミドベクターｐＮＹ２００シリーズを得
ることが出来る。
中のｐＵＢ１１０由来のブレオマイシン耐性遺伝子以外
の部分をプライマーＤＮＡを用いてＰＣＲ法によって増
幅、回収した後ライゲーションを行えば、ブレオマイシ
ン耐性遺伝子が除去された新規発現プラスミドベクター
ｐＮＹを得ることができる。例えば、ｐＮＨ３００シリ
ーズの発現プラスミドベクターを鋳型にＰＣＲを行えば
ＭＷＰプロモーターが１個の発現プラスミドベクターｐ
ＮＹ３００シリーズを得ることが出来、ｐＮＨ４００シ
リーズの発現プラスミドベクターを鋳型にＰＣＲを行え
ばプロモーターが３個の発現プラスミドベクターｐＮＹ
４００シリーズを、ｐＮＨ２００シリーズの発現プラス
ミドベクターを鋳型にＰＣＲを行えばプロモーターが５
個の発現プラスミドベクターｐＮＹ２００シリーズを得
ることが出来る。
【００２２】こうして調製した本発明の発現プラスミド
ベクターに連結する有用なペプチドやタンパク質などの
異種遺伝子産物をコードする遺伝子は、バチルス属細菌
で発現可能な遺伝子であれば何れの生物由来の遺伝子で
もよく、ヒト、動物、鳥類、魚類、微生物、ウイルスそ
の他各種生物由来の遺伝子産物（酵素、ホルモン、サイ
トカイン、免疫グロブリンその他生理活性ペプチド、抗
原蛋白質など）の生産に適用できる。
ベクターに連結する有用なペプチドやタンパク質などの
異種遺伝子産物をコードする遺伝子は、バチルス属細菌
で発現可能な遺伝子であれば何れの生物由来の遺伝子で
もよく、ヒト、動物、鳥類、魚類、微生物、ウイルスそ
の他各種生物由来の遺伝子産物（酵素、ホルモン、サイ
トカイン、免疫グロブリンその他生理活性ペプチド、抗
原蛋白質など）の生産に適用できる。
【００２３】これらの異種遺伝子産物をコードする遺伝
子は、公知の方法に従って本発明発現プラスミドベクタ
ーのプロモーター、ＳＤ配列、シグナルペプチドをコー
ドする遺伝子の下流のクローニング用制限酵素サイトに
組み込めばよく、例えば、モレキュラー・クローニング
・ア・ラボラトリーマニュアル第２版、コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリー（Molecular Cloning
2nd ed., A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor L
aboratory, 1989）に記載の方法で行えばよい。
子は、公知の方法に従って本発明発現プラスミドベクタ
ーのプロモーター、ＳＤ配列、シグナルペプチドをコー
ドする遺伝子の下流のクローニング用制限酵素サイトに
組み込めばよく、例えば、モレキュラー・クローニング
・ア・ラボラトリーマニュアル第２版、コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリー（Molecular Cloning
2nd ed., A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor L
aboratory, 1989）に記載の方法で行えばよい。
【００２４】遺伝子の発現に用いる宿主としては、バチ
ルスに属する細菌であればよく、例えば、バチルス・ブ
レビス、バチルス・チョーシネンシス（B. choshinensi
s）などが好適に使用できる。
ルスに属する細菌であればよく、例えば、バチルス・ブ
レビス、バチルス・チョーシネンシス（B. choshinensi
s）などが好適に使用できる。
【００２５】宿主菌を形質転換する方法は公知の方法で
よく、例えば、バチルス・ブレビス、バチルス・チョー
シネンシスではTakahashiらの方法（J. Bacteriol., 15
8, 1130(1983))またはTakagiらの方法（Agric. Biol. C
hem., 53, 3099-3100(1989))などが例示される。
よく、例えば、バチルス・ブレビス、バチルス・チョー
シネンシスではTakahashiらの方法（J. Bacteriol., 15
8, 1130(1983))またはTakagiらの方法（Agric. Biol. C
hem., 53, 3099-3100(1989))などが例示される。
【００２６】得られた形質転換体の培養に用いる培地
は、形質転換体が生育して目的とする異種遺伝子産物を
生産しうるものであれば如何なるものでもよい。該培地
に含有させる炭素源としては、例えば、グルコース、シ
ュークロース、グリセロール、澱粉、デキストリン、糖
蜜、有機酸などが用いられる。また窒素源としては、カ
ゼイン、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ
酸、尿素、グリシンなどの有機窒素源、硫酸アンモニウ
ムなどの無機窒素源などが用いられる。その他、塩化カ
リウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、塩化ナ
トリウム、硫酸マグネシウムなどの無機塩が必要に応じ
て培地に加えられる。栄養要求性を示す菌は、その生育
に必要な栄養物質を培地に添加すればよい。該栄養物質
としては、アミノ酸類、ビタミン類、核酸などが挙げら
れる。
は、形質転換体が生育して目的とする異種遺伝子産物を
