KR100857748B1 - 대장균과 브레비바실러스 속 세균 간의 플라스미드 셔틀 벡터 - Google Patents

대장균과 브레비바실러스 속 세균 간의 플라스미드 셔틀 벡터 Download PDF

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Abstract

본 발명은 브레비바실러스 속 세균 및 대장균 모두에서 복제가능하고, 브레비바실러스 속 세균에서 기능할 수 있는 프로모터, 및 대장균 및 브레비바실러스 속 세균에 대한 선택 마커(들)로서 기능할 수 있는 DNA 서열(들)을 함유하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 셔틀 벡터, 상기 플라스미드 셔틀 벡터를 이용하여 브레비바실러스 속 세균을 형질전환시키는 방법을 제공한다.
이러한 플라스미드 셔틀 벡터는 브레비바실러스 속 세균의 효율적인 형질전환을 가능하게 한다. 또한, 특히 본 발명의 플라스미드 셔틀 벡터 pNCMO2는 브레비바실러스 속 세균에서 목적 유전자를 효율적으로 발현 및 분비시키지만 대장균에서의 발현은 현저하게 억제하는 유전자 발현 조절 영역을 갖기 때문에, 대장균을 사용하여 재조합 유전자 발현 플라스미드를 효율적으로 구축할 수 있고, 이는 브레비바실러스 속 세균에서의 단백질 제조에 적합하다.

Description

대장균과 브레비바실러스 속 세균 간의 플라스미드 셔틀 벡터 {PLASMID SHUTTLE VECTOR BETWEEN ESCHERICHIA COLI AND BACTERIA OF GENUS BREVIBACILLUS}
본 발명은 대장균 (Escherichia coli)과 브레비바실러스 (Brevibacillus) 속 세균 간의 플라스미드 셔틀 벡터, 및 이러한 플라스미드 셔틀 벡터를 사용하여 브레비바실러스 속 세균을 형질전환시키는 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 브레비바실러스 속 세균에서 목적 유전자 산물을 효과적으로 발현 및 분비시키지만 대장균에서의 발현을 현저하게 억제하는 유전자 발현 조절 영역을 갖는 플라스미드 셔틀 벡터에 관한 것이고, 이는 브레비바실러스 속 세균에서의 유전자 발현에 적절하다. 또한, 본 발명은 이러한 형질전환 방법에 의해 형질전환된 형질전환체를 배양하는 것을 특징으로 하는 단백질 제조 방법에 관한 것이다.
Udaka 등은 다량의 단백질이 세포외로 분비되고 세포외 프로테아제 활성이 약한, 대장균 및 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)에서는 발견되지 않는 우수한 특징을 갖는 브레비바실러스 속 (바실러스 속의 종래의 분류로부터 분리)의 세균을 숙주로서 사용하는 재조합 단백질의 발현 시스템의 개발에 성공하였다 (일본 특허 No. 2082727, JP-A 62-201583 (1987), Yamagata, H. 등, J. Bacteriol., 169, 1239-1245 (1987), Shigezo Udaka, Nippon Nogeikagaku Kaishi 61, 669-676 (1987), Takao, M. 등, Appl. Microbiol, Biotechnol., 30, 75-80 (1989), Yamagata, H. 등, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86, 3589-3593 (1989)). 브레비바실러스 속 세균을 숙주로 사용하는 발현 시스템에 의한 α-아밀라아제 (일본 특허 No. 2082727) 또는 인간 상피세포 성장 인자 (hEGF) (일본 특허 No. 2787585)의 제조 등이 지금까지 보고되었다.
한편, 브레비바실러스 속 세균의 유전자 발현에 유용한 플라스미드 벡터로서, 예를 들어, pNU200 (Shigezo Udaka, Nippon Nogeikagaku Kaishi 61, 669-676 (1987)), pNH300 (Shiga, Y. 등, Applied and Environmental Microbiology, 58, 525-531 (1992)), pNH400 (Ishihara, T. 등, J. Bacteriol., 177, 745-749 (1995)), pHY700 (JP-A 4-278091 (1992)), pHT 시리즈 플라스미드 (일본 특허 No. 2727391) 등이 지금까지 보고되었다. 특히, 본 발명가들은 pNY301 및 기타 pNY 시리즈 플라스미드를 브레비바실러스 속 세균의 형질전환에 유용한 플라스미드 벡터로 특허출원하였다 (JP-A 10-295378).
발명이 이루고자 하는 기술적 과제
상기 언급한 바와 같이, 브레비바실러스 속 세균을 숙주로 사용하는 단백질의 분비 생산 시스템은 유전자 재조합에 의한 단백질의 생산에서 유용한 시스템이다. 그러나, 브레비바실러스 속 세균의 형질전환 효율은 대장균의 형질전환 효율에 비해 낮다. 따라서, 브레비바실러스 속 세균을 사용하는 재조합 유전자 발현 플라스미드의 구축이 대장균에 비해 어렵다는 단점이 있다. 예를 들어, 전기천공 (electroporation) 방법 (Takagi, T. 등, Agric. Biol. Chem., 53, 3099-3100 (1989))을 사용하는 경우, 대장균의 형질전환 효율은 1010 CFU/㎍DNA에 달한다. 한편, 브레비바실러스 속에 속하는 브레비바실러스 코시넨시스 (Brevibacillus choshinensis) (종래에는 바실러스 브레비스 (Bacillus brevis); Shida O. 등, Int. J. Syst. Bacteriol., 46, 939-946 (1996)에서 분류학적 위치가 변경됨)의 경우에는, 107 CFU/㎍DNA에 불과하다. 또한, 전기천공 방법 이외의 방법을 사용하는 경우, 브레비바실러스 속 세균의 형질전환 효율이 더욱 감소되는 것으로 알려져 있다.
특히, 복잡한 4차 구조를 갖는 단백질을 코딩하는 유전자, 예를 들어, A 서브유닛 1개 및 B 서브유닛 5개를 함유하는 비브리오 콜레라로부터 생산되는 콜레라 독소 (CT) (Clements 및 Finkelstein, Intect. Immun., 24; 760-769 (1979))와 같은 단백질을 코딩하는 유전자로의 브레비바실러스 속 세균의 형질전환, 및 형질전환체를 사용하는 단백질 제조는 현재까지 매우 어려웠다.
문제점들에 대한 한 해결책으로서, 형질전환 단계가 용이한 다른 숙주 세포, 예를 들어, 대장균에서도 또한 복제가능한 플라스미드 벡터 (이하 "셔틀 벡터"로 칭함)를 사용하고, 이러한 숙주 세포를 사용하여 재조합 유전자 발현 플라스미드의 구축을 먼저 수행하고, 이러한 재조합 유전자 발현 플라스미드를 사용하여 브레비바실러스 속 세균의 형질전환을 전기천공 등에 의해 추가로 수행하는 방법이 고려된다.
셔틀 벡터, 및 셔틀 벡터를 사용하는 형질전환 방법은 당업자에게 공지된 기술이다. 예를 들어, 대장균과 바실러스 서브틸리스 간의 셔틀 벡터에 관해, JP-A 63-198986 (1998), JP-A 2000-197491 등이 보고되었다. 그럼에도 불구하고, 브레비바실러스 속 세균의 유전자 재조합에 의한 형질전환 작업에서 및 형질전환체로의 재조합 유전자 발현에서 이용가능한 플라스미드 셔틀 벡터, 및 상기 플라스미드 셔틀 벡터를 사용하여 브레비바실러스 속 세균을 형질전환시키는 방법은 현재까지 알려져 있지 않다.
