DE60219604T2 - Plasmid-shuttlevektor zwischen escherichia coli und brevibacillus - Google Patents

Plasmid-shuttlevektor zwischen escherichia coli und brevibacillus Download PDF

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Description

  • Technisches Fachgebiet, zu dem die Erfindung gehört
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Plasmid-Pendelvektor (shuttle vector) zwischen Escherichia coli und Bakterien der Gattung Brevibacillus und ein Verfahren zum Transformieren von Bakterien der Gattung Brevibacillus unter Verwendung des Plasmid-Pendelvektors. Spezifischer bezieht sie sich auf einen Plasmid-Pendelvektor, der eine Genexpressionskontrollregion hat, die effektiv ein Zielgen in Bakterien der Gattung Brevibacillus exprimiert und absondert, aber die Expression in Escherichia coli signifikant unterdrückt, und der für die Genexpression in Bakterien der Gattung Brevibacillus geeignet ist. Weiter bezieht sie sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das durch Züchten einer Transformante, transformiert durch das Transformationsverfahren, gekennzeichnet ist.
  • Stand der Technik
  • Udaka et al. waren erfolgreich bei der Entwicklung eines Expressionssystems eines rekombinanten Proteins unter Verwendung als Wirt von Bakterien der Gattung Brevibacillus (getrennt von der gewöhnlichen Klassifizierung der Gattung Bacillus) mit hervorragenden Merkmalen, die in Escherichia coli und Bacillus subtilis nicht gefunden wurden, dass eine große Menge eines Proteins extrazellulär sezerniert wird und eine extrazelluläre Proteaseaktivität schwach ist (Patent Nr. 2082727, JP-A 62-201583 (1987), Yamagata, H. et al., J. Bacteriol., 169, 1239–1245 (1987), Shigezo Udaka, Nippon Nogeikagaku Kaishi 61, 669–676 (1987), Takao, M. et al., Appl. Microbiol, Blotechnol., 30, 75–80 (1989), Yamagata, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86, 3589–3593 (1989)). Die Herstellung von α-Amylase (Patent Nr. 2082727) oder menschlichem epidermalen Wachstumsfaktor (hEGF) (Patent Nr. 2787585) durch ein Expressionssystem unter Verwendung von Bakterien der Gattung Brevibacillus als Wirt und desgleichen wurde bisher berichtet.
  • Währenddessen wurden als Plasmidvektor, brauchbar zur Genexpression von Bakterien der Gattung Brevibacillus, zum Beispiel pNU200 (Shigezo Udaka, Nippon Nogeikagaku Kaishi 61, 669–676 (1987)), pNH300 (Shiga, Y. et al., Applied and Environmental Microbiology, 58, 525–531 (1992)), pNH400 (Ishihara, T. et al., J. Bacteriol., 117, 745–749 (1995)), pHY700 (JP-A 4-278091 (1992), pHT-Serie-Plasmide (Patent Nr. 2727391) und desgleichen bisher berichtet. Besonders die vorliegenden Erfinder verwendeten pNY301 und andere pNY-Serie-Plasmide für das Patent (JP-A 10-295378) als Plasmidvektor, brauchbar für die Transformation von Bakterien der Gattung Brevibacillus.
  • Die pNY-Serie-Plasmide enthalten eine Expressionskontrollregion, die (einen) Promotor(en) und (eine) SD-Sequenz(en) aus Bakterien der Gattung Brevibacillus, einen Replikationsursprung, ein Replikationsursprungsproteingen und ein Neomycin-Resistenzgen von dem Plasmid pUB110. Und pNY-Serie-Plasmide können ein HS-Gen von Brevibacillus choshinensis HPD31 enthalten.
  • Probleme, welche die Erfindung lösen soll
  • Wie vorstehend erwähnt, ist das sekretorische Produktionssystem von Proteinen unter Verwendung von Bakterien der Gattung Brevibacillus als Wirt eines der brauchbaren Systeme bei der Herstellung von Proteinen durch genetische Rekombination. Jedoch ist eine Transformationseffizienz von Bakterien der Gattung Brevibacillus im Vergleich zu einer Transformationseffizienz von Escherichia coli gering. Demgemäß gab es einen Defekt, dass die Konstruktion von rekombinanten Genexpressionsplasmiden unter Verwendung von Bakterien der Gattung Brevibacillus im Vergleich zu Escherichia coli schwierig ist. Zum Beispiel erreicht im Fall der Verwendung eines Elektroporationsverfahren (Takagi, T. et al., Agric. Biol. Chem., 53, 3099–3100 (1989)) eine Transformationseffizienz von Escherichia coli 1010 CFU/ugDNA. Währenddessen war es im Fall von Brevibacillus choshinensis (früher Bacillus brevis; es gab eine Änderung bei der taxonomischen Position in Shida O., et al., Int. J. Syst. Bacteriol., 46, 939–946 (1996)), der zu der Gattung Brevibacillus gehört, nur 107 CFU/ugDNA. Weiter war bekannt, dass im Fall der Anwendung eines Verfahrens mit Ausnahme des Elektroporationsverfahrens die Transformationseffizienz der Bakterien der Gattung Brevibacillus mehr reduziert ist.
  • Besonders die Transformation von Bakterien der Gattung Brevibacillus mit einem Gen, das ein Protein mit einer Komplexen Struktur höherer Ordnung codiert, zum Beispiel einem Gen, das ein Protein wie das Choleratoxin (CT), hergestellt von Vibrio cholerae codiert, das eine A-Untereinheit und fünf B-Untereinheiten umfasst (Clements und Finkelstein, Intect. Immun., 24; 760–769 (1979)), und die Proteinherstellung unter Verwendung der Transfomante erfuhren bis heute viele Schwierigkeiten.
  • Als eine der Maßnahmen, um die Probleme zu bewältigen, wird ein Verfahren erwogen, bei dem ein Plasmidvektor (nachstehend als „Pendelvektor" bezeichnet), der auch in anderen für einen Transformationsschritt einfachen Wirtszellen replizierbar ist, zum Beispiel in Escherichia coli verwendet wird, die Konstruktion eines rekombinanten Genexpressionsplasmids unter Verwendung der Wirtszellen zuerst konstruiert wird und die Transformation der Bakterien der Gattung Brevibacillus weiter durch Elektroporation oder desgleichen unter Verwendung des rekombinanten Genexpressionsplasmids ausgeführt wird.
  • Ein Pendelvektor und ein Transformationsverfahren unter Verwendung des Pendelvektors sind Techniken, die Fachleuten bekannt sind. Zum Beispiel wurden in Bezug auf einen Pendelvektor zwischen Escherichia coli und Bacillus subtilis JP-A 63-198986 (1988), JP-A 2000-197491 und desgleichen berichtet. Trotzdem waren ein Plasmid-Pendelvektor, verwertbar in einem Tranformationsverfahren durch genetische Rekombination von Bakterien der Gattung Brevibacillus und bei der rekombinanten Genexpression mit der Transformante, und ein Verfahren zum Transformieren von Bakterien der Gattung Brevibacillus unter Verwendung des Plasmid-Pendelvektors bis heute unbekannt.
  • Mittel zum Lösen der Probleme
  • Die vorliegenden Erfinder konzentrierten sich auf solche Brauchbarkeit, dass ein Zielprotein extrazellulär in einem Expressionssystem unter Verwendung von Bakterien der Gattung Brevibacillus als Wirt sezerniert wird, erwogen ernsthaft die Notwendigkeit für die Entwicklung eines neuen Wirt-Vektor-Systems, das die vorhergehenden Defekte löst, und versuchten, einen neuen Plasmid-Pendelvektor zu entwickeln, bei dem Escherichia coli und Bakterien der Gattung Brevibacillus als Wirt verwendet werden können und der bei genetischer Rekombination verwendet werden kann.
  • Um das Ziel zu erreichen, konzentrierten sich die vorliegenden Erfinder demnach wieder auf den Punkt, dass besonders der Plasmidvektor pNY301, für den die vorliegenden Erfinder bereits ein Patent anmeldeten, unter einer großen Anzahl von Plasmidvektoren einen Promotor und eine Sekretionssignalsequenz von Brevibacillus choshinensis HPD31 enthält. Auf Grundlage dieses Plasmidvektors pNY301 synthetisierten sie mehrere DNA-Sequenzen durch PCR oder desgleichen oder schnitten sie aus von bekannten Sequenzen, fügten weiter diese DNA-Fragmente in den Plasmidvektor ein und bestätigten die Insertion. Außerdem führten sie die Bestätigung der Transformation mit den erhaltenen Plasmiden durch, die Bestätigung der Expression in Transformanten und so weiter. Als Ergebnis der Durchführung einer riesigen Anzahl dieser delikaten Behandlungen und Tätigkeiten mit Versuch und Irrtum waren sie letztendlich erfolgreich bei der Herstellung eines gewünschten neuen Plasmid-Pendelvektors.
