KR20220155328A - 합성 고분자 및 그의 제조 방법, 성형 재료, 그리고, 성형체 - Google Patents
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Abstract
본 개시의 일 측면은, 폴리펩티드 골격을 포함하는 제1 세그먼트와, 상기 제1 세그먼트에 직접 결합하는 하나 또는 복수의 제2 세그먼트를 갖고, 상기 제2 세그먼트가 상기 폴리펩티드 골격에 대한 가소화 기능을 갖는 분자단을 포함하는 합성 고분자를 제공한다.
Description
본 개시는, 합성 고분자 및 그의 제조 방법, 성형 재료, 그리고, 성형체에 관한 것이다.
견사 피브로인 및 거미줄 피브로인과 같은 구조 단백질은, 우수한 견뢰성을 발휘할 수 있는 점에서, 합성 수지 등으로 구성되는 구조 재료의 대체 물질로서 주목받고 있다. 최근에 있어서는, 재조합 기술의 발전에 따라 전술한 바와 같은 구조 단백질을 모방한 재조합 구조 단백질의 양산 기술의 개발이 진행되고 있다(예를 들면, 특허문헌 1).
단백질은 주쇄에는 아미드기, 측쇄에는 카르복시기, 아미노기, 수산기, 티올기와 같은 극성기를 많이 갖는 점에서, 분자간에 있어서 다수의 수소 결합이 형성된다. 이 때문에, 구조 단백질을 가열 가압 성형함으로써 얻어지는 성형체는 기계적인 강도가 우수하다고 생각되지만, 충격 등을 받음으로써, 금, 균열이 발생하는 등 깨지기 쉬운 측면도 갖고 있다. 전술한 바와 같은 사정이, 단백질을 일반적인 범용 플라스틱의 대체품으로서 사용하는 장해로 되어 있다.
구조 단백질을 사용하여 성형체를 형성함에 있어서, 범용 플라스틱과 같이 가소제를 첨가함으로써 성형체의 유연성을 향상시키는 것도 생각된다. 그러나, 가소제는 일반적으로 소수성이며, 전술한 바와 같은 극성기를 많이 갖는 단백질과의 상용성이 낮다. 본 발명자의 검토에 의하면, 구조 단백질에 가소제를 혼합하여 성형체를 형성한 경우, 구조 단백질과 가소제의 사이에서 상분리가 발생하여, 기대하는 바와 같은 효과를 얻어지지 않는 것이 판명되고 있다. 또한, 단백질이나 구조 단백질을 사용한 필름이나 섬유 등의 가열 가압 성형 이외의 성형 수법으로 제조되는 단백질 성형체에 있어서도 높은 유연성을 갖는 것이 요망된다.
본 개시는, 펩티드 골격을 갖는 고분자 재료로서, 유연성이 우수한 성형체를 제조 가능한 합성 고분자 및 그의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 개시는 또한, 전술한 합성 고분자를 함유하는 성형 재료 및 성형체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 개시의 일 측면은, 폴리펩티드 골격을 포함하는 제1 세그먼트와, 상기 제1 세그먼트에 직접 결합하는 하나 또는 복수의 제2 세그먼트를 갖고, 상기 제2 세그먼트가 상기 폴리펩티드 골격에 대한 가소화 기능을 갖는 분자단을 포함하는, 합성 고분자를 제공한다.
상기 합성 고분자는, 제2 세그먼트를 갖는 점에서, 단백질과 마찬가지로 폴리펩티드 골격을 가지면서, 합성 고분자 전체로서, 유연성이 우수한 재료로 되어 있다. 또한, 상기 합성 고분자는, 제1 세그먼트와 제2 세그먼트가 직접 결합하고 있기 때문에, 단백질에 가소제를 단순히 혼합하는 경우와 같은 거시적인 상분리의 발생이 저감되어 있다. 이 때문에, 유연성이 우수한 성형체를 제조 가능하다.
상기 폴리펩티드 골격은 소수성 폴리펩티드 골격이라도 좋다. 당해 소수성 폴리펩티드 골격의 평균 하이드로퍼시·인덱스(소수성도: 소수성 지표)가 0.22 이상이라도 좋다. 폴리펩티드 골격이 전술한 바와 같은 소수성 폴리펩티드 골격임으로써, 가소화 기능을 갖는 분자단의 제1 세그먼트와의 친화성이 향상되어, 보다 유연성이 우수한 성형체를 제조할 수 있다.
상기 제2 세그먼트의 분자량이, 상기 제1 세그먼트의 분자량을 100이라고 했을 때에 1∼70의 범위 내의 값이라도 좋다. 이에 따라, 합성 고분자를 사용하여 얻어지는 성형체에 있어서, 제1 세그먼트의 특성(예를 들면, 높은 기계적 강도)을 유지하면서, 성형체 전체의 유연성을 유리하게 높일 수 있다.
상기 제2 세그먼트가, 폴리에테르, 폴리에스테르, 폴리카보네이트, 폴리아미드, 폴리올, 폴리올레핀, 폴리아세탈, 폴리케탈, 폴리(메타)아크릴레이트, 실리콘, 폴리우레탄, 폴리알킬렌이민, 페놀 수지, 우레아 수지, 멜라민 수지, 및 다당류로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종에 유래하는 골격을 포함해도 좋다.
상기 제2 세그먼트가, 폴리에테르기, 폴리에스테르기, 폴리카보네이트기, 폴리아미드기, 폴리올기, 및, 수식 다당기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종을 포함해도 좋다.
상기 제1 세그먼트를 복수 갖고, 상기 제2 세그먼트의 일부가 2 이상의 상기 제1 세그먼트와 결합하여 네트워크 구조를 형성하고 있어도 좋다. 네트워크 구조를 가짐으로써, 예를 들면, 상기 합성 고분자로 구성되는 성형체는 큰 신도를 발휘할 수 있다. 또한 네트워크 구조를 가짐으로써, 예를 들면, 상기 합성 고분자로 구성되는 성형체에 탄성체로서의 기능을 부여할 수 있다.
상기 제1 세그먼트를 복수 갖고, 상기 제1 세그먼트와 제2 세그먼트가 교대로 결합하고 있어도 좋다. 제1 세그먼트와 제2 세그먼트가 교대로 결합함으로써, 예를 들면, 상기 합성 고분자로 구성되는 성형체는 큰 신도를 발휘할 수 있다.
상기 제2 세그먼트가 복수의 상기 분자단을 포함하고, 복수의 상기 분자단이 서로 연결하고 있어도 좋다. 제2 세그먼트의 설계의 폭을 보다 넓힐 수 있어, 합성 고분자의 유연성을 보다 용이하게 조정할 수 있다.
제2 세그먼트가 링커(반응성 관능기)를 추가로 포함하고, 상기 링커를 통하여 상기 분자단과 상기 폴리펩티드가 결합하고 있어도 좋다.
상기 링커가, 하기 식(1)로 나타나는 구조 단위, 하기 일반식(2a)∼(6)으로 나타나는 구조 단위, 하기 식(7)로 나타나는 구조 단위, 하기 일반식(8a)∼(9)로 나타나는 구조 단위, 하기 일반식(10)∼(11b)로 나타나는 구조 단위, 및 하기 일반식(13)∼(16)으로 나타나는 구조 단위로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종을 포함해도 좋다.
[화학식 1]
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[화학식 17]
[화학식 18]
[화학식 19]
상기 일반식(2a), (2b), (3a), (4a), (4b), (5), (6), (10), (11a) 및 (11b)에 있어서, Y는, 서로 독립적으로, 산소 원자, 황원자, 또는 NR1을 나타내고, R1은, 수소, 탄화수소기, 방향족기, 카르보닐기, 및 술포닐기를 나타내고, 상기 일반식(2a), (2b), (3a), (4a), (4b), (8a), (8b), (9), (10), (11a) 및 (11b)에 있어서, R은, 서로 독립적으로, 수소, 탄화수소기, 및 방향족기를 나타낸다.
상기 링커가, 상기 식(1)로 나타나는 구조 단위, 그리고, 상기 일반식(2a), (3a), (4a), (4b) 및 (10)으로 나타나는 구조 단위로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종이라도 좋다.
상기 폴리펩티드 골격이 인공 단백질에 유래하는 골격을 포함해도 좋다.
상기 인공 단백질이 인공 구조 단백질을 포함해도 좋다.
상기 인공 구조 단백질이 인공 피브로인을 포함해도 좋다.
상기 인공 피브로인이 인공 개변 거미줄 피브로인을 포함해도 좋다.
본 개시의 일 측면은, 전술한 합성 고분자를 함유하는, 성형 재료를 제공한다.
상기 성형 재료는, 전술한 합성 고분자를 함유하는 점에서, 유연성이 우수한 성형체를 제조할 수 있다.
본 개시의 일 측면은, 전술한 합성 고분자를 함유하는, 성형체를 제공한다.
상기 성형체는, 전술한 합성 고분자를 함유하는 점에서 유연성이 우수하다.
본 개시의 일 측면은, 폴리펩티드 골격을 포함하는 화합물과, 하기 일반식(1A)∼(16A)로 나타나는 화합물을 반응시킴으로써 합성 고분자를 얻는 공정을 구비하고, 상기 폴리펩티드 골격은, 티올기, 아미노기, 하이드록시기, 구아니디노기, 카르복시기, 페녹시기, 인돌기, 아미드기, 아지드기, 및 알키닐기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종을 갖는 합성 고분자의 제조 방법을 제공한다.
[화학식 20]
[화학식 21]
[화학식 22]
[화학식 23]
[화학식 24]
[화학식 25]
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[화학식 39]
상기 일반식(1A), (2A), (2B), (3A), (3B), (4A), (5A), (6A), (7A), (8A), (8B), (9A), (10A), (11A), (11B) 및 (12A)에 있어서 R2는, 상기 폴리펩티드 골격에 대한 가소화 기능을 갖는 분자단을 나타내고, 상기 일반식(2A), (2B), (3A), (3B), (4A), (5A), (6A), (8B), (9A), (10A), (11A) 및 (11B)에 있어서, Y는, 서로 독립적으로, 산소 원자, 황원자, 또는 NR1을 나타내고, R1은, 수소, 탄화수소기, 방향족기, 카르보닐기, 및 술포닐기를 나타내고, 상기 일반식(2A), (2B), (3A), (3B), (4A), (5A), (8A), (8B), (9A), (10A), (11A) 및 (11B)에 있어서 R은, 서로 독립적으로, 수소, 탄화수소기, 및 방향족기를 나타내고, 상기 일반식(6A) 및 (12A)에 있어서, Z는 할로겐 원자, 술폰산 에스테르기, 및 불소 함유 카복실산 에스테르기를 나타내고, 상기 일반식(15A)에 있어서, X는 할로겐 원자를 나타낸다.
상기 합성 고분자의 제조 방법은, 특정의 관능기를 갖는 폴리펩티드 골격을 포함하는 화합물과, 폴리펩티드 골격에 대한 가소화 기능을 갖는 분자단을 갖는, 하기 일반식(1A)∼(16A)로 나타나는 특정의 화합물을 반응시킴으로써 합성 고분자를 조제하고 있다. 이렇게 함으로써, 얻어지는 합성 고분자는, 폴리펩티드 골격에 대한 가소화 기능을 갖는 분자단을 갖고, 단백질과 마찬가지로 폴리펩티드 골격을 가지면서, 합성 고분자 전체로서, 유연성이 우수한 재료로 되어 있다. 이 때문에, 유연성이 우수한 성형체를 제조 가능하다. 또한, 상기 합성 고분자는, 제1 세그먼트와 제2 세그먼트가 결합하고 있기 때문에, 단백질에 가소제를 단순히 혼합하는 경우와 같은 거시적인 상분리의 발생이 저감되어 있다.
폴리펩티드 골격을 포함하는 화합물과, 하기 일반식(1A)∼(12A) 또는 (14A)로 나타나는 화합물의 반응이 마이클 부가 반응이라도 좋다.
상기 폴리펩티드 골격이 소수성 폴리펩티드 골격이라도 좋다. 당해 소수성 폴리펩티드 골격의 평균 하이드로퍼시·인덱스가 0.22 이상이라도 좋다.
상기 폴리펩티드 골격에 대한 가소화 기능을 갖는 분자단이, 상기 폴리펩티드 골격의 분자량을 100이라고 했을 때에 1∼70의 범위 내의 값이라도 좋다.
상기 폴리펩티드 골격을 갖는 화합물이 인공 단백질을 포함해도 좋다.
상기 인공 단백질이 인공 구조 단백질을 포함해도 좋다.
본 개시의 일 측면은, 폴리펩티드 골격을 포함하는 화합물과, 상기 폴리펩티드 골격에 대한 가소화 기능을 갖는 분자단을 포함하는 화합물과, 하기 일반식(2-1A)∼(2-16A)로 나타나는 구조 단위로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종의 구조 단위를 2개 이상 갖는 화합물을 반응시킴으로써 합성 고분자를 얻는 공정을 구비하고, 상기 폴리펩티드 골격은, 티올기, 아미노기, 하이드록시기, 구아니디노기, 카르복시기, 페녹시기, 인돌기, 아미드기, 아지드기, 및 알키닐기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종을 갖고, 상기 분자단을 포함하는 화합물은, 티올기, 아미노기, 하이드록시기, 구아니디노기, 카르복시기, 페녹시기, 인돌기, 아미드기, 아지드기, 및 알키닐기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종을 갖는 합성 고분자의 제조 방법을 제공한다.
[화학식 40]
[화학식 41]
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상기 일반식(2-2A), (2-2B), (2-3A), (2-3B), (2-4A), (2-5A), (2-6A), (2-10A), (2-11A), 및 (2-11B)에 있어서, Y는, 서로 독립적으로, 산소 원자, 황원자, 또는 NR1을 나타내고, R1은, 수소, 탄화수소기, 방향족기, 카르보닐기, 및 술포닐기를 나타내고, 상기 일반식(2-2A), (2-2B), (2-3A), (2-3B), (2-4A), (2-8A), (2-8B), (2-9A), (2-10A), (2-11A), (2-11B), 및 (2-12A)에 있어서 R은, 서로 독립적으로, 수소, 탄화수소기, 및 방향족기를 나타내고, 상기 일반식(2-6A) 및 (2-12A)에 있어서, Z는 할로겐 원자, 술폰산 에스테르기, 및 불소 함유 카복실산 에스테르기를 나타내고, 상기 일반식(2-15A)에 있어서, X는 할로겐 원자를 나타낸다.
상기 합성 고분자의 제조 방법은, 특정의 관능기를 갖는 폴리펩티드 골격을 포함하는 화합물과, 폴리펩티드 골격에 대한 가소화 기능을 갖고, 특정의 관능기를 갖는 분자단을 포함하는 화합물과, 일반식(2-1A)∼(2-16A)로 나타나는 구조 단위로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종의 구조 단위를 2개 이상 갖는 화합물을 반응시킴으로써 합성 고분자를 조제한다. 이렇게 함으로써, 얻어지는 합성 고분자는, 폴리펩티드 골격에 대한 가소화 기능을 갖는 분자단을 갖고, 단백질과 마찬가지로 폴리펩티드 골격을 가지면서, 합성 고분자 전체로서, 유연성이 우수한 재료로 되어 있다. 이 때문에, 유연성이 우수한 성형체를 제조 가능하다. 또한, 상기 합성 고분자는, 제1 세그먼트와 제2 세그먼트가 결합하고 있기 때문에, 단백질에 가소제를 단순히 혼합하는 경우와 같은 거시적인 상분리의 발생이 저감되어 있다.
상기 폴리펩티드 골격이 소수성 폴리펩티드 골격이라도 좋다. 당해 소수성 폴리펩티드 골격의 평균 하이드로퍼시·인덱스가 0.22 이상이라도 좋다.
상기 폴리펩티드 골격에 대한 가소화 기능을 갖는 분자단의 분자량이, 상기 폴리펩티드 골격의 분자량을 100이라고 했을 때에 1∼70의 범위 내의 값이라도 좋다.
본 개시에 의하면, 펩티드 골격을 갖는 고분자 재료로서, 유연성이 우수한 성형체를 제조 가능한 합성 고분자를 제공할 수 있다. 본 개시에 의하면 또한, 전술한 합성 고분자를 함유하는 성형 재료 및 성형체를 제공할 수 있다.
[도 1] 도 1은, 인공 피브로인의 도메인 서열의 일례를 나타내는 모식도이다.
[도 2] 도 2는, 천연 유래의 피브로인의 z/w(%)의 값의 분포를 나타내는 도면이다.
[도 3] 도 3은, 천연 유래의 피브로인의 x/y(%)의 값의 분포를 나타내는 도면이다.
[도 4] 도 4는, 인공 피브로인의 도메인 서열의 일례를 나타내는 모식도이다.
[도 5] 도 5는, 피브로인의 도메인 서열의 일례를 나타내는 모식도이다.
[도 6] 도 6은, 실시예에서 조제한 성형 재료에 대한 SDS-PAGE의 측정 결과를 나타내는 도면이다.
[도 7] 도 7은, 실시예에서 조제한 성형 재료에 대한 SDS-PAGE의 측정 결과를 나타내는 도면이다.
[도 8] 도 8은, 실시예에서 사용한 가압 성형기의 모식 단면도이다.
[도 9] 도 9는, 도 8에 나타낸 가압 성형기의 사용 방법을 나타내는 모식도이며, (a)는 조성물 도입 전, (b)는 조성물 도입 직후, (c)는 조성물을 가열 및 가압하고 있는 상태의 가압 성형기의 모식 단면도이다.
[도 10] 도 10은, 실시예 1의 합성 고분자를 사용하여 성형한 성형체의 외관을 나타내는 사진이다.
[도 11] 도 11은, 비교예 2의 혼합물을 사용하여 성형한 성형체의 외관을 나타내는 사진이다.
[도 12] 도 12는, 비교예 3의 혼합물을 사용하여 성형한 성형체의 외관을 나타내는 사진이다.
[도 13] 도 13은, 실시예 12에서 조제한 섬유의 외관을 나타내는 사진이다.
[도 14] 도 14는, 실시예 13에서 조제한 합성 고분자에 대한 GPC 측정의 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 15] 도 15는, 실시예 14에서 조제한 합성 고분자에 대한 GPC 측정의 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 16] 도 16은, 실시예 15에서 조제한 합성 고분자에 대한 GPC 측정의 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 17] 도 17은, 실시예 16에서 조제한 합성 고분자에 대한 GPC 측정의 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 18] 도 18은, 실시예 17에서 조제한 합성 고분자에 대한 GPC 측정의 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 19] 도 19는, 참고예 2에 있어서의 GPC 측정의 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 20] 도20은, 참고예 3에 있어서의 접촉각 측정의 결과를 나타내는 사진이다.
[도 2] 도 2는, 천연 유래의 피브로인의 z/w(%)의 값의 분포를 나타내는 도면이다.
[도 3] 도 3은, 천연 유래의 피브로인의 x/y(%)의 값의 분포를 나타내는 도면이다.
[도 4] 도 4는, 인공 피브로인의 도메인 서열의 일례를 나타내는 모식도이다.
[도 5] 도 5는, 피브로인의 도메인 서열의 일례를 나타내는 모식도이다.
[도 6] 도 6은, 실시예에서 조제한 성형 재료에 대한 SDS-PAGE의 측정 결과를 나타내는 도면이다.
[도 7] 도 7은, 실시예에서 조제한 성형 재료에 대한 SDS-PAGE의 측정 결과를 나타내는 도면이다.
[도 8] 도 8은, 실시예에서 사용한 가압 성형기의 모식 단면도이다.
[도 9] 도 9는, 도 8에 나타낸 가압 성형기의 사용 방법을 나타내는 모식도이며, (a)는 조성물 도입 전, (b)는 조성물 도입 직후, (c)는 조성물을 가열 및 가압하고 있는 상태의 가압 성형기의 모식 단면도이다.
[도 10] 도 10은, 실시예 1의 합성 고분자를 사용하여 성형한 성형체의 외관을 나타내는 사진이다.
[도 11] 도 11은, 비교예 2의 혼합물을 사용하여 성형한 성형체의 외관을 나타내는 사진이다.
[도 12] 도 12는, 비교예 3의 혼합물을 사용하여 성형한 성형체의 외관을 나타내는 사진이다.
[도 13] 도 13은, 실시예 12에서 조제한 섬유의 외관을 나타내는 사진이다.
[도 14] 도 14는, 실시예 13에서 조제한 합성 고분자에 대한 GPC 측정의 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 15] 도 15는, 실시예 14에서 조제한 합성 고분자에 대한 GPC 측정의 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 16] 도 16은, 실시예 15에서 조제한 합성 고분자에 대한 GPC 측정의 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 17] 도 17은, 실시예 16에서 조제한 합성 고분자에 대한 GPC 측정의 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 18] 도 18은, 실시예 17에서 조제한 합성 고분자에 대한 GPC 측정의 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 19] 도 19는, 참고예 2에 있어서의 GPC 측정의 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 20] 도20은, 참고예 3에 있어서의 접촉각 측정의 결과를 나타내는 사진이다.
이하, 본 개시를 실시하기 위한 형태에 대해서, 경우에 따라 도면을 참조하여, 상세하게 설명한다. 단, 이하의 실시 형태는 본 개시를 설명하기 위한 예시이며, 본 개시를 이하의 내용에 한정하는 취지는 아니다.
본 명세서에 있어서 예시하는 재료는 특별히 언급하지 않는 한, 1종을 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다. 조성물 중의 각 성분의 함유량은, 조성물 중의 각 성분에 해당하는 물질이 복수 존재하는 경우에는, 특별히 언급하지 않는 한, 조성물 중에 존재하는 당해 복수의 물질의 합계량을 의미한다.
본 명세서에 있어서 성형 재료란 성형체를 제조하기 위해 사용되는 재료를 말한다. 본 개시에 따른 상기 성형 재료는, 재조합 구조 단백질에 대하여 화학 수식을 행한 단백질 소재라고도 말할 수 있다. 본 명세서에 있어서의 성형체의 형상은 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들면, 필름 형상, 판형상, 블록 형상, 해면 형상(스펀지 형상), 및 섬유 형상 등이라도 좋다. 본 명세서에 있어서의 성형 재료의 형태도 하등 한정되는 것은 아니고, 예를 들면, 분말, 입체(粒體), 액체, 및 겔 등이라도 좋다. 또한, 본 개시에 따른 성형 재료는, 예를 들면, 가열 가압 성형, 캐스트 성형, 및 방사 등에 의해 각종 형상의 성형체로 할 수 있다. 성형시에는, 필요에 따라, 틀을 사용해도 좋다.
[합성 고분자]
합성 고분자의 일 실시 형태는, 폴리펩티드 골격을 포함하는 제1 세그먼트와, 상기 제1 세그먼트에 결합하는 하나 또는 복수의 제2 세그먼트를 갖는다. 상기 제2 세그먼트가 상기 폴리펩티드 골격에 대한 가소화 기능을 갖는 분자단을 포함한다. 제2 세그먼트의 수는, 제1 세그먼트 1개에 대하여, 하나 또는 복수이며, 바람직하게는 2 이상이며, 보다 바람직하게는 2∼10이며, 더욱 바람직하게는 2∼8이며, 더욱 바람직하게는 2∼6이며, 가장 바람직하게는 2∼4이다.
합성 고분자로서는, 제1 세그먼트 및 제2 세그먼트를 갖는 것이면 좋고, 예를 들면, 1개의 제1 세그먼트에 하나 또는 복수의 제2 세그먼트가 결합한 것이라도 좋고, 제1 세그먼트와, 제1 세그먼트에 결합한 제2 세그먼트를 포함하는 블록이 복수 연결한 것이라도 좋다. 즉, 합성 고분자는, 폴리펩티드 골격을 포함하는 제1 세그먼트를 주쇄로 하고, 제2 세그먼트를 측쇄에 갖는 고분자(예를 들면, 그래프트 폴리머 등)라도 좋고, 또한, 제1 세그먼트 및 제2 세그먼트를 포함하는 블록 폴리머라도 좋다. 즉, 상기 제1 세그먼트를 복수 갖고, 상기 제1 세그먼트와 제2 세그먼트가 교대로 결합하고 있어도 좋다. 제1 세그먼트와 제2 세그먼트가 교대로 결합함으로써, 예를 들면, 상기 합성 고분자로 구성되는 성형체는 큰 신도를 발휘할 수 있다.
또한 합성 고분자는, 상기 제1 세그먼트를 복수 갖고, 상기 제2 세그먼트의 일부가 2 이상의 상기 제1 세그먼트와 결합하여 네트워크 구조를 형성하고 있어도 좋다. 네트워크 구조를 가짐으로써, 예를 들면, 상기 합성 고분자로 구성되는 성형체는 큰 신도를 발휘할 수 있다. 또한 네트워크 구조를 가짐으로써, 예를 들면, 상기 합성 고분자로 구성되는 성형체에 탄성체로서의 기능을 부여할 수 있다.
제1 세그먼트와 제2 세그먼트의 결합은, 직접 결합하고 있어도 좋고, 또한 제1 세그먼트 및 제2 세그먼트와 결합할 수 있는 바와 같은 구조에 의해 결합하고 있어도 좋다. 또한, 그들의 어느 결합 형태에 있어서도, 제1 세그먼트와 제2 세그먼트의 결합은 공유 결합이라도 좋다.
(제1 세그먼트)
제1 세그먼트는, 폴리펩티드 골격을 구성하는 아미노산 서열 중의 관능기(예를 들면, 시스테인이 갖는 티올기 등)에 의해 제2 세그먼트와 결합하고 있어도 좋다. 바꾸어 말하면, 제2 세그먼트와 결합 가능한 관능기를 갖는 폴리펩티드이면, 상기의 폴리펩티드 골격으로서 채용할 수 있다. 이때, 폴리펩티드가 갖는 상기 관능기의 수는, 예를 들면, 1개 이상, 2개 이상, 또는 4개 이상이라도 좋다. 폴리펩티드가 갖는 상기 관능기의 수는, 예를 들면, 30개 이하, 25개 이하, 20개 이하, 15개 이하, 10개 이하, 또는 8개 이하라도 좋다. 폴리펩티드가 갖는 상기 관능기의 수는 전술한 범위 내에서 조정할 수 있고, 예를 들면, 1∼30, 1∼25, 1∼20, 1∼15, 1∼10, 1∼8, 또는 2∼8이라도 좋다. 제1 세그먼트는 또한, 폴리펩티드 골격을 구성하는 아미노산 서열 중의 관능기에 대하여 도입한 관능기에 의해 제2 세그먼트와 결합하고 있어도 좋다.
전술한 바와 같은 관능기는, 예를 들면, 티올기, 아미노기, 하이드록시기, 구아니디노기, 카르복시기, 페녹시기, 인돌기, 아미드기, 아지드기, 및 알키닐기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종이라도 좋고, 바람직하게는, 티올기, 아미노기, 하이드록시기, 구아니디노기, 카르복시기, 페녹시기, 인돌기, 및 아미드기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종이라도 좋고, 보다 바람직하게는, 티올기, 아미노기, 하이드록시기, 구아니디노기, 카르복시기, 페녹시기, 및 인돌기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종이라도 좋고, 더욱 바람직하게는, 티올기, 아미노기, 하이드록시기, 구아니디노기, 카르복시기, 및 페녹시기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종이라도 좋고, 더욱 보다 바람직하게는, 티올기, 아미노기, 하이드록시기, 구아니디노기, 및 카르복시기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종이라도 좋고, 더욱 보다 또한 바람직하게는, 티올기, 아미노기, 하이드록시기, 및 구아니디노기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종이라도 좋고, 특히 바람직하게는, 티올기, 아미노기, 및 하이드록시기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종이라도 좋고, 특히 보다 바람직하게는, 티올기, 및 아미노기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종이라도 좋고, 가장 바람직하게는 티올기이다. 아미노기는, 예를 들면, 리신이 갖는 아미노기라도 좋다. 하이드록시기는, 예를 들면, 세린이 갖는 하이드록시기, 및 트레오닌이 갖는 하이드록시기 등이라도 좋다. 구아니디노기는, 예를 들면, 아르기닌이 갖는 구아니디노기라도 좋다. 카르복시기는, 예를 들면, 글루타민산이 갖는 카르복시기, 및 아스파라긴산이 갖는 카르복시기 등이라도 좋다. 페녹시기는, 예를 들면, 타이로신이 갖는 페녹시기라도 좋다. 인돌기는, 예를 들면, 트립토판이 갖는 인돌기라도 좋다. 아미드기는, 예를 들면, 글루타민이 갖는 아미드기, 및 아스파라긴이 갖는 아미드기 등이라도 좋다. 알키닐기는, 시스테인이 갖는 티올기에 대하여 할로겐화 아세틸렌을 반응시켜 도입한 알키닐기라도 좋다.
제1 세그먼트는 폴리펩티드 골격을 포함하고, 예를 들면, 폴리펩티드 골격만으로 이루어져도 좋다. 폴리펩티드 골격은, 인공 단백질에 유래하는 골격을 포함해도 좋고, 인공 단백질에 유래하는 골격만으로 이루어져도 좋다. 상기 인공 단백질은, 인공 피브로인을 포함해도 좋고, 인공 피브로인만으로 이루어져도 좋다. 폴리펩티드 골격이 재조합 단백질에 유래하는 골격을 포함함으로써, 폴리펩티드 골격을 구성하는 아미노산 서열 중의 관능기의 수 및 위치를 임의로 조절할 수 있다. 이에 따라, 합성 고분자 및 성형 재료의 구조 그리고 특성을 디자인하는 것이 가능하게 된다. 또한, 재조합 단백질이 인공 피브로인을 포함함으로써, 합성 고분자의 피브릴화가 용이하게 된다. 이에 따라, 합성 고분자를 성형 재료로서 사용한 경우에 있어서의 섬유 형성능이 향상되는 등의 이점이 얻어진다.
제1 세그먼트의 분자량은, 예를 들면, 바람직하게는 200∼1000000이며, 보다 바람직하게는 300∼900000이며, 더욱 바람직하게는 400∼800000이며, 더욱 보다 바람직하게는 500∼700000이며, 더욱 보다 또한 바람직하게는 600∼600000이며, 더욱 적합하게는 1000∼600000이며, 더욱 적합하게는 3000∼600000이며, 더욱 적합하게는 5000∼600000이며, 더욱 적합하게는 10000∼600000이며, 더욱 적합하게는 5000∼100000이다. 또한, 제1 세그먼트의 분자량이 200 미만이면, 가소화 기능을 갖는 분자단을 포함하는 제2 세그먼트(소프트 세그먼트)에 대하여 하드 세그먼트로서 기능하는 제1 세그먼트가 지나치게 작아질 우려가 있다. 그렇게 된 경우에는, 합성 고분자(성형 재료)를 사용하여 성형되는 성형체의 강성이 작아지고, 예를 들면, 구조체로서의 사용이 곤란해질 가능성이 있다. 한편, 제1 세그먼트의 분자량이 1000000 초과이면, 연결 반응의 반응성이 저하되기 때문에, 화학 공학적으로 소재로서 상업 생산이 가능한 시간에서 반응을 완수할 수 없고, 그 결과, 성형체 내에 잔존한 미반응의 제2 세그먼트의 국재화로 이어질 가능성이 있다. 또한, 제1 세그먼트의 분자량, 및 제1 세그먼트에 포함되는 폴리펩티드 골격의 분자량은, 예를 들면, 1000 이상, 2000 이상, 3000 이상, 4000 이상, 5000 이상, 6000 이상, 7000 이상, 8000 이상, 9000 이상, 10000 이상, 20000 이상, 30000 이상, 40000 이상, 50000 이상, 60000 이상, 70000 이상, 80000 이상, 90000 이상, 100000 이상이라도 좋다. 또한, 제1 세그먼트의 분자량, 및 제1 세그먼트에 포함되는 폴리펩티드 골격의 분자량은, 400000 이하, 360000 미만, 300000 이하, 200000 이하라도 좋다. 제1 세그먼트나 폴리펩티드 골격은, 분자량이 작을수록, 용매로의 용해도가 높아지는 경향에 있다. 그 때문에, 폴리펩티드 골격이나 제1 세그먼트의 분자량이, 예를 들면, 200000 이하, 혹은 100000 이하인 경우에는, 폴리펩티드 골격을 포함하는 화합물을 용매에 용해시키고, 폴리펩티드 골격에 대한 가소화 기능을 갖는 분자단을 포함하는 화합물과 반응시킴으로써 합성 고분자를 얻을 때에, 목적으로 하는 합성 고분자의 생성 효율의 향상이 요망될 수 있다. 또한, 그렇게 하여 얻어지는 합성 고분자를 사용하여 성형된 성형체에 있어서는, 어느 정도의 강도를 확보하면서, 유연성의 향상이 기대될 수 있다. 게다가, 폴리펩티드 골격이나 제1 세그먼트의 분자량이, 예를 들면, 200000 이하, 혹은 100000 이하인 경우에는, 합성 고분자의 유연성을 높이기 위해 제2 세그먼트의 사용량을 가급적 억제할 수 있는 것이 기대된다. 또한, 상기한 제1 세그먼트의 분자량 및 폴리펩티드 골격의 분자량은 중량 평균 분자량이다.
본 명세서에 있어서의 분자량은, 도데실 황산 나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(SDS-PAGE)에 의해 측정되는 값이다. 또한, 이러한 전기 영동은 이하의 수순으로 실시된다. 즉, 우선, 2mg의 분말 샘플에 200μL, 2M 염화 리튬 DMSO(후지필름와코준야쿠사 제조)를 더하고, 80℃, 60분간, 추가로 95℃, 10분간 가열하면서 교반함으로써, 샘플을 용해시킨다. 그 후, 10M 우레아 용액으로 샘플을 50배 희석, 시료용 완충액(후지필름와코준야쿠사 제조)으로 추가로 2배 희석하고, 95℃, 5분간 가열함으로써, 단백질을 변성시킨다. 이어서, 전기 영동 장치(Bio-lad 제조)에 SDS-PAGE용 겔(Bio-lad 제조)을 부착하고, 장치에 SDS 버퍼를 채우는 한편, 전기 영동 장치를 전원 장치(Bio craft 제조)에 연결한다. 변성시킨 샘플을 10μL씩 SDS-PAGE용 겔의 각 웰에 더하고, 30mA/1매, 30분간의 조건으로 전류를 흘린다. 전기 영동 종료 후, SDS-PAGE용 겔을 장치로부터 취출하고, Oriole 형광 겔 스테인(Bio-lad 제조)에 담그어, 1시간 진탕한다. 그 후, UV 샘플 트레이(Bio-lad 제조)에 겔을 올리고, Gel Doc EZ 겔 촬영 장치(Bio-lad 제조)로 염색상을 취득한다.
<인공 단백질>
인공 단백질로서는, 공업 규모에서의 제조가 가능한 임의의 단백질을 들 수 있고, 예를 들면, 공업용에 이용할 수 있는 단백질 등을 들 수 있다. 공업용에 이용 가능하다란, 예를 들면, 옥내나 옥외에서 사용되는 여러 가지 범용 재료 등에 이용할 수 있는 것을 말한다. 공업용에 이용할 수 있는 단백질의 구체예로서는, 구조 단백질을 들 수 있다. 또한, 구조 단백질의 구체예로서는, 스파이더 실크(거미줄), 누에나방 실크, 케라틴, 콜라겐, 엘라스틴 및 레실린, 그리고 이들 유래의 단백질 등을 들 수 있다. 사용하는 단백질로서는, 인공 피브로인이 바람직하고, 인공 거미줄 피브로인(인공 개변 거미줄 피브로인)이 보다 바람직하다.
또한, 인공 단백질은, 재조합(리콤비넌트) 단백질과 합성 단백질을 포함한다. 즉, 본 명세서에 있어서 「인공 단백질」이란, 인위적으로 제조된 단백질을 의미한다. 인공 단백질은, 그 도메인 서열이, 천연 유래의 단백질의 아미노산 서열과는 상이한 단백질이라도 좋고, 천연 유래의 단백질의 아미노산 서열과 동일한 단백질이라도 좋다. 또한, 「인공 단백질」은, 천연 유래의 단백질의 아미노산 서열을 그대로 이용한 것이라도 좋고, 천연 유래의 단백질의 아미노산 서열에 기초하여 그 아미노산 서열을 개변한 것(예를 들면, 클로닝한 천연 유래의 단백질의 유전자 서열을 개변함으로써 아미노산 서열을 개변한 것)이라도 좋고, 또한 천연 유래의 단백질에 의하지 않고 인공적으로 설계 및 합성한 것(예를 들면, 설계한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 화학 합성함으로써 소망하는 아미노산 서열을 갖는 것)이라도 좋다. 또한, 인공 단백질은, 천연 단백질과는 달리, 아미노산 서열을 자유롭게 설계할 수 있는 점에서, 이러한 인공 단백질이, 후술하는 본 실시 형태의 성형 재료나 성형체에 포함되는 합성 고분자에 함유되는 경우에는, 인공 단백질의 아미노산 서열을 적절히 디자인함으로써 성형 재료나 성형체의 기능이나 특성, 물성 등을 임의로 컨트롤할 수 있다. 또한, 항상 균일한 분자 디자인이 가능하기 때문에, 목적 단백질과의 상동성이 높은, 목적에 따른 단백질을 안정적으로 얻을 수 있다. 이것으로, 목적으로 하는 합성 고분자, 나아가서는 그것을 사용하여 얻어지는 성형 재료나 성형체의 품질의 안정화가 유리하게 도모된다.
