WO2019146765A1 - タンパク質成形体用素材、タンパク質成形体、及びタンパク質成形体の製造方法 - Google Patents

タンパク質成形体用素材、タンパク質成形体、及びタンパク質成形体の製造方法 Download PDF

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acid sequence
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本章 渡邉
純一 野場
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Ｓｐｉｂｅｒ株式会社
テクノハマ株式会社
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    • B29C43/02—Compression moulding, i.e. applying external pressure to flow the moulding material; Apparatus therefor of articles of definite length, i.e. discrete articles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B29—WORKING OF PLASTICS; WORKING OF SUBSTANCES IN A PLASTIC STATE IN GENERAL
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    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L89/00—Compositions of proteins; Compositions of derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to a material for a protein compact, a protein compact, and a method for producing a protein compact.
  • a molded article of a composition containing a polypeptide is known. These moldings can be obtained by heating and pressing a powder containing natural spider silk protein and / or a polypeptide derived from natural spider silk protein in a mold.
  • the molded body described in Patent Document 2 has high strength (bending stress 67.1 MPa).
  • the powder handling property is not good as a material for a molded body.
  • powder is easy to scatter. Loss is likely to occur when transporting or weighing powder.
  • the powder may wear the part. It takes time and effort to clean the powder that got into that part. Handling of the material is important in forming a protein compact.
  • the present invention provides a material for a protein compact, a protein compact, and a method for producing a protein compact, which can improve the handling property.
  • the present invention provides the following [1] to [11].
  • [1] A film-like material for protein moldings, which contains a protein.
  • [2] The material for a formed protein according to [1], wherein the protein is a structural protein.
  • [3] The material for a formed protein according to [2], wherein the structural protein is spider silk fibroin.
  • [4] A protein molded body, wherein a plurality of the material for a protein molded body according to any one of [1] to [3] are laminated and fused to each other.
  • a method for producing a protein molded body comprising the steps of: laminating a plurality of the material for a protein molded body according to [1] to obtain a laminate; and heating and pressing the laminate.
  • a method for producing a protein molded body comprising the steps of: laminating a plurality of materials for a protein molded body according to [2] to obtain a laminate; and heating and pressing the laminate.
  • a method for producing a protein molded body comprising the steps of: laminating a plurality of the material for a protein molded body according to [3] to obtain a laminate; and heating and pressing the laminate.
  • the handling property is improved as compared to the case where powder is used as the material.
  • bending physical properties for example, bending stress, toughness, etc. are improved as compared to conventional protein compacts.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view schematically showing a pressure molding machine.
  • 2 (a) shows the state before the introduction of the composition
  • FIG. 2 (b) shows the state immediately after the introduction of the composition
  • FIG. 2 (c) shows the pressure molding machine in the state of heating and pressurizing the composition.
  • FIG. 3 is a photograph of a film-like material for a protein compact according to an example.
  • FIG. 4 is a photograph of a formed protein according to an example and a formed protein according to a comparative example.
  • FIG. 5 is a figure which shows the result of the three-point bending test in a comparative example and an Example.
  • FIG. 6 is a view showing the results of water resistance evaluation in Comparative Examples and Examples.
  • FIG. 7 is a view showing stress-strain characteristics in the comparative example and the example.
  • the material for a protein molding according to the present embodiment contains a protein and is in the form of a film.
  • the protein compact according to the present embodiment can be formed using this material for protein compacts. Specifically, a plurality of film-like materials for a protein compact are laminated and fused to each other to form a protein compact.
  • the protein in this embodiment is preferably a structural protein.
  • a structural protein is a protein having a role in constructing a biological structure, and is different from functional proteins such as enzymes, hormones and antibodies.
  • structural proteins include naturally occurring structural proteins such as naturally occurring fibroin, collagen, resilin, elastin and keratin.
  • Naturally occurring fibroins are fibroins produced by insects and arachnids.
  • the structural protein according to the present embodiment is preferably spider silk fibroin.
  • Spider silk fibroin includes natural spider silk fibroin and modified fibroin derived from natural spider silk fibroin.
  • Natural spider silk fibroin includes, for example, spider silk proteins produced by spiders. "Modified fibroin” means fibroin having an amino acid sequence different from naturally occurring fibroin.
  • fibroin produced by insects include Bombyx mori (Bombyx mori), Quwaco (Bombyx mandarina), pemphigus (Antheraea yamamai), moth (Anteraea pernyi), moth (Eriogyna pyretorum), moth (Pilosamia Cynthia ricini) ), Silkworms produced by silkworms such as silkworms (Samia cynthia), cricketworms (Caligura japonica), tusser moths (Antheraea mylitta), and muga moths (Antheraea assama), hornets ejected by the larvae of the hornets (Vespa simillima xanthoptera) Silk protein is mentioned.
  • insect-produced fibroin include, for example, silkworm fibroin L chain (GenBank accession No. M76430 (base sequence), AAA27840.1 (amino acid sequence)).
  • Spider silk proteins are, according to their source organs, large tenacious spider proteins (major ampullate spider protein (MaSp), high elongating fissure-like spider proteins (minor ampullate spider protein (MiSp), It has been designated as a flagelliform (Flag), a tubular (tubuliform), an aggregate, a grapevine (aciniform) and a pearlike spider silk protein.
  • the fibroins produced by the spiders include, for example, spiders belonging to the genus Araneus such as spider spiders, spider spiders, spider spiders, blue spider spiders, and spider spiders, spider spiders (genus Neoscona) such as spider spiders, spider spiders, spider spiders and spiders , Spiders belonging to the genus Pronus (Pronus), such as Torino Fundamas, spiders belonging to the genus Torino Fundama (Cyrtarachne) such as Torino Fundamas, and Otorino Fundames, such as spiders such as Togegumo and Tibusegumo Spiders belonging to the genus Gasteracantha, spiders belonging to the genus Ordgarius, such as the spiders belonging to the genus Gasteracantha and those belonging to the genus Ordgarius A spider belonging to the genus Angiope (Argiope), a spider belonging to the genus Angiope, a spider
  • fibroin produced by spiders include, for example, fibroin-3 (adf-3) [derived from Araneus diadematus] (GenBank accession number AAC47010 (amino acid sequence), U47855 (base sequence)), fibroin- 4 (adf-4) [derived from Araneus diadematus] (GenBank accession number AAC47011 (amino acid sequence), U47856 (base sequence)), dragline silk protein spidroin 1 (derived from Nephila clavipes) (genbank accession number AAC 04504 (amino acid sequence), U37520 (base sequence)), major angu11ate spidroin 1 [La rodectus hesperus] (GenBank Accession No.
  • ABR68856 amino acid sequence
  • EF 595246 base sequence
  • dragline silk protein spidroin 2 [from Nephila clavata] (GenBank Accession No. AAL 32472 (amino acid sequence), AF 44 1 245 (base sequence)), major anpullate spidroin 1 [from Euprosthenops australis] (GenBank accession numbers CAJ00428 (amino acid sequence), AJ 973 155 (base sequence)), and major ampullate spidroin 2 [Euprosthenops australis] (GenB nk accession number CAM 32249.1 (amino acid sequence), AM 490169 (base sequence)), minor ampullate silk protein 1 [Nephila clavipes] (GenBank accession number AAC 14589.
  • Naturally derived fibroin further include fibroin whose sequence information is registered in NCBI GenBank.
  • sequence information is registered in NCBI GenBank.
  • spidroin, ampullate, fibroin, “silk and polypeptide”, or “silk and protein” are described as keywords among sequences including INV as DIVISION among sequence information registered in NCBI GenBank.
  • the sequence can be confirmed by extracting a specified product string from CDS, and a described sequence of a specific string from SOURCE to TISSUE TYPE.
  • the structural protein may be a polypeptide derived from the above-mentioned naturally occurring structural protein, ie a recombinant polypeptide.
  • recombinant fibroin is produced by several heterologous protein production systems, and transgenic goats, transgenic silkworms, or recombinant plants or mammalian cells are used as a method for producing them.
  • the recombinant fibroin can be obtained, for example, by deleting one or more of the sequences encoding the (A) n motif from the cloned gene sequence of naturally occurring fibroin. Also, for example, it is obtained by designing an amino acid sequence corresponding to the deletion of one or more (A) n motifs from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin, and chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence. It can also be done. In any case, in addition to the modification corresponding to the deletion of the (A) n motif from the amino acid sequence of naturally derived fibroin, one or more amino acid residues are further substituted, deleted, inserted and / or added. The amino acid sequence corresponding to the above may be modified.
  • Substitutions, deletions, insertions and / or additions of amino acid residues can be carried out by methods known to those skilled in the art such as partial directed mutagenesis. Specifically, Nucleic Acid Res. 10, 6487 (1982), Methods in Enzymology, 100, 448 (1983) and the like.
  • the recombinant polypeptide of the large nasogastric silkworm silk protein is, for example, a protein comprising a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m (wherein (A) n The motif indicates an amino acid sequence composed of 4 to 20 amino acid residues, and (A) the number of alanine residues relative to the total number of amino acid residues in n motif is 80% or more.REP is 10 to 200 amino acid residues.
  • the m represents an integer of 8 to 300.
  • a plurality of (A) n motifs may be identical to each other or different from each other.
