WO2021201103A1 - 難燃性材料及びその製造方法 - Google Patents

難燃性材料及びその製造方法 Download PDF

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WO2021201103A1
WO2021201103A1 PCT/JP2021/013843 JP2021013843W WO2021201103A1 WO 2021201103 A1 WO2021201103 A1 WO 2021201103A1 JP 2021013843 W JP2021013843 W JP 2021013843W WO 2021201103 A1 WO2021201103 A1 WO 2021201103A1
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amino acid
seq
protein
flame
retardant
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PCT/JP2021/013843
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English (en)
French (fr)
Inventor
小林　誠
孝興 石井
秀樹 加賀田
Original Assignee
Ｓｐｉｂｅｒ株式会社
三井住友建設株式会社
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Publication date
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B27—WORKING OR PRESERVING WOOD OR SIMILAR MATERIAL; NAILING OR STAPLING MACHINES IN GENERAL
    • B27K—PROCESSES, APPARATUS OR SELECTION OF SUBSTANCES FOR IMPREGNATING, STAINING, DYEING, BLEACHING OF WOOD OR SIMILAR MATERIALS, OR TREATING OF WOOD OR SIMILAR MATERIALS WITH PERMEANT LIQUIDS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; CHEMICAL OR PHYSICAL TREATMENT OF CORK, CANE, REED, STRAW OR SIMILAR MATERIALS
    • B27K3/00—Impregnating wood, e.g. impregnation pretreatment, for example puncturing; Wood impregnation aids not directly involved in the impregnation process
    • B27K3/34—Organic impregnating agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K21/00—Fireproofing materials
    • C09K21/14—Macromolecular materials

Definitions

  • the present invention relates to a flame-retardant material and a method for producing the same.
  • flame-retardant materials have been used in various fields such as clothing, building materials, and electrical and electronic products.
  • Some flame-retardant materials exhibit flame-retardant properties by subjecting a non-flame-retardant material to a flame-retardant treatment such as adding a flame-retardant imparting agent.
  • phosphorus-based compounds such as sodium phosphate and boron-based compounds such as boron are widely used as flame-retardant imparting agents.
  • phosphoric acid-based and boron-based flame retardant-imparting agents tend to be soluble in water as a whole, and it is difficult to keep the amount required to suppress combustion in the material for a long period of time. There is a tendency, and long-term maintenance of flame retardancy becomes an issue.
  • the phenomenon of white flowers in which crystals are deposited on the surface of the material due to exposure of wood injected with these flame retardant agents to high humidity environment or rain is recognized as a serious problem in the construction industry. There is.
  • Patent Document 1 discloses a flame retardant agent comprising an aqueous solution containing a boron-based flame retardant-imparting component and a polysiloxane compound.
  • white flowers are suppressed by the elution prevention effect due to the immobilization of boron in the polysiloxane network.
  • the flame-retardant imparting agent used conventionally has metal corrosiveness.
  • a phosphate-based borate agent corrodes stainless steel.
  • the present invention is a novel flame-retardant material which has a property of being difficult to dissolve in water, does not have toxicity and metal corrosiveness, and is treated with a biodegradable flame-retardant-imparting agent, and a method for producing the same.
  • the purpose is to provide.
  • the present inventors have previously invented a flame retardant-imparting agent containing modified fibroin as an active ingredient, and proved that a knitted fabric knitted with modified fibroin fiber has excellent flame retardancy, and imparted this flame retardancy. It has been proposed that an article having excellent flame retardancy can be provided by producing an article by using the agent alone or by mixing it with another material (Japanese Patent Laid-Open No. 2020-05805).
  • a flame retardant-imparting agent typified by modified fibroin can be used more effectively. That is, among the proteins as flame-retardant imparting agents, a material impregnated with a flame-retardant and sparingly soluble protein or coated with a flame-retardant and sparingly soluble protein exhibits excellent flame retardancy and is difficult to burn. Since it is soluble, elution due to high humidity environment or rain is suppressed, and thus it has been found that it has an advantage of not causing whitening, and the present invention has been completed.
  • the present invention relates to, for example, the following inventions.
  • a flame-retardant material obtained by impregnating a raw material with one or more flame-retardant and sparingly soluble proteins and / or coating the surface of the raw material with one or more flame-retardant and sparingly soluble proteins.
  • the content of the protein after immersing the flame-retardant material in water for 24 hours is maintained at 50% or more by mass ratio as compared with the content of the protein in the flame-retardant material before immersion.
  • [4] The flame-retardant material according to any one of [1] to [3], wherein the critical oxygen index (LOI) value of the protein is 26 or more.
  • LOI critical oxygen index
  • [5] The flame-retardant material according to any one of [1] to [4], wherein the raw material is a cellulose material.
  • [6] The flame-retardant material according to any one of [1] to [5], wherein the raw material is a building material or a construction material.
  • [7] The flame-retardant material according to any one of [1] to [6], wherein the protein is a structural protein.
  • [8] The flame-retardant material according to any one of [1] to [7], wherein the protein is modified fibroin or soybean protein.
  • the flame-retardant material according to any one of [1] to [12], wherein the protein has a molecular weight of 100 kDa or less.
  • a method for producing a protein-containing material which comprises a step of coating and forming a protein-containing portion on the surface of the raw material.
  • the production method according to [14], wherein the protein-containing material is a flame-retardant material.
  • [16] The content of the protein after the protein-containing material is immersed in water for 24 hours is maintained at 50% or more by mass ratio as compared with the content of the protein in the protein-containing material before immersion [14].
  • the production method according to [15]. [17] The production method according to any one of [14] to [16], wherein the protein-containing liquid is an aqueous solution containing one or more of the above-mentioned flame-retardant and sparingly soluble proteins. [18] The production method according to any one of [14] to [17], wherein the protein is an isolated, purified or synthesized protein. [19] The production method according to any one of [14] to [18], wherein the critical oxygen index (LOI) value of the protein is 26 or more.
  • LOI critical oxygen index
  • the flame-retardant material of the present invention exhibits excellent flame retardancy by using a biodegradable, flame-retardant and soluble-resistant protein (flame-retardant imparting agent), while biodegrading the material. It does not impair sex. Further, the flame-retardant material of the present invention is impregnated or coated with a flame-retardant and sparingly soluble protein, so that the protein as a flame-retardant-imparting agent can be dissolved even in a high humidity environment such as summer or high temperature. Since it is difficult to put out, it is possible to provide a material that can maintain flame retardancy for a long period of time. Therefore, it is not necessary to add a whitening inhibitor to prevent the flame retardant-imparting agent from leaching out, and cost reduction in terms of process and cost can be expected.
  • a biodegradable, flame-retardant and soluble-resistant protein flame-retardant imparting agent
  • a flame-retardant imparting agent is eluted from a raw material due to dissolution in water by impregnating or coating the material with a poorly water-soluble protein at normal temperature and pressure. Can be suppressed. Therefore, the flame retardancy is stably maintained for a longer period of time.
  • the flame-retardant material of the present invention impregnates a raw material with one or more flame-retardant and sparingly soluble proteins and / or coats the surface of the raw material with one or more flame-retardant and sparingly soluble proteins. It is a material that has been used.
  • the flame-retardant and sparingly soluble protein refers to a protein that is flame-retardant and water-resistant at normal temperature and pressure, and imparts flame retardancy to the raw material. It may also be called a flammable agent.
  • flame retardancy means the property of "hard to burn” that resists combustion, and measures the combustion rate of the material and the oxygen index (when the material is burned in an environment where the oxygen concentration is changed). It can be evaluated by measuring the minimum oxygen concentration at which combustion lasts), measuring the total calorific value obtained in the exothermic test, and measuring the mass change of the material before and after exposure to high temperature.
  • the normal pressure means 1 atm the normal temperature means 25 ° C.
  • the poorly water-soluble means having a solubility of less than 1 g / L in water.
  • the protein which is the flame retardant-imparting agent according to the present embodiment is a protein isolated, purified or synthesized because the degree of flame retardancy may decrease due to the inclusion of flammable impurities. Is desirable. Further, it is preferably a recombinant protein that can be mass-produced by a cell engineering technique, and more preferably a purified recombinant protein.
  • the recombinant protein may be a natural protein or a modified protein, and a modified protein that can have a variation in structure in order to obtain a flame retardant effect is more preferable. Further, the protein may be chemically modified and may be a copolymer with another material.
  • the poorly soluble protein imparted to the raw material may be one kind or a combination of two or more kinds.
  • the critical oxygen index (LOI) value of the protein according to the present embodiment may be 18 or more, 20 or more, 22 or more, 24 or more, or 26 or more. It may be 27 or more, 28 or more, 29 or more, or 30 or more.
  • the LOI value is a value measured in accordance with the test method of powder granules or synthetic resin having a low melting point on May 31, 1995, Fire and Disaster Management Agency Dangerous Goods Regulation Division Manager Fire Danger No. 50.
  • the protein according to this embodiment is poorly water-soluble at normal temperature and pressure, but at a temperature of 100 ° C. or higher and / or a pressure of 1 atm (0.101 MPa) or higher, for example, 0.102 MPa or higher, 0. It is preferably water-soluble at pressures of 106 MPa or more, 0.110 MPa or more, 0.150 MPa or more, 0.200 MPa or more, and 0.500 MPa or more.
  • Water solubility means a solubility of 1 g / L or more.
  • the numerical value of pressure means the value of absolute pressure, and is the sum of the pressure of the environment such as atmospheric pressure and the pressure intentionally applied.
  • the pressure measurement was performed in an environment of 1 atm. In an environment of 1 atm, the pressure value when no pressure is intentionally applied is 0.101 MPa.
  • the type of poorly soluble protein according to this embodiment is not particularly limited. It may be a functional protein typified by an enzyme, and is a structural protein intended to maintain the structure of an organism such as poorly water-soluble collagen, soybean protein, keratin, elastin and other animal and plant proteins, and fibroin. You may. From the viewpoint of contributing to the improvement of the strength of the raw material itself by introducing it into the raw material, it is preferably a structural protein, and more preferably a modified structural protein.
  • the sparingly soluble structural protein examples include sparingly water-soluble fibroin, sparingly water-soluble collagen, resilin, elastin and keratin, and proteins or protein derivatives derived from these, and are particularly excellent in flame retardancy (LOI) compared to other proteins.
  • Modified fibroin which has a high value) and has a low solubility in water at normal pressure, is preferable.
  • the molecular weight of the poorly soluble protein is preferably 100 kDa or less, and more preferably 50 kDa or less from the viewpoint of easy introduction depending on the material.
  • the protein derivative include those in which a substituent is introduced into the side chain of the protein, those in which the protein chain is crosslinked, and the like.
  • the modified fibroin has a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m or the formula 2: [(A) n motif-REP] m- (A) n motif. It is a protein contained.
  • the modified fibroin may further have an amino acid sequence (N-terminal sequence and C-terminal sequence) added to either or both of the N-terminal side and the C-terminal side of the domain sequence.
  • the N-terminal sequence and the C-terminal sequence are not limited to this, but are typically regions that do not have the repetition of the amino acid motif characteristic of fibroin, and consist of about 100 residues of amino acids.
  • modified fibroin means artificially produced fibroin (artificial fibroin).
  • the modified fibroin may be a fibroin whose domain sequence is different from the amino acid sequence of the naturally occurring fibroin, or may be a fibroin having the same amino acid sequence as the naturally occurring fibroin.
  • “Naturally derived fibroin” as used herein is also represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m or the formula 2: [(A) n motif-REP] m- (A) n motif. It is a protein containing the domain sequence to be used.
  • modified fibroin may be one in which the amino acid sequence of naturally-derived fibroin is used as it is, or one in which the amino acid sequence is modified based on the amino acid sequence of naturally-derived fibroin (for example, cloned naturally-derived). It may be a product in which the amino acid sequence is modified by modifying the gene sequence of fibroin, or an artificially designed and synthesized product (for example, a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence) regardless of naturally occurring fibroin. It may have a desired amino acid sequence by chemical synthesis).
  • domain sequence refers to a fibroin-specific crystalline region (typically corresponding to (A) n motif of amino acid sequence) and an amorphous region (typically, REP of amino acid sequence).
  • An amino acid sequence that produces (corresponding to.)) which is represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m or the formula 2: [(A) n motif-REP] m- (A) n motif.
  • the (A) n motif shows an amino acid sequence mainly composed of alanine residues, and the number of amino acid residues is 2 to 27.
  • the number of amino acid residues of the n motif may be an integer of 2 to 20, 4 to 27, 4 to 20, 8 to 20, 10 to 20, 4 to 16, 8 to 16, or 10 to 16. .
  • the ratio of the number of alanine residues to the total number of amino acid residues in the n motif may be 40% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 83% or more, 85% or more, It may be 86% or more, 90% or more, 95% or more, or 100% (meaning that it is composed of only alanine residues).
  • a plurality of (A) n motifs present in the domain sequence may be composed of at least seven alanine residues only.
  • REP shows an amino acid sequence consisting of 2-200 amino acid residues.
  • REP may be an amino acid sequence composed of 10 to 200 amino acid residues.
  • m represents an integer of 2 to 300 and may be an integer of 10 to 300.
  • the plurality of (A) n motifs may have the same amino acid sequence or different amino acid sequences.
  • the plurality of REPs may have the same amino acid sequence or different amino acid sequences.
  • the modified fibroin according to the present embodiment is, for example, an amino acid sequence corresponding to, for example, substitution, deletion, insertion and / or addition of one or more amino acid residues to the cloned naturally occurring fibroin gene sequence. It can be obtained by modifying. Substitution, deletion, insertion and / or addition of amino acid residues can be carried out by methods well known to those skilled in the art such as partial mutagenesis. Specifically, Nucleic Acid Res. It can be carried out according to the method described in the literature such as 10, 6487 (1982), Methods in Enzymology, 100, 448 (1983).
  • Naturally-derived fibroin is a protein containing a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m or the formula 2: [(A) n motif-REP] m- (A) n motif. Yes, specifically, for example, fibroin produced by insects or spiders.
  • fibroins produced by insects include Bombyx mori, Bombyx mandarina, Antheraea yamamai, Anteraea perni, tussah, and tussah. ), Silk moth (Samia synthia), Chrysanthemum (Caligra japonica), Chusser silk moth (Antheraea mylitta), Muga silk moth (Antheraea assama), etc. Hornet silk protein can be mentioned.
  • fibroin produced by insects include silk moth fibroin L chain (GenBank accession number M76430 (base sequence) and AAA27840.1 (amino acid sequence)).
  • fibroins produced by spiders include spiders belonging to the genus Araneus such as spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders,
  • Spiders belonging to (Gasteracantha genus), spiders belonging to the genus Isekigumo (genus Ordgarius) such as Mameitaisekigumo and Mutsutogaysekigumo, spiders belonging to the genus Koganegumo, Kogatakoganegumo and Nagakoganegumo, etc.
  • Spider silk protein can be mentioned.
  • examples of the spider silk protein include traction thread proteins such as MaSp (MaSp1 and MaSp2) and ADF (ADF3 and ADF4), MiSp (MiSp1 and MiSp2), and the like.