발명의 개요
본 발명가들은 브레비바실러스 속 세균을 숙주로 사용하는 발현 시스템에서 목적 단백질이 세포외로 분비되도록 하는 유용성에 초점을 맞추고, 상기의 단점을 해결하는 신규 숙주-벡터 시스템의 개발에 대한 필요성을 통감하여, 대장균과 브레비바실러스 속 세균이 숙주로서 사용될 수 있는 벡터로서, 유전자 재조합에서 사용될 수 있는 신규 플라스미드 셔틀 벡터를 개발하기 위해 노력하였다.
따라서, 목적을 달성하기 위해, 본 발명가들은 다수의 플라스미드 벡터 중에서 특히 기존에 본 발명가들이 특허 출원하였던 플라스미드 벡터 pNY301이 브레비바실러스 코시넨시스 HPD31로부터의 프로모터 및 분비 시그널 서열을 함유한다는 것에 다시 초점을 맞추었다. 이러한 플라스미드 벡터 pNY301을 기초로, 본 발명가들은 PCR 등에 의해 다양한 DNA 서열을 합성하거나 이들을 공지된 서열로부터 잘라내고, 추가로 이러한 DNA 단편들을 플라스미드 벡터 내로 삽입하여, 삽입을 확인하였다. 또한, 본 발명가들은 생성된 플라스미드로의 형질전환의 확인, 형질전환체에서의 발현의 확인 등을 수행하였다. 다수의 이러한 정교한 처리 및 조작을 시행 착오로 수행한 결과, 본 발명가들은 원하는 신규 플라스미드 셔틀 벡터의 제조에 드디어 성공하였다.
이러한 방식으로 성공적으로 제조된 신규 플라스미드 셔틀 벡터를 대장균 및 브레비바실러스 속 세균 내로 도입하고, 생성된 세균을 배양하였다. 따라서, 플라스미드 셔틀 벡터의 복제가 임의의 숙주에서 수행되었다. 플라스미드 셔틀 벡터를 사용한 재조합 유전자 산물 발현에서는, 브레리바실러스 속 세균에서 목적 유전자가 효과적으로 분비 및 발현되지만, 대장균에서는 발현이 상당히 억제된다는 것이 확인되었다. 또한, 브레비바실러스 속 세균의 형질전환체가 다른 공지된 방법에 의해서는 수득되지 않음에도 불구하고, 이러한 플라스미드 셔틀 벡터의 사용에 의해 형질전환이 가능해진다는 것이 확인되었다. 따라서, 본 발명이 완성되었다.
즉, 상기의 문제점들을 해결하기 위해, 본 발명은 브레비바실러스 속 세균의 유전자 재조합에 의한 형질 전환 및 형질전환체로의 단백질 제조에 유용한, 대장균과 브레비바실러스 속 세균 간의 플라스미드 셔틀 벡터, 및 이러한 플라스미드 셔틀 벡터를 사용하는 형질전환 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 브레비바실러스 속 세균에서 목적 유전자 산물을 효율적으로 발현 및 분비시키지만 대장균에서의 발현을 현저하게 억제하는 유전자 발현 조절 영역을 갖고, 브레비바실러스 속 세균에서의 유전자 발현 및 단백질 제조에 적절한 플라스미드 셔틀 벡터를 제공한다. 또한, 본 발명은 브레비바실러스 속 세균을 이러한 플라스미드 셔틀 벡터를 사용하여 형질전환시키는 방법, 및 이러한 플라스미드 셔틀 벡터로 형질전환된 브레비바실러스 속 세균을 배양하는 것을 특징으로 하는 단백질 제조 방법을 제공한다.
도 1은 P2 프로모터를 나타낸다.
도 2는 Lac 오퍼레이터 서열을 나타낸다.
도 3은 SD 서열 (SD1)을 나타낸다.
도 4는 SD 서열 (SD2)을 나타낸다.
도 5는 R2L6 유형 개질 시그널 펩티드를 나타낸다 (상단은 뉴클레오티드 서열, 하단은 아미노산 서열).
도 6은 PCR 클로닝 프라이머 1을 나타낸다.
도 7은 PCR 클로닝 프라이머 2를 나타낸다.
도 8은 PCR 클로닝 프라이머 3을 나타낸다.
도 9는 PCR 클로닝 프라이머 4를 나타낸다.
도 10은 PCR 클로닝 프라이머 5를 나타낸다.
도 11은 PCR 클로닝 프라이머 6을 나타낸다.
도 12는 PCR 클로닝 프라이머 7을 나타낸다.
도 13은 PCR 클로닝 프라이머 8을 나타낸다.
도 14는 PCR 클로닝 프라이머 9를 나타낸다.
도 15는 PCR 클로닝 프라이머 10을 나타낸다.
도 16은 PCR 클로닝 프라이머 11을 나타낸다.
도 17은 PCR 클로닝 프라이머 12를 나타낸다.
도 18은 PCR 클로닝 프라이머 13을 나타낸다.
도 19는 PCR 클로닝 프라이머 14를 나타낸다.
도 20은 PCR 클로닝 프라이머 15를 나타낸다.
도 21은 플라스미드 셔틀 벡터 pNCM02의 제한효소 지도를 나타낸다.
도 22는 플라스미드 셔틀 벡터 pNCM02의 구축 과정을 나타낸다.
도 23은 도 22의 연속을 나타낸다.
도 24는 재조합 유전자 발현 플라스미드 pNCM02BLA 및 pNC301BLA의 구축 과정을 나타낸다.
도 25는 대장균 JM109/pNCM02BLA 및 대장균 JM109/pNC301BLA의 생산성을 나타낸다.
도 26은 대장균 JM109/pNCM02BLA 및 대장균 JM109/pNC301BLA에 의한 할로 형성 및 성장을 나타내는 도면 대용 사진이다.
도 27은 대장균 JM109/pNCM02BLA에 의한 BLA 발현에 대한 IPTG의 효과를 나타내는 도면 대용 사진이다.
도 28은 브레비바실러스 코시넨시스 HPD31-S5/pNCM02BLA 및 브레비바실러스 코시넨시스 HPD31-S5/pNC301BLA에 의한 BLA의 생산성을 나타낸다.
도 29는 재조합 유전자 발현 플라스미드 pNCMO2CT의 구축 과정을 나타낸다.
도 30은 형질전환체 브레비바실러스 코시넨시스 HPD31-S5/pNCMO2CT의 배양물의 쿠마시 브릴리언트 블루 염색 이미지 및 웨스턴 블롯팅 이미지를 나타내는 도면 대용 사진이다.
본 발명을 하기에 상세하게 기술한다.
본 발명의 플라스미드 셔틀 벡터는 대장균과 브레비바실러스 숙 세균 모두에서 복제가능하고, 브레비바실러스 속 세균에서 기능할 수 있는 프로모터, 및 대장균 및 브레비바실러스 속 세균에 대한 선택 마커(들)을 코딩하는 DNA 서열(들)을 함유하는 플라스미드 셔틀 벡터이다.