生産しうるものであれば如何なるものでもよい。該培地
に含有させる炭素源としては、例えば、グルコース、シ
ュークロース、グリセロール、澱粉、デキストリン、糖
蜜、有機酸などが用いられる。また窒素源としては、カ
ゼイン、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ
酸、尿素、グリシンなどの有機窒素源、硫酸アンモニウ
ムなどの無機窒素源などが用いられる。その他、塩化カ
リウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、塩化ナ
トリウム、硫酸マグネシウムなどの無機塩が必要に応じ
て培地に加えられる。栄養要求性を示す菌は、その生育
に必要な栄養物質を培地に添加すればよい。該栄養物質
としては、アミノ酸類、ビタミン類、核酸などが挙げら
れる。
【００２７】また、培養に際して必要があれば、培地に
抗生物質例えばペニシリン、エリスロマイシン、クロラ
ムフェニコール、バシトラシン、Ｄ−サイクロセリン、
アンピシリン、ネオマイシンなどを加える。更に必要に
より、消泡剤、例えば大豆油、ラード油、各種界面活性
剤などを培地に加えてもよい。
抗生物質例えばペニシリン、エリスロマイシン、クロラ
ムフェニコール、バシトラシン、Ｄ−サイクロセリン、
アンピシリン、ネオマイシンなどを加える。更に必要に
より、消泡剤、例えば大豆油、ラード油、各種界面活性
剤などを培地に加えてもよい。
【００２８】培地の初発ｐＨは、５．０〜９．０、さら
に好ましくは６．５〜７．５である。培養温度は、通
常、１５℃〜４２℃、さらに好ましくは２４℃〜３７℃
であり、培養時間は、通常、１６〜１６６時間、さらに
好ましくは２４〜９６時間である。
に好ましくは６．５〜７．５である。培養温度は、通
常、１５℃〜４２℃、さらに好ましくは２４℃〜３７℃
であり、培養時間は、通常、１６〜１６６時間、さらに
好ましくは２４〜９６時間である。
【００２９】本発明で、形質転換体を前記の条件で培養
することによって、培養物中に異種遺伝子産物が生成、
蓄積される。このようにして得られた異種遺伝子産物
は、公知の方法により、例えば膜処理、硫安分画法、ク
ロマトグラフィーなど（蛋白質・核酸の基礎実験法、南
江堂、（1985)）で精製することができる。
することによって、培養物中に異種遺伝子産物が生成、
蓄積される。このようにして得られた異種遺伝子産物
は、公知の方法により、例えば膜処理、硫安分画法、ク
ロマトグラフィーなど（蛋白質・核酸の基礎実験法、南
江堂、（1985)）で精製することができる。
【００３０】以下本発明を実施例により更に詳しく説明
するが、これは例示的なものであり、本発明はこれに限
定されるものではない。
するが、これは例示的なものであり、本発明はこれに限
定されるものではない。
【００３１】
【実施例１】 プラスミドベクターｐＮＹ３０１の構築
【００３２】（１）ｐＮＨ３０１の構築 ＭＷＰ遺伝子のＰ５プロモーター、シグナル配列を得る
ために、ｐＮＵ２１０（S. Udaka, et al. Methods in
Enzymology, 217, 23-33(1993))を鋳型に、配列番号３
のプライマーと配列番号４のプライマーを用いてＰＣＲ
を行った。
ために、ｐＮＵ２１０（S. Udaka, et al. Methods in
Enzymology, 217, 23-33(1993))を鋳型に、配列番号３
のプライマーと配列番号４のプライマーを用いてＰＣＲ
を行った。
【００３３】ＰＣＲは、配列番号３のプライマーと配列
番号４のプライマーを各々１００ｐｍｏｌ、Ｔａｑポリ
メラーゼ ２．５単位、ｄＮＴＰ ２００μＭ、ｐＮＵ
２１０鋳型ＤＮＡ １ｎｇ、１００μｌ Ｔａｑ緩衝液
（１０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．５）、２．５ｍＭ
Ｍｇ++、５０ｍＭ 塩化カリウム、１００μｇ／ｍｌ
ウシ血清アルブミン）を混合し、９６℃で３０秒保持し
た後、ＤＮＡの熱変性（９４℃、６０秒）、プライマー
のアニーリング（５４℃、６０秒）、プライマーの伸長
（７０℃、６０秒）を２５サイクルさせることによって
行った。
番号４のプライマーを各々１００ｐｍｏｌ、Ｔａｑポリ
メラーゼ ２．５単位、ｄＮＴＰ ２００μＭ、ｐＮＵ
２１０鋳型ＤＮＡ １ｎｇ、１００μｌ Ｔａｑ緩衝液
（１０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．５）、２．５ｍＭ
Ｍｇ++、５０ｍＭ 塩化カリウム、１００μｇ／ｍｌ
ウシ血清アルブミン）を混合し、９６℃で３０秒保持し
た後、ＤＮＡの熱変性（９４℃、６０秒）、プライマー
のアニーリング（５４℃、６０秒）、プライマーの伸長
（７０℃、６０秒）を２５サイクルさせることによって
行った。
【００３４】ＰＣＲで増幅した約２６０ｂｐの遺伝子を
制限酵素ＡａｔIIとＸｂａＩで切断し、プラスミドｐＧ
ＥＭ−７Ｚｆ（プロメガ社製）のＡａｔII，ＸｂａＩサ
イトにＴ４リガーゼを用いて連結後、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ
Ｍ１０９に形質転換し、プラスミドｐＧＥＭ−Ｐ５を得
た。
