JP7219899B2 - 成形体の製造方法および成形体 - Google Patents
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Description
[1] 構造タンパク質を含む組成物を成形する工程1と、上記工程1で得られる成形組成物を圧縮して延伸する工程2と、を含む成形体の製造方法。
[2] 上記工程1が、上記組成物を加熱および加圧することを含む、[1]に記載の方法。
[3] 上記工程2が、上記成形組成物を加熱することを含む、[1]または[2]に記載の方法。
[4] 上記工程2を複数回繰り返す、[1]~[3]のいずれかに記載の方法。
[5] 上記工程2の前および上記工程2の後の少なくともいずれかにおいて、上記成形組成物を乾燥する工程3を含む、[1]~[4]のいずれかに記載の方法。
[6] 構造タンパク質がクモ糸フィブロインである、[1]~[5]のいずれかに記載の方法。
[7] 構造タンパク質を含む組成物の成形体であって、曲げ弾性率が8.47GPaを超える成形体。
[8] 構造タンパク質を含む組成物の成形体であって、曲げ強度が141MPaを超える成形体。
[9] 構造タンパク質を含む組成物の成形体であって、配向度が0.22以上である成形体。
[10] 上記構造タンパク質がクモ糸フィブロインである、[7]~[9]のいずれかに記載の方法。
構造タンパク質とは、生体構造を構築する役割を有するタンパク質であり、酵素、ホルモン、抗体等の機能タンパク質とは異なる。構造タンパク質としては、天然に存在するフィブロイン、コラ-ゲン、レシリン、エラスチン及びケラチン等の天然型構造タンパク質を挙げることができる。天然に存在するフィブロインとして、昆虫及びクモ類が産生するフィブロインが知られている。本実施形態において、構造タンパク質はスパイダーシルクタンパク質を含むことが好ましい。
組換えポリペプチドの製造方法について、以下に詳述する。目的とする組換えポリペプチドは、例えば、構造タンパク質をコードする遺伝子配列と、当該遺伝子配列に作動可能に連結された1又は複数の調節配列とを有する発現ベクターで形質転換された宿主により、当該遺伝子を発現させることにより生産することができる。
一実施形態である成形体の製造方法は、構造タンパク質を含む組成物をたとえば鋳型(モールド)に導入して成形する工程1と、工程1で得られた成形組成物を圧縮して延伸し、成形体を得る工程2と、を含む。
ネフィラ・クラビペス(Nephila clavipes)由来のフィブロイン(GenBankアクセッション番号:P46804.1、GI:1174415)の塩基配列及びアミノ酸配列をGenBankのウェブデータベースより取得した後、生産性の向上を目的としてアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を施し、さらにN末端に配列番号5で示されるアミノ酸配列(タグ配列及びヒンジ配列)を付加して、配列番号12で示されるアミノ酸配列を有する組換えフィブロイン(以下、「PRT410」ともいう。)を設計した。
上記で得られたPRT410をコードする遺伝子を含むpET22b(+)発現ベクターで、大腸菌BLR(DE3)を形質転換した。形質転換された大腸菌を、アンピシリンを含む2mLのLB培地で15時間培養後、同培養液を、表1に示すシード培養用培地100mLに、OD600が0.005となるように添加した。培養液の温度を30℃に保ち、OD600が5になるまでフラスコにて、さらに約15時間培養を行い、シード培養液を得た。
IPTGを添加してから2時間後に回収した菌体を20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.4)で洗浄した。洗浄後の菌体を約1mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)を含む20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.4)に懸濁させ、高圧ホモジナイザー(GEA Niro Soavi社)で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.4)で洗浄した。洗浄後の沈殿物を100mg/mLの濃度になるように8M グアニジン緩衝液(8Mグアニジン塩酸塩、10mMリン酸二水素ナトリウム、20mM NaCl、1mM Tris-HCl、pH7.0)で懸濁し、60℃で30分間、スターラーで撹拌し、溶解させた。溶解後、透析チューブ(三光純薬株式会社製のセルロースチューブ36/32)を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分を除き、凍結乾燥粉末を回収した。