  • spider silk proteins produced by spiders include, for example, fibroin-3 (aff-3) [derived from Araneus diadematus] (GenBank accession numbers AAC47010 (amino acid sequence), U47855 (nucleic acid sequence)). fibroin-4 (aff-4) [derived from Araneus diadematus] (GenBank accession number AAC47011 (amino acid sequence), U47856 (nucleic acid sequence)), dragline silk protein spidroin 1 [from Nephila clavipes] (GenBank sequence No.
  • AAC4701 ), U37520 (nucleic acid sequence)), major aggregate protein 1 [derived from Laterectus hesperus] (GenBank accession number ABR68856 (nucleic acid sequence), EF595246 (nucleic acid sequence)), dragline silk protein (derived from nuclear protein2) No.
  • AAL32472 nucleic acid sequence
  • AF441245 nucleic acid sequence
  • major protein spidroin 1 [derived from Europe protein australis]
  • GenBank accession number CAJ00428 nucleotide sequence
  • AJ973155 nucleus acid sequence
  • major protein GeneBank accession number CAM32249.1 (nucleic acid sequence), AM490169 (base sequence)
  • minor aggregate silk protein 1 [Nephila protein]
  • GenBank accession number AAC14589.1 amino acid sequence
  • minor amplifier Clavipes GeneBank accession number AAC14591.1 (amino acid sequence)
  • minor amplify speedin-like protein [Nefilengys proteina] (GenBank accession number ABR3728.1 (amino acid sequence), etc.
  • fibroin whose sequence information is registered in NCBI GenBank can be mentioned.
  • sequence information registered in NCBI GenBank among the sequences containing INV as DIVISION, spidroin, amplifier, fibroin, "silk and protein", or “silk and protein” are described as keywords in DEFINITION. It can be confirmed by extracting a sequence, a character string of a specific protein from CDS, and a sequence in which a specific character string is described in TISSUE TYPE from SOURCE.
  • the modified fibroin according to the present embodiment may be modified silk fibroin (modified amino acid sequence of silk protein produced by silkworm), or modified spider silk fibroin (spider silk protein produced by spiders). It may be a modified amino acid sequence).
  • modified spider silk fibroin is preferable because it is more excellent in flame retardancy.
  • modified fibroin examples include modified fibroin (first modified fibroin) derived from the large spitting tube bookmarker thread protein produced in the large bottle-shaped gland of spiders, and a domain sequence with a reduced content of glycine residues.
  • a modified fibroin having a reduced domain sequence can be mentioned.
  • the first modified fibroin examples include proteins containing a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m.
  • the number of amino acid residues of the (A) n motif is preferably an integer of 3 to 20, more preferably an integer of 4 to 20, even more preferably an integer of 8 to 20, and an integer of 10 to 20. Is even more preferable, an integer of 4 to 16 is even more preferable, an integer of 8 to 16 is particularly preferable, and an integer of 10 to 16 is most preferable.
  • the number of amino acid residues constituting REP in the formula 1 is preferably 10 to 200 residues, more preferably 10 to 150 residues, and 20 to 100 residues.
  • the total number of residues of glycine residue, serine residue and alanine residue contained in the amino acid sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m is the amino acid residue. It is preferably 40% or more, more preferably 60% or more, and further preferably 70% or more with respect to the total number.
  • the first modified fibroin contains the unit of the amino acid sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m , and the C-terminal sequence is the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 3 or It may be a polypeptide having an amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 3.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the same as the amino acid sequence consisting of 50 residues at the C-terminal of the amino acid sequence of ADF3 (GI: 1263287, NCBI), and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is a sequence. It is the same as the amino acid sequence in which 20 residues were removed from the C end of the amino acid sequence shown in No. 1, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 was obtained by removing 29 residues from the C end of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. It has the same amino acid sequence.
  • the amino acid sequence shown in (1-i) SEQ ID NO: 4 (recombinant spider silk protein ADF3 KaiLargeNRSH1), or the amino acid sequence shown in (1-ii) SEQ ID NO: 4 and 90
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 4 is the first to the amino acid sequence of ADF3 in which the amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) consisting of the starting codon, His10 tag and the HRV3C protease (Human rhinovirus 3C protease) recognition site is added to the N-terminal.
  • the 13th repeat region is increased approximately twice and mutated so that the translation terminates at the 1154th amino acid residue.
  • the amino acid sequence at the C-terminal of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is the same as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • the modified fibroin of (1-i) may consist of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • the second modified fibroin has an amino acid sequence whose domain sequence has a reduced content of glycine residues as compared with naturally occurring fibroin. It can be said that the second modified fibroin has an amino acid sequence corresponding to at least one or more glycine residues in REP replaced with another amino acid residue as compared with naturally occurring fibroin. ..
  • the second modified fibroin has a domain sequence of GGX and GPGXX in REP as compared with naturally occurring fibroin (where G is a glycine residue, P is a proline residue, and X is an amino acid residue other than glycine. In at least one motif sequence selected from), it has an amino acid sequence corresponding to at least one or a plurality of glycine residues in the motif sequence being replaced with another amino acid residue. You may.
  • the ratio of the motif sequence in which the above-mentioned glycine residue is replaced with another amino acid residue may be 10% or more of the total motif sequence.
  • the second modified fibroin contains a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m , and is located closest to the C-terminal side of the domain sequence (A) from the n motif to the above domain sequence.
  • the total number of amino acid residues in the amino acid sequence consisting of XGX (where X indicates amino acid residues other than glycine) contained in all REPs in the sequence excluding the sequence up to the C-terminal of is z, and the above domain sequence.
  • the number of alanine residues with respect to the total number of amino acid residues in the n motif may be 83% or more, preferably 86% or more, more preferably 90% or more, and 95% or more. It is even more preferably 100% (meaning that it is composed of only alanine residues).
  • the second modified fibroin is preferably one in which the content ratio of the amino acid sequence consisting of XGX is increased by substituting one glycine residue of the GGX motif with another amino acid residue.
  • the content ratio of the amino acid sequence consisting of GGX in the domain sequence is preferably 30% or less, more preferably 20% or less, further preferably 10% or less, 6 % Or less is even more preferable, 4% or less is even more preferable, and 2% or less is particularly preferable.
  • the content ratio of the amino acid sequence consisting of GGX in the domain sequence can be calculated by the same method as the method for calculating the content ratio (z / w) of the amino acid sequence consisting of XGX below.
  • fibroin modified fibroin or naturally-derived fibroin
  • domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m it is located most on the C-terminal side from the domain sequence (A) n.
  • the amino acid sequence consisting of XGX is extracted from all REPs contained in the sequence excluding the sequence from the motif to the C end of the domain sequence.
  • z / w (%) can be calculated by dividing z by w.
  • z / w in naturally derived fibroin will be described.
  • 663 types of fibroin (of which 415 types were derived from spiders) were extracted.
  • Naturally-derived fibroin containing the domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m among all the extracted fibroins and having an amino acid sequence consisting of GGX in the fibroin of 6% or less.
  • z / w was calculated by the above-mentioned calculation method. The result is shown in FIG.
  • the horizontal axis of FIG. 2 indicates z / w (%), and the vertical axis indicates frequency.
  • the z / w in naturally-derived fibroin is less than 50.9% (the highest is 50.86%).
  • z / w is preferably 50.9% or more, more preferably 56.1% or more, further preferably 58.7% or more, and 70% or more. Is even more preferable, and 80% or more is even more preferable.
  • the upper limit of z / w is not particularly limited, but may be, for example, 95% or less.
  • the second modified fibroin is, for example, modified from the cloned naturally occurring fibroin gene sequence so as to encode another amino acid residue by substituting at least a part of the base sequence encoding the glycine residue.
  • one glycine residue in the GGX motif and the GPGXX motif may be selected as the glycine residue to be modified, or may be replaced so that z / w is 50.9% or more. It can also be obtained, for example, by designing an amino acid sequence satisfying the above embodiment from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin and chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence.
  • one or more amino acid residues are further substituted or deleted.
  • Insertion and / or modification of the amino acid sequence corresponding to the addition may be performed.
  • the other amino acid residue described above is not particularly limited as long as it is an amino acid residue other than the glycine residue, but is a valine (V) residue, a leucine (L) residue, an isoleucine (I) residue, and methionine ( Hydrophobic amino acid residues such as M) residue, proline (P) residue, phenylalanine (F) residue and tryptophan (W) residue, glutamine (Q) residue, asparagine (N) residue, serine (S) ) Residues, hydrophilic amino acid residues such as lysine (K) residue and glutamate (E) residue are preferred, valine (V) residue, leucine (L) residue, isoleucine (I) residue, phenylalanine ( F) residues and glutamine (Q) residues are more preferred, and glutamine (Q) residues are even more preferred.
  • (2-i) SEQ ID NO: 6 (Met-PRT380), SEQ ID NO: 7 (Met-PRT410), SEQ ID NO: 8 (Met-PRT525) or SEQ ID NO: 9 (Met) - contains an amino acid sequence represented by PRT799) or an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by (2-ii) SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9.
  • Modified fibroin can be mentioned.
  • the modified fibroin of (2-i) will be described.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 is obtained by substituting GQX for all GGX in the REP of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 (Met-PRT313) corresponding to naturally occurring fibroin.
  • every two (A) n motifs are deleted from the N-terminal side to the C-terminal side from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, and the amino acid sequence is further before the C-terminal sequence.
  • One [(A) n motif-REP] is inserted in.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 two alanine residues are inserted on the C-terminal side of each (A) n motif of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, and some glutamine (Q) residues are further added. It is substituted with a serine (S) residue and a part of the amino acid on the C-terminal side is deleted so as to have substantially the same molecular weight as that of SEQ ID NO: 7.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 is a region of 20 domain sequences existing in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 (however, several amino acid residues on the C-terminal side of the region are substituted). A predetermined hinge sequence and His tag sequence are added to the C-terminal of the sequence obtained by repeating the above four times.
  • the value of z / w in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 (corresponding to naturally occurring fibroin) is 46.8%.
  • the z / w values in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 are 58.7%, respectively. It is 70.1%, 66.1% and 70.0%.
  • x / y in the jagged ratio (described later) of 1: 1.8 to 11.3 of the amino acid sequences shown by SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 is They are 15.0%, 15.0%, 93.4%, 92.7% and 89.8%, respectively.
  • the modified fibroin of (2-i) may consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9.
  • the modified fibroin of (2-ii) contains an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9.
  • the modified fibroin of (2-ii) is also a protein containing a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m.
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the modified fibroin of (2-ii) has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9, and is contained in REP.
  • X indicates an amino acid residue other than glycine.
  • the second modified fibroin may contain a tag sequence at either or both of the N-terminus and the C-terminus. This enables isolation, immobilization, detection, visualization and the like of modified fibroin.
  • an affinity tag using specific affinity (binding, affinity) with other molecules can be mentioned.
  • affinity tag a histidine tag (His tag)
  • His tag is a short peptide in which about 4 to 10 histidine residues are lined up, and has the property of specifically binding to metal ions such as nickel. Therefore, isolation of modified fibroin by metal chelating chromatography (chromatography) is performed. Can be used for.
  • Specific examples of the tag sequence include the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 (amino acid sequence including His tag sequence and hinge sequence).
  • tag sequences such as glutathione-S-transferase (GST) that specifically binds to glutathione and maltose-binding protein (MBP) that specifically binds to maltose.
  • GST glutathione-S-transferase
  • MBP maltose-binding protein
  • an "epitope tag” that utilizes an antigen-antibody reaction can also be used.
  • an antigenic peptide epitope
  • an antibody against the epitope can be bound.
  • the epitope tag include HA (peptide sequence of hemagglutinin of influenza virus) tag, myc tag, FLAG tag and the like.
  • a tag sequence that can be separated by a specific protease can also be used.
  • the modified fibroin from which the tag sequence has been separated can also be recovered.
  • the modified fibroin containing the tag sequence the amino acids represented by (2-iii) SEQ ID NO: 12 (PRT380), SEQ ID NO: 13 (PRT410), SEQ ID NO: 14 (PRT525) or SEQ ID NO: 15 (PRT799).
  • Examples thereof include a modified fibroin containing a sequence or an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in (2-iv) SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15. ..
  • amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 16 (PRT313), SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 are represented by SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9, respectively.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 11 (including His tag sequence and hinge sequence) is added to the N-terminal of the indicated amino acid sequence.
  • the modified fibroin of (2-iii) may consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15.
  • the modified fibroin of (2-iv) comprises an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15.
  • the modified fibroin of (2-iv) is also a protein containing the domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m.
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the modified fibroin of (2-iv) has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15 and is contained in REP.
  • X indicates an amino acid residue other than glycine.
  • the second modified fibroin may contain a secretory signal for releasing the protein produced in the recombinant protein production system to the outside of the host.
  • the sequence of the secretory signal can be appropriately set according to the type of host.
  • the third modified fibroin has an amino acid sequence whose domain sequence has a reduced content of (A) n motifs as compared to naturally occurring fibroin. It can be said that the domain sequence of the third modified fibroin has an amino acid sequence corresponding to the deletion of at least one or more (A) n motifs as compared with naturally occurring fibroin.
  • the third modified fibroin may have an amino acid sequence corresponding to a 10-40% deletion of the (A) n motif from naturally occurring fibroin.
  • the third modification fibroin its domain sequence, compared to the naturally occurring fibroin, at least from the N-terminal side toward the C-terminal one to three (A) n motif every one (A) n motif It may have an amino acid sequence corresponding to the deletion of.
  • the third modified fibroin has a domain sequence of at least two consecutive (A) n- motif deletions and one (A) from the N-terminal side to the C-terminal side as compared to naturally occurring fibroin. ) It may have an amino acid sequence corresponding to the deletion of the n-motif being repeated in this order.
  • the third modified fibroin may have an amino acid sequence corresponding to the deletion of the (A) n motif at least every other two domain sequences from the N-terminal side to the C-terminal side. ..
  • the third modified fibroin contains a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m , and two adjacent [(A) n motifs from the N-terminal side to the C-terminal side.
  • -REP The number of amino acid residues in the REP of the unit is sequentially compared, and when the number of amino acid residues in the REP having a small number of amino acid residues is 1, the ratio of the number of amino acid residues in the other REP is 1.8 to When x is the maximum value of the sum of the number of amino acid residues of two adjacent [(A) n motif-REP] units, which is 11.3, and y is the total number of amino acid residues in the domain sequence.
  • the number of alanine residues with respect to the total number of amino acid residues in the n motif may be 83% or more, preferably 86% or more, more preferably 90% or more, and 95% or more. It is even more preferably 100% (meaning that it is composed of only alanine residues).
  • FIG. 1 shows a domain sequence obtained by removing the N-terminal sequence and the C-terminal sequence from the modified fibroin. From the N-terminal side (left side), the domain sequence consists of (A) n motif-first REP (50 amino acid residues)-(A) n motif-second REP (100 amino acid residues)-(A) n. Motif-Third REP (10 amino acid residues)-(A) n Motif-Fourth REP (20 amino acid residues)-(A) n Motif-Fifth REP (30 amino acid residues)-(A) It has an arrangement called n motifs.