본 실시 형태에 따른 폴리펩티드는, 아미노산 잔기수가 50 이상이면 좋다. 당해 아미노산 잔기수는, 예를 들면, 100 이상, 150 이상, 200 이상, 250 이상, 300 이상, 350 이상, 400 이상, 450 이상 또는 500 이상이다. 당해 아미노산 잔기수는, 예를 들면, 5000 이하, 4500 이하, 4000 이하, 3500 이하, 3000 이하, 2500 이하, 2000 이하, 1500 이하, 1000 이하이다. 아미노산 잔기수가 적을수록, 용매로의 용해도가 높아지는 경향에 있다. 그 때문에, 본 실시 형태에 따른 폴리펩티드의 아미노산 잔기수가, 예를 들면 5000 이하, 혹은 2500 이하인 경우에는, 폴리펩티드 골격을 포함하는 화합물을 용매에 용해시키고, 폴리펩티드 골격에 대한 가소화 기능을 갖는 분자단을 포함하는 화합물과 반응시킴으로써 합성 고분자를 얻을 때에, 목적으로 하는 합성 고분자의 생성 효율의 향상이 요망될 수 있다. 또한, 그렇게 하여 얻어지는 합성 고분자를 사용하여 이루어지는 성형체에 있어서는, 어느 정도의 강도를 확보하면서, 유연성의 향상이 기대될 수 있다.
(폴리펩티드 골격)
폴리펩티드 골격은, 예를 들면, 소수성 폴리펩티드 골격이라도 좋다. 폴리펩티드 골격이 소수성 폴리펩티드 골격인 경우에는, 가소화 기능을 갖는 분자단의 제1 세그먼트와의 친화성이 향상되어, 보다 유연성이 우수한 성형체를 제조할 수 있다. 게다가, 이러한 성형체의 내수성이 향상되고, 예를 들면, 성형체가 공업용의 범용 재료로서 사용되는 경우에, 사용 수명의 연명화가 유리하게 도모될 수 있다. 또한, 본 실시 형태에 따른 합성 고분자는, 예를 들면, 제2 세그먼트에 포함되는, 폴리펩티드 골격에 대한 가소화 기능을 갖는 분자단의 소수성 내지 친수성을 컨트롤함으로써, 합성 고분자 전체의 소수성 내지 친수성을 임의로 조정 가능하지만, 폴리펩티드 골격이 소수성 폴리펩티드 골격인 경우에는, 폴리펩티드 골격이 친수성 폴리펩티드 골격인 경우에 비하여, 합성 고분자 전체를 소수성측에 시프트할 수 있고, 이것으로 합성 고분자 전체의 소수성 내지 친수성을 보다 폭 넓은 범위에 걸쳐 컨트롤 가능하게 된다.
소수성 폴리펩티드 골격에 있어서의 소수성은, 후술하는 평균 하이드로퍼시·인덱스의 값을 지표로서 추정할 수 있다. 소수성 폴리펩티드 골격의 평균 하이드로퍼시·인덱스의 값은, 예를 들면, 0.00 이상, 0.10 이상, 0.20 이상, 0.22 이상, 0.25 이상, 0.30 이상, 0.35 이상, 0.40 이상, 0.45 이상, 0.50 이상, 0.55 이상, 0.60 이상, 0.65 이상, 또는 0.70 이상이라도 좋다. 또한, 그 상한값은 특별히 제한되는 것은 아니지만, 예를 들면, 1.00 이하라도 좋고, 0.7 이하라도 좋다.
소수성 폴리펩티드 골격은, 60℃에 있어서의 브롬화 리튬 수용액(농도: 9M)에 대한 용해성이 낮은 것이 바람직하다. 이 용해성은, 상기 소수성 폴리펩티드 골격에 상당하는 화합물(폴리펩티드) 또는 합성 고분자를 분해하고 소수성 폴리펩티드 골격만 단리하여 얻어진 폴리펩티드를 사용하여 평가할 수 있다. 60℃에 있어서의 브롬화 리튬 수용액(농도: 9M)에 대하여 상기 폴리펩티드를 용해시킨 경우의 최대 농도가, 예를 들면, 30질량% 미만, 25질량% 미만, 20질량% 미만, 15질량% 미만, 10질량% 미만, 5질량% 미만, 또는 1질량% 미만이라도 좋다. 또한, 소수성 폴리펩티드 골격으로서는, 60℃에 있어서의 브롬화 리튬 수용액(농도: 9M)에 대하여 전혀 용해되지 않는 것이라도 좋다.
소수성 폴리펩티드 골격은, 물의 접촉각이 큰 것인 것이 바람직하다. 물의 접촉각은, 기재 상에 상기 소수성 폴리펩티드 골격에 상당하는 화합물(폴리 펩티드) 또는 합성 고분자를 분해하고 소수성 폴리펩티드 골격만 단리하여 얻어진 폴리펩티드로 이루어지는 막을 형성하고, 당해 막을 사용하여 평가할 수 있다. 당해 막에 물을 적하하고, 5초간 경과 후의 접촉각이 55° 이상이 되는 바와 같은 막을 구성하는 폴리펩티드가, 상기 소수성 폴리펩티드 골격으로서 바람직하다. 상기 접촉각은, 예를 들면, 60° 이상, 65° 이상, 또는 70° 이상이라도 좋다.
소수성 폴리펩티드 골격은, 내열수성이 우수한 것이 바람직하다. 대열수성은, 상기 소수성 폴리펩티드 골격에 상당하는 화합물(폴리펩티드) 또는 합성 고분자를 분해하고 소수성 폴리펩티드 골격만 단리하여 얻어진 폴리펩티드를 사용하여 평가할 수 있다. 상기 폴리펩티드와 물로 이루어지는 분산액으로서, 상기 폴리펩티드의 함유량이 5질량%인 분산액을 조제하고, 당해 분산액을 100℃에서 5시간 가열 처리해도 분해되지 않는 바와 같은 폴리펩티드가, 상기 소수성 폴리펩티드 골격으로서 바람직하다.
본 실시 형태에 따른 폴리펩티드 골격은, 예를 들면, 구조 단백질이라도 좋다. 구조 단백질이란, 생체의 구조와 관련된 단백질, 혹은 생체가 만들어내는 구조체를 구성하는 단백질, 또는 그들에 유래하는 단백질을 의미한다. 구조 단백질은, 또한, 일정한 조건하에 있어서 자기 응집하여, 섬유, 필름, 수지, 겔, 미셀, 나노 파티클 등의 구조체를 형성하는 단백질을 말한다. 구조 단백질은, 천연에 있어서는, 예를 들면, 피브로인, 케라틴, 콜라겐, 엘라스틴 및 레실린을 들 수 있다.
구조 단백질은, 인공 구조 단백질이라도 좋다. 본 명세서에 있어서 「인공 구조 단백질」이란, 인위적으로 제조된 구조 단백질을 의미한다. 인공 구조 단백질은, 유전자 재조합에 의해 미생물 생산한 구조 단백질이라도 좋고, 성형성이나 생산성의 관점에서 아미노산의 서열을 개량한 것도 포함하여, 천연 유래 구조 단백질의 서열에 한정되지 않는다.
인공 구조 단백질을 인공적으로 성형할 때, 측쇄가 작은 아미노산일수록 수소 결합하기 쉽고, 강도가 높은 성형체를 얻기 쉽다. 또한, 알라닌 잔기 및 글리신 잔기는, 측쇄가 비극성의 아미노산이기 때문에, 폴리펩티드 생성에 있어서의 접는 과정에서 내측으로 향하도록 배치되고, α 헬릭스 구조 또는 β 시트 구조를 취하기 쉽다. 따라서, 글리신 잔기, 알라닌 잔기, 세린 잔기 등의 아미노산의 비율이 높은 것이 바람직하다. 강도가 보다 우수한 성형체를 얻는 관점에서, 알라닌 잔기 함유량은, 예를 들면, 10∼40%이면 좋고, 12∼40%, 15∼40%, 18∼40%, 20∼40%, 또는, 22∼40%라도 좋다. 강도가 보다 우수한 성형체를 얻는 관점에서, 글리신 잔기 함유량은, 예를 들면, 10∼55%면 좋고, 11∼55%, 13∼55%, 15∼55%, 18∼55%, 20∼55%, 22∼55%, 또는 25∼55%라도 좋다.
또한, 본 명세서에 있어서, 「알라닌 잔기 함유량」이란, 하기 식으로 나타나는 값이다.
알라닌 잔기 함유량=(폴리펩티드에 포함되는 알라닌 잔기의 수/폴리펩티드의 전체 아미노산 잔기의 수)×100(%)
또한, 글리신 잔기 함유량, 세린 잔기 함유량, 트레오닌 잔기 함유량, 프롤린 잔기 함유량 및 타이로신 잔기 함유량은, 상기 식에 있어서, 알라닌 잔기를 각각 글리신 잔기, 세린 잔기, 트레오닌 잔기, 프롤린 잔기 및 타이로신 잔기라고 바꾸어 읽은 것과 동의(同義)이다.
가공성을 향상시키는 관점에서는, 가공 시점에 있어서 분자간의 강고한 수소 결합을 저해하는 것이 중요하고, 이 관점에서 측쇄가 큰 아미노산 또는 굴곡성을 갖는 아미노산이 일정할수록, 서열 전체에 균질하게 포함되어 있는 것이 바람직하고, 구체적으로는, 타이로신 잔기, 트레오닌 잔기, 프롤린 잔기가 포함되는 모티프를 반복하여 주기로 들어와 있어도 좋다. 예를 들면, 임의의 연속한 20아미노산 잔기 중, 프롤린 잔기, 트레오닌 잔기 및 타이로신 잔기의 합계 함유량이, 5% 이상, 5.5% 초과, 6.0% 이상, 6.5% 초과, 7.0% 이상, 7.5% 초과, 8.0% 이상, 8.5% 초과, 9.0% 이상, 10.0% 이상, 또는 15.0% 이상이라도 좋다. 또한 예를 들면, 임의의 연속한 20아미노산 잔기 중, 프롤린 잔기, 트레오닌 잔기 및 타이로신 잔기의 합계 함유량이, 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 또는 20% 이하라도 좋다.
일 실시 형태에 따른 인공 구조 단백질은, 세린 잔기 함유량, 트레오닌 잔기 함유량 및 타이로신 잔기 함유량의 합계가, 4% 이상, 4.5% 이상, 5% 이상, 5.5% 이상, 6% 이상, 6.5% 이상, 또는 7% 이상이라도 좋다. 세린 잔기 함유량, 트레오닌 잔기 함유량 및 타이로신 잔기 함유량의 합계는, 예를 들면, 35% 이하, 33% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 또는 20% 이하라도 좋다.
일 실시 형태에 따른 인공 구조 단백질은, 반복 서열을 갖는 것이라도 좋다. 즉, 본 실시 형태에 따른 폴리펩티드는, 폴리펩티드 내에 서열 동일성이 높은 아미노산 서열(반복 서열 단위)이 복수 존재하는 것이라도 좋다. 반복 서열 단위의 아미노산 잔기수는 6∼200인 것이 바람직하다. 또한, 반복 서열 단위간의 서열 동일성은, 예를 들면, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상이라도 좋다. 또한, 반복 서열 단위의 소수성도(하이드로퍼시·인덱스)는, 예를 들면, -0.80 이상, -0.70 이상, -0.60 이상, -0.50 이상, -0.40 이상, -0.30 이상, -0.20 이상, -0.10 이상, 0.00 이상, 0.22 이상, 0.25 이상, 0.30 이상, 0.35 이상, 0.40 이상, 0.45 이상, 0.50 이상, 0.55 이상, 0.60 이상, 0.65 이상, 또는 0.70 이상이라도 좋다. 또한, 반복 서열 단위의 소수성도의 상한값은 특별히 제한되는 것은 아니지만, 예를 들면, 1.0 이하라도 좋고, 0.7 이하라도 좋다.
일 실시 형태에 따른 인공 구조 단백질은, (A)n 모티프를 포함하는 것이라도 좋다. 본 명세서에 있어서, (A)n 모티프란, 알라닌 잔기를 주로 하는 아미노산 서열을 의미한다. (A)n 모티프의 아미노산 잔기수는 2∼27이라도 좋고, 2∼20, 2∼16, 또는 2∼12의 정수라도 좋다. 또한 (A)n 모티프 중의 전체 아미노산 잔기수에 대한 알라닌 잔기수의 비율은 40% 이상이라도 좋고, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 83% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 100%(알라닌 잔기만으로 구성되는 것을 의미함.)라도 좋다.
인공 구조 단백질에는, 글리신 잔기, 세린 잔기, 또는 알라닌 잔기와 이웃하는 위치에, 시스테인 잔기가 삽입된 것에 상당하는 아미노산 서열을 갖고 있는 것이 바람직하고, 글리신 잔기와 이웃하는 위치에, 시스테인 잔기가 삽입된 것에 상당하는 아미노산 서열을 갖고 있는 것이 보다 바람직하다. 시스테인 잔기는 메르캅토기를(티올기 또는 술피드릴기라고도 함) 갖고, 메르캅토기의 선택성에 따라, 제2 세그먼트와의 결합을 용이한 것으로 할 수 있다. 따라서, 인공 구조 단백질에 있어서의 시스테인 잔기의 삽입 위치에 따라, 제1 세그먼트의 폴리펩티드 골격에 대한 제2 세그먼트의 결합 위치를 임의의 위치로 할 수 있다. 또한, 시스테인 잔기는, 글리신 잔기, 세린 잔기, 또는 알라닌 잔기와, 글리신 잔기, 세린 잔기, 또는 알라닌 잔기의 사이에 위치하고 있어도 좋고, 세린 잔기와, 글리신 잔기의 사이에 위치하고 있어도 좋다.
인공 구조 단백질에는, 소수성 아미노산 잔기와 이웃하는 위치에, 시스테인 잔기가 삽입된 것에 상당하는 아미노산 서열을 갖고 있는 것이 바람직하다. 이 경우, 분자간에서 소수성 아미노산 잔기끼리가 소수적 상호작용에 의해 고정된다. 시스테인 잔기는, 소수성 아미노산 잔기의 옆에 위치하고 있어도 좋고 소수성 아미노산 잔기와, 소수성 아미노산 잔기 이외의 아미노산 잔기의 사이에, 위치하고 있어도 좋고, 소수성 아미노산 잔기와, 글리신 잔기, 세린 잔기, 또는 알라닌 잔기의 사이에 위치하고 있어도 좋고 소수성 아미노산 잔기와, 글리신 잔기의 사이에 위치하고 있어도 좋다. 소수성 아미노산 잔기는, 이소로이신 잔기, 발린 잔기, 로이신 잔기, 페닐알라닌 잔기, 메티오닌 잔기, 및 알라닌 잔기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종이라도 좋다.
인공 구조 단백질로서는, 인공 피브로인이 바람직하다. 피브로인으로서는, 예를 들면, 천연 유래의 피브로인을 들 수 있다. 천연 유래의 피브로인으로서는, 예를 들면, 곤충 또는 거미류가 산생하는 피브로인을 들 수 있다.
곤충이 산생하는 피브로인으로서는, 예를 들면, 봄빅스 모리(Bombyx mori), 봄빅스 만다리나(Bombyx mandarina), 천잠(Antheraea yamamai), 작잠(Anteraea pernyi), 풍잠(Eriogyna pyretorum), 비잠(Pilosamia Cynthia ricini), 저잠(Samia cynthia), 율충(Caligura japonica), 안테래아 밀리타(Antheraea mylitta), 안테래아 아싸마(Antheraea assama) 등의 누에가 산생하는 견 단백질, 및 황말벌(Vespa simillima xanthoptera)의 유충이 토출하는 호넷 실크 단백질을 들 수 있다.
곤충이 산생하는 피브로인의 보다 구체적인 예로서는, 예를 들면, 누에·피브로인 L쇄(GenBank 수탁번호 M76430(염기 서열), AAA 27840.1(아미노산 서열))를 들 수 있다.
거미류가 산생하는 피브로인으로서는, 예를 들면, Araneus ventricosus, Araneus diadematus, Araneus pinguis, Araneus pentagrammicus 및 Araneus nojimai 등의 Araneus속에 속하는 거미, Neoscona scylla, Neoscona nautica, Neoscona adianta 및 Neoscona scylloides 등의 Neoscona속에 속하는 거미, Pronoides brunneus 등의 Pronus속에 속하는 거미, Cyrtarachne bufo 및 Cyrtarachne inaequalis 등의 Cyrtarachne속에 속하는 거미, Gasteracantha kuhli 및 Gasteracantha mammosa 등의 Gasteracantha속에 속하는 거미, Ordgarius hobsoni 및 Ordgarius sexspinosus 등의 Ordgarius속에 속하는 거미, Argiope amoena, Argiope minuta 및 Argiope bruennichi 등의 Argiope속에 속하는 거미, Arachnura logio 등의 Arachnura속에 속하는 거미, Acusilas coccineus 등의 Acusilas속에 속하는 거미, Cyrtophora moluccensis, Cyrtophora exanthematica 및 Cyrtophora unicolor 등의 Cytophora속에 속하는 거미, Poltys illepidus 등의 Poltys속에 속하는 거미, Cyclosa octotuberculata, Cyclosa sedeculata, Cyclosa vallata 및 Cyclosa atrata 등의 Cyclosa속에 속하는 거미, 및 Chorizopes nipponicus 등의 Chorizopes속에 속하는 거미가 산생하는 스파이더 실크 단백질, 그리고 Tetragnatha praedonia, Tetragnatha maxillosa, Tetragnatha extensa 및 Tetragnatha squamata 등의 Tetragnatha속에 속하는 거미, Leucauge celebesiana, Leucauge blanda 및 Leucauge subblanda 등의 Leucauge속에 속하는 거미, Nephila clavata 및 Nephila pilipes 등의 Nephila속에 속하는 거미, Menosira ornata 등의 Menosira속에 속하는 거미, Dyschiriognatha tenera 등의 Dyschiriognatha속에 속하는 거미, Latrodectus mactans, Latrodectus hasselti, Latrodectus geometricus 및 Latrodectus tredecimguttatus 등의 Latrodectus속에 속하는 거미, 및 Euprosthenops속에 속하는 거미 등의 Tetragnathidae과에 속하는 거미가 산생하는 스파이더 실크 단백질을 들 수 있다. 스파이더 실크 단백질로서는, 예를 들면, MaSp(MaSp1 및 MaSp2), ADF(ADF3 및 ADF4) 등의 견인사 단백질, 그리고 MiSp(MiSp1 및 MiSp2) 등을 들 수 있다.
거미류가 산생하는 피브로인의 보다 구체적인 예로서는, 예를 들면, fibroin-3(adf-3)[Araneus diadematus 유래](GenBank 수탁번호 AAC47010(아미노산 서열), U47855(염기 서열)), fibroin-4(adf-4)[Araneus diadematus 유래](GenBank 수탁번호 AAC47011(아미노산 서열), U47856(염기 서열)), dragline silk protein spidroin 1[Nephila clavipes 유래](GenBank 수탁번호 AAC04504(아미노산 서열), U37520(염기 서열)), major angu11ate spidroin 1[Latrodectus hesperus 유래](GenBank 수탁번호 ABR68856(아미노산 서열), EF595246(염기 서열)), dragline silk protein spidroin 2[Nephila clavata 유래](GenBank 수탁번호 AAL32472(아미노산 서열), AF441245(염기 서열)), major anpullate spidroin 1[Euprosthenops australis 유래](GenBank 수탁번호 CAJ00428(아미노산 서열), AJ973155(염기 서열)), 및 major ampullate spidroin 2[Euprosthenops australis](GenBank 수탁번호 CAM32249.1(아미노산 서열), AM490169(염기 서열)), minor ampullate silk protein 1[Nephila clavipes](GenBank 수탁번호 AAC14589.1(아미노산 서열)), minor ampullate silk protein 2[Nephila clavipes](GenBank 수탁번호 AAC14591.1(아미노산 서열)), 그리고 minor ampullate spidroin-like protein[Nephilengys cruentata](GenBank 수탁번호 ABR37278.1(아미노산 서열) 등을 들 수 있다.
천연 유래의 피브로인의 보다 구체적인 예로서는, 추가로, NCBI GenBank에 서열 정보가 등록되어 있는 피브로인을 들 수 있다. 예를 들면, NCBI GenBank에 등록되어 있는 서열 정보 중 DIVISION으로서 INV를 포함하는 서열 중으로부터, DEFINITION에 spidroin, ampullate, fibroin, 「silk 및 polypeptide」, 또는 「silk 및 protein」이 키워드로서 기재되어 있는 서열, CDS로부터 특정 product의 문자열, SOURCE로부터 TISSUE TYPE에 특정 문자열이 기재된 서열을 추출함으로써 확인할 수 있다.
본 명세서에 있어서 「인공 피브로인」이란, 인위적으로 제조된 피브로인(인조 피브로인)을 의미한다. 인공 피브로인은, 천연 유래의 피브로인의 아미노산 서열과는 상이한 피브로인이라도 좋고, 천연 유래의 피브로인의 아미노산 서열과 동일한 피브로인이라도 좋다.
인공 피브로인은, 천연 유래 피브로인에 준하는 구조를 갖는 섬유상 단백질이라도 좋고, 천연 유래 피브로인이 갖는 반복 서열과 동일한 서열을 갖는 피브로인이라도 좋다. 「피브로인이 갖는 반복 서열과 동일한 서열」이란, 실제로 천연 유래 피브로인이 갖는 서열이라도 좋고, 그것과 유사한 서열이라도 좋다.
「인공 피브로인」은, 본 개시에서 특정되는 아미노산 서열을 갖는 것이면, 천연 유래의 피브로인에 의거하여 그 아미노산 서열을 개변한 것(예를 들면, 클로닝한 천연 유래의 피브로인의 유전자 서열을 개변함으로써 아미노산 서열을 개변한 것)이라도 좋고, 또한 천연 유래의 피브로인에 의하지 않고 인공적으로 아미노산 서열을 설계한 것(예를 들면, 설계한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 화학 합성함으로써 소망하는 아미노산 서열을 갖는 것)이라도 좋다. 또한, 인공 피브로인의 아미노산 서열을 개변한 것도, 그 아미노산 서열이 천연 유래의 피브로인의 아미노산 서열과는 상이한 것이면, 인공 피브로인에 포함된다. 인공 피브로인으로서는, 예를 들면, 인공견(실크) 피브로인(누에가 산생하는 견 단백질의 아미노산 서열을 개변한 것), 및 인공 거미줄 피브로인(거미류가 산생하는 스파이더 실크 단백질의 아미노산 서열을 개변한 것) 등을 들 수 있다. 본 개시에 따른 합성 고분자를 성형 재료로서 사용하는 경우, 거미줄 피브로인은 비교적으로 피브릴화가 용이하여 섬유 형성능이 높은 점에서, 인공 피브로인은, 바람직하게는 인공 거미줄 피브로인을 포함하고, 보다 바람직하게는 인공 거미줄 피브로인으로 이루어진다.
본 실시 형태에 따른 인공 피브로인의 구체적인 예로서, 거미의 대병상선에서 산생되는 대토사관 드래그라인 실크 단백질에 유래하는 인공 피브로인(제1 인공 피브로인), 글리신 잔기의 함유량이 저감된 도메인 서열을 갖는 인공 피브로인(제2 인공 피브로인), (A)n모티프의 함유량이 저감된 도메인 서열을 갖는 인공 피브로인(제3 인공 피브로인), 글리신 잔기의 함유량, 및 (A)n모티프의 함유량이 저감된 인공 피브로인(제4 인공 피브로인), 국소적으로 소수성 지표가 큰 영역을 포함하는 도메인 서열을 갖는 인공 피브로인(제5 인공 피브로인), 그리고 글루타민 잔기의 함유량이 저감된 도메인 서열을 갖는 인공 피브로인(제6 인공 피브로인)을 들 수 있다.
제1 인공 피브로인으로서는, 식 1: [(A)n모티프-REP]m으로 나타나는 도메인 서열을 포함하는 단백질을 들 수 있다. 제1 인공 피브로인에 있어서, (A)n모티프의 아미노산 잔기수는, 3∼20의 정수가 바람직하고, 4∼20의 정수가 보다 바람직하고, 8∼20의 정수가 더욱 바람직하고, 10∼20의 정수가 더욱 보다 바람직하고, 4∼16의 정수가 더욱 보다 또한 바람직하고, 8∼16의 정수가 특히 바람직하고, 10∼16의 정수가 가장 바람직하다. 제1 인공 피브로인은, 식 1 중, REP를 구성하는 아미노산 잔기의 수는, 10∼200 잔기인 것이 바람직하고, 10∼150 잔기인 것이 보다 바람직하고, 20∼100 잔기인 것이 더욱 바람직하고, 20∼75잔기인 것이 더욱 보다 바람직하다. 제1 인공 피브로인은, 식 1: [(A)n모티프-REP]m으로 나타나는 아미노산 서열 중에 포함되는 글리신 잔기, 세린 잔기 및 알라닌 잔기의 합계 잔기수가 아미노산 잔기수 전체에 대하여, 40% 이상인 것이 바람직하고, 60% 이상인 것이 보다 바람직하고, 70% 이상인 것이 더욱 바람직하다.
제1 인공 피브로인은, 식 1: [(A)n모티프-REP]m으로 나타나는 아미노산 서열의 단위를 포함하고, 또한 C말단 서열이 서열 번호 1∼3 중 어느 것에 나타나는 아미노산 서열 또는 서열 번호 1∼3 중 어느 것에 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열인 폴리펩티드라도 좋다.
서열 번호 1에 나타나는 아미노산 서열은, ADF3(GI: 1263287, NCBI)의 아미노산 서열의 C말단의 50 잔기의 아미노산으로 이루어지는 아미노산 서열과 동일하고, 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열은, 서열 번호 1에 나타나는 아미노산 서열의 C말단으로부터 20잔기 제거한 아미노산 서열과 동일하고, 서열 번호 3에 나타나는 아미노산 서열은, 서열 번호 1에 나타나는 아미노산 서열의 C말단으로부터 29잔기 제거한 아미노산 서열과 동일하다.
제1 인공 피브로인의 보다 구체적인 예로서, (1-i)서열 번호 4(recombinant spider silk protein ADF3KaiLargeNRSH1)로 나타나는 아미노산 서열, 또는 (1-ii)서열 번호 4로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 인공 피브로인을 들 수 있다. 서열 동일성은, 95% 이상인 것이 바람직하다.
서열 번호 4로 나타나는 아미노산 서열은, N말단에 개시 코돈, His10 태그 및 HRV3C 프로테아제(Human rhinovirus 3C 프로테아제) 인식 사이트로 이루어지는 아미노산 서열(서열 번호 5)을 부가한 ADF3의 아미노산 서열에 있어서, 제1∼13번째의 반복 영역을 대략 2배가 되도록 늘림과 동시에, 번역이 제1154번째 아미노산 잔기로 종지하도록 변이시킨 것이다. 서열 번호 4로 나타나는 아미노산 서열의 C말단의 아미노산 서열은, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열과 동일하다.
(1-i)의 인공 피브로인은, 서열 번호 4로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 것이라도 좋다.
제2 인공 피브로인은, 그 도메인 서열이, 천연 유래의 피브로인과 비교하여, 글리신 잔기의 함유량이 저감된 아미노산 서열을 갖는다. 제2 인공 피브로인은, 천연 유래의 피브로인과 비교하여, 적어도 REP 중의 하나 또는 복수의 글리신 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 것에 상당하는 아미노산 서열을 갖는 것이라고 할 수 있다.
제2 인공 피브로인은, 그 도메인 서열이, 천연 유래의 피브로인과 비교하여, REP 중의 GGX 및 GPGXX(단, G는 글리신 잔기, P는 프롤린 잔기, X는 글리신 이외의 아미노산 잔기를 나타냄.)로부터 선택되는 적어도 하나의 모티프 서열에 있어서, 적어도 하나 또는 복수의 당해 모티프 서열 중의 1개의 글리신 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 것에 상당하는 아미노산 서열을 갖는 것이라도 좋다.
제2 인공 피브로인은, 전술한 글리신 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 모티프 서열의 비율이, 전체 모티프 서열에 대하여, 10% 이상이라도 좋다.
제2 인공 피브로인은, 식 1: [(A)n모티프-REP]m으로 나타나는 도메인 서열을 포함하고, 상기 도메인 서열로부터, 가장 C말단측에 위치하는 (A)n모티프에서 상기 도메인 서열의 C말단까지의 서열을 제거한 서열 중의 전체 REP에 포함되는 XGX(단, X는 글리신 이외의 아미노산 잔기를 나타냄.)로 이루어지는 아미노산 서열의 총 아미노산 잔기수를 z로 하고, 상기 도메인 서열로부터, 가장 C말단측에 위치하는 (A)n모티프에서 상기 도메인 서열의 C말단까지의 서열을 제거한 서열 중의 총 아미노산 잔기수를 w로 했을 때에, z/w가 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상 또는 50.9% 이상인 아미노산 서열을 갖는 것이라도 좋다. (A)n모티프 중의 전체 아미노산 잔기수에 대한 알라닌 잔기수는 83% 이상이라도 좋지만, 86% 이상인 것이 바람직하고, 90% 이상인 것이 보다 바람직하고, 95% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 100%인 것(알라닌 잔기만으로 구성되는 것을 의미함)이 더욱 보다 바람직하다.
제2 인공 피브로인은, GGX 모티프의 1개의 글리신 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환함으로써, XGX로 이루어지는 아미노산 서열의 함유 비율을 높인 것인 것이 바람직하다. 제2 인공 피브로인은, 도메인 서열 중의 GGX로 이루어지는 아미노산 서열의 함유 비율이 30% 이하인 것이 바람직하고, 20% 이하인 것이 보다 바람직하고, 10% 이하인 것이 더욱 바람직하고, 6% 이하인 것이 더욱 보다 바람직하고, 4% 이하인 것이 더욱 보다 또한 바람직하고, 2% 이하인 것이 특히 바람직하다. 도메인 서열 중의 GGX로 이루어지는 아미노산 서열의 함유 비율은, 하기 XGX로 이루어지는 아미노산 서열의 함유 비율(z/w)의 산출 방법과 동일한 방법으로 산출할 수 있다.
z/w의 산출 방법을 더욱 상세하게 설명한다. 우선, 식 1: [(A)n모티프-REP]m으로 나타나는 도메인 서열을 포함하는 피브로인(인공 피브로인 또는 천연 유래의 피브로인)에 있어서, 도메인 서열로부터, 가장 C말단측에 위치하는 (A)n모티프에서 도메인 서열의 C말단까지의 서열을 제거한 서열에 포함되는 모든 REP로부터, XGX로 이루어지는 아미노산 서열을 추출한다. XGX를 구성하는 아미노산 잔기의 총수가 z이다. 예를 들면, XGX로 이루어지는 아미노산 서열이 50개 추출된 경우(중복은 없음), z는 50×3=150이다. 또한, 예를 들면, XGXGX로 이루어지는 아미노산 서열의 경우와 같이 2개의 XGX에 포함되는 X(중앙의 X)가 존재하는 경우에는, 중복분을 공제하여 계산한다(XGXGX의 경우에는 5아미노산 잔기임). w는, 도메인 서열로부터, 가장 C말단측에 위치하는 (A)n모티프에서 도메인 서열의 C말단까지의 서열을 제거한 서열에 포함되는 총 아미노산 잔기수이다. 예를 들면, 도 1에 나타낸 도메인 서열의 경우, w는 4+50+4+100+4+10+4+20+4+30=230이다(가장 C말단측에 위치하는 (A)n모티프는 제거함.) 다음으로 z를 w로 나눔으로써, z/w(%)를 산출할 수 있다.
여기에서, 천연 유래의 피브로인에 있어서의 z/w에 대해서 설명한다. 우선, 전술한 바와 같이, NCBI GenBank에 아미노산 서열 정보가 등록되어 있는 피브로인을 예시한 방법에 의해 확인한 결과, 663종류의 피브로인(이 중, 거미류 유래의 피브로인은 415종류)이 추출되었다. 추출된 모든 피브로인 중, 식 1: [(A)n모티프-REP]m으로 나타나는 도메인 서열을 포함하고, 피브로인 중의 GGX로 이루어지는 아미노산 서열의 함유 비율이 6% 이하인 천연 유래의 피브로인의 아미노산 서열로부터, 전술한 산출 방법에 의해, z/w를 산출했다. 그 결과를 도 2에 나타낸다. 도 2의 가로축은 z/w(%)를 나타내고, 세로축은 빈도를 나타낸다. 도 2로부터 분명한 바와 같이, 천연 유래의 피브로인에 있어서의 z/w는, 모두 50.9% 미만이다(가장 높은 것에서, 50.86%).
제2 인공 피브로인에 있어서, z/w는, 50.9% 이상인 것이 바람직하고, 56.1% 이상인 것이 보다 바람직하고, 58.7% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 70% 이상인 것이 더욱 보다 바람직하고, 80% 이상인 것이 더욱 보다 또한 바람직하다. z/w의 상한에 특별히 제한은 없지만, 예를 들면, 95% 이하라도 좋다.
제2 인공 피브로인은, 예를 들면, 클로닝한 천연 유래의 피브로인의 유전자 서열로부터, 글리신 잔기를 코딩하는 염기 서열의 적어도 일부를 치환하여 다른 아미노산 잔기를 코딩하도록 개변함으로써 얻을 수 있다. 이때, 개변하는 글리신 잔기로서, GGX 모티프 및 GPGXX 모티프에 있어서의 1개의 글리신 잔기를 선택해도 좋고, 또한 z/w가 50.9% 이상이 되도록 치환해도 좋다. 또한, 예를 들면, 천연 유래의 피브로인의 아미노산 서열로부터 상기 태양을 충족하는 아미노산 서열을 설계하고, 설계한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 화학 합성함으로써 얻을 수도 있다. 어느 경우에 있어서도, 천연 유래의 피브로인의 아미노산 서열로부터 REP 중의 글리신 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환한 것에 상당하는 개변에 더하여, 추가로 하나 또는 복수의 아미노산 잔기를 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가한 것에 상당하는 아미노산 서열의 개변을 행해도 좋다.
상기의 다른 아미노산 잔기로서는, 글리신 잔기 이외의 아미노산 잔기이면 특별히 제한은 없지만, 발린(V) 잔기, 로이신(L) 잔기, 이소로이신(I) 잔기, 메티오닌(M) 잔기, 프롤린(P) 잔기, 페닐알라닌(F) 잔기 및 트립토판(W) 잔기 등의 소수성 아미노산 잔기, 글루타민(Q) 잔기, 아스파라긴(N) 잔기, 세린(S) 잔기, 리신(K) 잔기 및 글루타민산(E) 잔기 등의 친수성 아미노산 잔기가 바람직하고, 발린(V) 잔기, 로이신(L) 잔기, 이소로이신(I) 잔기, 페닐알라닌(F) 잔기 및 글루타민(Q) 잔기가 보다 바람직하고, 글루타민(Q) 잔기가 더욱 바람직하다.
제2 인공 피브로인의 보다 구체적인 예로서, (2-i)서열 번호 6(Met-PRT380), 서열 번호 7(Met-PRT410), 서열 번호 8(Met-PRT525) 혹은 서열 번호 9(Met-PRT799)로 나타나는 아미노산 서열, 또는 (2-ii)서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8 혹은 서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 인공 피브로인을 들 수 있다.
(2-i)의 인공 피브로인에 대해서 설명한다. 서열 번호 6으로 나타나는 아미노산 서열은, 천연 유래의 피브로인에 상당하는 서열 번호 10(Met-PRT313)으로 나타나는 아미노산 서열의 REP 중의 모든 GGX를 GQX로 치환한 것이다. 서열 번호 7로 나타나는 아미노산 서열은, 서열 번호 6으로 나타나는 아미노산 서열로부터, N말단측으로부터 C말단측을 향하여 2개 간격으로 (A)n모티프를 결실시키고, 추가로 C말단 서열의 앞쪽에 [(A)n모티프-REP]를 1개 삽입한 것이다. 서열 번호 8로 나타나는 아미노산 서열은, 서열 번호 7로 나타나는 아미노산 서열의 각 (A)n모티프의 C말단측에 2개의 알라닌 잔기를 삽입하고, 추가로 일부의 글루타민(Q) 잔기를 세린(S) 잔기로 치환하고, 서열 번호 7의 분자량과 대략 동일해지도록 C말단측의 일부의 아미노산을 결실시킨 것이다. 서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열은, 서열 번호 7로 나타나는 아미노산 서열 중에 존재하는 20개의 도메인 서열의 영역(단, 당해 영역의 C말단측의 수 아미노산 잔기가 치환되어 있음.)을 4회 반복한 서열의 C말단에 소정의 힌지 서열과 His 태그 서열이 부가된 것이다.
서열 번호 10으로 나타나는 아미노산 서열(천연 유래의 피브로인에 상당)에 있어서의 z/w의 값은, 46.8%이다. 서열 번호 6으로 나타나는 아미노산 서열, 서열 번호 7로 나타나는 아미노산 서열, 서열 번호 8로 나타나는 아미노산 서열, 및 서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열에 있어서의 z/w의 값은, 각각 58.7%, 70.1%, 66.1% 및 70.0%이다. 또한, 서열 번호 10, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8 및 서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열의 기자 비율(후술함) 1:1.8∼11.3에 있어서의 x/y의 값은, 각각 15.0%, 15.0%, 93.4%, 92.7% 및 89.8%이다.