次に、人工クモ糸粉末をステンレス製治具に充填し、ホットプレスを用いて温度170℃、圧力30MPaで加熱および加圧を行った(ステップS02)。これにより、成形組成物(中間成形体)を得た(ステップS03)。成形組成物のサイズは、直径20mm、厚さ3mmの円板状であり、質量は1.2gであった。
切り出した試験片に対し、卓上形精密万能試験機(株式会社島津製作所製、オートグラフAGS-X 1kN)を用いて三点曲げ試験を行い、曲げ強度及び曲げ弾性率を測定した。測定条件は、支点間距離14mm、試験速度1mm/minとした。試験片のサイズは、長さ18mm、幅4mm、厚さ0.6~2mmとした。
切り出した試験片に対し、マイクロビッカース硬さ試験機(島津製作所株式会社製、商品名:HMV-G)にてビッカース硬さを測定した。
試験例1では、実施例1~3でそれぞれ1回のみの加熱延伸を行い、圧下率を変化させた。実施例1では圧下率を30%とし、実施例2では圧下率を50%とし、実施例3では圧下率を68%とした。比較例では、加圧成形後に加熱延伸を行わなかったこと以外、実施例1~3と同様にして成形体を得た。試験結果を表3に示す。表3に示されるように、圧下率を変化させたいずれの実施例でも、曲げ強度および曲げ弾性率の両方において、比較例よりも高い値が得られた。
試験例2では、実施例3,4,5,6において、最終的な圧下率が70%に近くなるようにし、加熱延伸をそれぞれ1,3,5,9回行った。試験結果を表4に示す。表4に示されるように、同程度の圧下率であれば、加熱延伸工程の回数が多い方が、曲げ強度が大きくなった。
試験例3では、最初の真空乾燥機を用いた乾燥(ステップS04)と、延伸後の真空乾燥機を用いた乾燥(ステップS06)とを行わなかったこと以外、上記した方法と同様に成形体を作製した。すなわち、試験例3では、2つの乾燥工程が省略された。実施例9,10では、それぞれ1回のみの加熱延伸を行い、圧下率を変化させた。実施例9では圧下率を41%とし、実施例10では圧下率を60%とした。比較例では、加圧成形後に加熱延伸を行わなかったこと以外、実施例9,10と同様にして成形体を得た。これらの試験片について、上記の曲げ試験を行った。さらに試験例3では、広角X線散乱装置(株式会社リガク製、XtaLAB)を用いて、試験片の配向度を測定した。試験結果を表7に示す。表7に示されるように、加熱延伸工程の回数が同じであれば、圧下率の大きい方が、配向度が大きくなった。また実施例9,10では、実施例1~8に比して曲げ強度が低い。これは、乾燥工程が省略されたことに起因し、試験片が水分を多く含んでいたためと思われる。
Claims (10)
- 強化繊維を含まない成形体の製造方法であって、
構造タンパク質と、前記構造タンパク質の含有量の50質量%以下の添加成分と、からなる組成物を成形する工程1と、
前記工程1で得られる成形組成物を圧縮して延伸する工程2と、を含み、
前記工程1および前記工程2を経て曲げ強度が141MPaを超える前記成形体を得る、成形体の製造方法。 - 前記工程1が、前記組成物を加熱および加圧することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記工程2が、前記成形組成物を加熱することを含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記工程2を複数回繰り返す、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記工程2の前および前記工程2の後の少なくともいずれかにおいて、前記成形組成物を乾燥する工程3を含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記構造タンパク質がクモ糸フィブロインである、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 強化繊維を含まない成形体の製造方法であって、
構造タンパク質を含む組成物(ただし、約30重量%から約95重量%のモロコシ粉を含有する組成物を除く。)を成形する工程1と、
前記工程1で得られる成形組成物を圧縮して延伸する工程2と、を含み、
前記工程1および前記工程2を経て曲げ強度が141MPaを超える前記成形体を得る、成形体の製造方法。 - 構造タンパク質を含む組成物の成形体であって、前記成形体は強化繊維を含まず、曲げ強度が141MPaを超え、かつ、曲げ弾性率が8.47GPaを超える成形体。
- 構造タンパク質を含む組成物の成形体であって、前記成形体は強化繊維を含まず、配向度が0.22以上であり、かつ、曲げ強度が141MPaを超える成形体。
- 前記構造タンパク質がクモ糸フィブロインである、請求項8または9に記載の成形体。
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