  • Two adjacent [(A) n motif-REP] units are sequentially selected from the N-terminal side toward the C-terminal side so as not to overlap. At this time, there may be a [(A) n motif-REP] unit that is not selected.
  • pattern 1 (comparison between the first REP and the second REP and comparison between the third REP and the fourth REP)
  • pattern 2 (comparison between the first REP and the second REP, and a comparison).
  • 4th REP and 5th REP comparison Pattern 3 (2nd REP and 3rd REP comparison, and 4th REP and 5th REP comparison
  • Pattern 4 (1st REP and (Comparison of the second REP) is shown. There are other selection methods.
  • the number of amino acid residues of each REP in two adjacent [(A) n motif-REP] units selected is compared.
  • each pattern add up the total number of amino acid residues of the two adjacent [(A) n motif-REP] units shown by the solid line (not only REP, but also the number of amino acid residues of (A) n motif. be.). Then, the total values added are compared, and the total value (maximum value of the total value) of the pattern in which the total value is maximized is defined as x. In the example shown in FIG. 1, the total value of pattern 1 is the maximum.
  • x / y (%) can be calculated by dividing x by the total number of amino acid residues y in the domain sequence.
  • x / y is preferably 50% or more, more preferably 60% or more, further preferably 65% or more, still more preferably 70% or more. It is preferably 75% or more, even more preferably 80% or more, and particularly preferably 80% or more.
  • the upper limit of x / y is not particularly limited and may be, for example, 100% or less.
  • x / y is preferably 89.6% or more, and when the jagged ratio is 1: 1.8 to 3.4, x.
  • / Y is preferably 77.1% or more, and when the jagged ratio is 1: 1.9 to 8.4, x / y is preferably 75.9% or more, and the jagged ratio is 1. In the case of 1.9 to 4.1, x / y is preferably 64.2% or more.
  • the third modified fibroin is a modified fibroin in which at least 7 of the (A) n motifs present in the domain sequence are composed only of alanine residues
  • the x / y is 46.4% or more. Is more preferable, 50% or more is more preferable, 55% or more is further preferable, 60% or more is further more preferable, 70% or more is even more preferable, and 80% or more. It is particularly preferable to have.
  • the upper limit of x / y is not particularly limited and may be 100% or less.
  • the horizontal axis of FIG. 3 indicates x / y (%), and the vertical axis indicates frequency.
  • the x / y of naturally occurring fibroin is less than 64.2% (the highest is 64.14%).
  • the third modified fibroin deletes one or more of the sequences encoding the (A) n motif from the cloned naturally occurring fibroin gene sequence so that x / y is 64.2% or more.
  • an amino acid sequence corresponding to the deletion of one or more (A) n motifs so that x / y is 64.2% or more is designed and designed from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin. It can also be obtained by chemically synthesizing a nucleic acid encoding the amino acid sequence.
  • amino acid residues are further substituted, deleted, inserted and / or added.
  • the amino acid sequence corresponding to the above may be modified.
  • 3-i) SEQ ID NO: 17 (Met-PRT399), SEQ ID NO: 7 (Met-PRT410), SEQ ID NO: 8 (Met-PRT525) or SEQ ID NO: 9 (Met) contains an amino acid sequence represented by PRT799) or an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by (3-ii) SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9.
  • Modified fibroin can be mentioned.
  • the modified fibroin of (3-i) will be described.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 17 is from the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 10 (Met-PRT313) corresponding to naturally occurring fibroin, every other (A) n from the N-terminal side to the C-terminal side.
  • the motif is deleted, and one [(A) n motif-REP] is inserted in front of the C-terminal sequence.
  • the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 is as described in the second modified fibroin.
  • the value of x / y in the jagged ratio of 1: 1.8 to 11.3 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 is 15.0%.
  • the value of x / y in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17 and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 is 93.4%.
  • the value of x / y in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 is 92.7%.
  • the value of x / y in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 is 89.8%.
  • the modified fibroin of (3-i) may consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9.
  • the modified fibroin of (3-ii) contains an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9.
  • the modified fibroin of (3-ii) is also a protein containing a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m.
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the modified fibroin of (3-ii) has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9, and is N-terminal to C-terminal.
  • the number of amino acid residues of REP of two adjacent [(A) n motif-REP] units is sequentially compared and the number of amino acid residues of REP having a small number of amino acid residues is 1, the other
  • x / y is preferably 64.2% or more.
  • the third modified fibroin may contain the above-mentioned tag sequence at either or both of the N-terminal and the C-terminal.
  • modified fibroin containing the tag sequence the amino acids represented by (3-iii) SEQ ID NO: 18 (PRT399), SEQ ID NO: 13 (PRT410), SEQ ID NO: 14 (PRT525) or SEQ ID NO: 15 (PRT799).
  • modified fibroins comprising a sequence or an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in (3-iv) SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15. ..
  • amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 are the N-terminals of the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9, respectively.
  • the amino acid sequence shown by (including His tag sequence and hinge sequence) is added.
  • the modified fibroin of (3-iii) may consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15.
  • the modified fibroin of (3-iv) comprises an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15.
  • the modified fibroin of (3-iv) is also a protein containing the domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m.
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the modified fibroin of (3-iv) has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15, and is N-terminal to C-terminal.
  • the number of amino acid residues of REP of two adjacent [(A) n motif-REP] units is sequentially compared and the number of amino acid residues of REP having a small number of amino acid residues is 1, the other Let x be the maximum value of the total value of the sum of the number of amino acid residues of two adjacent [(A) n motif-REP] units in which the ratio of the number of amino acid residues in REP is 1.8 to 11.3.
  • x / y is preferably 64.2% or more.
  • the third modified fibroin may contain a secretory signal for releasing the protein produced in the recombinant protein production system to the outside of the host.
  • the sequence of the secretory signal can be appropriately set according to the type of host.
  • the fourth modified fibroin has an amino acid sequence whose domain sequence has a reduced content of (A) n motifs and a reduced content of glycine residues as compared with naturally occurring fibroin.
  • the domain sequence of the fourth modified fibroin lacked at least one or more (A) n motifs as compared to naturally occurring fibroin, plus at least one or more glycine residues in the REP. It can be said that it has an amino acid sequence corresponding to being substituted with another amino acid residue. That is, the fourth modified fibroin is a modified fibroin having the characteristics of the above-mentioned second modified fibroin and the third modified fibroin. Specific aspects and the like are as described in the second modified fibroin and the third modified fibroin.
  • the fourth modified fibroin (4-i) SEQ ID NO: 7 (Met-PRT410), SEQ ID NO: 8 (Met-PRT525), SEQ ID NO: 9 (Met-PRT799), SEQ ID NO: 13 (PRT410) ), The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 (PRT525) or SEQ ID NO: 15 (PRT799), or (4-ii) SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15
  • modified fibroins containing an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by Specific embodiments of the modified fibroin comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15 are as described above.
  • the fifth modified fibroin had one or more amino acid residues in the REP replaced with amino acid residues having a higher hydrophobicity index than the naturally occurring fibroin in its domain sequence, and / or REP. It may have an amino acid sequence containing a region having a large hydrophobic index locally, which corresponds to the insertion of one or a plurality of amino acid residues having a large hydrophobic index.
  • the region having a locally large hydrophobicity index is composed of consecutive 2 to 4 amino acid residues.
  • the amino acid residue having a large hydrophobicity index is an amino acid selected from isoleucine (I), valine (V), leucine (L), phenylalanine (F), cysteine (C), methionine (M) and alanine (A). It is more preferably a residue.
  • one or more amino acid residues in REP were replaced with amino acid residues having a higher hydrophobicity index as compared with naturally occurring fibroin, and / or one or more amino acid residues in REP.
  • one or more amino acid residues were substituted, deleted, inserted and / or added as compared with naturally occurring fibroin.
  • the fifth modified fibroin leaves one or more hydrophilic amino acid residues (for example, amino acid residues having a negative hydrophobicity index) in the REP from the cloned naturally occurring fibroin gene sequence. It can be obtained by substituting for a group (eg, an amino acid residue with a positive hydrophobicity index) and / or inserting one or more hydrophobic amino acid residues in the REP. Also, for example, one or more hydrophilic amino acid residues in the REP have been replaced with hydrophobic amino acid residues from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin, and / or one or more hydrophobic amino acid residues in the REP.
  • a group eg, an amino acid residue with a positive hydrophobicity index
  • one or more hydrophilic amino acid residues in the REP have been replaced with hydrophobic amino acid residues from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin, and / or one or more hydrophobic amino acid residues in the REP.
  • an amino acid sequence corresponding to the insertion of and chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence In each case, one or more hydrophilic amino acid residues in the REP were replaced with hydrophobic amino acid residues from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin, and / or one or more hydrophobic amino acids in the REP.
  • the amino acid sequence corresponding to the substitution, deletion, insertion and / or addition of one or more amino acid residues may be further modified.
  • the fifth modified fibroin contains a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m , from the (A) n motif located closest to the C-terminal side to the C-terminal of the above domain sequence.
  • the total number of amino acid residues contained in the region where the average value of the hydrophobicity index of consecutive 4 amino acid residues is 2.6 or more is defined as p.
  • hydrophobicity index For the hydrophobicity index of amino acid residues, a known index (Hydropathy index: Kyte J, & Doolittle R (1982) "A single method for dispensing the hydropathic character of protein. 105-132) is used. Specifically, the hydrophobicity index (hydropathy index, hereinafter also referred to as “HI”) of each amino acid is as shown in Table 1 below.
  • sequence A [(A) n motif-REP] m.
  • the average value of the hydrophobicity index is obtained for all consecutive 4 amino acid residues (each amino acid residue is used to calculate the average value 1 to 4 times).
  • a region in which the average value of the hydrophobicity index of consecutive four amino acid residues is 2.6 or more is specified. Even if a certain amino acid residue corresponds to a plurality of "consecutive four amino acid residues having an average value of 2.6 or more of the hydrophobicity index", it should be included as one amino acid residue in the region. become.
  • the total number of amino acid residues contained in the region is p. Further, the total number of amino acid residues contained in the sequence A is q.
  • the average value of the hydrophobicity index of 4 consecutive amino acid residues is 2.
  • the hydrophobicity index of the consecutive four amino acid residues is present.
  • p / q is preferably 6.2% or more, more preferably 7% or more, further preferably 10% or more, and more preferably 20% or more. Even more preferably, it is even more preferably 30% or more.
  • the upper limit of p / q is not particularly limited, but may be, for example, 45% or less.
  • the fifth modified fibroin is, for example, one or more hydrophilic amino acid residues (eg, a hydrophobic index) in the REP so that the amino acid sequence of the cloned naturally occurring fibroin satisfies the above p / q condition.
  • Amino acid residue with a negative value is replaced with a hydrophobic amino acid residue (for example, an amino acid residue with a positive hydrophobicity index), and / or one or more hydrophobic amino acid residues are inserted in the REP.
  • a hydrophobic amino acid residue for example, an amino acid residue with a positive hydrophobicity index
  • an amino acid sequence satisfying the above p / q condition from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin and chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence.
  • one or more amino acid residues in the REP were replaced with amino acid residues with a higher hydrophobicity index compared to naturally occurring fibroin, and / or one or more amino acid residues in the REP.
  • the modification corresponding to the substitution, deletion, insertion and / or addition of one or more amino acid residues may be performed. ..
  • the amino acid residue having a large hydrophobicity index is not particularly limited, but isoleucine (I), valine (V), leucine (L), phenylalanine (F), cysteine (C), methionine (M) and alanine (A). ) Is preferable, and valine (V), leucine (L) and isoleucine (I) are more preferable.
  • the amino acid sequence set forth in (5-i) SEQ ID NO: 19 (Met-PRT720), SEQ ID NO: 20 (Met-PRT665) or SEQ ID NO: 21 (Met-PRT666) Alternatively, a modified fibroin containing (5-ii) an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21 can be mentioned.
  • the modified fibroin of (5-i) will be described.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19 consists of 3 amino acid residues in every other REP except for the domain sequence of the terminal on the C-terminal side with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 (Met-PRT410).
  • the amino acid sequence (VLI) is inserted at two locations, a part of the glutamine (Q) residue is replaced with a serine (S) residue, and a part of the amino acid on the C-terminal side is deleted.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 20 is the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 8 (Met-PRT525) with one amino acid sequence (VLI) consisting of 3 amino acid residues inserted every other REP. be.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21 is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 with two amino acid sequences (VLI) consisting of three amino acid residues inserted every other REP.
  • the modified fibroin of (5-i) may consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21.
  • the modified fibroin of (5-ii) comprises an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21.
  • the modified fibroin of (5-ii) is also a protein containing a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m.
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the modified fibroin of (5-ii) has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21, and is located most on the C-terminal side (A) n.
  • P / q is preferably 6.2% or more.
  • the fifth modified fibroin may contain a tag sequence at either or both of the N-terminus and the C-terminus.
  • modified fibroin comprising a tag sequence
  • a modified fibroin containing an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 24 can be mentioned.
  • amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 are the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 11 (His tag) at the N-terminal of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21, respectively. (Including array and hinge array) is added.
  • the modified fibroin of (5-iii) may consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 24.
  • the modified fibroin of (5-iv) comprises an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 24.
  • the modified fibroin of (5-iv) is also a protein containing the domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m.
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the modified fibroin of (5-iv) has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 24, and is located most on the C-terminal side (A) n.
  • P / q is preferably 6.2% or more.
  • the fifth modified fibroin may contain a secretory signal for releasing the protein produced in the recombinant protein production system to the outside of the host.
  • the sequence of the secretory signal can be appropriately set according to the type of host.
  • the sixth modified fibroin has an amino acid sequence in which the content of glutamine residues is reduced as compared with naturally occurring fibroin.
  • the sixth modified fibroin preferably contains at least one motif selected from the GGX motif and the GPGXX motif in the amino acid sequence of REP.
  • the content of the GPGXXX motif is usually 1% or more, may be 5% or more, and is preferably 10% or more.
  • the upper limit of the GPGXX motif content is not particularly limited and may be 50% or less, or 30% or less.
  • GPGXX motif content is a value calculated by the following method.
  • Formula 1 [(A) n- motif-REP] m
  • Formula 2 [(A) n- motif-REP] m-
  • Fibroin containing a domain sequence represented by n- motif (modified fibroin or naturally derived) In (fibroin), the number of GPGXX motifs contained in the region in all REPs included in the sequence excluding the sequence from the (A) n motif located closest to the C-terminal side to the C-terminal of the domain sequence from the domain sequence.
  • s be the number obtained by multiplying the total number by 3 (that is, corresponding to the total number of G and P in the GPGXX motif), and the sequence from the (A) n motif located closest to the C-terminal side to the C-terminal of the domain sequence is taken from the domain sequence.
  • the GPGXX motif content is calculated as s / t, where t is the total number of amino acid residues in all REPs excluding (A) n motifs.