(2-i)의 인공 피브로인은, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8 또는 서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 것이라도 좋다.
(2-ii)의 인공 피브로인은, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8 또는 서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것이다. (2-ii)의 인공 피브로인도 또한, 식 1: [(A)n모티프-REP]m으로 나타나는 도메인 서열을 포함하는 단백질이다. 상기 서열 동일성은, 95% 이상인 것이 바람직하다.
(2-ii)의 인공 피브로인은, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8 또는 서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖고, 또한 REP 중에 포함되는 XGX(단, X는 글리신 이외의 아미노산 잔기를 나타냄.)로 이루어지는 아미노산 서열의 총 아미노산 잔기수를 z로 하고, 상기 도메인 서열 중의 REP의 총 아미노산 잔기수를 w로 했을 때에, z/w가 50.9% 이상인 것이 바람직하다.
제2 인공 피브로인은, N말단 및 C말단의 어느 한쪽 또는 양쪽에 태그 서열을 포함하고 있어도 좋다. 이에 따라, 인공 피브로인의 단리, 고정화, 검출 및 가시화 등이 가능하게 된다.
태그 서열로서, 예를 들면, 다른 분자와의 특이적 친화성(결합성, 어피니티)을 이용한 어피니티 태그를 들 수 있다. 어피니티 태그의 구체예로서, 히스티딘 태그(His 태그)를 들 수 있다. His 태그는, 히스티딘 잔기가 4 내지 10개 정도 나열된 짧은 펩티드로, 니켈 등의 금속 이온과 특이적으로 결합하는 성질이 있기 때문에, 금속 킬레이트 크로마토그래피(chelating metal chromatography)에 의한 인공 피브로인의 단리에 이용할 수 있다. 태그 서열의 구체예로서, 예를 들면, 서열 번호 11로 나타나는 아미노산 서열(His 태그 서열 및 힌지 서열을 포함하는 아미노산 서열)을 들 수 있다.
또한, 글루타티온에 특이적으로 결합하는 글루타티온-S-트랜스퍼라아제(GST), 말토오스에 특이적으로 결합하는 말토오스 결합 단백질(MBP) 등의 태그 서열을 이용할 수도 있다.
또한, 항원 항체 반응을 이용한 「에피토프 태그」를 이용할 수도 있다. 항원성을 나타내는 펩티드(에피토프)를 태그 서열로서 부가함으로써, 당해 에피토프에 대한 항체를 결합시킬 수 있다. 에피토프 태그로서, HA(인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌의 펩티드 서열) 태그, myc 태그, FLAG 태그 등을 들 수 있다. 에피토프 태그를 이용함으로써, 높은 특이성으로 용이하게 인공 피브로인을 정제할 수 있다.
또한 태그 서열을 특정의 프로테아제로 분리할 수 있도록 한 것도 사용할 수 있다. 당해 태그 서열을 통하여 흡착한 단백질을 프로테아제 처리함으로써, 태그 서열을 분리한 인공 피브로인을 회수할 수도 있다.
태그 서열을 포함하는 인공 피브로인의 보다 구체적인 예로서, (2-iii)서열 번호 12(PRT380), 서열 번호 13(PRT410), 서열 번호 14(PRT525) 혹은 서열 번호 15(PRT799)로 나타나는 아미노산 서열, 또는 (2-iv)서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14 혹은 서열 번호 15로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 인공 피브로인을 들 수 있다.
서열 번호 16(PRT313), 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14 및 서열 번호 15로 나타나는 아미노산 서열은, 각각 서열 번호 10, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8 및 서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열의 N말단에 서열 번호 11로 나타나는 아미노산 서열(His 태그 서열 및 힌지 서열을 포함함)을 부가한 것이다.
(2-iii)의 인공 피브로인은, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14 또는 서열 번호 15로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 것이라도 좋다.
(2-iv)의 인공 피브로인은, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14 또는 서열 번호 15로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것이다. (2-iv)의 인공 피브로인도 또한, 식 1: [(A)n모티프-REP]m으로 나타나는 도메인 서열을 포함하는 단백질이다. 상기 서열 동일성은, 95% 이상인 것이 바람직하다.
(2-iv)의 인공 피브로인은, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14 또는 서열 번호 15로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖고, 또한 REP 중에 포함되는 XGX(단, X는 글리신 이외의 아미노산 잔기를 나타냄.)로 이루어지는 아미노산 서열의 총 아미노산 잔기수를 z로 하고, 상기 도메인 서열 중의 REP의 총 아미노산 잔기수를 w로 했을 때에, z/w가 50.9% 이상인 것이 바람직하다.
제2 인공 피브로인은, 인공 단백질 생산계에 있어서 생산된 단백질을 숙주의 외부에 방출하기 위한 분비 시그널을 포함하고 있어도 좋다. 분비 시그널의 서열은, 숙주의 종류에 따라 적절히 설정할 수 있다.
제3 인공 피브로인은, 그 도메인 서열이, 천연 유래의 피브로인과 비교하여, (A)n모티프의 함유량이 저감된 아미노산 서열을 갖는다. 제3 인공 피브로인의 도메인 서열은, 천연 유래의 피브로인과 비교하여, 적어도 하나 또는 복수의 (A)n모티프가 결실한 것에 상당하는 아미노산 서열을 갖는 것이라고 할 수 있다.
제3 인공 피브로인은, 천연 유래의 피브로인으로부터 (A)n모티프를 10∼40% 결실시킨 것에 상당하는 아미노산 서열을 갖는 것이라도 좋다.
제3 인공 피브로인은, 그 도메인 서열이, 천연 유래의 피브로인과 비교하여, 적어도 N말단측으로부터 C말단측을 향하여 1∼3개의 (A)n모티프마다 1개의 (A)n모티프가 결실한 것에 상당하는 아미노산 서열을 갖는 것이라도 좋다.
제3 인공 피브로인은, 그 도메인 서열이, 천연 유래의 피브로인과 비교하여, 적어도 N말단측으로부터 C말단측을 향하여 2개 연속한 (A)n모티프의 결실, 및 1개의 (A)n모티프의 결실이 이 순서로 반복된 것에 상당하는 아미노산 서열을 갖는 것이라도 좋다.
제3 인공 피브로인은, 그 도메인 서열이, 적어도 N말단측으로부터 C말단측을 향하여 2개 간격으로 (A)n모티프가 결실한 것에 상당하는 아미노산 서열을 갖는 것이라도 좋다.
제3 인공 피브로인은, 식 1: [(A)n모티프-REP]m으로 나타나는 도메인 서열을 포함하고, N말단측에서 C말단측을 향하고, 이웃하는 2개의 [(A)n모티프-REP] 유닛의 REP의 아미노산 잔기수를 순차 비교하여, 아미노산 잔기수가 적은 REP의 아미노산 잔기수를 1로 했을 때, 다른 한쪽의 REP의 아미노산 잔기수의 비가 1.8∼11.3이 되는 이웃하는 2개의 [(A)n모티프-REP] 유닛의 아미노산 잔기수를 모두 더한 합계값의 최대값을 x로 하고, 도메인 서열의 총 아미노산 잔기수를 y로 했을 때에, x/y가 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상 또는 50% 이상인 아미노산 서열을 갖는 것이라도 좋다. (A)n모티프 중의 전체 아미노산 잔기수에 대한 알라닌 잔기수는 83% 이상이라도 좋지만, 86% 이상인 것이 바람직하고, 90% 이상인 것이 보다 바람직하고, 95% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 100%인 것(알라닌 잔기만으로 구성되는 것을 의미함)이 더욱 보다 바람직하다.
x/y의 산출 방법을 도 1을 참조하면서 더욱 상세하게 설명한다. 도 1에는, 인공 피브로인으로부터 N말단 서열 및 C말단 서열을 제거한 도메인 서열을 나타낸다. 당해 도메인 서열은, N말단측(좌측)으로부터 (A)n모티프-제1 REP(50아미노산 잔기)-(A)n모티프-제2 REP(100아미노산 잔기)-(A)n모티프-제3 REP(10아미노산 잔기)-(A)n모티프-제4 REP(20아미노산 잔기)-(A)n모티프-제5 REP(30아미노산 잔기)-(A)n모티프라는 서열을 갖는다.
이웃하는 2개의 [(A)n모티프-REP] 유닛은, 중복이 없도록, N말단측으로부터 C말단측을 향하여, 순차 선택한다. 이때, 선택되지 않는 [(A)n모티프-REP] 유닛이 존재해도 좋다. 도 1에는, 패턴 1(제1 REP와 제2 REP의 비교, 및 제3 REP와 제4 REP의 비교), 패턴 2(제1 REP와 제2 REP의 비교, 및 제4 REP와 제5 REP의 비교), 패턴 3(제2 REP와 제3 REP의 비교, 및 제4 REP와 제5 REP의 비교), 패턴 4(제1 REP와 제2 REP의 비교)를 나타냈다. 또한, 이 이외에도 선택 방법은 존재한다.
다음으로 각 패턴에 대해서, 선택한 이웃하는 2개의 [(A)n모티프-REP] 유닛 중의 각 REP의 아미노산 잔기수를 비교한다. 비교는, 보다 아미노산 잔기수가 적은 쪽을 1이라고 했을 때의, 다른 한쪽의 아미노산 잔기수의 비를 구함으로써 행한다. 예를 들면, 제1 REP(50아미노산 잔기)와 제2 REP(100아미노산 잔기)의 비교의 경우, 보다 아미노산 잔기수가 적은 제1 REP를 1이라고 했을 때, 제2 REP의 아미노산 잔기수의 비는, 100/50=2이다. 마찬가지로, 제4 REP(20아미노산 잔기)와 제5 REP(30아미노산 잔기)의 비교의 경우, 보다 아미노산 잔기수가 적은 제4 REP를 1이라고 했을 때, 제5 REP의 아미노산 잔기수의 비는, 30/20=1.5이다.
도 1 중, 보다 아미노산 잔기수가 적은 쪽을 1이라고 했을 때에, 다른 한쪽의 아미노산 잔기수의 비가 1.8∼11.3이 되는 [(A)n모티프-REP] 유닛의 조(組)를 실선으로 나타냈다. 본 명세서 중, 이 비를 기자 비율이라고 부른다. 보다 아미노산 잔기수가 적은 쪽을 1이라고 했을 때에, 다른 한쪽의 아미노산 잔기수의 비가 1.8 미만 또는 11.3 초과가 되는 [(A)n모티프-REP] 유닛의 조는 파선으로 나타냈다.
각 패턴에 있어서, 실선으로 나타낸 이웃하는 2개의 [(A)n모티프-REP] 유닛의 모든 아미노산 잔기수를 모두 더한다(REP뿐만 아니라, (A)n모티프의 아미노산 잔기수도 임.). 그리고 모두 더한 합계값을 비교하여, 당해 합계값이 최대가 되는 패턴의 합계값(합계값의 최대값)을 x로 한다. 도 1에 나타낸 예에서는, 패턴 1의 합계값이 최대이다.
다음으로, x를 도메인 서열의 총 아미노산 잔기수 y로 나눔으로써, x/y(%)를 산출할 수 있다.
제3 인공 피브로인에 있어서, x/y는, 50% 이상인 것이 바람직하고, 60% 이상인 것이 보다 바람직하고, 65% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 70% 이상인 것이 더욱 보다 바람직하고, 75% 이상인 것이 더욱 보다 또한 바람직하고, 80% 이상인 것이 특히 바람직하다. x/y의 상한에 특별히 제한은 없고, 예를 들면, 100% 이하라도 좋다. 기자 비율이 1:1.9∼11.3의 경우에는, x/y는 89.6% 이상인 것이 바람직하고, 기자 비율이 1:1.8∼3.4의 경우에는, x/y는 77.1% 이상인 것이 바람직하고, 기자 비율이 1:1.9∼8.4의 경우에는, x/y는 75.9% 이상인 것이 바람직하고, 기자 비율이 1:1.9∼4.1의 경우에는, x/y는 64.2% 이상인 것이 바람직하다.
제3 인공 피브로인이, 도메인 서열 중에 복수 존재하는 (A)n모티프의 적어도 7개가 알라닌 잔기만으로 구성되는 인공 피브로인인 경우, x/y는, 46.4% 이상인 것이 바람직하고, 50% 이상인 것이 보다 바람직하고, 55% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 60% 이상인 것이 더욱 보다 바람직하고, 70% 이상인 것이 더욱 보다 또한 바람직하고, 80% 이상인 것이 특히 바람직하다. x/y의 상한에 특별히 제한은 없고, 100% 이하이면 좋다.
여기에서, 천연 유래의 피브로인에 있어서의 x/y에 대해서 설명한다. 우선, 전술한 바와 같이, NCBI GenBank에 아미노산 서열 정보가 등록되어 있는 피브로인을 예시한 방법에 의해 확인한 결과, 663종류의 피브로인(이 중, 거미류 유래의 피브로인은 415종류)이 추출되었다. 추출된 모든 피브로인 중, 식 1: [(A)n모티프-REP]m으로 나타나는 도메인 서열로 구성되는 천연 유래의 피브로인의 아미노산 서열로부터, 전술한 산출 방법에 의해, x/y를 산출했다. 기자 비율이 1:1.9∼4.1의 경우의 결과를 도 3에 나타낸다.
도 3의 가로축은 x/y(%)를 나타내고, 세로축은 빈도를 나타낸다. 도 3으로부터 분명한 바와 같이, 천연 유래의 피브로인에 있어서의 x/y는, 모두 64.2% 미만이다(가장 높은 것에서, 64.14%).
제3 인공 피브로인은, 예를 들면, 클로닝한 천연 유래의 피브로인의 유전자 서열로부터, x/y가 64.2% 이상이 되도록 (A)n모티프를 코딩하는 서열의 하나 또는 복수를 결실시킴으로써 얻을 수 있다. 또한, 예를 들면, 천연 유래의 피브로인의 아미노산 서열로부터, x/y가 64.2% 이상이 되도록 하나 또는 복수의 (A)n모티프가 결실한 것에 상당하는 아미노산 서열을 설계하고, 설계한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 화학 합성함으로써 얻을 수도 있다. 어느 경우에 있어서도, 천연 유래의 피브로인의 아미노산 서열로부터 (A)n모티프가 결실한 것에 상당하는 개변에 더하여, 추가로 하나 또는 복수의 아미노산 잔기를 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가한 것에 상당하는 아미노산 서열의 개변을 행해도 좋다.
제3 인공 피브로인의 보다 구체적인 예로서, (3-i)서열 번호 17(Met-PRT399), 서열 번호 7(Met-PRT410), 서열 번호 8(Met-PRT525) 혹은 서열 번호 9(Met-PRT799)로 나타나는 아미노산 서열, 또는 (3-ii)서열 번호 17, 서열 번호 7, 서열 번호 8 혹은 서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 인공 피브로인을 들 수 있다.
(3-i)의 인공 피브로인에 대해서 설명한다. 서열 번호 17로 나타나는 아미노산 서열은, 천연 유래의 피브로인에 상당하는 서열 번호 10(Met-PRT313)으로 나타나는 아미노산 서열로부터, N말단측으로부터 C말단측을 향하여 2개 간격으로 (A)n모티프를 결실시키고, 추가로 C말단 서열의 앞쪽에 [(A)n모티프-REP]를 1개 삽입한 것이다. 서열 번호 7, 서열 번호 8 또는 서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열은, 제2 인공 피브로인에서 설명한 대로이다.
서열 번호 10으로 나타나는 아미노산 서열(천연 유래의 피브로인에 상당)의 기자 비율 1:1.8∼11.3에 있어서의 x/y의 값은 15.0%이다. 서열 번호 17로 나타나는 아미노산 서열, 및 서열 번호 7로 나타나는 아미노산 서열에 있어서의 x/y의 값은, 모두 93.4%이다. 서열 번호 8로 나타나는 아미노산 서열에 있어서의 x/y의 값은, 92.7%이다. 서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열에 있어서의 x/y의 값은, 89.8%이다. 서열 번호 10, 서열 번호 17, 서열 번호 7, 서열 번호 8 및 서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열에 있어서의 z/w의 값은, 각각 46.8%, 56.2%, 70.1%, 66.1% 및 70.0%이다.
(3-i)의 인공 피브로인은, 서열 번호 17, 서열 번호 7, 서열 번호 8 또는 서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 것이라도 좋다.
(3-ii)의 인공 피브로인은, 서열 번호 17, 서열 번호 7, 서열 번호 8 또는 서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것이다. (3-ii)의 인공 피브로인도 추가로 식 1: [(A)n모티프-REP]m으로 나타나는 도메인 서열을 포함하는 단백질이다. 상기 서열 동일성은, 95% 이상인 것이 바람직하다.
(3-ii)의 인공 피브로인은, 서열 번호 17, 서열 번호 7, 서열 번호 8 또는 서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖고, 또한 N말단측에서 C말단측을 향하고, 이웃하는 2개의 [(A)n모티프-REP] 유닛의 REP의 아미노산 잔기수를 순차 비교하여, 아미노산 잔기수가 적은 REP의 아미노산 잔기수를 1이라고 했을 때, 다른 한쪽의 REP의 아미노산 잔기수의 비가 1.8∼11.3(기자 비율이 1:1.8∼11.3)이 되는 이웃하는 2개의 [(A)n모티프-REP] 유닛의 아미노산 잔기수를 모두 더한 합계값의 최대값을 x로 하고, 도메인 서열의 총 아미노산 잔기수를 y로 했을 때에, x/y가 64.2% 이상인 것이 바람직하다.
제3 인공 피브로인은, N말단 및 C말단의 어느 한쪽 또는 양쪽에 전술한 태그 서열을 포함하고 있어도 좋다.
태그 서열을 포함하는 인공 피브로인의 보다 구체적인 예로서, (3-iii)서열 번호 18(PRT399), 서열 번호 13(PRT410), 서열 번호 14(PRT525) 혹은 서열 번호 15(PRT799)로 나타나는 아미노산 서열, 또는 (3-iv)서열 번호 18, 서열 번호 13, 서열 번호 14 혹은 서열 번호 15로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 인공 피브로인을 들 수 있다.
서열 번호 18, 서열 번호 13, 서열 번호 14 및 서열 번호 15로 나타나는 아미노산 서열은, 각각 서열 번호 17, 서열 번호 7, 서열 번호 8 및 서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열의 N말단에 서열 번호 11로 나타나는 아미노산 서열(His 태그 서열 및 힌지 서열을 포함함)을 부가한 것이다.
(3-iii)의 인공 피브로인은, 서열 번호 18, 서열 번호 13, 서열 번호 14 또는 서열 번호 15로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 것이라도 좋다.
(3-iv)의 인공 피브로인은, 서열 번호 18, 서열 번호 13, 서열 번호 14 또는 서열 번호 15로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것이다. (3-iv)의 인공 피브로인도 또한, 식 1: [(A)n모티프-REP]m으로 나타나는 도메인 서열을 포함하는 단백질이다. 상기 서열 동일성은, 95% 이상인 것이 바람직하다.
(3-iv)의 인공 피브로인은, 서열 번호 18, 서열 번호 13, 서열 번호 14 또는 서열 번호 15로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖고, 또한 N말단측에서 C말단측을 향하고, 이웃하는 2개의 [(A)n모티프-REP] 유닛의 REP의 아미노산 잔기수를 순차 비교하여, 아미노산 잔기수가 적은 REP의 아미노산 잔기수를 1이라고 했을 때, 다른 한쪽의 REP의 아미노산 잔기수의 비가 1.8∼11.3이 되는 이웃하는 2개의 [(A)n모티프-REP] 유닛의 아미노산 잔기수를 모두 더한 합계값의 최대값을 x로 하고, 도메인 서열의 총 아미노산 잔기수를 y로 했을 때에, x/y가 64.2% 이상인 것이 바람직하다.
제3 인공 피브로인은, 인공 단백질 생산계에 있어서 생산된 단백질을 숙주의 외부에 방출하기 위한 분비 시그널을 포함하고 있어도 좋다. 분비 시그널의 서열은, 숙주의 종류에 따라 적절히 설정할 수 있다.
제4 인공 피브로인은, 그 도메인 서열이, 천연 유래의 피브로인과 비교하여, (A)n모티프의 함유량이 저감된 것에 더하여, 글리신 잔기의 함유량이 저감된 아미노산 서열을 갖는 것이다. 제4 인공 피브로인의 도메인 서열은, 천연 유래의 피브로인과 비교하여, 적어도 하나 또는 복수의 (A)n모티프가 결실한 것에 더하여, 추가로 적어도 REP 중의 하나 또는 복수의 글리신 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 것에 상당하는 아미노산 서열을 갖는 것이라고 할 수 있다. 즉, 제4 인공 피브로인은, 전술한 제2 인공 피브로인과, 제3 인공 피브로인의 특징을 겸비하는 인공 피브로인이다. 구체적인 태양 등은, 제2 인공 피브로인, 및 제3 인공 피브로인에서 설명한 대로이다.
제4 인공 피브로인의 보다 구체적인 예로서, (4-i)서열 번호 7(Met-PRT410), 서열 번호 8(Met-PRT525), 서열 번호 9(Met-PRT799), 서열 번호 13(PRT410), 서열 번호 14(PRT525) 혹은 서열 번호 15(PRT799)로 나타나는 아미노산 서열, 또는 (4-ii)서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 13, 서열 번호 14 혹은 서열 번호 15로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 인공 피브로인을 들 수 있다. 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 13, 서열 번호 14 또는 서열 번호 15로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 인공 피브로인의 구체적인 태양은 전술한 대로이다.
제5 인공 피브로인은, 그 도메인 서열이, 천연 유래의 피브로인과 비교하여, REP 중의 하나 또는 복수의 아미노산 잔기가 소수성 지표가 큰 아미노산 잔기로 치환된 것, 및/또는 REP 중에 하나 또는 복수의 소수성 지표가 큰 아미노산 잔기가 삽입된 것에 상당하는, 국소적으로 소수성 지표가 큰 영역을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 것이라도 좋다.
국소적으로 소수성 지표가 큰 영역은, 연속하는 2∼4아미노산 잔기로 구성되어 있는 것이 바람직하다.
전술한 소수성 지표가 큰 아미노산 잔기는, 이소로이신(I), 발린(V), 로이신(L), 페닐알라닌(F), 시스테인(C), 메티오닌(M) 및 알라닌(A)으로부터 선택되는 아미노산 잔기인 것이 보다 바람직하다.
제5 인공 피브로인은, 천연 유래의 피브로인과 비교하여, REP 중의 하나 또는 복수의 아미노산 잔기가 소수성 지표가 큰 아미노산 잔기로 치환된 것, 및/또는 REP 중에 하나 또는 복수의 소수성 지표가 큰 아미노산 잔기가 삽입된 것에 상당하는 개변에 더하여, 추가로, 천연 유래의 피브로인과 비교하여, 하나 또는 복수의 아미노산 잔기를 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가한 것에 상당하는 아미노산 서열의 개변이 있어도 좋다.
제5 인공 피브로인은, 예를 들면, 클로닝한 천연 유래의 피브로인의 유전자 서열로부터 REP 중의 하나 또는 복수의 친수성 아미노산 잔기(예를 들면, 소수성 지표가 마이너스인 아미노산 잔기)를 소수성 아미노산 잔기(예를 들면, 소수성 지표가 플러스인 아미노산 잔기)로 치환하는 것, 및/또는 REP 중에 하나 또는 복수의 소수성 아미노산 잔기를 삽입함으로써 얻을 수 있다. 또한, 예를 들면, 천연 유래의 피브로인의 아미노산 서열로부터 REP 중의 하나 또는 복수의 친수성 아미노산 잔기를 소수성 아미노산 잔기로 치환한 것, 및/또는 REP 중에 하나 또는 복수의 소수성 아미노산 잔기를 삽입한 것에 상당하는 아미노산 서열을 설계하고, 설계한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 화학 합성함으로써 얻을 수도 있다. 어느 경우에 있어서도, 천연 유래의 피브로인의 아미노산 서열로부터 REP 중의 하나 또는 복수의 친수성 아미노산 잔기를 소수성 아미노산 잔기로 치환한 것, 및/또는 REP 중에 하나 또는 복수의 소수성 아미노산 잔기를 삽입한 것에 상당하는 개변에 더하여, 추가로 하나 또는 복수의 아미노산 잔기를 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가한 것에 상당하는 아미노산 서열의 개변을 행해도 좋다.
제5 인공 피브로인은, 식 1: [(A)n모티프-REP]m으로 나타나는 도메인 서열을 포함하고, 가장 C말단측에 위치하는 (A)n모티프에서 상기 도메인 서열의 C말단까지의 서열을 상기 도메인 서열로부터 제거한 서열에 포함되는 모든 REP에 있어서, 연속하는 4아미노산 잔기의 소수성 지표의 평균값이 2.6 이상이 되는 영역에 포함되는 아미노산 잔기의 총수를 p로 하고, 가장 C말단측에 위치하는 (A)n모티프에서 상기 도메인 서열의 C말단까지의 서열을 상기 도메인 서열로부터 제거한 서열에 포함되는 아미노산 잔기의 총수를 q로 했을 때에, p/q가 6.2% 이상인 아미노산 서열을 가져도 좋다.
아미노산 잔기의 소수성 지표에 대해서는, 공지의 지표(Hydropathy index: Kyte J, & Doolittle R(1982) “A simple method for displaying the hydropathic character of a protein”, J. Mol. Biol., 157, pp.105-132)를 사용한다. 구체적으로는, 각 아미노산의 소수성 지표(하이드로퍼시·인덱스, 이하 「HI」라고도 기재함.)는, 하기 표 1에 나타내는 대로이다.
p/q의 산출 방법을 더욱 상세하게 설명한다. 산출에는, 식 1: [(A)n모티프-REP]m으로 나타나는 도메인 서열로부터, 가장 C말단측에 위치하는 (A)n모티프에서 도메인 서열의 C말단까지의 서열을 제거한 서열(이하, 「서열 A」라고 함)을 사용한다. 우선, 서열 A에 포함되는 모든 REP에 있어서, 연속하는 4아미노산 잔기의 소수성 지표의 평균값을 산출한다. 소수성 지표의 평균값은, 연속하는 4아미노산 잔기에 포함되는 각 아미노산 잔기의 HI의 총합을 4(아미노산 잔기수)로 나누어 구한다. 소수성 지표의 평균값은, 모든 연속하는 4아미노산 잔기에 대하여 구한다(각 아미노산 잔기는, 1∼4회 평균값의 산출에 사용됨.). 이어서, 연속하는 4아미노산 잔기의 소수성 지표의 평균값이 2.6 이상이 되는 영역을 특정한다. 어느 아미노산 잔기가, 복수의 「소수성 지표의 평균값이 2.6 이상이 되는 연속하는 4아미노산 잔기」에 해당하는 경우라도, 영역 중에는 1아미노산 잔기로서 포함되게 된다. 그리고, 당해 영역에 포함되는 아미노산 잔기의 총수가 p이다. 또한, 서열 A에 포함되는 아미노산 잔기의 총수가 q이다.
예를 들면, 「소수성 지표의 평균값이 2.6 이상이 되는 연속하는 4아미노산 잔기」가 20개소 추출된 경우(중복은 없음), 연속하는 4아미노산 잔기의 소수성 지표의 평균값이 2.6 이상이 되는 영역에는, 연속하는 4아미노산 잔기(중복은 없음)가 20 포함되게 되고, p는 20×4=80이다. 또한, 예를 들면, 2개의 「소수성 지표의 평균값이 2.6 이상이 되는 연속하는 4아미노산 잔기」가 1아미노산 잔기만큼 중복하여 존재하는 경우, 연속하는 4아미노산 잔기의 소수성 지표의 평균값이 2.6 이상이 되는 영역에는, 7아미노산 잔기가 포함되게 된다(p=2×4-1=7. 「-1」은 중복분의 공제임.). 예를 들면, 도 4에 나타낸 도메인 서열의 경우, 「소수성 지표의 평균값이 2.6 이상이 되는 연속하는 4아미노산 잔기」가 중복하지 않고 7개 존재하기 때문에, p는 7×4=28이 된다. 또한, 예를 들면, 도 4에 나타낸 도메인 서열의 경우, q는 4+50+4+40+4+10+4+20+4+30=170이다(C말단측의 마지막에 존재하는 (A)n모티프는 포함시키지 않음). 다음으로, p를 q로 나눔으로써, p/q(%)를 산출할 수 있다. 도 4의 경우 28/170=16.47%가 된다.
제5 인공 피브로인에 있어서, p/q는, 6.2% 이상인 것이 바람직하고, 7% 이상인 것이 보다 바람직하고, 10% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 20% 이상인 것이 더욱 보다 바람직하고, 30% 이상인 것이 더욱 보다 또한 바람직하다. p/q의 상한은, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 45% 이하라도 좋다.
제5 인공 피브로인은, 예를 들면, 클로닝한 천연 유래의 피브로인의 아미노산 서열을, 상기의 p/q의 조건을 충족하도록, REP 중의 하나 또는 복수의 친수성 아미노산 잔기(예를 들면, 소수성 지표가 마이너스인 아미노산 잔기)를 소수성 아미노산 잔기(예를 들면, 소수성 지표가 플러스인 아미노산 잔기)로 치환하는 것, 및/또는 REP 중에 하나 또는 복수의 소수성 아미노산 잔기를 삽입함으로써, 국소적으로 소수성 지표가 큰 영역을 포함하는 아미노산 서열에 개변함으로써 얻을 수 있다. 또한, 예를 들면, 천연 유래의 피브로인의 아미노산 서열로부터 상기의 p/q의 조건을 충족하는 아미노산 서열을 설계하고, 설계한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 화학 합성함으로써 얻을 수도 있다. 어느 경우에 있어서도, 천연 유래의 피브로인과 비교하여, REP 중의 하나 또는 복수의 아미노산 잔기가 소수성 지표가 큰 아미노산 잔기로 치환된 것, 및/또는 REP 중에 하나 또는 복수의 소수성 지표가 큰 아미노산 잔기가 삽입된 것에 상당하는 개변에 더하여, 추가로 하나 또는 복수의 아미노산 잔기를 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가한 것에 상당하는 개변을 행해도 좋다.
소수성 지표가 큰 아미노산 잔기로서는, 특별히 제한은 없지만, 이소로이신(I), 발린(V), 로이신(L), 페닐알라닌(F), 시스테인(C), 메티오닌(M) 및 알라닌(A)이 바람직하고, 발린(V), 로이신(L) 및 이소로이신(I)이 보다 바람직하다.
제5 인공 피브로인의 보다 구체적인 예로서, (5-i)서열 번호 19(Met-PRT720), 서열 번호 20(Met-PRT665) 혹은 서열 번호 21(Met-PRT666)로 나타나는 아미노산 서열, 또는 (5-ii)서열 번호 19, 서열 번호 20 혹은 서열 번호 21로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 인공 피브로인을 들 수 있다.
(5-i)의 인공 피브로인에 대해서 설명한다. 서열 번호 19로 나타나는 아미노산 서열은, 서열 번호 7(Met-PRT410)로 나타나는 아미노산 서열에 대하여, C말단측의 단말의 도메인 서열을 제거하고, REP 하나 간격으로 각각 3아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열(VLI)을 2개소 삽입하고, 추가로 일부의 글루타민(Q) 잔기를 세린(S) 잔기로 치환하고, 또한 C말단측의 일부의 아미노산을 결실시킨 것이다. 서열 번호 20으로 나타나는 아미노산 서열은, 서열 번호 8(Met-PRT525)로 나타나는 아미노산 서열에 대하여, REP 하나 간격으로 각각 3아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열(VLI)을 1개소 삽입한 것이다. 서열 번호 21로 나타나는 아미노산 서열은, 서열 번호 8로 나타나는 아미노산 서열에 대하여, REP 하나 간격으로 각각 3아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열(VLI)을 2개소 삽입한 것이다.
(5-i)의 인공 피브로인은, 서열 번호 19, 서열 번호 20 또는 서열 번호 21로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 것이라도 좋다.
(5-ii)의 인공 피브로인은, 서열 번호 19, 서열 번호 20 또는 서열 번호 21로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것이다. (5-ii)의 인공 피브로인도 또한, 식 1: [(A)n모티프-REP]m으로 나타나는 도메인 서열을 포함하는 단백질이다. 상기 서열 동일성은, 95% 이상인 것이 바람직하다.
(5-ii)의 인공 피브로인은, 서열 번호 19, 서열 번호 20 또는 서열 번호 21로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖고, 또한 가장 C말단측에 위치하는 (A)n모티프에서 도메인 서열의 C말단까지의 서열을 도메인 서열로부터 제거한 서열에 포함되는 모든 REP에 있어서, 연속하는 4아미노산 잔기의 소수성 지표의 평균값이 2.6 이상이 되는 영역에 포함되는 아미노산 잔기의 총수를 p로 하고, 가장 C말단측에 위치하는 (A)n모티프에서 도메인 서열의 C말단까지의 서열을 도메인 서열로부터 제거한 서열에 포함되는 아미노산 잔기의 총수를 q로 했을 때에, p/q가 6.2% 이상인 것이 바람직하다.
제5 인공 피브로인은, N말단 및 C말단의 어느 한쪽 또는 양쪽에 태그 서열을 포함하고 있어도 좋다.
태그 서열을 포함하는 인공 피브로인의 보다 구체적인 예로서, (5-iii)서열 번호 22(PRT720), 서열 번호 23(PRT665) 혹은 서열 번호 24(PRT666)로 나타나는 아미노산 서열, 또는 (5-iv)서열 번호 22, 서열 번호 23 혹은 서열 번호 24로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 인공 피브로인을 들 수 있다.
서열 번호 22, 서열 번호 23 및 서열 번호 24로 나타나는 아미노산 서열은, 각각 서열 번호 19, 서열 번호 20 및 서열 번호 21로 나타나는 아미노산 서열의 N말단에 서열 번호 11로 나타나는 아미노산 서열(His 태그 서열 및 힌지 서열을 포함함)을 부가한 것이다.
(5-iii)의 인공 피브로인은, 서열 번호 22, 서열 번호 23 또는 서열 번호 24로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 것이라도 좋다.
(5-iv)의 인공 피브로인은, 서열 번호 22, 서열 번호 23 또는 서열 번호 24로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것이다. (5-iv)의 인공 피브로인도 또한, 식 1: [(A)n모티프-REP]m으로 나타나는 도메인 서열을 포함하는 단백질이다. 상기 서열 동일성은, 95% 이상인 것이 바람직하다.
(5-iv)의 인공 피브로인은, 서열 번호 22, 서열 번호 23 또는 서열 번호 24로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖고, 또한 가장 C말단측에 위치하는 (A)n모티프에서 도메인 서열의 C말단까지의 서열을 도메인 서열로부터 제거한 서열에 포함되는 모든 REP에 있어서, 연속하는 4아미노산 잔기의 소수성 지표의 평균값이 2.6 이상이 되는 영역에 포함되는 아미노산 잔기의 총수를 p로 하고, 가장 C말단측에 위치하는 (A)n모티프에서 도메인 서열의 C말단까지의 서열을 도메인 서열로부터 제거한 서열에 포함되는 아미노산 잔기의 총수를 q로 했을 때에, p/q가 6.2% 이상인 것이 바람직하다.
제5 인공 피브로인은, 인공 단백질 생산계에 있어서 생산된 단백질을 숙주의 외부에 방출하기 위한 분비 시그널을 포함하고 있어도 좋다. 분비 시그널의 서열은, 숙주의 종류에 따라 적절히 설정할 수 있다.
제6 인공 피브로인은, 천연 유래의 피브로인과 비교하여, 글루타민 잔기의 함유량이 저감된 아미노산 서열을 갖는다.
제6 인공 피브로인은, REP의 아미노산 서열 중에, GGX 모티프 및 GPGXX 모티프로부터 선택되는 적어도 하나의 모티프가 포함되어 있는 것이 바람직하다.
제6 인공 피브로인이, REP 중에 GPGXX 모티프를 포함하는 경우, GPGXX 모티프 함유율은, 통상 1% 이상이며, 5% 이상이라도 좋고, 10% 이상인 것이 바람직하다. GPGXX 모티프 함유율의 상한에 특별히 제한은 없고, 50% 이하라도 좋고, 30% 이하라도 좋다.
본 명세서에 있어서, 「GPGXX 모티프 함유율」은, 이하의 방법에 의해 산출되는 값이다.
식 1: [(A)n모티프-REP]m, 또는 식 2: [(A)n모티프-REP]m-(A)n모티프로 나타나는 도메인 서열을 포함하는 피브로인(인공 피브로인 또는 천연 유래의 피브로인)에 있어서, 가장 C말단측에 위치하는 (A)n모티프에서 도메인 서열의 C말단까지의 서열을 도메인 서열로부터 제거한 서열에 포함되는 모든 REP에 있어서, 그 영역에 포함되는 GPGXX 모티프의 개수의 총수를 3배한 수(즉, GPGXX 모티프 중의 G 및 P의 총수에 상당)를 s로 하고, 가장 C말단측에 위치하는 (A)n모티프에서 도메인 서열의 C말단까지의 서열을 도메인 서열로부터 제거하고, 추가로 (A)n모티프를 제거한 전체 REP의 아미노산 잔기의 총수를 t로 했을 때에, GPGXX 모티프 함유율은 s/t로서 산출된다.