본 발명의 플라스미드 셔틀 벡터는 대장균 및 브레비바실러스 속 세균에서 자율적으로 복제가능하다. 따라서, 대장균을 사용하여 본 발명의 플라스미드 셔틀 벡터 내에 DNA 단편을 삽입하는 것과 같은 단계에 의해 재조합 유전자 발현 플라스미드를 구축할 수 있고, 브레비바실러스 속 세균의 추가적인 형질전환을 이러한 재조합 유전자 발현 플라스미드를 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 플라스미드 셔틀 벡터가 갖는, 브레비바실러스 속 세균에서 기능할 수 있는 프로모터는 브레비바실러스 속 세균에서 기능하는 한 특별히 한정되지 않는다. 바람직하게는 브레비바실러스 속 세균으로부터의 프로모터이다. 프로모터의 특히 바람직한 예로는 브레비바실러스 브레비스 47 (Brevibacillus brevis 47) (종래에는 바실러스 브레비스 47 (Bacillus brevis 47))로부터의 MWP 프로모터 영역 (JP-B 1-58950 (1989) 및 JP-B 7-108224 (1995)), 및 브레비바실러스 코시넨시스 HPD31 (FERM BP-6863) (종래에는 바실러스 브레비스; 이러한 균주는 바실러스 브레비스 H102 (FERM BP-1087)과 동일하다)로부터의 HWP 프로모터 영역 (JP-A 4-278091 (1992) 및 JP-A 6-133782 (1994)) 내에 함유된 프로모터, 예를 들어 P2 프로모터 (서열 번호 1: 도 1)가 포함될 수 있다.
본 발명의 플라스미드 셔틀 벡터는 브레비바실러스 속 세균에서 기능하는 프로모터의 3'-말단에 리보좀 결합 영역 (SD 서열) 및 발현 단백질의 분비를 위한 시그널 펩티드를 코딩하는 DNA 서열 (분비 시그널 서열)을 추가로 함유한다. SD 서열로서, 예를 들어, 브레비바실러스 코시넨시스의 HWP 유전자 발현 조절 영역으로부터의 서열, 예컨대 SD1 (서열 번호 3: 도 3) 또는 SD2 (서열 번호 4: 도 4)를 사용할 수 있다. 분비 시그널 서열로서, 예를 들어, 브레비바실러스 코시넨시스 HPD31 (FERM BP-1087, FERM BP-6863)의 HWP 프로모터 영역 내에 함유된 시그널 서열을 사용할 수 있다. 특히 바람직한 예로서, R2L6 유형 등의 개질 HWP 시그널 서열 (JP-A 7-170984 (1995))이 언급될 수 있다 (이러한 R2L6 유형 개질 시그널 서열에 관해, 이의 아미노산 서열을 서열 번호 5에 나타내고, 이의 DNA 서열을 서열 번호 21에 나타낸다. 또한, 양 서열을 도 5에 나타낸다. 도면에서, 상단은 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 하단은 아미노산 서열을 나타낸다).
본 발명의 플라스미드 셔틀 벡터는 세균에서의 복제에 필요한 복제 조절 영역을 코딩하는 DNA 서열을 추가로 함유한다. 복제 조절 영역과 관련하여, 하나의 공통 영역 또는 상이한 영역들이 브레비바실러스 속 세균과 대장균 모두에 사용될 수 있다. 브레비바실러스 속 세균에서의 복제 조절 영역은 Rep 단백질 유전자 및 복제 개시점을 함유한다. 브레비바실러스 속 세균에서 복제 조절 영역으로 기능할 수 있는 서열은 브레비바실러스 속 세균에서 복제 및 성장하는 플라스미드 내에 함유되고 플라스미드의 복제 조절 영역으로 기능하는 DNA 서열인 한 특별히 한정되지 않는다. 특히 바람직한 예로서, 플라스미드 pUB110으로부터의 Rep 단백질 유전자 및 복제 개시점을 코딩하는 DNA 서열이 언급될 수 있다.
대장균에서, 복제 개시점이 복제 조절 영역으로서 요구된다. 대장균에서 기능할 수 있는 복제 개시점을 코딩하는 DNA 서열은 대장균에서 복제 및 성장하는 플라스미드 내에 함유되고 플라스미드의 복제 개시점으로 기능하는 DNA 서열인 한 특별히 한정되지 않는다. 플라스미드의 복제 개시점으로 기능하는 ori 영역을 함유하는 DNA 서열이 바람직하다. 대장균을 사용하는 유전자 재조합 조작에서 통상 사용되는 플라스미드 벡터, 예컨대 pUC 시리즈, 예를 들어, pUC18, pUC118 및 pUC119, 및 pBR322의 ori 영역을 코딩하는 DNA 서열이 특히 바람직하다.
브레비바실러스 속 세균과 대장균 모두에서 기능할 수 있는 복제 조절 영역을 코딩하는 DNA 서열로서, 그램 포지티브 세균과 그램 네가티브 세균 모두에서 기능할 수 있는 복제 조절 영역인, pLS1/pE194 플라스미드 패밀리 (Del Solar, G. 등, Mol. Microbiol., 8, 789-796 (1993))에 속하는 플라스미드의 복제 조절 영역이 언급될 수 있다. 예를 들어, 락토바실러스 아시도필루스 (Lactobacillus acidophilus)로부터의 플라스미드 pLA106의 ori, RepA 및 RepB를 함유하는 복제 조절 영역 (Sano, K. 등, FEMS Microbiology Letters, 148, 223-226 (1997))을 코딩하는 DNA 서열을 사용할 수 있다.
본 발명의 플라스미드 셔틀 벡터가 갖는, 브레비바실러스 속 세균 및 대장균에 대한 선택 마커로서 기능할 수 있는 서열에 관하여, 하나의 공통 DNA 서열 또는 상이한 DNA 서열들이 브레비바실러스 속 세균과 대장균 모두에 사용될 수 있다. 선택 마커로서 기능할 수 있는 서열에 관하여, 약물 내성 유전자를 사용할 수 있다. 브레비바실러스 속 세균에 대해, 예를 들어, 브레비바실러스 속 세균 및 이와 유사한 바실러스 속 세균으로부터의 약물 내성 유전자를 함유하는 DNA 서열을 사용할 수 있다. 이의 특히 바람직한 예로는 플라스미드 벡터 pNY301 내에 함유된 네오마이신 내성 유전자 (JP-A 10-295378 (1998)) 및 pHT110 내에 함유된 에리트로마이신 내성 유전자 (일본 특허 No. 2727391)가 포함될 수 있다. 또한, 대장균에 대해서, 예를 들어, 대장균으로부터의 공지된 약물 내성 유전자인 카나마이신 내성 유전자, 앰피실린 내성 유전자, 클로람페니콜 내성 유전자 등을 코딩하는 DNA 서열이 이용가능하다. 또한, 브레비바실러스 속 세균과 대장균 모두에서 기능할 수 있는 약물 내성 유전자로서, 제오신 내성 유전자 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 플라스미드 셔틀 벡터는 대장균에서의 재조합 유전자 발현을 억제하는 기능을 갖는 DNA 서열을 추가로 함유할 수 있다. 예를 들어, lacI 유전자를 갖는 대장균의 경우, 대장균으로부터의 lac 오퍼레이터 서열 (서열 번호 2: 도 2)이 브레비바실러스 속 세균에서 기능하는 프로모터 서열의 3'-말단에 함유될 수 있다.