  • the sequence obtained by excluding the sequence from the (A) n motif located on the most C-terminal side to the C-terminal of the domain sequence from the domain sequence is targeted at "the most C-terminal side".
  • the sequence from (A) n motif to the C-terminal of the domain sequence located in (A) may contain a sequence having a low correlation with the sequence characteristic of fibroin, and m is small. In this case (that is, when the domain sequence is short), it affects the calculation result of the GPGXX motif content, and this effect is eliminated.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing the domain sequence of modified fibroin.
  • the sixth modified fibroin has a glutamine residue content of preferably 9% or less, more preferably 7% or less, further preferably 4% or less, and particularly preferably 0%. ..
  • glucose residue content is a value calculated by the following method.
  • Formula 1 [(A) n- motif-REP] m
  • Formula 2 [(A) n- motif-REP] m-
  • all the sequences from the (A) n motif located closest to the C-terminal side to the C-terminal of the domain sequence are excluded from the domain sequence (the sequence corresponding to "region A" in FIG. 5).
  • the total number of glutamine residues contained in the region is u, and the sequence from the (A) n motif located most on the C-terminal side to the C-terminal of the domain sequence is removed from the domain sequence, and (A) n.
  • the glutamine residue content is calculated as u / t, where t is the total number of amino acid residues in all REPs excluding the motif.
  • t is the total number of amino acid residues in all REPs excluding the motif.
  • the sixth modified fibroin corresponds to its domain sequence being deleted from one or more glutamine residues in the REP or replaced with other amino acid residues as compared to naturally occurring fibroin. It may have an amino acid sequence.
  • the "other amino acid residue” may be an amino acid residue other than the glutamine residue, but is preferably an amino acid residue having a larger hydrophobicity index than the glutamine residue.
  • the hydrophobicity index of amino acid residues is as shown in Table 1.
  • amino acid residues having a larger hydrophobicity index than glutamine residues include isoleucine (I), valine (V), leucine (L), phenylalanine (F), cysteine (C), and methionine (M).
  • Amino acid residues selected from alanine (A), glycine (G), threonine (T), serine (S), tryptophan (W), tyrosine (Y), proline (P) and histidine (H). can.
  • amino acid residues selected from isoleucine (I), valine (V), leucine (L), phenylalanine (F), cysteine (C), methionine (M) and alanine (A) are more preferable.
  • Isoleucine (I), valine (V), leucine (L) and phenylalanine (F) are more preferably amino acid residues.
  • the sixth modified fibroin has a REP hydrophobicity of -0.8 or more, more preferably -0.7 or more, further preferably 0 or more, and 0.3 or more. Is even more preferable, and 0.4 or more is particularly preferable.
  • the upper limit of the hydrophobicity of REP is not particularly limited and may be 1.0 or less, or 0.7 or less.
  • hydrophilcity of REP is a value calculated by the following method.
  • Formula 1 [(A) n- motif-REP] m
  • Formula 2 [(A) n- motif-REP] m-
  • all the sequences from the (A) n motif located closest to the C-terminal side to the C-terminal of the domain sequence are excluded from the domain sequence (the sequence corresponding to "region A" in FIG. 5).
  • the sum of the hydrophobicity indexes of each amino acid residue in the region is v, and the sequence from the (A) n motif located most on the C-terminal side to the C-terminal of the domain sequence is removed from the domain sequence, and further ( A) The hydrophobicity of REP is calculated as v / t, where t is the total number of amino acid residues of all REPs excluding the n motif.
  • the reason for targeting is the above-mentioned reason. The same is true.
  • the sixth modified fibroin had its domain sequence deleted of one or more glutamine residues in REP as compared to naturally occurring fibroin, and / or one or more glutamine residues in REP.
  • modification corresponding to the replacement of one or more amino acid residues with other amino acid residues there may be further modification of the amino acid sequence corresponding to the substitution, deletion, insertion and / or addition of one or more amino acid residues. ..
  • the sixth modified fibroin deletes one or more glutamine residues in REP from the cloned naturally occurring fibroin gene sequence and / or removes one or more glutamine residues in REP. It can be obtained by substituting with the amino acid residue of. Also, for example, one or more glutamine residues in REP were deleted from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin, and / or one or more glutamine residues in REP were replaced with other amino acid residues. It can also be obtained by designing an amino acid sequence corresponding to this and chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence.
  • SEQ ID NO: 25 (Met-PRT888), SEQ ID NO: 26 (Met-PRT965), SEQ ID NO: 27 (Met-PRT889), SEQ ID NO: 28 (Met) -PRT916), SEQ ID NO: 29 (Met-PRT918), SEQ ID NO: 30 (Met-PRT699), SEQ ID NO: 31 (Met-PRT698), SEQ ID NO: 32 (Met-PRT966), SEQ ID NO: 41 (Met-PRT917) or SEQ ID NO: Modified fibroin containing the amino acid sequence represented by No.
  • the modified fibroin of (6-i) will be described.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 25 is obtained by substituting VL for all QQs in the amino acid sequence (Met-PRT410) shown in SEQ ID NO: 7.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26 is one in which all QQs in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 are replaced with TS, and the remaining Qs are replaced with A.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 27 is one in which all QQs in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 are replaced with VL, and the remaining Qs are replaced with I.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28 is one in which all QQs in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 are replaced with VI, and the remaining Qs are replaced with L.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 29 is one in which all QQs in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 are replaced with VF, and the remaining Qs are replaced with I.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30 is the one in which all the QQs in the amino acid sequence (Met-PRT525) shown in SEQ ID NO: 8 are replaced with VL.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31 is one in which all QQs in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 are replaced with VL, and the remaining Qs are replaced with I.
  • amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 41 and SEQ ID NO: 42 are all residual glutamine.
  • the group content is 9% or less (Table 2).
  • the modified fibroin of (6-i) has SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 41 or SEQ ID NO: 42. It may consist of the indicated amino acid sequence.
  • the modified fibroins of (6-ii) are in SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 41 or SEQ ID NO: 42. It contains an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the indicated amino acid sequence.
  • the modified fibroin of (6-ii) is also a domain represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m or the formula 2: [(A) n motif-REP] m- (A) n motif. It is a protein containing a sequence. The sequence identity is preferably 95% or more.
  • the modified fibroin of (6-ii) preferably has a glutamine residue content of 9% or less. Further, the modified fibroin of (6-ii) preferably has a GPGXX motif content of 10% or more.
  • the sixth modified fibroin may contain a tag sequence at either or both of the N-terminus and the C-terminus. This enables isolation, immobilization, detection, visualization and the like of modified fibroin.
  • modified fibroin containing the tag sequence (6-iii) SEQ ID NO: 33 (PRT888), SEQ ID NO: 34 (PRT965), SEQ ID NO: 35 (PRT889), SEQ ID NO: 36 (PRT916), SEQ ID NO: 37 (PRT918), Modified fibroin containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 38 (PRT699), SEQ ID NO: 39 (PRT698), SEQ ID NO: 40 (PRT966), SEQ ID NO: 43 (PRT917) or SEQ ID NO: 44 (PRT1028), or (PRT1028).
  • amino acid sequences shown by SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 43 and SEQ ID NO: 44 are, respectively, SEQ ID NO: 25. , SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 41 and SEQ ID NO: 42 shown by SEQ ID NO: 11 at the N-terminal of the amino acid sequence.
  • the amino acid sequence (including His tag sequence and hinge sequence) is added.
  • SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 43 and SEQ ID NO: 44 all have a glutamine residue content of 9% or less (Table 3).
  • the modified fibroins of (6-iii) are in SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 43 or SEQ ID NO: 44. It may consist of the indicated amino acid sequence.
  • the modified fibroins of (6-iv) are in SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 43 or SEQ ID NO: 44. It contains an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the indicated amino acid sequence.
  • the modified fibroin of (6-iv) is also a domain represented by formula 1: [(A) n motif-REP] m or formula 2: [(A) n motif-REP] m- (A) n motif. It is a protein containing a sequence. The sequence identity is preferably 95% or more.
  • the modified fibroin of (6-iv) preferably has a glutamine residue content of 9% or less. Further, the modified fibroin of (6-iv) preferably has a GPGXX motif content of 10% or more.
  • the sixth modified fibroin may contain a secretory signal for releasing the protein produced in the recombinant protein production system to the outside of the host.
  • the sequence of the secretory signal can be appropriately set according to the type of host.
  • the modified fibroin is at least two or more of the characteristics of the first modified fibroin, the second modified fibroin, the third modified fibroin, the fourth modified fibroin, the fifth modified fibroin, and the sixth modified fibroin. It may be a modified fibroin having the above-mentioned characteristics.
  • the modified fibroin is preferably hydrophilic modified fibroin because it is more excellent in flame retardancy.
  • hydrophilic modified fibroin is a value obtained by obtaining the total hydrophobicity index (HI) of all amino acid residues constituting the modified fibroin, and then dividing the total by the total number of amino acid residues. It is a modified fibroin having (average HI) of 0 or less.
  • the hydrophobicity index is as shown in Table 1.
  • modified fibroin having an average HI of more than 0 may be referred to as hydrophobic modified fibroin.
  • hydrophilic modified fibroin examples include the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 11, and SEQ ID NO: 14. Or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 7, amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9, amino acid represented by SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15.
  • modified fibroins comprising the amino acid sequence set forth in the sequence, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21.
  • hydrophobically modified fibroin examples include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 or SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 35.
  • modified fibroins comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 or SEQ ID NO: 44.
  • the modified fibroin is a host transformed with an expression vector having, for example, a nucleic acid sequence encoding the modified fibroin and one or more regulatory sequences operably linked to the nucleic acid sequence. Therefore, it can be produced by expressing the nucleic acid.
  • the method for producing the nucleic acid encoding the modified fibroin is not particularly limited.
  • the nucleic acid is produced by a method of amplifying and cloning by a polymerase chain reaction (PCR) or the like and modifying it by a genetic engineering method, or a method of chemically synthesizing it. can do.
  • the chemical synthesis method of nucleic acid is not particularly limited, and for example, based on the amino acid sequence information of fibroin obtained from NCBI's web database, etc., AKTA oligonucleotide plus 10/100 (GE Healthcare Japan Co., Ltd.), etc.
  • Genes can be chemically synthesized by ligating automatically synthesized oligonucleotides by PCR or the like. At this time, in order to facilitate purification and / or confirmation of the modified fibroin, a nucleic acid encoding the modified fibroin consisting of an amino acid sequence in which an amino acid sequence consisting of a starting codon and a His10 tag is added to the N-terminal of the above amino acid sequence is synthesized. You may.
  • the regulatory sequence is a sequence that controls the expression of modified fibroin in the host (for example, promoter, enhancer, ribosome binding sequence, transcription termination sequence, etc.), and can be appropriately selected according to the type of host.
  • an inducible promoter that functions in the host cell and can induce the expression of modified fibroin may be used.
  • An inducible promoter is a promoter that can control transcription by the presence of an inducing substance (expression inducer), the absence of a repressor molecule, or physical factors such as an increase or decrease in temperature, osmotic pressure, or pH value.
  • the type of expression vector can be appropriately selected according to the type of host, such as a plasmid vector, a viral vector, a cosmid vector, a phosmid vector, and an artificial chromosome vector.
  • a vector that can be autonomously replicated in a host cell or can be integrated into the chromosome of the host and contains a promoter at a position where a nucleic acid encoding modified fibroin can be transcribed is preferably used.
  • any of prokaryotes and eukaryotes such as yeast, filamentous fungi, insect cells, animal cells and plant cells can be preferably used.
  • prokaryotic hosts include bacteria belonging to the genera Escherichia, Brevibacillus, Serratia, Bacillus, Microbacterium, Brevibacterium, Corinebacterium, Pseudomonas and the like.
  • microorganisms belonging to the genus Escherichia include Escherichia coli and the like.
  • microorganisms belonging to the genus Brevibacillus include Brevibacillus agri and the like.
  • microorganisms belonging to the genus Serratia include Serratia marcescens and the like.
  • microorganisms belonging to the genus Bacillus include Bacillus satirus and the like.
  • microorganisms belonging to the genus Microbacterium include Microbacterium, Ammonia Philum and the like.
  • microorganisms belonging to the genus Brevibacterium include Brevibacterium divaricatum and the like.
  • microorganisms belonging to the genus Corynebacterium include Corynebacterium and Ammonia Genes.
  • microorganisms belonging to the genus Pseudomonas include Pseudomonas putida and the like.
  • a prokaryote when used as a host, as a vector into which a nucleic acid encoding modified fibroin is introduced, for example, pBTrp2 (manufactured by Beringer Mannheim), pGEX (manufactured by Pharmacia), pUC18, pBluescriptII, pSupex, pET22b, pCold, pUB110, Examples thereof include pNCO2 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 2002-238569).
  • Examples of eukaryotic hosts include yeast and filamentous fungi (molds, etc.).
  • yeast include yeasts belonging to the genus Saccharomyces, Pichia, Schizosaccharomyces and the like.
  • filamentous fungi include filamentous fungi belonging to the genus Aspergillus, the genus Penicillium, the genus Trichoderma, and the like.
  • examples of the vector into which the nucleic acid encoding the modified fibroin is introduced include YEP13 (ATCC37115) and YEp24 (ATCC37051).
  • a method for introducing an expression vector into the host cell any method for introducing DNA into the host cell can be used. For example, a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], electroporation method, spheroplast method, protoplast method, lithium acetate method, competent method and the like.
  • nucleic acid by a host transformed with an expression vector in addition to direct expression, secretory production, fusion protein expression, etc. can be performed according to the method described in Molecular Cloning 2nd Edition. ..
  • the modified fibroin can be produced, for example, by culturing a host transformed with an expression vector in a culture medium, producing and accumulating the modified fibroin in the culture medium, and collecting the modified fibroin from the culture medium.
  • the method of culturing the host in the culture medium can be carried out according to the method usually used for culturing the host.
  • the culture medium contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the host, and the host can be efficiently cultured. If so, either a natural medium or a synthetic medium may be used.
  • the carbon source may be any assimilated by the transforming microorganisms, for example, glucose, fructose, sucrose, carbohydrates containing them such as honey, starch and starch hydrolysate, acetic acid and propionic acid.
  • Organic acids and alcohols such as ethanol and propanol can be used.
  • the nitrogen source include ammonium salts of inorganic or organic acids such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate and ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, and peptone, meat extract, yeast extract and corn steep liquor.
  • Casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented bacterial cells and digested products thereof can be used.
  • inorganic salts for example, primary potassium phosphate, secondary potassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate and calcium carbonate can be used.
  • Culturing of prokaryotes such as Escherichia coli or eukaryotes such as yeast can be carried out under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature is, for example, 15-40 ° C.
  • the culture time is usually 16 hours to 7 days.
  • the pH of the culture medium during culturing is preferably maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH of the culture medium can be adjusted using an inorganic acid, an organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia or the like.
  • antibiotics such as ampicillin and tetracycline may be added to the culture medium as needed.
  • an inducer may be added to the medium as needed.
  • isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside or the like is used when culturing a microorganism transformed with an expression vector using the lac promoter
  • indol acrylic is used when culturing a microorganism transformed with an expression vector using the trp promoter. Acids and the like may be added to the medium.
  • Isolation and purification of the expressed modified fibroin can be performed by a commonly used method.
  • the modified fibroin is expressed in a lysed state in cells
  • the host cells are collected by centrifugation, suspended in an aqueous buffer solution, and then an ultrasonic crusher, a French press, or a manton. Crush the host cells with a gaulin homogenizer, dynomil, or the like to obtain a cell-free extract.
  • a method usually used for isolating and purifying a protein that is, a solvent extraction method, a salting-out method using sulfuric acid, a desalting method, or an organic solvent is used.
  • Precipitation method anion exchange chromatography method using a resin such as diethylaminoethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Kasei), positive using a resin such as S-Sepharose FF (manufactured by Pharmacia) Ion exchange chromatography method, hydrophobic chromatography method using resins such as butyl Sepharose and phenyl Sepharose, gel filtration method using molecular sieve, affinity chromatography method, chromatofocusing method, electrophoresis method such as isoelectric point electrophoresis Purified preparations can be obtained by using the above methods alone or in combination.
  • a resin such as diethylaminoethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Kasei)
  • S-Sepharose FF manufactured by Pharmacia
  • Ion exchange chromatography method hydrophobic chromatography method using resin
  • the modified fibroin When the modified fibroin is expressed by forming an insoluble matter in the cells, the insoluble matter of the modified fibroin is recovered as a precipitate fraction by similarly collecting the host cell, crushing it, and centrifuging it.
  • the insoluble form of the recovered modified fibroin can be solubilized with a protein denaturing agent.
  • a purified preparation of modified fibroin can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the modified fibroin When the modified fibroin is secreted extracellularly, the modified fibroin can be recovered from the culture supernatant. That is, a purified sample can be obtained by treating the culture by a method such as centrifugation to obtain a culture supernatant, and using the same isolation and purification method as described above from the culture supernatant.
  • the raw material according to the present embodiment is not particularly limited as long as it is a material that needs to be imparted with flame retardancy and can be impregnated with protein or coated with protein.
  • wood, wood board, paper, corrugated cardboard and wood materials that are a mixture thereof, cellulosic materials such as grass, bamboo and rice straw, inorganic materials such as pottery, stone, cement and glass, polyester, polyamide and acrylic. Examples thereof include synthetic materials (resins, etc.) such as polypropylene. Wood materials and cellulose materials are more preferable from the viewpoint of maintaining the biodegradability of the entire material.
  • Building materials are a general term for materials used for the structure and finish of buildings, and are not limited to, for example, based on the Building Standards Act.
  • Construction materials are a general term for materials that make up construction structures, and the materials include, but are not limited to, steel, concrete, wood, stone, polymer materials, and fiber materials.
  • Examples of building materials or construction materials include structural materials used for structural frames, finishing materials such as exterior materials and interior materials, and examples of materials include cellulose materials (fiber materials), which are wood materials. Is preferable. In addition to logs and lumber products, laminated lumber and plywood are also included as wood materials.
  • the raw material is impregnated with one or more flame-retardant and sparingly soluble proteins, and / or the surface of the raw material is impregnated with one or more flame-retardant and sparingly soluble proteins.
  • the raw material is preferably impregnated with one or more flame-retardant and sparingly soluble proteins, and the raw material is impregnated with one or more flame-retardant and sparingly soluble proteins.
  • the surface of the raw material may be coated with one or more flame-retardant and sparingly soluble proteins.
  • the flame-retardant material of one embodiment is one in which the raw material is impregnated with one or more kinds of modified fibroin, the raw material is impregnated with one or more kinds of modified fibroin, and the surface of the raw material is impregnated with one or more kinds. It may be coated with modified fibroin.
  • the one or more proteins permeate the inside of the raw material, are uniformly or non-uniformly dispersed inside the raw material, and become one with the raw material.
  • the weight difference between the weight of the flame-retardant material after impregnation and drying and the weight of the raw material before impregnation can be used as the impregnation amount.
  • the one or more proteins are present in a film form on the surface of the raw material, and at least one of the surfaces of the raw material is continuously or intermittently present. Cover the part.
  • the weight difference between the weight of the flame-retardant material after coating and drying and the weight of the raw material before coating can be used as the coating amount.
  • the thickness of the coating film in the case of coating can be appropriately set depending on the desired flame retardancy and / or strength, and may be, for example, 0.01 ⁇ m to 500 ⁇ m, and may be 1 ⁇ m to 100 ⁇ m. preferable.
  • the strength of the raw material can also be improved by impregnating or coating the protein. The impregnation method and the coating method will be described in detail in the manufacturing method described later.
  • the content of the protein which is a flame-retardant imparting agent in the flame-retardant material is preferably 1% by mass or more based on the total amount of the flame-retardant material. It is more preferably mass% or more, further preferably 10 mass% or more, and even more preferably 20 mass% or more.
  • the upper limit of the protein content may be 99% by mass or 50% by mass or less based on the total amount of the flame-retardant material.
  • the protein content after immersing the flame-retardant material in water for 24 hours is preferably maintained at 50% or more by mass ratio as compared with the protein content in the flame-retardant material before immersion, preferably 60%. It is more preferable to maintain 70% or more, 80% or more, or 90% or more.
  • the experimental conditions are room temperature (around 25 ° C.).
  • the method for producing a protein-containing material of the present invention is a step of impregnating a raw material with a protein-containing liquid containing one or more flame-retardant and sparingly soluble proteins to form a protein-containing portion inside the raw material, and / or A step of coating the surface of the raw material with the protein-containing liquid to form a protein-containing portion on the surface of the raw material is included.
  • One or more flame-retardant and sparingly soluble proteins (flame-retardant imparting agents) and raw materials are as described above.
  • the protein-containing material produced by the production method of the present invention is a raw material impregnated and / or coated with one or more flame-retardant and sparingly soluble proteins, and can be a flame-retardant material.
  • the flame-retardant materials are as described above.
  • the protein-containing portion is referred to as a protein-containing region, and the protein-containing portion inside the raw material is a region in which the protein is uniformly or non-uniformly dispersed in a part or all of the raw material, and is protein-containing on the surface of the raw material.
  • the portion refers to a region in which a film-like protein (protein coating film) is continuously or intermittently present on the surface of a raw material.
  • the protein-containing material can be a flame-retardant material.
  • the protein-containing liquid according to the present embodiment may be a liquid in which a protein is dispersed or dissolved, and is preferably a protein solution.
  • the solvent is not particularly limited, but water is preferable from the viewpoint of reducing the burden on the environment.
  • the method for preparing the protein-containing liquid is not particularly limited.
  • the protein may be dispersed or dissolved in the solvent. It is more preferable to dissolve the material in order to impregnate it.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • DMF N, N-dimethylformamide
  • HFIP hexafluoroisopropanol
  • An inorganic salt may be added to the solvent as a dissolution accelerator.
  • the pressure is an absolute pressure as described above.
  • Proteins can be easily dissolved in water without the use of solubilizers such as urea and metal salts. Therefore, a high-concentration protein solution can be easily prepared without going through a step such as dialysis. It can be said that this solution preparation method is more preferable because the labor for purification after dissolution can be saved.
  • proteins to which such a preparation method can be applied include fibroin and soybean protein, and it is preferable to select one or more of these and use them as a flame retardant-imparting agent.
  • heat may be applied, and the temperature is not particularly limited. 50 ° C. or higher is preferable, 80 ° C. or higher is more preferable, and 100 ° C. or higher is even more preferable. It is more preferable to use a protein having an average value (average HI) of the hydrophobicity index of 0 or less because an aqueous protein solution can be efficiently prepared and a tendency to show high flame retardancy is observed.
  • average HI average HI
  • WO2017 / 094722 describes the conditions necessary for preparing a protein solution by applying pressure to a dispersion containing a protein, that is, the dissolution solvent, the type of the target protein, the temperature, the pressure, and the like.
  • the raw material is impregnated with a protein-containing liquid containing one or more flame-retardant and sparingly soluble proteins to form a protein-containing portion inside the raw material.
  • the impregnation method is not particularly limited, but any method may be used as long as the protein can be introduced into the raw material by contacting the protein-containing liquid with a part or all of the raw material.
  • the protein can be efficiently introduced into the raw material by pressurizing and reducing the pressure while contacting the raw material with the protein-containing liquid after drying the raw material in advance.
  • High pressure High temperature for example, 40 to 200 ° C.
  • long time for example, 5 to 300 minutes
  • pressurization for example, pressure of 0.102 MPa to 100 MPa
  • depressurization for example, decompression from pressurized state to normal pressure or
  • the amount of protein introduced can be increased by repeating the process with a reduced pressure of 0.001 MPa to 0.10 MPa).
  • the detailed process is described in, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-2111412.
  • the surface of the raw material is coated with a protein-containing liquid containing one or more flame-retardant and sparingly soluble proteins to form a protein-containing portion on the surface of the raw material.
  • the coating method is not particularly limited, but a method suitable for the raw material can be applied.
  • An exemplary method includes a method of immersing a part or all of the raw material in the protein-containing liquid, a method of spraying the protein-containing liquid on the raw material, a method of applying the protein-containing liquid to the raw material, and the like.
  • a film-shaped protein thin film prepared in advance may be attached. The thicker the coating film, the higher the flame retardant effect can be obtained.
  • the seed culture solution was added to a jar fermenter to which 500 mL of the production medium (Table 5) was added so that the OD 600 was 0.05.
  • the culture solution temperature was maintained at 37 ° C., and the culture was controlled at a constant pH of 6.9. Further, the dissolved oxygen concentration in the culture solution was maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
  • the feed solution (glucose 455 g / 1 L, Yeast Extract 120 g / 1 L) was added at a rate of 1 mL / min.
  • the culture solution temperature was maintained at 37 ° C., and the culture was controlled at a constant pH of 6.9. Further, the dissolved oxygen concentration in the culture solution was maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration, and the culture was carried out for 20 hours. Then, 1 M of isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) was added to the culture solution to a final concentration of 1 mM to induce the expression of modified fibroin. Twenty hours after the addition of IPTG, the culture solution was centrifuged and the cells were collected. SDS-PAGE was performed using cells prepared from the culture medium before and after the addition of IPTG, and the expression of the desired modified fibroin was confirmed by the appearance of the desired modified fibroin-sized band depending on the addition of IPTG. bottom.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactop
  • the washed precipitate was suspended in 8M guanidine buffer (8M guanidine hydrochloride, 10 mM sodium dihydrogen phosphate, 20 mM NaCl, 1 mM Tris-HCl, pH 7.0) to a concentration of 100 mg / mL and at 60 ° C. Stir with a stirrer for 30 minutes to dissolve. After dissolution, dialysis was performed with water using a dialysis tube (cellulose tube 36/32 manufactured by Sanko Junyaku Co., Ltd.). The white aggregated protein obtained after dialysis was recovered by centrifugation, water was removed by a lyophilizer, and the lyophilized powder was recovered to obtain modified fibroin (PRT799, 200 kDa).
  • 8M guanidine buffer 8M guanidine hydrochloride, 10 mM sodium dihydrogen phosphate, 20 mM NaCl, 1 mM Tris-HCl, pH 7.0
  • Example 1 Measurement of flame retardancy of protein itself>
  • DMSO Dimethyl sulfoxide
  • LiCl LiCl was dissolved so as to be 4.0% by mass was prepared as a solvent, and lyophilized powder of modified fibroin was added thereto to a concentration of 24% by mass, and a shaker was used. It was dissolved for 3 hours. Then, the insoluble matter and bubbles were removed to obtain a modified fibroin solution (spinning stock solution).
  • the prepared spinning stock solution is filtered at 90 ° C. with a metal filter having an opening of 5 ⁇ m, then allowed to stand in a 30 mL stainless syringe to defoam, and then 100% by mass methanol solidified from a solid nozzle having a needle diameter of 0.2 mm. It was discharged into the bathtub. The discharge temperature was 90 ° C. After solidification, the obtained raw yarn was wound up and air-dried to obtain modified fibroin fiber (raw material fiber).
  • the critical oxygen index (LOI) value of the knitted fabric knitted with the modified fibroin (PRT799) fiber was 27.2.
  • the LOI value is 26 or more, it has a self-extinguishing property and is considered to be flame-retardant. It can be seen that the modified fibroin is excellent in flame retardancy. Therefore, an article having excellent flame retardancy can be obtained by producing the article by using the modified fibroin alone or by mixing the modified fibroin with another material.
  • PRT410 50 kDa
  • PRT587 100 kDa
  • Similar values are expected to be obtained for these flame retardancy.
  • the freeze-dried powders of PRT410 and 587 were expressed and purified in the same manner as PRT799.
  • aqueous solution of silk protein (at least 200 kDa) is prepared by the method described in the non-patent document "Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin" (DL Kaplan et al., Nature Protocol, 6, 2011, 1612-1631), and a dialysis method is performed. To obtain a 15% aqueous solution (Example 2-3).
  • Example 3-1 An impregnation test was carried out using cedar wood cut into 52 mm ⁇ 20 mm ⁇ 2.3 mm dried at 80 ° C. for 24 hours.
  • the cedar wood was impregnated with the flame-retardant protein aqueous solution prepared in Example 2-1 and subjected to pressurization and heat treatment at a temperature of 120 ° C. and a pressure of 0.2 MPa for 24 hours.
  • the cedar wood was taken out from the autoclave and dried at 80 ° C. for 24 hours to obtain the flame-retardant wood of Example 3-1.
  • the mass increase rate (%) of the flame-retardant wood with respect to the absolute dry mass of the raw material cedar was determined. The mass increase rate is shown in FIG.
  • Example 3-2 The flame-retardant wood of Example 3-2 was prepared by performing the same operation as in Example 3-1 except that the flame-retardant protein aqueous solution prepared in Example 2-2 was used. Similarly, the mass increase rate of the flame-retardant wood was obtained and shown in FIG.
  • Example 3-3 The flame-retardant wood of Example 3-3 was prepared by performing the same operation as in Example 3-1 except that the flame-retardant protein aqueous solution prepared in Example 2-3 was used. Similarly, the mass increase rate of the flame-retardant wood was obtained and shown in FIG.
  • Comparative Example 3-1 The flame-retardant wood of Comparative Example 3-1 was prepared by performing the same operation as in Example 3-1 except that the flame retardant agent prepared in Comparative Example 2-1 was used. Similarly, the mass increase rate of the flame-retardant wood was obtained and shown in FIG.
  • Comparative Example 3-2 The flame retardant wood of Comparative Example 3-2 was prepared by performing the same operation as in Example 3-1 except that the flame retardant agent prepared in Comparative Example 2-2 was used. Similarly, the mass increase rate of the flame-retardant wood was obtained and shown in FIG.
  • Example 4-1 The flame-retardant wood obtained in Example 3-1 was heated in an electric furnace (AS ONE Corporation, ROP-001) kept at 500 ° C. for 5 minutes, and the flammability was evaluated from the weight loss rate at that time. The results are shown in FIG.