  • the amino acid sequences may be the same or different. Specifically, a protein comprising the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 12 can be mentioned.
  • a protein comprising a domain sequence represented by Formula 2: [REP2] o (wherein, in Formula 2, o represents an integer of 5 to 300.
  • REP2 is a Gly-X
  • An amino acid sequence consisting of a single Y is shown, and X and Y are any amino acid residues other than Gly, and the plurality of REP2 may be identical amino acid sequences to each other or may be different amino acid sequences.
  • a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 can be mentioned.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 13 corresponds to the repeat portion and motif of a partial sequence of human collagen type 4 (Genbank accession numbers of NCBI: CAA56335.1, GI: 3702452) obtained from the NCBI database.
  • the amino acid sequence (tag sequence and hinge sequence) shown in SEQ ID NO: 5 is added to the N-terminus of the amino acid sequence from residue 301 to residue 540.
  • REP3 As a recombinant polypeptide of resilin, for example, a protein comprising a domain sequence represented by the formula 3: [REP3] p (wherein, in the formula 3, p represents an integer of 4 to 300.
  • REP3 is Ser-1J-1) J shows an amino acid sequence composed of J-Tyr-Gly-U-Pro, wherein J represents an arbitrary amino acid residue, preferably an amino acid residue selected from the group consisting of Asp, Ser and Thr. Is any amino acid residue, preferably an amino acid residue selected from the group consisting of Pro, Ala, Thr and Ser.
  • the plurality of REP3 may have the same amino acid sequence or different amino acid sequences. Good) can be mentioned.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 14 is an amino acid sequence of Resilin (Genbank Accession Nos. NP 611 157, Gl: 24654243 of NCBI), wherein Thr at position 87 is substituted with Ser, and Asn at position 95
  • the amino acid sequence (tag sequence) shown by SEQ ID NO: 17 is added to the N-terminal of the amino acid sequence from the 19th residue to the 321st residue of the sequence obtained by substituting Asp.
  • a protein having an amino acid sequence of Accession Nos. AAC98395 (human), I47076 (sheep), NP786966 (bovine) of Genbank of NCBI can be mentioned.
  • a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15 can be mentioned.
  • the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15 is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 at the N-terminus of the amino acid sequence from residue 121 to residue 390 of the amino acid sequence of accession number AAC 98395 of Genbank of Genbank (tag sequence And hinge arrangement) are added.
  • a recombinant polypeptide of keratin for example, type I keratin of Capra hircus etc. can be mentioned.
  • a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 (the amino acid sequence of Genbank Accession No. ACY30466 of NCBI) can be mentioned.
  • the recombinant polypeptide comprises 90% or more of (i) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 10, or (ii) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 10 It may be a recombinant fibroin comprising an amino acid sequence having the sequence identity of
  • a recombinant fibroin comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 10 is described.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is an alternate sequence from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 corresponding to naturally occurring fibroin (corresponding to naturally occurring fibroin) from the N terminal side to the C terminal side A) n motif is deleted and one [(A) n motif-REP] is inserted in front of the C-terminal sequence.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 4 is one in which all GGX in the REP of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2 is replaced with GQX.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 10 inserts two alanine residues at the C-terminal side of each (A) n motif of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 4 and further contains some glutamine (Q) residues. It is one in which a serine (S) residue is substituted and a portion of the amino acid at the N-terminal side is deleted so as to be approximately the same as the molecular weight of SEQ ID NO: 4.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 3 is one in which all GGX in the REP of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1 is replaced with GQX.
  • a recombinant fibroin comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 10 is described.
  • the recombinant fibroin contains an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 10.
  • Recombinant fibroin is also a protein comprising a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n Motif-REP] m .
  • the above sequence identity is preferably 95% or more.
  • the above-mentioned recombinant fibroin may contain a tag sequence at either or both of the N-terminus and the C-terminus. This makes it possible to isolate, immobilize, detect and visualize the recombinant fibroin.
  • an affinity tag utilizing specific affinity (binding, affinity) with another molecule can be mentioned.
  • a histidine tag (His tag) can be mentioned as a specific example of an affinity tag.
  • the His tag is a short peptide consisting of 4 to 10 histidine residues, and has the property of specifically binding to a metal ion such as nickel, so that a single peptide of recombinant fibroin by metalating metal chromatography can be obtained. It can be used for separation.
  • the tag sequence for example, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 (amino acid sequence containing His tag) can be mentioned.
  • tag sequences such as glutathione-S-transferase (GST) that specifically binds to glutathione and maltose binding protein (MBP) that specifically binds to maltose can also be used.
  • GST glutathione-S-transferase
  • MBP maltose binding protein
  • epitope tags utilizing antigen-antibody reactions can also be used.
  • a peptide (epitope) showing antigenicity as a tag sequence an antibody against the epitope can be bound.
  • the epitope tag include HA (peptide sequence of hemagglutinin of influenza virus) tag, myc tag, FLAG tag and the like.
  • tag sequence can be separated by a specific protease
  • recombinant fibroin containing the tag sequence (iii) the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11, or (iv) SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11 And a recombinant fibroin comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in
  • the recombinant polypeptide comprises (iii) an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11, or (iv) an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 90 by more than 90%. It may be a recombinant fibroin comprising an amino acid sequence having the sequence identity of
  • amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 6, 7, 8, 9 and 11 are the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 5 (His tag) at the N-terminus of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4 and 10, respectively. (Inclusive) is added.
  • Recombinant fibroin is also a protein comprising a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n Motif-REP] m .
  • the above sequence identity is preferably 95% or more.
  • the structural protein comprises a recombinant polypeptide.
  • a recombinant polypeptide By including a recombinant polypeptide as a structural protein, it is possible to adjust the flexural modulus, flexural strength and hardness of the resulting molded article to desired values.
  • the method for producing the recombinant polypeptide is described in detail below.
  • the recombinant polypeptide of interest is, for example, a host transformed with an expression vector having a gene sequence encoding a structural protein and one or more regulatory sequences operably linked to the gene sequence. It can be produced by expressing a gene.
  • a gene encoding a natural structural protein can be used to produce a gene by amplification and cloning by polymerase chain reaction (PCR) or the like, or by chemical synthesis.
  • the chemical synthesis method of the gene is not particularly limited, and, for example, AKTA oligopilot plus 10/100 (GE Healthcare Japan Co., Ltd.), etc. based on the amino acid sequence information of the structural protein obtained from the NCBI web database etc.
  • the gene can be chemically synthesized by a method of ligating the oligonucleotide synthesized at step S by PCR or the like.
  • a gene encoding a polypeptide having an amino acid sequence consisting of a start codon and a His10 tag at the N-terminus of the above amino acid sequence may be synthesized.
  • the regulatory sequence is a sequence that controls the expression of a recombinant protein in a host (for example, a promoter, an enhancer, a ribosome binding sequence, a transcription termination sequence, etc.), and can be appropriately selected depending on the type of host.
  • a promoter an inducible promoter which functions in a host cell and is capable of inducing expression of a target protein may be used.
  • An inducible promoter is a promoter that can control transcription due to the presence of an inducer (expression inducer), the absence of a repressor molecule, or physical factors such as temperature, osmotic pressure or an increase or decrease in pH value.
  • the type of expression vector can be appropriately selected according to the type of host, such as a plasmid vector, a virus vector, a cosmid vector, a fosmid vector, an artificial chromosome vector and the like.
  • a vector capable of autonomous replication in a host cell or capable of being integrated into the host chromosome and containing a promoter at a position capable of transcribing a gene encoding a target recombinant polypeptide is preferable. Used for
  • any of prokaryotes and eukaryotes such as yeast, filamentous fungi, insect cells, animal cells and plant cells can be suitably used.
  • prokaryote examples include bacteria belonging to the genus Escherichia, Brevibacillus, Serratia, Bacillus, Microbacterium, Microbacterium, Brevibacterium, Corynebacterium and Pseudomonas.
  • vectors for introducing a gene encoding a target recombinant polypeptide include pBTrp2 (manufactured by Boehringer Mannheim), pGEX (manufactured by Pharmacia), pUC18, pBluescript II, pSupex, pET22b, pCold, pUB110, pNCO2 (specifically, JP2002-238569 gazette) etc. can be mentioned.
  • Eukaryotic hosts can include, for example, yeast and filamentous fungi (molds and the like).
  • yeast As a yeast, the yeast which belongs to Saccharomyces genus, Pichia genus, Schizosaccharomyces genus etc. can be mentioned, for example.
  • filamentous fungi include filamentous fungi belonging to the genus Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, and the like.
  • vectors examples include YEP13 (ATCC 37115), YEp24 (ATCC 37051) and the like.
  • any method of introducing DNA into the host cell can be used.
  • a method using calcium ion [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)]
  • electroporation method electroporation method
  • spheroplast method protoplast method
  • lithium acetate method competent method and the like.
  • the target recombinant polypeptide can be obtained, for example, by culturing a host transformed with the expression vector according to the present invention in a culture medium, generating and accumulating the protein in the culture medium, and collecting it from the culture medium. It can be manufactured.
  • the method of culturing the host according to the present invention in a culture medium can be carried out according to a method usually used for culturing the host.
