JP2022162038A - 合成高分子及びその製造方法、成形材料、並びに、成形体 - Google Patents

合成高分子及びその製造方法、成形材料、並びに、成形体 Download PDF

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奈緒 北原
Nao Kitahara
誠司 白川
Seiji Shirakawa
健太郎 ▲高▼橋
Kentaro Takahashi
れおな 武藤
Reona Muto
オリバ－ セイエッド シャファート
Syed Shafaat Oliver
秀樹 加賀田
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Abstract

【課題】ペプチド骨格を有する高分子材料であって、柔軟性に優れる成形体を製造可能な合成高分子及びその製造方法を提供すること。【解決手段】本開示の一側面は、ポリペプチド骨格を含む第一のセグメントと、上記第一のセグメントに直接結合する一又は複数の第二のセグメントと、を有し、上記第二のセグメントが上記ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を含む、合成高分子を提供する。【選択図】なし

Description

本開示は、合成高分子及びその製造方法、成形材料、並びに、成形体に関する。
絹糸フィブロイン及びクモ糸フィブロインといった構造タンパク質は、優れた堅牢性を発揮し得ることから、合成樹脂等で構成される構造材料の代替物質として注目されている。近年においては、組換え技術の発展によって上述のような構造タンパク質を模した組換え構造タンパク質の量産技術の開発が進んでいる（例えば、特許文献１）。
タンパク質は主鎖にはアミド基、側鎖にはカルボキシ基、アミノ基、水酸基、チオール基といった極性基を多く有することから、分子間において多数の水素結合が形成される。このため、構造タンパク質を加熱加圧成形することで得られる成形体は機械的な強度に優れると考えられるが、衝撃等を受けることによって、ひび、割れが生じるなど脆い側面も有している。上述のような事情が、タンパク質を一般的な汎用プラスチックの代替品として使用する障害となっている。
国際公開第２０１５／１７８４６６号
構造タンパク質を用いて成形体を形成するにあたり、汎用プラスチックのように可塑剤を添加することで成形体の柔軟性を向上させることも考えられる。しかし、可塑剤は一般的に疎水性であり、上述のような極性基を多く有するタンパク質との相溶性が低い。本発明者らの検討によれば、構造タンパク質に可塑剤を混合し成形体を形成した場合、構造タンパク質と可塑剤との間で相分離が生じ、期待するような効果を得られないことが判明している。また、タンパク質や構造タンパク質を用いたフィルムや繊維等の加熱加圧成形以外の成形手法で製造されるタンパク質成形体においても高い柔軟性を有することが望まれる。
本開示は、ペプチド骨格を有する高分子材料であって、柔軟性に優れる成形体を製造可能な合成高分子及びその製造方法を提供することを目的とする。本開示はまた、上述の合成高分子を含有する成形材料及び成形体を提供することを目的とする。
本開示の一側面は、ポリペプチド骨格を含む第一のセグメントと、上記第一のセグメントに直接結合する一又は複数の第二のセグメントと、を有し、上記第二のセグメントが上記ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を含む、合成高分子を提供する。
上記合成高分子は、第二のセグメントを有することから、タンパク質同様にポリペプチド骨格を有しながら、合成高分子全体として、柔軟性に優れる材料となっている。また、上記合成高分子は、第一のセグメントと第二のセグメントとが直接結合しているため、タンパク質に可塑剤を単純に混合する場合のようなマクロな相分離の発生が低減されている。このため、柔軟性に優れる成形体を製造可能である。
上記ポリペプチド骨格は疎水性ポリペプチド骨格であってよい。当該疎水性ポリペプチド骨格の平均ハイドロパシー・インデックス（疎水性度：疎水性指標）が０．２２以上であってよい。ポリペプチド骨格が上述のような疎水性ポリペプチド骨格であることによって、可塑化機能を有する分子団との第一のセグメントとの親和性が向上し、より柔軟性に優れる成形体を製造できる。
上記第二のセグメントの分子量が、上記第一のセグメントの分子量を１００としたときに１～７０の範囲内の値であってよい。これによって、合成高分子を用いて得られる成形体において、第一のセグメントの特性（例えば、高い機械的強度）を保持しつつ、成形体全体の柔軟性が有利に高めることができる。
上記第二のセグメントが、ポリエーテル、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリオール、ポリオフィン、ポリアセタール、ポリケタール、ポリ（メタ）アクリレート、シリコーン、ポリウレタン、ポリアルキレンイミン、フェノール樹脂、尿素樹脂、メラミン樹脂、及び多糖類からなる群より選択される少なくとも一種に由来する骨格を含んでもよい。
上記第二のセグメントが、ポリエーテル基、ポリエステル基、ポリカーボネート基、ポリアミド基、ポリオール基、及び、修飾多糖基からなる群より選択される少なくとも一種を含んでもよい。
上記第一のセグメントを複数有し、上記第二のセグメントの一部が２以上の上記第一のセグメントと結合してネットワーク構造を形成していてもよい。ネットワーク構造を有することで、例えば、上記合成高分子で構成される成形体は大きな伸度を発揮し得る。またネットワーク構造を有することで、例えば、上記合成高分子で構成される成形体に弾性体としての機能を付与し得る。
上記第一のセグメントを複数有し、上記第一のセグメントと第二のセグメントとが交互に結合していてもよい。第一のセグメントと第二のセグメントとが交互に結合することによって、例えば、上記合成高分子で構成される成形体は大きな伸度を発揮し得る。
上記第二のセグメントが複数の上記分子団を含み、複数の上記分子団が互いに連結していてもよい。第二セグメントの設計の幅をより広げることができ、合成高分子の柔軟性をより容易に調整できる。
第二のセグメントがリンカー（反応性官能基）を更に含み、上記リンカーを介して上記分子団と上記ポリペプチドとが結合していてもよい。
上記リンカーが、下記式（１）で表される構造単位、下記一般式（２ａ）～（６）で表される構造単位、下記式（７）で表される構造単位、下記一般式（８ａ）～（９）で表される構造単位、下記一般式（１０）～（１１ｂ）で表される構造単位、及び下記一般式（１３）～（１６）で表される構造単位からなる群より選択される少なくとも一種を含んでもよい。
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上記一般式（２ａ）、（２ｂ）、（３ａ）、（４ａ）、（４ｂ）、（５）、（６）、（１０）、（１１ａ）及び（１１ｂ）において、Ｙは、互いに独立に、酸素原子、硫黄原子、又はＮＲ１を示し、Ｒ１は、水素、炭化水素基、芳香族基、カルボニル基、及びスルホニル基を示し、上記一般式（２ａ）、（２ｂ）、（３ａ）、（４ａ）、（４ｂ）、（８ａ）、（８ｂ）、（９）、（１０）、（１１ａ）及び（１１ｂ）において、Ｒは、互いに独立に、水素、炭化水素基、及び芳香族基を示す。
上記リンカーが、上記式（１）で表される構造単位、並びに、上記一般式（２ａ）、（３ａ）、（４ａ）、（４ｂ）及び（１０）で表される構造単位からなる群より選択される少なくとも一種であってよい。
上記ポリペプチド骨格が人工タンパク質に由来する骨格を含んでもよい。
上記人工タンパク質が人工構造タンパク質を含んでもよい。
上記人工構造タンパク質が人工フィブロインを含んでもよい。
上記人工フィブロインが人工改変クモ糸フィブロインを含んでもよい。
本開示の一側面は、上述の合成高分子を含有する、成形材料を提供する。
上記成形材料は、上述の合成高分子を含有することから、柔軟性に優れる成形体を製造することができる。
本開示の一側面は、上述の合成高分子を含有する、成形体を提供する。
上記成形体は、上述の合成高分子を含有することから柔軟性に優れる。
本開示の一側面は、ポリペプチド骨格を含む化合物と、下記一般式（１Ａ）～（１６Ａ）で表される化合物とを反応させることによって合成高分子を得る工程を備え、上記ポリペプチド骨格は、チオール基、アミノ基、ヒドロキシ基、グアニジノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、インドール基、アミド基、アジド基、及びアルキニル基からなる群より選択される少なくとも一種を有する、合成高分子の製造方法を提供する。
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上記一般式（１Ａ）、（２Ａ）、（２Ｂ）、（３Ａ）、（３Ｂ）、（４Ａ）、（５Ａ）、（６Ａ）、（７Ａ）、（８Ａ）、（８Ｂ）、（９Ａ）、（１０Ａ）、（１１Ａ）、（１１Ｂ）及び（１２Ａ）においてＲ２は、上記ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を示し、上記一般式（２Ａ）、（２Ｂ）、（３Ａ）、（３Ｂ）、（４Ａ）、（５Ａ）、（６Ａ）、（８Ｂ）、（９Ａ）、（１０Ａ）、（１１Ａ）及び（１１Ｂ）において、Ｙは、互いに独立に、酸素原子、硫黄原子、又はＮＲ１を示し、Ｒ１は、水素、炭化水素基、芳香族基、カルボニル基、及びスルホニル基を示し、上記一般式（２Ａ）、（２Ｂ）、（３Ａ）、（３Ｂ）、（４Ａ）、（５Ａ）、（８Ａ）、（８Ｂ）、（９Ａ）、（１０Ａ）、（１１Ａ）及び（１１Ｂ）においてＲは、互いに独立に、水素、炭化水素基、及び芳香族基を示し、上記一般式（６Ａ）及び（１２Ａ）において、Ｚはハロゲン原子、スルホン酸エステル基、及び含フッ素カルボン酸エステル基を示し、上記一般式（１５Ａ）において、Ｘはハロゲン原子を示す。
上記合成高分子の製造方法は、特定の官能基を有するポリペプチド骨格を含む化合物と、ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を有する、下記一般式（１Ａ）～（１６Ａ）で表される特定の化合物と、を反応させることによって合成高分子を調製している。こうすることによって、得られる合成高分子は、ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を有し、タンパク質同様にポリペプチド骨格を有しながら、合成高分子全体として、柔軟性に優れる材料となっている。このため、柔軟性に優れる成形体を製造可能である。また、上記合成高分子は、第一のセグメントと第二のセグメントとが結合しているため、タンパク質に可塑剤を単純に混合する場合のようなマクロな相分離の発生が低減されている。
ポリペプチド骨格を含む化合物と、下記一般式（１Ａ）～（１２Ａ）又は（１４Ａ）で表される化合物との反応がマイケル付加反応であってもよい。
上記ポリペプチド骨格が疎水性ポリペプチド骨格であってよい。当該記疎水性ポリペプチド骨格の平均ハイドロパシー・インデックスが０．２２以上であってよい。
上記前記ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団が、上記ポリペプチド骨格の分子量を１００としたときに１～７０の範囲内の値であってよい。
上記ポリペプチド骨格を有する化合物が人工タンパク質を含んでもよい。
上記人工タンパク質が人工構造タンパク質を含んでよい。
本開示の一側面は、ポリペプチド骨格を含む化合物と、上記ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を含む化合物と、下記一般式（２－１Ａ）～（２－１６Ａ）で表される構造単位からなる群より選択される少なくも一種の構造単位を２つ以上有する化合物と、を反応させることによって合成高分子を得る工程を備え、上記ポリペプチド骨格は、チオール基、アミノ基、ヒドロキシ基、グアニジノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、インドール基、アミド基、アジド基、及びアルキニル基からなる群より選択される少なくとも一種を有し、上記分子団を含む化合物は、チオール基、アミノ基、ヒドロキシ基、グアニジノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、インドール基、アミド基、アジド基、及びアルキニル基からなる群より選択される少なくとも一種を有する、合成高分子の製造方法を提供する。
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上記一般式（２－２Ａ）、（２－２Ｂ）、（２－３Ａ）、（２－３Ｂ）、（２－４Ａ）、（２－５Ａ）、（２－６Ａ）、（２－１０Ａ）、（２－１１Ａ）、及び（２－１１Ｂ）において、Ｙは、互いに独立に、酸素原子、硫黄原子、又はＮＲ１を示し、Ｒ１は、水素、炭化水素基、芳香族基、カルボニル基、及びスルホニル基を示し、上記一般式（２－２Ａ）、（２－２Ｂ）、（２－３Ａ）、（２－３Ｂ）、（２－４Ａ）、（２－８Ａ）、（２－８Ｂ）、（２－９Ａ）、（２－１０Ａ）、（２－１１Ａ）、（２－１１Ｂ）、及び（２－１２Ａ）においてＲは、互いに独立に、水素、炭化水素基、及び芳香族基を示し、上記一般式（２－６Ａ）及び（２－１２Ａ）において、Ｚはハロゲン原子、スルホン酸エステル基、及び含フッ素カルボン酸エステル基を示し、上記一般式（２－１５Ａ）において、Ｘはハロゲン原子を示す。
上記合成高分子の製造方法は、特定の官能基を有するポリペプチド骨格を含む化合物と、ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有し、特定の官能基を有する分子団を含む化合物と、一般式（２－１Ａ）～（２－１６Ａ）で表される構造単位からなる群より選択される少なくも一種の構造単位を２つ以上有する化合物と、を反応させることによって合成高分子を調製する。こうすることによって、得られる合成高分子は、ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を有し、タンパク質同様にポリペプチド骨格を有しながら、合成高分子全体として、柔軟性に優れる材料となっている。このため、柔軟性に優れる成形体を製造可能である。また、上記合成高分子は、第一のセグメントと第二のセグメントとが結合しているため、タンパク質に可塑剤を単純に混合する場合のようなマクロな相分離の発生が低減されている。
上記ポリペプチド骨格が疎水性ポリペプチド骨格であってよい。当該疎水性ポリペプチド骨格の平均ハイドロパシー・インデックスが０．２２以上であってよい。
上記前記ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団の分子量が、上記ポリペプチド骨格の分子量を１００としたときに１～７０の範囲内の値であってよい。
本開示によれば、ペプチド骨格を有する高分子材料であって、柔軟性に優れる成形体を製造可能な合成高分子を提供できる。本開示によればまた、上述の合成高分子を含有する成形材料及び成形体を提供できる。
図１は、人工フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。 図２は、天然由来のフィブロインのｚ／ｗ（％）の値の分布を示す図である。 図３は、天然由来のフィブロインのｘ／ｙ（％）の値の分布を示す図である。 図４は、人工フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。 図５は、フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。 図６は、実施例で調製した成形材料についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥの測定結果を示す図である。 図７は、実施例で調製した成形材料についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥの測定結果を示す図である。 図８は、実施例で用いた加圧成形機の模式断面図である。 図９は、図８に示した加圧成形機の使用方法を示す模式図であり、（ａ）は組成物導入前、（ｂ）は組成物導入直後、（ｃ）は組成物を加熱及び加圧している状態、の加圧成形機の模式断面図である。 図１０は、実施例１の合成高分子を用いて成形した成形体の外観を示す写真である。 図１１は、比較例２の混合物を用いて成形した成形体の外観を示す写真である。 図１２は、比較例３の混合物を用いて成形した成形体の外観を示す写真である。 図１３は、実施例１２で調製した繊維の外観を示す写真である。 図１４は、実施例１３で調製した合成高分子に対するＧＰＣ測定の結果を示すグラフである。 図１５は、実施例１４で調製した合成高分子に対するＧＰＣ測定の結果を示すグラフである。 図１６は、実施例１５で調製した合成高分子に対するＧＰＣ測定の結果を示すグラフである。 図１７は、実施例１６で調製した合成高分子に対するＧＰＣ測定の結果を示すグラフである。 図１８は、実施例１７で調製した合成高分子に対するＧＰＣ測定の結果を示すグラフである。 図１９は、参考例２におけるＧＰＣ測定の結果を示すグラフである。 図２０は、参考例３における接触角測定の結果を示す写真である。
以下、本開示を実施するための形態について、場合によって図面を参照し、詳細に説明する。ただし、以下の実施形態は本開示を説明するための例示であり、本開示を以下の内容に限定する趣旨ではない。
本明細書において例示する材料は特に断らない限り、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。組成物中の各成分の含有量は、組成物中の各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
本明細書において成形材料とは成形体を製造するために用いられる材料をいう。本開示に係る上記成形材料は、組換え構造タンパク質に対して化学修飾を行ったタンパク質素材ともいえる。本明細書における成形体の形状は特に限定されるものではなく、例えば、フィルム形状、板形状、ブロック形状、海綿形状（スポンジ形状）、及び繊維形状等であってよい。本明細書における成形材料の形態も何ら限定されるものではなく、例えば、粉末、粒体、液体、及びゲル等であってよい。また、本開示に係る成形材料は、例えば、加熱加圧成形、キャスト成形、及び紡糸等によって各種形状の成形体とすることができる。成形の際には、必要に応じて、型を用いてもよい。
［合成高分子］
合成高分子の一実施形態は、ポリペプチド骨格を含む第一のセグメントと、上記第一のセグメントに結合する一又は複数の第二のセグメントを有する。上記第二のセグメントが上記ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を含む。第二のセグメントの数は、第一のセグメント１つに対して、一又は複数であり、好ましくは２以上であり、より好ましくは２～１０であり、さらに好ましくは２～８であり、さらに好ましくは２～６であり、最も好ましくは２～４である。
合成高分子としては、第一のセグメント及び第二のセグメントを有するものであればよく、例えば、１つの第一のセグメントに一又は複数の第二のセグメントが結合したものであってよく、第一のセグメントと、第一のセグメントに結合した第二のセグメントとを含むブロックが複数連結したものであってもよい。すなわち、合成高分子は、ポリペプチド骨格を含む第一のセグメントを主鎖とし、第二のセグメントを側鎖に有する高分子（例えば、グラフトポリマー等）であってよく、また、第一のセグメント及び第二のセグメントを含むブロックポリマーであってよもよい。すなわち、上記第一のセグメントを複数有し、上記第一のセグメントと第二のセグメントとが交互に結合していてもよい。第一のセグメントと第二のセグメントとが交互に結合することによって、例えば、上記合成高分子で構成される成形体は大きな伸度を発揮し得る。
また合成高分子は、上記第一のセグメントを複数有し、上記第二のセグメントの一部が２以上の上記第一のセグメントと結合してネットワーク構造を形成していてもよい。ネットワーク構造を有することで、例えば、上記合成高分子で構成される成形体は大きな伸度を発揮し得る。またネットワーク構造を有することで、例えば、上記合成高分子で構成される成形体に弾性体としての機能を付与し得る。
第一のセグメントと第二のセグメントとの結合は、直接結合していてもよく、また第一のセグメント及び第二のセグメントと結合できるような構造によって結合していてもよい。なお、それらのいずれの結合形態においても、第一のセグメントと第二のセグメントとの結合は共有結合であってもよい。
（第一のセグメント）
第一のセグメントは、ポリペプチド骨格を構成するアミノ酸配列中の官能基（例えば、システインの有するチオール基等）によって第二のセグメントと結合していてよい。換言すれば、第二のセグメントと結合可能な官能基を有するポリペプチドであれば、上記のポリペプチド骨格として採用できる。この際、ポリペプチドが有する上記官能基の数は、例えば、１個以上、２個以上、又は４個以上であってよい。ポリペプチドが有する上記官能基の数は、例えば、３０個以下、２５個以下、２０個以下、１５個以下、１０個以下、又は８個以下であってよい。ポリペプチドが有する上記官能基の数は上述の範囲内で調整することができ、例えば、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～８、又は２～８であってよい。第一のセグメントはまた、ポリペプチド骨格を構成するアミノ酸配列中の官能基に対して導入した官能基によって第二のセグメントと結合していてよい。
上述のような官能基は、例えば、チオール基、アミノ基、ヒドロキシ基、グアニジノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、インドール基、アミド基、アジド基、及びアルキニル基からなる群より選択される少なくとも一種であってよく、好ましくは、チオール基、アミノ基、ヒドロキシ基、グアニジノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、インドール基、及びアミド基からなる群より選択される少なくとも一種であってよく、より好ましくは、チオール基、アミノ基、ヒドロキシ基、グアニジノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、及びインドール基からなる群より選択される少なくとも一種であってよく、更に好ましくは、チオール基、アミノ基、ヒドロキシ基、グアニジノ基、カルボキシ基、及びフェノキシ基からなる群より選択される少なくとも一種であってよく、更により好ましくは、チオール基、アミノ基、ヒドロキシ基、グアニジノ基、及びカルボキシ基からなる群より選択される少なくとも一種であってよく、更によりまた好ましくは、チオール基、アミノ基、ヒドロキシ基、及びグアニジノ基からなる群より選択される少なくとも一種であってよく、特に好ましくは、チオール基、アミノ基、及びヒドロキシ基からなる群より選択される少なくとも一種であってよく、特により好ましくは、チオール基、及びアミノ基からなる群より選択される少なくとも一種であってよく、最も好ましくはチオール基である。アミノ基は、例えば、リジンが有するアミノ基であってよい。ヒドロキシ基は、例えば、セリンが有するヒドロキシ基、及びスレオニンが有するヒドロキシ基等であってよい。グアニジノ基は、例えば、アルギニンが有するグアニジノ基であってよい。カルボキシ基は、例えば、グルタミン酸が有するカルボキシ基、及びアスパラギン酸が有するカルボキシ基等であってよい。フェノキシ基は、例えば、チロシンが有するフェノキシ基であってよい。インドール基は、例えば、トリプロファンが有するインドール基であってよい。アミド基は、例えば、グルタミンが有するアミド基、及びアスパラギンが有するアミド基等であってよい。アルキニル基は、システインが有するチオール基に対してハロゲン化アセチレンを反応させて導入したアルキニル基であってよい。
第一のセグメントはポリペプチド骨格を含み、例えば、ポリペプチド骨格のみからなってもよい。ポリペプチド骨格は、人工タンパク質に由来する骨格を含んでもよく、人工タンパク質に由来する骨格のみからなってもよい。上記人工タンパク質は、人工フィブロインを含んでもよく、人工フィブロインのみからなってもよい。ポリペプチド骨格が組換えタンパク質に由来する骨格を含むことによって、ポリペプチド骨格を構成するアミノ酸配列中の官能基の数及び位置を任意に調節することできる。これによって、合成高分子及び成形材料の構造並びに特性をデザインすることが可能となる。また、組換えタンパク質が人工フィブロインを含むことによって、合成高分子のフィブリル化が容易となる。これによって、合成高分子を成形材料として用いた場合における繊維形成能が向上する等の利点が得られる。
第一のセグメントの分子量は、例えば、好ましくは２００～１００００００であり、より好ましくは３００～９０００００であり、更に好ましくは４００～８０００００であり、更により好ましくは５００～７０００００であり、更によりまた好ましくは６００～６０００００であり、更に好適には１０００～６０００００であり、更に好適には３０００～６０００００であり、更に好適には５０００～６０００００であり、更に好適には１００００～６０００００であり、更に好適には５０００～１０００００である。なお、第一のセグメントの分子量が２００未満であると、可塑化機能を有する分子団を含む第二のセグメント（ソフトセグメント）に対してハードセグメントとして機能する第一のセグメントが小さくなり過ぎる恐れがある。そうなった場合には、合成高分子（成形材料）を用いて成形される成形体の剛性が小さくなって、例えば構造体としての使用が困難となる可能性がある。一方、第一のセグメントの分子量が１００００００超であると、連結反応の反応性が低下するため、化学工学的に素材として商業生産が可能な時間で反応を完遂できず、その結果、成形体内に残存した未反応の第二セグメントの局在化につながる可能性がある。また、第一のセグメントの分子量、及び第一のセグメントに含まれるポリペプチド骨格の分子量は、例えば、１０００以上、２０００以上、３０００以上、４０００以上、５０００以上、６０００以上、７０００以上、８０００以上、９０００以上、１００００以上、２００００以上、３００００以上、４００００以上、５００００以上、６００００以上、７００００以上、８００００以上、９００００以上、１０００００以上であってよい。さらに、第一のセグメントの分子量、及び第一のセグメントに含まれるポリペプチド骨格の分子量は、４０００００以下、３６００００未満、３０００００以下、２０００００以下であってよい。第一のセグメントやポリペプチド骨格は、分子量が小さい程、溶媒への溶解度が高まる傾向にある。それ故、ポリペプチド骨格や第一のセグメントの分子量が、例えば２０００００以下、或いは１０００００以下である場合には、ポリペプチド骨格を含む化合物を溶媒に溶解させて、ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を含む化合物と反応させることで合成高分子を得る際に、目的とする合成高分子の生成効率の向上が望まれ得る。また、そのようにして得られる合成高分子を用いて成形された成形体においては、ある程度の強度を確保しつつ、柔軟性の向上が期待され得る。加えて、ポリペプチド骨格や第一のセグメントの分子量が、例えば２０００００以下、或いは１０００００以下である場合には、合成高分子の柔軟性を高めるために第二のセグメントの使用量を可及的に抑制し得ることが期待される。なお、上記した第一のセグメントの分子量及びポリペプチド骨格の分子量は重量平均分子量である。
本明細書における分子量は、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって測定される値である。なお、かかる電気泳動は以下の手順にて実施される。すなわち、先ず、２ｍｇの粉末サンプルに２００μＬ、２Ｍ塩化リチウムＤＭＳＯ（富士フィルム和光純薬製）を加え、８０℃、６０分間、さらに９５℃、１０分間加熱しながら攪拌することで、サンプルを溶解させる。その後、１０Ｍウレア溶液でサンプルを５０倍希釈、試料用緩衝液（富士フィルム和光純薬製）でさらに２倍希釈し、９５℃、５分間加熱することで、タンパク質を変成させる。次いで、電気泳動装置（Bio－lad製）にＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲル（Bio－lad製）を取り付け、装置にＳＤＳバッファーを満たす一方、電気泳動装置を電源装置（Bio craft製）に繋ぐ。変成させたサンプルを１０μＬずつＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲルの各ウェルに加え、３０ｍＡ／１枚、３０分間の条件で電流を流す。電気泳動終了後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲルを装置から取り出し、Ｏｒｉｏｌｅ蛍光ゲルステイン（Bio-lad製）に浸し、１時間振盪する。その後、ＵＶサンプルトレイ（Bio－lad製）にゲルをのせ、Gel Doc EZゲル撮影装置（Bio－lad製）で染色像を取得する。
＜人工タンパク質＞
人工タンパク質としては、工業規模での製造が可能な任意のタンパク質を挙げることができ、例えば、工業用に利用できるタンパク質等を挙げることができる。工業用に利用可能とは、例えば、屋内や屋外で使用される様々な汎用材料等に利用し得ることをいう。工業用に利用できるタンパク質の具体例としては、構造タンパク質を挙げることができる。また、構造タンパク質の具体例としては、スパイダーシルク（クモ糸）、カイコシルク、ケラチン、コラ－ゲン、エラスチン及びレシリン、並びにこれら由来のタンパク質等を挙げることができる。使用するタンパク質としては、人工フィブロインが好ましく、人工クモ糸フィブロイン（人工改変クモ糸フィブロイン）がより好ましい。
なお、人工タンパク質は、組換え（リコンビナント）タンパク質と合成タンパク質とを含む。つまり、本明細書において「人工タンパク質」とは、人為的に製造されたタンパク質を意味する。人工タンパク質は、そのドメイン配列が、天然由来のタンパク質のアミノ酸配列とは異なるタンパク質であってもよく、天然由来のタンパク質のアミノ酸配列と同一であるタンパク質であってもよい。また、「人工タンパク質」は、天然由来のタンパク質のアミノ酸配列をそのまま利用したものであってもよく、天然由来のタンパク質のアミノ酸配列に依拠してそのアミノ酸配列を改変したもの（例えば、クローニングした天然由来のタンパク質の遺伝子配列を改変することによりアミノ酸配列を改変したもの）であってもよく、また天然由来のタンパク質に依らず人工的に設計及び合成したもの（例えば、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより所望のアミノ酸配列を有するもの）であってもよい。なお、人工タンパク質は、天然タンパク質とは異なり、アミノ酸配列を自由に設計し得るものであることから、かかる人工タンパク質が、後述する本実施形態の成形材料や成形体に含まれる合成高分子に含有される場合には、人工タンパク質のアミノ酸配列を適宜にデザインすることによって成形材料や成形体の機能や特性、物性等を任意にコントロールすることができる。また、常に均一な分子デザインが可能であるため、目的タンパク質との相同性の高い、目的に応じたタンパク質を安定的に得ることができる。以て、目的とする合成高分子、ひいてはそれを用いて得られる成形材料や成形体の品質の安定化が有利に図られる。
本実施形態に係るポリペプチドは、アミノ酸残基数が５０以上であればよい。当該アミノ酸残基数は、例えば、１００以上、１５０以上、２００以上、２５０以上、３００以上、３５０以上、４００以上、４５０以上又は５００以上である。当該アミノ酸残基数は、例えば、５０００以下、４５００以下、４０００以下、３５００以下、３０００以下、２５００以下、２０００以下、１５００以下、１０００以下である。アミノ酸残基数が少ない程、溶媒への溶解度が高まる傾向にある。それ故、本実施形態に係るポリペプチドのアミノ酸残基数が、例えば５０００以下、或いは２５００以下である場合には、ポリペプチド骨格を含む化合物を溶媒に溶解させて、ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を含む化合物と反応させることで合成高分子を得る際に、目的とする合成高分子の生成効率の向上が望まれ得る。また、そのようにして得られる合成高分子を用いてなる成形体においては、ある程度の強度を確保しつつ、柔軟性の向上が期待され得る。
（ポリペプチド骨格）
ポリペプチド骨格は、例えば、疎水性ポリペプチド骨格であってよい。ポリペプチド骨格が疎水性ポリペプチド骨格である場合には、可塑化機能を有する分子団の第一のセグメントとの親和性が向上し、より柔軟性に優れる成形体を製造できる。加えて、かかる成形体の耐水性が向上し、例えば、成形体が工業用の汎用材料として使用される場合に、使用寿命の延命化が有利に図られ得る。また、本実施形態に係る合成高分子は、例えば、第二のセグメントに含まれる、ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団の疎水性乃至親水性をコントロールすることで、合成高分子全体の疎水性乃至親水性を任意に調整可能であるが、ポリペプチド骨格が疎水性ポリペプチド骨格である場合には、ポリペプチド骨格が親水性ポリペプチド骨格である場合に比して、合成高分子全体を疎水性側にシフトすることができ、以て合成高分子全体の疎水性乃至親水性をより幅広い範囲にわたってコントロール可能となる。
疎水性ポリペプチド骨格における疎水性は、後述する平均ハイドロパシー・インデックスの値を指標として推定することができる。疎水性ポリペプチド骨格の平均ハイドロパシー・インデックスの値は、例えば、０．００以上、０．１０以上、０．２０以上、０．２２以上、０．２５以上、０．３０以上、０．３５以上、０．４０以上、０．４５以上、０．５０以上、０．５５以上、０．６０以上、０．６５以上、又は０．７０以上であってよい。また、その上限値は特に制限されるものではないものの、例えば、１．００以下であってもよく、０．７以下であってもよい。
疎水性ポリペプチド骨格は、６０℃における臭化リチウム水溶液（濃度：９Ｍ）に対する溶解性の低いものが好ましい。この溶解性は、上記疎水性ポリペプチド骨格に相当する化合物（ポリぺプチド）又は合成高分子を分解し疎水性ポリペプチド骨格のみ単離して得られたポリペプチドを用いて評価できる。６０℃における臭化リチウム水溶液（濃度：９Ｍ）に対して上記ポリペプチドを溶解させた場合の最大濃度が、例えば、３０質量％未満、２５質量％未満、２０質量％未満、１５質量％未満、１０質量％未満、５質量％未満、又は１質量％未満であってよい。なお、疎水性ポリペプチド骨格としては、６０℃における臭化リチウム水溶液（濃度：９Ｍ）に対して全く溶解しないものであってもよい。
疎水性ポリペプチド骨格は、水の接触角が大きなものであることが好ましい。水の接触角は、基材上に上記疎水性ポリペプチド骨格に相当する化合物（ポリぺプチド）又は合成高分子を分解し疎水性ポリペプチド骨格のみ単離して得られたポリペプチドからなる膜を形成し、当該膜を用いて評価できる。当該膜に水を滴下して、５秒間経過後の接触角が５５°以上となるような膜を構成するポリペプチドが、上記疎水性ポリペプチド骨格として好ましい。上記接触角は、例えば、６０°以上、６５°以上、又は７０°以上であってよい。
疎水性ポリペプチド骨格は、耐熱水性に優れたものであることが好ましい。対熱水性は、上記疎水性ポリペプチド骨格に相当する化合物（ポリぺプチド）又は合成高分子を分解し疎水性ポリペプチド骨格のみ単離して得られたポリペプチドを用いて評価できる。上記ポリペプチドと水とからなる分散液であって、上記ポリペプチドの含有量が５質量％である分散液を調製し、当該分散液を１００℃で５時間加熱処理しても分解しないようなポリペプチドが、上記疎水性ポリペプチド骨格として好ましい。
本実施形態に係るポリペプチド骨格は、例えば、構造タンパク質であってよい。構造タンパク質とは、生体の構造に関わるタンパク質、若しくは生体が作り出す構造体を構成するタンパク質、又はそれらに由来するタンパク質を意味する。構造タンパク質は、また、一定の条件下において自己凝集し、繊維、フィルム、樹脂、ゲル、ミセル、ナノパーティクル等の構造体を形成するタンパク質のことをいう。構造タンパク質は、天然においては、例えば、フィブロイン、ケラチン、コラ－ゲン、エラスチン及びレシリンが挙げられる。