制限酵素ＡａｔIIとＸｂａＩで切断し、プラスミドｐＧ
ＥＭ−７Ｚｆ（プロメガ社製）のＡａｔII，ＸｂａＩサ
イトにＴ４リガーゼを用いて連結後、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ
Ｍ１０９に形質転換し、プラスミドｐＧＥＭ−Ｐ５を得
た。
【００３５】バチルス・ブレビスＨＰＤ３１の染色体よ
り得た約１５０ｂｐのステムループ構造を有するＨＳ遺
伝子（ターミネーター遺伝子：特願平８−１２３９７
０）の両端がＨｉｎｄIIIとＮｓｉＩサイトになるよう
に前記と同じ条件にてＰＣＲで増幅し、ｐＧＥＭ−Ｐ５
のＨｉｎｄIIIとＮｓｉＩサイトに挿入し、ｐＧＥＭ−
Ｐ５ＨＳを得た。
り得た約１５０ｂｐのステムループ構造を有するＨＳ遺
伝子（ターミネーター遺伝子：特願平８−１２３９７
０）の両端がＨｉｎｄIIIとＮｓｉＩサイトになるよう
に前記と同じ条件にてＰＣＲで増幅し、ｐＧＥＭ−Ｐ５
のＨｉｎｄIIIとＮｓｉＩサイトに挿入し、ｐＧＥＭ−
Ｐ５ＨＳを得た。
【００３６】ｐＧＥＭ−Ｐ５ＨＳをＡａｔIIとＮｓｉＩ
で切断しＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑化したＤＮＡ
断片４５４ｂｐを、ｐＵＢ１１０（T. McKenzie, et a
l, Plasmid, 15. 95-103(1986))をＰｖｕIIとＡｃｃＩ
で切断後ＤＮＡポリメラーゼで平滑化した３４４７ｂｐ
のＤＮＡ断片に連結し、これをバチルス・ブレビスＨＰ
Ｄ３１にエレクトロポレーション法（Agric. Biol. Che
m., 53, 3099-3100(1989))で導入しプラスミドベクター
ｐＮＨ３０１を得た。ｐＮＨ３０１の制限酵素地図及び
プロモーターを含む一部の塩基配列を図２に示した。
で切断しＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑化したＤＮＡ
断片４５４ｂｐを、ｐＵＢ１１０（T. McKenzie, et a
l, Plasmid, 15. 95-103(1986))をＰｖｕIIとＡｃｃＩ
で切断後ＤＮＡポリメラーゼで平滑化した３４４７ｂｐ
のＤＮＡ断片に連結し、これをバチルス・ブレビスＨＰ
Ｄ３１にエレクトロポレーション法（Agric. Biol. Che
m., 53, 3099-3100(1989))で導入しプラスミドベクター
ｐＮＨ３０１を得た。ｐＮＨ３０１の制限酵素地図及び
プロモーターを含む一部の塩基配列を図２に示した。
【００３７】（２）ｐＮＹ３０１の構築 ｐＮＨ３０１を鋳型に、配列番号５のプライマーと配列
番号６のプライマーを用いてＰＣＲを行った。
番号６のプライマーを用いてＰＣＲを行った。
【００３８】ＰＣＲは、配列番号５のプライマーと配列
番号６のプライマーを各々１００ｐｍｏｌ、Ｔａｑポリ
メラーゼ２．５単位、ｄＮＴＰ ２００μＭ、ｐＮＨ３
０１鋳型ＤＮＡ １ｎｇ、１００μｌ Ｔａｑ緩衝液
（１０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．５）、２．５ｍＭ
Ｍｇ++、５０ｍＭ 塩化カリウム、１００μｇ／ｍｌ
ウシ血清アルブミン）を混合し、９６℃で３０秒保持し
た後、ＤＮＡの熱変性（９４℃、６０秒）、プライマー
のアニーリング（５４℃、１２０秒）、プライマーの伸
長（７０℃、１８０秒）を２５サイクルさせることによ
って行った。ＰＣＲで増幅した約３．４ｋｂの遺伝子を
Ｓｓｅ８３８７Ｉで切断、Ｔ４リガーゼを用いて連結し
バチルス・プレビスＨＰＤ３１にエレクトロポレーショ
ン法で導入し、プラスミドベクターｐＮＹ３０１を得
た。
番号６のプライマーを各々１００ｐｍｏｌ、Ｔａｑポリ
メラーゼ２．５単位、ｄＮＴＰ ２００μＭ、ｐＮＨ３
０１鋳型ＤＮＡ １ｎｇ、１００μｌ Ｔａｑ緩衝液
（１０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．５）、２．５ｍＭ
Ｍｇ++、５０ｍＭ 塩化カリウム、１００μｇ／ｍｌ
ウシ血清アルブミン）を混合し、９６℃で３０秒保持し
た後、ＤＮＡの熱変性（９４℃、６０秒）、プライマー
のアニーリング（５４℃、１２０秒）、プライマーの伸
長（７０℃、１８０秒）を２５サイクルさせることによ
って行った。ＰＣＲで増幅した約３．４ｋｂの遺伝子を
Ｓｓｅ８３８７Ｉで切断、Ｔ４リガーゼを用いて連結し
バチルス・プレビスＨＰＤ３１にエレクトロポレーショ
ン法で導入し、プラスミドベクターｐＮＹ３０１を得
た。
【００３９】ｐＮＹ３０１の制限酵素地図及びプロモー
ターを含む一部の塩基配列を図３に示した。プラスミド
ベクターｐＮＹ３０１を保持するバチルス・ブレビスＨ
ＰＤ３１／ｐＮＹ３０１は、通産省工業技術院生命工学
工業技術研究所にＦＥＲＭＰ−１５９３４として寄託さ
れている。
ターを含む一部の塩基配列を図３に示した。プラスミド
ベクターｐＮＹ３０１を保持するバチルス・ブレビスＨ
ＰＤ３１／ｐＮＹ３０１は、通産省工業技術院生命工学
工業技術研究所にＦＥＲＭＰ−１５９３４として寄託さ
れている。
【００４０】
【実施例２】 プラスミドベクターｐＮＹ３０１の形質転換効率 実施例１で得たプラスミドベクターｐＮＹ３０１及びｐ