  • Der neue Plasmid-Pendelvektor, der erfolgreich auf diese Weise hergestellt wurde, wurde in Escherichia coli und in Brevibacillus choshinensis eingeführt, und die erhaltenen Bakterien wurden gezüchtet. Infolgedessen wurde die Replikation des Plasmid-Pendelvektors in einem beliebigen der Wirte durchgeführt. Es wurde gefunden, dass bei der rekombinanten Genexpression unter Verwendung des Plasmid-Pendelvektors ein Zielgen in Brevibacillus choshinensis effektiv sezerniert und exprimiert wird, aber dass die Expression in Escherichia signifikant unterdrückt wird. Es wurde weiter bestätigt, dass selbst wenn eine Transformante des Brevibacillus choshinensis durch andere bekannte Verfahren nicht erhalten wird, die Transformation mit der Anwendung des Plasmid-Pendelvektors möglich ist. Demnach wurde die Erfindung abgeschlossen.
  • Das heißt, die Erfindung stellt zum Lösen der vorhergehenden Probleme einen Plasmid-Pendelvektor zwischen Escherichia coli und Brevibacillus choshinensis bereit, der für die Transformation durch genetische Rekombination von Brevibacillus choshinensis und für die Proteinherstellung mit der Transformanten brauchbar ist, und ein Transformationsverfahren unter Verwendung des Plasmid-Pendelvektors. Besonders stellt sie einen Plasmid-Pendelvektor mit einer Genexpressionskontrollregion bereit, welcher effizient ein Zielgen in Brevibacillus choshinensis exprimiert und sezerniert, aber welcher die Expression in Escherichia coli signifikant unterdrückt und für die Genexpression in Brevibacillus choshinensis und zur Proteinherstellung geeignet ist. Weiter stellt die Erfindung ein Verfahren zum Transformieren von Brevibacillus choshinensis unter Verwendung des Plasmid-Pendelvektors, und ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins bereit, gekennzeichnet durch Züchten von Brevibacillus choshinensis, der mit dem Plasmid-Pendelvektor transformiert ist.
  • Kurze Beschreibung der Abbildungen
  • 1 zeigt einen P2-Promotor.
  • 2 zeigt eine Lac-Operatorsequenz.
  • 3 zeigt eine SD-Sequenz (SD1).
  • 4 zeigt eine SD-Sequenz (SD2).
  • 5 zeigt ein modifiziertes Signalpeptid vom R2L6-Typ (Nucleotidsequenz in der oberen Reihe und Aminosäuresequenz in der unteren Reihe).
  • 6 zeigt Primer 1 der PCR-Clonierung.
  • 7 zeigt Primer 2 der PCR-Clonierung.
  • 8 zeigt Primer 3 der PCR-Clonierung.
  • 9 zeigt Primer 4 der PCR-Clonierung.
  • 10 zeigt Primer 5 der PCR-Clonierung.
  • 11 zeigt Primer 6 der PCR-Clonierung.
  • 12 zeigt Primer 7 der PCR-Clonierung.
  • 13 zeigt Primer 8 der PCR-Clonierung.
  • 14 zeigt Primer 9 der PCR-Clonierung.
  • 15 zeigt Primer 10 der PCR-Clonierung.
  • 16 zeigt Primer 11 der PCR-Clonierung.
  • 17 zeigt Primer 12 der PCR-Clonierung.
  • 18 zeigt Primer 13 der PCR-Clonierung.
  • 19 zeigt Primer 14 der PCR-Clonierung.
  • 20 zeigt Primer 15 der PCR-Clonierung.
  • 21 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmid-Pendelvektors pNCMO2.
  • 22 zeigt ein Verfahren zur Konstruktion des Plasmid-Pendelvektors pNCMO2.
  • 23 zeigt eine Fortsetzung der vorstehenden.
  • 24 zeigt ein Verfahren der Konstruktion der rekombinanten Genexpressionsplasmide pNCMO2BLA und pNC301BLA.
  • 25 zeigt eine Produktivität von E. coli JM109/pNCMO2BLA und E. coli JM109/pNC301BLA.
  • 26 ist ein Foto an Stelle einer Abbildung, das die Bildung eines Hofs und das Wachstum durch E. coli JM109/pNCMO2BLA und E. coli MP109/pNC301BLA zeigt.
  • 27 ist ein Foto an Stelle einer Abbildung, das die Wirkungen von IPTG in Bezug auf die BLA-Expression durch E. coli JM109/pNCMO2BLA zeigt.
  • 28 zeigt eine Produktivität von BLA durch Brevibacillus choshinensis HPD31-S5/pNCMO2BLA und Brevibacillus choshinensis HPD31-S5/pNC301BLA.
  • 29 zeigt ein Verfahren der Konstruktion des rekombinanten Genexpressionsplasmids pNCMO2CT.
  • 30 ist Fotos an Stelle einer Abbildung, die ein Bild der Coomassie Brilliant Blue-Färbung und ein Bild des Western-Blottings einer Kultur der Transformante Brevibacillus choshinensis HPD31-S5/pNCMO2CT zeigen.
  • Art der Ausführung der Erfindung
  • Die Erfindung wird nachstehend ausführlich beschrieben.
  • Der Plasmid-Pendelvektor der Erfindung ist ein Plasmid-Pendelvektor, der sowohl in Escherichia coli als auch in Brevibacillus choshinensis replizierbar ist und einen Promotor umfasst, der in der Lage ist, in Brevibacillus choshinensis zu funktionieren, und (eine) DNA-Sequenz(en), die einen selektive(n) Marker für Brevibacillus choshinensis und Escherichia coli codiert/codieren.
  • Der Plasmid-Pendelvektor der Erfindung ist in Escherichia coli und Brevibacillus choshinensis autonom replizierbar. Demgemäß kann durch einen Schritt wie die Insertion eines DNA-Fragments in den Plasmid-Pendelvektor der Erfindung unter Verwendung von Escherichia coli ein rekombinantes Genexpressionsplasmid konstruiert werden, und weiter kann die Transformation von Brevibacillus choshinensis unter Verwendung des rekombinanten Genexpressionsplasmid durchgeführt werden.
  • Der Promotor, der in der Lage ist, in Brevibacillus choshinensis, der den Plasmid-Pendelvektor der Erfindung besitzt, zu funktionieren, ist nicht besonders begrenzt, solange er in Brevibacillus choshinensis funktioniert. Er ist vorzugsweise ein Promotor von Bakterien der Gattung Brevibacillus. Besonders bevorzugte Beispiele davon können Promotoren beinhalten, die in einer MWP-Promotorregion von Brevibacillus brevis 47 (früher Bacillus brevis 47) (JP-B 1-58950 (1989) und JP-B 7-108224 (1995)) und einer HWP-Promotoregion von Brevibacillus choshinensis HPD31 (FERM BP-6863) (früher Bacillus brevis; dieser Stamm ist der gleiche wie Bacillus brevis H102 (FERM BP-1087) (JP-A 4-278091 (1992) und JP-A 6-133782 (1994)) enthalten sind, zum Beispiel einen P2-Promotor (Sequenz Nr. 1: 1).
  • Der Plasmid-Pendelvektor der Erfindung umfasst weiter eine Ribosombindende Region (SD-Sequenz) und eine DNA-Sequenz, die ein Signalpeptid zum Sezernieren eines Expressionsproteins codiert, an dem 3'-Terminus eines Promotors, der in Brevibacillus choshinensis funktioniert. Als SD-Sequenz kann zum Beispiel eine Sequenz von einer Expressionskontrollregion eines HWP-Gens von Brevibacillus choshinensis, wie SD1 (Sequenz Nr. 3: 3) oder SD2 (Sequenz Nr. 4: 4) verwendet werden. Als Sekretionssignalpeptid kann zum Beispiel ein Signalpeptid, das in einer HWP-Promotorregion von Brevibacillus choshinensis HPD31 (FERM BP-1087, FERM BP-6863) enthalten ist, verwendet werden. Als ein besonders bevorzugtes Beispiel kann eine modifizierte HWP-Signalsequenz vom R2L6-Typ oder desgleichen (JP-A 7-170984 (1995)) erwähnt werden (in Bezug auf dieses modifizierte Signalpeptid vom R2L6-Typ wird seine Aminosäuresequenz in Sequenz Nr. 5 gezeigt, und die DNA-Sequenz, die diese codiert, wird in Sequenz Nr. 21 gezeigt. Weiter werden beide der Sequenzen in 5 gezeigt. In der Abbildung zeigt die obere Reihe eine Nucleotidsequenz und die untere Reihe zeigt eine Aminosäuresequenz).