構造タンパク質は、人工構造タンパク質であってもよい。本明細書において「人工構造タンパク質」とは、人為的に製造された構造タンパク質を意味する。人工構造タンパク質は、遺伝子組換えにより微生物生産した構造タンパク質であってよく、成形性や生産性の観点からアミノ酸の配列を改良したものも含み、天然由来構造タンパク質の配列に限定されない。
人工構造タンパク質を人工的に成形する際、側鎖の小さいアミノ酸ほど水素結合しやすく、強度の高い成形体を得やすい。また、アラニン残基及びグリシン残基は、側鎖が非極性のアミノ酸であるため、ポリペプチド生成における折りたたみの過程で内側に向くように配置され、αヘリックス構造又はβシート構造を取りやすい。よって、グリシン残基、アラニン残基、セリン残基等のアミノ酸の割合が高いことが望ましい。強度により優れる成形体を得る観点から、アラニン残基含有量は、例えば、１０～４０％であればよく、１２～４０％、１５～４０％、１８～４０％、２０～４０％、又は、２２～４０％であってよい。強度により優れる成形体を得る観点から、グリシン残基含有量は、例えば、１０～５５％であればよく、１１～５５％、１３～５５％、１５～５５％、１８～５５％、２０～５５％、２２～５５％、又は２５～５５％であってよい。
なお、本明細書において、「アラニン残基含有量」とは、下記式で表される値である。
アラニン残基含有量＝（ポリペプチドに含まれるアラニン残基の数／ポリペプチドの全アミノ酸残基の数）×１００（％）
また、グリシン残基含有量、セリン残基含有量、スレオニン残基含有量、プロリン残基含有量及びチロシン残基含有量は、上記式において、アラニン残基をそれぞれグリシン残基、セリン残基、スレオニン残基、プロリン残基及びチロシン残基と読み替えたものと同義である。
加工性を向上させる観点では、加工時点において分子間の強固な水素結合を阻害することが重要であり、この観点から側鎖の大きいアミノ酸又は屈曲性を有するアミノ酸が一定程度、配列全体に均質に含まれていることが望ましく、具体的には、チロシン残基、スレオニン残基、プロリン残基が含まれるモチーフを繰り返して周期で入っていてもよい。例えば、任意の連続した２０アミノ酸残基の中、プロリン残基、スレオニン残基及びチロシン残基の合計含有量が、５％以上、５．５％超、６．０％以上、６．５％超、７．０％以上、７．５％超、８．０％以上、８．５％超、９．０％以上、１０．０％以上、又は１５．０％以上であってよい。また例えば、任意の連続した２０アミノ酸残基の中、プロリン残基、スレオニン残基及びチロシン残基の合計含有量が、５０％以下、４０％以下、３０％以下、又は２０％以下であってよい。
一実施形態に係る人工構造タンパク質は、セリン残基含有量、スレオニン残基含有量及びチロシン残基含有量の合計が、４％以上、４．５％以上、５％以上、５．５％以上、６％以上、６．５％以上、又は７％以上であってよい。セリン残基含有量、スレオニン残基含有量及びチロシン残基含有量の合計は、例えば、３５％以下、３３％以下、３０％以下、２５％以下、又は２０％以下であってよい。
一実施形態に係る人工構造タンパク質は、反復配列を有するものであってよい。すなわち、本実施形態に係るポリペプチドは、ポリペプチド内に配列同一性が高いアミノ酸配列（反復配列単位）が複数存在するものであってよい。反復配列単位のアミノ酸残基数は６～２００であることが好ましい。また、反復配列単位間の配列同一性は、例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上であってよい。また、反復配列単位の疎水性度（ハイドロパシー・インデックス）は、例えば、－０．８０以上、－０．７０以上、－０．６０以上、－０．５０以上、－０．４０以上、－０．３０以上、－０．２０以上、－０．１０以上、０．００以上、０．２２以上、０．２５以上、０．３０以上、０．３５以上、０．４０以上、０．４５以上、０．５０以上、０．５５以上、０．６０以上、０．６５以上、又は０．７０以上であってよい。なお、反復配列単位の疎水性度の上限値は特に制限されるものではないものの、例えば、１．０以下であってもよく、０．７以下であってもよい。
一実施形態に係る人工構造タンパク質は、（Ａ）ｎモチーフを含むものであってよい。本明細書において、（Ａ）ｎモチーフとは、アラニン残基を主とするアミノ酸配列を意味する。（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数は２～２７であってよく、２～２０、２～１６、又は２～１２の整数であってよい。また、（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は４０％以上であってよく、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％（アラニン残基のみで構成されることを意味する。）であってもよい。
人工構造タンパク質には、グリシン残基、セリン残基、又はアラニン残基と隣り合う位置に、システイン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有していることが好ましく、グリシン残基と隣り合う位置に、システイン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有していることがより好ましい。システイン残基はメルカプト基を（チオール基又はスルフヒドリル基ともいう）有し、メルカプト基の選択性によって、第二のセグメントとの結合を容易なものとすることができる。したがって、人工構造タンパク質におけるシステイン残基の挿入位置に応じて、第一のセグメントのポリペプチド骨格に対する第二のセグメントの結合位置を任意の位置とすることができる。なお、システイン残基は、グリシン残基、セリン残基、又はアラニン残基と、グリシン残基、セリン残基、又はアラニン残基との間に位置していてよく、セリン残基と、グリシン残基との間に位置していてよい。
人工構造タンパク質には、疎水性アミノ酸残基と隣り合う位置に、システイン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有していることが好ましい。この場合、分子間で疎水性アミノ酸残基同士が疎水的相互作用により固定される。システイン残基は、疎水性アミノ酸残基の隣に位置していてよく、疎水性アミノ酸残基と、疎水性アミノ酸残基以外のアミノ酸残基との間に、位置していてもよく、疎水性アミノ酸残基と、グリシン残基、セリン残基、又はアラニン残基との間に位置していてよく、疎水性アミノ酸残基と、グリシン残基との間に位置していてよい。疎水性アミノ酸残基は、イソロイシン残基、バリン残基、ロイシン残基、フェニルアラニン残基、メチオニン残基、及びアラニン残基からなる群より選択される１種であってよい。
人工構造タンパク質としては、人工フィブロインが好ましい。フィブロインとしては、例えば、天然由来のフィブロインが挙げられる。天然由来のフィブロインとしては、例えば、昆虫又はクモ類が産生するフィブロインが挙げられる。
昆虫が産生するフィブロインとしては、例えば、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍａｎｄａｒｉｎａ）、天蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ ｙａｍａｍａｉ）、柞蚕（Ａｎｔｅｒａｅａ ｐｅｒｎｙｉ）、楓蚕（Ｅｒｉｏｇｙｎａ ｐｙｒｅｔｏｒｕｍ）、蓖蚕（Ｐｉｌｏｓａｍｉａ Ｃｙｎｔｈｉａ ｒｉｃｉｎｉ）、樗蚕（Ｓａｍｉａ ｃｙｎｔｈｉａ）、栗虫（Ｃａｌｉｇｕｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、チュッサー蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ ｍｙｌｉｔｔａ）、ムガ蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ ａｓｓａｍａ）等のカイコが産生する絹タンパク質、及びスズメバチ（Ｖｅｓｐａ ｓｉｍｉｌｌｉｍａ ｘａｎｔｈｏｐｔｅｒａ）の幼虫が吐出するホーネットシルクタンパク質が挙げられる。
昆虫が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、カイコ・フィブロインＬ鎖（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ７６４３０（塩基配列）、ＡＡＡ２７８４０．１（アミノ酸配列））が挙げられる。
クモ類が産生するフィブロインとしては、例えば、オニグモ、ニワオニグモ、アカオニグモ、アオオニグモ及びマメオニグモ等のオニグモ属（Ａｒａｎｅｕｓ属）に属するクモ、ヤマシロオニグモ、イエオニグモ、ドヨウオニグモ及びサツマノミダマシ等のヒメオニグモ属（Ｎｅｏｓｃｏｎａ属）に属するクモ、コオニグモモドキ等のコオニグモモドキ属（Ｐｒｏｎｕｓ属）に属するクモ、トリノフンダマシ及びオオトリノフンダマシ等のトリノフンダマシ属（Ｃｙｒｔａｒａｃｈｎｅ属）に属するクモ、トゲグモ及びチブサトゲグモ等のトゲグモ属（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ属）に属するクモ、マメイタイセキグモ及びムツトゲイセキグモ等のイセキグモ属（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ属）に属するクモ、コガネグモ、コガタコガネグモ及びナガコガネグモ等のコガネグモ属（Ａｒｇｉｏｐｅ属）に属するクモ、キジロオヒキグモ等のオヒキグモ属（Ａｒａｃｈｎｕｒａ属）に属するクモ、ハツリグモ等のハツリグモ属（Ａｃｕｓｉｌａｓ属）に属するクモ、スズミグモ、キヌアミグモ及びハラビロスズミグモ等のスズミグモ属（Ｃｙｔｏｐｈｏｒａ属）に属するクモ、ゲホウグモ等のゲホウグモ属（Ｐｏｌｔｙｓ属）に属するクモ、ゴミグモ、ヨツデゴミグモ、マルゴミグモ及びカラスゴミグモ等のゴミグモ属（Ｃｙｃｌｏｓａ属）に属するクモ、及びヤマトカナエグモ等のカナエグモ属（Ｃｈｏｒｉｚｏｐｅｓ属）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質、並びにアシナガグモ、ヤサガタアシナガグモ、ハラビロアシダカグモ及びウロコアシナガグモ等のアシナガグモ属（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、オオシロカネグモ、チュウガタシロカネグモ及びコシロカネグモ等のシロカネグモ属（Ｌｅｕｃａｕｇｅ属）に属するクモ、ジョロウグモ及びオオジョロウグモ等のジョロウグモ属（Ｎｅｐｈｉｌａ属）に属するクモ、キンヨウグモ等のアズミグモ属（Ｍｅｎｏｓｉｒａ属）に属するクモ、ヒメアシナガグモ等のヒメアシナガグモ属（Ｄｙｓｃｈｉｒｉｏｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、クロゴケグモ、セアカゴケグモ、ハイイロゴケグモ及びジュウサンボシゴケグモ等のゴケグモ属（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ属）に属するクモ、及びユープロステノプス属（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ属）に属するクモ等のアシナガグモ科（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈｉｄａｅ科）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質が挙げられる。スパイダーシルクタンパク質としては、例えば、ＭａＳｐ（ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２）、ＡＤＦ（ＡＤＦ３及びＡＤＦ４）等の牽引糸タンパク質、並びにＭｉＳｐ（ＭｉＳｐ１及びＭｉＳｐ２）等が挙げられる。
クモ類が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、ｆｉｂｒｏｉｎ－３（ａｄｆ－３）［Ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１０（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５５（塩基配列））、ｆｉｂｒｏｉｎ－４（ａｄｆ－４）［Ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１１（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｉｄｒｏｉｎ １［Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ０４５０４（アミノ酸配列）、Ｕ３７５２０（塩基配列））、ｍａｊｏｒ ａｎｇｕ１１ａｔｅ ｓｐｉｄｒｏｉｎ １［Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ ｈｅｓｐｅｒｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ６８８５６（アミノ酸配列）、ＥＦ５９５２４６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｉｄｒｏｉｎ ２［Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖａｔａ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ３２４７２（アミノ酸配列）、ＡＦ４４１２４５（塩基配列））、ｍａｊｏｒ ａｎｐｕｌｌａｔｅ ｓｐｉｄｒｏｉｎ １［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＪ００４２８（アミノ酸配列）、ＡＪ９７３１５５（塩基配列））、及びｍａｊｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｐｉｄｒｏｉｎ ２［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＭ３２２４９．１（アミノ酸配列）、ＡＭ４９０１６９（塩基配列））、ｍｉｎｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ １［Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５８９．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ２［Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５９１．１（アミノ酸配列））、並びにｍｉｎｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｐｉｄｒｏｉｎ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｎｅｐｈｉｌｅｎｇｙｓ ｃｒｕｅｎｔａｔａ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ３７２７８．１（アミノ酸配列））等が挙げられる。
天然由来のフィブロインのより具体的な例としては、更に、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋに配列情報が登録されているフィブロインを挙げることができる。例えば、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報のうちＤＩＶＩＳＩＯＮとしてＩＮＶを含む配列の中から、ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮにｓｐｉｄｒｏｉｎ、ａｍｐｕｌｌａｔｅ、ｆｉｂｒｏｉｎ、「ｓｉｌｋ及びｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」、又は「ｓｉｌｋ及びｐｒｏｔｅｉｎ」がキーワードとして記載されている配列、ＣＤＳから特定のｐｒｏｄｕｃｔの文字列、ＳＯＵＲＣＥからＴＩＳＳＵＥ ＴＹＰＥに特定の文字列の記載された配列を抽出することにより確認することができる。
本明細書において「人工フィブロイン」とは、人為的に製造されたフィブロイン（人造フィブロイン）を意味する。人工フィブロインは、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列とは異なるフィブロインであってもよく、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列と同一であるフィブロインであってもよい。
人工フィブロインは、天然由来フィブロインに準ずる構造を有する繊維状タンパク質であってよく、天然由来フィブロインが有する反復配列と同様の配列を有するフィブロインであってもよい。「フィブロインが有する反復配列と同様の配列」とは、実際に天然由来フィブロインが有する配列であってもよく、それと類似する配列であってもよい。
「人工フィブロイン」は、本開示で特定されるアミノ酸配列を有するものであれば、天然由来のフィブロインに依拠してそのアミノ酸配列を改変したもの（例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列を改変することによりアミノ酸配列を改変したもの）であってもよく、また天然由来のフィブロインに依らず人工的にアミノ酸配列を設計したもの（例えば、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより所望のアミノ酸配列を有するもの）であってもよい。なお、人工フィブロインのアミノ酸配列を改変したものも、そのアミノ酸配列が天然由来のフィブロインのアミノ酸配列とは異なるものであれば、人工フィブロインに含まれる。人工フィブロインとしては、例えば、人工絹（シルク）フィブロイン（カイコが産生する絹タンパク質のアミノ酸配列を改変したもの）、及び人工クモ糸フィブロイン（クモ類が産生するスパイダーシルクタンパク質のアミノ酸配列を改変したもの）などが挙げられる。本開示に係る合成高分子を成形材料として用いる場合、クモ糸フィブロインは比較的にフィブリル化が容易で繊維形成能が高いことから、人工フィブロインは、好ましくは人工クモ糸フィブロインを含み、より好ましくは人工クモ糸フィブロインからなる。
本実施形態に係る人工フィブロインの具体的な例として、クモの大瓶状腺で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する人工フィブロイン（第１の人工フィブロイン）、グリシン残基の含有量が低減されたドメイン配列を有する人工フィブロイン（第２の人工フィブロイン）、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたドメイン配列を有する人工フィブロイン（第３の人工フィブロイン）、グリシン残基の含有量、及び（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された人工フィブロイン（第４の人工フィブロイン）、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むドメイン配列を有する人工フィブロイン（第５の人工フィブロイン）、並びにグルタミン残基の含有量が低減されたドメイン配列を有する人工フィブロイン（第６の人工フィブロイン）が挙げられる。
第１の人工フィブロインとしては、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質が挙げられる。第１の人工フィブロインにおいて、（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数は、３～２０の整数が好ましく、４～２０の整数がより好ましく、８～２０の整数が更に好ましく、１０～２０の整数が更により好ましく、４～１６の整数が更によりまた好ましく、８～１６の整数が特に好ましく、１０～１６の整数が最も好ましい。第１の人工フィブロインは、式１中、ＲＥＰを構成するアミノ酸残基の数は、１０～２００残基であることが好ましく、１０～１５０残基であることがより好ましく、２０～１００残基であることが更に好ましく、２０～７５残基であることが更により好ましい。第１の人工フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるアミノ酸配列中に含まれるグリシン残基、セリン残基及びアラニン残基の合計残基数がアミノ酸残基数全体に対して、４０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることが更に好ましい。
第１の人工フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるアミノ酸配列の単位を含み、かつＣ末端配列が配列番号１～３のいずれかに示されるアミノ酸配列又は配列番号１～３のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であるポリペプチドであってもよい。
配列番号１に示されるアミノ酸配列は、ＡＤＦ３（ＧＩ：１２６３２８７、ＮＣＢＩ）のアミノ酸配列のＣ末端の５０残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列と同一であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２０残基取り除いたアミノ酸配列と同一であり、配列番号３に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２９残基取り除いたアミノ酸配列と同一である。
第１の人工フィブロインのより具体的な例として、（１－ｉ）配列番号４（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｐｉｄｅｒ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ＡＤＦ３ＫａｉＬａｒｇｅＮＲＳＨ１）で示されるアミノ酸配列、又は（１－ｉｉ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、人工フィブロインを挙げることができる。配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
配列番号４で示されるアミノ酸配列は、Ｎ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号５）を付加したＡＤＦ３のアミノ酸配列において、第１～１３番目の反復領域をおよそ２倍になるように増やすとともに、翻訳が第１１５４番目アミノ酸残基で終止するように変異させたものである。配列番号４で示されるアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸配列は、配列番号３で示されるアミノ酸配列と同一である。
（１－ｉ）の人工フィブロインは、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
第２の人工フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、グリシン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。第２の人工フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＲＥＰ中の１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。
第２の人工フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中のＧＧＸ及びＧＰＧＸＸ（但し、Ｇはグリシン残基、Ｐはプロリン残基、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）から選ばれる少なくとも一つのモチーフ配列において、少なくとも１又は複数の当該モチーフ配列中の１つのグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
第２の人工フィブロインは、上述のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたモチーフ配列の割合が、全モチーフ配列に対して、１０％以上であってもよい。
第２の人工フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、上記ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列中の全ＲＥＰに含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列中の総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが３０％以上、４０％以上、５０％以上又は５０．９％以上であるアミノ酸配列を有するものであってもよい。（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は８３％以上であってよいが、８６％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、１００％であること（アラニン残基のみで構成されることを意味する）が更により好ましい。
第２の人工フィブロインは、ＧＧＸモチーフの１つのグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換することにより、ＸＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合を高めたものであることが好ましい。第２の人工フィブロインは、ドメイン配列中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合が３０％以下であることが好ましく、２０％以下であることがより好ましく、１０％以下であることが更に好ましく、６％以下であることが更により好ましく、４％以下であることが更によりまた好ましく、２％以下であることが特に好ましい。ドメイン配列中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合は、下記ＸＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合（ｚ／ｗ）の算出方法と同様の方法で算出することができる。
ｚ／ｗの算出方法を更に詳細に説明する。まず、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むフィブロイン（人工フィブロイン又は天然由来のフィブロイン）において、ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列に含まれる全てのＲＥＰから、ＸＧＸからなるアミノ酸配列を抽出する。ＸＧＸを構成するアミノ酸残基の総数がｚである。例えば、ＸＧＸからなるアミノ酸配列が５０個抽出された場合（重複はなし）、ｚは５０×３＝１５０である。また、例えば、ＸＧＸＧＸからなるアミノ酸配列の場合のように２つのＸＧＸに含まれるＸ（中央のＸ）が存在する場合は、重複分を控除して計算する（ＸＧＸＧＸの場合は５アミノ酸残基である）。ｗは、ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列に含まれる総アミノ酸残基数である。例えば、図１に示したドメイン配列の場合、ｗは４＋５０＋４＋１００＋４＋１０＋４＋２０＋４＋３０＝２３０である（最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフは除いている。）。次に、ｚをｗで除すことによって、ｚ／ｗ（％）を算出することができる。
ここで、天然由来のフィブロインにおけるｚ／ｗについて説明する。まず、上述のように、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにアミノ酸配列情報が登録されているフィブロインを例示した方法により確認したところ、６６３種類のフィブロイン（このうち、クモ類由来のフィブロインは４１５種類）が抽出された。抽出された全てのフィブロインのうち、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、フィブロイン中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合が６％以下である天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、上述の算出方法により、ｚ／ｗを算出した。その結果を図２に示す。図２の横軸はｚ／ｗ（％）を示し、縦軸は頻度を示す。図２から明らかなとおり、天然由来のフィブロインにおけるｚ／ｗは、いずれも５０．９％未満である（最も高いもので、５０．８６％）。
第２の人工フィブロインにおいて、ｚ／ｗは、５０．９％以上であることが好ましく、５６．１％以上であることがより好ましく、５８．７％以上であることが更に好ましく、７０％以上であることが更により好ましく、８０％以上であることが更によりまた好ましい。ｚ／ｗの上限に特に制限はないが、例えば、９５％以下であってもよい。
第２の人工フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列から、グリシン残基をコードする塩基配列の少なくとも一部を置換して別のアミノ酸残基をコードするように改変することにより得ることができる。このとき、改変するグリシン残基として、ＧＧＸモチーフ及びＧＰＧＸＸモチーフにおける１つのグリシン残基を選択してもよいし、またｚ／ｗが５０．９％以上になるように置換してもよい。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から上記態様を満たすアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中のグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
上記の別のアミノ酸残基としては、グリシン残基以外のアミノ酸残基であれば特に制限はないが、バリン（Ｖ）残基、ロイシン（Ｌ）残基、イソロイシン（Ｉ）残基、メチオニン（Ｍ）残基、プロリン（Ｐ）残基、フェニルアラニン（Ｆ）残基及びトリプトファン（Ｗ）残基等の疎水性アミノ酸残基、グルタミン（Ｑ）残基、アスパラギン（Ｎ）残基、セリン（Ｓ）残基、リシン（Ｋ）残基及びグルタミン酸（Ｅ）残基等の親水性アミノ酸残基が好ましく、バリン（Ｖ）残基、ロイシン（Ｌ）残基、イソロイシン（Ｉ）残基、フェニルアラニン（Ｆ）残基及びグルタミン（Ｑ）残基がより好ましく、グルタミン（Ｑ）残基が更に好ましい。
第２の人工フィブロインのより具体的な例として、（２－ｉ）配列番号６（Ｍｅｔ－ＰＲＴ３８０）、配列番号７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）、配列番号８（Ｍｅｔ－ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号９（Ｍｅｔ－ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（２－ｉｉ）配列番号６、配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、人工フィブロインを挙げることができる。
（２－ｉ）の人工フィブロインについて説明する。配列番号６で示されるアミノ酸配列は、天然由来のフィブロインに相当する配列番号１０（Ｍｅｔ－ＰＲＴ３１３）で示されるアミノ酸配列のＲＥＰ中の全てのＧＧＸをＧＱＸに置換したものである。配列番号７で示されるアミノ酸配列は、配列番号６で示されるアミノ酸配列から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号８で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列の各（Ａ）ｎモチーフのＣ末端側に２つのアラニン残基を挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、配列番号７の分子量とほぼ同じとなるようにＣ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号９で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中に存在する２０個のドメイン配列の領域（但し、当該領域のＣ末端側の数アミノ酸残基が置換されている。）を４回繰り返した配列のＣ末端に所定のヒンジ配列とＨｉｓタグ配列が付加されたものである。
配列番号１０で示されるアミノ酸配列（天然由来のフィブロインに相当）におけるｚ／ｗの値は、４６．８％である。配列番号６で示されるアミノ酸配列、配列番号７で示されるアミノ酸配列、配列番号８で示されるアミノ酸配列、及び配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｚ／ｗの値は、それぞれ５８．７％、７０．１％、６６．１％及び７０．０％である。また、配列番号１０、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列のギザ比率（後述する）１：１．８～１１．３におけるｘ／ｙの値は、それぞれ１５．０％、１５．０％、９３．４％、９２．７％及び８９．８％である。
（２－ｉ）の人工フィブロインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
（２－ｉｉ）の人工フィブロインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（２－ｉｉ）の人工フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
（２－ｉｉ）の人工フィブロインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＲＥＰ中に含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列中のＲＥＰの総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが５０．９％以上であることが好ましい。
第２の人工フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、人工フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
タグ配列として、例えば、他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用したアフィニティタグを挙げることができる。アフィニティタグの具体例として、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を挙げることができる。Ｈｉｓタグは、ヒスチジン残基が４から１０個程度並んだ短いペプチドで、ニッケル等の金属イオンと特異的に結合する性質があるため、金属キレートクロマトグラフィー（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ｍｅｔａｌ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による人工フィブロインの単離に利用することができる。タグ配列の具体例として、例えば、配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含むアミノ酸配列）が挙げられる。