본 발명의 플라스미드 셔틀 벡터는 신규이다. 예를 들어, pNCMO2는 크기가 5,224 bp인 플라스미드 벡터이다. pNCMO2의 제한효소 지도 및 프로모터를 함유하는 이의 일부의 뉴클레오티드 서열을 도 21에 나타내었다. pNCMO2의 프로모터 영역은 브레비바실러스 코시넨시스 HPD31의 HWP 프로모터 영역으로부터의 P2 프로모터, 대장균으로부터의 lac 오퍼레이터, SD 서열, 분비 시그널 서열로서의 R2L6 유형 개질 시그널 서열, 멀티클로닝 부위, 및 터미네이터로서의 HS 유전자 (JP-A 9-224677 (1997))를 함유한다. 멀티클로닝 부위와 관련하여, PstI, BamHI, SalI, XbaI, XhoI, EcoRI, KpnI, SmaI, ClaI, HindIII 부위가 클로닝 부위로서 이용가능하다.
플라스미드 셔틀 벡터 pNCMO2는 브레비바실러스 속 세균에 대한 선택 마커 유전자로서의 네오마이신 내성 유전자를 코딩하는 DNA 서열, 브레비바실러스 속 세균에서의 복제에 필요한 pUB110으로부터의 Rep 단백질 유전자, 대장균의 복제 개시점으로서의 ColE1 ori 영역, 및 대장균에 대한 선택 마커 유전자로서의 앰피실린 내성 유전자를 함유한다.
본 발명에서의 플라스미드 셔틀 벡터 pNCMO2의 구축에서, pNY301, pNH326, pNU201 등을 사용한다. 플라스미드 pNY301은 JP-A 10-295378 (1998))에서, pNH326은 [Kajino, T. 등, Appl. Environ. Microbiol., 66, 638-642 (2000)]에서, 그리고 pNU201은 [Udaka, S. 등, Methods in Enzymology, 217, 23-33 (1993)]에서 각각 공개된 것으로, 이들은 공지된 플라스미드이다. 본 발명의 플라스미드 셔틀 벡터의 구축에서 사용되는 기타 플라스미드들은 시장에서 구입할 수 있다.
플라스미드 벡터 pNCMO2를 보유하는 브레비바실러스 코시넨시스 HPD31-S5/pNCMO2는 2000년 12월 12일에 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구소의 특허 미생물 기탁 센터 (현재, 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허 생물 기탁 센터)에 국제 기탁되었고, 수탁번호 No. FERM BP-7394를 부여받았다.
본 발명의 발현 플라스미드의 구축에서 사용되는 숙주는 대장균에 속하는 균 주인 한 특별히 한정되지 않는다. 특히 바람직한 예로서, 대장균 JM109가 언급될 수 있다. 대장균 JM109는 시장에서 구입할 수 있는 공지된 균주이다.
대장균을 사용하여 본 발명의 플라스미드 셔틀 벡터로부터 재조합 유전자 발현 플라스미드를 구축하는 방법과 관련하여, 당업자에게 공지된 분자 생물학의 표준 기술을 기초로 하는 방법을 적절하게 사용할 수 있다. 예를 들어, [Molecular Cloning 제2판, A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory (1989)]에 기술된 방법이 언급된다. 상세사항은 실시예에 기술된다.
본 발명에서 재조합 유전자의 발현에 사용되는 숙주로서, 브레비바실러스 속 세균의 임의의 균주를 사용할 수 있다. 브레비바실러스 코시넨시스가 바람직하다. 특히 바람직한 예로는 브레비바실러스 코시넨시스 HPD31 (FERM BP-1087, FERM BP-6863), 및 이의 변종인 브레비바실러스 코시넨시스 HPD31-S5 (FERM BP-6623)가 포함될 수 있다.
본 발명의 셔틀 벡터 및 대장균으로 구축된 재조합 유전자 발현 플라스미드를 사용하여 브레비바실러스 속 세균을 형질전환시키는 방법으로서, 당업자에게 공지된 형질전환 방법, 예컨대 전기천공을 사용할 수 있다.
본 발명의 형질전환체의 배양에 사용되는 배지는, 필요하다면, 탄소 원, 질소 원 및 무기 염류를 함유한다. 당류 및 무기 염류로 주로 제조된 합성 배지를 사용하여 배양을 수행할 수 있다. 영양요구성을 나타내는 균주를 사용하는 경우, 이의 성장에 필요한 영양소를 배지에 첨가하는 것이 현명하다. 또한, 필요하다면 항생물질, 소포제 등을 첨가할 수 있다.
배양 조건과 관련하여, 배지의 초기 pH는 5.0 내지 9.0, 바람직하게는 6.5 내지 7.5로 조절한다. 배양 온도는 일반적으로 15 ℃ 내지 42 ℃, 바람직하게는 24 내지 37 ℃이고, 배양 시간은 일반적으로 16 내지 360 시간, 바람직하게는 24 내지 144 시간이다. 이것에 의해 본 발명의 방법에 의해 형질전환된 브레비바실러스 속 세균은 배양 용액 내에 단백질을 생산 및 축적한다.
배양의 완결 후, 배양물로부터의 목적 단백질의 수집은 당업자에게 공지된 단백질 정제 방법, 예컨대 용매 추출, 한외여과, 황산 암모늄 분획화, HPLC, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 전기영동 및 등전점 전기영동의 적절한 조합에 의해 가능해진다.
하기에 본 발명을 실시예를 참조로 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이는 예시적이고, 본 발명은 이에 한정되지 않는다.
실시예 1
플라스미드 셔틀 벡터 pNCMO2의 구축
(1) 플라스미드 셔틀 벡터 pNC301의 구축
플라스미드 벡터 pUC119를 주형으로 하고 프라이머 1 (서열 번호 6: 도 6) 및 프라이머 2 (서열 번호 7: 도 7)을 사용하여 PCR에 의해 증폭을 수행하고, 생성된 PCR 산물을 NsiI로 절단하여, 대장균의 복제 개시점으로서의 ColE1 ori 영역 및 앰피실린 내성 유전자를 함유하는 약 2 kbp의 DNA 단편을 수득하였다.
PCR은 PCR 키트 (Takara Shuzo Co., Ltd. 제조)를 사용하여, 100 pmol의 각각의 프라이머, 2.5 유닛의 Taq 중합효소, 200 μM dNTP, 1 ng pUC119 주형 DNA 및 100 ㎕ Taq 버퍼 (10 mM 트리스-히드로클로라이드 (pH 8.5), 2.5 mM Mg++, 50 mM 염화 칼륨 및 100 ㎍/ml 소 혈청 알부민)를 혼합한 후, 혼합물을 96 ℃에서 30 초 동안 유지시킨 후, DNA 열 변성 (94 ℃, 60 초), 프라이머 어닐링 (54 ℃, 60 초) 및 프라이머 신장 (70 ℃, 60 초)의 사이클을 25 회 반복하도록 수행하였다. 이러한 조건을 이하 조건 1로 칭한다.