  • Example 4-2 The flame-retardant wood obtained in Example 3-2 was heated in an electric furnace (AS ONE Corporation, ROP-001) kept at 500 ° C. for 5 minutes, and the flammability was evaluated from the weight loss rate at that time. The results are shown in FIG.
  • Example 4-3 The flame-retardant wood obtained in Example 3-3 was heated in an electric furnace maintained at 500 ° C. for 5 minutes, and the flammability was evaluated from the weight loss rate at that time. The results are shown in FIG.
  • Comparative Example 4-1 The flame-retardant wood obtained in Comparative Example 3-1 was heated in an electric furnace maintained at 500 ° C. for 5 minutes, and the flammability was evaluated from the weight reduction rate at that time. The results are shown in FIG.
  • Comparative Example 4-2 The flame-retardant wood obtained in Comparative Example 3-2 was heated in an electric furnace maintained at 500 ° C. for 5 minutes, and the flammability was evaluated from the weight reduction rate at that time. The results are shown in FIG.
  • Example 5-2 Comparative Example 5-1 and Comparative Example 5-2, the woods obtained in Example 3-2, Comparative Examples 3-1 and 3-2 were used, respectively.
  • the mass increase rate (%) calculated by comparing with the wood mass before impregnation is shown in “after impregnation” in FIG.
  • each wood was sufficiently immersed in 50 ml of water and allowed to stand at 25 ° C. for 24 hours. After soaking in water, it was dried at 80 ° C.
  • the masses of boric acid (Comparative Example 5-1) and phosphoric acid (Comparative Example 5-2) are greatly reduced by immersing in water.
  • Comparative Example 5-2 when the mass increase rate was 25.9%, it was found that the mass increase rate decreased to 5.1% in the first immersion, and only about 20% of the original impregnation amount remained. rice field.
  • the protein (Example 5-1) did not dissolve in water even after repeated immersion, and most of it remained. Specifically, the mass increase rate, which was 22.2%, has decreased by only about 2%, and it can be seen that 90% or more of the impregnated poorly soluble proteins remain undissolved. ..
  • the protein-impregnated material has strong resistance to water because at least 50% or more of the protein remains inside the material even after being immersed in water for 24 hours, 48 hours, and 72 hours. I understand.
  • Example 5-1 of the first water immersion Comparative Example 5-1 and Comparative Example 5-2 and Comparative Example 5-3.
  • FIG. 9 shows photographs of wood of Example 5-1 and Comparative Example 5-1 and Comparative Example 5-2 and Example 5-3 from the left.
  • the wood impregnated with the aqueous protein solution did not change in appearance, while the chemicals were deposited on the surface of the wood impregnated with boric acid and sodium phosphate. From this, it was found that the flame-retardant material impregnated with protein is less likely to cause whitening.
  • Example 6-2 Comparative Example 6-1 and Comparative Example 6-2, the woods obtained in Example 3-2, Comparative Example 3-1 and Comparative Example 3-2 were used. Each wood was soaked in water three times in the same manner as in the above water immersion test. Each wood was dried at 80 ° C. for 24 hours, and then heated in an electric furnace maintained at 500 ° C. for 5 minutes. The flammability was evaluated. The results are shown in FIG.
  • Example 6-2 Compared with the results of Examples 3-2 and 3-1 there was no significant change in the mass residual ratio of the wood impregnated with the protein solution (Example 6-2), while boric acid (Comparative Example 6-1). ) And sodium phosphate (Comparative Example 6-2) impregnated with the mass residual ratio of the wood. It was found that the protein-impregnated wood can maintain a substantial flame-retardant effect because 50% or more of the protein remains even after being immersed in water.

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Abstract

本発明は、水に溶け出しにくい性質を持ち、毒性及び金属腐食性を持たず、さらに、生分解性のある難燃性付与剤によって処理された、新規な難燃性材料、及びその製造方法を提供することを目的とする。本発明の難燃性材料は、原材料に１種以上の難燃性かつ難溶性のタンパク質を含浸させ、及び／又は、上記原材料の表面を１種以上の難燃性かつ難溶性のタンパク質でコーティングした、難燃性材料である。本発明のタンパク質含有材の製造方法は、１種以上の難溶性タンパク質を含むタンパク質含有液を原材料に含浸させて上記原材料の内部にタンパク質含有部を形成する工程、及び／又は、上記タンパク質含有液で上記原材料の表面をコーティングして上記原材料の表面にタンパク質含有部を形成する工程を含む。

Description

難燃性材料及びその製造方法
　本発明は、難燃性材料及びその製造方法に関する。
　従来から、衣服、建材、電気電子製品等の様々な分野で難燃性材料が利用されている。難燃性材料には、難燃性を有しない材料に対して難燃性付与剤を添加するなどの難燃化処理を行うことにより難燃性が発揮されるものがある。
　例えば、木質材やセルロース系材料を難燃化するためには、難燃性付与剤として、リン酸ナトリウムなどのリン系化合物及びホウ素などのホウ素系化合物が広く用いられている。しかし、リン酸系、ホウ素系難燃性付与剤は全体的に水に対して溶けやすい傾向があり、燃焼を抑制するために必要とされる量を長期間材料中に留めておくことが難しい傾向にあり、難燃性の長期保持が課題となる。また、これらの難燃性付与剤を注入した木材が高湿度環境や雨にさらされること等に起因し、材料表面に結晶が析出する白華という現象は建築業界でも重大な問題と認識されている。
　一方、白華を抑えるために多様な工夫がなされている。例えば、特許文献１には、ホウ素系の難燃性付与成分とポリシロキサン化合物とを含む水溶液からなる難燃薬剤が開示されている。ここで、ホウ素がポリシロキサンネットワーク中に固定化されることによる溶出防止効果によって、白華が抑制されていることが開示されている。これら技術は白華が抑えられるものの、温度や湿度等の環境条件によっては白華がおこる可能性が否定できず、材料の美観を損ねたり、難燃性が低下したりすることが依然と懸念される。
　また、リン酸やホウ酸など無機系の難燃剤を多用する場合、例えば、生分解性を有する天然繊維等の場合、難燃性付与剤を使用することによって生分解性の特徴が失われてしまうことがある。難燃性付与剤の水への耐性を高めるために薬剤を使用した場合、さらに生分解性が抑えられてしまい、また、建築材料への長期間の使用等を想定した場合、薬剤によっては人体に対する毒性が問題になることも懸念される。
　さらに、従来用いられている難燃性付与剤には、金属腐食性があることも課題の一つある。例えばホウ酸リン酸系の薬剤がステンレスを腐食することが知られている。
特開２０１９－１３７８０５号公報
　本発明は、水に溶け出しにくい性質を持ち、毒性及び金属腐食性を持たず、さらに、生分解性のある難燃性付与剤によって処理された、新規な難燃性材料、及びその製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは以前、改変フィブロインを有効成分として含有する難燃性付与剤を発明し、改変フィブロイン繊維で編んだ編地が優れた難燃性を持つことを証明し、この難燃性付与剤単独で、又は他の材料と混ぜ込む等して物品を製造することにより、難燃性に優れる物品を提供できると提案した（特開２０２０―０５０８０５号公報）。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究の結果、改変フィブロインに代表される難燃性付与剤がより有効に利用できることを見出した。すなわち難燃性付与剤としてのタンパク質のうち難燃性かつ難溶性を示すタンパク質を含浸させた又は難燃性かつ難溶性を示すタンパク質でコーティングした材料が優れた難燃性を発揮するとともに、難溶性であるゆえ、高湿度環境下や雨による溶出が抑制されるため、白華しないとの利点をもたらすことを見出し、本発明の完成に至った。
　本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
［１］
　原材料に１種以上の難燃性かつ難溶性のタンパク質を含浸させ、及び／又は、上記原材料の表面を１種以上の難燃性かつ難溶性のタンパク質でコーティングした、難燃性材料。
［２］
　上記難燃性材料を水に２４時間浸漬した後の上記タンパク質の含有量が、浸漬前の上記難燃性材料における上記タンパク質の含有量と比較して質量比で５０％以上維持される、［１］に記載の難燃性材料。
［３］
　上記タンパク質が単離、精製又は合成されたタンパク質である、［１］又は［２］に記載の難燃性材料。
［４］
　上記タンパク質の限界酸素指数（ＬＯＩ）値が２６以上である、［１］～［３］のいずれかに記載の難燃性材料。
［５］
　上記原材料がセルロース材である、［１］～［４］のいずれかに記載の難燃性材料。
［６］
　上記原材料が建築材料又は建設材料である、［１］～［５］のいずれかに記載の難燃性材料。
［７］
　上記タンパク質が構造タンパク質である、［１］～［６］のいずれかに記載の難燃性材料。
［８］
　上記タンパク質が改変フィブロイン又は大豆タンパク質である、［１］～［７］のいずれかに記載の難燃性材料。
［９］
　上記タンパク質が改変クモ糸フィブロインである、［１］～［８］のいずれかに記載の難燃性材料。
［１０］
　上記タンパク質の疎水性指標の平均値（平均ＨＩ）が０以下の改変フィブロインである、［１］～［９］のいずれかに記載の難燃性材料。
［１１］
　上記タンパク質が０．１０２ＭＰａ以上の圧力で水溶性を示す、［１］～［１０］のいずれかに記載の難燃性材料。
［１２］
　上記タンパク質が１００℃以上の温度で水溶性を示す、［１１］に記載の難燃性材料。
［１３］
　上記タンパク質の分子量が１００ｋＤａ以下である、［１］～［１２］のいずれかに記載の難燃性材料。
［１４］
　１種以上の難燃性かつ難溶性のタンパク質を含むタンパク質含有液を原材料に含浸させて上記原材料の内部にタンパク質含有部を形成する工程、及び／又は、上記タンパク質含有液で上記原材料の表面をコーティングして上記原材料の表面にタンパク質含有部を形成する工程を含む、タンパク質含有材の製造方法。
［１５］
　上記タンパク質含有材が難燃性材料である、［１４］に記載の製造方法。
［１６］
　上記タンパク質含有材を水に２４時間浸漬した後の上記タンパク質の含有量が、浸漬前の上記タンパク質含有材における上記タンパク質の含有量と比較して質量比で５０％以上維持される、［１４］又は［１５］に記載の製造方法。
［１７］
　上記タンパク質含有液が上記１種以上の難燃性かつ難溶性のタンパク質を含む水溶液である、［１４］～［１６］のいずれかに記載の製造方法。
［１８］
　上記タンパク質が単離、精製又は合成されたタンパク質である、［１４］～［１７］のいずれかに記載の製造方法。
［１９］
　上記タンパク質の限界酸素指数（ＬＯＩ）値が２６以上である、［１４］～［１８］のいずれかに記載の製造方法。
［２０］
　上記原材料が木質材又はセルロース材である、［１４］～［１９］のいずれかに記載の製造方法。
［２１］
　上記原材料が建築材料又は建設材料である、［１４］～［２０］のいずれかに記載の製造方法。
［２２］
　上記タンパク質が構造タンパク質である、［１４］～［２１］のいずれかに記載の製造方法。
［２３］
　上記タンパク質が改変フィブロイン又は大豆タンパク質である、［１４］～［２２］のいずれかに記載の製造方法。
［２４］
　上記タンパク質が改変クモ糸フィブロインである、［１４］～［２３］のいずれかに記載の製造方法。
［２５］
　上記タンパク質の疎水性指標の平均値（平均ＨＩ）が０以下である、［１４］～［２４］のいずれかに記載の製造方法。
［２６］
　上記タンパク質含有液は、上記１種以上の難燃性かつ難溶性のタンパク質を０．１０２ＭＰａ以上の圧力の印加により溶解させることによって調製される、［１４］～［２５］のいずれかに記載の製造方法。
［２７］
　上記タンパク質含有液は、上記１種以上の難燃性かつ難溶性のタンパク質を１００℃以上の温度で溶解させることによって調製される、［２６］に記載の製造方法。
［２８］
　上記タンパク質の分子量が１００ｋＤａ以下である、［１４］～［２７］のいずれかに記載の製造方法。
　本発明によれば、新規な難燃性材料及びその製造方法の提供が可能となる。
　本発明の難燃性材料は、生分解性を有する難燃性かつ難溶性のタンパク質（難燃性付与剤）を使用することにより、優れた難燃性を発揮する一方で、材料の生分解性を損なうことはない。また、本発明の難燃性材料は、難燃性かつ難溶性のタンパク質を含浸又はコーティングすることで、例えば夏季や高温地帯など湿度の高い環境においても、難燃性付与剤であるタンパク質が溶け出しにくいため、難燃性を長期にわたって維持できる材料を提供することができる。そのため、難燃性付与剤が溶け出さないようにするための白華抑制剤を添加する必要がなく、工程面及び費用面でのコスト削減が期待できる。
　さらに、本発明のタンパク質含有材の製造方法は、常温常圧において難水溶性のタンパク質を材料に含浸又はコーティングすることによって、水への溶解に起因する、原材料からの難燃性付与剤の溶出を抑制することができる。そのため、難燃性がより長期にわたって安定的に維持される。
改変フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。 天然由来のフィブロインのｚ／ｗ（％）の値の分布を示す図である。 天然由来のフィブロインのｘ／ｙ（％）の値の分布を示す図である。 改変フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。 改変フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。 難燃性材料含浸後、乾燥させた木材の質量増加率を示す図である。 燃焼後の質量残存率を示す図である。 水浸漬後の質量残存率を示す図である。 １回の水浸漬後の木材の写真を示す図である。 ３回の水浸漬後木材を燃焼させた場合の質量残存率を示す図である。
　以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
〔難燃性材料〕
　本発明の難燃性材料は、原材料に１種以上の難燃性かつ難溶性のタンパク質を含浸させ、及び／又は、上記原材料の表面を１種以上の難燃性かつ難溶性のタンパク質でコーティングした材料である。
＜タンパク質＞
　本実施形態に係る難燃性かつ難溶性のタンパク質は、難燃性であり、かつ、常温常圧において難水溶性のタンパク質を指し、原材料に難燃性を付与するため、本明細書において難燃性付与剤と呼ぶ場合もある。ここで、難燃性とは、燃焼に対して抵抗する“燃えにくい”性質を意味し、材料の燃焼速度の測定や酸素指数（酸素濃度を変化させた環境中で材料を燃焼した時の、燃焼が持続する最低の酸素濃度）の測定、発熱性試験で得られる総発熱量の測定、高温に晒した前後の材料の質量変化の測定等によって評価することができる。また、常圧とは１気圧を意味し、常温とは２５℃を意味し、難水溶性とは水に対して１ｇ／Ｌ未満の溶解度を有することを意味する。難燃性付与剤を原材料に含浸又はコーティングする（以下、まとめて「付与する」）ことで、高温、高湿環境、又は、雨や雪に曝されても、白華が起こりにくく、難燃性を長期にわたって維持できる難燃性材料を作製することができる。
　本実施形態に係る難燃性付与剤であるタンパク質は、燃焼性の不純物が含まれることによって難燃性の程度が低下する可能性があることから単離、精製又は合成されたタンパク質であることが望ましい。また、細胞工学的手法により大量生産できる組換えタンパク質であることが好ましく、精製された組換えタンパク質であることがより好ましい。組換えタンパク質としては、天然タンパク質であっても改変タンパク質であってもよく、難燃効果を出すために構造にバリエーションを持たせることができる改変タンパク質がより好ましい。さらに、タンパク質は化学修飾されたものでよく、他材料との共重合体であってもよい。原材料に付与される難溶性タンパク質は、１種類であってもよく、２種類以上の組み合わせであってもよい。
　本実施形態に係るタンパク質の限界酸素指数（ＬＯＩ）値が、１８以上であってよく、２０以上であってもよく、２２以上であってもよく、２４以上であってもよく、２６以上であってもよく、２７以上であってもよく、２８以上であってもよく、２９以上であってもよく、３０以上であってもよい。本明細書において、ＬＯＩ値は、消防庁危険物規制課長　消防危５０号平成７年５月３１日の粉粒状又は融点の低い合成樹脂の試験方法に準拠して測定される値である。
　本実施形態に係るタンパク質は、常温常圧において難水溶性であるが、１００℃以上の温度、及び／又は、１気圧（０．１０１ＭＰａ）超の圧力において、例えば、０．１０２ＭＰａ以上、０．１０６ＭＰａ以上、０．１１０ＭＰａ以上、０．１５０ＭＰａ以上、０．２００ＭＰａ以上、０．５００ＭＰａ以上の圧力において、水溶性を示すものであることが好ましい。水溶性とは、１ｇ／Ｌ以上の溶解度を意味する。難溶性のタンパク質を水に溶かして水溶液とすることで、原材料への含浸及び／又はコーティングを容易にすることができる。本明細書において、圧力（ＭＰａ）の数値は絶対圧の値を意味し、大気圧等の環境の圧力と意図して加えた圧力との和である。また、圧力測定は１気圧の環境下で行ったものである。１気圧の環境下において、意図して圧力を加えない場合の圧力値は０．１０１ＭＰａとなる。
　本実施形態に係る難溶性タンパク質の種類は特に限定されない。酵素に代表される機能性タンパク質でもよく、難水溶性コラーゲン、大豆タンパク質、ケラチン、エラスチンをはじめとする動植物性のタンパク質、フィブロインのように生物の構造を維持することを目的とした構造タンパク質であってもよい。原材料に導入することで原材料そのものの強度向上に寄与するという観点から、構造タンパク質であることが好ましく、改変構造タンパク質であることがより好ましい。難溶性の構造タンパク質としては、難水溶性フィブロイン、難水溶性コラーゲン、レシリン、エラスチン及びケラチン、並びにこれら由来のタンパク質又はタンパク質誘導体等を挙げられ、特に他のタンパク質よりも難燃性に優れ（ＬＯＩ値が高い）、また常圧で水に対する溶解度が低い性質を示す改変フィブロインが好ましい。難溶性タンパク質の分子量が１００ｋＤａ以下であることが好ましく、材料により導入しやすい観点から５０ｋＤａ以下であることがより好ましい。タンパク質誘導体としては、例えばタンパク質の側鎖に置換基を導入したもの、タンパク質鎖を架橋したもの等が挙げられる。
（改変フィブロイン）
　本実施形態に係る改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。改変フィブロインは、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側のいずれか一方又は両方に更にアミノ酸配列（Ｎ末端配列及びＣ末端配列）が付加されていてもよい。Ｎ末端配列及びＣ末端配列は、これに限定されるものではないが、典型的には、フィブロインに特徴的なアミノ酸モチーフの反復を有さない領域であり、１００残基程度のアミノ酸からなる。