また、グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列を利用することもできる。
さらに、抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用することもできる。抗原性を示すペプチド（エピトープ）をタグ配列として付加することにより、当該エピトープに対する抗体を結合させることができる。エピトープタグとして、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列）タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等を挙げることができる。エピトープタグを利用することにより、高い特異性で容易に人工フィブロインを精製することができる。
さらにタグ配列を特定のプロテアーゼで切り離せるようにしたものも使用することができる。当該タグ配列を介して吸着したタンパク質をプロテアーゼ処理することにより、タグ配列を切り離した人工フィブロインを回収することもできる。
タグ配列を含む人工フィブロインのより具体的な例として、（２－ｉｉｉ）配列番号１２（ＰＲＴ３８０）、配列番号１３（ＰＲＴ４１０）、配列番号１４（ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号１５（ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（２－ｉｖ）配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４若しくは配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、人工フィブロインを挙げることができる。
配列番号１６（ＰＲＴ３１３）、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１０、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。
（２－ｉｉｉ）の人工フィブロインは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
（２－ｉｖ）の人工フィブロインは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（２－ｉｖ）の人工フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
（２－ｉｖ）の人工フィブロインは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＲＥＰ中に含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列中のＲＥＰの総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが５０．９％以上であることが好ましい。
第２の人工フィブロインは、人工タンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
第３の人工フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。第３の人工フィブロインのドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、少なくとも１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。
第３の人工フィブロインは、天然由来のフィブロインから（Ａ）ｎモチーフを１０～４０％欠失させたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
第３の人工フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって１～３つの（Ａ）ｎモチーフ毎に１つの（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
第３の人工フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって２つ連続した（Ａ）ｎモチーフの欠失、及び１つの（Ａ）ｎモチーフの欠失がこの順に繰り返されたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
第３の人工フィブロインは、そのドメイン配列が、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
第３の人工フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８～１１．３となる隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが２０％以上、３０％以上、４０％以上又は５０％以上であるアミノ酸配列を有するものであってもよい。（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は８３％以上であってよいが、８６％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、１００％であること（アラニン残基のみで構成されることを意味する）が更により好ましい。
ｘ／ｙの算出方法を図１を参照しながら更に詳細に説明する。図１には、人工フィブロインからＮ末端配列及びＣ末端配列を除いたドメイン配列を示す。当該ドメイン配列は、Ｎ末端側（左側）から（Ａ）ｎモチーフ－第１のＲＥＰ（５０アミノ酸残基）－（Ａ）ｎモチーフ－第２のＲＥＰ（１００アミノ酸残基）－（Ａ）ｎモチーフ－第３のＲＥＰ（１０アミノ酸残基）－（Ａ）ｎモチーフ－第４のＲＥＰ（２０アミノ酸残基）－（Ａ）ｎモチーフ－第５のＲＥＰ（３０アミノ酸残基）－（Ａ）ｎモチーフという配列を有する。
隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットは、重複がないように、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、順次選択する。このとき、選択されない［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットが存在してもよい。図１には、パターン１（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較、及び第３のＲＥＰと第４のＲＥＰの比較）、パターン２（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較、及び第４のＲＥＰと第５のＲＥＰの比較）、パターン３（第２のＲＥＰと第３のＲＥＰの比較、及び第４のＲＥＰと第５のＲＥＰの比較）、パターン４（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較）を示した。なお、これ以外にも選択方法は存在する。
次に各パターンについて、選択した隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニット中の各ＲＥＰのアミノ酸残基数を比較する。比較は、よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときの、他方のアミノ酸残基数の比を求めることによって行う。例えば、第１のＲＥＰ（５０アミノ酸残基）と第２のＲＥＰ（１００アミノ酸残基）の比較の場合、よりアミノ酸残基数の少ない第１のＲＥＰを１としたとき、第２のＲＥＰのアミノ酸残基数の比は、１００／５０＝２である。同様に、第４のＲＥＰ（２０アミノ酸残基）と第５のＲＥＰ（３０アミノ酸残基）の比較の場合、よりアミノ酸残基数の少ない第４のＲＥＰを１としたとき、第５のＲＥＰのアミノ酸残基数の比は、３０／２０＝１．５である。
図１中、よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときに、他方のアミノ酸残基数の比が１．８～１１．３となる［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットの組を実線で示した。本明細書中、この比をギザ比率と呼ぶ。よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときに、他方のアミノ酸残基数の比が１．８未満又は１１．３超となる［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットの組は破線で示した。
各パターンにおいて、実線で示した隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットの全てのアミノ酸残基数を足し合わせる（ＲＥＰのみではなく、（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数もである。）。そして、足し合わせた合計値を比較して、当該合計値が最大となるパターンの合計値（合計値の最大値）をｘとする。図１に示した例では、パターン１の合計値が最大である。
次に、ｘをドメイン配列の総アミノ酸残基数ｙで除すことによって、ｘ／ｙ（％）を算出することができる。
第３の人工フィブロインにおいて、ｘ／ｙは、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、６５％以上であることが更に好ましく、７０％以上であることが更により好ましく、７５％以上であることが更によりまた好ましく、８０％以上であることが特に好ましい。ｘ／ｙの上限に特に制限はなく、例えば、１００％以下であってよい。ギザ比率が１：１．９～１１．３の場合には、ｘ／ｙは８９．６％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．８～３．４の場合には、ｘ／ｙは７７．１％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．９～８．４の場合には、ｘ／ｙは７５．９％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．９～４．１の場合には、ｘ／ｙは６４．２％以上であることが好ましい。
第３の人工フィブロインが、ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）ｎモチーフの少なくとも７つがアラニン残基のみで構成される人工フィブロインである場合、ｘ／ｙは、４６．４％以上であることが好ましく、５０％以上であることがより好ましく、５５％以上であることが更に好ましく、６０％以上であることが更により好ましく、７０％以上であることが更によりまた好ましく、８０％以上であることが特に好ましい。ｘ／ｙの上限に特に制限はなく、１００％以下であればよい。
ここで、天然由来のフィブロインにおけるｘ／ｙについて説明する。まず、上述のように、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにアミノ酸配列情報が登録されているフィブロインを例示した方法により確認したところ、６６３種類のフィブロイン（このうち、クモ類由来のフィブロインは４１５種類）が抽出された。抽出された全てのフィブロインのうち、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列で構成される天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、上述の算出方法により、ｘ／ｙを算出した。ギザ比率が１：１．９～４．１の場合の結果を図３に示す。
図３の横軸はｘ／ｙ（％）を示し、縦軸は頻度を示す。図３から明らかなとおり、天然由来のフィブロインにおけるｘ／ｙは、いずれも６４．２％未満である（最も高いもので、６４．１４％）。
第３の人工フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列から、ｘ／ｙが６４．２％以上になるように（Ａ）ｎモチーフをコードする配列の１又は複数を欠失させることにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、ｘ／ｙが６４．２％以上になるように１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
第３の人工フィブロインのより具体的な例として、（３－ｉ）配列番号１７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ３９９）、配列番号７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）、配列番号８（Ｍｅｔ－ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号９（Ｍｅｔ－ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（３－ｉｉ）配列番号１７、配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、人工フィブロインを挙げることができる。
（３－ｉ）の人工フィブロインについて説明する。配列番号１７で示されるアミノ酸配列は、天然由来のフィブロインに相当する配列番号１０（Ｍｅｔ－ＰＲＴ３１３）で示されるアミノ酸配列から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列は、第２の人工フィブロインで説明したとおりである。
配列番号１０で示されるアミノ酸配列（天然由来のフィブロインに相当）のギザ比率１：１．８～１１．３におけるｘ／ｙの値は１５．０％である。配列番号１７で示されるアミノ酸配列、及び配列番号７で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、いずれも９３．４％である。配列番号８で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、９２．７％である。配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、８９．８％である。配列番号１０、配列番号１７、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｚ／ｗの値は、それぞれ４６．８％、５６．２％、７０．１％、６６．１％及び７０．０％である。
（３－ｉ）の人工フィブロインは、配列番号１７、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
（３－ｉｉ）の人工フィブロインは、配列番号１７、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（３－ｉｉ）の人工フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
（３－ｉｉ）の人工フィブロインは、配列番号１７、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＮ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８～１１．３（ギザ比率が１：１．８～１１．３）となる隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが６４．２％以上であることが好ましい。
第３の人工フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方に上述したタグ配列を含んでいてもよい。
タグ配列を含む人工フィブロインのより具体的な例として、（３－ｉｉｉ）配列番号１８（ＰＲＴ３９９）、配列番号１３（ＰＲＴ４１０）、配列番号１４（ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号１５（ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（３－ｉｖ）配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４若しくは配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、人工フィブロインを挙げることができる。
配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１７、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。
（３－ｉｉｉ）の人工フィブロインは、配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
（３－ｉｖ）の人工フィブロインは、配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（３－ｉｖ）の人工フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
（３－ｉｖ）の人工フィブロインは、配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＮ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８～１１．３となる隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが６４．２％以上であることが好ましい。
第３の人工フィブロインは、人工タンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
第４の人工フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたことに加え、グリシン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有するものである。第４の人工フィブロインのドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、少なくとも１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに加え、更に少なくともＲＥＰ中の１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。すなわち、第４の人工フィブロインは、上述した第２の人工フィブロインと、第３の人工フィブロインの特徴を併せ持つ人工フィブロインである。具体的な態様等は、第２の人工フィブロイン、及び第３の人工フィブロインで説明したとおりである。
第４の人工フィブロインのより具体的な例として、（４－ｉ）配列番号７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）、配列番号８（Ｍｅｔ－ＰＲＴ５２５）、配列番号９（Ｍｅｔ－ＰＲＴ７９９）、配列番号１３（ＰＲＴ４１０）、配列番号１４（ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号１５（ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（４－ｉｉ）配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４若しくは配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、人工フィブロインを挙げることができる。配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含む人工フィブロインの具体的な態様は上述のとおりである。
第５の人工フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むアミノ酸配列を有するものであってよい。
局所的に疎水性指標の大きい領域は、連続する２～４アミノ酸残基で構成されていることが好ましい。
上述の疎水性指標の大きいアミノ酸残基は、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）から選ばれるアミノ酸残基であることがより好ましい。
第５の人工フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する改変に加え、更に、天然由来のフィブロインと比較して、１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変があってもよい。
第５の人工フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がマイナスであるアミノ酸残基）を疎水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基）に置換すること、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基に置換したこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基に置換したこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
第５の人工フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を上記ドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を上記ドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であるアミノ酸配列を有してもよい。
アミノ酸残基の疎水性指標については、公知の指標（Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ ｉｎｄｅｘ：Ｋｙｔｅ Ｊ，＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ Ｒ（１９８２）“Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７，ｐｐ．１０５－１３２）を使用する。具体的には、各アミノ酸の疎水性指標（ハイドロパシー・インデックス、以下「ＨＩ」とも記す。）は、下記表１に示すとおりである。
Figure 2022162038000060
ｐ／ｑの算出方法を更に詳細に説明する。算出には、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列（以下、「配列Ａ」とする）を用いる。まず、配列Ａに含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値を算出する。疎水性指標の平均値は、連続する４アミノ酸残基に含まれる各アミノ酸残基のＨＩの総和を４（アミノ酸残基数）で除して求める。疎水性指標の平均値は、全ての連続する４アミノ酸残基について求める（各アミノ酸残基は、１～４回平均値の算出に用いられる。）。次いで、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域を特定する。あるアミノ酸残基が、複数の「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」に該当する場合であっても、領域中には１アミノ酸残基として含まれることになる。そして、当該領域に含まれるアミノ酸残基の総数がｐである。また、配列Ａに含まれるアミノ酸残基の総数がｑである。
例えば、「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が２０カ所抽出された場合（重複はなし）、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域には、連続する４アミノ酸残基（重複はなし）が２０含まれることになり、ｐは２０×４＝８０である。また、例えば、２つの「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が１アミノ酸残基だけ重複して存在する場合、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域には、７アミノ酸残基含まれることになる（ｐ＝２×４－１＝７。「－１」は重複分の控除である。）。例えば、図４に示したドメイン配列の場合、「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が重複せずに７つ存在するため、ｐは７×４＝２８となる。また、例えば、図４に示したドメイン配列の場合、ｑは４＋５０＋４＋４０＋４＋１０＋４＋２０＋４＋３０＝１７０である（Ｃ末端側の最後に存在する（Ａ）ｎモチーフは含めない）。次に、ｐをｑで除すことによって、ｐ／ｑ（％）を算出することができる。図４の場合２８／１７０＝１６．４７％となる。
第５の人工フィブロインにおいて、ｐ／ｑは、６．２％以上であることが好ましく、７％以上であることがより好ましく、１０％以上であることが更に好ましく、２０％以上であることが更により好ましく、３０％以上であることが更によりまた好ましい。ｐ／ｑの上限は、特に制限されないが、例えば、４５％以下であってもよい。
第５の人工フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインのアミノ酸配列を、上記のｐ／ｑの条件を満たすように、ＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がマイナスであるアミノ酸残基）を疎水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基）に置換すること、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入することにより、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むアミノ酸配列に改変することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から上記のｐ／ｑの条件を満たすアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当する改変を行ってもよい。
疎水性指標の大きいアミノ酸残基としては、特に制限はないが、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）が好ましく、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びイソロイシン（Ｉ）がより好ましい。
第５の人工フィブロインのより具体的な例として、（５－ｉ）配列番号１９（Ｍｅｔ－ＰＲＴ７２０）、配列番号２０（Ｍｅｔ－ＰＲＴ６６５）若しくは配列番号２１（Ｍｅｔ－ＰＲＴ６６６）で示されるアミノ酸配列、又は（５－ｉｉ）配列番号１９、配列番号２０若しくは配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、人工フィブロインを挙げることができる。
（５－ｉ）の人工フィブロインについて説明する。配列番号１９で示されるアミノ酸配列は、配列番号７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）で示されるアミノ酸配列に対し、Ｃ末端側の端末のドメイン配列を除いて、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を２カ所挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、かつＣ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号２０で示されるアミノ酸配列は、配列番号８（Ｍｅｔ－ＰＲＴ５２５）で示されるアミノ酸配列に対し、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を１カ所挿入したものである。配列番号２１で示されるアミノ酸配列は、配列番号８で示されるアミノ酸配列に対し、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を２カ所挿入したものである。
（５－ｉ）の人工フィブロインは、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
（５－ｉｉ）の人工フィブロインは、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（５－ｉｉ）の人工フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
（５－ｉｉ）の人工フィブロインは、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であることが好ましい。
第５の人工フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。
タグ配列を含む人工フィブロインのより具体的な例として、（５－ｉｉｉ）配列番号２２（ＰＲＴ７２０）、配列番号２３（ＰＲＴ６６５）若しくは配列番号２４（ＰＲＴ６６６）で示されるアミノ酸配列、又は（５－ｉｖ）配列番号２２、配列番号２３若しくは配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、人工フィブロインを挙げることができる。
配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２４で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。
（５－ｉｉｉ）の人工フィブロインは、配列番号２２、配列番号２３又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
（５－ｉｖ）の人工フィブロインは、配列番号２２、配列番号２３又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（５－ｉｖ）の人工フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
（５－ｉｖ）の人工フィブロインは、配列番号２２、配列番号２３又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であることが好ましい。
第５の人工フィブロインは、人工タンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
第６の人工フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、グルタミン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。
第６の人工フィブロインは、ＲＥＰのアミノ酸配列中に、ＧＧＸモチーフ及びＧＰＧＸＸモチーフから選ばれる少なくとも一つのモチーフが含まれていることが好ましい。
第６の人工フィブロインが、ＲＥＰ中にＧＰＧＸＸモチーフを含む場合、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率は、通常１％以上であり、５％以上であってもよく、１０％以上であるのが好ましい。ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の上限に特に制限はなく、５０％以下であってよく、３０％以下であってもよい。
本明細書において、「ＧＰＧＸＸモチーフ含有率」は、以下の方法により算出される値である。
式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロイン（人工フィブロイン又は天然由来のフィブロイン）において、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域に含まれるＧＰＧＸＸモチーフの個数の総数を３倍した数（即ち、ＧＰＧＸＸモチーフ中のＧ及びＰの総数に相当）をｓとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率はｓ／ｔとして算出される。
ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としているのは、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列」（ＲＥＰに相当する配列）には、フィブロインに特徴的な配列と相関性の低い配列が含まれることがあり、ｍが小さい場合（つまり、ドメイン配列が短い場合）、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出結果に影響するので、この影響を排除するためである。なお、ＲＥＰのＣ末端に「ＧＰＧＸＸモチーフ」が位置する場合、「ＸＸ」が例えば「ＡＡ」の場合であっても、「ＧＰＧＸＸモチーフ」として扱う。
図１は、人工フィブロインのドメイン配列を示す模式図である。図１を参照しながらＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出方法を具体的に説明する。まず、図１に示した人工フィブロインのドメイン配列（「［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフ」タイプである。）では、全てのＲＥＰが「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」（図１中、「領域Ａ」で示した配列。）に含まれているため、ｓを算出するためのＧＰＧＸＸモチーフの個数は７であり、ｓは７×３＝２１となる。同様に、全てのＲＥＰが「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」（図１中、「領域Ａ」で示した配列。）に含まれているため、当該配列から更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数ｔは５０＋４０＋１０＋２０＋３０＝１５０である。次に、ｓをｔで除すことによって、ｓ／ｔ（％）を算出することができ、図１の人工フィブロインの場合２１／１５０＝１４．０％となる。
第６の人工フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましく、７％以下であることがより好ましく、４％以下であることが更に好ましく、０％であることが特に好ましい。
本明細書において、「グルタミン残基含有率」は、以下の方法により算出される値である。
式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロイン（人工フィブロイン又は天然由来のフィブロイン）において、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列（図１の「領域Ａ」に相当する配列。）に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域に含まれるグルタミン残基の総数をｕとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、グルタミン残基含有率はｕ／ｔとして算出される。グルタミン残基含有率の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。
第６の人工フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、又は他のアミノ酸残基に置換したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってよい。