  • Der Plasmid-Pendelvektor der Erfindung umfasst weiter die DNA-Sequenz, die eine Replikationskontrollregion codiert, die für die Replikation in Bakterien notwendig ist. In Bezug auf die Replikationskontrollregion können entweder eine gemeinsame Region oder unterschiedliche Regionen für sowohl Bakterien der Gattung Brevibacillus als auch Escherichia coli verwendet werden. Die Replikationskontrollregion in Bakterien der Gattung Brevibacillus umfasst ein Rep-Proteingen und einen Replikationsstartpunkt. Die Sequenz, die in der Lage ist, als eine Replikationskontrollregion in Brevibacillus choshinensis zu funktionieren, ist nicht besonders begrenzt, solange sie in einem Plasmid enthalten ist, das in Brevibacillus choshinensis repliziert und gezüchtet wird, und eine DNA-Sequenz ist, die als eine Replikationskontrollregion eines Plasmids funktioniert. Als ein besonders bevorzugtes Beispiel kann ein Rep-Proteingen von dem Plasmid pUB110 und eine DNA-Sequenz, die ein Replikationsstartpunkt codiert, erwähnt werden.
  • In Escherichia coli wird ein Replikationsstartpunkt als eine Replikationskontrollregion benötigt. Eine DNA-Sequenz, die einen Replikationsstartpunkt codiert, der in der Lage ist, in Escherichia coli zu funktionieren, ist nicht besonders begrenzt, solange sie eine DNA-Sequenz ist, die in einem Plasmid enthalten ist, das in Escherichia coli repliziert und gezüchtet wurde, und als Replikationsstartpunkt eines Plasmids funktioniert. Vorzugsweise ist eine DNA-Sequenz, die eine ORI-Region enthält, die als Replikationsstartpunkt eines Plasmids funktioniert. Besonders bevorzugt ist eine DNA-Sequenz, die eine ORI-Region von Plasmidvektoren codiert, die gewöhnlich bei genetischer Rekombinationsmanipulation unter Verwendung von Escherichia coli verwendet werden, wie die pUC-Serie, zum Beispiel pUC18, pUC118 und pUC119 und pBR322.
  • Als DNA-Sequenz, die eine Replikationskontrollregion codiert, die in der Lage ist, sowohl in Bakterien der Gattung Brevibacillus als auch in Escherichia coli zu funktionieren, kann eine Replikationskontrollregion eines zu einer pLS1/pE194-Plasmidfamilie gehörendes Plasmids, die eine Replikationskontrollregion ist, die in der Lage ist, sowohl in grampositiven Bakterien als auch in gramnegativen Bakterien zu funktionieren (Del Solar, G. et al., Mol. Microbiol., 8, 789–796 (1993)), erwähnt werden. Zum Beispiel kann eine DNA-Sequenz verwendet werden, die eine Replikationskontrollregion codiert (Sano. K. et al., FEMS Microbiology Letters, 148, 223–226 (1997)), die Ori, RepA und RepB des Plasmids pLA106 von Lactobacillus acidophilus umfasst.
  • In Bezug auf Sequenzen, die in der Lage sind, als selektive Marker für Brevibacillus choshinensis und Escherichia coli, das den Plasmid-Pendelvektor der Erfindung besitzt, zu funktionieren, kann eine gemeinsame Sequenz oder unterschiedliche Sequenzen zu sowohl Brevibacillus choshinensis als auch Escherichia coli verwendet werden. In Bezug auf die Sequenzen, die in der Lage sind, als selektive Marker zu funktionieren, kann ein Drug-Resistenzgen verwendet werden. Für Brevibacillus choshinensis kann zum Beispiel eine DNA-Sequenz, die ein Drug-Resistenzgen von Bakterien der Gattung Brevibacillus und aus Bakterien der Gattung Bacillus enthält, dazu analog verwendet werden. Besonders bevorzugte Beispiele davon können ein Neomycin-Resistenzgen, das im Plasmidvektor pNY301 (JP-A 10-295378 (1998)) enthalten ist, und ein Erythromycin-Resistenzgen, das in pHT110 (Patent Nr. 2727391) enthalten ist, beinhalten. Weiter ist für Escherichia coli zum Beispiel eine DNA-Sequenz, die ein Kanamycin-Resistenzgen, ein Ampicillin-Resistenzgen, ein Chloramphenicol-Resistenzgen oder desgleichen codiert, das ein bekanntes Drug-Resistenzgen von Escherichia coli ist, verfügbar. Noch weiter kann ein Drug-Resistenzgen, das in der Lage ist, sowohl in Brevibacillus choshinensis als auch in Escherichia coli zu funktionieren, ein Zeocin-Resistenzgen oder desgleichen verwendet werden.
  • Der Plasmid-Pendelvektor der Erfindung kann weiter eine DNA-Sequenz umfassen mit einer Funktion, die Expression des rekombinanten Gens in Escherichia coli zu unterdrücken. Zum Beispiel kann im Fall von Escherichia coli mit einem LacI-Gen eine Lac-Operatorsequenz (Sequenz Nr. 2: 2) von Escherichia coli in dem 3'-Terminus einer Promotorsequenz, die in Brevibacillus choshinensis funktioniert, enthalten sein.
  • Der Plasmid-Pendelvektor der Erfindung ist neu. Zum Beispiel ist pNCMO2 ein Plasmidvektor mit einer Größe von 5,224 bp. Eine Restriktionskarte von pNCMO2 und eine Nucleotidsequenz von seinem Teil, der einen Promotor enthält, wurden in 21 gezeigt. Die Promotorregion von pNCMO2 enthält einen P2-Promotor von einer HWP-Promotorregion von Brevibacillus choshinensis HPD31, einen Lac-Operator von Escherichia coli, eine SD-Sequenz, ein modifiziertes Signalpeptid vom R2L6-Typ als Sekretionssignalpeptid, eine Multicloning-Stelle und ein HS-Gen (JP-A 9-224677 (1997)) als Terminator. In Bezug auf die Multicloning-Stelle sind PstI-, BamHI-, SalI-, XbaI-, XhoI-, EcoRI-, KpnI-, SmaI-, ClaI-, HindIII-Stellen als Clonierungsstellen verfügbar.
  • Der Plasmid-Pendelvektor pNCMO2 enthält eine DNA-Sequenz, die ein Neomycin-Resistenzgen als selektives Markergen für Brevibacillus choshinensis codiert, ein Rep-Proteingen von pUB110, das für die Replikation in Brevibacillus choshinensis notwendig ist, eine ColE1-Ori-Region als Replikationsstartpunkt von Escherichia coli und ein Ampicillin-Resistenzgen als selektives Markergen für Escherichia coli.
  • Bei der Konstruktion des Plasmid-Pendelvektors pNCMO2 in der Erfindung, werden pNY301, pNH326, pNU201 und dergleichen verwendet. Das Plasmid pNY301 wird in JP-A 10-295378 (1988) offen gelegt, das Plasmid pNH326 in Kajino, T. et al., Appl. Environ. Microbiol., 66, 638–642 (2000) und pNU201 in Udaka, S. et al., Methods in Enzymology, 217, 23–33 (1993), jeweils, und diese sind bekannte Plasmide. Andere Plasmide, die bei der Konstruktion des Plasmid-Pendelvektors der Erfindung verwendet werden, können im Handel bezogen werden.
  • Brevibacillus choshinensis HPD31-S5/pNCMO2, der den Plasmidvektor pNCMO2 trägt, wurde international am 12. Dezember 2000 in Patent Microorganism Depository of National Institute of Bicscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trads and Industry (der derzeitige Name: International Patent Organism Depasitary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) hinterlegt, und er wird der Belegnr. FERM BF-7394 zugeordnet.
  • Der bei der Konstruktion des Expressionsplasmids der Erfindung verwendete Wirt ist nicht besonders begrenzt, solange er ein Stamm ist, der zu Escherichia coli gehört. Als ein besonders bevorzugtes Beispiel kann E. coli JM109 erwähnt werden. E. coli JM109 ist ein bekannter Stamm, der im Handel bezogen werden kann.
  • In Bezug auf ein Verfahren zur Konstruktion eines rekombinanten Genexpressionsplamids von dem Plasmid-Pendelvektor der Erfindung unter Verwendung von Escherichia coli kann ein Verfahren auf der Grundlage einer Standard-Technologie der Molekularbiologie, die einem Fachmann bekannt ist, in geeigneter Weise verwendet werden. Zum Beispiel wird das Verfahren erwähnt, das in Molecular Cloning, 2. Aufl., A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)) beschrieben ist. Die Einzelheiten werden in den Beispielen beschrieben.
  • Als bei der Expression des rekombinanten Gens in der Erfindung verwendeter Wirt kann ein beliebiger Stamm von Brevibacillus choshinensis verwendet werden. Bevorzugte Beispiele können Brevibacillus choshinensis HPD31 (FERM BP-1087, FERM BP-6863) und Brevibacillus choshinensis HPD31-S5 (FERM BP-6623), das eine Variante davon ist, beinhalten.