  • the host according to the present invention is a prokaryote such as E. coli or a eukaryote such as yeast, it contains, as a culture medium for the host according to the present invention, carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts and the like that can be used by the host.
  • a culture medium for the host according to the present invention carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts and the like that can be used by the host.
  • a natural medium or a synthetic medium may be used.
  • the carbon source may be any as long as the above-mentioned transformed microorganism can assimilate, for example, glucose, fructose, sucrose and molasses containing them, carbohydrates such as starch and starch hydrolysate, acetic acid and propionic acid etc. Organic acids and alcohols such as ethanol and propanol can be used.
  • Nitrogen sources include, for example, ammonium, ammonium salts of inorganic acids or organic acids such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate and ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, Casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells and digests thereof can be used.
  • inorganic acids or organic acids such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate and ammonium phosphate
  • other nitrogen-containing compounds such as peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, Casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells and digests thereof can be used.
  • potassium phosphate, potassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate and calcium carbonate can be used.
  • the culture of a prokaryote such as E. coli or a eukaryote such as yeast can be performed under aerobic conditions such as shake culture or submerged aeration culture, for example.
  • the culture temperature is, for example, 15 to 40 ° C.
  • the culture time is usually 16 hours to 7 days.
  • the pH of the culture medium during culture is preferably maintained at 3.0 to 9.0. Adjustment of the pH of the culture medium can be carried out using an inorganic acid, an organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia and the like.
  • antibiotics such as ampicillin and tetracycline may be added to the culture medium as needed during culture.
  • an inducer may be added to the medium as needed.
  • indole acrylic An acid or the like may be added to the medium.
  • the recombinant polypeptide of the present invention can be isolated and purified by methods commonly used for protein isolation and purification. For example, when the recombinant polypeptide is expressed in a dissolved state in cells, after completion of culture, host cells are recovered by centrifugation, suspended in an aqueous buffer, and then sonicated, French press The host cells are disrupted using a Manton Gaulin homogenizer, Dynomill, etc. to obtain a cell-free extract.
  • the host cell when the recombinant polypeptide forms an insoluble form in cells and is expressed, the host cell is similarly recovered and then disrupted and centrifuged to obtain an insoluble form of the recombinant polypeptide as a precipitate fraction. Recover.
  • the insoluble form of the recovered recombinant polypeptide can be solubilized with a protein denaturant. After the operation, a purified preparation of the recombinant polypeptide can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the recombinant polypeptide When the recombinant polypeptide is secreted extracellularly, the recombinant polypeptide can be recovered from the culture supernatant. That is, a culture supernatant is obtained by treating the culture by a method such as centrifugation, and a purified preparation can be obtained from the culture supernatant by using the same isolation and purification method as described above.
  • the material for a protein compact may contain a protein. It is preferable that the material for a protein shaped body contains a structural protein as a main component.
  • the material for a protein molded body may be only a structural protein, or may contain a structural protein and optional additional components (eg, plasticizers, colorants, fillers, synthetic resins, etc.).
  • the content of the additive component is preferably 50% by mass or less of the total amount of structural proteins.
  • the main component means that the content is 50% by mass or more (preferably 80% by mass or more, more preferably 90% by mass or more).
  • the film-like material for a protein compact has a predetermined thickness.
  • the thickness of the material for protein molding may be, for example, 3 to 100 ⁇ m.
  • the thickness of the material for a protein compact is preferably 15 to 30 ⁇ m.
  • the protein compact contains protein as a main component. It is preferable that a protein molded body obtained by laminating a plurality of sheets of the protein forming material and fusing them together contains a structural protein as a main component.
  • the interface between a plurality of materials for protein compacts may disappear after being subjected to heat and pressure, or may remain after being subjected to heat and pressure.
  • the material for a protein forming material made into a film from protein powder is laminated and fused to each other, the bending property (for example, bending stress or toughness) of the forming material is improved.
  • the material for a protein compact and the method for producing the protein compact are described in detail below.
  • powder of the structural protein is dissolved in dimethylsulfoxide (DMSO) solvent to form a dope solution, which is cast on a substrate surface, dried and / or desolvated.
  • the viscosity of the dope solution is preferably 15 to 80 cP (centipoise) from the viewpoint of film forming properties.
  • the solvent of the dope solution may be a mixed solution of water and ethanol.
  • the substrate used in the cast molding is preferably a PET film or a release film in which a silicone compound is immobilized on the surface of the PET film.
  • These substrates are stable in DMSO solvent, and have the advantages of being able to stably cast the dope solution and to easily separate the membrane after molding. Glass or metal may be used as the substrate.
  • Drying / desolvation may be any of vacuum drying, hot air drying, air drying and immersion in liquid.
  • the liquid used for immersion in the liquid may be water, lower alcohol having 1 to 5 carbon atoms such as methanol, ethanol, 2-propanol and the like.
  • Immersion in liquid may be carried out by immersing the cast film in a mixed liquid of water and alcohol to remove the solvent.
  • the temperature of the solvent removal solution (coagulation solution) is preferably 0 to 90.degree.
  • a material for a protein molded body can be produced.
  • the cutting is preferably performed by using a mold adapted to the required film size, but it may be manually cut or any other commonly used cutting method.
  • the film-shaped molded material may be immersed in methanol, acetonitrile, ethanol, water, or acetone before the production of the molded product (before laminating a plurality of film-shaped molded materials).
  • the immersion time is preferably 1 to 200 hours, more preferably 80 to 120 hours.
  • FIG. 1 is a schematic cross-sectional view of a pressure molding machine that can be used to produce a protein compact.
  • the press molding machine 10 shown in FIG. 1 is provided with a mold 2 which can be heated by forming a through hole, and an upper pin 4 and a lower pin 6 which can move up and down in the through hole of the mold.
  • a plurality of sheets of the above-mentioned material for a protein molded body are introduced in a space formed by inserting the upper pin 4 or the lower pin 6 into the mold 2, and the upper side is heated while heating the mold 2.
  • a protein compact can be obtained by compressing the material for protein compact with the pin 4 and the lower pin 6.
  • FIG. 2 shows a process chart for obtaining a protein compact, wherein (a) is before introduction of the material for protein compact, (b) is immediately after introduction of the material for protein compact, (c) is the material for protein compact It is a schematic cross section of a pressure molding machine in a state of heating and pressing.
  • the material for protein forming body 7 is introduced into the through hole to obtain a laminate 8a.
  • the number of sheets of the protein forming material 7 may be two or more. Depending on the size of the target protein compact, the number of the material for protein compact 7 can be adjusted. As shown in FIG.
  • the upper pin 4 is inserted into the through hole of the mold 2 and lowered, heating of the mold 2 is started, and the laminate 8a is heated and pressurized in the through hole.
  • the upper pin 4 is lowered to a predetermined pressing force, and heating and pressing are continued until the material for the protein forming material reaches a predetermined temperature in the state shown in FIG.
  • the composition 8b is obtained. Thereafter, the temperature of the mold 2 is decreased using a cooler (eg, spot cooler), and when the composition 8b reaches a predetermined temperature, the upper pin 4 or the lower pin 6 is removed from the mold 2 and the contents Is removed to obtain a protein compact.
  • the pressurization may be performed by lowering the upper pin 4 with the lower pin 6 fixed, but both lowering of the upper pin 4 and raising of the lower pin 6 may be performed.
  • a step of forming a film of a structural protein for example, structural protein powder
  • a raw material for a protein molded body for example, structural protein powder
  • laminating a plurality of raw materials for protein molded body And heating and pressing the laminate to fuse the protein forming material, and cooling the fused material.
  • the heating in the heating and pressurizing step is preferably performed at 80 to 250 ° C., more preferably 100 to 180 ° C., and still more preferably 130 to 150 ° C.
  • the pressurization is preferably performed at 5 kN or more, more preferably 10 kN or more, and still more preferably 20 kN or more.
  • the time for which the treatment is continued under the condition is preferably 0 to 100 minutes, more preferably 1 to 50 minutes, and still more preferably 5 to 10 minutes.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 12 is a region of 20 domain sequences present in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 9 (provided that several amino acid residues at the C-terminal side of the region are substituted).
  • An amino acid sequence in which a His tag is added to the C terminus of a sequence obtained by repeating 4 times is added an amino acid sequence (including a His tag) shown in SEQ ID NO: 5 at the N terminus.
  • a nucleic acid encoding the designed modified spider silk fibroin was synthesized.
  • the NdeI site at the 5 'end and the EcoRI site downstream of the stop codon were added to the nucleic acid.
  • This nucleic acid was cloned into a cloning vector (pUC118). Thereafter, the same nucleic acid was digested with NdeI and EcoRI, cut out, and then recombined into a protein expression vector pET-22b (+) to obtain an expression vector.
  • E. coli BLR (DE3) was transformed with the obtained pET-22b (+) expression vector.
  • the transformed E. coli was cultured in 2 mL of LB medium containing ampicillin for 15 hours.
  • the culture solution was added to 100 mL of a seed culture medium (Table 1) containing ampicillin such that the OD600 was 0.005.
  • the culture solution temperature was maintained at 30 ° C., and flask culture was performed until the OD 600 reached 5 (about 15 hours) to obtain a seed culture solution.