「他のアミノ酸残基」は、グルタミン残基以外のアミノ酸残基であればよいが、グルタミン残基よりも疎水性指標の大きいアミノ酸残基であることが好ましい。アミノ酸残基の疎水性指標は表１に示すとおりである。
表１に示すとおり、グルタミン残基よりも疎水性指標の大きいアミノ酸残基としては、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、プロリン（Ｐ）及びヒスチジン（Ｈ）から選ばれるアミノ酸残基を挙げることができる。これらの中でも、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）から選ばれるアミノ酸残基であることがより好ましく、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びフェニルアラニン（Ｆ）から選ばれるアミノ酸残基であることが更に好ましい。
第６の人工フィブロインは、ＲＥＰの疎水性度（ハイドロパシー・インデックス）が、例えば、－０．８０以上、－０．７０、－０．６０以上、－０．５０以上、－０．４０以上、－０．３０以上、－０．２０以上、－０．１０以上、０．００以上、０．１０以上、０．２０以上、０．２２以上、０．２５以上、０．３０以上、０．３５以上、０．４０以上、０．４５以上、０．５０以上、０．５５以上、０．６０以上、０．６５以上、又は０．７０以上であってよい。ＲＥＰの疎水性度の上限に特に制限はなく、１．０以下であってよく、０．７以下であってもよい。
本明細書において、「ＲＥＰの疎水性度」は、以下の方法により算出される値である。
式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロイン（人工フィブロイン又は天然由来のフィブロイン）において、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列（図１の「領域Ａ」に相当する配列。）に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域の各アミノ酸残基の疎水性指標の総和をｖとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、ＲＥＰの疎水性度はｖ／ｔとして算出される。ＲＥＰの疎水性度の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。
第６の人工フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変があってもよい。
第６の人工フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列からＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失させること、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。
第６の人工フィブロインのより具体的な例として、（６－ｉ）配列番号２５（Ｍｅｔ－ＰＲＴ８８８）、配列番号２６（Ｍｅｔ－ＰＲＴ９６５）、配列番号２７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ８８９）、配列番号２８（Ｍｅｔ－ＰＲＴ９１６）、配列番号２９（Ｍｅｔ－ＰＲＴ９１８）、配列番号３０（Ｍｅｔ－ＰＲＴ６９９）、配列番号３１（Ｍｅｔ－ＰＲＴ６９８）、配列番号３２（Ｍｅｔ－ＰＲＴ９６６）、配列番号４１（Ｍｅｔ－ＰＲＴ９１７）若しくは配列番号４２（Ｍｅｔ－ＰＲＴ１０２８）で示されるアミノ酸配列を含む人工フィブロイン、又は（６－ｉｉ）配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１若しくは配列番号４２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む人工フィブロインを挙げることができる。
（６－ｉ）の人工フィブロインについて説明する。配列番号２５で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）中のＱＱを全てＶＬに置換したものである。配列番号２６で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＴＳに置換し、かつ残りのＱをＡに置換したものである。配列番号２７で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＬに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。配列番号２８で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＩに置換し、かつ残りのＱをＬに置換したものである。配列番号２９で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＦに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。
配列番号３０で示されるアミノ酸配列は、配列番号８で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ－ＰＲＴ５２５）中のＱＱを全てＶＬに置換したものである。配列番号３１で示されるアミノ酸配列は、配列番号８で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＬに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。
配列番号３２で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）中に存在する２０個のドメイン配列の領域を２回繰り返した配列中のＱＱを全てＶＦに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。
配列番号４１で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ－ＰＲＴ９１７）は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＬＩに置換し、かつ残りのＱをＶに置換したものである。配列番号４２で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ－ＰＲＴ１０２８）は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＩＦに置換し、かつ残りのＱをＴに置換したものである。
配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１及び配列番号４２で示されるアミノ酸配列は、いずれもグルタミン残基含有率は９％以下である（表２）。
Figure 2022162038000061
（６－ｉ）の人工フィブロインは、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１又は配列番号４２で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
（６－ｉｉ）の人工フィブロインは、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１又は配列番号４２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（６－ｉｉ）の人工フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
（６－ｉｉ）の人工フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましい。また、（６－ｉｉ）の人工フィブロインは、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率が１０％以上であることが好ましい。
第６の人工フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、人工フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
タグ配列を含む人工フィブロインのより具体的な例として、（６－ｉｉｉ）配列番号３３（ＰＲＴ８８８）、配列番号３４（ＰＲＴ９６５）、配列番号３５（ＰＲＴ８８９）、配列番号３６（ＰＲＴ９１６）、配列番号３７（ＰＲＴ９１８）、配列番号３８（ＰＲＴ６９９）、配列番号３９（ＰＲＴ６９８）、配列番号４０（ＰＲＴ９６６）、配列番号４３（ＰＲＴ９１７）若しくは配列番号４４（ＰＲＴ１０２８）で示されるアミノ酸配列を含む人工フィブロイン、又は（６－ｉｖ）配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４３若しくは配列番号４４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む人工フィブロインを挙げることができる。
配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４３及び配列番号４４で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１及び配列番号４２で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。Ｎ末端にタグ配列を付加しただけであるため、グルタミン残基含有率に変化はなく、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４３及び配列番号４４で示されるアミノ酸配列は、いずれもグルタミン残基含有率が９％以下である（表３）。
Figure 2022162038000062
（６－ｉｉｉ）の人工フィブロインは、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４３又は配列番号４４で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
（６－ｉｖ）の人工フィブロインは、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４３又は配列番号４４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（６－ｉｖ）の人工フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
（６－ｉｖ）の人工フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましい。また、（６－ｉｖ）の人工フィブロインは、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率が１０％以上であることが好ましい。
第６の人工フィブロインは、人工タンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
人工フィブロインは、第１の人工フィブロイン、第２の人工フィブロイン、第３の人工フィブロイン、第４の人工フィブロイン、第５の人工フィブロイン、及び第６の人工フィブロインが有する特徴のうち、少なくとも２つ以上の特徴を併せ持つ人工フィブロインであってもよい。
本実施形態に係る人工フィブロインはまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質であってよい。人工フィブロインは、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側のいずれか一方又は両方に更にアミノ酸配列（Ｎ末端配列及びＣ末端配列）が付加されていてもよい。Ｎ末端配列及びＣ末端配列は、これに限定されるものではないが、典型的には、フィブロインに特徴的なアミノ酸モチーフの反復を有さない領域であり、１００残基程度のアミノ酸からなる。
本明細書において「ドメイン配列」とは、フィブロイン特有の結晶領域（典型的には、アミノ酸配列の（Ａ）ｎモチーフに相当する。）と非晶領域（典型的には、アミノ酸配列のＲＥＰに相当する。）を生じるアミノ酸配列であり、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるアミノ酸配列を意味する。ここで、（Ａ）ｎモチーフは４～２７アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が８０％以上である。ＲＥＰは１０～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは１０～３００の整数を示す。ｍは、２０～３００の整数であることが好ましく、３０～３００の整数であることがより好ましい。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。
ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、少なくとも７つがアラニン残基のみで構成されることが好ましい。アラニン残基のみで構成されるとは、（Ａ）ｎモチーフが、（Ａｌａ）ｋ（Ａｌａはアラニン残基を示す。）で表されるアミノ酸配列を有することを意味する。ｋは、好ましくは４～２７の整数、より好ましくは４～２０の整数、更に好ましくは４～１６の整数を示す。
ＲＥＰは、１０～２００アミノ酸残基から構成される。ＲＥＰを構成するアミノ酸残基の１以上が、グリシン残基、セリン残基、及びアラニン残基からなる群より選択されるアミノ酸残基であってよい。すなわち、ＲＥＰは、グリシン残基、セリン残基、及びアラニン残基からなる群より選択されるアミノ酸残基を含んでいてよい。
ＲＥＰを構成するアミノ酸残基の１以上が、疎水性アミノ酸残基であってよい。すなわち、ＲＥＰは、疎水性アミノ酸残基を含んでいることが好ましい。疎水性アミノ酸残基とは、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基を意味する。アミノ酸残基の疎水性指標（ハイドロパシー・インデックス、以下「ＨＩ」とも記す。）については、公知の指標公知の指標（Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ ｉｎｄｅｘ：Ｋｙｔｅ Ｊ，＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ Ｒ（１９８２）“Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７，ｐｐ．１０５－１３２）を使用する。疎水性アミノ酸残基としては、例えば、イソロイシン（ＨＩ：４．５）、バリン（ＨＩ：４．２）、ロイシン（ＨＩ：３．８）、フェニルアラニン（ＨＩ：２．８）、メチオニン（ＨＩ：１．９）、アラニン（ＨＩ：１．８）が挙げられる。
本実施形態に係る人工フィブロインにおいて、ドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中にシステイン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有することが好ましい。
ドメイン配列は、ＲＥＰ中のグリシン残基、セリン残基、又はアラニン残基と隣り合う位置に、システイン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有していることが好ましく、ＲＥＰ中のグリシン残基と隣り合う位置に、システイン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有していることがより好ましい。ＲＥＰ中のシステイン残基は、グリシン残基、セリン残基、又はアラニン残基と、グリシン残基、セリン残基、又はアラニン残基との間に位置していてよく、セリン残基と、グリシン残基との間に位置していてよい。
ドメイン配列は、ＲＥＰ中の疎水性アミノ酸残基と隣り合う位置に、システイン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有していることが好ましい。この場合、分子間で疎水性アミノ酸残基同士が疎水的相互作用により固定される。ＲＥＰ中のシステイン残基は、疎水性アミノ酸残基の隣に位置していてよく、疎水性アミノ酸残基と、疎水性アミノ酸残基以外のアミノ酸残基との間に、位置していてもよく、疎水性アミノ酸残基と、グリシン残基、セリン残基、又はアラニン残基との間に位置していてよく、疎水性アミノ酸残基と、グリシン残基との間に位置していてよい。疎水性アミノ酸残基は、イソロイシン残基、バリン残基、ロイシン残基、フェニルアラニン残基、メチオニン残基、及びアラニン残基からなる群より選択される１種であってよい。
ドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、ドメイン配列のＮ末端及び／又はＣ末端の近傍に位置するＲＥＰ中に、システイン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有していてよい。この場合、分子鎖を長くすることができる。本明細書において、ドメイン配列のＮ末端の近傍に位置するＲＥＰとは、ドメイン配列のＮ末端から１～３番目に位置するＲＥＰを意味する。例えば、システイン残基は、ドメイン配列のＮ末端から１～２番目に位置するＲＥＰ中に位置していてよい。本明細書において、ドメイン配列のＣ末端の近傍に位置するＲＥＰとは、ドメイン配列のＣ末端から１～３番目に位置するＲＥＰを意味する。例えば、システイン残基は、ドメイン配列のＣ末端から１～２番目に位置するＲＥＰ中に位置していてよい。システイン残基は、ドメイン配列の最もＮ末端側及び／又は最もＣ末端側に位置するＲＥＰ中に位置していることが好ましい。
ドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の中央又は中央近傍にシステイン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有していてよい。本明細書において、ＲＥＰ中のアミノ酸配列の中央近傍とは、ＲＥＰの中央に位置するアミノ酸残基（中央に位置するアミノ酸残基が２つ存在する場合はＮ末端側のアミノ酸残基）からＮ末端側に向かって１～５番目の位置、又はＲＥＰの中央に位置するアミノ酸残基（中央に位置するアミノ酸残基が２つ存在する場合はＣ末端側のアミノ酸残基）から１～５番目の位置を示す。例えば、システイン残基は、ＲＥＰの中央に位置していてもよく、ＲＥＰの中央に位置するアミノ酸残基からＮ末端側、又はＣ末端側に向かって１～３番目又は１～２番目に位置していてもよい。ここにおいて、システイン残基が、例えば、ドメイン配列のＮ末端側とＣ末端側にそれぞれ一つずつ位置するように挿入されたポリペプチド骨格を含む第一のセグメントを用いる場合、そのような第一のセグメントと第二のセグメントとが交互に一つずつ位置するように連結させてなる合成高分子を得ることができる。この合成高分子を用いて得られる成形体（例えば、繊維やフィルム、ゲル等）では、伸度の向上が期待され得る。また、システイン残基が、例えば、ドメイン配列のＮ末端側やＣ末端側よりも中央部側に位置するように挿入されたポリペプチド骨格を含む第一のセグメントを用いる場合、そのような第一のセグメントに対して第二のセグメントが連結されてなる合成子分子では、溶媒に対する溶解度の向上が期待され得る。
人工フィブロインは、ＲＥＰのアミノ酸配列中に、ＧＰＧＸＸモチーフ（Ｇはグリシン残基、Ｐはプロリン残基、Ｘはグリシン残基以外のアミノ酸残基を示す。）を含むことが好ましい。ＲＥＰ中にこのモチーフが含まれることにより、人工フィブロインの伸度を向上させることができる。
人工フィブロインが、ＲＥＰ中にＧＰＧＸＸモチーフを含む場合、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率は、通常１％以上であり、５％以上であってもよく、好ましくは１０％以上である。この場合、人工フィブロイン繊維の応力がより一層高くなる。ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の上限に特に制限はなく、５０％以下であってよく、３０％以下であってもよい。
本明細書において、「ＧＰＧＸＸモチーフ含有率」は、以下の方法によって算出される値である。式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロインにおいて、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域に含まれるＧＰＧＸＸモチーフの個数の総数を３倍した数（即ち、ＧＰＧＸＸモチーフ中のＧ及びＰの総数に相当）をｃとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｄとしたときに、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率はｃ／ｄとして算出される。
ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としているのは、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列」（ＲＥＰに相当する配列）には、フィブロインに特徴的な配列と相関性の低い配列が含まれることがあり、ｍが小さい場合（つまり、ドメイン配列が短い場合）、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出結果に影響するので、この影響を排除するためである。なお、ＲＥＰのＣ末端に「ＧＰＧＸＸモチーフ」が位置する場合、「ＸＸ」が例えば「ＡＡ」の場合であっても、「ＧＰＧＸＸモチーフ」として扱う。
図５は、フィブロインのドメイン配列を示す模式図である。図５を参照しながらＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出方法を具体的に説明する。まず、図５に示したフィブロインのドメイン配列（「［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフ」タイプである。）では、全てのＲＥＰが「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」（図５中、「領域Ａ」で示した配列。）に含まれているため、ｃを算出するためのＧＰＧＸＸモチーフの個数は７であり、ｃは７×３＝２１となる。同様に、全てのＲＥＰが「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」（図５中、「領域Ａ」で示した配列。）に含まれているため、当該配列から更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数ｄは５０＋４０＋１０＋２０＋３０＝１５０である。次に、ｃをｄで除すことによって、ｃ／ｄ（％）を算出することができ、図５のフィブロインの場合２１／１５０＝１４．０％となる。
人工フィブロインは、ＲＥＰの疎水性度（ハイドロパシー・インデックス：疎水性指標）が、例えば、－０．８０、－０．７０、－０．０６以上、－０．５０以上、－０．４０以上、－０．３０以上、－０．２０以上、－０．１０以上、０．００以上、０．１０以上、０．２０以上、０．２２以上、０．２５以上、０．３０以上、０．３５以上、０．４０以上、０．４５以上、０．５０以上、０．５５以上、０．６０以上、０．６５以上、０．７０以上であってよい。ＲＥＰの疎水性度の上限に特に制限はなく、１．０以下であってよく、０．７以下であってもよい。
本明細書において、「ＲＥＰの疎水性度」は、以下の方法により算出される値である。式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロインにおいて、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列（図５の「領域Ａ」に相当する配列。）に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域の各アミノ酸残基の疎水性指標の総和をｅとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｆとしたときに、ＲＥＰの疎水性度はｅ／ｆとして算出される。ＲＥＰの疎水性度の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。
ドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中に１以上１６未満のシステイン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有していてよい。つまり、ＲＥＰに挿入したことに相当するシステイン残基の総数は、１以上１６未満であってよい。ＲＥＰ中に挿入したことに相当するシステイン残基の総数は、１以上１２以下、１以上１０以下、１以上８以下、１以上６以下、又は２以上４以下であってもよい。ドメイン配列中のＲＥＰ一つあたりのシステイン残基数は、例えば、１～３であってよく、１～２であってよく、１であってよい。
本実施形態に係る人工フィブロインのシステイン残基の総数は、１以上１６未満、１以上１２以下、１以上１０以下、１以上８以下、１以上６以下、又は２以上４以下であってもよい。
本実施形態に係る人工フィブロインは、上述したＲＥＰ中のシステイン残基に関する改変に加え、天然由来のフィブロインと比較して、１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変が更にあってもよい。
本実施形態に係る人工フィブロインの分子量は、特に限定されないが、例えば、１０ｋＤａ以上７００ｋＤａ以下であってよい。本実施形態に係る人工フィブロインの分子量は、例えば、２ｋＤａ以上、３ｋＤａ以上、４ｋＤａ以上、５ｋＤａ以上、６ｋＤａ以上、７ｋＤａ以上、８ｋＤａ以上、９ｋＤａ以上、１０ｋＤａ以上、２０ｋＤａ以上、３０ｋＤａ以上、４０ｋＤａ以上、５０ｋＤａ以上、６０ｋＤａ以上、７０ｋＤａ以上、８０ｋＤａ以上、９０ｋＤａ以上、又は１００ｋＤａ以上であってよく、６００ｋＤａ以下、５００ｋＤａ以下、４００ｋＤａ以下、３６０ｋＤａ未満、３００ｋＤａ以下、又は２００ｋＤａ以下であってよい。
本実施形態に係る人工フィブロインとしては、システイン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有することが好ましく、当該人工フィブロインのより具体的な例として、（ｉ）配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、又は配列番号５１で表されるアミノ酸配列を含む、人工フィブロイン、又は（ｉｉ）配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、又は配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含む、人工フィブロインを挙げるこができる。
配列番号４６で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１）は、配列番号５６で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１１）に対し、ドメイン配列の最もＮ末端側に位置するＲＥＰに、システイン残基を１カ所挿入したものである。すなわち、配列番号４６で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１）におけるシステイン残基の総数は１である。
配列番号４７で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２）は、配列番号５７で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１２）に対し、ドメイン配列の最もＮ末端側に位置するＲＥＰに、システイン残基を１カ所挿入したものである。すなわち、配列番号４７で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２）におけるシステイン残基の総数は１である。
配列番号４８で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ３）は、配列番号５７で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１２）に対し、ドメイン配列の最もＮ末端側に位置するＲＥＰ及び最もＣ末端側に位置するＲＥＰに、システイン残基をそれぞれ１カ所挿入したものである。すなわち、配列番号４８で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ３）におけるシステイン残基の総数は２である。
配列番号４９で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ４）は、配列番号５７で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１２）に対し、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側それぞれから１番目及び２番目に位置するＲＥＰ中に、それぞれ１カ所ずつシステイン残基が挿入されたものである。すなわち、配列番号４９で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ４）におけるシステイン残基の総数は４である。
配列番号５０で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ５）は、配列番号５７で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１２）に対し、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側それぞれから１～４番目に位置するＲＥＰ中に、それぞれ１カ所ずつシステイン残基が挿入されたものである。すなわち、配列番号５０で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ５）におけるシステイン残基の総数は８である。
配列番号５１で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ６）は、配列番号５７で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１２）に対し、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側それぞれから１～８番目に位置するＲＥＰ中に、それぞれ１カ所ずつシステイン残基が挿入されたものである。すなわち、配列番号５１で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ６）におけるシステイン残基の総数は１６である。
配列番号５２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ７）は、配列番号５８で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１３）に対し、ドメイン配列の最もＮ末端側及び最もＣ末端側それぞれに位置するＲＥＰに、システイン残基を１カ所ずつ挿入したものである。すなわち、配列番号５２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ７）におけるシステイン残基の総数は２である。
配列番号５３で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ８）は、配列番号５９で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１４）に対し、ドメイン配列の最もＮ末端側及び最もＣ末端側それぞれに位置するＲＥＰに、システイン残基を１カ所ずつ挿入したものである。すなわち、配列番号５３で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ８）におけるシステイン残基の総数は２である。
配列番号５４で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ９）は、配列番号５９で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１４）に対し、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側それぞれから１～４番目に位置するＲＥＰ中に、それぞれ１カ所ずつシステイン残基が挿入されたものである。すなわち、配列番号５４で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ９）におけるシステイン残基の総数は８である。
配列番号５５で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１０）は、配列番号５９で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１４）に対し、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側それぞれから１～８番目に位置するＲＥＰ中に、それぞれ１カ所ずつシステイン残基が挿入されたものである。すなわち、配列番号５５で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１０）におけるシステイン残基の総数は１６である。
（ｉ）の人工フィブロインは、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、又は配列番号５１で示されるアミノ酸配列のみを有するものであってもよい。（ｉｉ）の人工フィブロインは、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、又は配列番号５５で示されるアミノ酸配列のみを有するものであってもよい。
上述の人工フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これによって、人工フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
タグ配列として、例えば、他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用したアフィニティタグを挙げることができる。アフィニティタグの具体例として、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を挙げることができる。Ｈｉｓタグは、ヒスチジン残基が４から１０個程度並んだ短いペプチドで、ニッケル等の金属イオンと特異的に結合する性質があるため、金属キレートクロマトグラフィー（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ｍｅｔａｌ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による人工フィブロインの単離に利用することができる。タグ配列の具体例として、例えば、配列番号７０又は配列番号７１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグを含むアミノ酸配列）が挙げられる。
また、グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列を利用することもできる。