　本明細書において「改変フィブロイン」とは、人為的に製造されたフィブロイン（人造フィブロイン）を意味する。改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列とは異なるフィブロインであってもよく、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列と同一であるフィブロインであってもよい。本明細書でいう「天然由来のフィブロイン」もまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。
　「改変フィブロイン」は、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列をそのまま利用したものであってもよく、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列に依拠してそのアミノ酸配列を改変したもの（例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列を改変することによりアミノ酸配列を改変したもの）であってもよく、また天然由来のフィブロインに依らず人工的に設計及び合成したもの（例えば、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより所望のアミノ酸配列を有するもの）であってもよい。
　本明細書において「ドメイン配列」とは、フィブロイン特有の結晶領域（典型的には、アミノ酸配列の（Ａ）ｎモチーフに相当する。）と非晶領域（典型的には、アミノ酸配列のＲＥＰに相当する。）を生じるアミノ酸配列であり、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるアミノ酸配列を意味する。ここで、（Ａ）ｎモチーフは、アラニン残基を主とするアミノ酸配列を示し、アミノ酸残基数は２～２７である。（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数は、２～２０、４～２７、４～２０、８～２０、１０～２０、４～１６、８～１６、又は１０～１６の整数であってよい。また、（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は４０％以上であればよく、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％（アラニン残基のみで構成されることを意味する。）であってもよい。ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、少なくとも７つがアラニン残基のみで構成されてもよい。ＲＥＰは２～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ＲＥＰは、１０～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列であってもよい。ｍは２～３００の整数を示し、１０～３００の整数であってもよい。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。
　本実施形態に係る改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列に対し、例えば、１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行うことで得ることができる。アミノ酸残基の置換、欠失、挿入及び／又は付加は、部分特異的突然変異誘発法等の当業者に周知の方法により行うことができる。具体的には、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１０，６４８７（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４４８（１９８３）等の文献に記載されている方法に準じて行うことができる。
　天然由来のフィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質であり、具体的には、例えば、昆虫又はクモ類が産生するフィブロインが挙げられる。
　昆虫が産生するフィブロインとしては、例えば、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ）、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍａｎｄａｒｉｎａ）、天蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ｙａｍａｍａｉ）、柞蚕（Ａｎｔｅｒａｅａ　ｐｅｒｎｙｉ）、楓蚕（Ｅｒｉｏｇｙｎａ　ｐｙｒｅｔｏｒｕｍ）、蓖蚕（Ｐｉｌｏｓａｍｉａ　Ｃｙｎｔｈｉａ　ｒｉｃｉｎｉ）、樗蚕（Ｓａｍｉａ　ｃｙｎｔｈｉａ）、栗虫（Ｃａｌｉｇｕｒａ　ｊａｐｏｎｉｃａ）、チュッサー蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ｍｙｌｉｔｔａ）、ムガ蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ａｓｓａｍａ）等のカイコが産生する絹タンパク質、及びスズメバチ（Ｖｅｓｐａ　ｓｉｍｉｌｌｉｍａ　ｘａｎｔｈｏｐｔｅｒａ）の幼虫が吐出するホーネットシルクタンパク質が挙げられる。
　昆虫が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、カイコ・フィブロインＬ鎖（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ７６４３０（塩基配列）、及びＡＡＡ２７８４０．１（アミノ酸配列））が挙げられる。
　クモ類が産生するフィブロインとしては、例えば、オニグモ、ニワオニグモ、アカオニグモ、アオオニグモ及びマメオニグモ等のオニグモ属（Ａｒａｎｅｕｓ属）に属するクモ、ヤマシロオニグモ、イエオニグモ、ドヨウオニグモ及びサツマノミダマシ等のヒメオニグモ属（Ｎｅｏｓｃｏｎａ属）に属するクモ、コオニグモモドキ等のコオニグモモドキ属（Ｐｒｏｎｕｓ属）に属するクモ、トリノフンダマシ及びオオトリノフンダマシ等のトリノフンダマシ属（Ｃｙｒｔａｒａｃｈｎｅ属）に属するクモ、トゲグモ及びチブサトゲグモ等のトゲグモ属（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ属）に属するクモ、マメイタイセキグモ及びムツトゲイセキグモ等のイセキグモ属（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ属）に属するクモ、コガネグモ、コガタコガネグモ及びナガコガネグモ等のコガネグモ属（Ａｒｇｉｏｐｅ属）に属するクモ、キジロオヒキグモ等のオヒキグモ属（Ａｒａｃｈｎｕｒａ属）に属するクモ、ハツリグモ等のハツリグモ属（Ａｃｕｓｉｌａｓ属）に属するクモ、スズミグモ、キヌアミグモ及びハラビロスズミグモ等のスズミグモ属（Ｃｙｔｏｐｈｏｒａ属）に属するクモ、ゲホウグモ等のゲホウグモ属（Ｐｏｌｔｙｓ属）に属するクモ、ゴミグモ、ヨツデゴミグモ、マルゴミグモ及びカラスゴミグモ等のゴミグモ属（Ｃｙｃｌｏｓａ属）に属するクモ、及びヤマトカナエグモ等のカナエグモ属（Ｃｈｏｒｉｚｏｐｅｓ属）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質、並びにアシナガグモ、ヤサガタアシナガグモ、ハラビロアシダカグモ及びウロコアシナガグモ等のアシナガグモ属（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、オオシロカネグモ、チュウガタシロカネグモ及びコシロカネグモ等のシロカネグモ属（Ｌｅｕｃａｕｇｅ属）に属するクモ、ジョロウグモ及びオオジョロウグモ等のジョロウグモ属（Ｎｅｐｈｉｌａ属）に属するクモ、キンヨウグモ等のアズミグモ属（Ｍｅｎｏｓｉｒａ属）に属するクモ、ヒメアシナガグモ等のヒメアシナガグモ属（Ｄｙｓｃｈｉｒｉｏｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、クロゴケグモ、セアカゴケグモ、ハイイロゴケグモ及びジュウサンボシゴケグモ等のゴケグモ属（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ属）に属するクモ、及びユープロステノプス属（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ属）に属するクモ等のアシナガグモ科（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈｉｄａｅ科）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質が挙げられる。スパイダーシルクタンパク質としては、例えば、ＭａＳｐ（ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２）、ＡＤＦ（ＡＤＦ３及びＡＤＦ４）等の牽引糸タンパク質、ＭｉＳｐ（ＭｉＳｐ１及びＭｉＳｐ２）等が挙げられる。
　クモ類が産生するスパイダーシルクタンパク質のより具体的な例としては、例えば、ｆｉｂｒｏｉｎ－３（ａｄｆ－３）［Ａｒａｎｅｕｓ　ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１０（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５５（塩基配列））、ｆｉｂｒｏｉｎ－４（ａｄｆ－４）［Ａｒａｎｅｕｓ　ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１１（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ０４５０４（アミノ酸配列）、Ｕ３７５２０（塩基配列））、ｍａｊｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ　ｈｅｓｐｅｒｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ６８８５６（アミノ酸配列）、ＥＦ５９５２４６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　２［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖａｔａ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ３２４７２（アミノ酸配列）、ＡＦ４４１２４５（塩基配列））、ｍａｊｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ　ａｕｓｔｒａｌｉｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＪ００４２８（アミノ酸配列）、ＡＪ９７３１５５（塩基配列））、及びｍａｊｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　２［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ　ａｕｓｔｒａｌｉｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＭ３２２４９．１（アミノ酸配列）、ＡＭ４９０１６９（塩基配列））、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５８９．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５９１．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ－ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｎｅｐｈｉｌｅｎｇｙｓ　ｃｒｕｅｎｔａｔａ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ３７２７８．１（アミノ酸配列）等が挙げられる。
　天然由来のフィブロインのより具体的な例としては、更に、ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋに配列情報が登録されているフィブロインを挙げることができる。例えば、ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報のうちＤＩＶＩＳＩＯＮとしてＩＮＶを含む配列の中から、ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮにｓｐｉｄｒｏｉｎ、ａｍｐｕｌｌａｔｅ、ｆｉｂｒｏｉｎ、「ｓｉｌｋ及びｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」、又は「ｓｉｌｋ及びｐｒｏｔｅｉｎ」がキーワードとして記載されている配列、ＣＤＳから特定のｐｒｏｄｕｃｔの文字列、ＳＯＵＲＣＥからＴＩＳＳＵＥ　ＴＹＰＥに特定の文字列の記載された配列を抽出することにより確認することができる。
　本実施形態に係る改変フィブロインは、改変絹（シルク）フィブロイン（カイコが産生する絹タンパク質のアミノ酸配列を改変したもの）であってもよく、改変クモ糸フィブロイン（クモ類が産生するスパイダーシルクタンパク質のアミノ酸配列を改変したもの）であってもよい。改変フィブロインとしては、難燃性により優れることから、改変クモ糸フィブロインが好ましい。
　改変フィブロインの具体的な例として、クモの大瓶状腺で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する改変フィブロイン（第１の改変フィブロイン）、グリシン残基の含有量が低減されたドメイン配列を有する改変フィブロイン（第２の改変フィブロイン）、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたドメイン配列を有する改変フィブロイン（第３の改変フィブロイン）、グリシン残基の含有量、及び（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロイン（第４の改変フィブロイン）、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むドメイン配列を有する改変フィブロイン（第５の改変フィブロイン）、並びにグルタミン残基の含有量が低減されたドメイン配列を有する改変フィブロイン（第６の改変フィブロイン）が挙げられる。
　第１の改変フィブロインとしては、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質が挙げられる。第１の改変フィブロインにおいて、（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数は、３～２０の整数が好ましく、４～２０の整数がより好ましく、８～２０の整数が更に好ましく、１０～２０の整数が更により好ましく、４～１６の整数が更によりまた好ましく、８～１６の整数が特に好ましく、１０～１６の整数が最も好ましい。第１の改変フィブロインは、式１中、ＲＥＰを構成するアミノ酸残基の数は、１０～２００残基であることが好ましく、１０～１５０残基であることがより好ましく、２０～１００残基であることが更に好ましく、２０～７５残基であることが更により好ましい。第１の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるアミノ酸配列中に含まれるグリシン残基、セリン残基及びアラニン残基の合計残基数がアミノ酸残基数全体に対して、４０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることが更に好ましい。
　第１の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるアミノ酸配列の単位を含み、かつＣ末端配列が配列番号１～３のいずれかに示されるアミノ酸配列又は配列番号１～３のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であるポリペプチドであってもよい。
　配列番号１に示されるアミノ酸配列は、ＡＤＦ３（ＧＩ：１２６３２８７、ＮＣＢＩ）のアミノ酸配列のＣ末端の５０残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列と同一であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２０残基取り除いたアミノ酸配列と同一であり、配列番号３に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２９残基取り除いたアミノ酸配列と同一である。
　第１の改変フィブロインのより具体的な例として、（１－ｉ）配列番号４（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｓｐｉｄｅｒ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＡＤＦ３ＫａｉＬａｒｇｅＮＲＳＨ１）で示されるアミノ酸配列、又は（１－ｉｉ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　配列番号４で示されるアミノ酸配列は、Ｎ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ　ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ　３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号５）を付加したＡＤＦ３のアミノ酸配列において、第１～１３番目の反復領域をおよそ２倍になるように増やすとともに、翻訳が第１１５４番目アミノ酸残基で終止するように変異させたものである。配列番号４で示されるアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸配列は、配列番号３で示されるアミノ酸配列と同一である。
　（１－ｉ）の改変フィブロインは、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　第２の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、グリシン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。第２の改変フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＲＥＰ中の１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。
　第２の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中のＧＧＸ及びＧＰＧＸＸ（但し、Ｇはグリシン残基、Ｐはプロリン残基、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）から選ばれる少なくとも一つのモチーフ配列において、少なくとも１又は複数の当該モチーフ配列中の１つのグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
　第２の改変フィブロインは、上述のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたモチーフ配列の割合が、全モチーフ配列に対して、１０％以上であってもよい。
　第２の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、上記ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列中の全ＲＥＰに含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列中の総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが３０％以上、４０％以上、５０％以上又は５０．９％以上であるアミノ酸配列を有するものであってもよい。（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は８３％以上であってよいが、８６％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、１００％であること（アラニン残基のみで構成されることを意味する）が更により好ましい。
　第２の改変フィブロインは、ＧＧＸモチーフの１つのグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換することにより、ＸＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合を高めたものであることが好ましい。第２の改変フィブロインは、ドメイン配列中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合が３０％以下であることが好ましく、２０％以下であることがより好ましく、１０％以下であることが更に好ましく、６％以下であることが更により好ましく、４％以下であることが更によりまた好ましく、２％以下であることが特に好ましい。ドメイン配列中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合は、下記ＸＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合（ｚ／ｗ）の算出方法と同様の方法で算出することができる。
　ｚ／ｗの算出方法を更に詳細に説明する。まず、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むフィブロイン（改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン）において、ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列に含まれる全てのＲＥＰから、ＸＧＸからなるアミノ酸配列を抽出する。ＸＧＸを構成するアミノ酸残基の総数がｚである。例えば、ＸＧＸからなるアミノ酸配列が５０個抽出された場合（重複はなし）、ｚは５０×３＝１５０である。また、例えば、ＸＧＸＧＸからなるアミノ酸配列の場合のように２つのＸＧＸに含まれるＸ（中央のＸ）が存在する場合は、重複分を控除して計算する（ＸＧＸＧＸの場合は５アミノ酸残基である）。ｗは、ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列に含まれる総アミノ酸残基数である。例えば、図１に示したドメイン配列の場合、ｗは４＋５０＋４＋１００＋４＋１０＋４＋２０＋４＋３０＝２３０である（最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフは除いている。）。次に、ｚをｗで除すことによって、ｚ／ｗ（％）を算出することができる。