  • the seed culture solution was added to a jar fermenter to which 500 ml of a production medium (Table 2 below) was added so that the OD 600 was 0.05.
  • the temperature of the culture solution was maintained at 37 ° C., and the culture was controlled at a constant pH of 6.9. Also, the dissolved oxygen concentration in the culture solution was maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
  • the feed solution (glucose 455 g / 1 L, Yeast Extract 120 g / 1 L) was added at a rate of 1 mL / min.
  • the temperature of the culture solution was maintained at 37 ° C., and the culture was controlled at a constant pH of 6.9.
  • the culture was performed for 20 hours while maintaining the dissolved oxygen concentration in the culture solution at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
  • 1 M isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) was added to the culture solution to a final concentration of 1 mM to induce expression of the target altered fibroin. Twenty hours after the addition of IPTG, the culture solution was centrifuged to recover the cells.
  • SDS-PAGE is performed using cells prepared from the culture solution before IPTG addition and after IPTG addition, and the appearance of a band of a size corresponding to the target modified fibroin depending on IPTG addition allows the target modified spider silk The expression of fibroin was confirmed.
  • the precipitate after washing is suspended in 8 M guanidine buffer (8 M guanidine hydrochloride, 10 mM sodium dihydrogen phosphate, 20 mM NaCl, 1 mM Tris-HCl, pH 7.0) to a concentration of 100 mg / mL, 60 ° C. The solution was stirred for 30 minutes and dissolved. After dissolution, dialysis was performed with water using a dialysis tube (cellulose tube 36/32 manufactured by Sanko Pure Chemical Industries, Ltd.). White aggregated protein obtained after dialysis was recovered by centrifugation. Water was removed from the collected aggregated protein with a lyophilizer to obtain a lyophilized powder (structural protein powder) of the target modified fibroin.
  • 8 M guanidine buffer 8 M guanidine hydrochloride, 10 mM sodium dihydrogen phosphate, 20 mM NaCl, 1 mM Tris-HCl, pH 7.0
  • the solution was stirred for 30 minutes and dissolved.
  • dialysis
  • the degree of purification of the target modified spider silk fibroin in the obtained lyophilized powder was confirmed by image analysis of the result of polyacrylamide gel electrophoresis of the powder using Totallab (nonlinear dynamics ltd.). As a result, all modified spider silk fibroins had a purity of about 85%.
  • the structural protein powder obtained above was dissolved in a DMSO solvent at a concentration of 5.98% by mass to obtain a dope solution. Specifically, after dissolving the structural protein powder for 3 hours using a shaker, dust and bubbles were removed to obtain a dope solution. The viscosity of the dope solution was 23.5 cP (centipoise).
  • a release film (made by Mitsui Chemicals Tosoh Co., Ltd., product number "SP-PET-01-75-BU") in which a silicone compound is immobilized on the surface of a PET film having a thickness of 75 ⁇ m is used as a substrate.
  • the dope solution was cast using a micrometer film applicator 150 mm manufactured by MTI Corporation to prepare a wet film.
  • the wet film was allowed to stand at 60 ° C. for 16 hours, then allowed to stand in the vacuum dryer for another 16 hours and dried.
  • the structural protein film was then peeled from the substrate.
  • FIG. 3 shows the produced material for a protein compact.
  • the material for protein molded body is simply referred to as a material for molded body.
  • the material for moldings thus produced was used for production of the protein moldings of Examples 1 to 3. Further, the material for a molded body thus produced was dipped in methanol for 96 hours and then dried, and used for producing the protein molded bodies of Examples 4 to 7.
  • the material for a molded body obtained above is piled up as a sample in a total number of 1.35 g to obtain a sample, and the mold 2 of the pressure molding machine 10 shown in FIG. It has the rectangular through-hole of 35 mm x 15 mm.) It introduced in the through-hole of. Thereafter, heating of the mold 2 is started, and the upper pin 4 and the lower pin 6 are inserted into the through holes using a hand press machine (NT-100H-V09 manufactured by NPa System Co., Ltd.). Was pressurized. Under the present circumstances, it controlled so that the pressurization conditions of a sample might be 30 Mpa. When the temperature of the sample reached 130 ° C. in Examples 1-4, 150 ° C.
  • Example 7 shows the pressure and temperature in Examples 5-6, and 170 ° C. in Example 7, the pressure and temperature were maintained for 5 minutes. After that, the heating is stopped and it is cooled by a spot cooler (TS-25EP-1 made by TRUSCO NAKAYAMA CO., LTD.), And taken out when the temperature of the sample reaches 50 ° C. I got FIG. 4 (shown above of the two) shows the protein compact made as Example 1.
  • the conditions of Examples 1 to 3 are no immersion of the material for a molded body in methanol, and a molding temperature of 130 ° C.
  • the conditions of Example 4 are immersion of the material for a molded body in methanol, and a molding temperature of 130 ° C.
  • the conditions of Examples 5 to 6 are immersion of the material for a molded body in methanol, and a molding temperature of 150.degree.
  • the conditions of Example 7 are immersion of the material for a molded body in methanol, and the molding temperature is 170.degree.
  • FIG. 4 shows a protein compact prepared as a comparative example. That is, in the comparative example, the structural protein powder was heated and pressed to obtain a protein compact.
  • the structural protein powder may be scattered around the mold and may enter the movable part of the equipment. Therefore, in the case of repeated molding, it is necessary to take time and effort to remove the powder each time. In addition, in order to uniformly apply pressure to the sample at the time of molding, it was necessary to take care so that the thickness becomes uniform when introducing the structural protein powder into the through holes of the mold.