  • Als ein Verfahren zum Transformieren von Brevibacillus choshinensis unter Verwendung des Pendelvektors der Erfindung und eines rekombinanten Genexpressionsplasmids, das mit Escherichia coli konstruiert wurde, kann ein einem Fachmann bekanntes Transformationsverfahren wie die Elektroporation verwendet werden.
  • Ein Medium, das in Kultur der Transformante der Erfindung verwendet wird, enthält, wie benötigt, eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und anorganische Salze. Die Kultur kann unter Verwendung eines synthetischen Mediums, das hauptsächlich aus Saccharid und anorganischen Salzen gemacht wird, durchgeführt werden. Im Fall der Verwendung eines Stamms, der Auxotrophie aufweist, ist es empfehlenswert, Nährstoffe, die für sein Wachstum benötigt werden, zu einem Medium hinzuzufügen. Weiter können Antibiotikum, Antischaum und desgleichen hinzugefügt werden, wie benötigt.
  • In Bezug auf die Züchtungsbedingungen wird der anfängliche pH-Wert eines Mediums reguliert zu 5.0 bis 9.0, vorzugsweise 6.5 bis 7.5. Die Züchtungstemperatur ist gewöhnlich 15°C bis 42°C, vorzugsweise 24 bis 37°C und die Züchtungszeit ist gewöhnlich 16 bis 360 Stunden, vorzugsweise 24 bis 144 Stunden. Bakterien der Gattung Brevibacillus, die durch das Verfahren der Erfindung transformiert werden, produzieren und reichen dadurch Proteine in einer Kulturlösung an.
  • Nach Beendigung der Züchtung wird das Sammeln eines Zielproteins aus der Kultur durch eine geeignete Kombination von Proteinaufreinigungsverfahren, die einem Fachmann bekannt sind, wie Lösungsmittelextraktion, Ultrafiltration, Ammoniumsulfatfraktionierung, HPLC, Gelfiltrationschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, Elektrophorese und isoelektrische Fokussierung ermöglicht.
  • Beispiele
  • Die Erfindung wird spezifischer nachstehend unter Verweis auf Beispiele erläutert. Jedoch ist dieses erläuternd, und die Erfindung ist nicht darauf begrenzt.
  • Beispiel 1
  • Konstruktion des Plasmid-Pendelvektors pNCMO2
  • (1) Konstruktion des Plasmid-Pendelvektors pNC301
  • Die Amplifikation wurde durch PCR mit dem Plasmidvektor pUC119 als Matrize unter Verwendung von Primer 1 (Sequenz Nr. 6: 6) und Primer 2 (Sequenz Nr. 7: 7) ausgeführt, und das erhaltene PCR-Produkt wurde mit Nsil gespalten, um ein DNA-Fragment von ungefähr 2 kbp zu erhalten, das eine ColE1-Ori-Region als Replikationsstartpunkt von Escherichia coli und ein Ampicillin-Resistenzgen enthält.
  • PCR wurde so durchgeführt, dass ein PCR-Kit (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) verwendet wurde, 100 pmol von jedem Primer, 2.5 Einheiten einer Taq-Polymerase, 200 μM dNTP, 1 ng pUC119-Matrizen-DNA und 100 μl Taq-Puffer (10 mM Tris-Hydrochlorid (pH 8.5), 2.5 mM Mg++, 50 mM Kaliumchlorid und 100 μg/ml Rinderserumalbumin) wurden gemischt, die Mischung wurde 30 Sekunden bei 96°C gehalten und ein Zyklus von thermischer DNA-Denaturierung (94°C, 60 s), Primer-Annealing (54°C, 60 s) und Primer-Verlängerung (70°C, 60 s) wurde dann 25-mal wiederholt. Diese Bedingung wird nachstehend als Bedingung 1 bezeichnet.
  • Das vorstehend erhaltene DNA-Fragment von ungefähr 2 kbp wurde mit einer Sse8387l-Stelle des Plasmidvektors pNY301 (JP-A 10-295376 (1998)), der einen P5-Promotor von einer HWP-Promotorregion von Brevibacillus choshinensis HPD31 enthält, und einer HWP-Signalpeptidsequenz vom natürlichen Typ als Sekretionssignalpeptid mit einer T4-DNA-Ligase unter Verwendung eines DNA-Ligationskit (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) ligiert. E. coli JM109 (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) wurde mit dieser DNA durch das CaCl2-Verfahren (Molecular Cloning 2. Aufl., A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1, 82, (1989)), transformiert, und ein Plasmid wurde aus der erhaltenen Ampicillinresistenz-Transformanten extrahiert. Das erhaltene Plasmid war ein neuer in Escherichia coli und Bakterien der Gattung Brevibacillus replizierbarer Plasmid-Pendelvektor, und wurde pNC301 genannt.
  • Der Plasmid-Pendelvektor pNC301 enthält den P5-Promotor von der HWP-Promotorregion von Brevibacillus choshinensis HPD31, das Neomycin-Resistenzgen als selektives Markergen für die Gattung Brevibacillus, die ColE1-Ori-Region als einen Replikationsstartpunkt von Escherichia coli und das Ampicillin-Resistenzgen als ein selektives Markergen für Escherichia coli. Er enthält weiter das HWP-Signalpeptid vom natürlichen Typ als Sekretionssignalpeptid (22).
  • Die Konstruktion des Plasmid-Pendelvektors pNCMO2 wird nachstehend unter Verweis auf 23 beschrieben.
  • (2) Konstruktion des Plasmids pNC
  • Die gesamte Länge von pNC301, erhalten durch Ausschließen der HWP-Promotorregion von Brevibacillus choshinensis HPD31 aus dem Plasmid-Pendelvektor pNC301 wurde durch PCR unter Bedingung 1 unter Verwendung von Primer 3 (Sequenz Nr. 8: 8) und Primer 4 (Sequenz Nr. 9: 9) amplifiziert. Das amplifizierte Fragment von ungefähr 5 kbp wurde mit BclI behandelt und der Selbstligierung mit einer T4-DNA-Ligase unterworfen. E. coli JM109 wurde mit dieser DNA durch das CaCl2-Verfahren transformiert, um das Plasmid pNC zu erhalten. Die Reaktionsbedingung der PCR war (ein Zyklus einer Denaturierungstemperatur: 94°C–60 s, eine Annealing-Temperatur: 54°C–120 s und eine DNA-Kettenverlängerungstemperatur: 70°C–180 s wurde 25-mal wiederholt).
  • (3) Konstruktion des Plasmids pGEM-TP2
  • Eine DNA-Sequenz, die einen P2-Promotor von einer HWP-Promotorregion, enthalten in Plasmid pNU210 (Udaka, S. et al., Methods In Enzymology, 217, 23–33 (1993)), codiert, wurde durch PCR unter Bedingung 1 unter Verwendung von Primer 5 (Sequenz Nr. 10: 10) und Primer 6 (Sequenz Nr. 11: 11) amplifiziert, um ein DNA-Fragment von ungefähr 140 bp zu erhalten. Da Primer 6 eine Lac-Operatorsequenz enthält, enthält dieses DNA-Fragment die Lac-Operatorsequenz an dem 3'-Terminus des P2-Promotors. Dieses Fragment wurde mit pGEM-T (hergestellt von Promega) mit einer T4-DNA-Ligase ligiert. E. coli JM109 wurde mit dieser DNA durch das CaCl2-Verfahren transformiert, und ein Plasmid wurde aus der erhaltenen Ampicillinresistenz-Transformante extrahiert, um pGEM-TP2 zu erhalten.
  • (4) Konstruktion des Plasmids pGEM-TP2+
  • Eine DNA-Sequenz, enthalten im Plasmid pNH326 (Kajino, T., et al., Appl. Environ, Microbiol., 66, 638–642 (2000)), welche die SD1- und SD2-Sequenzen einer HWP-Promotorregion von Brevibacillus choshinensis HPD31, eine modifizierte HWP-Signalsequenz vom R2L6-Typ (JP-A 7-170984 (1995)) (Sequenz Nr. 5, Sequenz Nr. 21: 5) als Sekretionssignalpeptidsequenz und eine Multicloning-Stelle enthält, wurde durch PCR unter Bedingung 1 unter Verwendung von Primer 7 (Sequenz Nr. 12: 12) und Primer 8 (Sequenz Nr. 13: 13) amplifiziert, um ein DNA-Fragment von ungefähr 270 bp zu erhalten. Das erhaltene DNA-Fragment wurde mit den Restriktionsendonucleasen NsiI und HindIII behandelt und mit einer PstI/HindIII-Stelle von pGEM-TP2 mit einer T4DNA-Ligase ligiert. E. coli JM109 wurde mit dieser DNA durch das Verfahren der kompetenten Zelle transformiert, um pGEM-TP2+ zu erhalten.