ＮＨ３０１各々１ｎｇをバチルス・ブレビスＨＰＤ３１
にエレクトロポレーション法で導入した。反応終了後、
各々の反応液１μｌをＴＭＮ平板培地（ネオマイシン５
０μｇ／ｍｌを含む）に塗抹し、生じたコロニーを計数
し、各々のプラスミドベクターの形質転換効率を求め
た。表７に結果を示した。プラスミドベクターｐＮＹ３
０１はｐＮＨ３０１に比べ５倍以上の形質転換率を示
し、より効率的に宿主に形質転換出来ることが分かっ
た。
ＮＨ３０１各々１ｎｇをバチルス・ブレビスＨＰＤ３１
にエレクトロポレーション法で導入した。反応終了後、
各々の反応液１μｌをＴＭＮ平板培地（ネオマイシン５
０μｇ／ｍｌを含む）に塗抹し、生じたコロニーを計数
し、各々のプラスミドベクターの形質転換効率を求め
た。表７に結果を示した。プラスミドベクターｐＮＹ３
０１はｐＮＨ３０１に比べ５倍以上の形質転換率を示
し、より効率的に宿主に形質転換出来ることが分かっ
た。
【００４１】
【表７】
【００４２】
【実施例３】 プラスミドベクターｐＮＹ３０１の宿主中での保持率 組換え体を用いて大型培養槽にて異種遺伝子産物の大量
生産を行う場合、小スケールから段階的にスケールアッ
プする必要があり、大量培養では植継ぎでの安定性が必
要とされる。
生産を行う場合、小スケールから段階的にスケールアッ
プする必要があり、大量培養では植継ぎでの安定性が必
要とされる。
【００４３】実施例２で得たバチルス・ブレビスＨＰＤ
３１／ｐＮＹ３０１、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１／
ｐＮＨ３０１各々をＴＭ液体培地を３ｍｌ分注した試験
管に植菌し、３０℃で培養した。２４時間培養後、培養
液４μｌをとり、うち３μｌをＴＭ液体培地に植継ぎ同
じ条件で培養した。残りの培養液１μｌをＴＭ平板培地
に塗抹し、一晩３０℃で培養し、生じたコロニーを計数
した。さらにこのプレートをＴＭＮ平板培地にレプリカ
し３０℃で一晩培養を行い、生じたコロニーを計数し、
下記式にて各々のプラスミドベクターの保持率を求め
た。 プラスミドベクター保持率（％）＝（ＴＭＮ平板培地で
生じたコロニー数／ＴＭ平板培地で生じたコロニー数）
×１００
３１／ｐＮＹ３０１、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１／
ｐＮＨ３０１各々をＴＭ液体培地を３ｍｌ分注した試験
管に植菌し、３０℃で培養した。２４時間培養後、培養
液４μｌをとり、うち３μｌをＴＭ液体培地に植継ぎ同
じ条件で培養した。残りの培養液１μｌをＴＭ平板培地
に塗抹し、一晩３０℃で培養し、生じたコロニーを計数
した。さらにこのプレートをＴＭＮ平板培地にレプリカ
し３０℃で一晩培養を行い、生じたコロニーを計数し、
下記式にて各々のプラスミドベクターの保持率を求め
た。 プラスミドベクター保持率（％）＝（ＴＭＮ平板培地で
生じたコロニー数／ＴＭ平板培地で生じたコロニー数）
×１００
【００４４】更に上記操作を繰り返し、各植継ぎ回数に
よるプラスミドベクターの保持率を調べた。植継ぎ後の
プラスミドベクターの保持率を図４に示した。
よるプラスミドベクターの保持率を調べた。植継ぎ後の
プラスミドベクターの保持率を図４に示した。
【００４５】上記結果から明らかなように、プラスミド
ベクターｐＮＹ３０１は、５回植継ぎ後も安定に宿主に
保持されたが、対照であるプラスミドベクターｐＮＨ３
０１は植継ぎを重ねるに従って宿主での保持率は低下し
た。
ベクターｐＮＹ３０１は、５回植継ぎ後も安定に宿主に
保持されたが、対照であるプラスミドベクターｐＮＨ３
０１は植継ぎを重ねるに従って宿主での保持率は低下し
た。
【００４６】
【実施例４】 プラスミドベクターｐＮＨ３０１ＢＬＡ及びｐＮＹ３０
１ＢＬＡの構築 実施例１で構築したプラスミドベクターｐＮＨ３０１及
びｐＮＹ３０１を制限酵素ＡｐａＬＩ、ＢａｍＨＩで消
化し、各々３．９、３．４ｋｂの断片を得た。一方、プ
ラスミドベクターｐＨＴ１１０ＢＬＡ（特開平６−１３
３７８２）をＡｐａＬＩ、ＢｃｌＩで消化して、ＭＷＰ
のシグナルペプチドの一部とバチルス・リケニホルミス
（B. licheniformis）のα−アミラーゼ（ＢＬＡ）遺伝
子を含む約１．５ｋｂの断片を得、先に得た各々の３．
９ｋｂと３．４ｋｂ断片とＴ４リガーゼで連結し、プラ
スミドベクターｐＮＨ３０１ＢＬＡ及びｐＮＹ３０１Ｂ
ＬＡを得た（図５）。
１ＢＬＡの構築 実施例１で構築したプラスミドベクターｐＮＨ３０１及
びｐＮＹ３０１を制限酵素ＡｐａＬＩ、ＢａｍＨＩで消
化し、各々３．９、３．４ｋｂの断片を得た。一方、プ
ラスミドベクターｐＨＴ１１０ＢＬＡ（特開平６−１３
３７８２）をＡｐａＬＩ、ＢｃｌＩで消化して、ＭＷＰ
のシグナルペプチドの一部とバチルス・リケニホルミス
（B. licheniformis）のα−アミラーゼ（ＢＬＡ）遺伝
子を含む約１．５ｋｂの断片を得、先に得た各々の３．
９ｋｂと３．４ｋｂ断片とＴ４リガーゼで連結し、プラ
スミドベクターｐＮＨ３０１ＢＬＡ及びｐＮＹ３０１Ｂ
ＬＡを得た（図５）。
【００４７】
【実施例５】 プラスミドベクターｐＮＨ３０１ＢＬＡ及びｐＮＹ３０
１ＢＬＡを用いてのＢＬＡの分泌生産 実施例４で得たプラスミドベクターｐＮＨ３０１ＢＬＡ