さらに、抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用することもできる。抗原性を示すペプチド（エピトープ）をタグ配列として付加することにより、当該エピトープに対する抗体を結合させることができる。エピトープタグとして、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列）タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等を挙げることができる。エピトープタグを利用することにより、高い特異性で容易に人工フィブロインを精製することができる。
さらにタグ配列を特定のプロテアーゼで切り離せるようにしたものも使用することができる。当該タグ配列を介して吸着したタンパク質をプロテアーゼ処理することにより、タグ配列を切り離した人工フィブロインを回収することもできる。
タグ配列を含む人工フィブロインのより具体的な例として、（ｉｉｉ）配列番号６０（ＰＲＴ１５）、配列番号６１（ＰＲＴ１６）、配列番号６２（ＰＲＴ１７）、配列番号６３（ＰＲＴ１８）、配列番号６４（ＰＲＴ１９）、若しくは配列番号６５（ＰＲＴ２０）で示されるアミノ酸配列を含む、人工フィブロイン、又は（ｉｖ）配列番号６６（ＰＲＴ２１）、配列番号６７（ＰＲＴ２２）、配列番号６８（ＰＲＴ２３）、若しくは配列番号６９（ＰＲＴ２４）で示されるアミノ酸配列を含む、人工フィブロインを挙げることができる。
なお、配列番号６０（ＰＲＴ１５）、配列番号６１（ＰＲＴ１６）、配列番号６２（ＰＲＴ１７）、配列番号６３（ＰＲＴ１８）、配列番号６４（ＰＲＴ１９）、及び配列番号６５（ＰＲＴ２０）で示されるアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号４６（ＰＲＴ１）、配列番号４７（ＰＲＴ２）、配列番号４８（ＰＲＴ３）、配列番号４９（ＰＲＴ４）、配列番号５０（ＰＲＴ５）、及び配列番号５１（ＰＲＴ６）で示されるアミノ酸配列のＮ末端に、配列番号７０で示されるアミノ酸配列を含むタグ配列を導入したものである。また、配列番号６６（ＰＲＴ２１）、配列番号６７（ＰＲＴ２２）、配列番号６８（ＰＲＴ２３）、及び配列番号６９（ＰＲＴ２４）で示されるアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号５２（ＰＲＴ７）、配列番号５３（ＰＲＴ８）、配列番号５４（ＰＲＴ９）、及び配列番号５５（ＰＲＴ１０）で示されるアミノ酸配列のＮ末端に、配列番号７０で示されるアミノ酸配列を含むタグ配列を導入したものである。
（ｉｉｉ）の人工フィブロインは、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、又は配列番号６５で示されるアミノ酸配列のみを有するものであってもよい。
配列番号６０（ＰＲＴ１５）、配列番号６１（ＰＲＴ１６）、配列番号６２（ＰＲＴ１７）、配列番号６３（ＰＲＴ１８）、配列番号６４（ＰＲＴ１９）、又は配列番号６５（ＰＲＴ２０）で示されるアミノ酸配列を含む、人工フィブロインのＧＰＧＸＸモチーフ含有率は、それぞれ４０．２％、３９．９％、３９．９％、３９．７％、３９．３％、及び３８．６％であり、いずれも１０％以上である。
（ｉｖ）の人工フィブロインは、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、若しくは配列番号６９で示されるアミノ酸配列のみを有するものであってもよい。
配列番号６６（ＰＲＴ２１）、配列番号６７（ＰＲＴ２２）、配列番号６８（ＰＲＴ２３）、又は配列番号６９（ＰＲＴ２４）で示されるアミノ酸配列を含む、人工フィブロインのＧＰＧＸＸモチーフ含有率は、それぞれ３９．９％、３９．９％、３９．３％、及び３８．６％であり、いずれも１０％以上である。
上述の人工フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
〔核酸〕
一実施形態に係る核酸は、上記人工フィブロインをコードする。核酸の具体例として、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、又は配列番号５５で示されるアミノ酸配列を含む人工フィブロイン、又はこれらのアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端のいずれか一方若しくは両方に配列番号７０又は配列番号７１で示されるアミノ酸配列（タグ配列）を結合させた人工フィブロイン等をコードする核酸が挙げられる。
一実施形態に係る核酸は、上記人工フィブロインをコードする核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含む人工フィブロインをコードする核酸である。当該核酸によりコードされる人工フィブロインの上記ドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中にシステイン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有する。
「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。低ストリンジェントな条件とは、少なくとも８５％以上の同一性が配列間に存在する時のみハイブリダイゼーションが起こることを意味し、例えば、０．５％ＳＤＳを含む５×ＳＳＣを用い、４２℃でハイブリダイズする条件が挙げられる。中ストリンジェントな条件とは、少なくとも９０％以上の同一性が配列間に存在する時のみハイブリダイゼーションが起こることを意味し、例えば、０．５％ＳＤＳを含む５×ＳＳＣを用い、５０℃でハイブリダイズする条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、少なくとも９５％以上の同一性が配列間に存在する時のみハイブリダイゼーションが起こることを意味し、例えば、０．５％ＳＤＳを含む５×ＳＳＣを用い、６０℃でハイブリダイズする条件が挙げられる。
〔宿主及び発現ベクター〕
一実施形態に係る発現ベクターは、上記核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する。調節配列は、宿主における組換えタンパク質の発現を制御する配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等）であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
一実施形態に係る宿主は、上記発現ベクターで形質転換されたものである。宿主として、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも好適に用いることができる。
発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主の染色体中への組込みが可能で、一実施形態に係る核酸を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが好適に用いられる。
細菌等の原核生物を宿主として用いる場合は、一実施形態に係る発現ベクターは、原核生物中で自立複製が可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、一実施形態に係る核酸及び転写終結配列を含むベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
原核生物としては、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、及びシュードモナス属等に属する微生物を挙げることができる。
エシェリヒア属に属する微生物として、例えば、エシェリヒア・コリ ＢＬ２１（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ ＢＬ２１（ＤＥ３）（ライフテクノロジーズ社）、エシェリヒア・コリ ＢＬＲ（ＤＥ３）（メルクミリポア社）、エシェリヒア・コリ ＤＨ１、エシェリヒア・コリ ＧＩ６９８、エシェリヒア・コリ ＨＢ１０１、エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９、エシェリヒア・コリ Ｋ５（ＡＴＣＣ ２３５０６）、エシェリヒア・コリ ＫＹ３２７６、エシェリヒア・コリ ＭＣ１０００、エシェリヒア・コリ ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ ４７０７６）、エシェリヒア・コリ Ｎｏ．４９、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ ＴＢ１、エシェリヒア・コリ Ｔｕｎｅｒ（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ Ｗ１４８５、エシェリヒア・コリ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７３２５）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、及びエシェリヒア・コリ ＸＬ２－Ｂｌｕｅ等を挙げることができる。
ブレビバチルス属に属する微生物として、例えば、ブレビバチルス・アグリ、ブレビバチルス・ボルステレンシス、ブレビバチルス・セントロポラスブレビバチルス・フォルモサス、ブレビバチルス・インボカツス、ブレビバチルス・ラチロスポラス、ブレビバチルス・リムノフィルス、ブレビバチルス・パラブレビス、ブレビバチルス・レウスゼリ、ブレビバチルス・サーモルバー、ブレビバチルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ ＢＰ－１２２３）、ブレビバチルス・ブレビス４７Ｋ（ＦＥＲＭ ＢＰ－２３０８）、ブレビバチルス・ブレビス４７－５（ＦＥＲＭ ＢＰ－１６６４）、ブレビバチルス・ブレビス４７－５Ｑ（ＪＣＭ８９７５）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ－１０８７）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１－Ｓ（ＦＥＲＭ ＢＰ－６６２３）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１－ＯＫ（ＦＥＲＭ ＢＰ－４５７３）、及びブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３株（Ｔａｋａｒａ社製）等を挙げることができる。
セラチア属に属する微生物として、例えば、セラチア・リクエファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｃｅ）ＡＴＣＣ１４４６０、セラチア・エントモフィラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）、セラチア・フィカリア（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ）、セラチア・フォンティコーラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）、セラチア・グリメシ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｇｒｉｍｅｓｉｉ）、セラチア・プロテアマキュランス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ）、セラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）、セラチア・プリムシカ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ）、及びセラチア・ルビダエ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｒｕｂｉｄａｅａ）等を挙げることができる。
バチルス属に属する微生物として、例えば、バチルス・サチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、及びバチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）等を挙げることができる。
ミクロバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ＡＴＣＣ１５３５４等を挙げることができる。
ブレビバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）ＡＴＣＣ１４０２０、ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７）ＡＴＣＣ１３８２６，ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム・インマリオフィラム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６８、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９）ＡＴＣＣ１３６６５，ＡＴＣＣ１３８６９、ブレビバクテリウム・ロゼウムＡＴＣＣ１３８２５、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６６、ブレビバクテリウム・チオゲニタリスＡＴＣＣ１９２４０、ブレビバクテリウム・アルバムＡＴＣＣ１５１１１、及びブレビバクテリウム・セリヌムＡＴＣＣ１５１１２等を挙げることができる。
コリネバクテリウム属に属する微生物として、例えば、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ６８７１，ＡＴＣＣ６８７２、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１４０６７、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・アセトグルタミカムＡＴＣＣ１５８０６、コリネバクテリウム・アルカノリティカムＡＴＣＣ２１５１１、コリネバクテリウム・カルナエＡＴＣＣ１５９９１、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０２０，ＡＴＣＣ１３０３２，ＡＴＣＣ１３０６０、コリネバクテリウム・リリウムＡＴＣＣ１５９９０、コリネバクテリウム・メラセコーラＡＴＣＣ１７９６５、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３４０（ＦＥＲＭＢＰ－１５３９）、及びコリネバクテリウム・ハーキュリスＡＴＣＣ１３８６８等を挙げることができる。
シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物として、例えば、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・ブラシカセラム（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｒｕｍ）、シュードモナス・フルバ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｕｌｖａ）、及びシュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）Ｄ－０１１０等を挙げることができる。
上記宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，６９，２１１０ （１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３－２４８３９４号公報）、又はＧｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等を挙げることができる。
ブレビバチルス属に属する微生物の形質転換は、例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉらの方法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８３，１５６：１１３０－１１３４）や、Ｔａｋａｇｉらの方法（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８９，５３：３０９９－３１００）、又はＯｋａｍｏｔｏらの方法（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９７，６１：２０２－２０３）により実施することができる。
一実施形態に係る核酸を導入するベクター（以下、単に「ベクター」という。）としては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３－２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ－８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（－）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＴｒｓ３０〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ－５４０７）より調製〕、ｐＴｒｓ３２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ－５４０８）より調製〕、ｐＧＨＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ Ｂ－４００）より調製、特開昭６０－２２１０９１号公報〕、ｐＧＫＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ ＢＰ－６７９８）より調製、特開昭６０－２２１０９１号公報〕、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）〕、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、及びｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）等を挙げることができる。
宿主としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを用いる場合は、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＥＴ２２ｂ、及びｐＣｏｌｄ等を好適なベクターとして挙げることができる。
ブレビバチルス属に属する微生物に好適なベクターの具体例として、枯草菌ベクターとして公知であるｐＵＢ１１０、又はｐＨＹ５００（特開平２－３１６８２号公報）、ｐＮＹ７００（特開平４－２７８０９１号公報）、ｐＨＹ４８３１（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８７，１２３９－１２４５）、ｐＮＵ２００（鵜高重三、日本農芸化学会誌１９８７，６１：６６９－６７６）、ｐＮＵ１００（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９８９，３０：７５－８０）、ｐＮＵ２１１（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９２，１１２：４８８－４９１）、ｐＮＵ２１１Ｒ２Ｌ５（特開平７－１７０９８４号公報）、ｐＮＨ３０１（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９２，５８：５２５－５３１）、ｐＮＨ３２６、ｐＮＨ４００（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９５，１７７：７４５－７４９）、ｐＨＴ２１０（特開平６－１３３７８２号公報）、ｐＨＴ１１０Ｒ２Ｌ５（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９４，４２：３５８－３６３）、又は大腸菌とブレビバチルス属に属する微生物とのシャトルベクターであるｐＮＣＯ２（特開２００２－２３８５６９号公報）等を挙げることができる。
プロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであれば制限されない。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーター等の大腸菌又はファージ等に由来するプロモーターを挙げることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン－ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６～１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。発現ベクターにおいて、上記核酸の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
真核生物の宿主としては、例えば、酵母、糸状真菌（カビ等）及び昆虫細胞を挙げることができる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、シワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ヤロウィア属及びハンゼヌラ属等に属する酵母を挙げることができる。より具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クリベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、クリベロマイセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、トリコスポロン・プルランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、シワニオマイセス・アルビウス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ）、シワニオマイセス・オシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、キャンディダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・ポリモルファ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピキア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、及びハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）等を挙げることができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合の発現ベクターは通常、複製起点（宿主における増幅が必要である場合）及び大腸菌中でのベクターの増殖のための選抜マーカー、酵母における組換えタンパク質発現のためのプロモーター及びターミネーター、並びに酵母のための選抜マーカーを含むことが好ましい。
発現ベクターが非組込みベクターの場合、さらに自己複製配列（ＡＲＳ）を含むことが好ましい。これによって細胞内における発現ベクターの安定性を向上させることができる（Ｍｙｅｒｓ、Ａ．Ｍ．、ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｇｅｎｅ ４５：２９９－３１０）。
酵母を宿主として用いる場合のベクターとしては、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ＹＩｐ、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５、ｐＡ０８０４、ｐＨＩＬ３Ｏｌ、ｐＨＩＬ－Ｓ１、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣＺα、ｐＧＡＰＺα、及びｐＰＩＣＺ Ｂ等を挙げることができる。
プロモーターとしては、酵母中で発現できるものであれば制限されない。プロモーターとしては、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ １プロモーター、ｇａｌ １０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１ プロモーター、ＣＵＰ １プロモーター、ｐＧＡＰプロモーター、ｐＧＣＷ１４プロモーター、ＡＯＸ１プロモーター、及びＭＯＸプロモーター等を挙げることができる。
酵母への発現ベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。酵母への発現ベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０））、スフェロプラスト法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，４８８９（１９８４））、酢酸リチウム法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３））、及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法等を挙げることができる。
糸状真菌としては、例えば、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ウスチラーゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒａ）属、ボトリティス（Ｂｏｔｒｙｔｓ）属、マグナポルサ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）属、ムコア（Ｍｕｃｏｒ）属、メタリチウム（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ）属、モナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、及びリゾムコア属に属する菌等を挙げることができる。
糸状真菌の具体例として、アクレモニウム・アラバメンゼ（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌａｂａｍｅｎｓｅ）、アクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、アスペルギルス・アクレアツス（アキュレータス）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・サケ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｋｅ）、アスペルギルス・ゾジエ（ソーヤ）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・テュビゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・パラシチクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）、アスペルギルス・フィクム（フィキュウム）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｉｃｕｕｍ）、アスペルギルス・フェニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐｈｏｅｉｃｕｓ）、アスペルギルス・フォエチズス（フェチダス）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フラーブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ヤポニクス（ジャポニカス）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・ハージアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｓｅｅｉ）、クリソスポリウム・ルクノエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、サーモアスクス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、スポロトリクム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）、スポロトリクム・セルロフィルム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｐｈｉｌｕｍ）、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、チラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、ノイロスポラ・クラザ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、フザリウム・オキシスポーラス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｓ）、フザリウム・グラミネルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、ペニシリウム・クリゾゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・カマンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉ）、ペニシリウム・カネセンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｎｅｓｃｅｎｓ）、ペニシリウム・エメルソニ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、ペニシリウム・フニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、ペニシリウム・グリゼオロゼウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｇｒｉｓｅｏｒｏｓｅｕｍ）、ペニシリウム・パープロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・ロケフォルチ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）、マイセリオフトラ・サーモフィルム（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔａｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）、ムコア・アンビグス（Ｍｕｃｏｒ ａｍｂｉｇｕｕｓ）、ムコア・シイルシネロイデェス（Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）、ムコア・フラギリス（Ｍｕｃｏｒ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、ムコア・ヘマリス（Ｍｕｃｏｒ ｈｉｅｍａｌｉｓ）、ムコア・イナエクイスポラス（Ｍｕｃｏｒ ｉｎａｅｑｕｉｓｐｏｒｕｓ）、ムコア・オブロンジエリプティカス（Ｍｕｃｏｒ ｏｂｌｏｎｇｉｅｌｌｉｐｔｉｃｕｓ）、ムコア・ラセモサス（Ｍｕｃｏｒ ｒａｃｅｍｏｓｕｓ）、ムコア・レクルバス（Ｍｕｃｏｒ ｒｅｃｕｒｖｕｓ）、ムコア・サトゥルニナス（Ｍｏｃｏｒ ｓａｔｕｒｎｉｎｕｓ）、ムコア・サブティリススミウス（Ｍｏｃｏｒ ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｍｕｓ）、オガタエア・ポリモルファ（Ｏｇａｔａｅａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ファネロケーテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、リゾムコア・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、リゾムコア・プシルス（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ）、及びリゾプス・アルヒザス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ａｒｒｈｉｚｕｓ）等を挙げることができる。
宿主が糸状真菌である場合のプロモーターとしては、解糖系に関する遺伝子、構成的発現に関する遺伝子、加水分解に関する酵素遺伝子等いずれであってもよい。宿主が糸状真菌である場合のプロモーターとしては、具体的には、ａｍｙＢ、ｇｌａＡ、ａｇｄＡ、ｇｌａＢ、ＴＥＦ１、ｘｙｎＦ１ｔａｎｎａｓｅｇｅｎｅ、Ｎｏ．８ＡＮ、ｇｐｄＡ、ｐｇｋＡ、ｅｎｏＡ、ｍｅｌＯ、ｓｏｄＭ、ｃａｔＡ、及びｃａｔＢ等を挙げることができる。
糸状真菌への発現ベクターの導入は、従来公知の方法を用いて行うことができる。糸状真菌への発現ベクターの導入方法としては、例えば、Ｃｏｈｅｎらの方法（塩化カルシウム法）［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９：２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法［Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８：１１１（１９７９）］、コンピテント法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５６：２０９（１９７１）］、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
昆虫細胞として、例えば、鱗翅類の昆虫細胞が挙げられる。昆虫細胞としては、より具体的には、Ｓｆ９、及びＳｆ２１等のスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来の昆虫細胞、並びに、Ｈｉｇｈ ５等のイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）由来の昆虫細胞等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合のベクターとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）等のバキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２））を挙げることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）、及びＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、ポリペプチドを発現することができる。すなわち、組換え遺伝子導入ベクター及びバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルス（発現ベクター）を得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、ポリペプチドを発現させることができる。該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、及びｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）等を挙げることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターとバキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２－２２７０７５号公報）、及びリポフェクション法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７））等を挙げることができる。