  • (5) Konstruktion des Plasmid-Pendelvektors pNCMO2
  • Weiter wurde pGEM-TP2+ mit BamHI und PstI behandelt. Das erhaltene Fragment von ungefähr 400 bp wurde in eine BcII/PstI-Stelle von pNC eingefügt, mit einer T4-DNA-Ligase ligiert, und E. coli JM109 wurde mit dieser DNA durch das CaCl2-Verfahren transformiert. Ein Plasmid wurde aus dem erhaltenen Ampicillin-resistenten Stamm extrahiert, um den neuen Plasmid-Pendelvektor pNCMO2 zu erhalten (23). Die Konstruktionsskizze des Plasmid-Pendelvektors pNCMO2 wird in den 22 und 23 gezeigt. Die Restriktionskarte des so erhaltenen neuen Plasmid-Pendelvektors pNCMO2 und die Nucleotidsequenz von seinem Teil, der einen Promotor und desgleichen enthält, wurden in 21 gezeigt. Auf die vorstehend erwähnte Weise wurde Brevibacillus choshinensis HPD31-S5 (FERM BP-6623) unter Verwendung dieses Plasmid-Pendelvektors transformiert, und die erhaltene Transformante (Brevibacillus choshinensis HPD31-S5/pNCMO2) wurde international als FERM BP-7394 hinterlegt.
  • Beispiel 2
  • Transformationseffizienz von pNCMO2 und pNC301
  • Eine Transformationseffizienz von pNCMO2 und pNC301 wird in Tabelle 1 gezeigt. Die Transformationseffizienz von beiden Vektoren zu E. coli JM109 war zufriedenstellend hoch. Die Transformationseffizienz von pNCMO2 zu Brevibacillus choshinensis HPD31-S5 war niedrig, wie mit der von pNC301 verglichen, aber hoch genug, um das konstruierte Plasmid einzufügen. Die Transformation von E. coli JM109 wurde durch das CaCl2-Verfahren (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Press, 1, 82, (1989)) durchgeführt, und die Transformation von Brevibacillus choshinensis HPD31-S5 wurde durch Elektroporation (Tagaki, H. et al., Agric. Biol. Chem., 53, 3099–3100 (1989)) durchgeführt. Die Elektroporation wurde unter Bedingungen von 1.5 kV, 1000 Ω, 25 μF und 1.8 ms unter Verwendung von Gene Pulser (hergestellt von BioRad) durchgeführt.
  • (Tabelle 1) Transformationseffizienz von pNCMO2 und pNC301
    Figure 00150001
  • Beispiel 3
  • Vergleich der BLA-Herstellung zwischen dem Plasmid-Pendelvektor pNCMO2 und dem Plasmid-Pendelvektor pNC301
  • (1) Konstruktion der rekombinanten Genexpressionsplasmide pNCMO2BLA und pNC301 BLA
  • Ein α-Amylase-(BLA)Gen von Bacillus licheniformis wurde durch PCR mit pHY4631 (Yamagata, H. et al., J. of Biotechnol, 169, 1239–1245 (1987)) als Matrize unter Verwendung von Primer 9 (Sequenz Nr. 14: 14) und Primery 10 (Sequenz Nr. 15: 15) amplifiziert. Das erhaltene PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsendonucleasen PstI und HindIII verdaut, um ein BLA-Gen-enthaltendes DNA-Fragment von ungefähr 1.5 kb zu erhalten. Die in Beispiel 1 konstruierten Plasmidvektoren pNCMO2 und pNC301 wurden mit den Restriktionsendonucleasen PstI und HindIII verdaut, und das das vorstehend erhaltene BLA-Gen-enthaltende Fragment wurde dazu mit einer T4DNA-Ligase ligiert, um die Plasmidvektoren pNCMO2BLA und pNC310BLA zu erhalten (24). Weiter wurde E. coli JM109 durch das CaCl2-Verfahren unter Verwendung der Plasmidvektoren pNCMO2BLA und pNC301 BLA transformiert, um die Transformanten E. coli JM109/pNCMO2BLA und E. coli JM109/pNC301 BLA zu erhalten, die jeweils die Plasmidvektoren pNCMO2BLA und pNC301 BLA tragen.
  • Weiter war es auch möglich als BLA-Gen ein DNA-Fragment, gespalten aus einem BLA-Gen-enthaltenden Plasmid, zum Beispiel pHT110BLA (Patent Nr. 2727391), zu verwenden.
  • (2) BLA-Herstellung mit E. coli JM109/pNCMO2BLA und E. coli JM109/pNC301 BLA
  • Jede der Transformanten wurde in eine 1.5 ml Portion von 2×YT-Medium geimpft und über Nacht bei 37°C unter Schütteln inkubuiert. Diese Kulturlösung wurde mit einem Sonicator für 30 Sekunden behandelt, um die Zellen aufzubrechen, und die Amylase-Aktivität in der behandelten Lösung wurde durch das Verfahren von Saito (Arch. Biochem. Biophys., 155, 290 (1973)) unter Verwendung einer löslichen Stärke als Substrat gemessen (25). E. coli JM109/pNCMO2BLA produzierte Amylase in einer Menge, die ungefähr 1/70 im Vergleich zu E. coli JM109/pNC301 BLA war, und die Genexpression in Escherichia coli wurde effizient unterdrückt.
  • Weiter wurden E. coli JM109/pNCMO2BLA und E. coli JM109/pNC301 BLA auf einem LA-Agarmedium, das 3% Stärke enthielt, geimpft und über Nacht bei 37°C inkubiert, um Kolonien zu bilden, und die Bildung eines Hofs und das Wachstum davon wurden verglichen (26: Foto an Stelle einer Abbildung). Als Ergebnis war E. coli JM109/pNCMO2BLA kleiner an Größe des Hofs um die Kolonie als E. coli JM109/pNC301 BLA, und die BLA-Expression wurde daher unterdrückt. Außerdem wurde aus der Größe der gewachsenen Kolonie gefunden, dass sich E. coli JM109/pNCMO2BLA schneller vermehrte. Der Grund ist wahrscheinlich, dass die BLA-Expression bei guter Effizienz in E. coli JM109/pNCMO2BLA unterdrückt wurde und der auf dem Stamm ausgeübte Stress daher reduziert wurde, um die Amplifikation zu verbessern.
  • Wenn E. coli JM109/pNCMO2BLA auf einem Agarmedium, das 1 mM IPTG enthielt, inkubiert wurde, war die Größe des gebildeten Hofs fast die gleiche wie die des mit dem gleichen Stamm, der auf einem IPTG-freien Agarmedium inkubiert wurde, gebildeten Hofs (27: Foto an Stelle einer Abbildung). In Bezug auf die Expressions-unterdrückende Wirkung in Escherichia coli, bereitgestellt durch pNCMO2, unterdrückt, ist der Grund wahrscheinlich, dass zusätzlich zur unterdrückenden Wirkung durch Einfügen des Lac-Operators die P2-Promotor-Aktivität in Escherichia coli ziemlich niedrig ist, verglichen mit der P5-Promotor-Aktivität.
  • (3) BLA-Herstellung mit Brevibacillus choshinensis HPD31-S5/pNCMO2BLA und Brevibacillus choshinensis HPD31-S5/pNC301 BLA
  • Brevibacillus choshinensis HPD31-S5 wurde durch Elektroporation mit den Plasmidvektoren pNCMO2BLA und pNC301 BLA, jeweils in (1) erhalten, transformiert, um die Transformanten Brevibacillus choshinensis HPD31-S5/pNCMO2BLA und Brevibacillus choshinensis HPD31-S5/pNC301 BLA zu erhalten, die jeweils die Plasmidvektoren pNCMO2BLA und pNC301 BLA tragen ( 24). Die Elektroporation wurde unter Bedingungen von 1.5 kV, 1,000 Ω, 25 μF und 1.8 ms unter Verwendung von Gene Pulser (hergestellt von BioRad) durchgeführt. Jede der Transformanten wurde in ein Teströhrchen, das 1.5 ml TMN-Medium enthielt, geimpft und bei 30°C für 2 Tage unter Schütteln inkubiert. Diese Kulturlösung wurde zentrifugiert und die Amylase-Aktivität des Kulturüberstands wurde durch das Verfahren von Saito (Arch. Biochem. Biophys., 155, 290 (1973)) unter Verwendung einer löslichen Stärke als Substrat gemessen (28). Brevibacillus choshinensis HPD31-S5/pNCMO2BLA produzierte Amylase in einer Menge, die ungefähr 22-mal so groß wie Brevibacillus choshinensis HPD31-S5/pNC301 BLA war. Infolgedessen wurde gezeigt, dass pNCMO2 ein Gen in Bakterien der Gattung Brevibacillus weit effizienter als pNC301 exprimieren kann.