及びｐＮＹ３０１ＢＬＡ各々でバチルス・ブレビスＨＰ
Ｄ３１／ｐＮＹ３０１（ＦＥＲＭ Ｐ−１５９３４）を
エレクトロポレーション法で形質転換し、ｐＮＨ３０１
ＢＬＡ、ｐＮＹ３０１ＢＬＡ各々を保持する形質転換
体、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１／ｐＮＨ３０１ＢＬ
Ａ、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１／ｐＮＹ３０１ＢＬ
Ａを得た。各々３株の形質転換体を、５００ｍｌ容三角
フラスコにＴＭＮ培地１００ｍｌを分注し、１２１℃、
１５分間オートクレーブ滅菌した後、冷却した培地に接
種し、３０℃で３日間振とう培養した。この培養液を遠
心分離し、その培養上清のアミラーゼ活性を可溶性澱粉
を基質として斎藤の方法（Arch. Biochem. Biophys.,15
5, 290(1973)を用いて測定した（図６）。バチルス・ブ
レビスＨＰＤ３１／ｐＮＹ３０１ＢＬＡは、バチルス・
ブレビスＨＰＤ３１／ｐＮＨ３０１ＢＬＡの２倍以上の
ＢＬＡを生産し、各々の形質転換体の生産量のバラツキ
も少なく安定していた。
１ＢＬＡを用いてのＢＬＡの分泌生産 実施例４で得たプラスミドベクターｐＮＨ３０１ＢＬＡ
及びｐＮＹ３０１ＢＬＡ各々でバチルス・ブレビスＨＰ
Ｄ３１／ｐＮＹ３０１（ＦＥＲＭ Ｐ−１５９３４）を
エレクトロポレーション法で形質転換し、ｐＮＨ３０１
ＢＬＡ、ｐＮＹ３０１ＢＬＡ各々を保持する形質転換
体、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１／ｐＮＨ３０１ＢＬ
Ａ、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１／ｐＮＹ３０１ＢＬ
Ａを得た。各々３株の形質転換体を、５００ｍｌ容三角
フラスコにＴＭＮ培地１００ｍｌを分注し、１２１℃、
１５分間オートクレーブ滅菌した後、冷却した培地に接
種し、３０℃で３日間振とう培養した。この培養液を遠
心分離し、その培養上清のアミラーゼ活性を可溶性澱粉
を基質として斎藤の方法（Arch. Biochem. Biophys.,15
5, 290(1973)を用いて測定した（図６）。バチルス・ブ
レビスＨＰＤ３１／ｐＮＹ３０１ＢＬＡは、バチルス・
ブレビスＨＰＤ３１／ｐＮＨ３０１ＢＬＡの２倍以上の
ＢＬＡを生産し、各々の形質転換体の生産量のバラツキ
も少なく安定していた。
【００４８】
【実施例６】 プラスミドベクターｐＮＹ３０１／ＢＬＡの安定性 実施例５で調製したバチルス・ブレビスＨＰＤ３１／ｐ
ＮＹ３０１ＢＬＡ、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１／ｐ
ＮＨ３０１ＢＬＡを、ＴＭＮ液体培地３ｍｌを分注した
試験管に植菌し２日間培養した。１０5倍希釈した培養
液０．１ｍｌを、デンプンを３％含んだＴＭＮ寒天培地
に塗末し一晩培養した。生じたコロニー周辺のハローの
有無を肉眼で観察した（表８）。
ＮＹ３０１ＢＬＡ、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１／ｐ
ＮＨ３０１ＢＬＡを、ＴＭＮ液体培地３ｍｌを分注した
試験管に植菌し２日間培養した。１０5倍希釈した培養
液０．１ｍｌを、デンプンを３％含んだＴＭＮ寒天培地
に塗末し一晩培養した。生じたコロニー周辺のハローの
有無を肉眼で観察した（表８）。
【００４９】
【表８】
【００５０】バチルス・ブレビスＨＰＤ３１／ｐＮＨ３
０１ＢＬＡを塗末したプレートに生じたコロニーの５％
程が周辺にハローを形成しなくなっていたが、バチルス
・ブレビスＨＰＤ３１／ｐＮＹ３０１ＢＬＡを塗末した
プレートでは、全てのコロニーが周辺にハローを形成し
ていた。バチルス・ブレビスＨＰＤ３１／ｐＮＨ３０１
ＢＬＡを塗末したプレートのハローを形成しない形質転
換体を液体培養し、プラスミドベクターをアルカリ抽出
法（Birnboim H. C, and Doly J. Nucleic Acid Res.,
7. 1513(1979)）によって抽出した。抽出したプラスミ
ドベクターをアガロースゲル電気泳動に供し、その泳動
パターンを調べた（図７）。
０１ＢＬＡを塗末したプレートに生じたコロニーの５％
程が周辺にハローを形成しなくなっていたが、バチルス
・ブレビスＨＰＤ３１／ｐＮＹ３０１ＢＬＡを塗末した
プレートでは、全てのコロニーが周辺にハローを形成し
ていた。バチルス・ブレビスＨＰＤ３１／ｐＮＨ３０１
ＢＬＡを塗末したプレートのハローを形成しない形質転
換体を液体培養し、プラスミドベクターをアルカリ抽出
法（Birnboim H. C, and Doly J. Nucleic Acid Res.,
7. 1513(1979)）によって抽出した。抽出したプラスミ
ドベクターをアガロースゲル電気泳動に供し、その泳動
パターンを調べた（図７）。
【００５１】ハローを形成しなかったｐＮＨ３０１ＢＬ
Ａは、そのほとんどが小さなサイズになっており、プラ
スミドの一部欠失が起っているものと思われた。この結
果から、ｐＮＹ３０１ＢＬＡは、ｐＮＨ３０１ＢＬＡよ
り安定であり、プラスミドベクターとしての有用性がよ