약 2 kbp의 상기에서 수득된 DNA 단편을 브레비바실러스 코시넨시스 HPD31의 HWP 프로모터 영역으로부터의 P5 프로모터 및 분비 시그널 서열로서의 천연 유형 HWP 시그널 서열을 함유하는 플라스미드 벡터 pNY301 (JP-A 10-295376 (1998))의 Sse8387I 부위에 T4 DNA 결찰효소로 DNA 결찰 키트 (Takara Shuzo Co., Ltd. 제조)를 사용하여 결찰시켰다. CaCl2 방법 (Molecular Cloning 제2판, A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory, 1, 82, (1989))에 의해 이러한 DNA로 대장균 JM109 (Takara Shuzo Co., Ltd. 제조)를 형질전환시키고, 생성된 앰피실린 내성 형질전환체로부터 플라스미드를 추출하였다. 생성된 플라스미드는 대장균 및 브레비바실러스 속 세균에서 복제가능한 신규 플라스미드 셔틀 벡터였고, 이를 pNC301로 명명하였다.
플라스미드 셔틀 벡터 pNC301은 브레비바실러스 코시넨시스 HPD31의 HWP 프로모터 영역으로부터의 P5 프로모터, 브레비바실러스 속에 대한 선택 마커 유전자로서의 네오마이신 내성 유전자, 대장균의 복제 개시점으로서의 ColE1 ori 영역, 및 대장균에 대한 선택 마커로서의 앰피실린 내성 유전자를 함유한다. 이는 분비 시그널 서열로서의 천연 유형 HWP 시그널 서열을 또한 함유한다 (도 22).
플라스미드 셔틀 벡터 pNCMO2의 구축을 도 23을 참조로 하기에 기술한다.
(2) 플라스미드 pNC의 구축
플라스미드 셔틀 벡터 pNC301에서 브레비바실러스 코시넨시스 HPD31로부터의 HWP 프로모터 영역을 제거함으로써 수득한 전체 길이의 pNC301를 프라이머 3 (서열 번호 8: 도 8) 및 프라이머 4 (서열 번호 9: 도 9)를 사용하여 조건 1 하에 PCR에 의해 증폭시켰다. 약 5 kbp의 증폭된 단편을 BclI로 처리하고, T4 DNA 결찰효소로 자가 결찰시켰다. CaCl2 방법에 의해 이러한 DNA로 대장균 JM109를 형질전환시켜 플라스미드 pNC를 수득하였다. PCR의 반응 조건은 (변성 온도: 94 ℃ - 60 초, 어닐링 온도: 54 ℃ - 120 초, 및 DNA 사슬 신장 온도: 70 ℃ - 180 초의 사이클을 25 회 반복함)이었다.
(3) 플라스미드 pGEM-TP2의 구축
플라스미드 pNU210 (Udaka, S. 등, Methods in Enzymology, 217, 23-33 (1993)) 내에 함유된 HWP 프로모터 영역으로부터의 P2 프로모터를 코딩하는 DNA 서열을 프라이머 5 (서열 번호 10: 도 10) 및 프라이머 6 (서열 번호 11: 도 11)을 사용하여 조건 1 하에 PCR에 의해 증폭시켜, 약 140 bp의 DNA 단편을 수득하였다. 프라이머 6이 lac 오퍼레이터 서열을 함유하기 때문에, 이러한 DNA 단편은 P2 프로 모터의 3'-말단에 lac 오퍼레이터 서열을 함유한다. 이러한 단편을 pGEM-T (Promega 제조)에 T4 결찰효소로 결찰시켰다. 이러한 DNA로 CaCl2 방법에 의해 대장균 JM109를 형질전환시키고, 생성된 앰피실린 내성 형질전환체로부터 플라스미드를 추출하여, pGEM-TP2를 수득하였다.
(4) 플라스미드 pGEM-TP2+의 구축
브레비바실러스 코시넨시스 HPD31의 HWP 프로모터 영역의 SD1 및 SD2 서열, 분비 시그널 서열로서의 R2L6 유형 개질 HWP 시그널 서열 (JP-A 7-170984 (1995)) (서열 번호 5, 서열 번호 21: 도 5) 및 멀티클로닝 부위를 함유하는, 플라스미드 pNH326 (Kajino, T. 등, Appl. Environ. Microbiol., 66, 638-642 (2000)) 내에 함유된 DNA 서열을 프라이머 7 (서열 번호 12: 도 12) 및 프라이머 8 (서열 번호 13: 도 13)을 사용하여 조건 1 하에 PCR에 의해 증폭시켜, 약 270 bp의 단편을 수득하였다. 생성된 DNA 단편을 제한효소 NsiI 및 HindIII로 처리하고, pGEM-TP2의 PstI/HindIII 부위에 T4 DNA 결찰효소로 결찰시켰다. 수용성 (competent) 세포 방법에 의해 이러한 DNA로 대장균 JM109를 형질전환시켜 pGEM-TP2+를 수득하였다.
(5) 플라스미드 셔틀 벡터 pNCMO2의 구축
또한, pGEM-TP2+를 BamHI 및 PstI로 처리하였다. 약 400 bp의 생성된 단편을 pNC의 BclI/PstI 부위 내로 삽입하고, T4 DNA 결찰효소로 결찰시키고, CaCl2 방법에 의해 이러한 DNA로 대장균 JM109를 형질전환시켰다. 생성된 앰피실린 내성 형질전환체로부터 플라스미드를 추출하여, 신규 플라스미드 셔틀 벡터 pNCMO2를 수득하였다 (도 23). 플라스미드 셔틀 벡터 pNCMO2의 구축 개요를 도 22 및 23에 나타낸다. 이렇게 수득된 신규 플라스미드 셔틀 벡터 pNCMO2의 제한효소 지도, 및 프로모터 등을 함유하는 이의 일부의 뉴클레오티드 서열을 도 21에 나타낸다. 상기 언급된 방식으로, 브레비바실러스 코시넨시스 HPD31-S5 (FERM BP-6623)을 이러한 플라스미드 셔틀 벡터로 형질전환시키고, 생성된 형질전환체 (브레비바실러스 코시넨시스 HPD31-S5/pNCMO2)를 FERM BP-7394로 국제 기탁하였다.