GPGXX 모티프 함유율의 산출에 있어서, 「가장 C말단측에 위치하는 (A)n모티프에서 도메인 서열의 C말단까지의 서열을 도메인 서열로부터 제거한 서열」을 대상으로 하고 있는 것은, 「가장 C말단측에 위치하는 (A)n모티프에서 도메인 서열의 C말단까지의 서열」(REP에 상당하는 서열)에는, 피브로인에 특징적인 서열과 상관성이 낮은 서열이 포함되는 경우가 있고, m이 작은 경우(즉, 도메인 서열이 짧은 경우), GPGXX 모티프 함유율의 산출 결과에 영향을 주기 때문에, 이 영향을 배제하기 위함이다. 또한, REP의 C말단에 「GPGXX 모티프」가 위치하는 경우, 「XX」가 예를 들면, 「AA」의 경우라도, 「GPGXX 모티프」로 취급한다.
도 1은, 인공 피브로인의 도메인 서열을 나타내는 모식도이다. 도 1을 참조하면서 GPGXX 모티프 함유율의 산출 방법을 구체적으로 설명한다. 우선, 도 1에 나타낸 인공 피브로인의 도메인 서열(「[(A)n모티프-REP]m-(A)n모티프」 타입임.)에서는, 모든 REP가 「가장 C말단측에 위치하는 (A)n모티프에서 도메인 서열의 C말단까지의 서열을 도메인 서열로부터 제거한 서열」(도 1 중, 「영역 A」에서 나타낸 서열.)에 포함되어 있기 때문에, s를 산출하기 위한 GPGXX 모티프의 개수는 7이며, s는 7×3=21이 된다. 마찬가지로, 모든 REP가 「가장 C말단측에 위치하는 (A)n모티프에서 도메인 서열의 C말단까지의 서열을 도메인 서열로부터 제거한 서열」(도 1중, 「영역 A」에서 나타낸 서열.)에 포함되어 있기 때문에, 당해 서열로부터 추가로 (A)n모티프를 제거한 전체 REP의 아미노산 잔기의 총수 t는 50+40+10+20+30=150이다. 다음으로, s를 t로 나눔으로써, s/t(%)를 산출할 수 있고, 도 1의 인공 피브로인의 경우 21/150=14.0%가 된다.
제6 인공 피브로인은, 글루타민 잔기 함유율이 9% 이하인 것이 바람직하고, 7% 이하인 것이 보다 바람직하고, 4% 이하인 것이 더욱 바람직하고, 0%인 것이 특히 바람직하다.
본 명세서에 있어서, 「글루타민 잔기 함유율」은, 이하의 방법에 의해 산출되는 값이다.
식 1: [(A)n모티프-REP]m, 또는 식 2: [(A)n모티프-REP]m-(A)n모티프로 나타나는 도메인 서열을 포함하는 피브로인(인공 피브로인 또는 천연 유래의 피브로인)에 있어서, 가장 C말단측에 위치하는 (A)n모티프에서 도메인 서열의 C말단까지의 서열을 도메인 서열로부터 제거한 서열(도 1의 「영역 A」에 상당하는 서열.)에 포함되는 모든 REP에 있어서, 그 영역에 포함되는 글루타민 잔기의 총수를 u로 하고, 가장 C말단측에 위치하는 (A)n모티프에서 도메인 서열의 C말단까지의 서열을 도메인 서열로부터 제거하고, 추가로 (A)n모티프를 제거한 전체 REP의 아미노산 잔기의 총수를 t로 했을 때에, 글루타민 잔기 함유율은 u/t로서 산출된다. 글루타민 잔기 함유율의 산출에 있어서, 「가장 C말단측에 위치하는 (A)n모티프에서 도메인 서열의 C말단까지의 서열을 도메인 서열로부터 제거한 서열」을 대상으로 하고 있는 이유는, 전술한 이유와 동일하다.
제6 인공 피브로인은, 그 도메인 서열이, 천연 유래의 피브로인과 비교하여, REP 중의 하나 또는 복수의 글루타민 잔기를 결실한 것, 또는 다른 아미노산 잔기로 치환한 것에 상당하는 아미노산 서열을 갖는 것이라도 좋다.
「다른 아미노산 잔기」는, 글루타민 잔기 이외의 아미노산 잔기이면 좋지만, 글루타민 잔기보다도 소수성 지표가 큰 아미노산 잔기인 것이 바람직하다. 아미노산 잔기의 소수성 지표는 표 1에 나타내는 대로이다.
표 1에 나타내는 대로, 글루타민 잔기보다도 소수성 지표가 큰 아미노산 잔기로서는, 이소로이신(I), 발린(V), 로이신(L), 페닐알라닌(F), 시스테인(C), 메티오닌(M), 알라닌(A), 글리신(G), 트레오닌(T), 세린(S), 트립토판(W), 타이로신(Y), 프롤린(P) 및 히스티딘(H)으로부터 선택되는 아미노산 잔기를 들 수 있다. 이들 중에서도, 이소로이신(I), 발린(V), 로이신(L), 페닐알라닌(F), 시스테인(C), 메티오닌(M) 및 알라닌(A)으로부터 선택되는 아미노산 잔기인 것이 보다 바람직하고, 이소로이신(I), 발린(V), 로이신(L) 및 페닐알라닌(F)으로부터 선택되는 아미노산 잔기인 것이 더욱 바람직하다.
제6 인공 피브로인은, REP의 소수성도(하이드로퍼시·인덱스)가, 예를 들면, -0.80 이상, -0.70, -0.60 이상, -0.50 이상, -0.40 이상, -0.30 이상, -0.20 이상, -0.10 이상, 0.00 이상, 0.10 이상, 0.20 이상, 0.22 이상, 0.25 이상, 0.30 이상, 0.35 이상, 0.40 이상, 0.45 이상, 0.50 이상, 0.55 이상, 0.60 이상, 0.65 이상, 또는 0.70 이상이라도 좋다. REP의 소수성도의 상한에 특별히 제한은 없고, 1.0 이하라도 좋고, 0.7 이하라도 좋다.
본 명세서에 있어서, 「REP의 소수성도」는, 이하의 방법에 의해 산출되는 값이다.
식 1: [(A)n모티프-REP]m, 또는 식 2: [(A)n모티프-REP]m-(A)n모티프로 나타나는 도메인 서열을 포함하는 피브로인(인공 피브로인 또는 천연 유래의 피브로인)에 있어서, 가장 C말단측에 위치하는 (A)n모티프에서 도메인 서열의 C말단까지의 서열을 도메인 서열로부터 제거한 서열(도 1의 「영역 A」에 상당하는 서열.)에 포함되는 모든 REP에 있어서, 그 영역의 각 아미노산 잔기의 소수성 지표의 총합을 v로 하고, 가장 C말단측에 위치하는 (A)n모티프에서 도메인 서열의 C말단까지의 서열을 도메인 서열로부터 제거하고, 추가로 (A)n모티프를 제거한 전체 REP의 아미노산 잔기의 총수를 t로 했을 때에, REP의 소수성도는 v/t로서 산출된다. REP의 소수성도의 산출에 있어서, 「가장 C말단측에 위치하는 (A)n모티프에서 도메인 서열의 C말단까지의 서열을 도메인 서열로부터 제거한 서열」을 대상으로 하고 있는 이유는, 전술한 이유와 동일하다.
제6 인공 피브로인은, 그 도메인 서열이, 천연 유래의 피브로인과 비교하여, REP 중의 하나 또는 복수의 글루타민 잔기를 결실한 것, 및/또는 REP 중의 하나 또는 복수의 글루타민 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환한 것에 상당하는 개변에 더하여, 추가로 하나 또는 복수의 아미노산 잔기를 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가한 것에 상당하는 아미노산 서열의 개변이 있어도 좋다.
제6 인공 피브로인은, 예를 들면, 클로닝한 천연 유래의 피브로인의 유전자 서열로부터 REP 중의 하나 또는 복수의 글루타민 잔기를 결실 시키는 것, 및/또는 REP 중의 하나 또는 복수의 글루타민 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환함으로써 얻을 수 있다. 또한, 예를 들면, 천연 유래의 피브로인의 아미노산 서열로부터 REP 중의 하나 또는 복수의 글루타민 잔기를 결실한 것, 및/또는 REP 중의 하나 또는 복수의 글루타민 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환한 것에 상당하는 아미노산 서열을 설계하고, 설계한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 화학 합성함으로써 얻을 수도 있다.
제6 인공 피브로인의 보다 구체적인 예로서, (6-i)서열 번호 25(Met-PRT888), 서열 번호 26(Met-PRT965), 서열 번호 27(Met-PRT889), 서열 번호 28(Met-PRT916), 서열 번호 29(Met-PRT918), 서열 번호 30(Met-PRT699), 서열 번호 31(Met-PRT698), 서열 번호 32(Met-PRT966), 서열 번호 41(Met-PRT917) 혹은 서열 번호 42(Met-PRT1028)로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 인공 피브로인, 또는 (6-ii)서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 41혹은 서열 번호 42로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 인공 피브로인을 들 수 있다.
(6-i)의 인공 피브로인에 대해서 설명한다. 서열 번호 25로 나타나는 아미노산 서열은, 서열 번호 7로 나타나는 아미노산 서열(Met-PRT410) 중의 QQ를 모두 VL로 치환한 것이다. 서열 번호 26으로 나타나는 아미노산 서열은, 서열 번호 7로 나타나는 아미노산 서열 중의 QQ를 모두 TS로 치환하고, 또한 나머지의 Q를 A로 치환한 것이다. 서열 번호 27로 나타나는 아미노산 서열은, 서열 번호 7로 나타나는 아미노산 서열 중의 QQ를 모두 VL로 치환하고, 또한 나머지의 Q를 I로 치환한 것이다. 서열 번호 28로 나타나는 아미노산 서열은, 서열 번호 7로 나타나는 아미노산 서열 중의 QQ를 모두 VI로 치환하고, 또한 나머지의 Q를 L로 치환한 것이다. 서열 번호 29로 나타나는 아미노산 서열은, 서열 번호 7로 나타나는 아미노산 서열 중의 QQ를 모두 VF로 치환하고, 또한 나머지의 Q를 I로 치환한 것이다.
서열 번호 30으로 나타나는 아미노산 서열은, 서열 번호 8로 나타나는 아미노산 서열(Met-PRT525) 중의 QQ를 모두 VL로 치환한 것이다. 서열 번호 31로 나타나는 아미노산 서열은, 서열 번호 8로 나타나는 아미노산 서열 중의 QQ를 모두 VL로 치환하고, 또한 나머지의 Q를 I로 치환한 것이다.
서열 번호 32로 나타나는 아미노산 서열은, 서열 번호 7로 나타나는 아미노산 서열(Met-PRT410) 중에 존재하는 20개의 도메인 서열의 영역을 2회 반복한 서열 중의 QQ를 모두 VF로 치환하고, 또한 나머지의 Q를 I로 치환한 것이다.
서열 번호 41로 나타나는 아미노산 서열(Met-PRT917)은, 서열 번호 7로 나타나는 아미노산 서열 중의 QQ를 모두 LI로 치환하고, 또한 나머지의 Q를 V로 치환한 것이다. 서열 번호 42로 나타나는 아미노산 서열(Met-PRT1028)은, 서열 번호 7로 나타나는 아미노산 서열 중의 QQ를 모두 IF로 치환하고, 또한 나머지의 Q를 T로 치환한 것이다.
서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 41 및 서열 번호 42로 나타나는 아미노산 서열은, 모두 글루타민 잔기 함유율은 9% 이하이다(표 2).
(6-i)의 인공 피브로인은, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 41 또는 서열 번호 42로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 것이라도 좋다.
(6-ii)의 인공 피브로인은, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 41 또는 서열 번호 42로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것이다. (6-ii)의 인공 피브로인도 또한, 식 1: [(A)n모티프-REP]m, 또는 식 2: [(A)n모티프-REP]m-(A)n모티프로 나타나는 도메인 서열을 포함하는 단백질이다. 상기 서열 동일성은, 95% 이상인 것이 바람직하다.
(6-ii)의 인공 피브로인은, 글루타민 잔기 함유율이 9% 이하인 것이 바람직하다. 또한, (6-ii)의 인공 피브로인은, GPGXX 모티프 함유율이 10% 이상인 것이 바람직하다.
제6 인공 피브로인은, N말단 및 C말단의 어느 한쪽 또는 양쪽에 태그 서열을 포함하고 있어도 좋다. 이에 따라, 인공 피브로인의 단리, 고정화, 검출 및 가시화 등이 가능하게 된다.
태그 서열을 포함하는 인공 피브로인의 보다 구체적인 예로서, (6-iii)서열 번호 33(PRT888), 서열 번호 34(PRT965), 서열 번호 35(PRT889), 서열 번호 36(PRT916), 서열 번호 37(PRT918), 서열 번호 38(PRT699), 서열 번호 39(PRT698), 서열 번호 40(PRT966), 서열 번호 43(PRT917) 혹은 서열 번호 44(PRT1028)로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 인공 피브로인, 또는 (6-iv)서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 37, 서열 번호 38, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 43 혹은 서열 번호 44로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 인공 피브로인을 들 수 있다.
서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 37, 서열 번호 38, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 43 및 서열 번호 44로 나타나는 아미노산 서열은, 각각 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 41 및 서열 번호 42로 나타나는 아미노산 서열의 N말단에 서열 번호 11로 나타나는 아미노산 서열(His 태그 서열 및 힌지 서열을 포함함)을 부가한 것이다. N말단에 태그 서열을 부가한 것 뿐이기 때문에, 글루타민 잔기 함유율에 변화는 없고, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 37, 서열 번호 38, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 43 및 서열 번호 44로 나타나는 아미노산 서열은, 모두 글루타민 잔기 함유율이 9% 이하이다(표 3).
(6-iii)의 인공 피브로인은, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 37, 서열 번호 38, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 43 또는 서열 번호 44로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 것이라도 좋다.
(6-iv)의 인공 피브로인은, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 37, 서열 번호 38, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 43 또는 서열 번호 44로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것이다. (6-iv)의 인공 피브로인도 또한, 식 1: [(A)n모티프-REP]m, 또는 식 2: [(A)n모티프-REP]m-(A)n모티프로 나타나는 도메인 서열을 포함하는 단백질이다. 상기 서열 동일성은, 95% 이상인 것이 바람직하다.
(6-iv)의 인공 피브로인은, 글루타민 잔기 함유율이 9% 이하인 것이 바람직하다. 또한, (6-iv)의 인공 피브로인은, GPGXX 모티프 함유율이 10% 이상인 것이 바람직하다.
제6 인공 피브로인은, 인공 단백질 생산계에 있어서 생산된 단백질을 숙주의 외부에 방출하기 위한 분비 시그널을 포함하고 있어도 좋다. 분비 시그널의 서열은, 숙주의 종류에 따라 적절히 설정할 수 있다.
인공 피브로인은, 제1 인공 피브로인, 제2 인공 피브로인, 제3 인공 피브로인, 제4 인공 피브로인, 제5 인공 피브로인, 및 제6 인공 피브로인이 갖는 특징 중, 적어도 2개 이상의 특징을 겸비하는 인공 피브로인이라도 좋다.
본 실시 형태에 따른 인공 피브로인은 또한, 식 1: [(A)n 모티프-REP]m, 또는 식 2: [(A)n 모티프-REP]m-(A)n 모티프로 나타나는 도메인 서열을 포함하는 단백질이라도 좋다. 인공 피브로인은, 도메인 서열의 N말단측 및 C말단측의 어느 한쪽 또는 양쪽에 추가로 아미노산 서열(N말단 서열 및 C말단 서열)이 부가되어 있어도 좋다. N말단 서열 및 C말단 서열은, 이것에 한정되는 것은 아니지만, 전형적으로는, 피브로인에 특징적인 아미노산 모티프의 반복을 갖지 않는 영역이며, 100 잔기 정도의 아미노산으로 이루어진다.
본 명세서에 있어서 「도메인 서열」이란, 피브로인 특유의 결정 영역(전형적으로는, 아미노산 서열의 (A)n모티프에 상당함.)과 비결정 영역(전형적으로는, 아미노산 서열의 REP에 상당함.)을 생기게 하는 아미노산 서열이며, 식 1: [(A)n모티프-REP]m, 또는 식 2: [(A)n모티프-REP]m-(A)n모티프로 나타나는 아미노산 서열을 의미한다. 여기에서, (A)n모티프는 4∼27아미노산 잔기로 구성되는 아미노산 서열을 나타내고, 또한 (A)n모티프 중의 전체 아미노산 잔기수에 대한 알라닌 잔기수가 80% 이상이다. REP는 10∼200아미노산 잔기로 구성되는 아미노산 서열을 나타낸다. m은 10∼300의 정수를 나타낸다. m은, 20∼300의 정수인 것이 바람직하고, 30∼300의 정수인 것이 보다 바람직하다. 복수 존재하는 (A)n모티프는, 서로 동일한 아미노산 서열이라도 좋고, 상이한 아미노산 서열이라도 좋다. 복수 존재하는 REP는, 서로 동일한 아미노산 서열이라도 좋고, 상이한 아미노산 서열이라도 좋다.
도메인 서열 중에 복수 존재하는 (A)n모티프는, 적어도 7개가 알라닌 잔기만으로 구성되는 것이 바람직하다. 알라닌 잔기만으로 구성된다란, (A)n모티프가, (Ala)k(Ala는 알라닌 잔기를 나타냄.)로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것을 의미한다. k은, 바람직하게는 4∼27의 정수, 보다 바람직하게는 4∼20의 정수, 더욱 바람직하게는 4∼16의 정수를 나타낸다.
REP는, 10∼200아미노산 잔기로 구성된다. REP를 구성하는 아미노산 잔기의 1 이상이, 글리신 잔기, 세린 잔기, 및 알라닌 잔기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기라도 좋다. 즉, REP는, 글리신 잔기, 세린 잔기, 및 알라닌 잔기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기를 포함하고 있어도 좋다.
REP를 구성하는 아미노산 잔기의 1 이상이, 소수성 아미노산 잔기라도 좋다. 즉, REP는, 소수성 아미노산 잔기를 포함하고 있는 것이 바람직하다. 소수성 아미노산 잔기란, 소수성 지표가 플러스인 아미노산 잔기를 의미한다. 아미노산 잔기의 소수성 지표(하이드로퍼시·인덱스, 이하 「HI」라고도 기재함.)에 대해서는, 공지의 지표 공지의 지표(Hydropathy index: Kyte J, & Doolittle R(1982) “A simple method for displaying the hydropathic character of a protein”, J. Mol. Biol., 157, pp.105-132)를 사용한다. 소수성 아미노산 잔기로서는, 예를 들면, 이소로이신(HI: 4.5), 발린(HI: 4.2), 로이신(HI: 3.8), 페닐알라닌(HI: 2.8), 메티오닌(HI: 1.9), 알라닌(HI: 1.8)을 들 수 있다.
본 실시 형태에 따른 인공 피브로인에 있어서, 도메인 서열은, 천연 유래의 피브로인과 비교하여, REP 중에 시스테인 잔기가 삽입된 것에 상당하는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하다.
도메인 서열은, REP 중의 글리신 잔기, 세린 잔기, 또는 알라닌 잔기와 이웃하는 위치에, 시스테인 잔기가 삽입된 것에 상당하는 아미노산 서열을 갖고 있는 것이 바람직하고, REP 중의 글리신 잔기와 이웃하는 위치에, 시스테인 잔기가 삽입된 것에 상당하는 아미노산 서열을 갖고 있는 것이 보다 바람직하다. REP 중의 시스테인 잔기는, 글리신 잔기, 세린 잔기, 또는 알라닌 잔기와, 글리신 잔기, 세린 잔기, 또는 알라닌 잔기와의 사이에 위치하고 있어도 좋고 세린 잔기와, 글리신 잔기의 사이에 위치하고 있어도 좋다.
도메인 서열은, REP 중의 소수성 아미노산 잔기와 이웃하는 위치에, 시스테인 잔기가 삽입된 것에 상당하는 아미노산 서열을 갖고 있는 것이 바람직하다. 이 경우, 분자간에서 소수성 아미노산 잔기끼리가 소수적 상호작용에 의해 고정된다. REP 중의 시스테인 잔기는, 소수성 아미노산 잔기의 옆에 위치하고 있어도 좋고, 소수성 아미노산 잔기와, 소수성 아미노산 잔기 이외의 아미노산 잔기의 사이에, 위치하고 있어도 좋고, 소수성 아미노산 잔기와, 글리신 잔기, 세린 잔기, 또는 알라닌 잔기의 사이에 위치하고 있어도 좋고 소수성 아미노산 잔기와, 글리신 잔기의 사이에 위치하고 있어도 좋다. 소수성 아미노산 잔기는, 이소로이신 잔기, 발린 잔기, 로이신 잔기, 페닐알라닌 잔기, 메티오닌 잔기, 및 알라닌 잔기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종이라도 좋다.
도메인 서열은, 천연 유래의 피브로인과 비교하여, 도메인 서열의 N말단 및/또는 C말단의 근방에 위치하는 REP 중에, 시스테인 잔기가 삽입된 것에 상당하는 아미노산 서열을 갖고 있어도 좋다. 이 경우, 분자쇄를 길게 할 수 있다. 본 명세서에 있어서, 도메인 서열의 N말단의 근방에 위치하는 REP란, 도메인 서열의 N말단으로부터 1∼3번째에 위치하는 REP를 의미한다. 예를 들면, 시스테인 잔기는, 도메인 서열의 N말단으로부터 1∼2번째에 위치하는 REP 중에 위치하고 있어도 좋다. 본 명세서에 있어서, 도메인 서열의 C말단의 근방에 위치하는 REP란, 도메인 서열의 C말단으로부터 1∼3번째에 위치하는 REP를 의미한다. 예를 들면, 시스테인 잔기는, 도메인 서열의 C말단으로부터 1∼2번째에 위치하는 REP 중에 위치하고 있어도 좋다. 시스테인 잔기는, 도메인 서열의 가장 N말단측 및/또는 가장 C말단측에 위치하는 REP 중에 위치하고 있는 것이 바람직하다.
도메인 서열은, 천연 유래의 피브로인과 비교하여, REP 중의 중앙 또는 중앙 근방에 시스테인 잔기가 삽입된 것에 상당하는 아미노산 서열을 갖고 있어도 좋다. 본 명세서에 있어서, REP 중의 아미노산 서열의 중앙 근방이란, REP의 중앙에 위치하는 아미노산 잔기(중앙에 위치하는 아미노산 잔기가 2개 존재하는 경우에는 N말단측의 아미노산 잔기)로부터 N말단측을 향하여 1∼5번째의 위치, 또는 REP의 중앙에 위치하는 아미노산 잔기(중앙에 위치하는 아미노산 잔기가 2개 존재하는 경우에는C말단측의 아미노산 잔기)부터 1∼5번째의 위치를 나타낸다. 예를 들면, 시스테인 잔기는, REP의 중앙에 위치하고 있어도 좋고, REP의 중앙에 위치하는 아미노산 잔기로부터 N말단측, 또는 C말단측을 향하여 1∼3번째 또는 1∼2번째에 위치하고 있어도 좋다. 여기에 있어서, 시스테인 잔기가, 예를 들면, 도메인 서열의 N말단측과 C말단측에 각각 하나씩 위치하도록 삽입된 폴리펩티드 골격을 포함하는 제1 세그먼트를 사용하는 경우, 그러한 제1 세그먼트와 제2 세그먼트가 교대로 하나씩 위치하도록 연결시켜 이루어지는 합성 고분자를 얻을 수 있다. 이 합성 고분자를 사용하여 얻어지는 성형체(예를 들면, 섬유나 필름, 겔 등)에서는, 신도의 향상이 기대될 수 있다. 또한, 시스테인 잔기가, 예를 들면, 도메인 서열의 N말단측이나 C말단측보다도 중앙부측에 위치하도록 삽입된 폴리펩티드 골격을 포함하는 제1 세그먼트를 사용하는 경우, 그러한 제1 세그먼트에 대하여 제2 세그먼트가 연결되어 이루어지는 합성 자분자에서는, 용매에 대한 용해도의 향상이 기대될 수 있다.
인공 피브로인은, REP의 아미노산 서열 중에, GPGXX 모티프(G는 글리신 잔기, P는 프롤린 잔기, X는 글리신 잔기 이외의 아미노산 잔기를 나타냄.)를 포함하는 것이 바람직하다. REP 중에 이 모티프가 포함됨으로써, 인공 피브로인의 신도를 향상시킬 수 있다.
인공 피브로인이, REP 중에 GPGXX 모티프를 포함하는 경우, GPGXX 모티프 함유율은, 통상 1% 이상이며, 5% 이상이라도 좋고, 바람직하게는 10% 이상이다. 이 경우, 인공 피브로인 섬유의 응력이 보다 한층 높아진다. GPGXX 모티프 함유율의 상한에 특별히 제한은 없고, 50% 이하라도 좋고, 30% 이하라도 좋다.
본 명세서에 있어서, 「GPGXX 모티프 함유율」은, 이하의 방법에 의해 산출되는 값이다. 식 1: [(A)n모티프-REP]m, 또는 식 2: [(A)n모티프-REP]m-(A)n모티프로 나타나는 도메인 서열을 포함하는 피브로인에 있어서, 가장 C말단측에 위치하는 (A)n모티프에서 도메인 서열의 C말단까지의 서열을 도메인 서열로부터 제거한 서열에 포함되는 모든 REP에 있어서, 그 영역에 포함되는 GPGXX 모티프의 개수의 총수를 3배한 수(즉, GPGXX 모티프 중의 G 및 P의 총수에 상당)를 c로 하고, 가장 C말단측에 위치하는 (A)n모티프에서 도메인 서열의 C말단까지의 서열을 도메인 서열로부터 제거하고, 추가로 (A)n모티프를 제거한 전체 REP의 아미노산 잔기의 총수를 d로 했을 때에, GPGXX 모티프 함유율은 c/d로서 산출된다.
GPGXX 모티프 함유율의 산출에 있어서, 「가장 C말단측에 위치하는 (A)n모티프에서 도메인 서열의 C말단까지의 서열을 도메인 서열로부터 제거한 서열」을 대상으로 하고 있는 것은, 「가장 C말단측에 위치하는 (A)n모티프에서 도메인 서열의 C말단까지의 서열」(REP에 상당하는 서열)에는, 피브로인에 특징적인 서열과 상관성이 낮은 서열이 포함되는 경우가 있고, m이 작은 경우(즉, 도메인 서열이 짧은 경우), GPGXX 모티프 함유율의 산출 결과에 영향을 주기 때문에, 이 영향을 배제하기 위함이다. 또한, REP의 C말단에 「GPGXX 모티프」가 위치하는 경우, 「XX」가 예를 들면 「AA」의 경우라도, 「GPGXX 모티프」로서 취급한다.
도 5는, 피브로인의 도메인 서열을 나타내는 모식도이다. 도 5를 참조하면서 GPGXX 모티프 함유율의 산출 방법을 구체적으로 설명한다. 우선, 도 5에 나타낸 피브로인의 도메인 서열(「[(A)n모티프-REP]m-(A)n모티프」 타입임.)에서는 모든 REP가 「가장 C말단측에 위치하는 (A)n모티프에서 도메인 서열의 C말단까지의 서열을 도메인 서열로부터 제거한 서열」(도 5 중, 「영역 A」에서 나타낸 서열.)에 포함되어 있기 때문에, c를 산출하기 위한 GPGXX 모티프의 개수는 7이며, c는 7×3=21이 된다. 마찬가지로, 모든 REP가 「가장 C말단측에 위치하는 (A)n모티프에서 도메인 서열의 C말단까지의 서열을 도메인 서열로부터 제거한 서열」(도 5중, 「영역 A」에서 나타낸 서열.)에 포함되어 있기 때문에, 당해 서열로부터 추가로 (A)n모티프를 제거한 전체 REP의 아미노산 잔기의 총수 d는 50+40+10+20+30=150이다. 다음으로, c를 d로 나눔으로써, c/d(%)를 산출할 수 있고, 도 5의 피브로인의 경우 21/150=14.0%가 된다.
인공 피브로인은, REP의 소수성도(하이드로퍼시·인덱스: 소수성 지표)가, 예를 들면, -0.80, -0.70, -0.06 이상, -0.50 이상, -0.40 이상, -0.30 이상, -0.20 이상, -0.10 이상, 0.00 이상, 0.10 이상, 0.20 이상, 0.22 이상, 0.25 이상, 0.30 이상, 0.35 이상, 0.40 이상, 0.45 이상, 0.50 이상, 0.55 이상, 0.60 이상, 0.65 이상, 0.70 이상이라도 좋다. REP의 소수성도의 상한에 특별히 제한은 없고, 1.0 이하라도 좋고, 0.7 이하라도 좋다.
본 명세서에 있어서, 「REP의 소수성도」는, 이하의 방법에 의해 산출되는 값이다. 식 1: [(A)n모티프-REP]m, 또는 식 2: [(A)n모티프-REP]m-(A)n모티프로 나타나는 도메인 서열을 포함하는 피브로인에 있어서, 가장 C말단측에 위치하는 (A)n모티프에서 도메인 서열의 C말단까지의 서열을 도메인 서열로부터 제거한 서열(도 5의 「영역 A」에 상당하는 서열.)에 포함되는 모든 REP에 있어서, 그 영역의 각 아미노산 잔기의 소수성 지표의 총합을 e로 하고, 가장 C말단측에 위치하는 (A)n모티프에서 도메인 서열의 C말단까지의 서열을 도메인 서열로부터 제거하고, 추가로 (A)n모티프를 제거한 전체 REP의 아미노산 잔기의 총수를 f로 했을 때에, REP의 소수성도는 e/f로서 산출된다. REP의 소수성도의 산출에 있어서, 「가장 C말단측에 위치하는 (A)n모티프에서 도메인 서열의 C말단까지의 서열을 도메인 서열로부터 제거한 서열」을 대상으로 하고 있는 이유는, 전술한 이유와 동일하다.
도메인 서열은, 천연 유래의 피브로인과 비교하여, REP 중에 1 이상 16 미만의 시스테인 잔기가 삽입된 것에 상당하는 아미노산 서열을 갖고 있어도 좋다. 즉, REP에 삽입한 것에 상당하는 시스테인 잔기의 총수는, 1 이상 16 미만이라도 좋다. REP 중에 삽입한 것에 상당하는 시스테인 잔기의 총수는, 1 이상 12 이하, 1 이상 10 이하, 1 이상 8 이하, 1 이상 6 이하, 또는 2 이상 4 이하라도 좋다. 도메인 서열 중의 REP하나당의 시스테인 잔기수는, 예를 들면, 1∼3이라도 좋고, 1∼2라도 좋고, 1이라도 좋다.
본 실시 형태에 따른 인공 피브로인의 시스테인 잔기의 총수는, 1 이상 16 미만, 1 이상 12 이하, 1 이상 10 이하, 1 이상 8 이하, 1 이상 6 이하, 또는 2 이상 4 이하라도 좋다.
본 실시 형태에 따른 인공 피브로인은, 전술한 REP 중의 시스테인 잔기에 관한 개변에 더하여, 천연 유래의 피브로인과 비교하여, 하나 또는 복수의 아미노산 잔기를 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가한 것에 상당하는 아미노산 서열의 개변이 추가로 있어도 좋다.
본 실시 형태에 따른 인공 피브로인의 분자량은, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 10kDa 이상 700kDa 이하라도 좋다. 본 실시 형태에 따른 인공 피브로인의 분자량은, 예를 들면, 2kDa 이상, 3kDa 이상, 4kDa 이상, 5kDa 이상, 6kDa 이상, 7kDa 이상, 8kDa 이상, 9kDa 이상, 10kDa 이상, 20kDa 이상, 30kDa 이상, 40kDa 이상, 50kDa 이상, 60kDa 이상, 70kDa 이상, 80kDa 이상, 90kDa 이상, 또는 100kDa 이상이라도 좋고, 600kDa 이하, 500kDa 이하, 400kDa 이하, 360kDa미만, 300kDa 이하, 또는 200kDa 이하라도 좋다.
본 실시 형태에 따른 인공 피브로인으로서는, 시스테인 잔기가 삽입된 것에 상당하는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하고, 당해 인공 피브로인의 보다 구체적인 예로서, (i)서열 번호 46, 서열 번호 47, 서열 번호 48, 서열 번호 49, 서열 번호 50, 또는 서열 번호 51로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는, 인공 피브로인, 또는 (ii)서열 번호 52, 서열 번호 53, 서열 번호 54, 또는 서열 번호 55로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는, 인공 피브로인을 들 수 있다.
서열 번호 46으로 나타나는 아미노산 서열(PRT1)은, 서열 번호 56으로 나타나는 아미노산 서열(PRT11)에 대하여, 도메인 서열의 가장 N말단측에 위치하는 REP에, 시스테인 잔기를 1개소 삽입한 것이다. 즉, 서열 번호 46으로 나타나는 아미노산 서열(PRT1)에 있어서의 시스테인 잔기의 총수는 1이다.
서열 번호 47로 나타나는 아미노산 서열(PRT2)은, 서열 번호 57로 나타나는 아미노산 서열(PRT12)에 대하여, 도메인 서열의 가장 N말단측에 위치하는 REP에, 시스테인 잔기를 1개소 삽입한 것이다. 즉, 서열 번호 47로 나타나는 아미노산 서열(PRT2)에 있어서의 시스테인 잔기의 총수는 1이다.
서열 번호 48로 나타나는 아미노산 서열(PRT3)은, 서열 번호 57로 나타나는 아미노산 서열(PRT12)에 대하여, 도메인 서열의 가장 N말단측에 위치하는 REP 및 가장 C말단측에 위치하는 REP에, 시스테인 잔기를 각각 1개소 삽입한 것이다. 즉, 서열 번호 48로 나타나는 아미노산 서열(PRT3)에 있어서의 시스테인 잔기의 총수는 2이다.
서열 번호 49로 나타나는 아미노산 서열(PRT4)은, 서열 번호 57로 나타나는 아미노산 서열(PRT12)에 대하여, 도메인 서열의 N말단측 및 C말단측 각각으로부터 1번째 및 2번째에 위치하는 REP 중에, 각각 1개소씩 시스테인 잔기가 삽입된 것이다. 즉, 서열 번호 49로 나타나는 아미노산 서열(PRT4)에 있어서의 시스테인 잔기의 총수는 4이다.
서열 번호 50으로 나타나는 아미노산 서열(PRT5)은, 서열 번호 57로 나타나는 아미노산 서열(PRT12)에 대하여, 도메인 서열의 N말단측 및 C말단측 각각으로부터 1∼4번째에 위치하는 REP 중에, 각각 1개소씩 시스테인 잔기가 삽입된 것이다. 즉, 서열 번호 50으로 나타나는 아미노산 서열(PRT5)에 있어서의 시스테인 잔기의 총수는 8이다.
서열 번호 51로 나타나는 아미노산 서열(PRT6)은, 서열 번호 57로 나타나는 아미노산 서열(PRT12)에 대하여, 도메인 서열의 N말단측 및 C말단측 각각으로부터 1∼8번째에 위치하는 REP 중에, 각각 1개소씩 시스테인 잔기가 삽입된 것이다. 즉, 서열 번호 51로 나타나는 아미노산 서열(PRT6)에 있어서의 시스테인 잔기의 총수는 16이다.
서열 번호 52로 나타나는 아미노산 서열(PRT7)은, 서열 번호 58로 나타나는 아미노산 서열(PRT13)에 대하여, 도메인 서열의 가장 N말단측 및 가장 C말단측 각각에 위치하는 REP에, 시스테인 잔기를 1개소씩 삽입한 것이다. 즉, 서열 번호 52로 나타나는 아미노산 서열(PRT7)에 있어서의 시스테인 잔기의 총수는 2이다.
서열 번호 53으로 나타나는 아미노산 서열(PRT8)은, 서열 번호 59로 나타나는 아미노산 서열(PRT14)에 대하여, 도메인 서열의 가장 N말단측 및 가장 C말단측 각각에 위치하는 REP에, 시스테인 잔기를 1개소씩 삽입한 것이다. 즉, 서열 번호 53으로 나타나는 아미노산 서열(PRT8)에 있어서의 시스테인 잔기의 총수는 2이다.
서열 번호 54로 나타나는 아미노산 서열(PRT9)은, 서열 번호 59로 나타나는 아미노산 서열(PRT14)에 대하여, 도메인 서열의 N말단측 및 C말단측 각각으로부터 1∼4번째에 위치하는 REP 중에, 각각 1개소씩 시스테인 잔기가 삽입된 것이다. 즉, 서열 번호 54로 나타나는 아미노산 서열(PRT9)에 있어서의 시스테인 잔기의 총수는 8이다.
서열 번호 55로 나타나는 아미노산 서열(PRT10)은, 서열 번호 59로 나타나는 아미노산 서열(PRT14)에 대하여, 도메인 서열의 N말단측 및 C말단측 각각으로부터 1∼8번째에 위치하는 REP 중에, 각각 1개소씩 시스테인 잔기가 삽입된 것이다. 즉, 서열 번호 55로 나타나는 아미노산 서열(PRT10)에 있어서의 시스테인 잔기의 총수는 16이다.
(i)의 인공 피브로인은, 서열 번호 46, 서열 번호 47, 서열 번호 48, 서열 번호 49, 서열 번호 50, 또는 서열 번호 51로 나타나는 아미노산 서열만을 갖는 것이라도 좋다. (ii)의 인공 피브로인은, 서열 번호 52, 서열 번호 53, 서열 번호 54, 또는 서열 번호 55로 나타나는 아미노산 서열만을 갖는 것이라도 좋다.