り高いことが確認された。
Ａは、そのほとんどが小さなサイズになっており、プラ
スミドの一部欠失が起っているものと思われた。この結
果から、ｐＮＹ３０１ＢＬＡは、ｐＮＨ３０１ＢＬＡよ
り安定であり、プラスミドベクターとしての有用性がよ
り高いことが確認された。
【００５２】
【実施例７】 プラスミドベクターｐＮＨ３０１ｈＥＧＦ及びｐＮＹ３
０１ｈＥＧＦの構築 プラスミドベクターｐＮＨ３０１及びｐＮＹ３０１を制
限酵素ＡｐａＬＩ、ＰｓｔＩで消化し、各々３．９ｋｂ
および３．４ｋｂのＤＮＡ断片を得た。一方、プラスミ
ドベクターｐＨＴ１１０ＥＧＦ（特開平６−１３３７８
２）をＡｐａＬＩ、ＰｓｔＩで消化してＭＷＰのシグナ
ルペプチドの一部とｈ−ＥＧＦ遺伝子を含む約２００ｂ
ｐのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片と先に得た各々
３．９ｋｂおよび３．４ｋｂのＤＮＡ断片とをＴ４リガ
ーゼで連結し、プラスミドベクターｐＮＨ３０１ｈＥＧ
Ｆ及びｐＮＹ３０１ｈＥＧＦを得た（図８）。
０１ｈＥＧＦの構築 プラスミドベクターｐＮＨ３０１及びｐＮＹ３０１を制
限酵素ＡｐａＬＩ、ＰｓｔＩで消化し、各々３．９ｋｂ
および３．４ｋｂのＤＮＡ断片を得た。一方、プラスミ
ドベクターｐＨＴ１１０ＥＧＦ（特開平６−１３３７８
２）をＡｐａＬＩ、ＰｓｔＩで消化してＭＷＰのシグナ
ルペプチドの一部とｈ−ＥＧＦ遺伝子を含む約２００ｂ
ｐのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片と先に得た各々
３．９ｋｂおよび３．４ｋｂのＤＮＡ断片とをＴ４リガ
ーゼで連結し、プラスミドベクターｐＮＨ３０１ｈＥＧ
Ｆ及びｐＮＹ３０１ｈＥＧＦを得た（図８）。
【００５３】
【実施例８】 プラスミドベクターｐＮＨ３０１ｈＥＧＦ及びｐＮＹ３
０１ｈＥＧＦを用いてのｈ−ＥＧＦの分泌生産 実施例７で得たプラスミドベクターｐＮＨ３０１ｈＥＧ
Ｆ及びｐＮＹ３０１ｈＥＧＦ各々でバチルス・ブレビス
ＨＰＤ３１／ｐＮＹ３０１（ＦＥＲＭ Ｐ−１５３９
４）をエレクトロポレーション法で形質転換し、バチル
ス・ブレビスＨＰＤ３１／ｐＮＨ３０１ｈＥＧＦ、バチ
ルス・ブレビスＨＰＤ３１／ｐＮＹ３０１ｈＥＧＦを得
た。各々の形質転換体を５００ｍｌ容三角フラスコに２
ＳＬＮ培地（ペプトン ４％、酵母エキス ０．５％、
グルコース ２％、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．００１
％、ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ ０．００１％、ＺｎＳＯ4・
７Ｈ2Ｏ ０．０００１％、ネオマイシン５０μｇ／ｍ
ｌ、ｐＨ７．２）１００ｍｌを分注し、１２１℃、１５
分間オートクレーブ滅菌した後、冷却した培地に植菌
し、３０℃で３日間振とう培養した。この培養液を遠心
分離しその培養上清中のｈ−ＥＧＦ量をＨＰＬＣ（カラ
ム：Ｃ１８−１００Ａ、径４ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、バ
ッファー：０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／Ｈ2
Ｏ、０．１％ＴＦＡ／５０％アセトニトリル、リニアグ
ラジエント、検出：ＵＶ２７６ｎｍ）分析し、市販ｈ−
ＥＧＦ（フナコシ（株）社製）を標準品として同条件で
ＨＰＬＣを行った時のピーク面積と比較して生産量を求
めた（ｎ＝３：図９）。
０１ｈＥＧＦを用いてのｈ−ＥＧＦの分泌生産 実施例７で得たプラスミドベクターｐＮＨ３０１ｈＥＧ
Ｆ及びｐＮＹ３０１ｈＥＧＦ各々でバチルス・ブレビス
ＨＰＤ３１／ｐＮＹ３０１（ＦＥＲＭ Ｐ−１５３９
４）をエレクトロポレーション法で形質転換し、バチル
ス・ブレビスＨＰＤ３１／ｐＮＨ３０１ｈＥＧＦ、バチ
ルス・ブレビスＨＰＤ３１／ｐＮＹ３０１ｈＥＧＦを得
た。各々の形質転換体を５００ｍｌ容三角フラスコに２
ＳＬＮ培地（ペプトン ４％、酵母エキス ０．５％、
グルコース ２％、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．００１
％、ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ ０．００１％、ＺｎＳＯ4・
７Ｈ2Ｏ ０．０００１％、ネオマイシン５０μｇ／ｍ
ｌ、ｐＨ７．２）１００ｍｌを分注し、１２１℃、１５
分間オートクレーブ滅菌した後、冷却した培地に植菌
し、３０℃で３日間振とう培養した。この培養液を遠心
分離しその培養上清中のｈ−ＥＧＦ量をＨＰＬＣ（カラ
ム：Ｃ１８−１００Ａ、径４ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、バ
ッファー：０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／Ｈ2
Ｏ、０．１％ＴＦＡ／５０％アセトニトリル、リニアグ
ラジエント、検出：ＵＶ２７６ｎｍ）分析し、市販ｈ−
ＥＧＦ（フナコシ（株）社製）を標準品として同条件で
ＨＰＬＣを行った時のピーク面積と比較して生産量を求
めた（ｎ＝３：図９）。