一実施形態に係る組換えベクターは、形質転換体選択のための選択マーカー遺伝子をさらに含有していることが好ましい。例えば、大腸菌においては、選択マーカー遺伝子としては、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の各種薬剤に対する耐性遺伝子を用いることができる。栄養要求性に関与する遺伝子変異を相補できる劣性の選択マーカーも使用できる。酵母においては、選択マーカー遺伝子として、ジェネティシンに対する耐性遺伝子を用いることができ、栄養要求性に関与する遺伝子変異を相補する遺伝子、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３等の選択マーカーも使用できる。糸状真菌においては、選択マーカー遺伝子として、ｎｉａＤ（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９，１７９５－１７９７（１９９５））、ａｒｇＢ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｔｅｃｈｎｏｌ，６，３８６－３８９，（１９８４）），ｓＣ（Ｇｅｎｅ，８４，３２９－３３４，（１９８９））、ｐｔｒＡ（ＢｉｏｓｃｉＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，６４，１４１６－１４２１，（２０００））、ｐｙｒＧ（ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，１１２，２８４－２８９，（１９８３）），ａｍｄＳ（Ｇｅｎｅ，２６，２０５－２２１，（１９８３））、オーレオバシジン耐性遺伝子（Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ，２６１，２９０－２９６，（１９９９））、ベノミル耐性遺伝子（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８３，４８６９－４８７３，（１９８６））及びハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｇｅｎｅ，５７，２１－２６，（１９８７））からなる群より選ばれるマーカー遺伝子、ロイシン要求性相補遺伝子等が挙げられる。また、宿主が栄養要求性変異株の場合には、選択マーカー遺伝子として当該栄養要求性を相補する野生型遺伝子を用いることもできる。
一実施形態に係る発現ベクターで形質転換された宿主の選択は、上記核酸に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション及びコロニーハイブリダイゼーション等で行うことができる。当該プローブとしては、上記核酸の配列情報に基づき、ＰＣＲ法によって増幅した部分ＤＮＡ断片をラジオアイソトープ又はジゴキシゲニンで修飾したものを用いることができる。
〔人工フィブロインの製造方法〕
本実施形態に係る人工フィブロインは、上記発現ベクターで形質転換された宿主に、上記核酸を発現させる工程を含む方法によって、製造することができる。発現方法としては、直接発現のほか、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。酵母、動物細胞、昆虫細胞によって発現させた場合には、糖又は糖鎖が付加されたポリペプチドとして人工フィブロインを得ることができる。
本実施形態に係る人工フィブロインは、例えば、上記発現ベクターで形質転換された宿主を培養培地中で培養し、培養培地中に本実施形態に係る人工フィブロインを生成蓄積させ、該培養培地から採取することによって製造することができる。上記宿主を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。
上記宿主が、大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、上記宿主の培養培地として、該宿主が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有し、該宿主の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地、及び合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該宿主が資化し得るものであればよい。炭素源としては、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類を用いることができる。
窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。
無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。
大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物の培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は、例えば、１５～４０℃である。培養時間は、通常１６時間～７日間である。培養中の培養培地のｐＨは３．０～９．０に保持することが好ましい。培養培地のｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。
また、培養中必要に応じて、アンピシリン及びテトラサイクリン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
昆虫細胞の培養培地としては、例えば、一般に使用されているＴＮＭ－ＦＨ培地（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、Ｓｆ－９００ ＩＩ ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、及びＧｒａｃｅ‘ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２））等を用いることができる。
昆虫細胞の培養は、例えば、培養培地のｐＨ６～７、培養温度２５～３０℃等の条件下で、培養時間１～５日間とすることができる。また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。
宿主が植物細胞の場合、形質転換された植物細胞をそのまま培養してもよく、また植物の器官に分化させて培養することができる。該植物細胞を培養する培地としては、例えば、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、又はこれらの培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
動物細胞の培養は、例えば、培養培地のｐＨ５～９、培養温度２０～４０℃等の条件下で、培養時間３～６０日間とすることができる。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記発現ベクターで形質転換された宿主を用いて人工フィブロインを生産する方法としては、該人工フィブロインを宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、及び宿主細胞外膜上に生産させる方法等がある。使用する宿主細胞、及び生産させる人工フィブロインの構造を変えることによって、これらの各方法を選択することができる。
例えば、人工フィブロインが宿主細胞内又は宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９））、ロウらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０））、又は特開平５－３３６９６３号公報、国際公開第９４／２３０２１号等に記載の方法を準用することによって、人工フィブロインを宿主細胞外に積極的に分泌させるように変更させることができる。すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、人工フィブロインの活性部位を含むポリペプチドにシグナルペプチドを付加した形で発現させることによって、人工フィブロインを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
上記発現ベクターで形質転換された宿主によって生産された人工フィブロインは、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法で単離及び精製することができる。例えば、人工フィブロインが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、宿主細胞を遠心分離によって回収し、水系緩衝液にけん濁させた後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー及びダイノミル等によって宿主細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することによって得られる上清から、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法、すなわち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ－７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の方法を単独又は組み合わせて使用し、精製標品を得ることができる。
上記クロマトグラフィーとしては、フェニル－トヨパール（東ソー）、ＤＥＡＥ－トヨパール（東ソー）、セファデックスＧ－１５０（ファルマシアバイオテク）を用いたカラムクロマトグラフィーが好ましく用いられる。
また、人工フィブロインが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に宿主細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことによって、沈殿画分として人工フィブロインの不溶体を回収する。回収した人工フィブロインの不溶体は蛋白質変性剤で可溶化することができる。該操作の後、上記と同様の単離精製法によって人工フィブロインの精製標品を得ることができる。
人工フィブロイン、又は人工フィブロインに糖鎖の付加された誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清から人工フィブロイン又はその誘導体を回収することができる。すなわち、培養物を遠心分離等の手法で処理することによって培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることによって、精製標品を得ることができる。
（第二のセグメント）
上記第二のセグメントは、上記ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を含む。ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団とは、当該分子団同士の分子間力が、ポリペプチド骨格同士の分子間力よりも小さく、両者を混合した場合に、ポリペプチド骨格単体よりも素材の柔軟性を向上させることが可能な分子団をいう。また、ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団とは、ポリペプチド骨格よりも融点やガラス転移温度が低い分子団ともいえる。このような分子団としては、例えば、後述するポリエーテル等が挙げられる。なお、可塑化機能とは、柔軟性の向上機能、或いは曲げや引っ張りにおける破断伸度を高める機能ともいえる。また、ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団は、生分解性を有するもの、或いはバイオマス由来のものが好適に用いられる。それによって、合成高分子（成形材料）全体として生分解性を有することが十分に期待され、更には合成高分子（成形材料）の製造エネルギーの低減が図られ得る。
上記第二のセグメントは、上記分子団を複数含んでもよい。そして、上記第二のセグメントが複数の上記分子団を含み、複数の上記分子団が互いに連結していてもよい。また、上記分子団同士の連結は、一部に分岐を有していてもよい。上記連結が一部に分岐を有することで、第二のセグメントは、複数の上記分子団による分岐構造を有することができ、分岐ごとに第一のセグメントとの結合を複数形成することもできる。すなわち、上記連結の一部に分岐を導入することによっても、第一のセグメントと第二のセグメントとのネットワーク構造を形成することができる。このように、第二のセグメントが複数の上記分子団を含み、それらの分子団が互いに連結するものであることによって、第二セグメントの設計の幅をより広げることができ、例えば、合成高分子の柔軟性をより容易に調整できる。なお、第二のセグメントが上記分子団を一つだけ含んでいる場合には、複数の第二のセグメント同士を互いに連結させて、それら複数の第二のセグメントのうちの少なくとも一つを第一のセグメントに結合させてもよい。あるいは、複数の第二のセグメントを一つの第一のセグメントに結合させてもよい。なお、複数の第二のセグメント同士を連結する場合には、複数の第二のセグメント同士の連結の一部に分岐を導入して、第二のセグメントのネットワークを形成してもよい。
第二のセグメントは、例えば、ポリエーテル、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリオール（ポリビニルアルコール等）、ポリオレフィン、ポリアセタール、ポリケタール、ポリ（メタ）アクリレート、シリコーン、ポリウレタン、ポリアルキレンイミン、フェノール樹脂、尿素樹脂、メラミン樹脂、及び多糖類からなる群より選択される少なくとも一種に由来する骨格を含んでよく、好ましくは、ポリエーテル基、ポリエステル基、ポリカーボネート基、ポリアミド基、ポリオール基（ポリビニルアルコール基等）、及び、修飾多糖基からなる群より選択される少なくとも一種の官能基を含んでもよく、エーテル基、エステル基、カーボネート基、アミド基、及び、修飾多糖基からなる群より選択される少なくとも一種の官能基を含んでもよい。第二のセグメントは、例えば、エーテル結合、エステル結合、炭酸エステル結合（カーボネート結合）、アミド基、シロキサン結合、ウレタン結合、ウレタン結合、又はウレア結合を有する構造単位からなる群より選択される少なくとも一種の構造単位を含んでよく、またアルキレン基、置換アルキレン基、オキシメチレン基、アルキレンイミン基、又は修飾多糖基を有する構造単位からなる群より選択される少なくとも一種の構造単位を含むともいえる。
ポリエーテル基としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレンオキサイド／プロピレンオキサイド共重合体、及びポリブチレングリコール等のポリアルキレングリコール類に由来する官能基が挙げられる。なお、これらのポリエーテル基が第二のセグメントに含まれる場合、ポリエーテル基は、必要に応じて第二セグメントに含まれる、後述するリンカーが有するエステル基やチオエステル基、アミド基中のヘテロ元素（Ｏ，Ｎ，Ｓ）に直結していてもよい。あるいはポリエーテル基は、第一セグメントに含まれるポリペプチド骨格が有するエステル基やチオエステル基、アミド基中のヘテロ元素（Ｏ，Ｎ，Ｓ）に直結していてもよい。この場合、ポリエーテル基全体がリンカーや第一セグメントから分離しやすくなり、その結果、ポリエーテル基の生分解速度が高められ得る。
ポリエステル基としては、例えば、ポリ乳酸、ポリ（３－ヒドロキシブタン酸）、ポリヒドロキシブタン酸／ヒドロキシバレリル酸共重合体、ポリヒドロキシブタン酸／４－ヒドロキシブタン酸共重合体、ポリヒドロキシブタン酸／ヒドロキシヘキサン酸共重合体、ポリトリメチレンテレフタラート、ブタンジオール／長鎖ジカルボン酸共重合体、ポリエチレンテレフタラート、ポリブチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネート・アジペート共重合体、ポリブチレンアジペート・テレフタラート共重合体、ポリカプロラクトン、及びポリトリメチレンフランジカルボキシレート（Poly(trimethylene furandicarboxylate):PTF）等のポリエステル類に由来する官能基が挙げられる。ポリエステル基は、上述のポリエステル類の中でも、好ましくは、ポリカプロラクトンなどのバイオマスプラスチック又は生分解性プラスチックに分類されるに由来する官能基である。
ポリカーボネート基としては、例えば、１，６－ヘキサンジオールポリカーボネート、１，５－ペンタンジオールポリカーボネート、及び１，１０－デカンジオールカーボネート等の脂肪族炭化水素鎖を主骨格として有するポリカーボネート類に由来する官能基が挙げられる。
ポリアミド基としては、例えば、ナイロン３、ナイロン４、ナイロン５、ナイロン６、ナイロン１１、及びナイロン６１０等のポリアミド類に由来する官能基が挙げられる。ポリアミド基は、上述のポリアミド類の中でも、好ましくは、バイオマスプラスチック又は生分解性プラスチックに分類されるに由来する官能基である。
ポリオール基（ポリビニルアルコール基等）としては、例えば、ポリビニルアルコール、エチレン・ビニルアルコール共重合体等のポリオール類（ポリビニルアルコール類等）に由来する官能基が挙げられる。ポリオール基は、上述のポリオール類の中でも、好ましくは、バイオマスプラスチック又は生分解性プラスチックに分類されるに由来する官能基である。
修飾多糖類基としては、例えば、セルロース、デンプン、キチン、及びキトサン等を化学修飾した化合物に由来する官能基が挙げられる。上記化学修飾した化合物は、例えば、酢酸セルロース、エチルセルロース、酢酸デンプン、ヒドロキシプロピル化デンプン、カルボキシメチルキチン、及びカルボキシメチルキトサン等が挙げられる。
第二のセグメントは、上記ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団に加えて、リンカー（反応性官能基）を更に含んでもよい。この場合、上記リンカーを介して、上記分子団と上記ポリペプチド骨格とが結合していてよい。リンカーは、例えば、下記式（１）で表される構造単位、下記一般式（２ａ）～（６）で表される構造単位、下記式（７）で表される構造単位、下記一般式（８ａ）～（９）で表される構造単位、下記一般式（１０）～（１１ｂ）で表される構造単位、及び下記一般式（１３）～（１６）で表される構造単位からなる群より選択される少なくとも一種を含んでよく、下記式（１）で表される構造単位、下記一般式（２ａ）～（６）で表される構造単位、下記式（７）で表される構造単位、及び下記一般式（８ａ）～（９）で表される構造単位からなる群より選択される少なくとも一種を含んでよく、生分解性を向上させる観点から、好ましくは、下記記式（１）で表される構造単位、並びに、下記記一般式（２ａ）、（３ａ）、（４ａ）、（４ｂ）及び（１０）で表される構造単位からなる群より選択される少なくとも一種を含む。リンカーは、上述の構造単位を複数含んでもよい。すなわち、リンカーは、上述の構造単位のみからなってもよく、また上述の構造単位を複数有してもよい（リンカーの本体部に対して上述の構造単位が複数共有結合していてもよい）。リンカーの本体部は比較的分子量が小さいことが好ましい。リンカーが上述の構造単位を３つ以上有する場合、例えば、１つの第二のセグメントに対して、３つの第一のセグメントが結合することが可能であり、このような選択によっても上記合成高分子にネットワーク構造を導入することができる。また上記合成高分子の製造に用いる原料の選択（ポリペプチド骨格を有する化合物、及び、当該ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を含む化合物の官能基を調整すること）によって、複数ある第二のセグメントの一部が互いに結合した合成高分子とすることもできる。リンカーが上述の構造単位を複数有する場合、複数ある構造単位の少なくとも一つが上記ポリペプチド骨格と結合し、少なくとも一つが上記分子団と結合する構造であってよい。リンカーが、上述の構造単位のみからなる場合、リンカーを示す構造単位を表す式中に記載された二本の結合の一方にペプチド骨格、他方に上記分子団が結合する。例えば、上記リンカーが下記式（１）で表される場合、好ましくは、上記分子団が窒素（Ｎ）と結合し、他方がポリペプチド骨格と結合する。リンカーが上述の構造単位を複数有する場合、例えば、下記式（１）で表される構造単位の場合、好ましくは、リンカーの本体部に対して窒素（Ｎ）が結合し、他方が、上記ポリペプチド骨格及び上記分子団と結合する。
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上記一般式（２ａ）、（２ｂ）、（３ａ）、（４ａ）、（４ｂ）、（５）、（６）、（１０）、（１１ａ）及び（１１ｂ）において、Ｙは、互いに独立に、酸素原子、硫黄原子、又はＮＲ１を示す。上記ＮＲ１において、Ｒ１は、水素、炭化水素基、芳香族基、カルボニル基、及びスルホニル基を示す。上記一般式（２ａ）、（２ｂ）、（３ａ）、（４ａ）、（４ｂ）、（８ａ）、（８ｂ）、（９）、（１０）、（１１ａ）及び（１１ｂ）において、Ｒは、互いに独立に、水素、炭化水素基、及び芳香族基を示す。
第二のセグメントの分子量（ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団）は、例えば、２００～５０００００、３００～４０００００、３５０～３５００００、４００～３０００００、５００～２０００００、６００～１００００００、７００～５００００、８００～１００００、９００～７５００、又は１００～５０００である。何故なら、第二のセグメントの分子量の分子量が２００未満の低い値である場合、分子の三次元構造内において可塑化機能を有する上記分子団の局在化が難しくなるため、一定レベルの機能を発揮する為に導入しなければいけない可塑化機能を有する分子団の重量比率を必要以上に高めなければならない。その結果、合成高分子の製造における反応時間を長くしたり、必要な反応温度を高くしたり、しなければならない可能性があるからである。一方、第二のセグメントの分子量の分子量が５０００００を超える場合には、分子量が過大となって、第一のセグメントに対する第二のセグメントの結合反応性が低下する恐れがあるからである。なお、上記した第二のセグメントの分子量は、重量平均分子量であり、一般にはＧＰＣを用いた公知の方法で求められるものである。
第一のセグメントの分子量（ポリペプチド骨格）に対する第二のセグメント（ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団）の分子量は、合成高分子の用途等に応じて、適宜調整することができる。第二のセグメントの分子量（第一のセグメント１つに対して２つ以上の第二のセグメントが結合している場合には、合計の分子量）は、第一のセグメントの分子量１００を基準として、例えば、好ましくは１～１００００であり、より好ましくは１．５～９０００であり、更に好ましくは２～８０００であり、より好ましくは３～７０００であり、更に好ましくは５～５０００であり、更により好ましくは７～３０００であり、更によりまた好ましくは１０～２０００である。第一のセグメントの分子量に対する第二のセグメントの分子量が１未満であると、合成高分子（成形材料）を用いて得られる成形体において可塑性（柔軟性）が不十分となる可能性あり、一方、１００００超となると、可塑性が過度に高まって、成形体の剛性が低下する恐れがある。上述の範囲内であることで、柔軟性により優れる成形体を製造することが可能である。また、第二のセグメントの分子量、及びポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団の分子量は、第一のセグメントの分子量、又は第一のセグメントに含まれるポリペプチド骨格の分子量を１００としたとき（好ましくは第一のセグメントに含まれるポリペプチド骨格の分子量を１００としたとき）に、例えば、１．４以上、１．５以上、１．６以上、１．７以上、１．８以上、１．９以上、２．０以上、５．０以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上であってもよい。なお、その上限値は特に限定されるものではないものの、例えば、１００以下、８０以下、７０以下、６０以下、５０以下であってよい。さらに、第二のセグメントの分子量は、第一のセグメントの分子量を１００としたときに、好ましくは１～７０の範囲内であり、より好ましくは１．５～６０であり、更に好ましくは１．５～５０であり、特に好ましくは２．０～５０である。第一のセグメント（ポリペプチド骨格）の分子量と第二のセグメント（ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団）の分子量との比が上記の範囲内の値である場合には、例えば、合成高分子を用いて得られる成形体において、ポリペプチド骨格を有していることによる第一のセグメントの特性（例えば、高い機械的強度）を十分に保持しつつ、合成高分子全体の柔軟性、或いは延伸性等を高めることが期待され得る。なお、上記した、第一のセグメントの分子量を１００としたときの第二のセグメントの分子量の比率は重量平均分子量で求めたものである。
第一のセグメント（ポリペプチド骨格）と第二のセグメント（可塑化機能を有する分子団）との合成高分子中の含有比率は、合成高分子の用途等に応じて、適宜調整することができる。かかる含有比率は、質量比で、第二のセグメントを１００としたときに、第一のセグメントが、例えば、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、１００以上、１１０以上、１５０以上、２００以上、２５０以上、３００以上、３００以上、４００以上、４５０以上、５００以上、５５０以上、６００以上であってよい。かかる値の上限値は特に限定されるものではないものの、１０００以下、９００以下、８００以下、７００以下であってよい。第一のセグメントと第二のセグメントとの合成高分子中の含有比率が上記の範囲内の値とされていることによって、第二のセグメントの無駄な使用が抑えられて、合成高分子の製造コストの抑制が図られ得る。なお、合成高分子中における、第一のセグメントに対する第二のセグメントの含有比率の低減は、例えば、第一のセグメントの分子量の低減等によって有利に実現され得る。
上述の実施形態の説明においては、リンカーを第二のセグメントの構成要素として説明したが、第二のセグメントとは区別して取り扱ってもよい。また、リンカーを第一のセグメントの構成要素として扱うこともできる。なお、リンカー部の分子量は上記ポリペプチド骨格及び上記分子団に比べて小さいが、リンカーを第二のセグメントとは区別して取り扱う場合、上述の第二のセグメントの分子量はリンカー部の分子量を差し引いた範囲を第二のセグメントの分子量の好適範囲であるものとして扱う。同様に、リンカー部を第一のセグメントの構成要素としてあるかう場合、上述の第一のセグメントの分子量はリンカー部の分子量を加えた範囲を第一のセグメントの分子量の好適範囲であるものとして扱う。
［成形材料及び成形体］
成形材料の一実施形態は、上述の合成高分子を含有する。上記成形材料は、上述の合成高分子を含有することから、柔軟性に優れる成形体を製造することができる。成形材料は、上述の合成高分子に加えて、その他の成分を含んでもよい。その他の成分としては、例えば、ポリエステル、ポリアミド、多糖類等の汎用高分子や無機塩類等が挙げられる。成形材料がその他の成分を含む場合、上述の合成高分子の含有量は、成形材料全量を基準として、例えば、７０質量％以上、８０質量％以上、又は９０質量％以上であってよい。
成形体の一実施形態は、上述の合成高分子を含有する。上記成形体は、上述の合成高分子を含有することから柔軟性に優れる。
［合成高分子の製造方法］
上述の合成高分子は、例えば、ポリペプチド骨格を構成するシステインのチオール基（メルカプト基又はスルフヒドリル基ともいう）と、マレイミド又はマレイン酸誘導体の炭素－炭素二重結合との１，４－付加反応を利用して、チオエーテル結合を生成させることによって、上記分子団の有する官能基（例えば、ポリエーテル基、ポリエステル基、ポリカーボネート基、ポリアミド基、ポリオール基、及び、修飾多糖基からなる群より選択される少なくとも一種の官能基）を第一のセグメントに導入することで製造することができる。上述の合成高分子は、上述の製造方法の一例を応用し、例えば、システインを有するポリペプチド骨格を含む化合物と、当該ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を含み、且つチオール基を有する化合物と、マレイミド基を２つ以上有する化合物とを、上述のマレイミド基の１，４－付加反応を利用してチオエーテル結合を形成することによっても製造することができる。上述の合成高分子は、その他、例えば、エポキシ基、又はイソシアネート基に対する付加反応、α－ハロカルボニル基に対する置換反応、アルキニル基とアジド基との間のＨｕｉｓｇｅｎ環化反応を利用して製造することもできる。
より一般的には、合成高分子の製造方法の一実施形態は、ポリペプチド骨格を含む化合物と、下記一般式（１Ａ）～（１６Ａ）で表される化合物の少なくとも１種とを反応させることによって合成高分子を得る工程を備える。上記工程は、ポリペプチド骨格を含む化合物と、下記一般式（１Ａ）～（１２Ａ）で表される化合物とを反応させることによって合成高分子を得る工程であってよい。上記ポリペプチド骨格は、チオール基、アミノ基、ヒドロキシ基、グアニジノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、インドール基、アミド基、アジド基、及びアルキニル基からなる群より選択される少なくとも一種を有し、好ましくは、チオール基、アミノ基、ヒドロキシ基、グアニジノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、インドール基、及びアミド基からなる群より選択される少なくとも一種を有する。ポリペプチド骨格を含む化合物と、下記一般式（１Ａ）～（１２Ａ）又は（１４Ａ）で表される化合物との反応がマイケル付加反応であってよい。
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Figure 2022162038000083
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上記一般式（１Ａ）、（２Ａ）、（２Ｂ）、（３Ａ）、（３Ｂ）、（４Ａ）、（５Ａ）、（６Ａ）、（７Ａ）、（８Ａ）、（８Ｂ）、（９Ａ）、（１０Ａ）、（１１Ａ）、（１１Ｂ）及び（１２Ａ）においてＲ２は、上記ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を示す。上記ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団としては、上述の合成高分子についての説明において例示したものを適用できる。
上記一般式（２Ａ）、（２Ｂ）、（３Ａ）、（３Ｂ）、（４Ａ）、（５Ａ）、（６Ａ）、（８Ｂ）、（９Ａ）、（１０Ａ）、（１１Ａ）及び（１１Ｂ）において、Ｙは、互いに独立に、酸素原子、硫黄原子、又はＮＲ１を示す。上記ＮＲ１において、Ｒ１は、水素、炭化水素基、芳香族基、カルボニル基、及びスルホニル基を示し、上記一般式（２Ａ）、（２Ｂ）、（３Ａ）、（３Ｂ）、（４Ａ）、（５Ａ）、（８Ａ）、（８Ｂ）、（９Ａ）、（１０Ａ）、（１１Ａ）及び（１１Ｂ）においてＲは、互いに独立に、水素、炭化水素基、及び芳香族基を示す。上記一般式（６Ａ）及び（１２Ａ）において、Ｚはハロゲン原子、スルホン酸エステル基、及び含フッ素カルボン酸エステル基を示す。上記一般式（１５Ａ）において、Ｘはハロゲン原子を示す。
ポリペプチド骨格を有する化合物一つ（第一のセグメント一つ）に対して導入されるポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団（第二のセグメント）の数は、ポリペプチド骨格を構成するアミノ酸配列に由来するチオール基、アミノ基、ヒドロキシ基、グアニジノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、インドール基、アミド基、アジド基、及びアルキニル基（好ましくは、チオール基、アミノ基、ヒドロキシ基、グアニジノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、インドール基、及びアミド基）の合計官能基数以下となるが、例えば、１個以上、２個以上、又は４個以上であってよく、３０個以下、２５個以下、２０個以下、１５個以下、１０個以下、又は８個以下であってよい。ポリペプチド骨格を有する化合物一つ（第一のセグメント一つ）に対して導入されるポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団（第二のセグメント）の数は上述の範囲内で調整することができ、例えば、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～８、又は２～８であってよい。
合成高分子の製造方法においては、例えば、溶媒中で、ポリペプチド骨格を有する化合物と一般式（１Ａ）～（１６Ａ）で表される化合物の少なくとも１種（好ましくは一般式（１Ａ）～（１２Ａ）で表される化合物）とを混合してもよい。また、反応が進行しにくい場合には、酸、塩基の添加、及び加温等を行ってもよい。反応温度は、通常、０～１５０℃であり、例えば、５０～１５０℃、７０～１２０℃、又は９０～１００℃であってよく、また、１０～１１０℃、２０～１００℃、又は２５～９０℃であってよい。使用される溶媒は、ポリペプチド骨格を有する化合物及び一般式（１Ａ）～（１６Ａ）で表される化合物を溶解することができ、所望の反応の進行を阻害しないものであればよい。このような溶媒としては、ヘキサフルオロイソプロピルアルコール（ＨＦＩＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、酢酸、ギ酸等が挙げられる。
上述の反応によって得られる生成物（合成高分子を含む粗製物）は、例えば、再沈殿、順相カラムクロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、溶媒による洗浄などによって精製してもよい。
上述の合成高分子の製造方法の一実施形態は、ポリペプチド骨格を含む化合物と、前記ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を含む化合物と、下記一般式（２－１Ａ）～（２－１６Ａ）で表される構造単位からなる群より選択される少なくも一種の構造単位を２つ以上有する化合物と、を反応させることによって合成高分子を得る工程を備える。上記工程は、ポリペプチド骨格を含む化合物と、上記ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を含む化合物と、下記一般式（２－１Ａ）～（２－１２Ａ）で表される構造単位からなる群より選択される少なくも一種の官能基を２つ以上有する化合物と、を反応させることによって合成高分子を得る工程であってよい。
上記ポリペプチド骨格は、チオール基、アミノ基、ヒドロキシ基、グアニジノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、インドール基、アミド基、アジド基、及びアルキニル基からなる群より選択される少なくとも一種を有し、好ましくは、チオール基、アミノ基、ヒドロキシ基、グアニジノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、インドール基、及びアミド基からなる群より選択される少なくとも一種を有する。上記分子団を含む化合物は、チオール基、アミノ基、ヒドロキシ基、グアニジノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、インドール基、アミド基、アジド基、及びアルキニル基からなる群より選択される少なくとも一種を有し、好ましくは、チオール基、アミノ基、ヒドロキシ基、グアニジノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、インドール基、及びアミド基からなる群より選択される少なくとも一種を有する。ポリペプチド骨格が有する官能基と、上記分子団を含む化合物の有する官能基とは、一般式（２－１Ａ）～（２－１６Ａ）で表される構造単位からなる群より選択される少なくも一種の官能基を２つ以上有する化合物の官能基の種類に応じて、選択することができ、同一であっても異なってもよい。ポリペプチド骨格が有する官能基と、上記分子団を含む化合物の有する官能基とが異なる場合、合成高分子の分子構造の制御をより容易に行うことができる。