  • Example 1 (Other evaluation) The moldings of Example 1 and Comparative Example were placed on a matrix with a grid pattern, and the transparency was visually evaluated. As shown in FIG. 4, in Example 1, the grid pattern was clearly visible, while in the comparative example, the grid pattern was less visible than in Example 1. It was confirmed that Example 1 had higher transparency.
  • the handling property is improved as compared to the case where powder is used as the material.
  • bending physical properties for example, bending stress, toughness, etc. are improved as compared to conventional protein compacts.

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Abstract

タンパク質を含む、フィルム状のタンパク質成形体用素材。

Description

タンパク質成形体用素材、タンパク質成形体、及びタンパク質成形体の製造方法
　本発明は、タンパク質成形体用素材、タンパク質成形体、及びタンパク質成形体の製造方法に関する。
　特許文献１，２に記載されるように、ポリペプチドを含む組成物のモールド成形体が知られている。これらの成形体は、天然クモ糸タンパク質及び／又は天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドを含む粉末を金型内で加熱加圧することによって得られる。たとえば、特許文献２に記載の成形体は、高強度（曲げ応力６７．１ＭＰａ）を有する。
国際公開第２０１７／０４７５０３号 国際公開第２０１７／０４７５０４号
　粉末を金型に投入して成形する方法では、粉末のハンドリング性は、成形体用の素材として良いとは言えない。たとえば、粉末は飛散しやすい。粉末を運搬したり計量したりする際、ロスが発生しやすい。また設備の可動部（または摺動部）の隙間に粉末が入り込んだ場合には、粉末がその部分を摩耗させる恐れがある。その部分に入り込んだ粉末を掃除するには、手間を要する。タンパク質成形体を形成するにあたり、素材のハンドリング性は重要である。
　本発明は、ハンドリング性を向上させることができるタンパク質成形体用素材、タンパク質成形体、及びタンパク質成形体の製造方法を提供する。
　本発明は、以下の［１］～［１１］を提供する。
［１］　タンパク質を含む、フィルム状のタンパク質成形体用素材。
［２］　前記タンパク質が構造タンパク質である、［１］に記載のタンパク質成形体用素材。
［３］　上記構造タンパク質がクモ糸フィブロインである、［２］に記載のタンパク質成形体用素材。
［４］　［１］～［３］のいずれか一項に記載のタンパク質成形体用素材が複数枚積層され互いに融着されてなるタンパク質成形体。
［５］　［１］に記載のタンパク質成形体用素材を複数枚積層して積層体を得る工程と、上記積層体を加熱及び加圧する工程と、を含む、タンパク質成形体の製造方法。
［６］　［２］に記載のタンパク質成形体用素材を複数枚積層して積層体を得る工程と、上記積層体を加熱及び加圧する工程と、を含む、タンパク質成形体の製造方法。
［７］　［３］に記載のタンパク質成形体用素材を複数枚積層して積層体を得る工程と、上記積層体を加熱及び加圧する工程と、を含む、タンパク質成形体の製造方法。
［８］　上記積層体を得る工程に先立って、上記タンパク質成形体用素材をメタノールに浸す工程を更に含む、［５］～［７］のいずれかに記載のタンパク質成形体の製造方法。
［９］　タンパク質を主成分として含むタンパク質成形体であって、タフネスが８７ｋＪ／ｍ３以上５５４．９７ｋＪ／ｍ３以下である、タンパク質成形体。
［１０］　上記タンパク質が構造タンパク質である、［９］に記載のタンパク質成形体。
［１１］　上記構造タンパク質がクモ糸フィブロインである、［１０］に記載のタンパク質成形体。
　本発明によれば、タンパク質成形体用素材がフィルム状であるため、粉末を素材として用いる場合に比して、ハンドリング性が向上する。これに加え、本発明によれば、従来のタンパク質成形体に比して、曲げ物性（たとえば曲げ応力またはタフネス等）が向上する。
図１は加圧成形機を模式的に示す断面図である。 図２（ａ）は組成物の導入前の状態、図２（ｂ）は組成物の導入直後の状態、図２（ｃ）は組成物を加熱及び加圧している状態の加圧成形機をそれぞれ模式的に示す断面図である。 図３は実施例に係るフィルム状のタンパク質成形体用素材の写真である。 図４は実施例に係るタンパク質成形体及び比較例に係るタンパク質成形体の写真である。 図５は比較例および実施例における三点曲げ試験の結果を示す図である。 図６は比較例および実施例における耐水性評価の結果を示す図である。 図７は比較例および実施例における応力歪み特性を示す図である。
　以下、本発明の好適な実施形態について説明する。ただし、本発明は下記実施形態に何ら限定されるものではない。
　本実施形態に係るタンパク質成形体用素材は、タンパク質を含み、且つフィルム状である。このタンパク質成形体用素材を用いて、本実施形態に係るタンパク質成形体が形成され得る。具体的には、複数枚のフィルム状のタンパク質成形体用素材が積層され、互いに融着されて、タンパク質成形体が形成される。本実施形態におけるタンパク質は、構造タンパク質であることが好ましい。
［構造タンパク質］
　構造タンパク質とは、生体構造を構築する役割を有するタンパク質であり、酵素、ホルモン、抗体等の機能タンパク質とは異なる。構造タンパク質としては、天然に存在するフィブロイン、コラ－ゲン、レシリン、エラスチン及びケラチン等の天然型構造タンパク質を挙げることができる。天然に存在するフィブロインとして、昆虫及びクモ類が産生するフィブロインが知られている。
　本実施形態に係る構造タンパク質は、クモ糸フィブロインであることが好ましい。クモ糸フィブロインには、天然クモ糸フィブロイン、及び天然クモ糸フィブロインに由来する改変フィブロインが含まれる。天然クモ糸フィブロインとしては、例えば、クモ類が産生するスパイダーシルクタンパク質が挙げられる。「改変フィブロイン」とは、天然由来のフィブロインとは異なるアミノ酸配列を有するフィブロインを意味する。
　昆虫が産生するフィブロインとしては、例えば、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ）、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍａｎｄａｒｉｎａ）、天蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ｙａｍａｍａｉ）、柞蚕（Ａｎｔｅｒａｅａ　ｐｅｒｎｙｉ）、楓蚕（Ｅｒｉｏｇｙｎａ　ｐｙｒｅｔｏｒｕｍ）、蓖蚕（Ｐｉｌｏｓａｍｉａ　Ｃｙｎｔｈｉａ　ｒｉｃｉｎｉ）、樗蚕（Ｓａｍｉａ　ｃｙｎｔｈｉａ）、栗虫（Ｃａｌｉｇｕｒａ　ｊａｐｏｎｉｃａ）、チュッサー蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ｍｙｌｉｔｔａ）、ムガ蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ａｓｓａｍａ）等のカイコが産生する絹タンパク質、スズメバチ（Ｖｅｓｐａ　ｓｉｍｉｌｌｉｍａ　ｘａｎｔｈｏｐｔｅｒａ）の幼虫が吐出するホーネットシルクタンパク質が挙げられる。
　昆虫が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、カイコ・フィブロインＬ鎖（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ７６４３０（塩基配列）、ＡＡＡ２７８４０．１（アミノ酸配列））が挙げられる。
　クモには最大７種類の絹糸腺が存在し、それぞれ性質の異なるフィブロイン（スパイダーシルクタンパク質）を産生する。スパイダーシルクタンパク質は、その源泉の器官にしたがって、高い靭性を有する大瓶状スパイダータンパク質（ｍａｊｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭａＳｐ）、高度な伸長力を有する小瓶状スパイダータンパク質（ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭｉＳｐ）、並びに鞭状（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ（Ｆｌａｇ））、管状（ｔｕｂｕｌｉｆｏｒｍ）、集合（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）、ブドウ状（ａｃｉｎｉｆｏｒｍ）及びナシ状（ｐｙｒｉｆｏｒｍ）の各スパイダーシルクタンパク質と命名されている。
　クモ類が産生するフィブロインとしては、例えば、オニグモ、ニワオニグモ、アカオニグモ、アオオニグモ及びマメオニグモ等のオニグモ属（Ａｒａｎｅｕｓ属）に属するクモ、ヤマシロオニグモ、イエオニグモ、ドヨウオニグモ及びサツマノミダマシ等のヒメオニグモ属（Ｎｅｏｓｃｏｎａ属）に属するクモ、コオニグモモドキ等のコオニグモモドキ属（Ｐｒｏｎｕｓ属）に属するクモ、トリノフンダマシ及びオオトリノフンダマシ等のトリノフンダマシ属（Ｃｙｒｔａｒａｃｈｎｅ属）に属するクモ、トゲグモ及びチブサトゲグモ等のトゲグモ属（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ属）に属するクモ、マメイタイセキグモ及びムツトゲイセキグモ等のイセキグモ属（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ属）に属するクモ、コガネグモ、コガタコガネグモ及びナガコガネグモ等のコガネグモ属（Ａｒｇｉｏｐｅ属）に属するクモ、キジロオヒキグモ等のオヒキグモ属（Ａｒａｃｈｎｕｒａ属）に属するクモ、ハツリグモ等のハツリグモ属（Ａｃｕｓｉｌａｓ属）に属するクモ、スズミグモ、キヌアミグモ及びハラビロスズミグモ等のスズミグモ属（Ｃｙｔｏｐｈｏｒａ属）に属するクモ、ゲホウグモ等のゲホウグモ属（Ｐｏｌｔｙｓ属）に属するクモ、ゴミグモ、ヨツデゴミグモ、マルゴミグモ及びカラスゴミグモ等のゴミグモ属（Ｃｙｃｌｏｓａ属）に属するクモ、及びヤマトカナエグモ等のカナエグモ属（Ｃｈｏｒｉｚｏｐｅｓ属）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質、並びにアシナガグモ、ヤサガタアシナガグモ、ハラビロアシダカグモ及びウロコアシナガグモ等のアシナガグモ属（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、オオシロカネグモ、チュウガタシロカネグモ及びコシロカネグモ等のシロカネグモ属（Ｌｅｕｃａｕｇｅ属）に属するクモ、ジョロウグモ及びオオジョロウグモ等のジョロウグモ属（Ｎｅｐｈｉｌａ属）に属するクモ、キンヨウグモ等のアズミグモ属（Ｍｅｎｏｓｉｒａ属）に属するクモ、ヒメアシナガグモ等のヒメアシナガグモ属（Ｄｙｓｃｈｉｒｉｏｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、クロゴケグモ、セアカゴケグモ、ハイイロゴケグモ及びジュウサンボシゴケグモ等のゴケグモ属（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ属）に属するクモ、及びユープロステノプス属（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ属）に属するクモ等のアシナガグモ科（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈｉｄａｅ科）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質が挙げられる。スパイダーシルクタンパク質としては、例えば、ＭａＳｐ（ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２）、ＡＤＦ（ＡＤＦ３及びＡＤＦ４）等の牽引糸タンパク質、ＭｉＳｐ（ＭｉＳｐ１及びＭｉＳｐ２）等が挙げられる。