실시예 2
pNCMO2 및 pNC301의 형질전환 효율
pNCMO2 및 pNC301의 형질전환 효율을 표 1에 나타낸다. 대장균 JM109에 대한 양 벡터의 형질전환 효율은 충분히 높았다. 브레비바실러스 코시넨시스 HPD31-S5에 대한 pNCMO2의 형질전환 효율은 pNC301의 형질전환 효율에 비해 낮았지만, 구축된 플라스미드를 삽입하기에는 충분히 높았다. 대장균 JM109의 형질전환은 CaCl2 방법 (Molecular Cloning, Cold Spring Habor Laboratory, Press, 1, 82, (1989))에 의해 수행하였고, 브레비바실러스 코시넨시스 HPD31-S5의 형질전환은 전기천공 (Takagi, T. 등, Agric. Biol. Chem., 53, 3099-3100 (1989))에 의해 수행하였다. 전기천공은 1.5 kV, 1000 Ω, 25 ㎌ 및 1.8 msec의 조건 하에 Gene Pulser (BioRad 제조)를 사용하여 수행하였다.
pNCMO2 및 pNC301의 형질전환 효율
플라스미드 벡터 숙주 세균 형질전환 효율 (CFU/㎍ DNA)
pNOMO2 대장균 JM109 6.1 ×106
pNC301 대장균 JM109 8.6 ×106
pNC119 대장균 JM109 1.9 ×107
pNCMO2 브레비바실러스 코시넨시스 HPD31-S5 5.2 ×104
pNC301 브레비바실러스 코시넨시스 HPD31-S5 1.2 ×106
pNY301 브레비바실러스 코시넨시스 HPD31-S5 1.9 × 106
실시예 3
플라스미드 셔틀 벡터 pNCMO2 및 플라스미드 셔틀 벡터 pNC301 간의 BLA 생산 비교
(1) 재조합 유전자 발현 플라스미드 pNCMO2BLA 및 pNC301BLA의 구축
바실러스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis)로부터의 α-아밀라아제 (BLA) 유전자를 pHY4631 (Yamagata, H. 등, J. of Biotechnol, 169, 1239-1245 (1987))을 주형으로 하여 프라미어 9 (서열 번호 14: 도 14) 및 프라이머 10 (서열 번호 15: 도 15)을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 생성된 PCR 산물을 제한효소 PstI 및 HindIII로 절단하여, BLA 유전자를 함유하는 약 1.5 kb의 DNA 단편을 수득하였다. 실시예 1에서 구축된 플라스미드 벡터 pNCMO2 및 pNC301을 제한 효소 PstI 및 HindIII로 절단하고, 여기에 상기에서 수득된 BLA 유전자를 함유하는 단편을 T4 결찰효소로 결찰시켜, 플라스미드 벡터 pNCMO2BLA 및 pNC301BLA를 수득하였다 (도 24). 또한, CaCl2 방법에 의해 플라스미드 벡터 pNCMO2BLA 및 pNC301BLA를 사용하여 대장균 JM109를 형질전환시켜, 플라스미드 벡터 pNCMO2BLA 및 pNC301BLA를 각각 보유하는 형질전환체 대장균 JM109/pNCMO2BLA 및 대장균 JM109/pNC301BLA를 수득하였다.
또한, BLA 유전자로서, BLA 유전자를 함유하는 플라스미드, 예를 들어, pHT110BLA (일본 특허 No. 2727391)로부터 절단된 DNA 단편을 사용하는 것이 또한 가능하였다.
(2) 대장균 JM109/pNCMO2BLA 및 대장균 JM109/pNC301BLA로의 BLA 생산
각각의 형질전환체를 2 ×YT 배지의 1.5 ㎖ 부분에 접종하여, 하룻밤 동안 37 ℃에서 교반하면서 인큐베이션하였다. 이러한 배양 용액을 초음파처리기로 30 초 동안 처리하여, 세포를 분쇄시키고, 처리된 용액 내의 아밀라아제 활성을 가용성 전분을 기질로 사용하여 사이또의 방법 (Arch. Biochem. Biophys., 155, 290 (1973))의 방법에 의해 측정하였다 (도 25). 대장균 JM109/pNCMO2BLA는 대장균 JM109/pNC301BLA에 비해 약 1/70인 양으로 아밀라아제를 생산하였고, 대장균에서의 유전자 발현은 효율적으로 억제되었다.
또한, 대장균 JM109/pNCMO2BLA 및 대장균 JM109/pNC301BLA를 3 % 전분을 함유하는 LA 한천 배지 상에 접종하고, 하룻밤 동안 37 ℃에서 인큐베이션하여 콜로니를 형성시키고, 이의 할로 형성성 및 성장을 비교하였다 (도 26: 도면 대용 사진). 그 결과, 대장균 JM109/pNCMO2BLA는 대장균 JM109/pNC301BLA보다 콜로니 주변의 할로 크기가 작았고, 따라서 BLA 발현이 억제되었다. 또한, 성장된 콜로니의 크기로부터, 대장균 JM109/pNCMO2BLA가 더 빨리 증식하였다는 것이 확인되었다. 이는 아마도 대장균 JM109/pNCMO2BL에서 BLA 발현이 양호한 효율로 억제되고 따라서 세균에 가해지는 스트레스가 감소되어 증식을 개선시키기 때문일 것이다.
대장균 JM109/pNCMO2BLA를 1 mM IPTG를 함유하는 한천 배지 상에 접종하는 경우, 형성된 할로의 크기는 IPTG가 없는 한천 배지 상에 접종된 동일한 균주로 형성된 할로의 크기와 거의 동일하였다 (도 27: 도면 대용 사진). pNCMO2에 의해 제공되는 대장균에서의 발현 억제 효과에 관하여, 이는 아마 lac 오퍼레이터 삽입에 의한 억제 효과에 더하여, P2 프로모터 활성이 P5 프로모터 활성에 비해 대장균에서 매우 낮기 때문일 것이다.
(3) 브레비바실러스 코시넨시스 HPD31-S5/pNCMO2BLA 및 브레비바실러스 코시넨시스 HPD31-S5/pNC301BLA로의 BLA 생산
브레비바실러스 코시넨시스 HPD31-S5를 전기천공에 의해 각각 (1)에서 수득된 플라스미드 벡터 pNCMO2BLA 및 pNC301BLA로 형질전환시켜, 각각 플라스미드 벡터 pNCMO2BLA 및 pNC301BLA를 보유하는 형질전환체 브레비바실러스 코시넨시스 HPD31-S5/pNCMO2BLA 및 브레비바실러스 코시넨시스 HPD31-S5/pNC301BLA를 수득하였다 (도 24). 전기천공은 1.5 kV, 1000 Ω, 25 ㎌ 및 1.8 msec의 조건 하에 Gene Pulser (BioRad 제조)를 사용하여 수행하였다. 각각의 형질전환체를 1.5 ㎖ TMN 배지를 함유하는 시험관 내에 접종하고, 30 ℃에서 2 일 동안 교반하면서 인큐베이션하였다. 이러한 배양 용액을 원심분리하고, 배양 상층액의 아밀라아제 활성을 가용성 전분을 기질로 사용하여 사이또의 방법 (Arch. Biochem. Biophys., 155, 290 (1973))의 방법에 의해 측정하였다 (도 28). 브레비바실러스 코시넨시스 HPD31-S5/pNCMO2BLA는 브레비바실러스 코시넨시스 HPD31-S5/pNC301BLA 보다 약 22 배 큰 양으로 아밀라아제를 생산하였다. 따라서, pNCMO2가 pNC301보다 더욱 효율적으로 브레비바실러스 속 세균에서 유전자를 발현시킬 수 있는 것으로 나타났다.
실시예 4
재조합 유전자 발현 플라스미드 pNY326CT의 구축
(1) CTA 유전자 및 CTB 유전자의 수득
콜레라 독소 (CT) A 서브유닛 유전자 (CTA) (0.7 bp)를 비브리오 콜레라 염색체 DNA (Mekalanos, J. 등, Nature, 306, 551-557 (1983))를 주형으로 하여 프라이머 11 (서열 번호 16: 도 16) 및 프라이머 12 (서열 번호 17: 도 17)의 2 개의 합성 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 유사한 방식으로, CT B 유전자 (CTB) (0.3 bp)를 프라이머 13 (서열 번호 18: 도 18) 및 프라이머 14 (서열 번호 19: 도 19)의 2 개의 프라이머를 사용하여 증폭시켰다.