Figure 2022162038000102
Figure 2022162038000103
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Figure 2022162038000121
上記一般式（２－２Ａ）、（２－２Ｂ）、（２－３Ａ）、（２－３Ｂ）、（２－４Ａ）、（２－５Ａ）、（２－６Ａ）、（２－１０Ａ）、（２－１１Ａ）、及び（２－１１Ｂ）において、Ｙは、互いに独立に、酸素原子、硫黄原子、又はＮＲ１を示す。Ｒ１は、水素、炭化水素基、芳香族基、カルボニル基、及びスルホニル基を示す。上記一般式（２－２Ａ）、（２－２Ｂ）、（２－３Ａ）、（２－３Ｂ）、（２－４Ａ）、（２－８Ａ）、（２－８Ｂ）、（２－９Ａ）、（２－１０Ａ）、（２－１１Ａ）、（２－１１Ｂ）、及び（２－１２Ａ）においてＲは、互いに独立に、水素、炭化水素基、及び芳香族基を示す。上記一般式（２－６Ａ）及び（２－１２Ａ）において、Ｚはハロゲン原子、スルホン酸エステル基、及び含フッ素カルボン酸エステル基を示す。上記一般式（２－１５Ａ）において、Ｘはハロゲン原子を示す。
ポリペプチド骨格を含む化合物及び上記ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を含む化合物と、上述の特定官能基を２つ以上有する化合物との反応は、例えば、マイケル付加反応等であってよい。
本実施形態に係る合成高分子の製造方法では、特定の官能基を有するポリペプチド骨格を含む化合物、及びポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有し、特定の官能基を有する分子団を含む化合物に対して反応する官能基を、特定の構造単位を２つ以上有する化合物として切り分けている。このような製造方法を取ることで、特定の官能基を有するポリペプチド骨格を含む化合物と、ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有し、特定の官能基を有する分子団を含む化合物との間で反応を進行させずに、反応溶液を調製することができる。混合しても反応が進行しないため、十分に均一な状態となるまで、例えば時間をかけることもできる。均一な反応溶液が調製された後、特定の構造単位を２つ以上有する化合物を配合することによって、反応を開始させることによって、反応系の制御をより容易に行うことができ、より均一な合成高分子を調製することができる。このような方法は、ポリペプチド骨格や分子団の種類に応じて溶媒等へ溶解性が低いときに特に有用である。
以上、幾つかの実施形態について説明したが、本開示は上記実施形態に何ら限定されるものではない。また、上述した実施形態についての説明内容は、互いに適用することができる。
以下、実施例等に基づいて本開示をより具体的に説明する。ただし、本開示は以下の実施例に限定されるものではない。
〔人工フィブロインの製造〕
（１）発現ベクターの作製
配列番号７２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２７）を有する人工フィブロイン、配列番号６２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１７）を有する人工フィブロイン、及び配列番号６３で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１８）を有する人工フィブロインを設計した。なお、配列番号７２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２７）を有する人工フィブロインの平均ハイドロパシー・インデックスの値は０．４４であり、配列番号６２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１７）を有する人工フィブロインの平均ハイドロパシー・インデックスの値は０．４５であり、配列番号６３で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１８）を有する人工フィブロインの平均ハイドロパシー・インデックスの値は０．４６である。
配列番号６２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１７）は、配列番号７２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２７）に対し、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側のそれぞれから１番目に位置するＲＥＰ中に、それぞれ１カ所ずつシステイン残基が挿入されたものである。配列番号６２で示されるアミノ酸配列を有する人工フィブロインのシステイン残基の総数は２である。配列番号６３で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１８）は、配列番号７２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２７）に対し、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側それぞれから１～２番目に位置するＲＥＰ中に、それぞれ１カ所ずつシステイン残基が挿入されたものである。配列番号６３で示されるアミノ酸配列を有する人工フィブロインのシステイン残基の総数は４である。
配列番号６２、配列番号６３及び配列番号７２で示されるアミノ酸配列を有する人工フィブロインをコードする核酸をそれぞれ合成した。当該核酸には、５’末端にＮｄｅＩサイト、終止コドン下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した。この核酸をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。その後、同核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した後、タンパク質発現ベクターｐＥＴ－２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。
（２）タンパク質の製造
得られた発現ベクターで、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。当該形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。当該培養液を、アンピシリンを含む１００ｍＬのシード培養用培地（表４）にＯＤ６００が０．００５となるように添加した。培養液温度を３０℃に保ち、ＯＤ６００が５になるまでフラスコ培養を行い（約１５時間）、シード培養液を得た。
Figure 2022162038000122
当該シード培養液を５００ｍＬの生産培地（表５）を添加したジャーファーメンターにＯＤ６００が０．０５となるように添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにした。
Figure 2022162038000123
生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １２０ｇ／１Ｌ）を１ｍＬ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにし、２０時間培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、人工フィブロインを発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存した目的とする人工フィブロインサイズのバンドの出現によって、目的とする人工フィブロインの発現を確認した。
（３）タンパク質の精製
ＩＰＴＧを添加してから２時間後に回収した菌体を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の菌体を約１ｍＭのＰＭＳＦを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ Ｎｉｒｏ Ｓｏａｖｉ社製）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８Ｍ グアニジン緩衝液（８Ｍ グアニジン塩酸塩、１０ｍＭ リン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で懸濁し、６０℃で３０分間、スターラーで撹拌し、溶解させた。溶解後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分を除き、凍結乾燥粉末を回収することにより、粉末状の人工フィブロイン（ＰＲＴ１７、ＰＲＴ１８、ＰＲＴ２７）を得た。システイン残基を挿入した人工フィブロインについて、分子間でジスルフィド結合が形成されていることを確認した。人工フィブロインに、単量体１００質量部に対して、二量体が１３．８質量部、三量体が２．１質量部、四量体が０．８質量部含まれていることを確認した。ジスルフィド結合の形成は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって、測定した。
（実施例１）
数平均分子量：５０００のメトキシポリエチレングリコールマレイミド（シグマアルドリッチ社製：第二のセグメント）を用いて、合成高分子を調製した。具体的には、ガラス容器に、上述のようにして調製した配列番号６３で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１８）を有する、数平均分子量：５００００の人工フィブロイン（第一のセグメント）を２５００ｍｇ、上記メトキシポリエチレングリコールマレイミドを５００ｍｇ測り取り、更に溶媒として、ヘキサフルオロイソプロピルアルコール（セントラル硝子株式会社製、ＨＦＩＰ）を５０ｍＬ加え、撹拌することで、人工フィブロイン等を溶解させ反応溶液を得た。その後、室温（２５℃）にて、反応溶液を２０時間撹拌することで反応を行った。
２０時間が経過したところで、溶媒を留去し、粗生成物をメタノール（ナカライテスク株式会社製）で３回洗浄した。一回の洗浄にメタノール５０ｍＬを用いた。洗浄操作によって、メトキシポリエチレングリコールマレイミド等の未反応物を除去した。洗浄操作後、減圧乾燥を行うことによって、生成物（合成高分子）を得た。生成物に対するＳＤＳ－ＰＡＧＥによって、分子量の増大を確認し、人工フィブロインに、ポリエチレングリコール鎖が導入されていることを確認した。得られた合成高分子は、第一のセグメント一つに対して１～４個の第二のセグメントが結合したものとなっていることを確認した。図６にＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す。図６において、１及び７レーンが分子量特定のための標準サンプルであり、２，３が配列番号６３で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１８）を有する人工フィブロインであり、４が実施例１で調製した上記合成高分子である。
（実施例２）
数平均分子量が１００００であるメトキシポリエチレングリコールマレイミド（シグマアルドリッチ社製）を用いたこと、メトキシポリエチレングリコールマレイミドの配合量を２０ｍｇとしたこと、人工フィブロインを５０ｍｇとしたこと、溶媒としてヘキサフルオロイソプロピルアルコール（セントラル硝子株式会社製、ＨＦＩＰ）を１ｍＬ加えこと、及び粗生成物の一回の洗浄にメタノール１ｍＬを用いた以外は、実施例１と同様にして、合成高分子を調製した。生成物に対するＳＤＳ－ＰＡＧＥによって、分子量の増大を確認し、人工フィブロインに、ポリエチレングリコール鎖が導入されていることを確認した。得られた合成高分子は、第一のセグメント一つに対して１～４個の第二のセグメントが結合したものとなっていることを確認した。図６において、５レーンが実施例２で調製した上記構成高分子である。
（実施例３）
数平均分子量が７５０であるメトキシポリエチレングリコールマレイミド（シグマアルドリッチ社製）を用いたこと、及びメトキシポリエチレングリコールマレイミドの配合量を１．５ｍｇとしたこと以外は、実施例２と同様にして、合成高分子を調製した。生成物に対するＳＤＳ－ＰＡＧＥによって、分子量の増大を確認し、人工フィブロインに、ポリエチレングリコール鎖が導入されていることを確認した。得られた合成高分子は、第一のセグメント一つに対して１～４個の第二のセグメントが結合したものとなっていることを確認した。図６において、６レーンが実施例３で調製した上記構成高分子である。
（比較例１）
比較のため、システインを有しない人工フィブロインを用いて同様の実験を行った。すなわち、ガラス容器に、上述のようにして調製した配列番号７２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２７）を有する人工フィブロイン（数平均分子量：１０００００）を２０ｍｇ、数平均分子量：５０００のメトキシポリエチレングリコールマレイミド（シグマアルドリッチ社製）を４ｍｇ測り取り、更に溶媒として、ヘキサフルオロイソプロパノール（セントラル硝子株式会社製、ＨＦＩＰ）を１ｍＬ加え、撹拌することで、人工フィブロイン等を溶解させ反応溶液を得た。その後、室温（２５℃）にて、反応溶液を２０時間撹拌することで反応を行った。
２０時間が経過したところで、溶媒を留去し、粗生成物をメタノール（ナカライテスク株式会社製）で３回洗浄した。一回の洗浄にメタノール１ｍＬを用いた。洗浄操作によって、メトキシポリエチレングリコールマレイミド等の未反応物を除去した。洗浄操作後、減圧乾燥を行うことによって、生成物を得た。生成物に対するＳＤＳ－ＰＡＧＥによって、分子量に変化がないことが確認され、人工フィブロインと、メトキシポリエチレングリコールマレイミドとの反応が進行してないことを確認した。図７にＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す。図７において、１レーンが分子量特定のための標準サンプルであり、６レーンが生成物であり、７レーンが配列番号７２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２７）を有する人工フィブロインである。
（比較例２）
上述のようにして調製した配列番号７２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２７）を有する人工フィブロイン（数平均分子量：１０００００）と、ポリエチレンオキサイドとの混合物を調製した。具体的には、容器に、上記人工フィブロイン１０ｇと、上記人工フィブロイン全量を１００質量％として、５質量％の重量となるように、ポリエチレンオキサイド（数平均分子量：４０００）を配合し、ビーズミル（日本コークス工業株式会社製、アトライター）を用いて回転数：１０００回／分の条件で１０分間、乾式混合させて、混合物を調製した。
（比較例３）
ポリエチレンオキサイドとして、数平均分子量２００００のポリエチレンオキサイドを用いた他、比較例２と同様にして、混合物を調製した。
（比較例４）
上述のようにして調製した配列番号７２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２７）を有する人工フィブロイン（数平均分子量：１０００００）と、ポリエチレンオキサイドモノステアレート（４０Ｅ．Ｏ．、数平均分子量：２０４４）との混合物を調製した。人工フィブロイン全量を１００質量％として、１０質量％の重量となるように、ポリエチレンオキサイドモノステアレートを配合し、エタノール（９９．５％）中で１５時間混合し、オーブンにて６０℃で５時間乾燥させて、混合物を調製した。
＜成形体の評価＞
実施例１～３で調製した合成高分子、比較例２、３及び４で調製した混合物を用いて、それぞれ以下の条件で、加熱加圧成形によって成形体を調製した。成形には、図８に示す加圧成形機１０を用いた。図８は、加圧成形機の模式断面図である。図８に示す加圧成形機１０は、貫通孔が形成され加温可能な金型２と、金型２の貫通孔内で上下動が可能な上側ピン４及び下側ピン６とを備えるものであり、金型２に、上側ピン４又は下側ピン６を挿入して生じる空隙に、サンプルを導入して、金型２を加温しつつ、上側ピン４及び下側ピン６で組成物を圧縮することで、成形体を得ることができる。
図９を用いて、成形体を得る工程を説明する。図９の（ａ）は組成物導入前、（ｂ）はサンプル導入直後、（ｃ）はサンプルを加熱及び加圧している状態の加圧成形機の模式断面図である。図９の（ａ）に示すように、金型２の貫通孔に下側ピン６のみを挿入した状態で貫通孔内に組成物を導入し、図９の（ｂ）に示すように、金型２の貫通孔に上側ピン４を挿入して下降させ、金型２の加熱を開始して、加熱加圧前のサンプル８ａを貫通孔内で加熱加圧する。あらかじめ定めた加圧力に至るまで上側ピン４を下降させ、図９の（ｃ）に示す状態でサンプルが所定の温度に達するまで、加熱及び加圧を継続して、加熱加圧後の成形体８ｂを得る。場合によって、冷却器（例えばスポットクーラー）を用いて金型２の温度を下降させ、成形体８ｂが所定の温度になったところで、上側ピン４又は下側ピン６を金型２から抜き取り、成形体を得てもよい。加圧に関しては、下側ピン６を固定した状態で上側ピン４を下降させて実施してもよいが、上側ピン４の下降と下側ピン６の上昇の両方を実施してもよい。
具体的にはまず、上記合成高分子又は上記混合物を０.６ｇ測り取り、図８に示す加圧成形機１０の金型２（実施例１については、直径：１４ｍｍの円形状の貫通孔を有する円柱形状の金型を用い、比較例２，３及び４については、断面が３５ｍｍ×２５ｍｍの長方形状の貫通孔を有する円柱形状の金型を用いた。）の貫通孔内に導入した。この際、厚みが均等になるようにサンプルを加えていった。全てのサンプルを導入した後、金型２の加熱を開始するとともに、ハンドプレス機（ＮＰａシステム株式会社製、商品名：ＮＴ－１００Ｈ－Ｖ０９）を用いて、上側ピン４と下側ピン６を貫通孔内に挿入することでサンプルの加圧を行った。この際、サンプルの加圧条件が５０ＭＰａとなるように制御した。サンプルの温度が１５０℃に到達してから５分間経過したところで、加熱を中止し、スポットクーラー（トラスコ中山株式会社製、商品名：ＴＳ－２５ＥＰ－１）で冷却して、サンプルの温度が５０℃になったところで取り出し、バリ取りを行った後、直径：１４ｍｍ×厚さ：３．０ｍｍの円盤状の成形体（比較例２，３及び４は、縦：３５ｍｍ×横：２５ｍｍ×厚さ：３．０ｍｍの直方体形状の成形体）を得た。なお、成形に使用した、上記成形材料及び上記混合物の水分含有量は、加熱乾燥式水分計で測定したところ、いずれも７～９質量％であった。
得られた成形体について、外観についての目視観察、及びブリードアウトに関しての指で触り観測を行い、以下の基準で評価した。結果を表６に示す。また、成形体の外観を図１０、図１１及び図１２に示す。
［外観の評価基準］
Ａ：均一である。
Ｂ：均一であるが濁りがみられる。
Ｃ：不均一である。
［ブリードアウトの評価基準］
Ａ：ベタツキがない。
Ｂ：成形直後にベタツキがあるが、ふき取った後はベタツキがない。
Ｃ：ふき取ってもべたつきが残る、又は再度ベタツキが発生する。
Figure 2022162038000124
表６中、「－」は、測定を実施していないことを意味する。表６、図１０、図１１、図１２に示される結果から確認されるように、第一のセグメントと、第二のセグメントとが直接結合していることによって、実施例１～３では相分離等が確認されなかった。一方、人工フィブロインと、柔軟性の高分子との混合物である比較例１～４では、相分離やブリードアウトが発生することが確認された。
（実施例４）
実施例１で調製した合成高分子、及び上述のようにして調製した配列番号７２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２７）を有する人工フィブロイン（数平均分子量：１０００００）を含むフィルムを成形した。具体的には、容器にジメチルスルホキシド４．４ｇ測り取り、ここに上記人工フィブロイン０．１５ｇを測り取り、窒素下で１２０℃の条件下で１５分間撹拌し上記人工フィブロインを溶解させた。上記人工フィブロイン０．１５を更に加え、窒素下で１２０℃の条件下で３０分間撹拌し上記人工フィブロインが合計０．３０ｇ溶解した溶液を調製した。上記溶液中に、上記合成高分子０．１５ｇを測り取り、窒素下で９０℃の条件下で１５分間撹拌し上記合成高分子を溶解させた。上記合成高分子０．１５ｇを更に加え、窒素下で９０℃の条件下で３０分間撹拌させることで、上記人工フィブロイン及び上記合成高分子がそれぞれ０．３０ｇずつ溶解したドープ液を調製した。ドープ液中において、合成高分子：人工フィブロイン：ジメチルスルホキシドが、６質量％：６質量％：８８質量％となるように混合比を調整した。
上記ドープ液を８０℃の下、３０分間静置することで脱泡させた。コーター（株式会社井元製作所製）を用いて、脱泡後のドープ液からフィルムを成形した。まず、離型部材としてＰＥＴフィルム（１５０ｍｍ×２００ｍｍ）をコーター上に設置し、アプリケーター厚さ０．５ｍｍ、塗工スピード２０ｍ／分間の条件で、４０℃の温度条件下でドープ液の液膜を上記ＰＥＴフィルム状に設けた。その後、ドープ液の液膜をＰＥＴフィルムごと、送風オーブン内に静置し、１００℃の条件下で１５分間乾燥させ、更に真空オーブンに移し、８０℃の条件下で１５時間かけて真空乾燥させ、絶乾させることで、合成高分子及び人工フィブロインからなるフィルム状の成形体（フィルム）を調製した。
調製されたフィルムは無色透明であり、柔軟性があることが確認された。当該フィルムは曲げ応力を加えた場合であっても割れが発生しないことが確認された。
（実施例５）
上述のようにして調製した配列番号６２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１７）を有する人工フィブロイン（数平均分子量：５００００：第一のセグメント）２３００ｍｇと、数平均分子量２０，０００のポリエチレングリコールビスマレイミド、（Ｂｉｏｃｈｅｍｐｅｇ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．製、ＨＯ０２２０２２－２０Ｋ：第二のセグメント）９００ｍｇをナスフラスコ内で１１５ｍＬの溶媒（ＤＭＳＯ、キシダ化学株式会社製）に溶解させた後、トリエチルアミン（ナカライテスク株式会社製）１２μＬを加え、８０℃で１７時間撹拌しながら反応を行なった。酢酸エチル（関東化学株式会社製）３００ｍＬ、さらにヘキサン（関東化学株式会社製）３００ｍＬを加え、２時間静置して生成物を沈殿させた。さらに遠心（１，０００ｇ×１０分）を行い、上清を除去した。未反応のポリエチレングリコールビスマレイミドを除去するため、酢酸エチルを再度添加、遠心、上清除去を３回繰り返した。更に、減圧乾燥を行う事により生成物を得た。調製された合成高分子は、人工フィブロイン（第一のセグメントに相当）の分子鎖末端に、ポリエチレングリコール鎖を有するＮ置換マレイミド（第二のセグメントに相当）が結合したブロックが複数繰り返された構造を有する。すなわち、当該合成高分子は、第二のセグメント、第一のセグメント、及び第二のセグメントの順に３つのセグメントが結合した分子となっている。
上述のとおり調製した合成高分子を含むフィルムを成形した。具体的には、容器にジメチルスルホキシド４．５５ｇ測り取り、ここに上記合成高分子０．４５ｇを加え、窒素下で９０℃の条件下で３０分間撹拌させることで、上記合成高分子が溶解したドープ液を調製した。撹拌速度は１００ｒｐｍに設定した。ドープ液中において、合成高分子：ジメチルスルホキシドが、９質量％：９１質量％となるように混合比を調整した。
上記ドープ液を用いて、実施例４と同様にしてフィルム状の成形体（フィルム）を調製した。調製されたフィルムは無色透明であり、実施例４のフィルムよりもより柔軟性に優れることが確認された。当該フィルムは曲げ応力を加えた場合であっても割れが発生しないことが確認された。
（実施例６）
上述のようにして調製した配列番号６２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１７）を有する人工フィブロイン（数平均分子量：５００００：第一のセグメント）１４２４ｍｇと、数平均分子量２０，０００のメトキシポリエチレングリコールマレイミド、（Ｂｉｏｃｈｅｍｐｅｇ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．製、ＭＦ００１０２２－２０Ｋ：第二のセグメント）１０７６ｍｇをナスフラスコ内で７１ｍＬの溶媒（ＤＭＳＯ、キシダ化学株式会社製）に溶解させた後、トリエチルアミン（ナカライテスク株式会社製）７．５μＬを加え、８０℃で１７時間撹拌しながら反応を行なった。酢酸エチル（関東化学株式会社製）２１０ｍＬ、さらにヘキサン（関東化学株式会社製）２１０ｍＬを加え、１７時間静置して生成物を沈殿させた。さらに遠心（１，０００ｇ×１０分）を行い、上清を除去した。未反応のメトキシポリエチレングリコールマレイミドを除去するため、酢酸エチルを再度添加、遠心、上清除去を３回繰り返した。更に減圧乾燥を行う事によって合成高分子を得た。調製された合成高分子は、人工フィブロイン（第一のセグメントに相当）の分子鎖の両末端に、ポリエチレングリコール鎖を有するＮ置換マレイミド（第二のセグメントに相当）が結合した構造を有する。すなわち、当該合成高分子は、第二のセグメント、第一のセグメント、及び第二のセグメントの順に３つのセグメントが結合した分子となっている。
上述のとおり調製した合成高分子を含むフィルムを成形した。具体的には、容器にジメチルスルホキシド４．３０ｇ測り取り、ここに上記合成高分子０．７０ｇを加え、窒素下で９０℃の条件下で３０分間撹拌させることで、上記合成高分子が溶解したドープ液を調製した。撹拌速度は１００ｒｐｍに設定した。ドープ液中において、合成高分子：ジメチルスルホキシドが、１４質量％：８６質量％となるように混合比を調整した。
上記ドープ液を用いて、実施例４と同様にしてフィルム状の成形体（フィルム）を調製した。調製されたフィルムは無色透明であり、実施例４のフィルムよりもより柔軟性に優れることが確認された。当該フィルムは曲げ応力を加えた場合であっても割れが発生しないことが確認された。
（実施例７）
両末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコール（バイオケムペグ社製、数平均分子量：２００００）と、システイン残基を２つ有する人工フィブロインとを反応させ、合成高分子を調製した。具体的には、上述のように調製した配列番号６２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１７）を有する人工フィブロイン（数平均分子量：５００００）４.０２２ｇと、両末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコール１.５６４ｇと、溶媒としてジメチルスルホキシド２０１ｍＬとをナスフラスコに測り取り、８０℃で４８時間撹拌し溶解及び反応させ、合成高分子の溶液を得た。得られた溶液に、酢酸エチル６０３ｍＬ、及びヘキサン６０３ｍＬを加えて２時間攪拌し、遠心分離を行った後、さらに酢酸エチルで３回洗浄した。その後、エバポレーターで乾燥させて、最後に室温で真空乾燥させて合成高分子の粉末を得た。
（実施例８）
両末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコール（バイオケムペグ社製、数平均分子量：２００００）と、システイン残基を２つ有する人工フィブロインとを、反応させ、合成高分子を調製した。具体的には、上述のように調製した配列番号６２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１７）を有する人工フィブロイン（数平均分子量：５００００）３４８ｍｇをステンレス容器に測り取り、溶媒としてジメチルスルホキシド２.１１ｍＬを加え、撹拌し溶解させてフィブロイン溶液を得た。また、両末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコール１３２ｍｇをガラス容器に測り取り、溶媒としてジメチルスルホキシド１.０９ｍＬを加え、撹拌し溶解させてポリエチレングリコール溶液を得た。得られたフィブロイン溶液とポリエチレングリコール溶液とを撹拌しながら混合し、１００℃で５分間撹拌しながら反応させた後、更に１００℃で１０分間静置させ反応させることによって合成高分子を調製した。実施例８では、ジメチルスルホキシドに合成高分子が溶解したままの状態で、乾燥させることなく、後述するフィルム成形に供した。
（実施例９）
両末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコール（バイオケムペグ社製、数平均分子量：２００００）と、システイン残基を２つ有する人工フィブロインと、システイン残基を４つ有する人工フィブロインとを反応させ、合成高分子を調製した。具体的には、上述のように調製した配列番号６２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１７）を有する人工フィブロイン（数平均分子量：５００００、システイン残基の総数２）３３６ｍｇと、配列番号６３で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１８）を有する人工フィブロイン（数平均分子量：５３１００、システイン残基の総数４）４４ｍｇと、両末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコール１６０ｍｇとをガラス容器に測り取り、溶媒としてジメチルスルホキシド４.４２ｍＬを加え、撹拌しながら上述の成分を溶解させることで反応溶液を得た。得られた反応溶液を１００℃で１０分間撹拌しながら反応させた後、更に１００℃で５分間静置させ反応させることによって、合成高分子を調製した。実施例９では、ジメチルスルホキシドに合成高分子が溶解したままの状態で、乾燥させることなく、後述するフィルム成形に供した。
（実施例１０）
両末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコール（バイオケムペグ社製、数平均分子量：２００００）と、チオール基を２つ有する２、２’－（エチレンジオキシ）ジエタンチオール、システイン残基を２つ有する人工フィブロインとを反応させ、合成高分子を調製した。具体的には、上述のように調製した配列番号６２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１７）を有する人工フィブロイン（数平均分子量：５００００）３００ｍｇと、両末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコール２８４ｍｇとをガラス容器に測り取り、溶媒としてジメチルスルホキシド３.４２ｍＬを加え、撹拌し各成分を溶解させることで反応溶液を得た。得られた反応溶液を１００℃で１５分間撹拌し反応させた後、２、２’－（エチレンジオキシ）ジエタンチオール１.５５ｍｇを更に加え、１００℃で１０分間撹拌させ反応させることによって、合成高分子を調製した。実施例１０では、ジメチルスルホキシドに合成高分子が溶解したままの状態で、乾燥させることなく、後述するフィルム成形に供した。
（実施例１１）
両末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコール（バイオケムペグ社製、数平均分子量：１０００）と、両末端にシステイン残基を有する（即ち、両末端にチオール基を有する）ポリエチレングリコール（バイオケムペグ社製、数平均分子量：２０００）と、システイン残基を２つ有する人工フィブロインとを反応させ、合成高分子を調製した。具体的には、上述のように調製した配列番号６２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１７）を有する人工フィブロイン（数平均分子量：５００００）３７８ｍｇと、両末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールを７９ｍｇと、両末端にシステイン残基を有するポリエチレングリコール１４３ｍｇとをバイアル瓶に測り取り、溶媒としてジメチルスルホキシド４．４０ｍＬを加え、撹拌し溶解させることで反応溶液を得た。反応溶液を１００℃で１０分間撹拌しながら反応させたのち、更に１００℃で１０分間静置させ反応させることによって合成高分子を調製した。実施例１１では、ジメチルスルホキシドに合成高分子が溶解したままの状態で、乾燥させることなく、後述するフィルム成形に供した。
（比較例５）
実施例７～１１で調製された合成高分子との比較のために、上述のようにして調製した配列番号７２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２７）を有する人工フィブロイン（分子量：１０００００）を用い、類似の操作を加えた。具体的には、上述のようにして調製した配列番号７２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２７）を有する人工フィブロイン（分子量：１０００００）の粉末６５０ｍｇをステンレス容器に測り取り、溶媒としてジメチルスルホキシド３.９５５ｍＬを加え、撹拌し分散液を得た。得られた分散液を１２０℃で、３０分間撹拌し溶解した後、更に１００℃で１０分間静置させた。比較例５では、ジメチルスルホキシドに人工フィブロインが溶解したままの状態で、乾燥させることなく、後述するフィルム成形に供した。
＜成形体の評価＞
実施例７～１１で調製された合成高分子を用いて、以下の条件でフィルム状の成形体を作製した。実施例７で調製された合成高分子については、まず合成高分子の粉末５３０ｍｇをジメチルスルホキシド３.５３ｍＬに加え、９０℃で４０分間攪拌させることによって、上記粉末を溶解させてドープ溶液を調製し、次いで８０℃で３０分間静置し、脱泡させたものをフィルム成形に供した。実施例８～１１で調製された合成高分子は、ジメチルスルホキシドに溶解させたまま、乾燥させることなく、ドープ溶液としてフィルム成形に供した。また、比較例５の人工フィブロインも同様にジメチルスルホキシドに溶解したまま、乾燥させることなくドープ溶液としてフィルム成形に供した。
まず、離型部材としてＰＥＴフィルム（１５０ｍｍ×２００ｍｍ）を用意し、アプリケーターで厚さ０．４ｍｍとなるようにドープ溶液の液膜を、上記ＰＥＴフィルム上に設けた。その後、上記液膜をＰＥＴフィルムごと、送風オーブン内に静置し、６０℃の条件下で３０分間乾燥させ、更に真空オーブンに移し、８０℃の条件下で１５時間かけて真空乾燥させ、絶乾させることによって合成高分子又は人工フィブロインからなるフィルム状の成形体（フィルム）を調製した。
調製された各フィルムに対して引張試験を行うことで、弾性率、引張強度、破断伸度、及びタフネスを評価した。結果を表７に示す。表７には絶乾状態におけるフィルムの膜厚も併記した。なお、表７に示す破断伸度は、比較例５で得られた結果を基準とする相対値で記した。
Figure 2022162038000125
表７に示されるとおり、実施例７～１１で得られたフィルムは、比較例５で得られたフィルムと比べて、破断伸度が極めて大きく、且つ弾性率が低く抑制されていることがわかる。このことからも、実施例７～１１で得られたフィルムは柔軟性に十分に優れることが確認できる。くわえて、実施例７～１１で得られたフィルムはタフネスも十分に優れたものとなっている。