　クモ類が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、ｆｉｂｒｏｉｎ－３（ａｄｆ－３）［Ａｒａｎｅｕｓ　ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１０（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５５（塩基配列））、ｆｉｂｒｏｉｎ－４（ａｄｆ－４）［Ａｒａｎｅｕｓ　ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１１（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ０４５０４（アミノ酸配列）、Ｕ３７５２０（塩基配列））、ｍａｊｏｒ　ａｎｇｕ１１ａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ　ｈｅｓｐｅｒｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ６８８５６（アミノ酸配列）、ＥＦ５９５２４６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　２［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖａｔａ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ３２４７２（アミノ酸配列）、ＡＦ４４１２４５（塩基配列））、ｍａｊｏｒ　ａｎｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ　ａｕｓｔｒａｌｉｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＪ００４２８（アミノ酸配列）、ＡＪ９７３１５５（塩基配列））、及びｍａｊｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　２［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ　ａｕｓｔｒａｌｉｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＭ３２２４９．１（アミノ酸配列）、ＡＭ４９０１６９（塩基配列））、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５８９．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５９１．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ－ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｎｅｐｈｉｌｅｎｇｙｓ　ｃｒｕｅｎｔａｔａ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ３７２７８．１（アミノ酸配列）等が挙げられる。
　天然由来のフィブロインのより具体的な例としては、更に、ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋに配列情報が登録されているフィブロインを挙げることができる。例えば、ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報のうちＤＩＶＩＳＩＯＮとしてＩＮＶを含む配列の中から、ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮにｓｐｉｄｒｏｉｎ、ａｍｐｕｌｌａｔｅ、ｆｉｂｒｏｉｎ、「ｓｉｌｋ及びｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」、又は「ｓｉｌｋ及びｐｒｏｔｅｉｎ」がキーワードとして記載されている配列、ＣＤＳから特定のｐｒｏｄｕｃｔの文字列、ＳＯＵＲＣＥからＴＩＳＳＵＥ　ＴＹＰＥに特定の文字列の記載された配列を抽出することにより確認することができる。
　構造タンパク質は、上記天然型構造タンパク質に由来するポリペプチド、すなわち組換えポリペプチドであってもよい。例えば、組換えフィブロインは、いくつかの異種タンパク質生産系で産生されており、その製造方法として、トランスジェニック・ヤギ、トランスジェニック・カイコ、又は組換え植物若しくは哺乳類細胞が利用されている。
　組換えフィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列から（Ａ）ｎモチーフをコードする配列の１又は複数を欠失させることにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。アミノ酸残基の置換、欠失、挿入及び／又は付加は、部分特異的突然変異誘発法等の当業者に周知の方法により行うことができる。具体的には、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１０，６４８７（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４４８（１９８３）等の文献に記載されている方法に準じて行うことができる。
　大吐糸管しおり糸タンパク質の組換えポリペプチドは、例えば、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式１中、（Ａ）ｎモチーフは４～２０アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が８０％以上である。ＲＥＰは１０～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは８～３００の整数を示す。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）として表すことができる。具体的には配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をあげることができる。
　コラーゲンの組換えポリペプチドとして、例えば、式２：［ＲＥＰ２］ｏで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式２中、ｏは５～３００の整数を示す。ＲＥＰ２は、Ｇｌｙ一Ｘ一Ｙから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘ及びＹはＧｌｙ以外の任意のアミノ酸残基を示す。複数存在するＲＥＰ２は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。具体的には、配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号１３で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したヒトのコラーゲンタイプ４の部分的な配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号：ＣＡＡ５６３３５．１、ＧＩ：３７０２４５２）のリピート部分及びモチーフに該当する３０１残基目から５４０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号５で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
　レシリンの組換えポリペプチドとして、例えば、式３：［ＲＥＰ３］ｐで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式３中、ｐは４～３００の整数を示す。ＲＥＰ３はＳｅｒ一Ｊ一Ｊ一Ｔｙｒ一Ｇｌｙ一Ｕ－Ｐｒｏから構成されるアミノ酸配列を示す。Ｊは任意のアミノ酸残基を示し、特にＡｓｐ、Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。Ｕは任意のアミノ酸残基を示し、特にＰｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ及びＳｅｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。複数存在するＲＥＰ３は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。具体的には、配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号１４で示されるアミノ酸配列は、レシリン（ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＰ　６１１１５７、Ｇｌ：２４６５４２４３）のアミノ酸配列において、８７残基目のＴｈｒをＳｅｒに置換し、かつ９５残基目のＡｓｎをＡｓｐに置換した配列の１９残基目から３２１残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１７で示されるアミノ酸配列（タグ配列）が付加されたものである。
　エラスチンの組換えポリペプチドとして、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５（ヒト）、Ｉ４７０７６（ヒツジ）、ＮＰ７８６９６６（ウシ）等のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。具体的には、配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号１５で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５のアミノ酸配列の１２１残基目から３９０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号５で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
　ケラチンの組換えポリペプチドとして、例えば、カプラ・ヒルクス（Ｃａｐｒａ　ｈｉｒｃｕｓ）のタイプＩケラチン等を挙げることができる。具体的には、配列番号１６で示されるアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＡＣＹ３０４６６のアミノ酸配列）を含むタンパク質を挙げることができる。
　組換えポリペプチドは、（ｉ）配列番号２、配列番号４若しくは配列番号１０で示されるアミノ酸配列、又は（ｉｉ）配列番号２、配列番号４若しくは配列番号１０で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換えフィブロインであってもよい。
　（ｉ）配列番号２、配列番号４若しくは配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含む、組換えフィブロインについて説明する。配列番号２で示されるアミノ酸配列は、天然由来のフィブロインに相当する配列番号１で示されるアミノ酸配列（天然由来のフィブロインに相当）から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号４で示されるアミノ酸配列は、配列番号２で示されるアミノ酸配列のＲＥＰ中の全てのＧＧＸをＧＱＸに置換したものである。配列番号１０で示されるアミノ酸配列は、配列番号４で示されるアミノ酸配列の各（Ａ）ｎモチーフのＣ末端側に２つのアラニン残基を挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、配列番号４の分子量とほぼ同じとなるようにＮ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。なお、配列番号３で示されるアミノ酸配列は、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＲＥＰ中の全てのＧＧＸをＧＱＸに置換したものである。
　（ｉｉ）配列番号２、配列番号４若しくは配列番号１０で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換えフィブロインについて説明する。（ｉｉ）組換えフィブロインは、配列番号２、配列番号４又は配列番号１０で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（ｉｉ）組換えフィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　上述の組換えフィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、組換えフィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
　タグ配列として、例えば、他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用したアフィニティタグを挙げることができる。アフィニティタグの具体例として、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を挙げることができる。Ｈｉｓタグは、ヒスチジン残基が４から１０個程度並んだ短いペプチドで、ニッケル等の金属イオンと特異的に結合する性質があるため、金属キレートクロマトグラフィー（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　ｍｅｔａｌ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による組換えフィブロインの単離に利用することができる。タグ配列の具体例として、例えば、配列番号５で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグを含むアミノ酸配列）が挙げられる。
　また、グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列を利用することもできる。
　さらに、抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用することもできる。抗原性を示すペプチド（エピトープ）をタグ配列として付加することにより、当該エピトープに対する抗体を結合させることができる。エピトープタグとして、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列）タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等を挙げることができる。エピトープタグを利用することにより、高い特異性で容易に組換えフィブロインを精製することができる。
　さらにタグ配列を特定のプロテアーゼで切り離せるようにしたものも使用することができる。当該タグ配列を介して吸着したタンパク質をプロテアーゼ処理することにより、タグ配列を切り離した組換えフィブロインを回収することもできる。