(2) 플라스미드 pT7BlueCTA 및 플라스미드 pT7BlueCTB
플라스미드 pT7Blue (Novagen 제조) 및 상기 수득된 CTA 유전자 또는 CTB 유전자를 T4 결찰효소로 결찰시켜, CTA 유전자를 보유하는 플라스미드 pT7BlueCTA 또는 CTB 유전자를 보유하는 플라스미드 pT7BlueCTB를 수득하였다.
(3) 플라스미드 pNY326CTA의 구축
플라스미드 pNY326 [pNY301 (JP-A 10-295378 (1998))의 시그널 서열을 R2L6 유형 (서열 번호 5, 21: 도 5)으로 전환시켜 수득되는 플라스미드]을 NcoI 및 HindIII로 처리하여 3.6 kbp의 단편을 수득하였다. 또한, pT7BlueCTA를 NcoI 및 HindIII로 처리하여 CTA 유전자를 함유하는 0.7 kbp의 DNA 단편을 수득하였다. 이러한 DNA 단편을 상기에서 수득된 3.6 kbp의 유전자 단편에 T4 결찰효소로 결찰시켰다. 결찰된 DNA를 사용하여 전기천공에 의해 브레비바실러스 코시넨시스 HPD31-S5를 형질전환시켰다. 생성된 네오마이신 내성 균주로부터, 플라스미드를 추출하여, CTA 유전자를 보유한 pNY326CTA를 수득하였다.
(4) 플라스미드 pNY326CTB의 구축
유사한 방식으로, pNY326을 NcoI 및 BamHI로 처리하여 3.6 kbp의 단편을 수득하였다. 또한, pT7BlueCTB를 NcoI 및 BamHI로 처리하여 CTB 유전자를 함유하는 0.3 kbp의 DNA 단편을 수득하였다. 이러한 DNA 단편을 상기에서 수득된 3.6 kbp의 DNA 단편에 T4 결찰효소로 결찰시켰다. 결찰된 DNA를 사용하여 브레비바실러스 코시넨시스 HPD31-S5를 형질전환시켜, 네오마이신 내성을 갖는 균주를 선택하였다. 선택된 균주로부터, 플라스미드를 추출하여, CTB 유전자를 보유한 플라스미드 pNY326CTB를 수득하였다.
(5) 브레비바실러스 코시넨시스 HPD31-S5의 pNY326CT로의 형질전환의 시행
pNY326CTB를 BamHI 및 HindIII로 처리하여 4.7 kbp의 DNA 단편을 수득하였다. 또한, SD2 서열을 함유하는 형태의 CTA 유전자 (SD-CTA 유전자 (0.8 kbp))를 pNY326CTA를 주형으로 하여 프라이머 15 (서열 번호 20: 도 20) 및 프라이머 11 (서열 번호 16: 도 16)의 2 개의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR 산물을 BamHI 및 HindIII로 처리하여, 0.4 kbp의 단편을 수득하였다. 이러한 단편을 pNY326CTB로부터의 4.7 kbp의 상기에서 수득된 DNA 단편에 T4 결찰효소로 결찰시켰다. 결찰된 DNA를 사용하여 전기천공에 의해 브레비바실러스 코시넨시스 HPD31-S5를 형질전환시키고, 형질전환체를 50 ㎍/㎖ 네오마이신 함유 TM 한천 배지 (1 % 펩톤, 0.2 % 효모 추출물, 0.5 % 미트 추출물, 1 % 글루코스, 0.001 % FeSO4ㆍ7H2O, 0.001 % MnSO4ㆍ4H2O, 0.0001 % ZnSO4ㆍ7H2O, 1.5 % 한천, pH 7.0) 상에 도포하여, 네오마이신 내성을 갖는 균주를 선택하려 하였다. 그러나, 내성 균주가 수득되지 않았다. 전기천공은 1.5 kV, 1000 Ω, 25 ㎌ 및 1.8 msec의 조건 하에 Gene Pulser (BioRad 제조)를 사용하여 수행하였다.
실시예 5
재조합 유전자 발현 플라스미드 pNCMO2CT의 구축
(1) 플라스미드 pNCMO2CTB의 구축
pNCMO2를 NcoI 및 BamHI로 처리하여 5.2 kbp의 단편을 수득하였다. 또한, pT7BlueCTB를 NcoI 및 BamHI로 처리하여, CTB 유전자를 함유하는 0.3 kbp의 DNA 단편을 수득하였다. 이러한 DNA 단편을 상기에서 수득된 5.2 kbp의 유전자 단편에 T4 DNA 결찰효소로 결찰시켰다 (도 29). 이러한 결찰된 DNA로 대장균 JM109를 형질전환시키고, 플라스미드를 추출하여 CTB 유전자를 보유하는 pNCMO2CTB를 수득하였다.
(2) 플라스미드 pNCMO2CT의 구축
pNCM02 CTB를 BamHI 및 HindIII로 처리하여 5.5 kbp의 단편을 수득하였다. 실시예 4 (5)에서 수득된 SD-CTA 유전자 (0.8 kbp)를 BamHI 및 HindIII로 처리하여 0.8 kbp의 단편을 회수하였다. 이러한 단편을 상기에서 수득된 5.5 kbp의 유전자 단편에 T4 DNA 결찰효소로 결찰시켰다 (도 29). 결찰된 DNA로 대장균 JM109를 형질전환시켜, 앰피실린 내성을 갖는 형질전환체를 선택하였다. 3 개의 선택된 형질전환체로부터, 플라스미드를 추출하여 CTB 유전자를 보유하는 플라스미드 pNCMO2CT를 수득하였다. 서열분석 결과, 모든 형질전환체에서, CTB 유전자가 플라스미드에 바르게 결찰되었음이 확인되었다. 여기서 수득된 형질전환체를 대장균 JM109/pNCMO2CT로 지명하였다. 브레비바실러스 코시넨시스 HPD31-S5를 대장균 JM109/pNCMO2CT로부터 추출된 pNCMO2CT로 전기천공에 의해 형질전환시켰다. 따라서, 동일한 플라스미드를 보유한 다수의 형질전환체가 수득되었다. 생성된 형질전환체들을 브레비바실러스 코시넨시스 HPD31-S5/pNCMO2CT로 지명하였다. 전기천공은 1.5 kV, 1000 Ω, 25 ㎌ 및 1.8 msec의 조건 하에 Gene Pulser (BioRad 제조)를 사용하여 수행하였다.