【００５４】バチルス・ブレビスＨＰＤ３１／ｐＮＹ３
０１ｈＥＧＦは、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１／ｐＮ
Ｈ３０１ｈＥＧＦの２倍以上のｈ−ＥＧＦを生産した。
０１ｈＥＧＦは、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１／ｐＮ
Ｈ３０１ｈＥＧＦの２倍以上のｈ−ＥＧＦを生産した。
【００５５】
【発明の効果】本発明によって新規発現プラスミドベク
ターｐＮＹが開発された。本プラスミドベクターに異種
遺伝子を結合してなる発現プラスミドでバチルス属細菌
を形質転換し、該形質転換体を培養することにより、該
異種遺伝子産物を効率よく製造することができる。
ターｐＮＹが開発された。本プラスミドベクターに異種
遺伝子を結合してなる発現プラスミドでバチルス属細菌
を形質転換し、該形質転換体を培養することにより、該
異種遺伝子産物を効率よく製造することができる。
【００５６】
【配列表】バチルス・ブレビスのＭＷＰプロモーター及
びＨＷＰプロモーターの塩基配列を配列番号１、２に示
す。配列番号３〜６は、ＰＣＲ用プライマーを示す。下
記表１〜６に、配列番号１〜６で示される各配列を示
す。
びＨＷＰプロモーターの塩基配列を配列番号１、２に示
す。配列番号３〜６は、ＰＣＲ用プライマーを示す。下
記表１〜６に、配列番号１〜６で示される各配列を示
す。
【００５７】
【表１】
【００５８】
【表２】
【００５９】
【表３】
【００６０】
【表４】
【００６１】
【表５】
【００６２】
【表６】
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＵＢ１１０由来のプラスミドベクターの制限
酵素地図を示す。
酵素地図を示す。
【図２】プラスミドベクターｐＮＨ３０１の制限酵素地
図及びプロモーターを含む一部の塩基配列を示す。
図及びプロモーターを含む一部の塩基配列を示す。
【図３】プラスミドベクターｐＮＹ３０１の制限酵素地
図及びプロモーターを含む一部の塩基配列を示す。
図及びプロモーターを含む一部の塩基配列を示す。
【図４】プラスミドベクターｐＮＨ３０１、ｐＮＹ３０
１の宿主での保持率を示す。
１の宿主での保持率を示す。
【図５】プラスミドベクターｐＮＨ３０１ＢＬＡ、ｐＮ
Ｙ３０１ＢＬＡの構築図である。
Ｙ３０１ＢＬＡの構築図である。
【図６】ＢＬＡの生産性を示す。
【図７】プラスミドベクターｐＮＨ３０１ＢＬＡ、ｐＮ
Ｙ３０１ＢＬＡのアガロース電気泳動図である。
Ｙ３０１ＢＬＡのアガロース電気泳動図である。
【図８】プラスミドベクターｐＮＨ３０１ｈＥＧＦ、ｐ
ＮＹ３０１ｈＥＧＦの構築図である。
ＮＹ３０１ｈＥＧＦの構築図である。
【図９】ｈＥＧＦの生産性を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:08） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:08）
Claims (4)
- 【請求項１】 プラスミドｐＵＢ１１０の複製開始点、
複製開始タンパク質遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子以
外の部分に、バチルス属細菌由来のプロモーター及びＳ
Ｄ配列を含む発現調節領域遺伝子を１つ以上保有させる
ことのできる、新規発現プラスミドベクターｐＮＹ。 - 【請求項２】 図１に示される製限酵素地図のＡ、Ｂ、
Ｃ領域の１つ以上に、バチルス属細菌由来のプロモータ
ー及びＳＤ配列を含む発現調節領域遺伝子を１つ以上保
有させることのできる、請求項１に記載の新規発現プラ
スミドベクターｐＮＹ。 - 【請求項３】 プロモーターが、バチルス・ブレビスの
ＭＷＰプロモーター、ＨＷＰプロモーター、バチルス・
ズブチリスのレバンスクラーゼプロモーター、Ｓｐａｃ
プロモーター、バチルス・アミロリキファシエンスのア
ルカリプロテアーゼプロモーター、α−アミラーゼプロ
モーター、中性プロテアーゼプロモーター、バチルスｓ
ｐ．ＫＳＭ−６４のエンドヌクレアーゼプロモーター及
びバチルス・ステアロサーモフィラスの耐熱性枝つくり
酵素プロモーターから選ばれたプロモーターであるこ
と、を特徴とする請求項１又は２に記載の新規発現プラ
スミドベクターｐＮＹ。 - 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか１項に記載の新
規発現プラスミドベクターｐＮＹに異種遺伝子を結合し
てなる発現プラスミドでバチルス属細菌を形質転換し、
該形質転換体を培養することにより異種遺伝子産物を培
養物中に生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴
とする異種遺伝子産物の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12157597A JP3734593B2 (ja) | 1997-04-25 | 1997-04-25 | 新規発現プラスミドベクター及び該発現プラスミドベクターを保有するバチルス属細菌を用いた異種遺伝子産物の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12157597A JP3734593B2 (ja) | 1997-04-25 | 1997-04-25 | 新規発現プラスミドベクター及び該発現プラスミドベクターを保有するバチルス属細菌を用いた異種遺伝子産物の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10295378A true JPH10295378A (ja) | 1998-11-10 |
| JP3734593B2 JP3734593B2 (ja) | 2006-01-11 |
Family
ID=14814640
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12157597A Expired - Lifetime JP3734593B2 (ja) | 1997-04-25 | 1997-04-25 | 新規発現プラスミドベクター及び該発現プラスミドベクターを保有するバチルス属細菌を用いた異種遺伝子産物の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3734593B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002064800A1 (fr) * | 2001-02-14 | 2002-08-22 | Higeta Shoyu Co., Ltd. | Vecteur plasmide navette entre escherichia coli et brevibacillus |
| WO2002069991A1 (fr) * | 2001-03-05 | 2002-09-12 | Calpis Co., Ltd. | Inhibiteur de translocation bacterienne et procede d'inhibition de translocation bacterienne |
| WO2005045005A1 (ja) | 2003-11-11 | 2005-05-19 | Higeta Shoyu Co., Ltd. | 新規ブレビバチルス・チョウシネンシス及び該微生物を宿主とするタンパク質の製造方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110201548A1 (en) | 2007-04-23 | 2011-08-18 | Nihon Pharmaceutical Co., Ltd. | Therapeutic agent for acute hepatitis or prophylactic/therapeutic agent for fulminant hepatitis |
-
1997
- 1997-04-25 JP JP12157597A patent/JP3734593B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002064800A1 (fr) * | 2001-02-14 | 2002-08-22 | Higeta Shoyu Co., Ltd. | Vecteur plasmide navette entre escherichia coli et brevibacillus |
| US7332331B2 (en) | 2001-02-14 | 2008-02-19 | Higeta Shoyu Co., Ltd. | Plasmid shuttle vector between Escherichia coli and Brevibacillus |
| KR100857748B1 (ko) * | 2001-02-14 | 2008-09-09 | 히게따 쇼유 가부시키가이샤 | 대장균과 브레비바실러스 속 세균 간의 플라스미드 셔틀 벡터 |
| WO2002069991A1 (fr) * | 2001-03-05 | 2002-09-12 | Calpis Co., Ltd. | Inhibiteur de translocation bacterienne et procede d'inhibition de translocation bacterienne |
| WO2005045005A1 (ja) | 2003-11-11 | 2005-05-19 | Higeta Shoyu Co., Ltd. | 新規ブレビバチルス・チョウシネンシス及び該微生物を宿主とするタンパク質の製造方法 |
| US7655452B1 (en) | 2003-11-11 | 2010-02-02 | Higeta Shoyu Co., Ltd. | Brevibacillus choshinensis and process for prodcuing protein wtih use of the microbe as host |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3734593B2 (ja) | 2006-01-11 |
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