実施例７及び実施例８の結果から、一旦粉体として合成高分子を単離し再度溶解させてからフィルムを調製するよりも反応後の溶液から直接フィルムを成形することによって弾性率、破断伸度及びタフネスに優れるフィルムを調製できることが確認できた、また、実施例８、実施例１０及び実施例１１の結果から、第二のセグメントを構成する柔軟さを調製することによって、得られるフィルムの柔軟性を調製することができ、第二のセグメントを長くすることによって、その傾向が顕著となることが確認された。
（実施例１２）
上述のようにして調製した配列番号６２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１７）を有する人工フィブロイン（数平均分子量：５００００：第一のセグメント）２１７７ｍｇと、数平均分子量２００００のポリエチレングリコールビスマレイミド、（Ｂｉｏｃｈｅｍｐｅｇ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．製、ＨＯ０２２０２２－２０Ｋ：第二のセグメント）８２３ｍｇを塩化リチウムの濃度が２Ｍのジメチルスルホキシド溶液（ＤＭＳＯ、キシダ化学株式会社製）１２０００ｍｇに溶解させた後、窒素下で、１００℃で４時間撹拌しながら反応させることで、上記合成高分子が溶解したドープ液を調製した。撹拌速度は１００ｒｐｍに設定した。ドープ液中において、合成高分子：ジメチルスルホキシドが、２０質量％：８０質量％となるように混合比を調整した。得られたドープの１００℃における粘度は、１０９００ｍＰａ・ｓであった。調製されたドープ液中の合成高分子は、人工フィブロイン（第一のセグメントに相当）の分子鎖末端に、ポリエチレングリコール鎖を有するＮ置換マレイミド（第二のセグメントに相当）が結合したブロックが複数繰り返された構造を有する。
上記ドープ液を用いて、以下に示す条件で乾湿式紡糸することによって、繊維を調製した。１００℃のドープ液をノズル（ノズル直径：０．１ｍｍ）からギアポンプによって窒素ガスと共に押出しし、第一凝固浴（第１浴）、第二凝固浴（第２浴）、及び延伸浴（第３浴）を通過させた後、６０℃に設定した加熱式ローラーによって巻き取った。延伸浴での延伸倍率は８．５倍に設定した。第１浴は０℃のメタノール浴とし、第２浴は２５℃のメタノール浴とし、第３浴は５４℃の水浴とした。得られた繊維は十分な伸張性を有することを確認した。得られた繊維の外観を図１３に示す。
以上の実施例は、第二のセグメントがマレイミド基を有する場合についての例で示した。以下にマレイミド基に代えて異なる官能基を用いた場合、及び第一のセグメント及び第二のセグメントの間の結合種を変えた場合についても確認的にいくつかの例を示す。
（実施例１３）
数平均分子量：６０００のポリ（エチレングリコール）グリシジルエーテル（メルク社製：第二のセグメント）を用いて、合成高分子を調製した。具体的には、ガラス容器に、上述のようにして調製した配列番号６２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１７）を有する、数平均分子量：５００００の人工フィブロイン（第一のセグメント）を２７ｍｇ、上記ポリ（エチレングリコール）グリシジルエーテルを３．１ｍｇ測り取った。さらに、トリエチルアミン（ナカライ社製）を０．１４μＬ、及び溶媒として塩化リチウムのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液（塩化リチウム濃度が２質量％）を１．７３ｍＬ加えて、反応溶液を得た。なお、塩化リチウムは富士フイルム和光純薬製の物を用い、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドは関東化学の物を用いた。
上述の反応溶液を５０℃又は８０℃にて、３時間又は２０時間反応させた。反応後、ＲＯ水を６ｍＬ加えて生成物を沈殿させ、遠心分離し溶媒を除去した。さらに、ＲＯ水で３回、アセトンで２回洗浄し、都度遠心分離によって洗浄液を除去した。なお、一回の洗浄には溶媒（ＲＯ水又はアセトン）を１５ｍＬ使用した。このような洗浄操作によって、未反応のポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテルなどを除去した。洗浄後、減圧乾燥させることによって、合成高分子を得た。得られた合成高分子に対するＧＰＣ測定によって、生成物である合成高分子の分子量が反応前の人工フィブロインよりも増大していることが確認され、人工フィブロインとポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテルとの間で共有結合が形成されていることが確認された。ＧＰＣの結果を図１４に示す。
（実施例１４）
数平均分子量：２００００のポリエチレングリコール（ナカライ社製）とヘキサメチレンジイソシアネート（東京化成社製）とを反応させ、第二のセグメントに相当する高分子化合物を調製した。上記高分子化合物と、人工フィブロインとを反応させることによって合成高分子を調製した。
具体的には、ガラス容器に、上記ポリエチレングリコールを１９７ｍｇ測り取り、溶媒としてＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを０．８４７μＬ加えて４０℃に加熱して溶解させた。これを２５℃に戻し、上記ヘキサメチレンジイソシアネート３．２μＬを加えて反応液を調製した。反応液を４０℃又は６０℃にて、４時間撹拌することによって、反応を行った。
また、配列番号７２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２７）を有する、数平均分子量：１００００の人工フィブロイン（第一のセグメント）４２．９ｍｇを別のガラス容器に測り取り、ここに溶媒として塩化リチウムのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液（塩化リチウム濃度が２質量％）を１．４７ｍＬ加えて、１００℃で１０分間加熱することによって溶解させて溶液を調製した。また、それとは別に、配列番号６２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１７）を有する、数平均分子量５００００の人工フィブロイン（第一のセグメント）４２．９ｍｇを別のガラス容器に測り取り、ここに溶媒として塩化リチウムのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液（塩化リチウム濃度が２質量％）を１．４７ｍＬ加えて、６０℃で１０分間加熱することによって溶解させて溶液を調製した。それら２種類の人工フィブロイン溶液をそれぞれ３０℃まで放冷した。
第二のセグメントに相当する高分子化合物を含む溶液に塩化リチウム１６ｍｇ加えて調製した溶液を、上記２種類の人工フィブロイン溶液のそれぞれに対して８６ｍｇ加えて、２種類の反応溶液を得た。その後、各反応溶液を３０℃にて、２０時間撹拌することでそれぞれ反応を行った。
反応後、実施例１３と同様の方法で洗浄し、未反応の高分子化合物等を除去した。洗浄後、減圧乾燥させることによって、配列番号７２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２７）を有する人工フィブロインを含む合成高分子と、配列番号６２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１７）を有する人工フィブロインを含む合成高分子とを得た。得られた２種類の合成高分子に対するＧＰＣ測定によって、生成物である２種類の合成高分子の分子量が、いずれも反応前の人工フィブロインよりも増大していることが確認され、人工フィブロインと高分子化合物（ポリエチレングリコールとヘキサメチレンジイソシアネートの反応物）との間で共有結合が形成されていることが確認された。ＧＰＣの結果を図１５に示す。図１５の（ａ）は配列番号７２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２７）を有する人工フィブロインを含む合成高分子の結果を示し、図１５の（ｂ）は配列番号６２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１７）を有する人工フィブロインを含む合成高分子の結果を示す。
（実施例１５）
数平均分子量：２００００のポリエチレングリコール（ナカライ社製）と３－ブチン酸（３－Ｂｕｔｙｎｏｉｃ Ａｃｉｄ、東京化成社製）とを反応させ、第二のセグメントに相当する高分子化合物を調製した。上記高分子化合物と、人工フィブロインとを反応させることによって、合成高分子を調製した。
具体的には、ガラス容器に、上記ポリエチレングリコール１ｇ、３－ブチン酸２５ｍｇ、酸触媒としてｐ－トルエンスルホン酸（キシダ化学社製）１０．３ｍｇを測り取り、溶媒としてトルエン（キシダ化学製）１０ｍＬを加えて反応液を得た。当該反応液を９０℃で２０時間撹拌することによって反応を行った。２０時間が経過した時点で、シクロペンチルメチルエーテル（富士フイルム和光純薬社製）を５０ｍＬ加えて２時間静置し、沈殿させた。沈殿物を濾集し、シクロペンチルメチルエーテルで３回洗浄して、粉末を得た。一回の洗浄に溶媒（シクロペンチルメチルエーテル）を１５ｍＬ用いた。洗浄操作によって、３－ブチン酸等の未反応物を除去した。この沈殿と精製作業を２回繰り返し、減圧乾燥を行うことで、第二のセグメントに相当する高分子化合物の粉末を得た。
次にガラス容器に、上述のようにして調製した配列番号６２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１７）を有する、数平均分子量：５００００の人工フィブロイン（第一のセグメント）を４０ｍｇ、上記高分子化合物を１６ｍｇ、塩基触媒としてトリエチルアミン（ナカライ社製）を０．２２μＬ又は１．６７μＬ、溶媒として、塩化リチウムのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液（塩化リチウム濃度が２質量％）又はジメチルスルホキシドを２．８ｍＬ加えて、反応溶液を調製した。当該反応溶液を２５℃又は８０℃で２０時間撹拌することによって反応を行った。
反応後、実施例１３と同様の方法で洗浄し、未反応の高分子化合物等を除去した。洗浄後、減圧乾燥させることによって、合成高分子を得た。得られた合成高分子に対するＧＰＣ測定によって、生成物である合成高分子の分子量が、反応前の人工フィブロインよりも増大していることが確認され、人工フィブロインと高分子化合物（ポリエチレングリコールと３－ブチン酸との反応物）との間で共有結合が形成されていることが確認された。ＧＰＣの結果を図１６に示す。
（実施例１６）
数平均分子量：２００００のポリエチレングリコール（ナカライ社製）と、ブロモ酢酸メチル（東京化成社製）とを反応させ、第二のセグメントに相当する高分子化合物を調整した。上記高分子化合物と、人工フィブロインとを反応させることによって、合成高分子を調製した。当該反応液を９０℃で２０時間撹拌することによって反応を行った。
具体的には、ガラス容器に、上記ポリエチレングリコールを３００ｍｇ、ブロモ酢酸メチルを８．３μＬ、酸触媒としてｐ－トルエンスルホン酸（キシダ化学社製）を３．１ｍｇ測り取り、溶媒としてトルエン（キシダ化学社製）を３ｍＬ加えて反応液を調製した。当該反応液を９０℃で２０時間撹拌することによって反応を行った。２０時間が経過した時点で、シクロペンチルメチルエーテル（富士フィルム和光純薬社製）を５０ｍＬ加えて２時間静置し、沈殿させた。沈殿物を濾集し、シクロペンチルメチルエーテルで３回洗浄し、沈殿させた。沈殿物を濾集し、シクロペンチルメチルエーテルで３回洗浄して、粉末を得た。一回の洗浄に溶媒（シクロペンチルメチルエーテル）を５ｍＬ用いた。洗浄操作によって、ブロモ酢酸メチル等の未反応物を除去した。この沈殿と精製作業を２回繰り返し、減圧乾燥を行うことで、第二のセグメントに相当する高分子化合物の粉末を得た。
次にガラス容器に、上述のようにして調製した配列番号６２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１７）を有する、数平均分子量：５００００の人工フィブロイン（第一のセグメント）を３６ｍｇ、上記高分子化合物を１３．７ｍｇ、塩基触媒としてトリエチルアミン（ナカライ社製）を０．１９μＬ、溶媒として、塩化リチウムのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液（塩化リチウム濃度が２質量％）を２．９ｍＬ加えて、反応溶液を調製した。当該反応溶液を５０℃で２０時間撹拌することによって反応を行った。
反応後、実施例１３と同様の方法で洗浄し、未反応の高分子化合物等を除去した。洗浄後、減圧乾燥させることによって、合成高分子を得た。得られた合成高分子に対するＧＰＣ測定によって、生成物である合成高分子の分子量が、反応前の人工フィブロインよりも増大していることが確認され、人工フィブロインと高分子化合物（ポリエチレングリコールとブロモ酢酸メチルとの反応物）との間で共有結合が形成されていることが確認された。ＧＰＣの結果を図１７に示す。
（実施例１７）
数平均分子量：４００のポリエチレングリコール（富士フイルム和光純薬社製）、ｐ－トルエンスルホン酸一水和物（キシダ化学社製）、及びアジ化ナトリウム（ナカライ社製）を反応させ、第二のセグメントに相当する高分子化合物を調製した。また、人工フィブロインと、臭化プロパルギル（東京化成社製）とを反応させ、第一のセグメントに相当するアルキニル基を有する人工フィブロイン（第一のセグメント）を調製し、上記高分子化合物と反応させることによって、合成高分子を調製した。
具体的には、ガラス容器に、上記ポリエチレングリコールを２００ｍｇ、塩化パラトルエンスルホニルを２１０ｍｇ、塩基触媒としてトリエチルアミン（ナカライ社製）を３４８μＬ測り取り、反応液を調製した。当該反応液を２５℃で５時間撹拌することによって、反応を行った。５時間経過後、１Ｎ塩酸（関東化学社製）を９ｍＬ、酢酸エチル（関東化学社製）を９ｍＬ加え、分液漏斗に移し、酢酸エチル抽出を３回行った。さらに炭酸水素ナトリウム溶液（関東化学社製）、飽和食塩水（関東化学社製）で酢酸エチル層を洗浄し、硫酸ナトリウム（ナカライ社製）で脱水した。その後、減圧乾燥を行うことで、反応物を得た。
次に、ガラス容器に、上記反応物を２０ｍｇ、アジ化ナトリウムを５．５ｍｇ、触媒としてテトラブチルアンモニウムヨージド（東京化成社製）を０．５ｍｇ、溶媒としてジメチルスルホキシド（キシダ化学社製）１ｍＬを加えて反応液を調製した。当該反応液を８０℃で２０時間撹拌することによって反応させた。２０時間が経過した時点で、飽和塩化アンモニウム溶液（関東化学社製）３ｍＬを加え、分液漏斗に移し、酢酸エチル抽出を３回行った。さらに硫酸ナトリウム（ナカライ社製）で脱水した。その後、減圧乾燥を行うことで、第二のセグメントに相当する高分子化合物を得た。
次にガラス容器に、上述のようにして調製した配列番号６２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１７）を有する、数平均分子量：５００００の人工フィブロイン（第一のセグメント）を３０ｍｇ、臭化プロパルギルを０．９μＬ、溶媒としてジメチルスルホキシド（キシダ化学社製）を１ｍＬ加えて、反応液を調製した。当該反応液を、２５℃で２０時間撹拌することによって、反応させた。２０時間が経過した時点で、酢酸エチル（関東化学社製）３ｍＬを加えて生成物を沈殿させた。沈殿物を濾集し、酢酸エチルで３回洗浄した。一回の洗浄に溶媒（酢酸エチル）を５ｍＬ用いた。洗浄操作によって、臭化プロパルギル等の未反応物を除去した。洗浄操作後、減圧乾燥を行うことによって、第一のセグメントに相当するアルキニル基を有する人工フィブロイン（第一のセグメント）を得た。
ガラス容器に、上記高分子化合物０．４ｍｇと、上記第一のセグメントに相当するアルキニル基を有する人工フィブロイン（第一のセグメント）３０ｍｇと、触媒としてヨウ化銅（Ｉ）（ナカライ社製）を０．１７ｍｇ、溶媒としてジメチルスルホキシド（キシダ化学社製）を１ｍＬ測り取り、反応溶液を調製した。当該反応溶液を、８０℃で２０時間撹拌することによって、反応を行った。２０時間が経過した時点で、酢酸エチル３ｍＬを加えて、生成物を沈殿させた。沈殿物を濾集し、酢酸エチルで３回洗浄した。一回の洗浄に溶媒（酢酸エチル）を５ｍＬ用いた。洗浄操作によって、未反応の高分子化合物等を除去した。洗浄後、減圧乾燥させることによって、合成高分子を得た。得られた合成高分子に対するＧＰＣ測定によって、生成物である合成高分子の分子量が、反応前の人工フィブロインよりも増大していることが確認され、アルキニル基を有する人工フィブロインと高分子化合物（ポリエチレングリコールとアジ化ナトリウムとの反応物）との間で共有結合が形成されていることが確認された。ＧＰＣの結果を図１８に示す。
（参考例１：構造タンパク質の疎水性評価（溶解性））
人工フィブロイン、シルクフィブロイン（平均ハイドロパシー・インデックスの値：０．２１）について、９Ｍ臭化リチウム水溶液への溶解性を評価した。シルクフィブロインとしては、ＫＢセーレン社製の「シルクパウダーＩＭ」を用い、人工フィブロインとしては、上述のようにして調製した配列番号６２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１７）を有する人工フィブロイン（数平均分子量：５００００）、及び上述のようにして調製した配列番号７２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２７）を有する人工フィブロイン（数平均分子量：１０００００）を用いた。溶解性の評価は、具体的には、９Ｍ臭化リチウム水溶液にそれぞれシルクフィブロイン、人工フィブロインを所定量添加し、６０℃で３０分間撹拌した後の水溶液の外観を観察することによって、溶解性を評価した。結果を表８に示す。表８中、「Ａ」は添加したフィブロインが完全に溶解し、設定した濃度の溶液を調製できたことを示し、「Ｂ」はフィブロインの解け残りが観察されたことを示す。すなわち、人工フィブロインは６０℃の９Ｍ臭化リチウム水溶液に対しても５質量％相当の量も溶解させることができない、疎水性の高いフィブロインであることが確認された。
Figure 2022162038000126
（参考例２：構造タンパク質の疎水性評価（耐熱水性））
人工フィブロイン、シルクフィブロインについて、熱水耐性試験を行い、耐熱水性を評価した。シルクフィブロインとしては、ＫＢセーレン社製の「シルクパウダーＩＭ」を用い、人工フィブロインとしては、上述のようにして調製した配列番号６２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１７）を有する人工フィブロイン（数平均分子量：５００００）を用いた。フィブロインの含有量が５質量％となるように、ガラス容器にフィブロイン５０ｍｇ、溶媒としてＲＯ水を９５０ｍｇ加えて分散液を調製した。当該分散液を１００℃で５時間撹拌した。５時間が経過したところで、遠心分離によって溶媒を除去した。溶媒を除去後アセトンで２回洗浄し、遠心分離によってアセトンを除去した。洗浄操作後、減圧乾燥を行うことによって処理粉末を得た。処理粉末に対するＧＰＣ測定によって、分解の程度を確認した。ＧＰＣの結果を図１９に示す。図１９から明らかなように、シルクフィブロインは処理前に比べて分子量の減少が確認され、人工フィブロインにはそのような分子量の減少が確認されなかった。この結果から、上記の人工フィブロインはＲＯ水に対する親水性がシルクフィブロインよりも低かったためと推定される。換言すれば、上記人工フィブロインは疎水性が高いといえる。なお、図１９中、配列番号６２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１７）を有する人工フィブロイン（数平均分子量：５００００）の結果をＰＲＴ１００と記す。
（参考例３：構造タンパク質の疎水性評価（接触角））
人工フィブロイン、シルクフィブロインについて、水に対する接触角の測定及び評価を行った。シルクフィブロインとしては、ＫＢセーレン社製の「シルクパウダーＩＭ」を用い、人工フィブロインとしては、上述のようにして調製した配列番号６２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１７）を有する人工フィブロイン（数平均分子量：５００００）、及び上述のようにして調製した配列番号７２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２７）を有する人工フィブロイン（数平均分子量：１０００００）を用いた。接触角の測定は、具体的にはまず、フィブロインの含有量が３質量％となるように、ガラス容器にフィブロイン３０ｍｇ、溶媒としてジメチルスルホキシド９７０ｍｇを加え、分散液を調製した。当該分散液を１００℃で１５分間撹拌してジメチルスルホキシド溶液を調製した。次に、スライドガラス上に、厚さ１００μｍのマスキングテープを貼り付けシムにして、上述のようにして調製したジメチルスルホキシド溶液をキャストし液膜を形成した。その後、スライドガラスごと、真空オーブン（東京理科危機社製、製品名：ＶＯＳ－２１０Ｃ）内に移動、静置し、８０℃で減圧乾燥を行うことでフィブロインのフィルム（膜）を形成した。当該フィルムに対して、２μＬのＲＯ水を滴下し、５秒間経過後の水の接触角を、接触角計（共和界面科学社製、製品名：ＤＭｓ－０６１）を用いて測定した。測定は各フィブロインに対して、６サンプルで行い、その平均値を評価に用いた。結果を表９及び図２０に示す。表９に示すとおり、シルクフィブロインに比べて人工フィブロインは水の接触角が大きく、疎水性が高いことが確認された。図２０中、シルクフィブロインの結果を左に示し、配列番号６２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１７）を有する人工フィブロインの結果を右に示し、配列番号７２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２７）を有する人工フィブロインの結果を中央に示す。
Figure 2022162038000127
本開示によれば、ペプチド骨格を有する高分子材料であって、柔軟性に優れる成形体を製造可能な合成高分子を提供できる。本開示によればまた、上述の合成高分子を含有する成形材料及び成形体を提供できる。
本開示によれば、第一のセグメントに対して導入する第二のセグメントの選択によって、合成高分子の物性及び機能を調整することが可能である。ひいては、上記合成高分子を用いて調製される成形体の物性及び機能を調整し得る。
２…金型、４…上側ピン、６…下側ピン、８ａ…サンプル、８ｂ…成形体、１０…加圧成形機。

Claims (29)

  1. ポリペプチド骨格を含む第一のセグメントと、
    前記第一のセグメントに結合する一又は複数の第二のセグメントと、を有し、
    前記第二のセグメントが前記ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を含む、合成高分子。
  2. 前記ポリペプチド骨格が疎水性ポリペプチド骨格である、請求項１に記載の合成高分子。
  3. 前記疎水性ポリペプチド骨格の平均ハイドロパシー・インデックスが０．２２以上である、請求項２に記載の合成高分子。
  4. 前記第二のセグメントの分子量が、前記第一のセグメントの分子量を１００としたときに１～７０の範囲内の値である、請求項１～３のいずれか一項に記載の合成高分子。
  5. 前記第二のセグメントが、ポリエーテル、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリオール、ポリオレフィン、ポリアセタール、ポリケタール、ポリ（メタ）アクリレート、シリコーン、ポリウレタン、ポリアルキレンイミン、フェノール樹脂、尿素樹脂、メラミン樹脂、及び多糖類からなる群より選択される少なくとも一種に由来する骨格を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の合成高分子。
  6. 前記第二のセグメントが、ポリエーテル基、ポリエステル基、ポリカーボネート基、ポリアミド基、ポリオール基、及び、修飾多糖基からなる群より選択される少なくとも一種を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の合成高分子。
  7. 前記第一のセグメントを複数有し、
    前記第二のセグメントの一部が２以上の前記第一のセグメントと結合してネットワーク構造を形成している、請求項１～６のいずれか一項に記載の合成高分子。
  8. 前記第一のセグメントを複数有し、
    前記第一のセグメントと第二のセグメントとが交互に結合している、請求項１～６のいずれか一項に記載の合成高分子。
  9. 前記第二のセグメントが複数の前記分子団を含み、複数の前記分子団が互いに連結している、請求項１～８のいずれか一項に記載の合成高分子。
  10. 第二のセグメントがリンカーを更に含み、
    前記リンカーを介して前記分子団と前記ポリペプチドとが結合している、請求項１～９のいずれか一項に記載の合成高分子。
  11. 前記リンカーが、下記式（１）で表される構造単位、下記一般式（２ａ）～（６）で表される構造単位、下記式（７）で表される構造単位、下記一般式（８ａ）～（９）で表される構造単位、下記一般式（１０）～（１１ｂ）で表される構造単位、及び下記一般式（１３）～（１６）で表される構造単位からなる群より選択される少なくとも一種を含み、
    Figure 2022162038000128
    Figure 2022162038000129
    Figure 2022162038000130
    Figure 2022162038000131
    Figure 2022162038000132
    Figure 2022162038000133
    Figure 2022162038000134
    Figure 2022162038000135
    Figure 2022162038000136
    Figure 2022162038000137
    Figure 2022162038000138
    Figure 2022162038000139
    Figure 2022162038000140
    Figure 2022162038000141
    Figure 2022162038000142
    Figure 2022162038000143
    Figure 2022162038000144
    Figure 2022162038000145
    Figure 2022162038000146
    前記一般式（２ａ）、（２ｂ）、（３ａ）、（４ａ）、（４ｂ）、（５）、（６）、（１０）、（１１ａ）及び（１１ｂ）において、Ｙは、互いに独立に、酸素原子、硫黄原子、又はＮＲ１を示し、Ｒ１は、水素、炭化水素基、芳香族基、カルボニル基、及びスルホニル基を示し、
    前記一般式（２ａ）、（２ｂ）、（３ａ）、（４ａ）、（４ｂ）、（８ａ）、（８ｂ）、（９）、（１０）、（１１ａ）及び（１１ｂ）において、Ｒは、互いに独立に、水素、炭化水素基、及び芳香族基を示す、請求項１０に記載の合成高分子。
  12. 前記リンカーが、前記式（１）で表される構造単位、並びに、前記一般式（２ａ）、（３ａ）、（４ａ）、（４ｂ）及び（１０）で表される構造単位からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１１に記載の合成高分子。
  13. 前記ポリペプチド骨格が人工タンパク質に由来する骨格を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の合成高分子。
  14. 前記人工タンパク質が人工構造タンパク質を含む、請求項１３に記載の合成高分子。
  15. 前記人工構造タンパク質が人工フィブロインを含む、請求項１４に記載の合成高分子。
  16. 前記人工フィブロインが人工改変クモ糸フィブロインを含む、請求項１５に記載の合成高分子。
  17. 請求項１～１６のいずれか一項に記載の合成高分子を含有する、成形材料。
  18. 請求項１～１６のいずれか一項に記載の合成高分子を含有する、成形体。
  19. ポリペプチド骨格を含む化合物と、下記一般式（１Ａ）～（１６Ａ）で表される化合物の少なくとも１種とを反応させることによって合成高分子を得る工程を備え、
    前記ポリペプチド骨格は、チオール基、アミノ基、ヒドロキシ基、グアニジノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、インドール基、アミド基、アジド基、及びアルキニル基からなる群より選択される少なくとも一種を有し、
    Figure 2022162038000147
    Figure 2022162038000148
    Figure 2022162038000149
    Figure 2022162038000150
    Figure 2022162038000151
    Figure 2022162038000152
    Figure 2022162038000153
    Figure 2022162038000154
    Figure 2022162038000155
    Figure 2022162038000156
    Figure 2022162038000157
    Figure 2022162038000158
    Figure 2022162038000159
    Figure 2022162038000160
    Figure 2022162038000161
    Figure 2022162038000162
    Figure 2022162038000163
    Figure 2022162038000164
    Figure 2022162038000165
    Figure 2022162038000166
    前記一般式（１Ａ）、（２Ａ）、（２Ｂ）、（３Ａ）、（３Ｂ）、（４Ａ）、（５Ａ）、（６Ａ）、（７Ａ）、（８Ａ）、（８Ｂ）、（９Ａ）、（１０Ａ）、（１１Ａ）、（１１Ｂ）及び（１２Ａ）においてＲ２は、前記ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を示し、
    前記一般式（２Ａ）、（２Ｂ）、（３Ａ）、（３Ｂ）、（４Ａ）、（５Ａ）、（６Ａ）、（８Ｂ）、（９Ａ）、（１０Ａ）、（１１Ａ）及び（１１Ｂ）において、Ｙは、互いに独立に、酸素原子、硫黄原子、又はＮＲ１を示し、Ｒ１は、水素、炭化水素基、芳香族基、カルボニル基、及びスルホニル基を示し、
    前記一般式（２Ａ）、（２Ｂ）、（３Ａ）、（３Ｂ）、（４Ａ）、（５Ａ）、（８Ａ）、（８Ｂ）、（９Ａ）、（１０Ａ）、（１１Ａ）及び（１１Ｂ）においてＲは、互いに独立に、水素、炭化水素基、及び芳香族基を示し、
    前記一般式（６Ａ）及び（１２Ａ）において、Ｚはハロゲン原子、スルホン酸エステル基、及び含フッ素カルボン酸エステル基を示し、
    前記一般式（１５Ａ）において、Ｘはハロゲン原子を示す、合成高分子の製造方法。
  20. ポリペプチド骨格を含む化合物と、前記一般式（１Ａ）～（１２Ａ）又は（１４Ａ）で表される化合物との反応がマイケル付加反応である、請求項１９に記載の製造方法。
  21. 前記ポリペプチド骨格が疎水性ポリペプチド骨格である、請求項２０に記載の製造方法。
  22. 前記疎水性ポリペプチド骨格の平均ハイドロパシー・インデックスが０．２２以上である、請求項２１に記載の製造方法。
  23. 前記ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団の分子量が、前記ポリペプチド骨格の分子量を１００としたときに１～７０の範囲内の値である、請求項１９～２２のいずれか一項に記載の製造方法。
  24. 前記ポリペプチド骨格を有する化合物が人工タンパク質を含む、請求項１９～２３のいずれか一項に記載の製造方法。
  25. 前記人工タンパク質が人工構造タンパク質を含む、請求項２４に記載の製造方法。
  26. ポリペプチド骨格を含む化合物と、前記ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を含む化合物と、下記一般式（２－１Ａ）～（２－１６Ａ）で表される構造単位からなる群より選択される少なくも一種の構造単位を２つ以上有する化合物と、を反応させることによって合成高分子を得る工程を備え、
    前記ポリペプチド骨格は、チオール基、アミノ基、ヒドロキシ基、グアニジノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、インドール基、アミド基、アジド基、及びアルキニル基からなる群より選択される少なくとも一種を有し、
    前記分子団を含む化合物は、チオール基、アミノ基、ヒドロキシ基、グアニジノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、インドール基、アミド基、アジド基、及びアルキニル基からなる群より選択される少なくとも一種を有し、
    Figure 2022162038000167
    Figure 2022162038000168
    Figure 2022162038000169
    Figure 2022162038000170
    Figure 2022162038000171
    Figure 2022162038000172
    Figure 2022162038000173
    Figure 2022162038000174
    Figure 2022162038000175
    Figure 2022162038000176
    Figure 2022162038000177
    Figure 2022162038000178
    Figure 2022162038000179
    Figure 2022162038000180
    Figure 2022162038000181
    Figure 2022162038000182
    Figure 2022162038000183
    Figure 2022162038000184
    Figure 2022162038000185
    Figure 2022162038000186
    前記一般式（２－２Ａ）、（２－２Ｂ）、（２－３Ａ）、（２－３Ｂ）、（２－４Ａ）、（２－５Ａ）、（２－６Ａ）、（２－１０Ａ）、（２－１１Ａ）、及び（２－１１Ｂ）において、Ｙは、互いに独立に、酸素原子、硫黄原子、又はＮＲ１を示し、Ｒ１は、水素、炭化水素基、芳香族基、カルボニル基、及びスルホニル基を示し、
    前記一般式（２－２Ａ）、（２－２Ｂ）、（２－３Ａ）、（２－３Ｂ）、（２－４Ａ）、（２－８Ａ）、（２－８Ｂ）、（２－９Ａ）、（２－１０Ａ）、（２－１１Ａ）、（２－１１Ｂ）、及び（２－１２Ａ）においてＲは、互いに独立に、水素、炭化水素基、及び芳香族基を示し、
    前記一般式（２－６Ａ）及び（２－１２Ａ）において、Ｚはハロゲン原子、スルホン酸エステル基、及び含フッ素カルボン酸エステル基を示し、
    前記一般式（２－１５Ａ）において、Ｘはハロゲン原子を示す、合成高分子の製造方法。
  27. 前記ポリペプチド骨格が疎水性ポリペプチド骨格である、請求項２６に記載の製造方法。
  28. 前記疎水性ポリペプチド骨格の平均ハイドロパシー・インデックスが０．２２以上である、請求項２７に記載の製造方法。
  29. 前記ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団の分子量が、前記ポリペプチド骨格の分子量を１００としたときに１～７０の範囲内の値である、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の製造方法。
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