  • Beispiel 4
  • Konstruktion des rekombinanten Genexpressionsplasmids pNY326CT
  • (1) Erlangung des CTA-Gens und des CTB-Gens
  • Ein Gen der Choleratoxin (CT)-Untereinheit A (CTA) (0.7 bp) wurde durch PCR mit einer chromosomalen DNA von Vibrio cholerae (Mekalanos, J. et al., Nature, 306, 551–557 (1983)) als Matrize unter Verwendung von zwei synthetischen Primern, Primer 11 (Sequenz Nr. 16: 16) und Primer 12 (Sequenz Nr. 17: 17) amplifiziert. Auf ähnliche Weise wurde ein Gen von CT-Untereinheit B (CTB) (0.3 bp) unter Verwendung von zwei Primern, Primer 13 (Sequenz Nr. 18: 18) und Primer 14 (Sequenz Nr. 19: 19) amplifiziert.
  • (2) Plasmid pT7BlueCTA und Plasmid pT7BlueCTB
  • Das Plasmid pT7Blue (hergestellt von Novagen) und das vorstehend erhaltene CTA-Gen oder CTB-Gen wurden mit einer T4-Ligase ligiert, um das Plasmid pT7BlueCTA, welches das CTA-Gen trägt, oder das Plasmid pT7BlueCTB, welches das CTB-Gen trägt, zu erhalten.
  • (3) Konstruktion des Plasmids pNY326CTA
  • Das Plasmid pNY326 [Plasmid, erhalten durch Umwandeln des Signalpeptids von pNY301 (JP-A 10-295378 (1988)) zu einem R2L6-Typ (Sequenz Nrn. 5, 21: 5)] wurde mit NcoI und HindIII behandelt, um ein Fragment von 3.6 kbp zu erhalten. Weiter wurde pT7BlueCTA mit NcoI und HindIII behandelt, um ein CTA-Gen-enthaltendes DNA-Fragment von 0.7 kbp zu erhalten. Dieses DNA-Fragment wurde mit dem vorstehend erhaltenen Genfragment von 3.6 kbp mit einer T4-DNA-Ligase ligiert. Brevibacillus choshinensis HPD31-S5 wurde durch Elektroporation unter Verwendung der ligierten DNA transformiert. Aus dem erhaltenen Neomycin-resistenten Stamm wurde ein Plasmid extrahiert, um pNY326CTA zu erhalten, welches das CTA-Gen trägt.
  • (4) Konstruktion des Plasmids pNY326CTB
  • Auf ähnliche Weise wurde pNY326 mit NcoI und BamHI behandelt, um ein DNA-Fragment von 3.6 kbp zu erhalten. Weiter wurde pT7BlueCTB mit NcoI und BamHI behandelt, um ein CTB-Gen enthaltendes DNA-Fragment von 0.3 kbp zu erhalten. Dieses DNA-Fragment wurde mit dem vorstehend DNA-Fragment von 3.6 kbp mit einer T4-DNA-Ligase ligiert. Brevibacillus choshinensis HPD31-S5 wurde unter Verwendung der ligierten DNA transformiert, um einen Stamm mit einer Neomycin-Resistenz auszuwählen. Aus dem ausgewählten Stamm wurde ein Plasmid extrahiert, um das Plasmid pNY326 CTB zu erhalten, welches das CTB-Gen trägt.
  • (5) Untersuchung der Transformation von Brevibacillus choshinensis HPD31-S5 mit pNY326CT
  • pNY326CTB wurde mit BamHI und HindIII behandelt, um ein DNA-Fragment von 4.7 kbp zu erhalten. Weiter wurde ein CTA-Gen in der Form, die eine SD2-Sequenz (SD-CTA-Gen (0,8 kbp)) enthält, durch PCR mit pNY326CTA als Matrize unter Verwendung von zwei Primern, Primer 15 (Sequenz Nr. 20: 20) und Primer 11 (Sequenz Nr. 16: 16) amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit BamHI und HindIII behandelt, um ein Fragment von 0.4 kbp zu erhalten. Dieses Fragment wurde mit einer T4-DNA-Ligase an das vorstehend erhaltene DNA-Fragment von 4.7 kbp aus pNY326CTB ligiert. Brevibacillus choshinensis HPD31-S5 wurde durch Elektroporation unter Verwendung der ligierten DNA transformiert, und die Transformante wurde auf einem 50 μg/ml Neomycin enthaltenden TM-Agarmedium (1 % Pepton, 0.2% Hefeextrakt, 0.5% Fleischextrakt, 1 % Glucose, 0.001 % FeSO4·7H2O, 0.001% MnSO4·4H2O, 0.0001% ZnSO4·7H2O, 1,5% Agar, pH 7.0) angestrichen, um zu versuchen, einen Stamm mit einer Neomycin-Resistenz auszuwählen. Jedoch wurde der resistente Stamm nicht erhalten. Die Elektroporation wurde unter Bedingungen von 1.5 kV, 1,000 Ω, 25 μF und 1.8 ms unter Verwendung von Gene Pulser (hergestellt von BioRad) durchgeführt.
  • Beispiel 5
  • Konstruktion des rekombinanten Genexpressionsplasmids pNCMO2CT
  • (1) Konstruktion des Plasmids pNCMO2CTB
  • pNCMO2 wurde mit NcoI und BamHI behandelt, um ein Fragment von 5.2 kbp zu erhalten. Weiter wurde pT7BlueCTB mit NcoI und BamHI behandelt, um ein CTB-Gen enthaltendes DNA-Fragment von 0.3 kbp zu erhalten. Dieses DNA-Fragment wurde mit einer T4-DNA-Ligase mit dem vorstehend erhaltenen Genfragment von 5.2 kbp ligiert (29). E. coli JM109 wurde mit dieser ligierten DNA transformiert, und ein Plasmid wurde extrahiert, um pNCMO2CTB zu erhalten, welches das CTB-Gen trägt.
  • (2) Konstruktion des Plasmids pNCMO2CT
  • CTB von pNCMO2 wurde mit BamHI und HindIII behandelt, um ein Fragment von 5.5 kbp zu erhalten. Das SD-CTA-Gen (0.8 kbp), das in Beispiel 4 (5) erhalten wurde, wurde mit BamHI und HindIII behandelt, um ein Fragment von 0.8 kbp zugewinnen. Dieses Fragment wurde mit dem vorstehend erhaltenen Genfragment von 5.5 kbp mit einer T4-DNA-Ligase (29) ligiert. E. coli JM109 wurde mit der ligierten DNA transformiert, um einen Stamm mit einer Ampicillin-Resistenz auszuwählen. Aus dem ausgewählten Stamm wurde ein Plasmid extrahiert, um drei Stämme des Plasmids pNCMO2CT, welches das CTB-Gen trägt, zu erhalten. Als Ergebnis der Sequenzierung wurde gefunden, dass bei allen Stämmen das CTB-Gen korrekt mit dem Plasmid ligiert wurde. Die hier erhaltenen Stämme wurden E. coli JM109/pNCMO2CT genannt. Brevibacillus choshinensis HPD31-S5 wurde mit pNCMO2CT, das aus E. coli JM109/pNCMO2CT extrahiert wurde, durch Elektroporation transformiert. Infolgedessen wurde eine große Anzahl von Transformanten, die das gleiche Plasmid tragen, erhalten. Die erhaltenen Stämme wurden Brevibacillus choshinensis HPD31-S5/pNCMO2CT genannt. Die Elektroporation wurde unter Bedingungen von 1.5 kV, 1,000 Ω, 25 μF und 1.8 ms unter Verwendung von Gene Pulser (hergestellt von BioRad) durchgeführt.
  • (3) Expression von CT mit Brevibacillus choshinensis HPD31-S5/pNCMO2CT
  • Brevibacillus choshinensis HPD31-S5/pNCMO2CT wurde in 3 ml eines 50 μg/ml Neomycin-enthaltenden flüssigen TM-Mediums bei 30°C für 2 Tage unter Verwendung eines Teströhrchens mittlerer Größe unter Schütteln gezüchtet, und der Kulturüberstand wurde einer SDS-PAGE unterworfen. Die Analyse wurde durch Coomassie Brilliant Blue-Färbung und durch Western-Blotting mit einem polyclonalen Kaninchen-CT-Antikörper ausgeführt. Die bestimmten Molekulargewichte von CTA und CTB waren jeweils 28 kDa und 12 kDa, und zeigten jeweils gefärbte Banden bei Positionen der entsprechenden Molekulargewichte. Aus der Farbtiefe der Banden wurde jeweils die sekretorische Produktionsmenge von CTA bei 70 mg/l und die sekretorische Produktionsmenge von CTB bei 30 mg/l bestimmt. Seine SDS-PAGE-Elektrophoresemuster wird auf einem Foto an Stelle einer Abbildung gezeigt ( 30). Weiter wurde die Bande zu einer Stelle von ungefähr 90 kDa verschoben, wenn der Kulturüberstand unter Verwendung eines Galactoseharzes, das spezifisch CT bindet (Microbial Pathogenesis, 16, 71–79 (1994)), aufgereinigt wurde und die aufgereinigte Fraktion, ohne wärmebehandelt zu werden, dann der Elektrophorese unterworfen wurde. Aufgrund dieser Tatsache wurde vermutet, dass die exprimierte Untereinheit eine 1A5B-Struktur einnahm.