전술한 인공 피브로인은, N말단 및 C말단의 어느 한쪽 또는 양쪽에 태그 서열을 포함하고 있어도 좋다. 이에 따라, 인공 피브로인의 단리, 고정화, 검출 및 가시화 등이 가능하게 된다.
태그 서열로서, 예를 들면, 다른 분자와의 특이적 친화성(결합성, 어피니티)을 이용한 어피니티 태그를 들 수 있다. 어피니티 태그의 구체예로서, 히스티딘 태그(His 태그)를 들 수 있다. His 태그는, 히스티딘 잔기가 4 내지 10개 정도 나열된 짧은 펩티드로, 니켈 등의 금속 이온과 특이적으로 결합하는 성질이 있기 때문에, 금속 킬레이트 크로마토그래피(chelating metal chromatography)에 의한 인공 피브로인의 단리에 이용할 수 있다. 태그 서열의 구체예로서, 예를 들면, 서열 번호 70 또는 서열 번호 71로 나타나는 아미노산 서열(His 태그를 포함하는 아미노산 서열)을 들 수 있다.
또한, 글루타티온에 특이적으로 결합하는 글루타티온-S-트랜스퍼라아제(GST), 말토오스에 특이적으로 결합하는 말토오스 결합 단백질(MBP) 등의 태그 서열을 이용할 수도 있다.
또한, 항원 항체 반응을 이용한 「에피토프 태그」를 이용할 수도 있다. 항원성을 나타내는 펩티드(에피토프)를 태그 서열로서 부가함으로써, 당해 에피토프에 대한 항체를 결합시킬 수 있다. 에피토프 태그로서, HA(인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌의 펩티드 서열) 태그, myc 태그, FLAG 태그 등을 들 수 있다. 에피토프 태그를 이용함으로써, 높은 특이성으로 용이하게 인공 피브로인을 정제할 수 있다.
또한 태그 서열을 특정의 프로테아제로 분리할 수 있도록 한 것도 사용할 수 있다. 당해 태그 서열을 통하여 흡착한 단백질을 프로테아제 처리함으로써, 태그 서열을 분리한 인공 피브로인을 회수할 수도 있다.
태그 서열을 포함하는 인공 피브로인의 보다 구체적인 예로서, (iii)서열 번호 60(PRT15), 서열 번호 61(PRT16), 서열 번호 62(PRT17), 서열 번호 63(PRT18), 서열 번호 64(PRT19), 혹은 서열 번호 65(PRT20)로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는, 인공 피브로인, 또는 (iv)서열 번호 66(PRT21), 서열 번호 67(PRT22), 서열 번호 68(PRT23), 혹은 서열 번호 69(PRT24)로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는, 인공 피브로인을 들 수 있다.
또한, 서열 번호 60(PRT15), 서열 번호 61(PRT16), 서열 번호 62(PRT17), 서열 번호 63(PRT18), 서열 번호 64(PRT19), 및 서열 번호 65(PRT20)로 나타나는 아미노산 서열은, 각각, 서열 번호 46(PRT1), 서열 번호 47(PRT2), 서열 번호 48(PRT3), 서열 번호 49(PRT4), 서열 번호 50(PRT5), 및 서열 번호 51(PRT6)로 나타나는 아미노산 서열의 N말단에, 서열 번호 70으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 태그 서열을 도입한 것이다. 또한, 서열 번호 66(PRT21), 서열 번호 67(PRT22), 서열 번호 68(PRT23), 및 서열 번호 69(PRT24)로 나타나는 아미노산 서열은, 각각, 서열 번호 52(PRT7), 서열 번호 53(PRT8), 서열 번호 54(PRT9), 및 서열 번호 55(PRT10)로 나타나는 아미노산 서열의 N말단에, 서열 번호 70으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 태그 서열을 도입한 것이다.
(iii)의 인공 피브로인은, 서열 번호 60, 서열 번호 61, 서열 번호 62, 서열 번호 63, 서열 번호 64, 또는 서열 번호 65로 나타나는 아미노산 서열만을 갖는 것이라도 좋다.
서열 번호 60(PRT15), 서열 번호 61(PRT16), 서열 번호 62(PRT17), 서열 번호 63(PRT18), 서열 번호 64(PRT19), 또는 서열 번호 65(PRT20)로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는, 인공 피브로인의 GPGXX 모티프 함유율은, 각각 40.2%, 39.9%, 39.9%, 39.7%, 39.3%, 및 38.6%이며, 모두 10% 이상이다.
(iv)의 인공 피브로인은, 서열 번호 66, 서열 번호 67, 서열 번호 68, 혹은 서열 번호 69로 나타나는 아미노산 서열만을 갖는 것이라도 좋다.
서열 번호 66(PRT21), 서열 번호 67(PRT22), 서열 번호 68(PRT23), 또는 서열 번호 69(PRT24)로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는, 인공 피브로인의 GPGXX 모티프 함유율은, 각각 39.9%, 39.9%, 39.3%, 및 38.6%이며, 모두 10% 이상이다.
전술한 인공 피브로인은, 재조합 단백질 생산계에 있어서 생산된 단백질을 숙주의 외부에 방출하기 위한 분비 시그널을 포함하고 있어도 좋다. 분비 시그널의 서열은, 숙주의 종류에 따라 적절히 설정할 수 있다.
〔핵산〕
일 실시 형태에 따른 핵산은, 상기 인공 피브로인을 코딩한다. 핵산의 구체예로서, 서열 번호 46, 서열 번호 47, 서열 번호 48, 서열 번호 49, 서열 번호 50, 서열 번호 51, 서열 번호 52, 서열 번호 53, 서열 번호 54, 또는 서열 번호 55로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 인공 피브로인, 또는 이들의 아미노산 서열의 N말단 및 C말단의 어느 한쪽 혹은 양쪽에 서열 번호 70 또는 서열 번호 71로 나타나는 아미노산 서열(태그 서열)을 결합시킨 인공 피브로인 등을 코딩하는 핵산을 들 수 있다.
일 실시 형태에 따른 핵산은, 상기 인공 피브로인을 코딩하는 핵산의 상보쇄와 스트린전트한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 식 1: [(A)n모티프-REP]m, 또는 식 2: [(A)n모티프-REP]m-(A)n모티프로 나타나는 도메인 서열을 포함하는 인공 피브로인을 코딩하는 핵산이다. 당해 핵산에 의해 코딩되는 인공 피브로인의 상기 도메인 서열은, 천연 유래의 피브로인과 비교하여, REP 중에 시스테인 잔기가 삽입된 것에 상당하는 아미노산 서열을 갖는다.
「스트린전트한 조건」이란, 소위 특이적인 하이브리드가 형성되고, 비특이적인 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 「스트린전트한 조건」은, 저(低)스트린전트한 조건, 중(中)스트린전트한 조건 및 고(高)스트린전트한 조건 중 어느 것이라도 좋다. 저스트린전트한 조건이란, 적어도 85% 이상의 동일성이 서열간에 존재할 때만 하이브리다이제이션이 일어나는 것을 의미하고, 예를 들면, 0.5% SDS를 포함하는 5×SSC를 사용하여, 42℃에서 하이브리다이즈하는 조건을 들 수 있다. 중스트린전트한 조건이란, 적어도 90% 이상의 동일성이 서열간에 존재할 때만 하이브리다이제이션이 일어나는 것을 의미하고, 예를 들면, 0.5% SDS를 포함하는 5×SSC를 사용하여, 50℃에서 하이브리다이즈하는 조건을 들 수 있다. 고스트린전트한 조건이란, 적어도 95% 이상의 동일성이 서열간에 존재할 때만 하이브리다이제이션이 일어나는 것을 의미하고, 예를 들면, 0.5% SDS를 포함하는 5×SSC를 사용하여, 60℃에서 하이브리다이즈하는 조건을 들 수 있다.
〔숙주 및 발현 벡터〕
일 실시 형태에 따른 발현 벡터는, 상기 핵산 서열과, 당해 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 또는 복수의 조절 서열을 갖는다. 조절 서열은, 숙주에 있어서의 재조합 단백질의 발현을 제어하는 서열(예를 들면, 프로모터, 인핸서, 리보솜 결합 서열, 전사 종결 서열 등)이며, 숙주의 종류에 따라 적절히 선택할 수 있다. 발현 벡터의 종류는, 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 코스미드 벡터, 포스미드 벡터, 인공 염색체 벡터 등, 숙주의 종류에 따라 적절히 선택할 수 있다.
일 실시 형태에 따른 숙주는, 상기 발현 벡터로 형질 전환된 것이다. 숙주로서, 원핵 생물, 그리고 효모, 사상진균, 곤충 세포, 동물 세포 및 식물 세포 등의 진핵 생물 모두 적합하게 사용할 수 있다.
발현 벡터로서는, 숙주 세포에 있어서 자립 복제가 가능, 또는 숙주의 염색체 중으로의 통합이 가능하여, 일 실시 형태에 따른 핵산을 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것이 적합하게 사용된다.
세균 등의 원핵 생물을 숙주로서 사용하는 경우에는, 일 실시 형태에 따른 발현 벡터는, 원핵 생물 중에서 자립 복제가 가능함과 동시에, 프로모터, 리보솜 결합 서열, 일 실시 형태에 따른 핵산 및 전사 종결 서열을 포함하는 벡터인 것이 바람직하다. 프로모터를 제어하는 유전자가 포함되어 있어도 좋다.
원핵 생물로서는, 에쉬리키아속, 브레비바실러스속, 세라티아속, 바실러스속, 마이크로박테리움속, 브레비박테리움속, 코리네박테리움속, 및 슈도모나스속 등에 속하는 미생물을 들 수 있다.
에쉬리키아속에 속하는 미생물로서, 예를 들면, 에쉬리키아·콜리 BL21(노바젠사), 에쉬리키아·콜리 BL21(DE3)(라이프테크놀로지스사), 에쉬리키아·콜리 BLR(DE3)(머크밀리포어사), 에쉬리키아·콜리 DH1, 에쉬리키아·콜리 GI698, 에쉬리키아·콜리 HB101, 에쉬리키아·콜리 JM109, 에쉬리키아·콜리 K5(ATCC 23506), 에쉬리키아·콜리 KY3276, 에쉬리키아·콜리 MC1000, 에쉬리키아·콜리 MG1655(ATCC 47076), 에쉬리키아·콜리 No. 49, 에쉬리키아·콜리 Rosetta(DE3)(노바젠사), 에쉬리키아·콜리 TB1, 에쉬리키아·콜리 Tuner(노바젠사), 에쉬리키아·콜리 Tuner(DE3)(노바젠사), 에쉬리키아·콜리 W1485, 에쉬리키아·콜리 W3110(ATCC 27325), 에쉬리키아·콜리(Escherichia coli) XL1-Blue, 및 에쉬리키아·콜리 XL2-Blue 등을 들 수 있다.
브레비바실러스속에 속하는 미생물로서, 예를 들면, 브레비바실러스·아그리, 브레비바실러스·보스테렌시스, 브레비바실러스·센트로스포루스, 브레비바실러스·포르모수스, 브레비바실러스·인보카투스, 브레비바실러스·라테로스포루스, 브레비바실러스·림노필러스, 브레비바실러스·파라브레비스, 브레비바실러스·레우스제리, 브레비바실러스·서모루버, 브레비바실러스·브레비스 47(FERM BP-1223), 브레비바실러스·브레비스 47K(FERM BP-2308), 브레비바실러스·브레비스 47-5(FERM BP-1664), 브레비바실러스·브레비스 47-5Q(JCM8975), 브레비바실러스·초시넨시스 HPD31(FERM BP-1087), 브레비바실러스·초시넨시스 HPD31-S(FERM BP-6623), 브레비바실러스·초시넨시스 HPD31-OK(FERM BP-4573), 및 브레비바실러스·초시넨시스 SP3주(Takara사 제조) 등을 들 수 있다.
세라티아속에 속하는 미생물로서, 예를 들면, 세라티아·리퀘파시엔스(Serratia liquefacience) ATCC14460, 세라티아·엔토모필라(Serratia entomophila), 세라티아·피카리아(Serratia ficaria), 세라티아·폰티콜라(Serratia fonticola), 세라티아·그리메시(Serratia grimesii), 세라티아·프로테아마큘란스(Serratia proteamaculans), 세라티아·오도리페라(Serratia odorifera), 세라티아·플리무티카(Serratia plymuthica), 및 세라티아·루비데아(Serratia rubidaea) 등을 들 수 있다.
바실러스속에 속하는 미생물로서, 예를 들면, 바실러스·서브틸리스(Bacillus subtilis), 및 바실러스·아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 등을 들 수 있다.
마이크로박테리움속에 속하는 미생물로서, 예를 들면, 마이크로박테리움·암모니아필룸 ATCC15354 등을 들 수 있다.
브레비박테리움속에 속하는 미생물로서, 예를 들면, 브레비박테리움·디바리카툼(코리네박테리움·글루타미쿰) ATCC14020, 브레비박테리움·플라붐(코리네박테리움·글루타미쿰 ATCC14067) ATCC13826, ATCC14067, 브레비박테리움·임마리오필룸(Brevibacterium immariophilum) ATCC14068, 브레비박테리움·락토퍼멘툼(코리네박테리움·글루타미쿰 ATCC13869) ATCC13665, ATCC13869, 브레비박테리움·로제움 ATCC13825, 브레비박테리움·사카로리티쿰(Brevibacterium saccharolyticum) ATCC14066, 브레비박테리움·티오게니탈리스 ATCC19240, 브레비박테리움·알붐 ATCC15111, 및 브레비박테리움·세리눔 ATCC15112 등을 들 수 있다.
코리네박테리움속에 속하는 미생물로서, 예를 들면, 코리네박테리움·암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) ATCC 6871, ATCC6872, 코리네박테리움·글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032, 코리네박테리움·글루타미쿰 ATCC14067, 코리네박테리움·아세토애시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870, 코리네박테리움·아세토글루타미쿰 ATCC15806, 코리네박테리움·알카노리티쿰 ATCC21511, 코리네박테리움·칼루내 ATCC15991, 코리네박테리움·글루타미쿰 ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060, 코리네박테리움·릴리움 ATCC15990, 코리네박테리움·멜라세콜라 ATCC17965, 코리네박테리움·써모아미노게네스 AJ12340(FERMBP-1539), 및 코리네박테리움·헤르쿨리스 ATCC13868 등을 들 수 있다.
슈도모나스(Pseudomonas)속에 속하는 미생물로서, 예를 들면, 슈도모나스·푸티다(Pseudomonas putida), 슈도모나스·플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스·브래시카세아룸(Pseudomonas brassicacearum), 슈도모나스·풀바(Pseudomonas fulva), 및 슈도모나스·에스피(Pseudomonas sp.) D-0110 등을 들 수 있다.
상기 숙주 세포로의 발현 벡터의 도입 방법으로서는, 상기 숙주 세포로 DNA를 도입하는 방법이면 모두 사용할 수 있다. 예를 들면, 칼슘 이온을 사용하는 방법 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110(1972)〕, 프로토플라스트법(일본공개특허공보 소63-248394호), 또는 Gene, 17, 107(1982)이나 Molecular&General Genetics, 168, 111(1979)에 기재된 방법 등을 들 수 있다.
브레비바실러스속에 속하는 미생물의 형질 전환은, 예를 들면, Takahashi 등의 방법(J. Bacteriol., 1983, 156:1130-1134)이나, Takagi 등의 방법(Agric. Biol. Chem., 1989, 53:3099-3100), 또는 Okamoto 등의 방법(Biosci. Biotechnol. Biochem., 1997, 61:202-203)에 의해 실시할 수 있다.
일 실시 형태에 따른 핵산을 도입하는 벡터(이하, 단순히 「벡터」라고 함.)로서는, 예를 들면, pBTrp2, pBTac1, pBTac2(모두 베링거만하임사로부터 시판), pKK233-2(Pharmacia사 제조), pSE280(Invitrogen사 제조), pGEMEX-1(Promega사 제조), pQE-8(QIAGEN사 제조), pKYP10(일본공개특허공보 소58-110600호), pKYP200〔Agric. Biol. Chem., 48, 669(1984)〕, pLSA1〔Agric. Biol. Chem., 53, 277(1989)〕, pGEL1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306(1985)〕, pBluescript II SK(-)(Stratagene사 제조), pTrs30〔Escherichiacoli JM109/pTrS30(FERM BP-5407)으로부터 조제〕, pTrs32〔Escherichia coli JM109/pTrS32(FERM BP-5408)로부터 조제〕, pGHA2〔Escherichia coli IGHA2(FERM B-400)로부터 조제, 일본공개특허공보 소60-221091호〕, pGKA2〔Escherichia coli IGKA2(FERM BP-6798)로부터 조제, 일본공개특허공보 소60-221091호〕, pTerm2(US4686191, US4939094, US5160735), pSupex, pUB110, pTP5, pC194, pEG400〔J. Bacteriol., 172, 2392(1990)〕, pGEX(Pharmacia사 제조), 및 pET시스템(노바젠사 제조) 등을 들 수 있다.
숙주로서 Escherichia coli를 사용하는 경우에는, 예를 들면, pUC18, pBluescript II, pSupex, pET22b, 및 pCold 등을 적합한 벡터로서 들 수 있다.
브레비바실러스속에 속하는 미생물에 적합한 벡터의 구체예로서, 고초균 벡터로서 공지인 pUB110, 또는 pHY500(일본공개특허공보 평2-31682호), pNY700(일본공개특허공보 평4-278091호), pHY4831(J. Bacteriol., 1987, 1239-1245), pNU200(우다카 시게조, 일본농예화학회지 1987, 61:669-676), pNU100(Appl. Microbiol. Biotechnol., 1989, 30:75-80), pNU211(J. Biochem., 1992, 112:488-491), pNU211R2L5(일본공개특허공보 평7-170984호), pNH301(Appl. Environ. Microbiol., 1992, 58:525-531), pNH326, pNH400(J. Bacteriol., 1995, 177:745-749), pHT210(일본공개특허공보 평6-133782호), pHT110R2L5(Appl. Microbiol. Biotechnol., 1994, 42:358-363), 또는 대장균과 브레비바실러스속에 속하는 미생물과의 셔틀 벡터인 pNCO2(일본공개특허공보2002-238569호) 등을 들 수 있다.
프로모터로서는, 숙주 세포 중에서 기능하는 것이면 제한되지 않는다. 예를 들면, trp 프로모터(Ptrp), lac 프로모터, PL 프로모터, PR 프로모터, T7 프로모터 등의 대장균 또는 파지 등에 유래하는 프로모터를 들 수 있다. 또한 Ptrp를 2개 직렬시킨 프로모터(Ptrp×2), tac 프로모터, lacT7 프로모터, let I 프로모터와 같이 인위적으로 설계 개변된 프로모터 등도 사용할 수 있다.
리보솜 결합 서열인 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열과 개시 코돈의 사이를 적당한 거리(예를 들면, 6∼18염기)로 조절한 플라스미드를 사용하는 것이 바람직하다. 발현 벡터에 있어서, 상기 핵산의 발현에는 전사 종결 서열은 반드시 필요하지는 않지만, 구조 유전자의 바로 아래에 전사 종결 서열을 배치하는 것이 바람직하다.
진핵생물의 숙주로서는, 예를 들면, 효모, 사상진균(곰팡이 등) 및 곤충 세포를 들 수 있다.
효모로서는, 예를 들면, 사카로미세스(Saccharomyces)속, 스키조사카로미세스(Schizosaccharomyces)속, 클루이베로미세스(Kluyveromyces)속, 트리코스포론(Trichosporon)속, 슈와니오미세스(Schwanniomyces)속, 피키아(Pichia)속, 칸디다(Candida)속, 야로위아속 및 한세뉼라속 등에 속하는 효모를 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 사카로미세스·세레비제(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로미세스·폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로미세스·락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로미세스·마르시아누스(Kluyveromyces marxianus), 트리코스포론·풀루란스(Trichosporon pullulans), 슈와니오미세스·알루비우스(Schwanniomyces alluvius), 슈와니오미세스·옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis), 칸디다·유틸리스(Candida utilis), 피키아·파스토리스(Pichia pastoris) 피키아·안구스타(Pichia angusta), 피키아·메타놀리카(Pichia methanolica), 피키아·폴리모파(Pichia polymorpha), 피키아·스티피티스(Pichia stipitis), 야로위아·리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 및 한세뉼라·폴리모파(Hansenula polymorpha) 등을 들 수 있다.
효모를 숙주 세포로서 사용하는 경우의 발현 벡터는 통상, 복제 기점(숙주에 있어서의 증폭이 필요한 경우) 및 대장균 중에서의 벡터의 증식을 위한 선발 마커, 효모에 있어서의 재조합 단백질 발현을 위한 프로모터 및 터미네이터, 그리고 효모를 위한 선발 마커를 포함하는 것이 바람직하다.
발현 벡터가 비통합 벡터의 경우, 추가로 자기 복제 서열(ARS)을 포함하는 것이 바람직하다. 이에 따라 세포 내에 있어서의 발현 벡터의 안정성을 향상시킬 수 있다(Myers, A. M., et al.(1986) Gene 45:299-310).
효모를 숙주로서 사용하는 경우의 벡터로서는, 예를 들면, YEP13(ATCC37115), YEp24(ATCC37051), YCp50(ATCC37419), YIp, pHS19, pHS15, pA0804, pHIL3Ol, pHIL-S1, pPIC9K, pPICZα, pGAPZα, 및 pPICZ B 등을 들 수 있다.
프로모터로서는, 효모 중에서 발현할 수 있는 것이면 제한되지 않는다. 프로모터로서는, 예를 들면, 헥소스키나아제 등의 해당계의 유전자의 프로모터, PHO5 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터, gal 1프로모터, gal 10프로모터, 히트쇼크 폴리펩티드 프로모터, MFα 1프로모터, CUP 1프로모터, pGAP 프로모터, pGCW 14프로모터, AOX1 프로모터, 및 MOX 프로모터 등을 들 수 있다.
효모로의 발현 벡터의 도입 방법으로서는, 효모에 DNA를 도입하는 방법이면 모두 사용할 수 있다. 효모로의 발현 벡터의 도입 방법으로서는, 예를 들면, 일렉트로포레이션법(Methods Enzymol., 194, 182(1990)), 스페로플라스트법(Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 4889(1984)), 아세트산 리튬법(J. Bacteriol., 153, 163(1983)), 및 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929(1978) 기재의 방법 등을 들 수 있다.
사상진균으로서는, 예를 들면, 아크레모늄(Acremonium)속, 아스페르길루스(Aspergillus)속, 우스틸라고(Ustilago)속, 트리코데르마(Trichoderma)속, 뉴로스포라(Neurospora)속, 푸사리움(Fusarium)속, 휴미콜라(Humicola)속, 페니실리움(Penicillium)속, 마이셀리옵토라(Myceliophtora)속, 보트리티스(Botryts)속, 마그나폴세(Magnaporthe)속, 무코르(Mucor)속, 메타리지움(Metarhizium)속, 모나스쿠스(Monascus)속, 리조푸스(Rhizopus)속, 및 리조무코르속에 속하는 균 등을 들 수 있다.
사상진균의 구체예로서, 아크레모늄·알라바멘세(Acremonium alabamense), 아크레모늄·셀룰로리티커스(Acremonium cellulolyticus), 아스페르길루스·아쿨레아터스(아큘레이터스)(Aspergillus aculeatus), 아스페르길루스·아와모리(Aspergillus awamori), 아스페르길루스·오리제(Aspergillus oryzae), 아스페르길루스·사케(Aspergillus sake), 아스페르길루스·소재(소야)(Aspergillus sojae), 아스페르길루스·튜빙겐시스(Aspergillus tubigensis), 아스페르길루스·니제르(Aspergillus niger), 아스페르길루스·니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스페르길루스·파라시티커스(Aspergillus parasiticus), 아스페르길루스·피쿰(피큠)(Aspergillus ficuum), 아스페르길루스·포에이커스(Aspergillus phoeicus), 아스페르길루스·포에티더스(페티더스)(Aspergillus foetidus), 아스페르길루스·플라버스(Aspergillus flavus), 아스페르길루스·후미가터스(Aspergillus fumigatus), 아스페르길루스·야포니쿠스(쟈포니커스)(Aspergillus japonicus), 트리코데르마·비리데(Trichoderma viride), 트리코데르마·하지아눔(Trichoderma harzianum), 트리코데르마·리세에이(Trichoderma reseei), 크리소스포리움·루크노웬스(Chrysosporium lucknowense), 서모아스쿠스(Thermoascus), 스포로트리쿰(Sporotrichum), 스포로트리쿰·셀룰로필룸(Sporotrichum cellulophilum), 탈라로마이세스(Talaromyces), 티엘라비아·테레스트리스(Thielavia terrestris), 티엘라비아(Thielavia), 뉴로스포라·크라싸(Neurospora crassa), 푸사리움·옥시스포러스(Fusarium oxysporus), 푸사리움·그라미네아룸(Fusarium graminearum), 푸사리움·베네나툼(Fusarium venenatum), 휴미콜라·인솔렌스(Humicola insolens), 페니실리움·크라이소제넘(Penicillium chrysogenum), 페니실리움·카멤버티(Penicillium camemberti), 페니실리움·카네센스(Penicillium canescens), 페니실리움·에머소니(Penicillium emersonii), 페니실리움·푸니큘로섬(Penicillium funiculosum), 페니실리움·그리세오로세움(Penicillium griseoroseum), 페니실리움·퍼퓨로제넘(Penicillium purpurogenum), 페니실리움·로퀘포티(Penicillium roqueforti), 마이셀리옵토라·서모필룸(Myceliophtaora thermophilum), 무코르·암비구우스(Mucor ambiguus), 무코르·서시넬로이드스(Mucor circinelloides), 무코르·프라질리스(Mucor fragilis), 무코르·히에말리스(Mucor hiemalis), 무코르·이나에퀴스포러스(Mucor inaequisporus), 무코르·오블론지엘립티커스(Mucor oblongiellipticus), 무코르·라세모서스(Mucor racemosus), 무코르·레커버스(Mucor recurvus), 무코르·새터니누스(Mocor saturninus), 무코르·섭틸리스스무스(Mocor subtilissmus), 오가태아·폴리모파(Ogataea polymorpha), 파네로카에테·크리소스포리움(Phanerochaete chrysosporium), 리조무코르·미헤이(Rhizomucor miehei), 리조무코르·푸실러스(Rhizomucor pusillus), 및 리조푸스·아리주스(Rhizopus arrhizus) 등을 들 수 있다.
숙주가 사상진균인 경우의 프로모터로서는, 해당계에 관한 유전자, 구성적 발현에 관한 유전자, 가수분해에 관한 효소 유전자 등 어느 것이라도 좋다. 숙주가 사상진균인 경우의 프로모터로서는, 구체적으로는, amyB, glaA, agdA, glaB, TEF1, xynF1tannasegene, No. 8AN, gpdA, pgkA, enoA, melO, sodM, catA, 및 catB 등을 들 수 있다.
사상진균으로의 발현 벡터의 도입은, 종래 공지의 방법을 사용하여 행할 수 있다. 사상진균으로의 발현 벡터의 도입 방법으로서는, 예를 들면, Cohen 등의 방법(염화 칼슘법)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69:2110(1972)], 프로토플라스트법[Mol. Gen. Genet., 168:111(1979)], 컴피던트법[J. Mol. Biol., 56:209(1971)], 일렉트로포레이션법 등을 들 수 있다.
곤충 세포로서, 예를 들면, 인시류의 곤충 세포를 들 수 있다. 곤충 세포로서는, 보다 구체적으로는, Sf9, 및 Sf21 등의 스포돕테라 프루지퍼다(Spodoptera frugiperda) 유래의 곤충 세포, 그리고, High 5 등의 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) 유래의 곤충 세포 등을 들 수 있다.
곤충 세포를 숙주로서 사용하는 경우의 벡터로서는, 예를 들면, 밤나방과 곤충에 감염되는 바이러스인 오토그래파·캘리포니카·누클리어·폴리헤드로시스·바이러스(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 등의 바큘로바이러스(Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York(1992))를 들 수 있다.
곤충 세포를 숙주로서 사용하는 경우에는, 예를 들면, 커런트·프로토콜스·인·몰레큘러·바이올로지, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York(1992), 및 Bio/Technology, 6, 47(1988) 등에 기재된 방법에 의해, 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 즉, 재조합 유전자 도입 벡터 및 바큘로바이러스를 곤충 세포에 공(共)도입하여 곤충 세포 배양 상청 중에 재조합 바이러스(발현 벡터)를 얻은 후, 추가로 재조합 바이러스를 곤충 세포에 감염시켜, 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다. 당해 방법에 있어서 사용되는 유전자 도입 벡터로서는, 예를 들면, pVL1392, pVL1393, 및 pBlueBacIII(모두 Invitorogen사 제조) 등을 들 수 있다.
재조합 바이러스를 조제하기 위한, 곤충 세포로의 재조합 유전자 도입 벡터와 바큘로바이러스의 공도입 방법으로서는, 예를 들면, 인산 칼슘법(일본공개특허공보 평2-227075호), 및 리포펙션법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413(1987)) 등을 들 수 있다.
일 실시 형태에 따른 재조합 벡터는, 형질 전환체 선택을 위한 선택 마커 유전자를 추가로 함유하고 있는 것이 바람직하다. 예를 들면, 대장균에 있어서는, 선택 마커 유전자로서는, 테트라사이클린, 암피실린, 카나마이신 등의 각종 약제에 대한 내성 유전자를 사용할 수 있다. 영양 요구성에 관여하는 유전자 변이를 상보할 수 있는 열성의 선택 마커도 사용할 수 있다. 효모에 있어서는, 선택 마커 유전자로서, 제네티신에 대한 내성 유전자를 사용할 수 있고, 영양 요구성에 관여하는 유전자 변이를 상보하는 유전자, LEU2, URA3, TRP1, HIS3 등의 선택 마커도 사용할 수 있다. 사상진균에 있어서는, 선택 마커 유전자로서, niaD(Biosci. Biotechnol. Biochem., 59, 1795-1797(1995)), argB(Enzyme Microbiol Technol, 6, 386-389, (1984)), sC(Gene, 84, 329-334, (1989)), ptrA(BiosciBiotechnol Biochem, 64, 1416-1421, (2000)), pyrG(BiochemBiophys Res Commun, 112, 284-289, (1983)), amdS(Gene, 26, 205-221, (1983)), 오레오바시딘 내성 유전자(Mol Gen Genet, 261, 290-296, (1999)), 베노밀 내성 유전자(Proc Natl Acad Sci USA, 83, 4869-4873, (1986)) 및 하이그로마이신 내성 유전자(Gene, 57, 21-26, (1987))로 이루어지는 군으로부터 선택되는 마커 유전자, 로이신 요구성 상보 유전자 등을 들 수 있다. 또한, 숙주가 영양 요구성 변이주인 경우에는, 선택 마커 유전자로서 당해 영양 요구성을 상보하는 야생형 유전자를 사용할 수도 있다.
일 실시 형태에 따른 발현 벡터로 형질 전환된 숙주의 선택은, 상기 핵산에 선택적으로 결합하는 프로브를 사용한 플라크 하이브리다이제이션 및 콜로니 하이브리다이제이션 등으로 행할 수 있다. 당해 프로브로서는, 상기 핵산의 서열 정보에 기초하여, PCR법에 의해 증폭된 부분 DNA 단편을 라디오아이소토프 또는 디곡시제닌으로 수식한 것을 사용할 수 있다.
〔인공 피브로인의 제조 방법〕
본 실시 형태에 따른 인공 피브로인은, 상기 발현 벡터로 형질 전환된 숙주에, 상기 핵산을 발현시키는 공정을 포함하는 방법에 의해, 제조할 수 있다. 발현 방법으로서는, 직접 발현 외에, 몰레큘러·클로닝 제2판에 기재되어 있는 방법 등에 준하여, 분비 생산, 융합 단백질 발현 등을 행할 수 있다. 효모, 동물 세포, 곤충 세포에 의해 발현시킨 경우에는, 당 또는 당쇄가 부가된 폴리펩티드로서 인공 피브로인을 얻을 수 있다.
본 실시 형태에 따른 인공 피브로인은, 예를 들면, 상기 발현 벡터로 형질 전환된 숙주를 배양 배지 중에서 배양하고, 배양 배지 중에 본 실시 형태에 따른 인공 피브로인을 생성 축적시키고, 당해 배양 배지로부터 채취함으로써 제조할 수 있다. 상기 숙주를 배양 배지 중에서 배양하는 방법은, 숙주의 배양에 통상 사용되는 방법에 따라 행할 수 있다.
상기 숙주가, 대장균 등의 원핵 생물 또는 효모 등의 진핵 생물인 경우, 상기 숙주의 배양 배지로서, 당해 숙주가 자화(資化)할 수 있는 탄소원, 질소원 및 무기염류 등을 함유하고, 당해 숙주의 배양을 효율적으로 행할 수 있는 배지이면, 천연 배지, 및 합성 배지 중 어느 것을 사용해도 좋다.
탄소원으로서는, 당해 숙주가 자화할 수 있는 것이면 좋다. 탄소원으로서는, 예를 들면, 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 및 이들을 함유하는 당밀, 전분 및 전분 가수분해물 등의 탄수화물, 아세트산 및 프로피온산 등의 유기산, 그리고 에탄올 및 프로판올 등의 알코올류를 사용할 수 있다.
질소원으로서는, 예를 들면, 암모니아, 염화 암모늄, 황산 암모늄, 아세트산 암모늄 및 인산 암모늄 등의 무기산 또는 유기산의 암모늄염, 그 외의 질소 함유 화합물, 그리고 펩톤, 고기 진액, 효모 진액, 콘 스티프 리쿼, 카제인 가수분해물, 대두박 및 대두박 가수분해물, 각종 발효균체 및 그의 소화물을 사용할 수 있다.
무기염으로서는, 예를 들면, 인산 제1 칼륨, 인산 제2 칼륨, 인산 마그네슘, 황산 마그네슘, 염화 나트륨, 황산 제1 철, 황산 망간, 황산 구리 및 탄산 칼슘을 사용할 수 있다.
대장균 등의 원핵 생물 또는 효모 등의 진핵 생물의 배양은, 예를 들면, 진탕 배양 또는 심부 통기 교반 배양 등의 호기적 조건하에서 행할 수 있다. 배양 온도는, 예를 들면, 15∼40℃이다. 배양 시간은, 통상 16시간∼7일간이다. 배양 중의 배양 배지의 pH는 3.0∼9.0으로 유지하는 것이 바람직하다. 배양 배지의 pH의 조정은, 무기산, 유기산, 알칼리 용액, 우레아, 탄산 칼슘 및 암모니아 등을 사용하여 행할 수 있다.
또한, 배양 중 필요에 따라, 암피실린 및 테트라사이클린 등의 항생 물질을 배양 배지에 첨가해도 좋다. 프로모터로서 유도성의 프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질 전환한 미생물을 배양할 때에는, 필요에 따라 인듀서를 배지에 첨가해도 좋다. 예를 들면, lac 프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질 전환한 미생물을 배양할 때에는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드 등을, trp 프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질 전환한 미생물을 배양할 때에는 인돌아크릴산 등을 배지에 첨가해도 좋다.
곤충 세포의 배양 배지로서는, 예를 들면, 일반적으로 사용되고 있는 TNM-FH 배지(Pharmingen사 제조), Sf-900 II SFM 배지(Life Technologies사 제조), ExCell400, ExCell405(모두 JRH Biosciences사 제조), 및 Grace‘s Insect Medium(Nature, 195, 788(1962)) 등을 사용할 수 있다.
곤충 세포의 배양은, 예를 들면, 배양 배지의 pH6∼7, 배양 온도 25∼30℃ 등의 조건하에서, 배양 시간 1∼5일간으로 할 수 있다. 또한, 배양 중 필요에 따라, 겐타마이신 등의 항생 물질을 배양 배지에 첨가해도 좋다.
숙주가 식물 세포인 경우, 형질 전환된 식물 세포를 그대로 배양해도 좋고, 또한 식물의 기관에 분화시켜 배양할 수 있다. 당해 식물 세포를 배양하는 배지로서는, 예를 들면, 일반적으로 사용되고 있는 무라시게·앤드·스쿠그(MS) 배지, 화이트(White) 배지, 또는 이들의 배지에 옥신, 시토키닌 등, 식물 호르몬을 첨가한 배지 등을 사용할 수 있다.
동물 세포의 배양은, 예를 들면, 배양 배지의 pH5∼9, 배양 온도 20∼40℃ 등의 조건하에서, 배양 시간 3∼60일간으로 할 수 있다. 또한, 배양 중 필요에 따라, 카나마이신, 하이그로마이신 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 좋다.
상기 발현 벡터로 형질 전환된 숙주를 사용하여 인공 피브로인을 생산하는 방법으로서는, 당해 인공 피브로인을 숙주 세포 내에 생산시키는 방법, 숙주 세포 외로 분비시키는 방법, 및 숙주 세포 외막 상에 생산시키는 방법 등이 있다. 사용하는 숙주 세포, 및 생산시키는 인공 피브로인의 구조를 바꿈으로써, 이들의 각 방법을 선택할 수 있다.