　タグ配列を含む組換えフィブロインのより具体的な例として、（ｉｉｉ）配列番号７、配列番号９若しくは配列番号１１で示されるアミノ酸配列、又は（ｉｖ）配列番号７、配列番号９若しくは配列番号１１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換えフィブロインを挙げることができる。
　組換えポリペプチドは、（ｉｉｉ）配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で示されるアミノ酸配列、又は（ｉｖ）配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換えフィブロインであってもよい。
　配列番号６、７、８、９及び１１で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、２、３、４及び１０で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号５で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグを含む）を付加したものである。（ｉｖ）組換えフィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　構造タンパク質は、組換えポリペプチドを含むことが好ましい。構造タンパク質として組換えポリペプチドを含むことにより、得られるモールド成形体の曲げ弾性率、曲げ強度及び硬度を所望の数値に調整することが可能である。
［構造タンパク質を発現する組換え細胞］
　組換えポリペプチドの製造方法について、以下に詳述する。目的とする組換えポリペプチドは、例えば、構造タンパク質をコードする遺伝子配列と、当該遺伝子配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する発現ベクターで形質転換された宿主により、当該遺伝子を発現させることにより生産することができる。
　目的とする組換えポリペプチドをコードする遺伝子の製造方法は特に制限されない。例えば、天然の構造タンパク質をコードする遺伝子を利用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅しクローニングする方法、又は、化学的な合成によって、遺伝子を製造することができる。遺伝子の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどより入手した構造タンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ　１０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結する方法によって遺伝子を化学的に合成することができる。この際に、タンパク質の精製や確認を容易にするため、上記のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したポリペプチドをコードする遺伝子を合成してもよい。
　調節配列は、宿主における組換えタンパク質の発現を制御する配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等）であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。プロモーターとして、宿主細胞中で機能し、目的とするタンパク質を発現誘導可能な誘導性プロモーターを用いても良い。誘導性プロモーターは、誘導物質（発現誘導剤）の存在、リプレッサー分子の非存在、又は温度、浸透圧若しくはｐＨ値の上昇若しくは低下等の物理的要因により、転写を制御できるプロモーターである。
　発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主の染色体中への組込みが可能で、目的とする組換えポリペプチドをコードする遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが好適に用いられる。
　宿主として、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも好適に用いることができる。
　原核生物の好ましい例として、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する細菌を挙げることができる。
　目的とする組換えポリペプチドをコードする遺伝子を導入するベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２（ベーリンガーマンハイム社製）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＣｏｌｄ、ｐＵＢ１１０、ｐＮＣＯ２（特開２００２－２３８５６９号公報）等を挙げることができる。
　真核生物の宿主としては、例えば、酵母及び糸状真菌（カビ等）を挙げることができる。
　酵母としては、例えば、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属等に属する酵母を挙げることができる。糸状真菌としては、例えば、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属等に属する糸状真菌を挙げることができる。
　ベクターとしては、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）等を挙げることができる。
　上記宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，６９，２１１０　（１９７２）〕、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、コンピテント法等を挙げることができる。
　発現ベクターで形質転換された宿主による遺伝子の発現方法としては、直接発現のほか、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
　目的とする組換えポリペプチドは、例えば、本発明に係る発現ベクターで形質転換された宿主を培養培地中で培養し、培養培地中に当該タンパク質を生成蓄積させ、該培養培地から採取することにより製造することができる。本発明に係る宿主を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。
　本発明に係る宿主が、大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、本発明に係る宿主の培養培地として、該宿主が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有し、該宿主の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
　炭素源としては、上記形質転換微生物が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類を用いることができる。
　窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。
　無機塩類としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。
　大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物の培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は、例えば、１５～４０℃である。培養時間は、通常１６時間～７日間である。培養中の培養培地のｐＨは３．０～９．０に保持することが好ましい。培養培地のｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。
　また、培養中必要に応じて、アンピシリン及びテトラサイクリン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
　本発明に係る組換えポリペプチドは、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法で単離及び精製することができる。例えば、当該組換えポリペプチドが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、宿主細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁した後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー及びダイノミル等により宿主細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法、すなわち、溶媒抽出法、硫酸アンモニウム等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ　ＨＰＡ－７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の方法を単独又は組み合わせて使用し、精製標品を得ることができる。
　また、組換えポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に宿主細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として組換えポリペプチドの不溶体を回収する。回収した組換えポリペプチドの不溶体は蛋白質変性剤で可溶化することができる。該操作の後、上記と同様の単離精製法により組換えポリペプチドの精製標品を得ることができる。
　組換えポリペプチドが細胞外に分泌された場合には、培養上清から組換えポリペプチドを回収することができる。すなわち、培養物を遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
［タンパク質成形体用素材］
　タンパク質成形体用素材は、タンパク質を含んでいればよい。タンパク質成形体用素材は、主成分として、構造タンパク質を含むことが好ましい。タンパク質成形体用素材は、構造タンパク質のみであってもよく、構造タンパク質及び任意の添加成分（例えば、可塑剤、着色剤、フィラー、合成樹脂等）を含んでいてもよい。上記添加成分の含有量は、構造タンパク質の合計量の５０質量％以下にすることが好ましい。本明細書において主成分とは、含有量が５０質量％以上（好ましくは８０質量％以上、より好ましくは９０質量％以上）であることを示す。
　フィルム状のタンパク質成形体用素材は、所定の厚みを有する。タンパク質成形体用素材の厚みは、たとえば３～１００μｍであってよい。タンパク質成形体用素材の厚みは、１５～３０μｍであることが好ましい。フィルム状のタンパク質成形体用素材が用いられると、粉末を素材として用いる場合に比して、ハンドリング性が向上する。フィルム状のタンパク質成形体用素材は、粉末とは違って飛散しないため、成形体のための製造設備を摩耗等から保護する。タンパク質成形体用素材は、成形体のための製造設備のメンテナンスを低減させる。
　タンパク質成形体は、タンパク質を主成分として含む。複数枚のタンパク質成形体用素材が積層され互いに融着されてなるタンパク質成形体は、主成分として、構造タンパク質を含むことが好ましい。タンパク質成形体において、複数枚のタンパク質成形体用素材の境界面は、加熱及び加圧を受けた後に消滅していてもよく、加熱及び加圧を受けた後に残存していてもよい。タンパク質粉末からフィルム化されたタンパク質成形体用素材が積層され互いに融着されると、成形体の曲げ物性（たとえば曲げ応力またはタフネス等）が向上する。
　タンパク質成形体用素材およびタンパク質成形体の製造方法について、以下に詳述する。たとえば、上記構造タンパク質の粉末をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶媒に溶解させドープ溶液とし、これを基材表面にキャスト成形し、乾燥及び／又は脱溶媒する。ドープ溶液の粘度は１５～８０ｃＰ（センチポアズ）であるのが製膜性から好ましい。ドープ溶液の溶媒は、水とエタノールの混合溶液であってもよい。
　キャスト成形の際に使用する基材は、ＰＥＴフィルム又はＰＥＴフィルム表面にシリコーン化合物を固定化させた剥離フィルムが好ましい。これらの基材はＤＭＳＯ溶媒に対して安定であり、ドープ溶液を安定してキャスト成形でき、成形後の膜の分離も容易にできる利点がある。基板として、ガラスや金属を用いてもよい。
　乾燥／脱溶媒は、真空乾燥、熱風乾燥、風乾及び液中浸漬のいずれでもよい。液中浸漬に用いられる液は、水、メタノール、エタノール、２－プロパノールなどの炭素数１～５の低級アルコールでもよい。液中浸漬は、水とアルコールの混合液にキャストフィルムを浸漬して脱溶媒させものであってもよい。脱溶媒液（凝固液）の温度は０～９０℃が好ましい。
　このように作製したフィルムを切断することでタンパク質成形体用素材を作製することができる。切断は、必要とするフィルムのサイズに合わせた型を用いて打抜き加工することが望ましいが、手作業で切断してもよいし、その他一般的に用いられる切断方法であれば何でもよい。
　成形体の物性向上を目的として、成形体の製造の前（複数枚のフィルム状成形素材を積層する前）に、フィルム状成形素材をメタノール、アセトニトリル、エタノール、水、アセトンに浸してもよい。浸す時間は、１～２００時間が好ましく、８０～１２０時間がより好ましい。
　タンパク質成形体は、加圧成形機を用いて作製可能である。図１は、タンパク質成形体を製造するために用いることのできる加圧成形機の模式断面図である。図１に示す加圧成形機１０は、貫通孔が形成され加温可能な金型２と、金型の貫通孔内で上下動が可能な上側ピン４及び下側ピン６とを備えるものであり、金型２に、上側ピン４又は下側ピン６を挿入して生じる空隙に、上記タンパク質成形体用素材を複数枚積層した状態で導入して、金型２を加温しつつ、上側ピン４及び下側ピン６でタンパク質成形体用素材を圧縮することで、タンパク質成形体を得ることができる。