  • Wirkungen der Erfindung
  • Gemäß der Erfindung wird ein Plasmid-Pendelvektor zwischen Escherichia coli und Brevibacillus choshinensis bereitgestellt. Weiter unterdrückt der Plasmid-Pendelvektor der Erfindung die Genexpression in Escherichia coli, und kann die effiziente Genexpression in Brevibacillus choshinensis ermöglichen wie in den Ergebnissen der Expression des BLA-Gens in Beispiel 3 gezeigt. Wie durch die Expression von CT in den Beispielen 4 und 5 gezeigt, ist der Plasmid-Pendelvektor pNCMO2 in der Erfindung besonders brauchbar zur Konstruktion des rekombinanten Genexpressionsplasmids, das komplexe Genkonstruktion benötigt, und zur Proteinherstellung mit der Transformanten, die mit dem rekombinanten Genexpressionsplasmid transformiert wurde.
  • Beschreibung von Mikroorganismen, die unter Regel 13-2 hinterlegt sind
    • 1. Brevibacillus choshinensis HPD31-S5/pNCMO2 a. Name und Adresse einer Hinterlegungsstelle, bei der dieser Mikroorganismus hinterlegt wurde Name: International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Adresse: AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higatshi, Tsukuba Ibaraki, 305–8566, Japan b. Datum, an dem der Mikroorganismus in der Hinterlegungsstelle von a hinterlegt wurde 12. Dezember 2000 c. Hinterlegungsnummer, welche die Hinterlegungsstelle von a der Hinterlegung zuteilte FERM BP-7394
    • 2. Brevibacillus choshinensis HPD31 (FERM BP-1087) a. Name und Adresse einer Hinterlegungsstelle, bei der dieser Mikroorganismus hinterlegt wurde Name: International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Adresse: AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higatshi, Tsukuba Ibaraki, 305–8566, Japan b. Datum, an dem der Mikroorganismus in der Hinterlegungsstelle von a hinterlegt wurde 31. August 1999 c. Hinterlegungsnummer, welche die Hinterlegungsstelle von a der Hinterlegung zuteilte FERM BP-6863
    SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00240001
    Figure 00250001
    Figure 00260001
    Figure 00270001
    SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00280001
    Figure 00290001
    Figure 00300001
    Figure 00310001
    Figure 00320001

Claims (11)

  1. Plasmid-Pendelvektor (shuttle vector), dadurch gekennzeichnet, dass er sowohl in Brevibacillus choshinensis als auch in Escherichia coli replizierbar ist und dass er einen Promotor umfasst, der in der Lage ist, in Brevibacillus choshinensis zu funktionieren, und (eine) DNA Sequenz(en), die in der Lage ist/sind, als selektiver) Marker für Escherichia coli und Brevibacillus choshinensis zu funktionieren.
  2. Plasmid-Pendelvektor, replizierbar sowohl in Escherichia coli als auch in Brevibacillus choshinensis, dadurch gekennzeichnet, dass er umfasst (a) einen Promotor, der in der Lage ist, in Brevibacillus choshinensis zu funktionieren, eine SD-Sequenz und eine Sekretionssignalsequenz, (b) ein Rep-Proteingen und eine DNA-Sequenz, die einen Replikationsursprung codiert, die in der Lage sind, in Brevibacillus choshinensis zu funktionieren, (c) eine DNA-Sequenz, die in der Lage ist, als selektiver Marker für Brevibacillus choshinensis zu funtionieren, (d) eine DNA-Sequenz, die einen Replikationsursprung codiert, der in der Lage ist, in Escherichia coli zu funktionieren, und (e) eine DNA-Sequenz, die in der Lage ist, als selektiver Marker für Escherichia coli zu funktionieren.
  3. Plasmid-Pendelvektor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor, der in der Lage ist, in Brevibacillus choshinensis zu funktionieren, wie in Anspruch 1 oder 2 definiert, ein P2-Promotor ist, den ein HWP-Promotor von Brevibacillus choshinensis einschließt, und dessen Nucleotidsequenz in Sequenz Nr. 1 dargestellt ist.
  4. Plasmid-Pendelvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass er des weiteren eine DNA-Sequenz umfasst, die eine Funktion des Unterdrückens der Expression eines rekombinanten Proteins in Escherichia coli hat.
  5. Plasmid-Pendelvektor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz, die die Funktion des Unterdrückens der Expression eines rekombinanten Protein in Escherichia coli wie in Anspruch 4 definiert hat, eine Lac-Operatorsequenz von Escherichia coli ist, und deren Nucleotidsequenz in Sequenz Nr. 2 dargestellt ist.
  6. Plasmid-Pendelvektor pNCMO2 wie in 21 dargestellt.
  7. Brevibacillus choshinensis HPD31-S5/pNCMO2-Stamm, enthaltend Plasmid-Pendelvektor pNCMO2 nach Anspruch 6 und hinterlegt unter der internationalen Hinterlegungsnummer FERM BP-7394.
  8. Brevibacillus choshinensis, transformiert mit einem rekombinanten Plasmid, erhalten durch Einfügen einer DNA-Sequenz eines Gens, das ein Protein codiert, in den Plasmid-Pendelvektor wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert.
  9. Transformante, erhalten durch Transformieren von Brevibacillus choshinensis HPD31-S5, wie hinterlegt unter der internationalen Hinterlegungsnummer FERM BP-6623, mit einem rekombinanten Plasmid, erhalten durch Einfügen einer DNA-Sequenz, die ein Protein codiert, in den Plasmid-Pendelvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
  10. Transformationsverfahren, gekennzeichnet durch das Transformieren von Escherichia coli mit einem rekombinanten Plasmid, erhalten durch Einfügen einer DNA-Sequenz eines Gens, das ein Protein codiert, in den Plasmid-Pendelvektor wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert, das Extrahieren eines Plasmids aus der erhaltenen Transformante und das Transformieren von Brevibacillus choshinensis unter Verwendung des extrahierten Plasmids.
  11. Verfahren zum Herstellen eines Proteins, gekennzeichnet durch das Züchten von Brevibacillus choshinensis, der mit einem rekombinanten Plasmid transformiert ist, wobei das rekombinante Plasmid durch Einfügen einer DNA-Sequenz eines Gens, das ein Protein codiert, in den Plasmid-Pendelvektor wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert erhalten wurde, und das Sammeln des abgesonderten und in der Kulturlösung angesammelten Zielproteins.