예를 들면, 인공 피브로인이 숙주 세포 내 또는 숙주 세포 외막 상에 생산되는 경우, 폴 손 등의 방법(J. Biol. Chem., 264, 17619(1989)), 로우 등의 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227(1989), Genes Develop., 4, 1288(1990)), 또는 일본공개특허공보 평 5-336963호, 국제공개 제94/23021호 등에 기재된 방법을 준용함으로써, 인공 피브로인을 숙주 세포 외로 적극적으로 분비시키도록 변경시킬 수 있다. 즉, 유전자 재조합의 수법을 사용하여, 인공 피브로인의 활성 부위를 포함하는 폴리펩티드에 시그널 펩티드를 부가한 형태로 발현시킴으로써, 인공 피브로인을 숙주 세포 외로 적극적으로 분비시킬 수 있다.
상기 발현 벡터로 형질 전환된 숙주에 의해 생산된 인공 피브로인은, 단백질의 단리 정제에 통상 사용되고 있는 방법으로 단리 및 정제할 수 있다. 예를 들면, 인공 피브로인이, 세포 내에 용해 상태로 발현한 경우에는, 배양 종료 후, 숙주 세포를 원심 분리에 의해 회수하고, 수계 완충액에 현탁시킨 후, 초음파 파쇄기, 프렌치 프레스, 만톤가우린 호모게나이저 및 다이노밀 등에 의해 숙주 세포를 파쇄하여, 무세포 추출액을 얻는다. 당해 무세포 추출액을 원심 분리함으로써 얻어지는 상청으로부터, 단백질의 단리 정제에 통상 사용되고 있는 방법, 즉, 용매 추출법, 황산 암모늄 등에 의한 염석법, 탈염법, 유기 용매에 의한 침전법, 디에틸아미노에틸(DEAE)-세파로오스, DIAION HPA-75(미쓰비시카세이사 제조) 등의 레진을 사용한 음이온 교환 크로마토그래피법, S-Sepharose FF(Pharmacia사 제조) 등의 레진을 사용한 양이온 교환 크로마토그래피법, 부틸세파로오스, 페닐세파로오스 등의 레진을 사용한 소수성 크로마토그래피법, 분자체를 사용한 겔여과법, 어피니티 크로마토그래피법, 크로마토포커싱법, 등전점 전기 영동 등의 전기 영동법 등의 방법을 단독 또는 조합하여 사용하여, 정제표품을 얻을 수 있다.
상기 크로마토그래피로서는, 페닐-토요펄(토소), DEAE-토요펄(토소), 세파덱스 G-150(파마시아바이오테크)을 사용한 칼럼 크로마토그래피가 바람직하게 사용된다.
또한, 인공 피브로인이 세포 내에 불용체를 형성하여 발현한 경우에는, 마찬가지로 숙주 세포를 회수 후, 파쇄하고, 원심 분리를 행함으로써, 침전 획분으로서 인공 피브로인의 불용체를 회수한다. 회수한 인공 피브로인의 불용체는 단백질 변성제로 가용화할 수 있다. 당해 조작 후, 상기와 동일한 단리 정제법에 의해 인공 피브로인의 정제표품을 얻을 수 있다.
인공 피브로인, 또는 인공 피브로인에 당쇄가 부가된 유도체가 세포 외로 분비된 경우에는, 배양 상청으로부터 인공 피브로인 또는 그의 유도체를 회수할 수 있다. 즉, 배양물을 원심 분리 등의 수법으로 처리함으로써 배양 상청을 취득하고, 당해 배양 상청으로부터, 상기와 동일한 단리 정제법을 사용함으로써, 정제표품을 얻을 수 있다.
(제2 세그먼트)
상기 제2 세그먼트는, 상기 폴리펩티드 골격에 대한 가소화 기능을 갖는 분자단을 포함한다. 폴리펩티드 골격에 대한 가소화 기능을 갖는 분자단이란, 당해 분자단끼리의 분자간력이, 폴리펩티드 골격끼리의 분자간력보다도 작고, 양자를 혼합한 경우에, 폴리펩티드 골격 단체보다도 소재의 유연성을 향상시키는 것이 가능한 분자단을 말한다. 또한, 폴리펩티드 골격에 대한 가소화 기능을 갖는 분자단이란, 폴리펩티드 골격보다도 융점이나 유리 전이 온도가 낮은 분자단이라고도 말할 수 있다. 이러한 분자단으로서는, 예를 들면, 후술하는 폴리에테르 등을 들 수 있다. 또한, 가소화 기능이란, 유연성의 향상 기능, 혹은 굽힘이나 잡아당김에 있어서의 파단 신도를 높이는 기능이라고도 말할 수 있다. 또한, 폴리펩티드 골격에 대한 가소화 기능을 갖는 분자단은, 생분해성을 갖는 것, 혹은 바이오매스 유래의 것이 적합하게 사용된다. 그에 의해, 합성 고분자(성형 재료) 전체로서 생분해성을 갖는 것이 충분히 기대되고, 나아가서는 합성 고분자(성형 재료)의 제조 에너지의 저감이 도모될 수 있다.
상기 제2 세그먼트는, 상기 분자단을 복수 포함해도 좋다. 그리고, 상기 제2 세그먼트가 복수의 상기 분자단을 포함하고, 복수의 상기 분자단이 서로 연결하고 있어도 좋다. 또한, 상기 분자단끼리의 연결은, 일부에 분기를 갖고 있어도 좋다. 상기 연결이 일부에 분기를 가짐으로써, 제2 세그먼트는, 복수의 상기 분자단에 의한 분기 구조를 가질 수 있고, 분기마다에 제1 세그먼트와의 결합을 복수 형성할 수도 있다. 즉, 상기 연결의 일부에 분기를 도입함으로써도, 제1 세그먼트와 제2 세그먼트의 네트워크 구조를 형성할 수 있다. 이와 같이, 제2 세그먼트가 복수의 상기 분자단을 포함하고, 그들의 분자단이 서로 연결하는 것으로써, 제2 세그먼트의 설계의 폭을 보다 넓힐 수 있고, 예를 들면, 합성 고분자의 유연성을 보다 용이하게 조정할 수 있다. 또한, 제2 세그먼트가 상기 분자단을 하나만 포함하고 있는 경우에는, 복수의 제2 세그먼트끼리를 서로 연결시키고, 그들 복수의 제2 세그먼트 중의 적어도 하나를 제1 세그먼트에 결합시켜도 좋다. 혹은, 복수의 제2 세그먼트를 하나의 제1 세그먼트에 결합시켜도 좋다. 또한, 복수의 제2 세그먼트끼리를 연결하는 경우에는, 복수의 제2 세그먼트끼리의 연결의 일부에 분기를 도입하여, 제2 세그먼트의 네트워크를 형성해도 좋다.
제2 세그먼트는, 예를 들면, 폴리에테르, 폴리에스테르, 폴리카보네이트, 폴리아미드, 폴리올(폴리비닐알코올 등), 폴리올레핀, 폴리아세탈, 폴리케탈, 폴리(메타)아크릴레이트, 실리콘, 폴리우레탄, 폴리알킬렌이민, 페놀 수지, 우레아 수지, 멜라민 수지, 및 다당류로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종에 유래하는 골격을 포함해도 좋고, 바람직하게는, 폴리에테르기, 폴리에스테르기, 폴리카보네이트기, 폴리아미드기, 폴리올기(폴리비닐알코올기 등), 및, 수식 다당기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종의 관능기를 포함해도 좋고, 에테르기, 에스테르기, 카보네이트기, 아미드기, 및, 수식 다당기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종의 관능기를 포함해도 좋다. 제2 세그먼트는, 예를 들면, 에테르 결합, 에스테르 결합, 탄산 에스테르 결합(카보네이트 결합), 아미드기, 실록산 결합, 우레탄 결합, 우레탄 결합, 또는 우레아 결합을 갖는 구조 단위로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종의 구조 단위를 포함해도 좋고, 또한 알킬렌기, 치환 알킬렌기, 옥시메틸렌기, 알킬렌이민기, 또는 수식 다당기를 갖는 구조 단위로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종의 구조 단위를 포함한다고도 말할 수 있다.
폴리에테르기로서는, 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌옥사이드/프로필렌옥사이드 공중합체, 및 폴리부틸렌글리콜 등의 폴리알킬렌글리콜류에 유래하는 관능기를 들 수 있다. 또한, 이들의 폴리에테르기가 제2 세그먼트에 포함되는 경우, 폴리에테르기는, 필요에 따라 제2 세그먼트에 포함되는, 후술하는 링커가 갖는 에스테르기나 티오에스테르기, 아미드기 중의 헤테로 원소(O, N, S)에 직결하고 있어도 좋다. 혹은 폴리에테르기는, 제 1 세그먼트에 포함되는 폴리펩티드 골격이 갖는 에스테르기나 티오에스테르기, 아미드기 중의 헤테로 원소(O, N, S)에 직결하고 있어도 좋다. 이 경우, 폴리에테르기 전체가 링커나 제1 세그먼트로부터 분리하기 쉬워지고, 그 결과, 폴리에테르기의 생분해 속도가 높여질 수 있다.
폴리에스테르기로서는, 예를 들면, 폴리락트산, 폴리(3-하이드록시부탄산), 폴리하이드록시부탄산/하이드록시발레릴산 공중합체, 폴리하이드록시부탄산/4-하이드록시부탄산 공중합체, 폴리하이드록시부탄산/하이드록시헥산산 공중합체, 폴리트리메틸렌테레프탈레이트, 부탄디올/장쇄 디카복실산 공중합체, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리부틸렌숙시네이트, 폴리부틸렌숙시네이트·아디페이트 공중합체, 폴리부틸렌아디페이트·테레프탈레이트 공중합체, 폴리카프로락톤, 및 폴리트리메틸렌푸란디카르복실레이트(Poly(trimethylene furandicarboxylate): PTF) 등의 폴리에스테르류에 유래하는 관능기를 들 수 있다. 폴리에스테르기는, 전술한 폴리에스테르류 중에서도, 바람직하게는, 폴리카프로락톤 등의 바이오매스 플라스틱 또는 생분해성 플라스틱으로 분류되는 것에 유래하는 관능기이다.
폴리카보네이트기로서는, 예를 들면, 1,6-헥산디올폴리카보네이트, 1,5-펜탄디올폴리카보네이트, 및 1,10-데칸디올카보네이트 등의 지방족 탄화수소쇄를 주골격으로서 갖는 폴리카보네이트류에 유래하는 관능기를 들 수 있다.
폴리아미드기로서는, 예를 들면, 나일론 3, 나일론 4, 나일론 5, 나일론 6, 나일론 11, 및 나일론 610 등의 폴리아미드류에 유래하는 관능기를 들 수 있다. 폴리아미드기는, 전술한 폴리아미드류 중에서도, 바람직하게는, 바이오매스 플라스틱 또는 생분해성 플라스틱으로 분류되는 것에 유래하는 관능기이다.
폴리올기(폴리비닐알코올기 등)로서는, 예를 들면, 폴리비닐알코올, 에틸렌·비닐알코올 공중합체 등의 폴리올류(폴리비닐알코올류 등)에 유래하는 관능기를 들 수 있다. 폴리올기는, 전술한 폴리올류 중에서도, 바람직하게는, 바이오매스 플라스틱 또는 생분해성 플라스틱으로 분류되는 것에 유래하는 관능기이다.
수식 다당류기로서는, 예를 들면, 셀룰로오스, 전분, 키틴, 및 키토산 등을 화학 수식한 화합물에 유래하는 관능기를 들 수 있다. 상기 화학 수식한 화합물은, 예를 들면, 아세트산 셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 아세트산 전분, 하이드록시프로필화 전분, 카르복시메틸키틴, 및 카르복시메틸키토산 등을 들 수 있다.
제2 세그먼트는, 상기 폴리펩티드 골격에 대한 가소화 기능을 갖는 분자단에 더하여, 링커(반응성 관능기)를 추가로 포함해도 좋다. 이 경우, 상기 링커를 통하여, 상기 분자단과 상기 폴리펩티드 골격이 결합하고 있어도 좋다. 링커는, 예를 들면, 하기 식(1)로 나타나는 구조 단위, 하기 일반식(2a)∼(6)으로 나타나는 구조 단위, 하기 식(7)로 나타나는 구조 단위, 하기 일반식(8a)∼(9)로 나타나는 구조 단위, 하기 일반식(10)∼(11b)로 나타나는 구조 단위, 및 하기 일반식(13)∼(16)으로 나타나는 구조 단위로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종을 포함해도 좋고, 하기 식(1)로 나타나는 구조 단위, 하기 일반식(2a)∼(6)으로 나타나는 구조 단위, 하기 식(7)로 나타나는 구조 단위, 및 하기 일반식(8a)∼(9)로 나타나는 구조 단위로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종을 포함해도 좋고, 생분해성을 향상시키는 관점에서, 바람직하게는, 하기 식(1)로 나타나는 구조 단위, 그리고, 하기 일반식(2a), (3a), (4a), (4b) 및 (10)으로 나타나는 구조 단위로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종을 포함한다. 링커는, 전술한 구조 단위를 복수 포함해도 좋다. 즉, 링커는, 전술한 구조 단위만으로 이루어져도 좋고, 또한 전술한 구조 단위를 복수 가져도 좋다(링커의 본체부에 대하여 전술한 구조 단위가 복수 공유 결합하고 있어도 좋음). 링커의 본체부는 비교적 분자량이 작은 것이 바람직하다. 링커가 전술한 구조 단위를 3개 이상 갖는 경우, 예를 들면, 1개의 제2 세그먼트에 대하여, 3개의 제1 세그먼트가 결합하는 것이 가능하고, 이러한 선택에 의해서도 상기 합성 고분자에 네트워크 구조를 도입할 수 있다. 또한 상기 합성 고분자의 제조에 사용하는 원료의 선택(폴리펩티드 골격을 갖는 화합물, 및, 당해 폴리펩티드 골격에 대한 가소화 기능을 갖는 분자단을 포함하는 화합물의 관능기를 조정하는 것)에 따라, 복수 있는 제2 세그먼트의 일부가 서로 결합한 합성 고분자로 할 수도 있다. 링커가 전술한 구조 단위를 복수 갖는 경우, 복수 있는 구조 단위의 적어도 하나가 상기 폴리펩티드 골격과 결합하고, 적어도 하나가 상기 분자단과 결합하는 구조라도 좋다. 링커가, 전술한 구조 단위만으로 이루어지는 경우, 링커를 나타내는 구조 단위를 나타내는 식 중에 기재된 2개의 결합 중 한쪽에 펩티드 골격, 다른 한쪽에 상기 분자단이 결합한다. 예를 들면, 상기 링커가 하기 식(1)로 나타나는 경우, 바람직하게는, 상기 분자단이 질소(N)와 결합하고, 다른 한쪽이 폴리펩티드 골격과 결합한다. 링커가 전술한 구조 단위를 복수 갖는 경우, 예를 들면, 하기 식(1)로 나타나는 구조 단위의 경우, 바람직하게는, 링커의 본체부에 대하여 질소(N)가 결합하고, 다른 한쪽이, 상기 폴리펩티드 골격 및 상기 분자단과 결합한다.
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상기 일반식(2a), (2b), (3a), (4a), (4b), (5), (6), (10), (11a) 및 (11b)에 있어서, Y는, 서로 독립적으로, 산소 원자, 황원자, 또는 NR1을 나타낸다. 상기 NR1에 있어서, R1은, 수소, 탄화수소기, 방향족기, 카르보닐기, 및 술포닐기를 나타낸다. 상기 일반식(2a), (2b), (3a), (4a), (4b), (8a), (8b), (9), (10), (11a) 및 (11b)에 있어서, R은, 서로 독립적으로, 수소, 탄화수소기, 및 방향족기를 나타낸다.
제2 세그먼트의 분자량(폴리펩티드 골격에 대한 가소화 기능을 갖는 분자단)은, 예를 들면, 200∼500000, 300∼400000, 350∼350000, 400∼300000, 500∼200000, 600∼1000000, 700∼50000, 800∼10000, 900∼7500, 또는 100∼5000이다. 왜냐하면, 제2 세그먼트의 분자량의 분자량이 200 미만의 낮은 값인 경우, 분자의 삼차원 구조 내에 있어서 가소화 기능을 갖는 상기 분자단의 국재화가 어려워지기 때문에, 일정 레벨의 기능을 발휘하기 위해 도입하지 않으면 안 되는 가소화 기능을 갖는 분자단의 중량 비율을 필요 이상으로 높이지 않으면 안 된다. 그 결과, 합성 고분자의 제조에 있어서의 반응 시간을 길게 하거나, 필요한 반응 온도를 높게 하거나, 하지 않으면 안 될 가능성이 있기 때문이다. 한편, 제2 세그먼트의 분자량의 분자량이 500000을 초과하는 경우에는, 분자량이 과대해져, 제1 세그먼트에 대한 제2 세그먼트의 결합 반응성이 저하될 우려가 있기 때문이다. 또한, 상기한 제2 세그먼트의 분자량은, 중량 평균 분자량이며, 일반적으로는 GPC를 사용한 공지의 방법으로 구해지는 것이다.
제1 세그먼트의 분자량(폴리펩티드 골격)에 대한 제2 세그먼트(폴리펩티드 골격에 대한 가소화 기능을 갖는 분자단)의 분자량은, 합성 고분자의 용도 등에 따라, 적절히 조정할 수 있다. 제2 세그먼트의 분자량(제1 세그먼트 1개에 대하여 2개 이상의 제2 세그먼트가 결합하고 있는 경우에는, 합계의 분자량)은, 제1 세그먼트의 분자량 100을 기준으로 하고, 예를 들면, 바람직하게는 1∼10000이며, 보다 바람직하게는 1.5∼9000이며, 더욱 바람직하게는 2∼8000이며, 보다 바람직하게는 3∼7000이며, 더욱 바람직하게는 5∼5000이며, 더욱 보다 바람직하게는 7∼3000이며, 더욱 보다 또한 바람직하게는 10∼2000이다. 제1 세그먼트의 분자량에 대한 제2 세그먼트의 분자량이 1 미만이면, 합성 고분자(성형 재료)를 사용하여 얻어지는 성형체에 있어서 가소성(유연성)이 불충분해질 가능성이 있고, 한편, 10000초과로 되면, 가소성이 과도하게 높아져, 성형체의 강성이 저하될 우려가 있다. 전술한 범위 내임으로써, 유연성이 보다 우수한 성형체를 제조하는 것이 가능하다. 또한, 제2 세그먼트의 분자량, 및 폴리펩티드 골격에 대한 가소화 기능을 갖는 분자단의 분자량은, 제1 세그먼트의 분자량, 또는 제1 세그먼트에 포함되는 폴리펩티드 골격의 분자량을 100이라고 했을 때(바람직하게는 제1 세그먼트에 포함되는 폴리펩티드 골격의 분자량을 100이라고 했을 때)에, 예를 들면, 1.4 이상, 1.5 이상, 1.6 이상, 1.7 이상, 1.8 이상, 1.9 이상, 2.0 이상, 5.0 이상, 10 이상, 20 이상, 30 이상, 40 이상이라도 좋다. 또한, 그 상한값은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 100 이하, 80 이하, 70 이하, 60 이하, 50 이하라도 좋다. 또한, 제2 세그먼트의 분자량은, 제1 세그먼트의 분자량을 100이라고 했을 때에, 바람직하게는 1∼70의 범위 내이며, 보다 바람직하게는 1.5∼60이며, 더욱 바람직하게는 1.5∼50이며, 특히 바람직하게는 2.0∼50이다. 제1 세그먼트(폴리펩티드 골격)의 분자량과 제2 세그먼트(폴리펩티드 골격에 대한 가소화 기능을 갖는 분자단)의 분자량의 비가 상기의 범위 내의 값인 경우에는, 예를 들면, 합성 고분자를 사용하여 얻어지는 성형체에 있어서, 폴리펩티드 골격을 갖고 있는 것에 의한 제1 세그먼트의 특성(예를 들면, 높은 기계적 강도)을 충분히 유지하면서, 합성 고분자 전체의 유연성, 혹은 연신성 등을 높이는 것이 기대될 수 있다. 또한, 상기한 제1 세그먼트의 분자량을 100이라고 했을 때의 제2 세그먼트의 분자량의 비율은 중량 평균 분자량으로 구한 것이다.
제1 세그먼트(폴리펩티드 골격)와 제2 세그먼트(가소화 기능을 갖는 분자단)의 합성 고분자 중의 함유 비율은, 합성 고분자의 용도 등에 따라, 적절히 조정할 수 있다. 이러한 함유 비율은, 질량비로, 제2 세그먼트를 100이라고 했을 때에, 제1 세그먼트가, 예를 들면, 50 이상, 60 이상, 70 이상, 80 이상, 90 이상, 100 이상, 110 이상, 150 이상, 200 이상, 250 이상, 300 이상, 300 이상, 400 이상, 450 이상, 500 이상, 550 이상, 600 이상이라도 좋다. 이러한 값의 상한값은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 1000 이하, 900 이하, 800 이하, 700 이하라도 좋다. 제1 세그먼트와 제2 세그먼트의 합성 고분자 중의 함유 비율이 상기의 범위 내의 값이라고 되어 있음으로써, 제2 세그먼트의 쓸데없는 사용이 억제되어, 합성 고분자의 제조 비용의 억제가 도모될 수 있다. 또한, 합성 고분자 중에 있어서의, 제1 세그먼트에 대한 제2 세그먼트의 함유 비율의 저감은, 예를 들면, 제1 세그먼트의 분자량의 저감 등에 의해 유리하게 실현될 수 있다.
전술한 실시 형태의 설명에 있어서는, 링커를 제2 세그먼트의 구성 요소로서 설명했지만, 제2 세그먼트와는 구별하여 취급해도 좋다. 또한, 링커를 제1 세그먼트의 구성 요소로서 취급할 수도 있다. 또한, 링커부의 분자량은 상기 폴리펩티드 골격 및 상기 분자단에 비하여 작지만, 링커를 제2 세그먼트와는 구별하여 취급하는 경우, 전술한 제2 세그먼트의 분자량은 링커부의 분자량을 뺀 범위를 제2 세그먼트의 분자량의 적합 범위인 것으로서 취급한다. 마찬가지로, 링커부를 제1 세그먼트의 구성 요소로서 취급하는 경우, 전술한 제1 세그먼트의 분자량은 링커부의 분자량을 더한 범위를 제1 세그먼트의 분자량의 적합 범위인 것으로서 취급한다.
[성형 재료 및 성형체]
성형 재료의 일 실시 형태는, 전술한 합성 고분자를 함유한다. 상기 성형 재료는, 전술한 합성 고분자를 함유하는 점에서, 유연성이 우수한 성형체를 제조할 수 있다. 성형 재료는, 전술한 합성 고분자에 더하여, 그 외의 성분을 포함해도 좋다. 그 외의 성분으로서는, 예를 들면, 폴리에스테르, 폴리아미드, 다당류 등의 범용 고분자나 무기염류 등을 들 수 있다. 성형 재료가 그 외의 성분을 포함하는 경우, 전술한 합성 고분자의 함유량은, 성형 재료 전체량을 기준으로, 예를 들면, 70질량% 이상, 80질량% 이상, 또는 90질량% 이상이라도 좋다.
성형체의 일 실시 형태는, 전술한 합성 고분자를 함유한다. 상기 성형체는, 전술한 합성 고분자를 함유하는 점에서 유연성이 우수하다.
[합성 고분자의 제조 방법]
전술한 합성 고분자는, 예를 들면, 폴리펩티드 골격을 구성하는 시스테인의 티올기(메르캅토기 또는 술피드릴기라고도 함)와, 말레이미드 또는 말레산 유도체의 탄소-탄소 이중 결합과의 1,4-부가 반응을 이용하고, 티오에테르 결합을 생성시킴으로써, 상기 분자단이 갖는 관능기(예를 들면, 폴리에테르기, 폴리에스테르기, 폴리카보네이트기, 폴리아미드기, 폴리올기, 및, 수식 다당기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종의 관능기)를 제1 세그먼트에 도입함으로써 제조할 수 있다. 전술한 합성 고분자는, 전술한 제조 방법의 일례를 응용하고, 예를 들면, 시스테인을 갖는 폴리펩티드 골격을 포함하는 화합물과, 당해 폴리펩티드 골격에 대한 가소화 기능을 갖는 분자단을 포함하고, 또한 티올기를 갖는 화합물과, 말레이미드기를 2개 이상 갖는 화합물을, 전술한 말레이미드기의 1,4-부가 반응을 이용하여 티오에테르 결합을 형성함으로써도 제조할 수 있다. 전술한 합성 고분자는, 그 외, 예를 들면, 에폭시기, 또는 이소시아네이트기에 대한 부가 반응, α-할로카르보닐기에 대한 치환 반응, 알키닐기와 아지드기의 사이의 Huisgen 환화 반응을 이용하여 제조할 수도 있다.
보다 일반적으로는, 합성 고분자의 제조 방법의 일 실시 형태는, 폴리펩티드 골격을 포함하는 화합물과, 하기 일반식(1A)∼(16A)로 나타나는 화합물의 적어도 1종을 반응시킴으로써 합성 고분자를 얻는 공정을 구비한다. 상기 공정은, 폴리펩티드 골격을 포함하는 화합물과, 하기 일반식(1A)∼(12A)로 나타나는 화합물을 반응시킴으로써 합성 고분자를 얻는 공정이라도 좋다. 상기 폴리펩티드 골격은, 티올기, 아미노기, 하이드록시기, 구아니디노기, 카르복시기, 페녹시기, 인돌기, 아미드기, 아지드기, 및 알키닐기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종을 갖고, 바람직하게는, 티올기, 아미노기, 하이드록시기, 구아니디노기, 카르복시기, 페녹시기, 인돌기, 및 아미드기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종을 갖는다. 폴리펩티드 골격을 포함하는 화합물과, 하기 일반식(1A)∼(12A) 또는 (14A)로 나타나는 화합물의 반응이 마이클 부가 반응이라도 좋다.
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상기 일반식(1A), (2A), (2B), (3A), (3B), (4A), (5A), (6A), (7A), (8A), (8B), (9A), (10A), (11A), (11B) 및 (12A)에 있어서 R2는, 상기 폴리펩티드 골격에 대한 가소화 기능을 갖는 분자단을 나타낸다. 상기 폴리펩티드 골격에 대한 가소화 기능을 갖는 분자단으로서는, 전술한 합성 고분자에 대한 설명에 있어서 예시한 것을 적용할 수 있다.
상기 일반식(2A), (2B), (3A), (3B), (4A), (5A), (6A), (8B), (9A), (10A), (11A) 및 (11B)에 있어서, Y는, 서로 독립적으로, 산소 원자, 황원자, 또는 NR1을 나타낸다. 상기 NR1에 있어서, R1은, 수소, 탄화수소기, 방향족기, 카르보닐기, 및 술포닐기를 나타내고, 상기 일반식(2A), (2B), (3A), (3B), (4A), (5A), (8A), (8B), (9A), (10A), (11A) 및 (11B)에 있어서 R은, 서로 독립적으로, 수소, 탄화수소기, 및 방향족기를 나타낸다. 상기 일반식(6A) 및 (12A)에 있어서, Z는 할로겐 원자, 술폰산 에스테르기, 및 불소 함유 카복실산 에스테르기를 나타낸다. 상기 일반식(15A)에 있어서, X는 할로겐 원자를 나타낸다.
폴리펩티드 골격을 갖는 화합물 하나(제1 세그먼트 하나)에 대하여 도입되는 폴리펩티드 골격에 대한 가소화 기능을 갖는 분자단(제2 세그먼트)의 수는, 폴리펩티드 골격을 구성하는 아미노산 서열에 유래하는 티올기, 아미노기, 하이드록시기, 구아니디노기, 카르복시기, 페녹시기, 인돌기, 아미드기, 아지드기, 및 알키닐기(바람직하게는, 티올기, 아미노기, 하이드록시기, 구아니디노기, 카르복시기, 페녹시기, 인돌기, 및 아미드기)의 합계 관능기수 이하가 되지만, 예를 들면, 1개 이상, 2개 이상, 또는 4개 이상이라도 좋고, 30개 이하, 25개 이하, 20개 이하, 15개 이하, 10개 이하, 또는 8개 이하라도 좋다. 폴리펩티드 골격을 갖는 화합물 하나(제1 세그먼트 하나)에 대하여 도입되는 폴리펩티드 골격에 대한 가소화 기능을 갖는 분자단(제2 세그먼트)의 수는 전술한 범위 내에서 조정할 수 있고, 예를 들면, 1∼30, 1∼25, 1∼20, 1∼15, 1∼10, 1∼8, 또는 2∼8이라도 좋다.
합성 고분자의 제조 방법에 있어서는, 예를 들면, 용매 중에서, 폴리펩티드 골격을 갖는 화합물과 일반식(1A)∼(16A)로 나타나는 화합물의 적어도 1종(바람직하게는 일반식(1A)∼(12A)로 나타나는 화합물)을 혼합해도 좋다. 또한, 반응이 진행하기 어려운 경우에는, 산, 염기의 첨가, 및 가온 등을 행해도 좋다. 반응 온도는, 통상, 0∼150℃이며, 예를 들면, 50∼150℃, 70∼120℃, 또는 90∼100℃라도 좋고, 또한, 10∼110℃, 20∼100℃, 또는 25∼90℃라도 좋다. 사용되는 용매는, 폴리펩티드 골격을 갖는 화합물 및 일반식(1A)∼(16A)로 나타나는 화합물을 용해할 수 있고, 소망하는 반응의 진행을 저해하지 않는 것이면 좋다. 이러한 용매로서는, 헥사플루오로이소프로필알코올(HFIP), 디메틸술폭시드(DMSO), 디메틸포름아미드(DMF), 디메틸아세트아미드(DMA), 아세트산, 포름산 등을 들 수 있다.
전술한 반응에 의해 얻어지는 생성물(합성 고분자를 포함하는 조제물)은, 예를 들면, 재침전, 순상 칼럼 크로마토그래피, 역상 칼럼 크로마토그래피, 사이즈 배제 크로마토그래피, 용매에 의한 세정 등에 의해 정제해도 좋다.
전술한 합성 고분자의 제조 방법의 일 실시 형태는, 폴리펩티드 골격을 포함하는 화합물과, 상기 폴리펩티드 골격에 대한 가소화 기능을 갖는 분자단을 포함하는 화합물과, 하기 일반식(2-1A)∼(2-16A)로 나타나는 구조 단위로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종의 구조 단위를 2개 이상 갖는 화합물을 반응시킴으로써 합성 고분자를 얻는 공정을 구비한다. 상기 공정은, 폴리펩티드 골격을 포함하는 화합물과, 상기 폴리펩티드 골격에 대한 가소화 기능을 갖는 분자단을 포함하는 화합물과, 하기 일반식(2-1A)∼(2-12A)로 나타나는 구조 단위로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종의 관능기를 2개 이상 갖는 화합물을 반응시킴으로써 합성 고분자를 얻는 공정이라도 좋다.
상기 폴리펩티드 골격은, 티올기, 아미노기, 하이드록시기, 구아니디노기, 카르복시기, 페녹시기, 인돌기, 아미드기, 아지드기, 및 알키닐기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종을 갖고, 바람직하게는, 티올기, 아미노기, 하이드록시기, 구아니디노기, 카르복시기, 페녹시기, 인돌기, 및 아미드기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종을 갖는다. 상기 분자단을 포함하는 화합물은, 티올기, 아미노기, 하이드록시기, 구아니디노기, 카르복시기, 페녹시기, 인돌기, 아미드기, 아지드기, 및 알키닐기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종을 갖고, 바람직하게는, 티올기, 아미노기, 하이드록시기, 구아니디노기, 카르복시기, 페녹시기, 인돌기, 및 아미드기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종을 갖는다. 폴리펩티드 골격이 갖는 관능기와, 상기 분자단을 포함하는 화합물이 갖는 관능기는, 일반식(2-1A)∼(2-16A)로 나타나는 구조 단위로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종의 관능기를 2개 이상 갖는 화합물의 관능기의 종류에 따라, 선택할 수 있고, 동일해도 상이해도 좋다. 폴리펩티드 골격이 갖는 관능기와, 상기 분자단을 포함하는 화합물이 갖는 관능기가 상이한 경우, 합성 고분자의 분자 구조의 제어를 보다 용이하게 행할 수 있다.
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상기 일반식(2-2A), (2-2B), (2-3A), (2-3B), (2-4A), (2-5A), (2-6A), (2-10A), (2-11A), 및 (2-11B)에 있어서, Y는, 서로 독립적으로, 산소 원자, 황원자, 또는 NR1을 나타낸다. R1은, 수소, 탄화수소기, 방향족기, 카르보닐기, 및 술포닐기를 나타낸다. 상기 일반식(2-2A), (2-2B), (2-3A), (2-3B), (2-4A), (2-8A), (2-8B), (2-9A), (2-10A), (2-11A), (2-11B), 및 (2-12A)에 있어서 R은, 서로 독립적으로, 수소, 탄화수소기, 및 방향족기를 나타낸다. 상기 일반식(2-6A) 및 (2-12A)에 있어서, Z는 할로겐 원자, 술폰산 에스테르기, 및 불소 함유 카복실산 에스테르기를 나타낸다. 상기 일반식(2-15A)에 있어서, X는 할로겐 원자를 나타낸다.
폴리펩티드 골격을 포함하는 화합물 및 상기 폴리펩티드 골격에 대한 가소화 기능을 갖는 분자단을 포함하는 화합물과, 전술한 특정 관능기를 2개 이상 갖는 화합물의 반응은, 예를 들면, 마이클 부가 반응 등이라도 좋다.
본 실시 형태에 따른 합성 고분자의 제조 방법에서는, 특정의 관능기를 갖는 폴리펩티드 골격을 포함하는 화합물, 및 폴리펩티드 골격에 대한 가소화 기능을 갖고, 특정의 관능기를 갖는 분자단을 포함하는 화합물에 대하여 반응하는 관능기를, 특정의 구조 단위를 2개 이상 갖는 화합물로서 나누고 있다. 이러한 제조 방법을 취함으로써, 특정의 관능기를 갖는 폴리펩티드 골격을 포함하는 화합물과, 폴리펩티드 골격에 대한 가소화 기능을 갖고, 특정의 관능기를 갖는 분자단을 포함하는 화합물과의 사이에서 반응을 진행시키지 않고, 반응 용액을 조제할 수 있다. 혼합해도 반응이 진행하지 않기 때문에, 충분히 균일한 상태가 될 때까지, 예를 들면, 시간을 들일 수도 있다. 균일한 반응 용액이 조제된 후, 특정의 구조 단위를 2개 이상 갖는 화합물을 배합함으로써, 반응을 개시시킴으로써, 반응계의 제어를 보다 용이하게 행할 수 있어, 보다 균일한 합성 고분자를 조제할 수 있다. 이러한 방법은, 폴리펩티드 골격이나 분자단의 종류에 따라 용매 등으로 용해성이 낮을 때에 특히 유용하다.
이상, 몇 가지의 실시 형태에 대해서 설명했지만, 본 개시는 상기 실시 형태에 하등 한정되는 것은 아니다. 또한, 전술한 실시 형태에 대한 설명 내용은, 서로 적용할 수 있다.
실시예
이하, 실시예 등에 기초하여 본 개시를 보다 구체적으로 설명한다. 단, 본 개시는 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
〔인공 피브로인의 제조〕
(1)발현 벡터의 제작
서열 번호 72로 나타나는 아미노산 서열(PRT27)을 갖는 인공 피브로인, 서열 번호 62로 나타나는 아미노산 서열(PRT17)을 갖는 인공 피브로인, 및 서열 번호 63으로 나타나는 아미노산 서열(PRT18)을 갖는 인공 피브로인을 설계했다. 또한, 서열 번호 72로 나타나는 아미노산 서열(PRT27)을 갖는 인공 피브로인의 평균 하이드로퍼시·인덱스의 값은 0.44이며, 서열 번호 62로 나타나는 아미노산 서열(PRT17)을 갖는 인공 피브로인의 평균 하이드로퍼시·인덱스의 값은 0.45이며, 서열 번호 63으로 나타나는 아미노산 서열(PRT18)을 갖는 인공 피브로인의 평균 하이드로퍼시·인덱스의 값은 0.46이다.
서열 번호 62로 나타나는 아미노산 서열(PRT17)은, 서열 번호 72로 나타나는 아미노산 서열(PRT27)에 대하여, 도메인 서열의 N말단측 및 C말단측의 각각으로부터 1번째에 위치하는 REP 중에, 각각 1개소씩 시스테인 잔기가 삽입된 것이다. 서열 번호 62로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인공 피브로인의 시스테인 잔기의 총수는 2이다. 서열 번호 63으로 나타나는 아미노산 서열(PRT18)은, 서열 번호 72로 나타나는 아미노산 서열(PRT27)에 대하여, 도메인 서열의 N말단측 및 C말단측 각각으로부터 1∼2번째에 위치하는 REP 중에, 각각 1개소씩 시스테인 잔기가 삽입된 것이다. 서열 번호 63으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인공 피브로인의 시스테인 잔기의 총수는 4이다.
서열 번호 62, 서열 번호 63 및 서열 번호 72로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인공 피브로인을 코딩하는 핵산을 각각 합성했다. 당해 핵산에는, 5’ 말단에 NdeI 사이트, 종지 코돈 하류에 EcoRI 사이트를 부가했다. 이 핵산을 클로닝 벡터(pUC118)에 클로닝했다. 그 후, 동(同) 핵산을 NdeI 및 EcoRI에서 제한 효소 처리하여 잘라낸 후, 단백질 발현 벡터 pET-22b(+)에 재조합하여 발현 벡터를 얻었다.