　図２は、タンパク質成形体を得る工程図を示すものであり、（ａ）はタンパク質成形体用素材導入前、（ｂ）はタンパク質成形体用素材導入直後、（ｃ）はタンパク質成形体用素材を加熱及び加圧している状態の加圧成形機の模式断面図である。図２（ａ）に示すように、金型２の貫通孔に下側ピン６のみを挿入した状態で貫通孔内にタンパク質成形体用素材７を導入し、積層体８ａを得る。タンパク質成形体用素材７の枚数は、２枚以上であればよい。目的とするタンパク質成形体の大きさいに応じて、タンパク質成形体用素材７の枚数が調整され得る。図２（ｂ）に示すように、金型２の貫通孔に上側ピン４を挿入して下降させ、金型２の加熱を開始して、積層体８ａを貫通孔内で加熱加圧する。あらかじめ定めた加圧力に至るまで上側ピン４を下降させ、図２（ｃ）に示す状態でタンパク質成形体用素材が所定の温度に達するまで、加熱及び加圧を継続して、加熱加圧後の組成物８ｂを得る。その後、冷却器（例えばスポットクーラー）を用いて金型２の温度を下降させ、組成物８ｂが所定の温度になったところで、上側ピン４又は下側ピン６を金型２から抜き取り、内容物を取り出してタンパク質成形体を得る。加圧に関しては、下側ピン６を固定した状態で上側ピン４を下降させて実施してもよいが、上側ピン４の下降と下側ピン６の上昇の両方を実施してもよい。
　すなわち、本実施形態のタンパク質成形体の製造方法は、構造タンパク質（たとえば構造タンパク質粉末）をフィルム化してタンパク質成形体用素材を得る工程と、複数枚のタンパク質成形体用素材を積層して積層体を得る工程と、積層体を加熱及び加圧してタンパク質成形体用素材を融着させる工程と、その融着体を冷却する工程と、を含む。
　加熱加圧工程における加熱は、８０～２５０℃で行うことが好ましく、１００～１８０℃がより好ましく、１３０～１５０℃が更に好ましい。加圧は、５ｋＮ以上で行うことが好ましく、１０ｋＮ以上がより好ましく、２０ｋＮ以上が更に好ましい。また、所定の加熱加圧条件に達した後、その条件での処理を続ける時間（保温条件）は、０～１００分が好ましく、１～５０分がより好ましく、５～１０分が更に好ましい。
（製造例１：成形体前駆体の製造）
〔（１）改変クモ糸フィブロイン（タンパク質）の製造〕
（改変クモ糸フィブロインをコードする核酸の合成、及び発現ベクターの構築）
　配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有する改変クモ糸フィブロイン（ＰＲＴ７９９）を設計した。
　配列番号１２で示されるアミノ酸配列は、配列番号９で示されるアミノ酸配列中に存在する２０個のドメイン配列の領域（但し、当該領域のＣ末端側の数アミノ酸残基が置換されている。）を４回繰り返した配列のＣ末端にＨｉｓタグが付加されたアミノ酸配列に対し、Ｎ末端に配列番号５で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグを含む）を付加したものである。
　設計した改変クモ糸フィブロインをコードする核酸を合成した。当該核酸には、５’末端にＮｄｅＩサイト、終止コドン下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した。この核酸をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。その後、同核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した後、タンパク質発現ベクターｐＥＴ－２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。
（改変クモ糸フィブロインの発現）
　得られたｐＥＴ－２２ｂ（＋）発現ベクターで、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。当該形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。当該培養液を、アンピシリンを含む１００ｍＬのシード培養用培地（表１）にＯＤ６００が０．００５となるように添加した。培養液温度を３０℃に保ち、ＯＤ６００が５になるまでフラスコ培養を行い（約１５時間）、シード培養液を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　当該シード培養液を５００ｍｌの生産培地（下記表２）を添加したジャーファーメンターにＯＤ６００が０．０５となるように添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ　１２０ｇ／１Ｌ）を１ｍＬ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持しながら、２０時間培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、目的とする改変フィブロインを発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存した目的とする改変フィブロインに相当するサイズのバンドの出現により、目的とする改変クモ糸フィブロインの発現を確認した。
（改変クモ糸フィブロインの精製）
　ＩＰＴＧを添加してから２時間後に回収した菌体を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の菌体を約１ｍＭのＰＭＳＦを含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ　Ｎｉｒｏ　Ｓｏａｖｉ社製）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８Ｍ　グアニジン緩衝液（８Ｍ　グアニジン塩酸塩、１０ｍＭ　リン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で懸濁し、６０℃で３０分間、スターラーで撹拌し、溶解させた。溶解後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収した。回収した凝集タンパク質から凍結乾燥機で水分を除き、目的とする改変フィブロインの凍結乾燥粉末（構造タンパク質粉末）を得た。
　得られた凍結乾燥粉末における目的とする改変クモ糸フィブロインの精製度は、粉末のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果をＴｏｔａｌｌａｂ（ｎｏｎｌｉｎｅａｒ　ｄｙｎａｍｉｃｓ　ｌｔｄ．）を用いて画像解析することにより確認した。その結果、いずれの改変クモ糸フィブロインも精製度は約８５％であった。
（ドープ液の調整）
　上記で得られた構造タンパク質粉末を濃度５．９８質量％の割合でＤＭＳＯ溶媒に溶かし、ドープ液とした。具体的には、シェーカーを使用して構造タンパク質粉末を３時間溶解した後、ゴミと泡を取り除いて、ドープ液を得た。ドープ液の粘度は２３．５ｃＰ（センチポアズ）であった。
（フィルムキャスト成形）
　厚さ７５μｍのＰＥＴフィルム表面にシリコーン化合物を固定化させた離形フィルム（三井化学東セロ株式会社製、商品番号"SP-PET-01-75-BU"）を基板として使用し、この表面に、ＭＴＩ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製、マイクロメーター付きフィルムアプリケータ１５０ｍｍを使用して上記ドープ液をキャスト成形し、濡れ膜を作製した。その濡れ膜を６０℃で１６時間静置した後、真空乾燥機内でさらに１６時間静置し、乾燥した。その後構造タンパク質フィルムを基板から剥離した。
（タンパク質成形体用素材の作製）
　テスター産業社製打抜き機を用いて、上記のフィルムを１５×３５ｍｍの大きさに打抜いてタンパク質成形体用素材とした。図３に、作製したタンパク質成形体用素材を示す。以下、タンパク質成形体用素材を単に成形体用素材という。このように作製した成形体用素材を実施例１～３のタンパク質成形体の作製に用いた。また、このように作製した成形体用素材をメタノールに９６時間浸した後に乾燥させたものを実施例４～７のタンパク質成形体の作製に用いた。
（成形体の作製）
　上記で得られた成形体用素材を、総量１．３５ｇとなるような枚数で重ねてサンプルとし、図１に示す加圧成形機１０の金型２（円柱形状の金型であり、断面が３５ｍｍ×１５ｍｍの長方形状の貫通孔を有している。）の貫通孔内に導入した。その後、金型２の加熱を開始するとともに、ハンドプレス機（ＮＰａシステム株式会社製、ＮＴ－１００Ｈ－Ｖ０９）を用いて、上側ピン４と下側ピン６を貫通孔内に挿入することでサンプルの加圧を行った。この際、サンプルの加圧条件が３０ＭＰａとなるように制御した。サンプルの温度が、実施例１～４では１３０℃、実施例５～６では１５０℃、実施例７では１７０℃になったところで、上記圧力及び温度を維持したまま５分間保持した。その後、加熱を中止するとともにスポットクーラー（トラスコ中山株式会社製、ＴＳ－２５ＥＰ－１）で冷却して、サンプルの温度が５０℃になったところで取り出し、３５ｍｍ×１５ｍｍ×２ｍｍの直方体形状の成形体を得た。図４に（２つのうち上に示されるもの）、実施例１として作製したタンパク質成形体を示す。
　すなわち、実施例１～３の条件は、成形体用素材のメタノールへの浸漬無し、成形温度１３０℃である。実施例４の条件は、成形体用素材のメタノールへの浸漬有り、成形温度１３０℃である。実施例５～６の条件は、成形体用素材のメタノールへの浸漬有り、成形温度１５０℃である。実施例７の条件は、成形体用素材のメタノールへの浸漬有り、成形温度１７０℃である。
　比較例として、上記で得られた構造タンパク質粉末を用いて、上記した加圧成形機１０を用いた成形体の作製方法と同様にしてタンパク質成形体を得た。比較例では、サンプルの温度が１３０℃になったところで、上記圧力及び温度を維持したまま５分間保持した。図４に（２つのうち下に示されるもの）、比較例として作製したタンパク質成形体を示す。すなわち、比較例では、構造タンパク質粉末を加熱加圧してタンパク質成形体を得た。
（効果の確認）
　比較例では、金型の周辺に構造タンパク質粉末が散乱し、設備の可動部に入り込む可能性があった。このため、繰り返し成形する場合、都度粉末を除去する手間が必要であった。また、成形時にサンプルに圧力が均等に加わるよう、金型の貫通孔内に構造タンパク質粉末を導入する時に厚みが均等になるように配慮する必要があった。
　これに対して実施例１～７においては、成形体用素材が散乱することはなく、繰り返し成形する場合でも特段の配慮をする必要がなかった。また、成形体用素材がフィルム状であるため、これらを重ねた段階でサンプルの厚みは均等になっており、特段の配慮は不要であった。
（その他の評価）
　実施例１及び比較例の成形体を格子模様のある台紙の上に乗せ、透明性を目視で評価した。図４に示されるように、実施例１では格子模様をはっきりと目視できるのに対し、比較例は実施例１に比べて格子模様を視認しづらかった。実施例１の方が、高い透明性を有することが確認できた。
　また、実施例１～７及び比較例のタンパク質成形体について、以下の測定を行った。すなわち、オートグラフ（島津製作所株式会社製、ＡＧ－Ｘｐｌｕｓ）に籠治具を用いて、三点曲げ試験を行った。使用したロードセルは５０ｋＮであった。この際、三点曲げの支点間距離を２７ｍｍに固定し、測定速度を１ｍｍ／分とした。試験の結果、図７に示される応力歪み特性が得られた。図５には、各実施例および比較例について得られた曲げ応力を示す。
　また、実施例１～７及び比較例の成形体について、温度３０℃、湿度９６％の雰囲気下に９６時間置き、その前後の重量変化を見ることで耐水性の評価を行った。試験の結果、図６に示されるように、いずれの実施例も比較例に比べて重量変化が小さく、吸湿量が少ないことが確認できた。
　各実施例、比較例の評価結果を表３に示す。なお、タフネスについては、応力歪み特性のグラフから積分値を読み取り、体積当たりのエネルギー値を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　本発明によれば、タンパク質成形体用素材がフィルム状であるため、粉末を素材として用いる場合に比して、ハンドリング性が向上する。これに加え、本発明によれば、従来のタンパク質成形体に比して、曲げ物性（たとえば曲げ応力またはタフネス等）が向上する。
　２…金型、４…上側ピン、６…下側ピン、７…タンパク質成形体用素材、８ａ…積層体、８ｂ…加熱加圧後の積層体、１０…加圧成形機。

Claims (11)

  1. 　タンパク質を含む、フィルム状のタンパク質成形体用素材。
  2. 　前記タンパク質が構造タンパク質である、請求項１に記載のタンパク質成形体用素材。
  3. 　前記構造タンパク質がクモ糸フィブロインである、請求項２に記載のタンパク質成形体用素材。
  4. 　請求項１～３のいずれか一項に記載のタンパク質成形体用素材が複数枚積層され互いに融着されてなるタンパク質成形体。
  5. 　請求項１に記載のタンパク質成形体用素材を複数枚積層して積層体を得る工程と、
    　前記積層体を加熱及び加圧する工程と、を含む、タンパク質成形体の製造方法。
  6. 　請求項２に記載のタンパク質成形体用素材を複数枚積層して積層体を得る工程と、
    　前記積層体を加熱及び加圧する工程と、を含む、タンパク質成形体の製造方法。
  7. 　請求項３に記載のタンパク質成形体用素材を複数枚積層して積層体を得る工程と、
    　前記積層体を加熱及び加圧する工程と、を含む、タンパク質成形体の製造方法。
  8. 　前記積層体を得る工程に先立って、前記タンパク質成形体用素材をメタノールに浸す工程を更に含む、請求項５～７のいずれか一項に記載のタンパク質成形体の製造方法。
  9. 　タンパク質を主成分として含むタンパク質成形体であって、タフネスが８７ｋＪ／ｍ３以上５５４．９７ｋＪ／ｍ３以下である、タンパク質成形体。
  10. 　前記タンパク質が構造タンパク質である、請求項９に記載のタンパク質成形体。
  11. 　前記構造タンパク質がクモ糸フィブロインである、請求項１０に記載のタンパク質成形体。
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