(3) 브레비바실러스 코시넨시스 HPD31-S5/pNCMO2CT로의 CT의 발현
교반하면서 중간 크기의 시험관을 사용하여 50 ㎍/㎖ 네오마이신 함유 TM 액체 배지 3 ㎖에서 30 ℃에서 2 일 동안 브레비바실러스 코시넨시스 HPD31-S5/pNCMO2CT를 배양하고, 배양 상층액을 SDS-PAGE에 적용하였다. 분석은 쿠마시 브릴리언트 블루 염색 및 토끼 CT 폴리클로날 항체로의 웨스턴 블롯팅에 의해 수행하였다. CTA 및 CTB의 추정 분자량은 각각 28 kDa 및 12 kDa였고, 각각 상응하는 분자량의 위치에서 염색 밴드를 나타냈다. 밴드의 색 심도로부터, CTA의 분비 생산량은 70 ㎎/ℓ로, CTB의 분비 생산량은 30 ㎎/ℓ로 각각 추정되었다. 이의 SDS-PAGE 전기영동 패턴을 도면 대용 사진에 나타낸다 (도 30). 또한, 배양 상층액을 CT에 특이적으로 결합하는 갈락토스 수지 (Microbial Pathogenesis, 16, 71-79 (1994))를 사용하여 정제한 후, 정제된 분획을 가열 처리하지 않고 전기영동에 적용한 경우, 밴드는 약 90 kDa의 부위로 시프트되었다. 이러한 사실로부터, 발현된 서브유닛이 1A5B 구조를 취하는 것으로 추정되었다.
본 발명에 따라, 대장균과 브레비바실러스 속 세균 간의 플라스미드 셔틀 벡터가 제공된다. 또한, 본 발명의 플라스미드 셔틀 벡터는, 실시예 3에서의 BLA 유전자 발현 결과에 나타나는 바와 같이, 대장균에서의 유전자 발현을 억제하고, 브레비바실러스 코시넨시스에서 유전자가 효율적으로 발현되도록 할 수 있다. 실시예 4 및 5에서의 CT 발현에 의해 나타나는 바와 같이, 본 발명에서의 플라스미드 셔틀 벡터 pNCMO2는 복잡한 유전자 구축을 필요로 하는 재조합 유전자 발현 플라스미드의 구축 및 이러한 재조합 유전자 발현 플라스미드로 형질전환된 형질전환체로의 단백질 제조에 특히 유용하다.
규칙 13-2에 따라 기탁된 미생물에 대한 기술
1. 브레비바실러스 코시넨시스 HPD31-S5/pNCMO2
a. 미생물이 기탁된 기탁 기관의 명칭 및 주소
명칭: 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허 생물 기탁 센터
주소: 우편번호 305-8566 일본 이바라끼껭 쓰꾸바시 히가시 1-1-1
에이아이에스티 쓰꾸바 센트럴 6
b. 미생물이 a의 기탁 기관에 기탁된 날짜
2000년 12월 12일
c. a의 기탁 기관이 기탁에 부여한 수탁 번호
FERM BP-7394
2. 브레비바실러스 코시넨시스 HPD31 (FERM BP-1087)
a. 미생물이 기탁된 기탁 기관의 명칭 및 주소
명칭: 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허 생물 기탁 센터
주소: 우편번호 305-8566 일본 이바라끼껭 쓰꾸바시 히가시 1-1-1
에이아이에스티 쓰꾸바 센트럴 6
b. 미생물이 a의 기탁 기관에 기탁된 날짜
1999년 8월 31일
c. a의 기탁 기관이 기탁에 부여한 수탁 번호
FERM BP-6863
<110> Higeta Shoyu Co., Ltd. <120> Plasmid Shuttle Vector between E. coli and Brevibacillus <130> 6555 <150> JP2001-37167 <151> 2001-02-14 <160> 21 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 44 <212> DNA <213> Brevibacillus choshinensis <400> 1 aaggcgccgc aacttttgat tcgctcaggc gtttaatagg atgt 44 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 2 aattgtgagc ggataacaat t 21 <210> 3 <211> 10 <212> DNA <213> Brevibacillus choshinensis <400> 3 gaaaggaggt 10 <210> 4 <211> 12 <212> DNA <213> Brevibacillus choshinensis <400> 4 agaggaggag aa 12 <210> 5 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of R2L6 type modified signal sequence <400> 5 Met Lys Lys Arg Arg Val Val Asn Ser Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ala Ser Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala Pro Met Ala Phe Ala 20 25 30 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1 <400> 6 aaaatgcatg gccagcaaaa gg 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2 <400> 7 aaaatgcatg acgaaagggc 20 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3 <400> 8 aaatgatcaa agcttcggca ttatagtgcg gg 32 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 4 <400> 9 aaatgatcct gcaggatccg tcgactctag 30 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 5 <400> 10 aaaggatccg acataatgga cagg 24 <210> 11 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 6 <400> 11 aaactgcaga ataattgtta tccgctcaca attacatcct attaaacgcc tg 52 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 7 <400> 12 aaactgcatg gctttcctgc gaaagg 26 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 8 <400> 13 aaaagcttat cgatttcgaa ggg 23 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 9 <400> 14 cgctgcagca gcggcggcaa atc 23 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 10 <400> 15 aaaagcttat ctttgaacat aaattg 26 <210> 16 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 11 <400> 16 aaccatggct ttcgctaatg atgataagtt atat 34 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 12 <400> 17 ttaagcttca taattcatcc ttaattct 28 <210> 18 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 13 <400> 18 aaccatggct ttcgctacac ctcaaaatat tactgatttg tgtgcagaat accacaac 58 <210> 19 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 14 <400> 19 aaggatcctt aatttgccat actaattgcg gc 32 <210> 20 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 15 <400> 20 gcggatccag aggaggagaa cacaaggtc 29 <210> 21 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of R2L6 type modified signal sequence <400> 21 atgaaaaaaa gaagggtcgt taacagtgta ttgcttctgc tactgctagc tagtgcactc 60 gcacttactg ttgctcccat ggctttcgct 90

Claims (11)

  1. 서열번호 1 의 염기 서열로 나타내는 프로모터, 및 대장균 및 브레비바실러스 속 세균에 대한 선택 마커로서 기능할 수 있는 DNA 서열을 함유하는, 브레비바실러스 속 세균 및 대장균 모두에서 복제가능한 것을 특징으로 하는 플라스미드 셔틀 벡터.
  2. (a) 서열번호 1 의 염기 서열로 나타내는 프로모터, SD 서열 및 분비 시그널 서열, (b) 브레비바실러스 속 세균에서 기능할 수 있는 Rep 단백질 유전자 및 복제 개시점을 코딩하는 DNA 서열, (c) 브레비바실러스 속 세균에 대한 선택 마커로서 기능할 수 있는 DNA 서열, (d) 대장균에서 기능할 수 있는 복제 개시점을 코딩하는 DNA 서열, 및 (e) 대장균에 대한 선택 마커로서 기능할 수 있는 DNA 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는, 대장균 및 브레비바실러스 속 세균 모두에서 복제가능한 플라스미드 셔틀 벡터.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 대장균 유래의 lac 오퍼레이터 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 셔틀 벡터.
  6. 하기 도면에 나타난 제한효소 인식 부위를 갖는 플라스미드 셔틀 벡터 pNCM02:
    Figure 112003027130796-pct00001
  7. 제 6 항의 플라스미드 셔틀 벡터 pNCM02를 함유하고, 국제 기탁 번호 FERM BP-7394로서 기탁된 브레비바실러스 코시넨시스 (Brevibacillus choshinensis) HPD31-S5/pNCM02 균주.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
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