(2) 단백질의 제조
얻어진 발현 벡터로, 대장균 BLR(DE3)을 형질 전환했다. 당해 형질 전환 대장균을, 암피실린을 포함하는 2mL의 LB 배지에서 15시간 배양했다. 당해 배양액을, 암피실린을 포함하는 100mL의 시드 배양용 배지(표 4)에 OD600이 0.005가 되도록 첨가했다. 배양액 온도를 30℃로 유지하고, OD600이 5가 될 때까지 플라스크 배양을 행하여(약 15시간), 시드 배양액을 얻었다.
당해 시드 배양액을 500mL의 생산 배지(표 5)를 첨가한 자 퍼멘터에 OD600이 0.05가 되도록 첨가했다. 배양액 온도를 37℃로 유지하고, pH 6.9로 일정하게 제어하여 배양했다. 또한, 배양액 중의 용존 산소 농도를, 용존 산소 포화 농도의 20%로 유지하도록 했다.
생산 배지 중의 글루코스가 완전히 소비된 직후에, 피드액(글루코스 455g/1L, 이스트 익스트렉트(Yeast Extract) 120g/1L)을 1mL/분의 속도로 첨가했다. 배양액 온도를 37℃로 유지하고, pH 6.9로 일정하게 제어하여 배양했다. 또한 배양액 중의 용존 산소 농도를, 용존 산소 포화 농도의 20%로 유지하도록 하고, 20시간 배양을 행했다. 그 후, 1M의 이소프로필-β-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 대하여 종농도 1mM가 되도록 첨가하여, 인공 피브로인을 발현 유도시켰다. IPTG 첨가 후 20시간 경과한 시점에서, 배양액을 원심 분리하여, 균체를 회수했다. IPTG 첨가 전과 IPTG 첨가 후의 배양액으로부터 조제한 균체를 사용하여 SDS-PAGE를 행하고, IPTG 첨가에 의존한 목적으로 하는 인공 피브로인 사이즈의 밴드의 출현에 의해, 목적으로 하는 인공 피브로인의 발현을 확인했다.
(3) 단백질의 정제
IPTG를 첨가하고 나서 2시간 후에 회수한 균체를 20mM Tris-HCl buffer(pH 7.4)로 세정했다. 세정 후의 균체를 약 1mM의 PMSF를 포함하는 20mM Tris-HCl 완충액(pH 7.4)에 현탁시키고, 고압 호모게나이저(GEA Niro Soavi사 제조)로 세포를 파쇄했다. 파쇄한 세포를 원심 분리하여, 침전물을 얻었다. 얻어진 침전물을, 고순도가 될 때까지 20mM Tris-HCl 완충액(pH 7.4)으로 세정했다. 세정 후의 침전물을 100mg/mL의 농도가 되도록 8M 구아니딘 완충액(8M 구아니딘 염산염, 10mM 인산 2수소 나트륨, 20mM NaCl, 1mM Tris-HCl, pH 7.0)으로 현탁하고, 60℃에서 30분간, 스터러로 교반하여, 용해시켰다. 용해 후, 투석 튜브(산코준야쿠 주식회사 제조의 셀룰로오스 튜브 36/32)를 사용하여 물로 투석을 행했다. 투석 후에 얻어진 백색의 응집 단백질을 원심 분리에 의해 회수하고, 동결 건조기로 수분을 제거하여, 동결 건조 분말을 회수함으로써, 분말상의 인공 피브로인(PRT17, PRT18, PRT27)을 얻었다. 시스테인 잔기를 삽입한 인공 피브로인에 대해서, 분자간에서 디술피드 결합이 형성되어 있는 것을 확인했다. 인공 피브로인에, 단량체 100질량부에 대하여, 이량체가 13.8질량부, 삼량체가 2.1질량부, 사량체가 0.8질량부 포함되어 있는 것을 확인했다. 디술피드 결합의 형성은, SDS-PAGE에 의해, 측정했다.
(실시예 1)
수 평균 분자량: 5000의 메톡시폴리에틸렌글리콜말레이미드(시그마알드리치사 제조: 제2 세그먼트)를 사용하여, 합성 고분자를 조제했다. 구체적으로는, 유리 용기에, 전술한 바와 같이 하여 조제한 서열 번호 63으로 나타나는 아미노산 서열(PRT18)을 갖는, 수 평균 분자량: 50000의 인공 피브로인(제1 세그먼트)을 2500mg, 상기 메톡시폴리에틸렌글리콜말레이미드를 500mg 측정하여 취하고, 추가로 용매로서, 헥사플루오로이소프로필알코올(센트럴가라스 주식회사 제조, HFIP)을 50mL 더하고, 교반함으로써, 인공 피브로인 등을 용해시켜 반응 용액을 얻었다. 그 후, 실온(25℃)에서, 반응 용액을 20시간 교반함으로써 반응을 행했다.
20시간이 경과한 상태에서, 용매를 증류 제거하고, 조(粗)생성물을 메탄올(나카라이테스크 주식회사 제조)로 3회 세정했다. 1회의 세정에 메탄올 50mL를 사용했다. 세정 조작에 의해, 메톡시폴리에틸렌글리콜말레이미드 등의 미반응물을 제거했다. 세정 조작 후, 감압 건조를 행함으로써, 생성물(합성 고분자)을 얻었다. 생성물에 대한 SDS-PAGE에 의해, 분자량의 증대를 확인하고, 인공 피브로인에, 폴리에틸렌글리콜쇄가 도입되어 있는 것을 확인했다. 얻어진 합성 고분자는, 제1 세그먼트 하나에 대하여 1∼4개의 제2 세그먼트가 결합한 것으로 되어 있는 것을 확인했다. 도 6에 SDS-PAGE의 결과를 나타낸다. 도 6에 있어서, 1 및 7레인이 분자량 특정을 위한 표준 샘플이며, 2, 3이 서열 번호 63으로 나타나는 아미노산 서열(PRT18)을 갖는 인공 피브로인이며, 4가 실시예 1에서 조제한 상기 합성 고분자이다.
(실시예 2)
수 평균 분자량이 10000인 메톡시폴리에틸렌글리콜말레이미드(시그마알드리치 제조)를 사용한 것, 메톡시폴리에틸렌글리콜말레이미드의 배합량을 20mg으로 한 것, 인공 피브로인을 50mg으로 한 것, 용매로서 헥사플루오로이소프로필알코올(센트럴가라스 주식회사 제조, HFIP)을 1mL 더한 것, 및 조생성물의 1회의 세정에 메탄올1mL를 사용한 것 이외는, 실시예 1과 동일하게 하여, 합성 고분자를 조제했다. 생성물에 대한SDS-PAGE에 의해, 분자량의 증대를 확인하고, 인공 피브로인에, 폴리에틸렌글리콜쇄가 도입되어 있는 것을 확인했다. 얻어진 합성 고분자는, 제1 세그먼트 하나에 대하여 1∼4개의 제2 세그먼트가 결합한 것으로 되어 있는 것을 확인했다. 도 6에 있어서, 5레인이 실시예 2에서 조제한 상기 구성 고분자이다.
(실시예 3)
수 평균 분자량이 750인 메톡시폴리에틸렌글리콜말레이미드(시그마알드리치 제조)를 사용한 것, 및 메톡시폴리에틸렌글리콜말레이미드의 배합량을 1.5mg으로 한 것 이외는, 실시예 2와 동일하게 하여, 합성 고분자를 조제했다. 생성물에 대한 SDS-PAGE에 의해, 분자량의 증대를 확인하고, 인공 피브로인에, 폴리에틸렌글리콜쇄가 도입되어 있는 것을 확인했다. 얻어진 합성 고분자는, 제1 세그먼트 하나에 대하여 1∼4개의 제2 세그먼트가 결합한 것으로 되어 있는 것을 확인했다. 도 6에 있어서, 6레인이 실시예 3에서 조제한 상기 구성 고분자이다.
(비교예 1)
비교를 위해, 시스테인을 갖지 않는 인공 피브로인을 사용하여 동일한 실험을 행했다. 즉, 유리 용기에, 전술한 바와 같이 하여 조제한 서열 번호 72로 나타나는 아미노산 서열(PRT27)을 갖는 인공 피브로인(수 평균 분자량: 100000)을 20mg, 수 평균 분자량: 5000의 메톡시폴리에틸렌글리콜말레이미드(시그마알드리치 제조)를 4mg 측정하여 취하고, 추가로 용매로서, 헥사플루오로이소프로판올(센트럴가라스 주식회사 제조, HFIP)을 1mL 더하고, 교반함으로써, 인공 피브로인 등을 용해시켜 반응 용액을 얻었다. 그 후, 실온(25℃)에서, 반응 용액을 20시간 교반함으로써 반응을 행했다.
20시간이 경과한 상태에서, 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 메탄올(나카라이테스크 주식회사 제조)로 3회 세정했다. 1회의 세정에 메탄올 1mL를 사용했다. 세정 조작에 의해, 메톡시폴리에틸렌글리콜말레이미드 등의 미반응물을 제거했다. 세정 조작 후, 감압 건조를 행함으로써, 생성물을 얻었다. 생성물에 대한 SDS-PAGE에 의해, 분자량에 변화가 없는 것이 확인되고, 인공 피브로인과, 메톡시폴리에틸렌글리콜말레이미드의 반응이 진행하지 않는 것을 확인했다. 도 7에 SDS-PAGE의 결과를 나타낸다. 도 7에 있어서, 1레인이 분자량 특정을 위한 표준 샘플이며, 6레인이 생성물이며, 7레인이 서열 번호 72로 나타나는 아미노산 서열(PRT27)을 갖는 인공 피브로인이다.
(비교예 2)
전술한 바와 같이 하여 조제한 서열 번호 72로 나타나는 아미노산 서열(PRT27)을 갖는 인공 피브로인(수 평균 분자량: 100000)과, 폴리에틸렌옥사이드의 혼합물을 조제했다. 구체적으로는, 용기에, 상기 인공 피브로인 10g과, 상기 인공 피브로인 전체량을 100질량%로 하고, 5질량%의 중량이 되도록, 폴리에틸렌옥사이드(수 평균 분자량: 4000)를 배합하고, 비드밀(닛폰코크스고교 주식회사 제조, 아트리터)을 사용하여 회전수: 1000회/분의 조건으로 10분간, 건식 혼합시켜, 혼합물을 조제했다.
(비교예 3)
폴리에틸렌옥사이드로서, 수 평균 분자량 20000의 폴리에틸렌옥사이드를 사용한 것 외에, 비교예 2와 동일하게 하여, 혼합물을 조제했다.
(비교예 4)
전술한 바와 같이 하여 조제한 서열 번호 72로 나타나는 아미노산 서열(PRT27)을 갖는 인공 피브로인(수 평균 분자량: 100000)과, 폴리에틸렌옥사이드모노스테아레이트(40E.O., 수 평균 분자량: 2044)의 혼합물을 조제했다. 인공 피브로인 전량을 100질량%로 하고, 10질량%의 중량이 되도록, 폴리에틸렌옥사이드모노스테아레이트를 배합하고, 에탄올(99.5%) 중에서 15시간 혼합하고, 오븐에서 60℃에서 5시간 건조시켜, 혼합물을 조제했다.
<성형체의 평가>
실시예 1∼3에서 조제한 합성 고분자, 비교예 2, 3 및 4에서 조제한 혼합물을 사용하고, 각각 이하의 조건으로, 가열 가압 성형에 의해 성형체를 조제했다. 성형에는, 도 8에 나타내는 가압 성형기(10)를 사용했다. 도 8은, 가압 성형기의 모식 단면도이다. 도 8에 나타내는 가압 성형기(10)는, 관통공이 형성되고 가온 가능한 금형(2)과, 금형(2)의 관통공 내에서 상하동이 가능한 상측 핀(4) 및 하측 핀(6)을 구비하는 것이며, 금형(2)에, 상측 핀(4) 또는 하측 핀(6)을 삽입하여 발생하는 공극에, 샘플을 도입하고, 금형(2)을 가온하면서, 상측 핀(4) 및 하측 핀(6)으로 조성물을 압축함으로써, 성형체를 얻을 수 있다.
도 9를 사용하여, 성형체를 얻는 공정을 설명한다. 도 9의 (a)는 조성물 도입 전, (b)는 샘플 도입 직후, (c)은 샘플을 가열 및 가압하고 있는 상태의 가압 성형기의 모식 단면도이다. 도 9의 (a)에 나타내는 바와 같이, 금형(2)의 관통공에 하측 핀(6)만을 삽입한 상태에서 관통공 내에 조성물을 도입하고, 도 9의 (b)에 나타내는 바와 같이, 금형(2)의 관통공에 상측 핀(4)을 삽입하여 하강시키고, 금형(2)의 가열을 개시하고, 가열 가압 전의 샘플(8a)을 관통공 내에서 가열 가압한다. 미리 정한 가압력에 이를 때까지 상측 핀(4)을 하강시키고, 도 9의 (c)에 나타내는 상태에서 샘플이 소정의 온도에 도달할 때까지, 가열 및 가압을 계속하여, 가열 가압 후의 성형체(8b)를 얻는다. 경우에 따라, 냉각기(예를 들면, 스폿 쿨러)를 사용하여 금형(2)의 온도를 하강시키고, 성형체(8b)가 소정의 온도가 된 상태에서, 상측 핀(4) 또는 하측 핀(6)을 금형(2)으로부터 발취하여, 성형체를 얻어도 좋다. 가압에 관하여는, 하측 핀(6)을 고정한 상태에서 상측 핀(4)을 하강시켜 실시해도 좋지만, 상측 핀(4)의 하강과 하측 핀(6)의 상승의 양쪽을 실시해도 좋다.
구체적으로는 우선, 상기 합성 고분자 또는 상기 혼합물을 0.6g 측정하여 취하고, 도 8에 나타내는 가압 성형기(10)의 금형(2)(실시예 1에 대해서는, 직경: 14mm의 원형상의 관통공을 갖는 원기둥 형상의 금형을 사용하고, 비교예 2, 3 및 4에 대해서는, 단면이 35mm×25mm의 직사각 형상의 관통공을 갖는 원기둥 형상의 금형을 사용했음.)의 관통공 내에 도입했다. 이때, 두께가 균등해지도록 샘플을 첨가해 갔다. 모든 샘플을 도입한 후, 금형(2)의 가열을 개시함과 동시에, 핸드프레스기(NPa 시스템 주식회사 제조, 상품명: NT-100H-V09)를 사용하고, 상측 핀(4)과 하측 핀(6)을 관통공 내에 삽입함으로써 샘플의 가압을 행했다. 이때, 샘플의 가압 조건이 50MPa가 되도록 제어했다. 샘플의 온도가 150℃에 도달하고 나서 5분간 경과한 상태에서, 가열을 중지하고, 스폿 쿨러(토라스코나카야마 주식회사 제조, 상품명: TS-25EP-1)로 냉각하고, 샘플의 온도가 50℃가 된 상태에서 취출하고, 버어 제거를 행한 후, 직경: 14mm×두께: 3.0mm의 원반 형상의 성형체(비교예 2, 3 및 4는, 세로: 35mm×가로: 25mm×두께: 3.0mm의 직방체 형상의 성형체)를 얻었다. 또한, 성형에 사용한, 상기 성형 재료 및 상기 혼합물의 수분 함유량은, 가열 건조식 수분계로 측정한 결과, 모두 7∼9질량%였다.
얻어진 성형체에 대해서, 외관에 대한 육안 관찰, 및 블리드 아웃에 관하여 손가락으로 만져서 관측을 행하고, 이하의 기준으로 평가했다. 결과를 표 6에 나타낸다. 또한, 성형체의 외관을 도 10, 도 11 및 도 12에 나타낸다.
[외관의 평가 기준]
A: 균일하다.
B: 균일하지만 탁함이 보인다.
C: 불균일하다.
[블리드 아웃의 평가 기준]
A: 끈적임이 없다.
B: 성형 직후에 끈적임이 있지만, 닦아낸 후는 끈적임이 없다.
C: 닦아내도 끈적임이 남거나, 또는 재차 끈적임이 발생한다.
표 6 중, 「-」는, 측정을 실시하고 있지 않다는 것을 의미한다. 표 6, 도 10, 도 11, 도 12에 나타나는 결과로부터 확인되는 바와 같이, 제1 세그먼트와, 제2 세그먼트가 직접 결합하고 있음으로써, 실시예 1∼3에서는 상분리 등이 확인되지 않았다. 한편, 인공 피브로인과, 유연성의 고분자의 혼합물인 비교예 1∼4에서는, 상분리나 블리드 아웃이 발생하는 것이 확인되었다.
(실시예 4)
실시예 1에서 조제한 합성 고분자, 및 전술한 바와 같이 하여 조제한 서열 번호 72로 나타나는 아미노산 서열(PRT27)을 갖는 인공 피브로인(수 평균 분자량: 100000)을 포함하는 필름을 성형했다. 구체적으로는, 용기에 디메틸술폭시드 4.4g 측정하여 취하고, 여기에 상기 인공 피브로인 0.15g을 측정하여 취하고, 질소하에서 120℃의 조건하에서 15분간 교반하여 상기 인공 피브로인을 용해시켰다. 상기 인공 피브로인 0.15를 추가로 더하고, 질소하에서 120℃의 조건하에서 30분간 교반하여 상기 인공 피브로인이 합계 0.30g 용해된 용액을 조제했다. 상기 용액 중에, 상기 합성 고분자 0.15g을 측정하여 취하고, 질소하에서 90℃의 조건하에서 15분간 교반하여 상기 합성 고분자를 용해시켰다. 상기 합성 고분자 0.15g을 추가로 더하고, 질소하에서 90℃의 조건하에서 30분간 교반시킴으로써, 상기 인공 피브로인 및 상기 합성 고분자가 각각 0.30g씩 용해된 도프액을 조제했다. 도프액 중에 있어서, 합성 고분자:인공 피브로인:디메틸술폭시드가, 6질량%:6질량%:88질량%가 되도록 혼합비를 조정했다.
상기 도프액을 80℃하, 30분간 정치함으로써 탈포시켰다. 코터(주식회사 이모토세이사쿠쇼 제조)를 사용하여, 탈포 후의 도프액으로부터 필름을 성형했다. 우선, 이형 부재로서 PET 필름(150mm×200mm)을 코터 상에 설치하고, 애플리케이터 두께 0.5mm, 도공 스피드 20m/분간의 조건으로, 40℃의 온도 조건하에서 도프액의 액막을 상기 PET 필름 형상으로 마련했다. 그 후, 도프액의 액막을 PET 필름마다, 송풍 오븐 내에 정치하고, 100℃의 조건하에서 15분간 건조시키고, 추가로 진공 오븐으로 이동하고, 80℃의 조건하에서 15시간 걸쳐 진공 건조시키고, 절건(絶乾)시킴으로써, 합성 고분자 및 인공 피브로인으로 이루어지는 필름 형상의 성형체(필름)를 조제했다.
조제된 필름은 무색 투명이며, 유연성이 있는 것이 확인되었다. 당해 필름은 굽힘 응력을 가한 경우라도 균열이 발생하지 않는 것이 확인되었다.
(실시예 5)
전술한 바와 같이 하여 조제한 서열 번호 62로 나타나는 아미노산 서열(PRT17)을 갖는 인공 피브로인(수 평균 분자량: 50000: 제1 세그먼트) 2300mg과, 수 평균 분자량 20,000의 폴리에틸렌글리콜비스말레이미드, (Biochempeg Scientific Inc. 제조, HO022022-20K: 제2 세그먼트) 900mg을 가지 플라스크 내에서 115mL의 용매(DMSO, 키시다카가쿠 주식회사 제조)에 용해시킨 후, 트리에틸아민(나카라이테스크 주식회사 제조) 12μL를 더하고, 80℃에서 17시간 교반하면서 반응을 행했다. 아세트산 에틸(칸토카가쿠 주식회사 제조) 300mL, 추가로 헥산(칸토카가쿠 주식회사 제조) 300mL를 더하고, 2시간 정치하여 생성물을 침전시켰다. 추가로 원심(1,000g×10분)을 행하여, 상청을 제거했다. 미반응의 폴리에틸렌글리콜비스말레이미드를 제거하기 위해, 아세트산 에틸을 재차 첨가, 원심, 상청 제거를 3회 반복했다. 추가로, 감압 건조를 행함으로써 생성물을 얻었다. 조제된 합성 고분자는, 인공 피브로인(제1 세그먼트에 상당)의 분자쇄 말단에, 폴리에틸렌글리콜쇄를 갖는 N치환 말레이미드(제2 세그먼트에 상당)가 결합한 블록이 복수 반복된 구조를 갖는다. 즉, 당해 합성 고분자는, 제2 세그먼트, 제1 세그먼트, 및 제2 세그먼트의 순으로 3개의 세그먼트가 결합한 분자로 되어 있다.
전술한 바와 같이 조제한 합성 고분자를 포함하는 필름을 성형했다. 구체적으로는, 용기에 디메틸술폭시드 4.55g 측정하여 취하고, 여기에 상기 합성 고분자 0.45g을 더하고, 질소하에서 90℃의 조건하에서 30분간 교반시킴으로써, 상기 합성 고분자가 용해된 도프액을 조제했다. 교반 속도는 100rpm으로 설정했다. 도프액 중에 있어서, 합성 고분자:디메틸술폭시드가, 9질량%:91질량%가 되도록 혼합비를 조정했다.
상기 도프액을 사용하여, 실시예 4와 동일하게 하여 필름 형상의 성형체(필름)를 조제했다. 조제된 필름은 무색 투명이며, 실시예 4의 필름보다도 보다 유연성이 우수한 것이 확인되었다. 당해 필름은 굽힘 응력을 가한 경우라도 균열이 발생하지 않는 것이 확인되었다.
(실시예 6)
전술한 바와 같이 하여 조제한 서열 번호 62로 나타나는 아미노산 서열(PRT17)을 갖는 인공 피브로인(수 평균 분자량: 50000: 제1 세그먼트) 1424mg과, 수 평균 분자량 20,000의 메톡시폴리에틸렌글리콜말레이미드, (Biochempeg Scientific Inc. 제조, MF001022-20K: 제2 세그먼트) 1076mg을 가지 플라스크 내에서 71mL의 용매(DMSO, 키시다카가쿠 주식회사 제조)에 용해시킨 후, 트리에틸아민(나카라이테스크 주식회사 제조) 7.5μL를 더하고, 80℃에서 17시간 교반하면서 반응을 행했다. 아세트산 에틸(칸토카가쿠 주식회사 제조) 210mL, 추가로 헥산(칸토카가쿠 주식회사 제조) 210mL를 더하고, 17시간 정치하여 생성물을 침전시켰다. 추가로 원심(1,000g×10분)을 행하여, 상청을 제거했다. 미반응의 메톡시폴리에틸렌글리콜말레이미드를 제거하기 위해, 아세트산 에틸을 재차 첨가, 원심, 상청 제거를 3회 반복했다. 추가로 감압 건조를 행함으로써 합성 고분자를 얻었다. 조제된 합성 고분자는, 인공 피브로인(제1 세그먼트에 상당)의 분자쇄의 양 말단에, 폴리에틸렌글리콜쇄를 갖는 N치환 말레이미드(제2 세그먼트에 상당)가 결합한 구조를 갖는다. 즉, 당해 합성 고분자는, 제2 세그먼트, 제1 세그먼트, 및 제2 세그먼트의 순으로 3개의 세그먼트가 결합한 분자로 되어 있다.
전술한 바와 같이 조제한 합성 고분자를 포함하는 필름을 성형했다. 구체적으로는, 용기에 디메틸술폭시드 4.30g 측정하여 취하고, 여기에 상기 합성 고분자 0.70g을 더하고, 질소하에서 90℃의 조건하에서 30분간 교반시킴으로써, 상기 합성 고분자가 용해된 도프액을 조제했다. 교반 속도는 100rpm으로 설정했다. 도프액 중에 있어서, 합성 고분자:디메틸술폭시드가, 14질량%:86질량%가 되도록 혼합비를 조정했다.
상기 도프액을 사용하고, 실시예 4와 동일하게 하여 필름 형상의 성형체(필름)를 조제했다. 조제된 필름은 무색 투명이며, 실시예 4의 필름보다도 보다 유연성이 우수한 것이 확인되었다. 당해 필름은 굽힘 응력을 가한 경우라도 균열이 발생하지 않는 것이 확인되었다.
(실시예 7)
양 말단에 말레이미드기를 갖는 폴리에틸렌글리콜(바이오켐펙사 제조, 수 평균 분자량: 20000)과, 시스테인 잔기를 2개 갖는 인공 피브로인을 반응시켜, 합성 고분자를 조제했다. 구체적으로는, 전술한 바와 같이 조제한 서열 번호 62로 나타나는 아미노산 서열(PRT17)을 갖는 인공 피브로인(수 평균 분자량: 50000) 4.022g과, 양 말단에 말레이미드기를 갖는 폴리에틸렌글리콜 1.564g과, 용매로서 디메틸술폭시드 201mL를 가지 플라스크에 측정하여 취하고, 80℃에서 48시간 교반하여 용해 및 반응시켜, 합성 고분자의 용액을 얻었다. 얻어진 용액에, 아세트산 에틸 603mL, 및 헥산 603mL를 더하여 2시간 교반하고, 원심 분리를 행한 후, 추가로 아세트산 에틸로 3회 세정했다. 그 후, 이배퍼레이터로 건조시키고, 맨 마지막에 실온에서 진공 건조시켜 합성 고분자의 분말을 얻었다.
(실시예 8)
양 말단에 말레이미드기를 갖는 폴리에틸렌글리콜(바이오켐펙사 제조, 수 평균 분자량: 20000)과, 시스테인 잔기를 2개 갖는 인공 피브로인을, 반응시켜, 합성 고분자를 조제했다. 구체적으로는, 전술한 바와 같이 조제한 서열 번호 62로 나타나는 아미노산 서열(PRT17)을 갖는 인공 피브로인(수 평균 분자량: 50000) 348mg을 스테인리스 용기에 측정하여 취하고, 용매로서 디메틸술폭시드 2.11mL를 더하고, 교반하여 용해시켜 피브로인 용액을 얻었다. 또한, 양 말단에 말레이미드기를 갖는 폴리에틸렌글리콜 132mg을 유리 용기에 측정하여 취하고, 용매로서 디메틸술폭시드 1.09mL를 더하고, 교반하여 용해시켜 폴리에틸렌글리콜 용액을 얻었다. 얻어진 피브로인 용액과 폴리에틸렌글리콜 용액을 교반하면서 혼합하고, 100℃에서 5분간 교반하면서 반응시킨 후, 추가로 100℃에서 10분간 정치시켜 반응시킴으로써 합성 고분자를 조제했다. 실시예 8에서는, 디메틸술폭시드에 합성 고분자가 용해된 채의 상태에서, 건조시키는 일 없이, 후술하는 필름 성형에 제공했다.
(실시예 9)
양 말단에 말레이미드기를 갖는 폴리에틸렌글리콜(바이오켐펙사 제조, 수 평균 분자량: 20000)과, 시스테인 잔기를 2개 갖는 인공 피브로인과, 시스테인 잔기를 4개 갖는 인공 피브로인을 반응시켜, 합성 고분자를 조제했다. 구체적으로는, 전술한 바와 같이 조제한 서열 번호 62로 나타나는 아미노산 서열(PRT17)을 갖는 인공 피브로인(수 평균 분자량: 50000, 시스테인 잔기의 총수 2) 336mg과, 서열 번호 63으로 나타나는 아미노산 서열(PRT18)을 갖는 인공 피브로인(수 평균 분자량: 53100, 시스테인 잔기의 총수 4) 44mg과, 양 말단에 말레이미드기를 갖는 폴리에틸렌글리콜 160mg을 유리 용기에 측정하여 취하고, 용매로서 디메틸술폭시드 4.42mL를 더하고, 교반하면서 전술한 성분을 용해시킴으로써 반응 용액을 얻었다. 얻어진 반응 용액을 100℃에서 10분간 교반하면서 반응시킨 후, 추가로 100℃에서 5분간 정치시키고 반응시킴으로써, 합성 고분자를 조제했다. 실시예 9에서는, 디메틸술폭시드에 합성 고분자가 용해된 채의 상태에서, 건조시키는 일 없이, 후술하는 필름 성형에 제공했다.
(실시예 10)
양 말단에 말레이미드기를 갖는 폴리에틸렌글리콜(바이오켐펙사 제조, 수 평균 분자량: 20000)과, 티올기를 2개 갖는 2,2’-(에틸렌디옥시)디에탄티올, 시스테인 잔기를 2개 갖는 인공 피브로인을 반응시켜, 합성 고분자를 조제했다. 구체적으로는, 전술한 바와 같이 조제한 서열 번호 62로 나타나는 아미노산 서열(PRT17)을 갖는 인공 피브로인(수 평균 분자량: 50000) 300mg과, 양 말단에 말레이미드기를 갖는 폴리에틸렌글리콜 284mg을 유리 용기에 측정하여 취하고, 용매로서 디메틸술폭시드 3.42mL를 더하고, 교반하여 각 성분을 용해시킴으로써 반응 용액을 얻었다. 얻어진 반응 용액을 100℃에서 15분간 교반하여 반응시킨 후, 2,2’-(에틸렌디옥시)디에탄티올 1.55mg을 추가로 더하고, 100℃에서 10분간 교반시키고 반응시킴으로써 합성 고분자를 조제했다. 실시예 10에서는, 디메틸술폭시드에 합성 고분자가 용해된 채의 상태에서, 건조시키는 일 없이, 후술하는 필름 성형에 제공했다.
(실시예 11)
양 말단에 말레이미드기를 갖는 폴리에틸렌글리콜(바이오켐펙사 제조, 수 평균 분자량: 1000)과, 양 말단에 시스테인 잔기를 갖는(즉, 양 말단에 티올기를 갖는) 폴리에틸렌글리콜(바이오켐펙사 제조, 수 평균 분자량: 2000)과, 시스테인 잔기를 2개 갖는 인공 피브로인을 반응시켜, 합성 고분자를 조제했다. 구체적으로는, 전술한 바와 같이 조제한 서열 번호 62로 나타나는 아미노산 서열(PRT17)을 갖는 인공 피브로인(수 평균 분자량: 50000) 378mg과, 양 말단에 말레이미드기를 갖는 폴리에틸렌글리콜을 79mg과, 양 말단에 시스테인 잔기를 갖는 폴리에틸렌글리콜 143mg을 바이알병에 측정하여 취하고, 용매로서 디메틸술폭시드 4.40mL를 더하고, 교반하여 용해시킴으로써 반응 용액을 얻었다. 반응 용액을 100℃에서 10분간 교반하면서 반응시킨 후, 추가로 100℃에서 10분간 정치시켜 반응시킴으로써 합성 고분자를 조제했다. 실시예 11에서는, 디메틸술폭시드에 합성 고분자가 용해된 채의 상태에서, 건조시키는 일 없이, 후술하는 필름 성형에 제공했다.
(비교예 5)
실시예 7∼11에서 조제된 합성 고분자와의 비교를 위해, 전술한 바와 같이 하여 조제한 서열 번호 72로 나타나는 아미노산 서열(PRT27)을 갖는 인공 피브로인(분자량: 100000)을 사용하여, 유사의 조작을 가했다. 구체적으로는, 전술한 바와 같이 하여 조제한 서열 번호 72로 나타나는 아미노산 서열(PRT27)을 갖는 인공 피브로인(분자량: 100000)의 분말 650mg을 스테인리스 용기에 측정하여 취하고, 용매로서 디메틸술폭시드 3.955mL를 더하고, 교반하여 분산액을 얻었다. 얻어진 분산액을 120℃에서, 30분간 교반하여 용해한 후, 추가로 100℃에서 10분간 정치시켰다. 비교예 5에서는, 디메틸술폭시드에 인공 피브로인이 용해된 채의 상태에서, 건조시키는 일 없이, 후술하는 필름 성형에 제공했다.
<성형체의 평가>
실시예 7∼11에서 조제된 합성 고분자를 사용하여, 이하의 조건으로 필름 형상의 성형체를 제작했다. 실시예 7에서 조제된 합성 고분자에 대해서는, 우선 합성 고분자의 분말 530mg을 디메틸술폭시드 3.53mL에 더하고, 90℃에서 40분간 교반시킴으로써, 상기 분말을 용해시켜 도프 용액을 조제하고, 이어서 80℃에서 30분간 정치하고, 탈포시킨 것을 필름 성형에 제공했다. 실시예 8∼11에서 조제된 합성 고분자는, 디메틸술폭시드에 용해시킨 채, 건조시키는 일 없이, 도프 용액으로서 필름 성형에 제공했다. 또한, 비교예 5의 인공 피브로인도 마찬가지로 디메틸술폭시드에 용해된 채, 건조시키는 일 없이 도프 용액으로서 필름 성형에 제공했다.
우선, 이형 부재로서 PET 필름(150mm×200mm)을 준비하고, 애플리케이터로 두께 0.4mm가 되도록 도프 용액의 액막을, 상기 PET 필름 상에 마련했다. 그 후, 상기 액막을 PET 필름마다, 송풍 오븐 내에 정치하고, 60℃의 조건하에서 30분간 건조시키고, 추가로 진공 오븐으로 이동하고, 80℃의 조건하에서 15시간 걸쳐 진공 건조시키고, 절건시킴으로써 합성 고분자 또는 인공 피브로인으로 이루어지는 필름 형상의 성형체(필름)를 조제했다.
조제된 각 필름에 대하여 인장 시험을 행함으로써, 탄성률, 인장 강도, 파단 신도, 및 터프니스를 평가했다. 결과를 표 7에 나타낸다. 표 7에는 절건 상태에 있어서의 필름의 막두께도 병기했다. 또한, 표 7에 나타내는 파단 신도는, 비교예 5에서 얻어진 결과를 기준으로 하는 상대값이라고 기재했다.
표 7에 나타나는 바와 같이, 실시예 7∼11에서 얻어진 필름은, 비교예 5에서 얻어진 필름과 비교하여, 파단 신도가 매우 크고, 또한 탄성률이 낮게 억제되어 있는 것을 알 수 있다. 이 점에서도, 실시예 7∼11에서 얻어진 필름은 유연성이 충분히 우수한 것을 확인할 수 있다. 게다가, 실시예 7∼11에서 얻어진 필름은 터프니스도 충분히 우수한 것으로 되어 있다.
실시예 7 및 실시예 8의 결과로부터, 일단 분체로서 합성 고분자를 단리하고 재차 용해시키고 나서 필름을 조제하는 것보다도 반응 후의 용액으로부터 직접 필름을 성형함으로써 탄성률, 파단 신도 및 터프니스가 우수한 필름을 조제할 수 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 실시예 8, 실시예 10 및 실시예 11의 결과로부터, 제2 세그먼트를 구성하는 유연함을 조제함으로써, 얻어지는 필름의 유연성을 조제할 수 있고, 제2 세그먼트를 길게 함으로써, 그 경향이 현저해지는 것이 확인되었다.
(실시예 12)
전술한 바와 같이 하여 조제한 서열 번호 62로 나타나는 아미노산 서열(PRT17)을 갖는 인공 피브로인(수 평균 분자량: 50000: 제1 세그먼트) 2177mg과, 수 평균 분자량 20000의 폴리에틸렌글리콜비스말레이미드, (Biochempeg Scientific Inc. 제조, HO022022-20K: 제2 세그먼트) 823mg을 염화 리튬의 농도가 2M인 디메틸술폭시드 용액(DMSO, 키시다카가쿠 주식회사 제조) 12000mg에 용해시킨 후, 질소하에서, 100℃에서 4시간 교반하면서 반응시킴으로써, 상기 합성 고분자가 용해된 도프액을 조제했다. 교반 속도는 100rpm으로 설정했다. 도프액 중에 있어서, 합성 고분자:디메틸술폭시드가, 20질량%:80질량%가 되도록 혼합비를 조정했다. 얻어진 도프의 100℃에 있어서의 점도는, 10900mPa·s였다. 조제된 도프액 중의 합성 고분자는, 인공 피브로인(제1 세그먼트에 상당)의 분자쇄 말단에, 폴리에틸렌글리콜쇄를 갖는 N치환 말레이미드(제2 세그먼트에 상당)가 결합한 블록이 복수 반복된 구조를 갖는다.
상기 도프액을 사용하여, 이하에 나타내는 조건으로 건습식 방사함으로써, 섬유를 조제했다. 100℃의 도프액을 노즐(노즐 직경: 0.1mm)로부터 기어 펌프에 의해 질소 가스와 함께 압출하고, 제 1 응고욕(제1욕), 제2 응고욕(제2욕), 및 연신욕(제3욕)을 통과시킨 후, 60℃로 설정한 가열식 롤러에 의해 권취했다. 연신욕에서의 연신 배율은 8.5배로 설정했다. 제1욕는 0℃의 메탄올욕으로 하고, 제2욕은 25℃의 메탄올욕으로 하고, 제3욕은 54℃의 수욕으로 했다. 얻어진 섬유는 충분한 신장성을 갖는 것을 확인했다. 얻어진 섬유의 외관을 도 13에 나타낸다.
이상의 실시예는, 제2 세그먼트가 말레이미드기를 갖는 경우에 대한 예로 나타냈다. 이하에 말레이미드기를 대신하여 상이한 관능기를 사용한 경우, 및 제1 세그먼트 및 제2 세그먼트의 사이의 결합종을 바꾼 경우에 대해서도 확인적으로 몇 가지의 예를 나타낸다.