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AU (1) AU2002232155B2 (de)
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DE (1) DE60219604T2 (de)
DK (1) DK1369486T3 (de)
WO (1) WO2002064800A1 (de)

Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2251425B1 (de) 2004-07-06 2016-04-20 Kaneka Corporation Verfahren zur Herstellung eines Protein-A-ähnlichen Proteins unter Verwendung eines Bakteriums der Gattung Brevibacillus
JP2010172206A (ja) * 2009-01-27 2010-08-12 Iwate Prefecture セルロース分解を促進するタンパク質及びその利用とその生産方法
CN102365361B (zh) 2009-03-24 2015-09-02 株式会社钟化 对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质和免疫球蛋白结合性亲和配体
KR101893225B1 (ko) 2010-03-24 2018-08-29 가부시키가이샤 가네카 면역 글로불린에 특이적으로 결합하는 단백질 및 면역 글로불린 결합성의 친화성 리간드
WO2012133349A1 (ja) 2011-03-25 2012-10-04 株式会社カネカ アフィニティー分離マトリックス用タンパク質
KR20140007394A (ko) 2011-03-25 2014-01-17 가부시키가이샤 가네카 면역 글로불린 결합성 신규 폴리펩티드
WO2014046278A1 (ja) 2012-09-21 2014-03-27 株式会社カネカ アフィニティー分離マトリックス用タンパク質リガンド
US20160215026A1 (en) 2013-09-06 2016-07-28 Kaneka Corporation Dissociation capacity-boosted ligand for affinity dissociation matrix
KR101548480B1 (ko) 2015-02-11 2015-08-31 지에스칼텍스 주식회사 혼합당 동시발효능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 생산 방법
WO2017110922A1 (ja) 2015-12-25 2017-06-29 Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 高分子凝集体の製造方法
MY190347A (en) 2016-08-10 2022-04-15 Spiber Inc Production method for insoluble recombinant protein aggregate
WO2018043698A1 (ja) 2016-09-02 2018-03-08 Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 モールド成形体及びモールド成形体の製造方法
EP3521299A4 (de) 2016-10-03 2020-06-24 Spiber Inc. Verfahren zur aufreinigung rekombinanter proteine
WO2018101358A1 (ja) 2016-11-29 2018-06-07 Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 タンパク質組成物、その製造方法及び熱安定性向上方法
JPWO2018116979A1 (ja) 2016-12-20 2019-10-24 Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 繊維強化樹脂材および積層体
JPWO2018159695A1 (ja) 2017-02-28 2019-12-26 学校法人慶應義塾 微生物増殖抑制剤、微生物の増殖を抑制する方法、耐紫外線性向上剤、耐紫外線性を向上させる方法、人工タンパク質成形体及びその製造方法、人工タンパク質溶液、並びに、着色剤
JP6337252B1 (ja) 2017-03-10 2018-06-06 Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 高収縮人造フィブロイン繊維及びその製造方法、並びに人造フィブロイン繊維の収縮方法
EP3594384A4 (de) 2017-03-10 2020-12-09 Spiber Inc. Verfahren und vorrichtung zur herstellung von proteinfasern
US20200165311A1 (en) 2017-05-10 2020-05-28 Spiber Inc. Polypeptide Solution, Production Method for Polypeptide Fiber, and Artificial Polypeptide
CN110869446A (zh) 2017-06-02 2020-03-06 独立行政法人国立高等专门学校机构 蛋白质成形体及其制造方法、蛋白质溶液、以及蛋白质成形体用增塑剂
EP3650216A1 (de) 2017-07-04 2020-05-13 Spiber Inc. Verbundmaterial und verbundmaterialherstellungsverfahren
WO2019022163A1 (ja) 2017-07-26 2019-01-31 Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 改変フィブロイン
WO2019044982A1 (ja) 2017-08-30 2019-03-07 Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 高密度編地及び高密度編地の製造方法
CN111655913A (zh) 2018-01-31 2020-09-11 丝芭博株式会社 蛋白质纤维的制造方法
WO2019151436A1 (ja) 2018-01-31 2019-08-08 Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 タンパク質捲縮ステープルの製造方法
JP7453138B2 (ja) 2018-03-22 2024-03-19 株式会社島精機製作所 タンパク質繊維のクリンプ方法、タンパク質繊維の製造方法、タンパク質繊維、紡績糸、及びテキスタイル製品
WO2019194243A1 (ja) 2018-04-03 2019-10-10 Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 複合繊維及びその製造方法
JP7340263B2 (ja) 2018-04-03 2023-09-07 Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 高収縮人造フィブロイン撚糸及びその製造方法、並びに人造フィブロイン撚糸及びその収縮方法
CN112074631A (zh) 2018-04-03 2020-12-11 长谷虎纺绩株式会社 混纺纱以及该混纺纱的织物和该织物的制造方法
JP7340262B2 (ja) 2018-04-03 2023-09-07 Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 高収縮人造フィブロイン紡績糸及びその製造方法、並びに人造フィブロイン紡績糸及びその収縮方法
EP3778781A4 (de) 2018-04-03 2022-01-05 Spiber Inc. Formartikel und verfahren zur herstellung davon
JP7452861B2 (ja) 2018-04-03 2024-03-19 Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 高密度織物及びその製造方法
JP7323894B2 (ja) 2018-07-06 2023-08-09 株式会社ブリヂストン 軟質ポリウレタンフォーム、自動車用シートパッド、及び軟質ポリウレタンフォームの製造方法
US20210214404A1 (en) 2018-07-25 2021-07-15 Spiber Inc. Artificial Hair Fiber, Method for Manufacturing Same, and Artificial Hair
EP3859056A4 (de) 2018-09-28 2022-08-03 Spiber Inc. Verfahren zur herstellung von proteinfasern
JP7466872B2 (ja) 2018-09-28 2024-04-15 株式会社島精機製作所 タンパク質紡績糸の製造方法
WO2020067547A1 (ja) 2018-09-28 2020-04-02 Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 改変フィブロイン繊維
WO2020145363A1 (ja) 2019-01-09 2020-07-16 Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 改変フィブロイン
EP3919658A4 (de) 2019-01-31 2023-06-07 Aderans Company Limited Faser für kunsthaare, kunsthaar, verfahren zur herstellung von fasern für kunsthaare und verfahren zur herstellung von kunsthaar
BR112021014805A2 (pt) 2019-01-31 2022-01-04 Spiber Inc Métodos de produção para uma proteína recombinante e para aumentar o volume de produção
EP3922763A4 (de) 2019-02-07 2023-03-15 Spiber Inc. Verfahren zur herstellung von künstlich strukturierten proteinfasern
JPWO2020162626A1 (ja) 2019-02-07 2021-12-16 Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 組み換え構造タンパク質マルチフィラメント及びその製造方法
WO2021065794A1 (ja) 2019-09-30 2021-04-08 Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 タンパク質成形体の製造方法
CN114430771A (zh) 2019-09-30 2022-05-03 丝芭博株式会社 蛋白质粘合剂、接合体及其制备方法
CN114555108A (zh) 2019-09-30 2022-05-27 丝芭博株式会社 肌肉组织再生剂
JPWO2021125298A1 (de) 2019-12-19 2021-06-24
KR20220155328A (ko) 2020-03-16 2022-11-22 스파이버 가부시키가이샤 합성 고분자 및 그의 제조 방법, 성형 재료, 그리고, 성형체
WO2023038153A1 (ja) 2021-09-13 2023-03-16 Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 消臭材、消臭性付与剤並びに消臭性の付与方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2538200B2 (ja) 1985-10-09 1996-09-25 ア−ス製薬株式会社 ポリペプチド分泌発現ベクタ―及び形質転換微生物
JPH07108224B2 (ja) 1985-11-07 1995-11-22 重三 鵜高 バチルス・ブレビスを用いる遺伝子の発現方法
JPS63198986A (ja) 1987-02-16 1988-08-17 Mitsubishi Kasei Corp シヤトルベクタ−
JPH0754195B2 (ja) 1987-08-31 1995-06-07 株式会社東芝 ブライン利用空気調和機
EP0326046A3 (de) 1988-01-25 1990-06-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Herstellung von menschlichem Epidermal-Wachstumsfaktor
JPH02135091A (ja) 1988-11-16 1990-05-23 Yakult Honsha Co Ltd 複合シャトルベクター
DK0410498T3 (da) 1989-06-29 1999-03-22 Genencor Int Mutante mikrobielle alfa-amylaser med øget termisk, syre og/eller alkalisk stabilitet
JP3012026B2 (ja) 1991-03-05 2000-02-21 ヒゲタ醤油株式会社 高発現ベクター及び該高発現ベクター を保有する微生物並びに該微生物を 用いる有用物質の製造法
JP3433807B2 (ja) 1992-03-31 2003-08-04 鵜高 重三 新規アミノ酸配列及び該アミノ酸配列をコードするｄｎａを保有する発現ベクターを組み込んだバチルス・ブレビスを用いる有用物質の製造法
JP2727391B2 (ja) 1992-07-23 1998-03-11 ヒゲタ醤油株式会社 高発現ベクター及び該高発現ベクターを保有する微生物並びに該微生物を用いる有用物質の製造法
JP3696322B2 (ja) 1996-02-19 2005-09-14 ヒゲタ醤油株式会社 新規ｈｓ遺伝子及び該遺伝子を異種遺伝子産物をコードする構造遺伝子の下流に連結した発現プラスミド並びに該発現プラスミドを保有する形質転換体を用いた異種遺伝子産物の製造法
JP3734593B2 (ja) 1997-04-25 2006-01-11 ヒゲタ醤油株式会社 新規発現プラスミドベクター及び該発現プラスミドベクターを保有するバチルス属細菌を用いた異種遺伝子産物の製造法

Also Published As

Publication number Publication date
AU2002232155B2 (en) 2006-07-06
US7332331B2 (en) 2008-02-19
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EP1369486A4 (de) 2004-12-29
KR100857748B1 (ko) 2008-09-09
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CA2438118C (en) 2010-08-24
DE60219604D1 (de) 2007-05-31
US20040072328A1 (en) 2004-04-15
WO2002064800A1 (fr) 2002-08-22
EP1369486B1 (de) 2007-04-18
EP1369486A1 (de) 2003-12-10
KR20030074735A (ko) 2003-09-19
JP3753945B2 (ja) 2006-03-08
JP2002238569A (ja) 2002-08-27
ATE360080T1 (de) 2007-05-15

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