(실시예 13)
수 평균 분자량: 6000의 폴리(에틸렌글리콜)글리시딜에테르(머크사 제조: 제2 세그먼트)를 사용하여, 합성 고분자를 조제했다. 구체적으로는, 유리 용기에, 전술한 바와 같이 하여 조제한 서열 번호 62로 나타나는 아미노산 서열(PRT17)을 갖는, 수 평균 분자량: 50000의 인공 피브로인(제1 세그먼트)을 27mg, 상기 폴리(에틸렌글리콜)글리시딜에테르를 3.1mg 측정하여 취했다. 또한, 트리에틸아민(나카라이사 제조)을 0.14μL, 및 용매로서 염화 리튬의 N,N-디메틸포름아미드 용액(염화 리튬 농도가 2질량%)을 1.73mL 더하여, 반응 용액을 얻었다. 또한, 염화 리튬은 후지필름와코준야쿠 제조의 물을 사용하고, N,N-디메틸포름아미드는 칸토카가쿠의 물을 사용했다.
전술한 반응 용액을 50℃ 또는 80℃에서, 3시간 또는 20시간 반응시켰다. 반응 후, RO수를 6mL 더하여 생성물을 침전시키고, 원심 분리하여 용매를 제거했다. 또한, RO수로 3회, 아세톤으로 2회 세정하고, 그때마다 원심 분리에 의해 세정액을 제거했다. 또한, 1회의 세정에는 용매(RO수 또는 아세톤)를 15mL 사용했다. 이러한 세정 조작에 의해, 미반응의 폴리(에틸렌글리콜)디글리시딜에테르 등을 제거했다. 세정 후, 감압 건조시킴으로써, 합성 고분자를 얻었다. 얻어진 합성 고분자에 대한 GPC 측정에 의해, 생성물인 합성 고분자의 분자량이 반응 전의 인공 피브로인보다도 증대하고 있는 것이 확인되고, 인공 피브로인과 폴리(에틸렌글리콜)디글리시딜에테르의 사이에서 공유 결합이 형성되어 있는 것이 확인되었다. GPC의 결과를 도 14에 나타낸다.
(실시예 14)
수 평균 분자량: 20000의 폴리에틸렌글리콜(나카라이사 제조)과 헥사메틸렌디이소시아네이트(도쿄카세이사 제조)를 반응시켜, 제2 세그먼트에 상당하는 고분자 화합물을 조제했다. 상기 고분자 화합물과, 인공 피브로인을 반응시킴으로써 합성 고분자를 조제했다.
구체적으로는, 유리 용기에, 상기 폴리에틸렌글리콜을 197mg 측정하여 취하고, 용매로서 N,N-디메틸포름아미드를 0.847μL 더하고 40℃로 가열하여 용해시켰다. 이것을 25℃로 되돌리고, 상기 헥사메틸렌디이소시아네이트 3.2μL를 더하여 반응액을 조제했다. 반응액을 40℃ 또는 60℃에서, 4시간 교반함으로써, 반응을 행했다.
또한, 서열 번호 72로 나타나는 아미노산 서열(PRT27)을 갖는, 수 평균 분자량: 10000의 인공 피브로인(제1 세그먼트) 42.9mg을 다른 유리 용기에 측정하여 취하고, 여기에 용매로서 염화 리튬의 N,N-디메틸포름아미드 용액(염화 리튬 농도가 2질량%)을 1.47mL 더하고, 100℃에서 10분간 가열함으로써 용해시켜 용액을 조제했다. 또한, 그것과는 별개로, 서열 번호 62로 나타나는 아미노산 서열(PRT17)을 갖는, 수 평균 분자량 50000의 인공 피브로인(제1 세그먼트) 42.9mg을 다른 유리 용기에 측정하여 취하고, 여기에 용매로서 염화 리튬의 N,N-디메틸포름아미드 용액(염화 리튬 농도가 2질량%)을 1.47mL 더하고, 60℃에서 10분간 가열함으로써 용해시켜 용액을 조제했다. 그들 2종류의 인공 피브로인 용액을 각각 30℃까지 방냉했다.
제2 세그먼트에 상당하는 고분자 화합물을 포함하는 용액에 염화 리튬 16mg 더하여 조제한 용액을, 상기 2종류의 인공 피브로인 용액의 각각에 대하여 86mg 더하여, 2종류의 반응 용액을 얻었다. 그 후, 각 반응 용액을 30℃에서, 20시간 교반함으로써 각각 반응을 행했다.
반응 후, 실시예 13과 동일한 방법으로 세정하고, 미반응의 고분자 화합물 등을 제거했다. 세정 후, 감압 건조시킴으로써, 서열 번호 72로 나타나는 아미노산 서열(PRT27)을 갖는 인공 피브로인을 포함하는 합성 고분자와, 서열 번호 62로 나타나는 아미노산 서열(PRT17)을 갖는 인공 피브로인을 포함하는 합성 고분자를 얻었다. 얻어진 2종류의 합성 고분자에 대한 GPC 측정에 의해, 생성물인 2종류의 합성 고분자의 분자량이, 모두 반응 전의 인공 피브로인보다도 증대하고 있는 것이 확인되고, 인공 피브로인과 고분자 화합물(폴리에틸렌글리콜과 헥사메틸렌디이소시아네이트의 반응물)의 사이에서 공유 결합이 형성되어 있는 것이 확인되었다. GPC의 결과를 도 15에 나타낸다. 도 15의 (a)는 서열 번호 72로 나타나는 아미노산 서열(PRT27)을 갖는 인공 피브로인을 포함하는 합성 고분자의 결과를 나타내고, 도 15의 (b)는 서열 번호 62로 나타나는 아미노산 서열(PRT17)을 갖는 인공 피브로인을 포함하는 합성 고분자의 결과를 나타낸다.
(실시예 15)
수 평균 분자량: 20000의 폴리에틸렌글리콜(나카라이사 제조)과 3-부틴산(3-Butynoic Acid, 도쿄카세이사 제조)을 반응시켜, 제2 세그먼트에 상당하는 고분자 화합물을 조제했다. 상기 고분자 화합물과, 인공 피브로인을 반응시킴으로써 합성 고분자를 조제했다.
구체적으로는, 유리 용기에, 상기 폴리에틸렌글리콜 1g, 3-부틴산 25mg, 산 촉매로서 p-톨루엔술폰산(키시다카가쿠사 제조) 10.3mg을 측정하여 취하고, 용매로서 톨루엔(키시다카가쿠 제조) 10mL를 더하여 반응액을 얻었다. 당해 반응액을 90℃에서 20시간 교반함으로써 반응을 행했다. 20시간이 경과한 시점에서, 사이클로펜틸메틸에테르(후지필름와코준야쿠사 제조)를 50mL 더하여 2시간 정치하고, 침전시켰다. 침전물을 여집(濾集)하고, 사이클로펜틸메틸에테르로 3회 세정하여, 분말을 얻었다. 1회의 세정에 용매(사이클로펜틸메틸에테르)를 15mL 사용했다. 세정 조작에 의해, 3-부틴산 등의 미반응물을 제거했다. 이 침전과 정제 작업을 2회 반복하고, 감압 건조를 행함으로써, 제2 세그먼트에 상당하는 고분자 화합물의 분말을 얻었다.
다음으로 유리 용기에, 전술한 바와 같이 하여 조제한 서열 번호 62로 나타나는 아미노산 서열(PRT17)을 갖는, 수 평균 분자량: 50000의 인공 피브로인(제1 세그먼트)을 40mg, 상기 고분자 화합물을 16mg, 염기 촉매로서 트리에틸아민(나카라이사 제조)을 0.22μL 또는 1.67μL, 용매로서, 염화 리튬의 N,N-디메틸포름아미드 용액(염화 리튬 농도가 2질량%) 또는 디메틸술폭시드를 2.8mL 더하여, 반응 용액을 조제했다. 당해 반응 용액을 25℃ 또는 80℃에서 20시간 교반함으로써 반응을 행했다.
반응 후, 실시예 13과 동일한 방법으로 세정하고, 미반응의 고분자 화합물 등을 제거했다. 세정 후, 감압 건조시킴으로써, 합성 고분자를 얻었다. 얻어진 합성 고분자에 대한 GPC 측정에 의해, 생성물인 합성 고분자의 분자량이, 반응 전의 인공 피브로인보다도 증대하고 있는 것이 확인되고, 인공 피브로인과 고분자 화합물(폴리에틸렌글리콜과 3-부틴산의 반응물)의 사이에서 공유 결합이 형성되어 있는 것이 확인되었다. GPC의 결과를 도 16에 나타낸다.
(실시예 16)
수 평균 분자량: 20000의 폴리에틸렌글리콜(나카라이사 제조)과, 브로모아세트산 메틸(도쿄카세이사 제조)을 반응시켜, 제2 세그먼트에 상당하는 고분자 화합물을 조정했다. 상기 고분자 화합물과, 인공 피브로인을 반응시킴으로써, 합성 고분자를 조제했다. 당해 반응액을 90℃에서 20시간 교반함으로써 반응을 행했다.
구체적으로는, 유리 용기에, 상기 폴리에틸렌글리콜을 300mg, 브로모아세트산 메틸을 8.3μL, 산 촉매로서 p-톨루엔술폰산(키시다카가쿠사 제조)을 3.1mg 측정하여 취하고, 용매로서 톨루엔(키시다카가쿠사 제조)을 3mL 더하여 반응액을 조제했다. 당해 반응액을 90℃에서 20시간 교반함으로써 반응을 행했다. 20시간이 경과한 시점에서, 사이클로펜틸메틸에테르(후지필름와코준야쿠사 제조)를 50mL 더하여 2시간 정치하고, 침전시켰다. 침전물을 여집하고, 사이클로펜틸메틸에테르로 3회 세정하고, 침전시켰다. 침전물을 여집하고, 사이클로펜틸메틸에테르로 3회 세정하여, 분말을 얻었다. 1회의 세정에 용매(사이클로펜틸메틸에테르)를 5mL 사용했다. 세정 조작에 의해, 브로모아세트산 메틸 등의 미반응물을 제거했다. 이 침전과 정제 작업을 2회 반복하고, 감압 건조를 행함으로써, 제2 세그먼트에 상당하는 고분자 화합물의 분말을 얻었다.
다음으로 유리 용기에, 전술한 바와 같이 하여 조제한 서열 번호 62로 나타나는 아미노산 서열(PRT17)을 갖는, 수 평균 분자량: 50000의 인공 피브로인(제1 세그먼트)을 36mg, 상기 고분자 화합물을 13.7mg, 염기촉매로서 트리에틸아민(나카라이사 제조)을 0.19μL, 용매로서, 염화 리튬의 N,N-디메틸포름아미드 용액(염화 리튬 농도가 2질량%)을 2.9mL 더하여, 반응 용액을 조제했다. 당해 반응 용액을 50℃에서 20시간 교반함으로써 반응을 행했다.
반응 후, 실시예 13과 동일한 방법으로 세정하고, 미반응의 고분자 화합물 등을 제거했다. 세정 후, 감압 건조시킴으로써, 합성 고분자를 얻었다. 얻어진 합성 고분자에 대한 GPC 측정에 의해, 생성물인 합성 고분자의 분자량이, 반응 전의 인공 피브로인보다도 증대하고 있는 것이 확인되고, 인공 피브로인과 고분자 화합물(폴리에틸렌글리콜과 브로모아세트산 메틸의 반응물)의 사이에서 공유 결합이 형성되어 있는 것이 확인되었다. GPC의 결과를 도 17에 나타낸다.
(실시예 17)
수 평균 분자량: 400의 폴리에틸렌글리콜(후지필름와코준야쿠사 제조), p-톨루엔술폰산 1수화물(키시다카가쿠사 제조), 및 아지드화 나트륨(나카라이사 제조)을 반응시켜, 제2 세그먼트에 상당하는 고분자 화합물을 조제했다. 또한, 인공 피브로인과, 브롬화 프로파르길(도쿄카세이사 제조)를 반응시켜, 제1 세그먼트에 상당하는 알키닐기를 갖는 인공 피브로인(제1 세그먼트)을 조제하고, 상기 고분자 화합물과 반응시킴으로써, 합성 고분자를 조제했다.
구체적으로는, 유리 용기에, 상기 폴리에틸렌글리콜을 200mg, 염화 파라톨루엔술포닐을 210mg, 염기촉매로서 트리에틸아민(나카라이사 제조)을 348μL 측정하여 취하고, 반응액을 조제했다. 당해 반응액을 25℃에서 5시간 교반함으로써, 반응을 행했다. 5시간 경과 후, 1N 염산(칸토카가쿠사 제조)을 9mL, 아세트산 에틸(칸토카가쿠사 제조)을 9mL 더하고, 분액 깔대기로 이동하여, 아세트산 에틸 추출을 3회 행했다. 추가로 탄산수소나트륨 용액(칸토카가쿠사 제조), 포화 식염수(칸토카가쿠사 제조)로 아세트산 에틸층을 세정하고, 황산 나트륨(나카라이사 제조)으로 탈수했다. 그 후, 감압 건조를 행함으로써, 반응물을 얻었다.
다음으로, 유리 용기에, 상기 반응물을 20mg, 아지드화 나트륨을 5.5mg, 촉매로서 테트라부틸암모늄요오다이드(도쿄카세이사 제조)를 0.5mg, 용매로서 디메틸술폭시드(키시다카가쿠사 제조) 1mL를 더하여 반응액을 조제했다. 당해 반응액을 80℃에서 20시간 교반함으로써 반응시켰다. 20시간이 경과한 시점에서, 포화 염화 암모늄 용액(칸토카가쿠사 제조) 3mL를 더하고, 분액 깔대기로 이동하여, 아세트산 에틸 추출을 3회 행했다. 추가로 황산 나트륨(나카라이사 제조)으로 탈수했다. 그 후, 감압 건조를 행함으로써, 제2 세그먼트에 상당하는 고분자 화합물을 얻었다.
다음으로 유리 용기에, 전술한 바와 같이 하여 조제한 서열 번호 62로 나타나는 아미노산 서열(PRT17)을 갖는, 수 평균 분자량: 50000의 인공 피브로인(제1 세그먼트)을 30mg, 브롬화 프로파르길을 0.9μL, 용매로서 디메틸술폭시드(키시다카가쿠사 제조)를 1mL 더하여, 반응액을 조제했다. 당해 반응액을, 25℃에서 20시간 교반함으로써, 반응시켰다. 20시간이 경과한 시점에서, 아세트산 에틸(칸토카가쿠사 제조) 3mL를 더하여 생성물을 침전시켰다. 침전물을 여집하고, 아세트산 에틸로 3회 세정했다. 1회의 세정에 용매(아세트산 에틸)를 5mL 사용했다. 세정 조작에 의해, 브롬화 프로파르길 등의 미반응물을 제거했다. 세정 조작 후, 감압 건조를 행함으로써, 제1 세그먼트에 상당하는 알키닐기를 갖는 인공 피브로인(제1 세그먼트)을 얻었다.
유리 용기에, 상기 고분자 화합물 0.4mg과, 상기 제1 세그먼트에 상당하는 알키닐기를 갖는 인공 피브로인(제1 세그먼트) 30mg과, 촉매로서 요오드화 구리(I)(나카라이사 제조)를 0.17mg, 용매로서 디메틸술폭시드(키시다카가쿠사 제조)를 1mL 측정하여 취하고, 반응 용액을 조제했다. 당해 반응 용액을, 80℃에서 20시간 교반함으로써, 반응을 행했다. 20시간이 경과한 시점에서, 아세트산 에틸 3mL를 더하여, 생성물을 침전시켰다. 침전물을 여집하고, 아세트산 에틸로 3회 세정했다. 1회의 세정에 용매(아세트산 에틸)를 5mL 사용했다. 세정 조작에 의해, 미반응의 고분자 화합물 등을 제거했다. 세정 후, 감압 건조시킴으로써, 합성 고분자를 얻었다. 얻어진 합성 고분자에 대한 GPC 측정에 의해, 생성물인 합성 고분자의 분자량이, 반응 전의 인공 피브로인보다도 증대하고 있는 것이 확인되고, 알키닐기를 갖는 인공 피브로인과 고분자 화합물(폴리에틸렌글리콜과 아지드화 나트륨의 반응물)의 사이에서 공유 결합이 형성되어 있는 것이 확인되었다. GPC의 결과를 도 18에 나타낸다.
(참고예 1: 구조 단백질의 소수성 평가(용해성))
인공 피브로인, 실크 피브로인(평균 하이드로퍼시·인덱스의 값: 0.21)에 대해서, 9M 브롬화 리튬 수용액으로의 용해성을 평가했다. 실크 피브로인으로서는, KB 세이렌사 제조의 「실크 파우더 IM」을 사용하고, 인공 피브로인으로서는, 전술한 바와 같이 하여 조제한 서열 번호 62로 나타나는 아미노산 서열(PRT17)을 갖는 인공 피브로인(수 평균 분자량: 50000), 및 전술한 바와 같이 하여 조제한 서열 번호 72로 나타나는 아미노산 서열(PRT27)을 갖는 인공 피브로인(수 평균 분자량: 100000)을 사용했다. 용해성의 평가는, 구체적으로는, 9M 브롬화 리튬 수용액에 각각 실크 피브로인, 인공 피브로인을 소정량 더하고, 60℃에서 30분간 교반한 후의 수용액의 외관을 관찰함으로써, 용해성을 평가했다. 결과를 표 8에 나타낸다. 표 8 중, 「A」는 첨가한 피브로인이 완전히 용해되어, 설정한 농도의 용액을 조제할 수 있었던 것을 나타내고, 「B」는 피브로인의 용해 잔여물이 관찰된 것을 나타낸다. 즉, 인공 피브로인은 60℃의 9M 브롬화 리튬 수용액에 대해서도 5질량% 상당의 양도 용해시킬 수 없는, 소수성이 높은 피브로인인 것이 확인되었다.
(참고예 2: 구조 단백질의 소수성 평가(내열수성))
인공 피브로인, 실크 피브로인에 대해서, 열수내성 시험을 행하고, 내열수성을 평가했다. 실크 피브로인으로서는, KB 세이렌사 제조의 「실크 파우더 IM」을 사용하고, 인공 피브로인으로서는, 전술한 바와 같이 하여 조제한 서열 번호 62로 나타나는 아미노산 서열(PRT17)을 갖는 인공 피브로인(수 평균 분자량: 50000)을 사용했다. 피브로인의 함유량이 5질량%가 되도록, 유리 용기에 피브로인 50mg, 용매로서 RO수를 950mg 더하여 분산액을 조제했다. 당해 분산액을 100℃에서 5시간 교반했다. 5시간이 경과한 상태에서, 원심 분리에 의해 용매를 제거했다. 용매를 제거 후 아세톤으로 2회 세정하고, 원심 분리에 의해 아세톤을 제거했다. 세정 조작 후, 감압 건조를 행함으로써 처리 분말을 얻었다. 처리 분말에 대한 GPC 측정에 의해, 분해의 정도를 확인했다. GPC의 결과를 도 19에 나타낸다. 도 19로부터 분명한 바와 같이, 실크 피브로인은 처리 전과 비교하여 분자량의 감소가 확인되고, 인공 피브로인에는 그러한 분자량의 감소가 확인되지 않았다. 이 결과로부터, 상기의 인공 피브로인은 RO수에 대한 친수성이 실크 피브로인보다도 낮았기 때문이라고 추정된다. 바꾸어 말하면, 상기 인공 피브로인은 소수성이 높다고 말할 수 있다. 또한, 도 19 중, 서열 번호 62로 나타나는 아미노산 서열(PRT17)을 갖는 인공 피브로인(수 평균 분자량: 50000)의 결과를 PRT100이라고 기재한다.
(참고예 3: 구조 단백질의 소수성 평가(접촉각))
인공 피브로인, 실크 피브로인에 대해서, 물에 대한 접촉각의 측정 및 평가를 행했다. 실크 피브로인으로서는, KB 세이렌사 제조의 「실크 파우더 IM」을 사용하고, 인공 피브로인으로서는, 전술한 바와 같이 하여 조제한 서열 번호 62로 나타나는 아미노산 서열(PRT17)을 갖는 인공 피브로인(수 평균 분자량: 50000), 및 전술한 바와 같이 하여 조제한 서열 번호 72로 나타나는 아미노산 서열(PRT27)을 갖는 인공 피브로인(수 평균 분자량: 100000)을 사용했다. 접촉각의 측정은, 구체적으로는 우선, 피브로인의 함유량이 3질량%가 되도록, 유리 용기에 피브로인 30mg, 용매로서 디메틸술폭시드 970mg을 더하여, 분산액을 조제했다. 당해 분산액을 100℃에서 15분간 교반하여 디메틸술폭시드 용액을 조제했다. 다음으로, 슬라이드 글라스 상에, 두께 100μm의 마스킹 테이프를 접착심으로 하고, 전술한 바와 같이 하여 조제한 디메틸술폭시드 용액을 캐스트하여 액막을 형성했다. 그 후, 슬라이드 글라스마다, 진공 오븐(도쿄리카키카이사) 제조, 제품명: VOS-210C) 내로 이동, 정치하고, 80℃에서 감압 건조를 행함으로써 피브로인의 필름(막)을 형성했다. 당해 필름에 대하여, 2μL의 RO수를 적하하고, 5초간 경과 후의 물의 접촉각을, 접촉각계(쿄와카이멘카가쿠사 제조, 제품명: DMs-061)를 사용하여 측정했다. 측정은 각 피브로인에 대하여, 6샘플로 행하고, 그 평균값을 평가에 사용했다. 결과를 표 9 및 도 20에 나타낸다. 표 9에 나타내는 바와 같이, 실크 피브로인에 비하여 인공 피브로인은 물의 접촉각이 크고, 소수성이 높은 것이 확인되었다. 도 20 중, 실크 피브로인의 결과를 왼쪽에 나타내고, 서열 번호 62로 나타나는 아미노산 서열(PRT17)을 갖는 인공 피브로인의 결과를 오른쪽에 나타내고, 서열 번호 72로 나타나는 아미노산 서열(PRT27)을 갖는 인공 피브로인의 결과를 중앙에 나타낸다.
본 개시에 의하면, 펩티드 골격을 갖는 고분자 재료로서, 유연성이 우수한 성형체를 제조 가능한 합성 고분자를 제공할 수 있다. 본 개시에 의하면 또한, 전술한 합성 고분자를 함유하는 성형 재료 및 성형체를 제공할 수 있다.
본 개시에 의하면, 제1 세그먼트에 대하여 도입하는 제2 세그먼트의 선택에 의해, 합성 고분자의 물성 및 기능을 조정하는 것이 가능하다. 나아가서는, 상기 합성 고분자를 사용하여 조제되는 성형체의 물성 및 기능을 조정할 수 있다.
2: 금형
4: 상측 핀
6: 하측 핀
8a: 샘플
8b: 성형체
10: 가압 성형기
4: 상측 핀
6: 하측 핀
8a: 샘플
8b: 성형체
10: 가압 성형기
SEQUENCE LISTING
<110> Spiber Inc.
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composition and Moldied article
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Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly
465 470 475 480
Pro Tyr Gly Pro Gly Gln Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ser
485 490 495
Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Gly Gln Asn Gly Pro Gly Ser Gly
500 505 510
Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Ser Ala Ala Ala Ala
515 520 525
Ala Gly Gln Tyr Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro
530 535 540
Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gly Ser Gly Pro Gly
545 550 555 560
Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gln Ser Gly Ser Gly Gln Gln Gly
565 570 575
Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro
580 585 590
Gly Ser Gly Cys Gln Gln Gly Pro Gly Ala Ser
595 600
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20 25 30
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35 40 45
Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ser
50 55 60
Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln
65 70 75 80
Cys Gly Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly
85 90 95
Gln Gln Gly Pro Gly Ala Ser Gly Gln Tyr Cys Gly Pro Gly Gln Gln
100 105 110
Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly
115 120 125
Gln Tyr Gly Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Ser Ala Ala
130 135 140
Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Gly Pro Tyr Gly
145 150 155 160
Pro Gly Ala Ser Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro
165 170 175
Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly
180 185 190
Gln Tyr Gly Pro Tyr Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gly
195 200 205
Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gln Ser Gly Ser
210 215 220
Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Ala Ser Ala Ala Ala
225 230 235 240
Ala Ala Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Ala
245 250 255
Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro
260 265 270
Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Gly Gln Asn Gly Pro Gly Ser Gly Gln Tyr
275 280 285
Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly
290 295 300
Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala
305 310 315 320
Ala Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro
325 330 335
Gly Ser Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ser Ser
340 345 350
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr
355 360 365
Gly Pro Gly Gln Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gln Gln Gly
370 375 380
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435 440 445
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450 455 460
Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gly Pro Gly
465 470 475 480
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100 105 110
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130 135 140
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Gly Pro Gly Ala Ser Cys Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro
245 250 255
Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gly Tyr Gly Pro Gly
260 265 270
Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Gly Gln Asn Gly Pro Gly
275 280 285
Ser Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Ser Ala Ala
290 295 300
Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser
305 310 315 320
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly
325 330 335
Gln Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly
340 345 350
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355 360 365
Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gln Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln
370 375 380
Tyr Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Cys
385 390 395 400
Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala
405 410 415
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420 425 430
Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gly Ser Gly Pro Gly
435 440 445
Gln Tyr Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gln Ser Cys Gly Pro Gly Ser Gly
450 455 460
Gln Gln Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala
465 470 475 480
Ala Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Cys Gly Pro Tyr Gly Pro Gly
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Gln Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Gln Tyr Gly Pro
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530 535 540
Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Cys Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser
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20 25 30
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115 120 125
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130 135 140
Pro Gly Ser Gly Ile Tyr Gly Ile Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser
145 150 155 160
Gly Pro Gly Ile Tyr Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro Ser Ala Ser Ala
165 170 175
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Gly Val Phe Gly Pro Gly Ile Tyr Gly Pro
180 185 190
Tyr Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ile Tyr Gly Ser Gly Pro Gly
195 200 205
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210 215 220
Pro Gly Val Phe Gly Pro Tyr Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro
225 230 235 240
Gly Val Phe Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala
245 250 255
Gly Ile Tyr Gly Tyr Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro Tyr Gly Pro Gly
260 265 270
Ala Ser Gly Ile Asn Gly Pro Gly Ser Gly Ile Tyr Gly Pro Gly Val
275 280 285
Phe Gly Pro Gly Ile Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Val Phe
290 295 300
Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ile Tyr
305 310 315 320
Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro Gly Ile Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Gly
325 330 335
Pro Gly Val Phe Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala
340 345 350
Ala Gly Ile Tyr Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ile
355 360 365
Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ile Tyr Val Phe Gly Pro Gly Val Phe
370 375 380
Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro Tyr
385 390 395 400
Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ile Tyr Gly
405 410 415
Pro Gly Val Phe Gly Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ile
420 425 430
Tyr Gly Ser Gly Pro Gly Ile Tyr Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ile Ser
435 440 445
Gly Pro Gly Ser Gly Val Phe Gly Ile Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala
450 455 460
Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ile Tyr Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro
465 470 475 480
Tyr Gly Pro Gly Ile Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly
485 490 495
Ile Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Gly Ile Asn Gly Pro Gly Ser Gly Ile
500 505 510
Tyr Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro Gly Ile Ser Ala Ala Ala Ala Ala
515 520 525
Gly Ile Tyr Val Phe Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro Tyr Gly Pro Gly
530 535 540
Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ile Tyr Gly Ser Gly Pro Gly Val
545 550 555 560
Phe Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ile Ser Gly Ser Gly Val Phe Gly Pro
565 570 575
Gly Val Phe Gly Pro Tyr Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly
580 585 590
Ser Gly Val Phe Gly Pro Gly Ala Ser
595 600
Claims (29)
- 폴리펩티드 골격을 포함하는 제1 세그먼트와,
상기 제1 세그먼트에 결합하는 하나 또는 복수의 제2 세그먼트를 갖고,
상기 제2 세그먼트가 상기 폴리펩티드 골격에 대한 가소화 기능을 갖는 분자단을 포함하는 합성 고분자. - 제1항에 있어서,
상기 폴리펩티드 골격이 소수성 폴리펩티드 골격인 합성 고분자. - 제2항에 있어서,
상기 소수성 폴리펩티드 골격의 평균 하이드로퍼시·인덱스가 0.22 이상인 합성 고분자. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제2 세그먼트의 분자량이, 상기 제1 세그먼트의 분자량을 100이라고 했을 때에 1∼70의 범위 내의 값인 합성 고분자. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제2 세그먼트가, 폴리에테르, 폴리에스테르, 폴리카보네이트, 폴리아미드, 폴리올, 폴리올레핀, 폴리아세탈, 폴리케탈, 폴리(메타)아크릴레이트, 실리콘, 폴리우레탄, 폴리알킬렌이민, 페놀 수지, 우레아 수지, 멜라민 수지, 및 다당류로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종에 유래하는 골격을 포함하는 합성 고분자. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제2 세그먼트가, 폴리에테르기, 폴리에스테르기, 폴리카보네이트기, 폴리아미드기, 폴리올기, 및, 수식 다당기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종을 포함하는 합성 고분자. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 세그먼트를 복수 갖고,
상기 제2 세그먼트의 일부가 2 이상의 상기 제1 세그먼트와 결합하여 네트워크 구조를 형성하고 있는 합성 고분자. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 세그먼트를 복수 갖고,
상기 제1 세그먼트와 제2 세그먼트가 교대로 결합하고 있는 합성 고분자. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제2 세그먼트가 복수의 상기 분자단을 포함하고, 복수의 상기 분자단이 서로 연결하고 있는 합성 고분자. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
제2 세그먼트가 링커를 추가로 포함하고,
상기 링커를 통하여 상기 분자단과 상기 폴리펩티드가 결합하고 있는 합성 고분자. - 제10항에 있어서,
상기 링커가, 하기 식(1)로 나타나는 구조 단위, 하기 일반식(2a)∼(6)으로 나타나는 구조 단위, 하기 식(7)로 나타나는 구조 단위, 하기 일반식(8a)∼(9)로 나타나는 구조 단위, 하기 일반식(10)∼(11b)로 나타나는 구조 단위, 및 하기 일반식(13)∼(16)으로 나타나는 구조 단위로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종을 포함하고,
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
[화학식 6]
[화학식 7]
[화학식 8]
[화학식 9]
[화학식 10]
[화학식 11]
[화학식 12]
[화학식 13]
[화학식 14]
[화학식 15]
[화학식 16]
[화학식 17]
[화학식 18]
[화학식 19]
상기 일반식(2a), (2b), (3a), (4a), (4b), (5), (6), (10), (11a) 및 (11b)에 있어서, Y는, 서로 독립적으로, 산소 원자, 황원자, 또는 NR1을 나타내고, R1은, 수소, 탄화수소기, 방향족기, 카르보닐기, 및 술포닐기를 나타내고,
상기 일반식(2a), (2b), (3a), (4a), (4b), (8a), (8b), (9), (10), (11a) 및 (11b)에 있어서, R은, 서로 독립적으로, 수소, 탄화수소기, 및 방향족기를 나타내는 합성 고분자. - 제11항에 있어서,
상기 링커가, 상기 식(1)로 나타나는 구조 단위, 그리고, 상기 일반식(2a), (3a), (4a), (4b) 및 (10)으로 나타나는 구조 단위로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종인 합성 고분자. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리펩티드 골격이 인공 단백질에 유래하는 골격을 포함하는 합성 고분자. - 제13항에 있어서,
상기 인공 단백질이 인공 구조 단백질을 포함하는 합성 고분자. - 제14항에 있어서,
상기 인공 구조 단백질이 인공 피브로인을 포함하는 합성 고분자. - 제15항에 있어서,
상기 인공 피브로인이 인공 개변 거미줄 피브로인을 포함하는 합성 고분자. - 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 기재된 합성 고분자를 함유하는 성형 재료.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 기재된 합성 고분자를 함유하는 성형체.
- 폴리펩티드 골격을 포함하는 화합물과, 하기 일반식(1A)∼(16A)로 나타나는 화합물의 적어도 1종을 반응시킴으로써 합성 고분자를 얻는 공정을 구비하고,
상기 폴리펩티드 골격은, 티올기, 아미노기, 하이드록시기, 구아니디노기, 카르복시기, 페녹시기, 인돌기, 아미드기, 아지드기, 및 알키닐기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종을 갖고,
[화학식 20]
[화학식 21]
[화학식 22]
[화학식 23]
[화학식 24]
[화학식 25]
[화학식 26]
[화학식 27]
[화학식 28]
[화학식 29]
[화학식 30]
[화학식 31]
[화학식 32]
[화학식 33]
[화학식 34]
[화학식 35]
[화학식 36]
[화학식 37]
[화학식 38]
[화학식 39]
상기 일반식(1A), (2A), (2B), (3A), (3B), (4A), (5A), (6A), (7A), (8A), (8B), (9A), (10A), (11A), (11B) 및 (12A)에 있어서 R2는, 상기 폴리펩티드 골격에 대한 가소화 기능을 갖는 분자단을 나타내고,
상기 일반식(2A), (2B), (3A), (3B), (4A), (5A), (6A), (8B), (9A), (10A), (11A) 및 (11B)에 있어서, Y는, 서로 독립적으로, 산소 원자, 황원자, 또는 NR1을 나타내고, R1은, 수소, 탄화수소기, 방향족기, 카르보닐기, 및 술포닐기를 나타내고,
상기 일반식(2A), (2B), (3A), (3B), (4A), (5A), (8A), (8B), (9A), (10A), (11A) 및 (11B)에 있어서 R은, 서로 독립적으로, 수소, 탄화수소기, 및 방향족기를 나타내고,
상기 일반식(6A) 및 (12A)에 있어서, Z는 할로겐 원자, 술폰산 에스테르기, 및 불소 함유 카복실산 에스테르기를 나타내고,
상기 일반식(15A)에 있어서, X는 할로겐 원자를 나타내는 합성 고분자의 제조 방법. - 제19항에 있어서,
폴리펩티드 골격을 포함하는 화합물과, 상기 일반식(1A)∼(12A) 또는 (14A)로 나타나는 화합물의 반응이 마이클 부가 반응인 제조 방법. - 제20항에 있어서,
상기 폴리펩티드 골격이 소수성 폴리펩티드 골격인 제조 방법. - 제21항에 있어서,
상기 소수성 폴리펩티드 골격의 평균 하이드로퍼시·인덱스가 0.22 이상인 제조 방법. - 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리펩티드 골격에 대한 가소화 기능을 갖는 분자단의 분자량이, 상기 폴리펩티드 골격의 분자량을 100이라고 했을 때에 1∼70의 범위 내의 값인 제조 방법. - 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리펩티드 골격을 갖는 화합물이 인공 단백질을 포함하는 제조 방법. - 제24항에 있어서,
상기 인공 단백질이 인공 구조 단백질을 포함하는 제조 방법. - 폴리펩티드 골격을 포함하는 화합물과, 상기 폴리펩티드 골격에 대한 가소화 기능을 갖는 분자단을 포함하는 화합물과, 하기 일반식(2-1A)∼(2-16A)로 나타나는 구조 단위로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종의 구조 단위를 2개 이상 갖는 화합물을 반응시킴으로써 합성 고분자를 얻는 공정을 구비하고,
상기 폴리펩티드 골격은, 티올기, 아미노기, 하이드록시기, 구아니디노기, 카르복시기, 페녹시기, 인돌기, 아미드기, 아지드기, 및 알키닐기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종을 갖고,
상기 분자단을 포함하는 화합물은, 티올기, 아미노기, 하이드록시기, 구아니디노기, 카르복시기, 페녹시기, 인돌기, 아미드기, 아지드기, 및 알키닐기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종을 갖고,
[화학식 40]
[화학식 41]
[화학식 42]
[화학식 43]
[화학식 44]
[화학식 45]
[화학식 46]
[화학식 47]
[화학식 48]
[화학식 49]
[화학식 50]
[화학식 51]
[화학식 52]
[화학식 53]
[화학식 54]
[화학식 55]
[화학식 56]
[화학식 57]
[화학식 58]
[화학식 59]
상기 일반식(2-2A), (2-2B), (2-3A), (2-3B), (2-4A), (2-5A), (2-6A), (2-10A), (2-11A), 및 (2-11B)에 있어서, Y는, 서로 독립적으로, 산소 원자, 황원자, 또는 NR1을 나타내고, R1은, 수소, 탄화수소기, 방향족기, 카르보닐기, 및 술포닐기를 나타내고,
상기 일반식(2-2A), (2-2B), (2-3A), (2-3B), (2-4A), (2-8A), (2-8B), (2-9A), (2-10A), (2-11A), (2-11B), 및 (2-12A)에 있어서 R은, 서로 독립적으로, 수소, 탄화수소기, 및 방향족기를 나타내고,
상기 일반식(2-6A) 및 (2-12A)에 있어서, Z는 할로겐 원자, 술폰산 에스테르기, 및 불소 함유 카복실산 에스테르기를 나타내고,
상기 일반식(2-15A)에 있어서, X는 할로겐 원자를 나타내는 합성 고분자의 제조 방법. - 제26항에 있어서,
상기 폴리펩티드 골격이 소수성 폴리펩티드 골격인 제조 방법. - 제27항에 있어서,
상기 소수성 폴리펩티드 골격의 평균 하이드로퍼시·인덱스가 0.22 이상인 제조 방법. - 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리펩티드 골격에 대한 가소화 기능을 갖는 분자단의 분자량이, 상기 폴리펩티드 골격의 분자량을 100이라고 했을 때에 1∼70의 범위 내의 값인 제조 방법.
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