　ここで、天然由来のフィブロインにおけるｚ／ｗについて説明する。まず、上述のように、ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋにアミノ酸配列情報が登録されているフィブロインを例示した方法により確認したところ、６６３種類のフィブロイン（このうち、クモ類由来のフィブロインは４１５種類）が抽出された。抽出された全てのフィブロインのうち、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、フィブロイン中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合が６％以下である天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、上述の算出方法により、ｚ／ｗを算出した。その結果を図２に示す。図２の横軸はｚ／ｗ（％）を示し、縦軸は頻度を示す。図２から明らかなとおり、天然由来のフィブロインにおけるｚ／ｗは、いずれも５０．９％未満である（最も高いもので、５０．８６％）。
　第２の改変フィブロインにおいて、ｚ／ｗは、５０．９％以上であることが好ましく、５６．１％以上であることがより好ましく、５８．７％以上であることが更に好ましく、７０％以上であることが更により好ましく、８０％以上であることが更によりまた好ましい。ｚ／ｗの上限に特に制限はないが、例えば、９５％以下であってもよい。
　第２の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列から、グリシン残基をコードする塩基配列の少なくとも一部を置換して別のアミノ酸残基をコードするように改変することにより得ることができる。このとき、改変するグリシン残基として、ＧＧＸモチーフ及びＧＰＧＸＸモチーフにおける１つのグリシン残基を選択してもよいし、またｚ／ｗが５０．９％以上になるように置換してもよい。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から上記態様を満たすアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中のグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
　上記の別のアミノ酸残基としては、グリシン残基以外のアミノ酸残基であれば特に制限はないが、バリン（Ｖ）残基、ロイシン（Ｌ）残基、イソロイシン（Ｉ）残基、メチオニン（Ｍ）残基、プロリン（Ｐ）残基、フェニルアラニン（Ｆ）残基及びトリプトファン（Ｗ）残基等の疎水性アミノ酸残基、グルタミン（Ｑ）残基、アスパラギン（Ｎ）残基、セリン（Ｓ）残基、リシン（Ｋ）残基及びグルタミン酸（Ｅ）残基等の親水性アミノ酸残基が好ましく、バリン（Ｖ）残基、ロイシン（Ｌ）残基、イソロイシン（Ｉ）残基、フェニルアラニン（Ｆ）残基及びグルタミン（Ｑ）残基がより好ましく、グルタミン（Ｑ）残基が更に好ましい。
　第２の改変フィブロインのより具体的な例として、（２－ｉ）配列番号６（Ｍｅｔ－ＰＲＴ３８０）、配列番号７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）、配列番号８（Ｍｅｔ－ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号９（Ｍｅｔ－ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（２－ｉｉ）配列番号６、配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
　（２－ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号６で示されるアミノ酸配列は、天然由来のフィブロインに相当する配列番号１０（Ｍｅｔ－ＰＲＴ３１３）で示されるアミノ酸配列のＲＥＰ中の全てのＧＧＸをＧＱＸに置換したものである。配列番号７で示されるアミノ酸配列は、配列番号６で示されるアミノ酸配列から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号８で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列の各（Ａ）ｎモチーフのＣ末端側に２つのアラニン残基を挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、配列番号７の分子量とほぼ同じとなるようにＣ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号９で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中に存在する２０個のドメイン配列の領域（但し、当該領域のＣ末端側の数アミノ酸残基が置換されている。）を４回繰り返した配列のＣ末端に所定のヒンジ配列とＨｉｓタグ配列が付加されたものである。
　配列番号１０で示されるアミノ酸配列（天然由来のフィブロインに相当）におけるｚ／ｗの値は、４６．８％である。配列番号６で示されるアミノ酸配列、配列番号７で示されるアミノ酸配列、配列番号８で示されるアミノ酸配列、及び配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｚ／ｗの値は、それぞれ５８．７％、７０．１％、６６．１％及び７０．０％である。また、配列番号１０、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列のギザ比率（後述する）１：１．８～１１．３におけるｘ／ｙの値は、それぞれ１５．０％、１５．０％、９３．４％、９２．７％及び８９．８％である。
　（２－ｉ）の改変フィブロインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（２－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（２－ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（２－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＲＥＰ中に含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列中のＲＥＰの総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが５０．９％以上であることが好ましい。
　第２の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、改変フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
　タグ配列として、例えば、他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用したアフィニティタグを挙げることができる。アフィニティタグの具体例として、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を挙げることができる。Ｈｉｓタグは、ヒスチジン残基が４から１０個程度並んだ短いペプチドで、ニッケル等の金属イオンと特異的に結合する性質があるため、金属キレートクロマトグラフィー（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　ｍｅｔａｌ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による改変フィブロインの単離に利用することができる。タグ配列の具体例として、例えば、配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含むアミノ酸配列）が挙げられる。
　また、グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列を利用することもできる。
　さらに、抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用することもできる。抗原性を示すペプチド（エピトープ）をタグ配列として付加することにより、当該エピトープに対する抗体を結合させることができる。エピトープタグとして、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列）タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等を挙げることができる。エピトープタグを利用することにより、高い特異性で容易に改変フィブロインを精製することができる。
　さらにタグ配列を特定のプロテアーゼで切り離せるようにしたものも使用することができる。当該タグ配列を介して吸着したタンパク質をプロテアーゼ処理することにより、タグ配列を切り離した改変フィブロインを回収することもできる。
　タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（２－ｉｉｉ）配列番号１２（ＰＲＴ３８０）、配列番号１３（ＰＲＴ４１０）、配列番号１４（ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号１５（ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（２－ｉｖ）配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４若しくは配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
　配列番号１６（ＰＲＴ３１３）、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１０、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。
　（２－ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（２－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（２－ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（２－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＲＥＰ中に含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列中のＲＥＰの総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが５０．９％以上であることが好ましい。
　第２の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
　第３の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。第３の改変フィブロインのドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、少なくとも１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。
　第３の改変フィブロインは、天然由来のフィブロインから（Ａ）ｎモチーフを１０～４０％欠失させたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
　第３の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって１～３つの（Ａ）ｎモチーフ毎に１つの（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
　第３の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって２つ連続した（Ａ）ｎモチーフの欠失、及び１つの（Ａ）ｎモチーフの欠失がこの順に繰り返されたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
　第３の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
　第３の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８～１１．３となる隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが２０％以上、３０％以上、４０％以上又は５０％以上であるアミノ酸配列を有するものであってもよい。（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は８３％以上であってよいが、８６％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、１００％であること（アラニン残基のみで構成されることを意味する）が更により好ましい。
　ｘ／ｙの算出方法を図１を参照しながら更に詳細に説明する。図１には、改変フィブロインからＮ末端配列及びＣ末端配列を除いたドメイン配列を示す。当該ドメイン配列は、Ｎ末端側（左側）から（Ａ）ｎモチーフ－第１のＲＥＰ（５０アミノ酸残基）－（Ａ）ｎモチーフ－第２のＲＥＰ（１００アミノ酸残基）－（Ａ）ｎモチーフ－第３のＲＥＰ（１０アミノ酸残基）－（Ａ）ｎモチーフ－第４のＲＥＰ（２０アミノ酸残基）－（Ａ）ｎモチーフ－第５のＲＥＰ（３０アミノ酸残基）－（Ａ）ｎモチーフという配列を有する。
　隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットは、重複がないように、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、順次選択する。このとき、選択されない［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットが存在してもよい。図１には、パターン１（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較、及び第３のＲＥＰと第４のＲＥＰの比較）、パターン２（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較、及び第４のＲＥＰと第５のＲＥＰの比較）、パターン３（第２のＲＥＰと第３のＲＥＰの比較、及び第４のＲＥＰと第５のＲＥＰの比較）、パターン４（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較）を示した。なお、これ以外にも選択方法は存在する。
　次に各パターンについて、選択した隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニット中の各ＲＥＰのアミノ酸残基数を比較する。比較は、よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときの、他方のアミノ酸残基数の比を求めることによって行う。例えば、第１のＲＥＰ（５０アミノ酸残基）と第２のＲＥＰ（１００アミノ酸残基）の比較の場合、よりアミノ酸残基数の少ない第１のＲＥＰを１としたとき、第２のＲＥＰのアミノ酸残基数の比は、１００／５０＝２である。同様に、第４のＲＥＰ（２０アミノ酸残基）と第５のＲＥＰ（３０アミノ酸残基）の比較の場合、よりアミノ酸残基数の少ない第４のＲＥＰを１としたとき、第５のＲＥＰのアミノ酸残基数の比は、３０／２０＝１．５である。
　図１中、よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときに、他方のアミノ酸残基数の比が１．８～１１．３となる［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットの組を実線で示した。本明細書中、この比をギザ比率と呼ぶ。よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときに、他方のアミノ酸残基数の比が１．８未満又は１１．３超となる［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットの組は破線で示した。
　各パターンにおいて、実線で示した隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットの全てのアミノ酸残基数を足し合わせる（ＲＥＰのみではなく、（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数もである。）。そして、足し合わせた合計値を比較して、当該合計値が最大となるパターンの合計値（合計値の最大値）をｘとする。図１に示した例では、パターン１の合計値が最大である。
　次に、ｘをドメイン配列の総アミノ酸残基数ｙで除すことによって、ｘ／ｙ（％）を算出することができる。
　第３の改変フィブロインにおいて、ｘ／ｙは、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、６５％以上であることが更に好ましく、７０％以上であることが更により好ましく、７５％以上であることが更によりまた好ましく、８０％以上であることが特に好ましい。ｘ／ｙの上限に特に制限はなく、例えば、１００％以下であってよい。ギザ比率が１：１．９～１１．３の場合には、ｘ／ｙは８９．６％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．８～３．４の場合には、ｘ／ｙは７７．１％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．９～８．４の場合には、ｘ／ｙは７５．９％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．９～４．１の場合には、ｘ／ｙは６４．２％以上であることが好ましい。
　第３の改変フィブロインが、ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）ｎモチーフの少なくとも７つがアラニン残基のみで構成される改変フィブロインである場合、ｘ／ｙは、４６．４％以上であることが好ましく、５０％以上であることがより好ましく、５５％以上であることが更に好ましく、６０％以上であることが更により好ましく、７０％以上であることが更によりまた好ましく、８０％以上であることが特に好ましい。ｘ／ｙの上限に特に制限はなく、１００％以下であればよい。
　ここで、天然由来のフィブロインにおけるｘ／ｙについて説明する。まず、上述のように、ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋにアミノ酸配列情報が登録されているフィブロインを例示した方法により確認したところ、６６３種類のフィブロイン（このうち、クモ類由来のフィブロインは４１５種類）が抽出された。抽出された全てのフィブロインのうち、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列で構成される天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、上述の算出方法により、ｘ／ｙを算出した。ギザ比率が１：１．９～４．１の場合の結果を図３に示す。
　図３の横軸はｘ／ｙ（％）を示し、縦軸は頻度を示す。図３から明らかなとおり、天然由来のフィブロインにおけるｘ／ｙは、いずれも６４．２％未満である（最も高いもので、６４．１４％）。
　第３の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列から、ｘ／ｙが６４．２％以上になるように（Ａ）ｎモチーフをコードする配列の１又は複数を欠失させることにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、ｘ／ｙが６４．２％以上になるように１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
　第３の改変フィブロインのより具体的な例として、（３－ｉ）配列番号１７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ３９９）、配列番号７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）、配列番号８（Ｍｅｔ－ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号９（Ｍｅｔ－ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（３－ｉｉ）配列番号１７、配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
　（３－ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号１７で示されるアミノ酸配列は、天然由来のフィブロインに相当する配列番号１０（Ｍｅｔ－ＰＲＴ３１３）で示されるアミノ酸配列から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列は、第２の改変フィブロインで説明したとおりである。
　配列番号１０で示されるアミノ酸配列（天然由来のフィブロインに相当）のギザ比率１：１．８～１１．３におけるｘ／ｙの値は１５．０％である。配列番号１７で示されるアミノ酸配列、及び配列番号７で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、いずれも９３．４％である。配列番号８で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、９２．７％である。配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、８９．８％である。配列番号１０、配列番号１７、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｚ／ｗの値は、それぞれ４６．８％、５６．２％、７０．１％、６６．１％及び７０．０％である。
　（３－ｉ）の改変フィブロインは、配列番号１７、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（３－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１７、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（３－ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（３－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１７、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＮ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８～１１．３（ギザ比率が１：１．８～１１．３）となる隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが６４．２％以上であることが好ましい。
　第３の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方に上述したタグ配列を含んでいてもよい。
　タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（３－ｉｉｉ）配列番号１８（ＰＲＴ３９９）、配列番号１３（ＰＲＴ４１０）、配列番号１４（ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号１５（ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（３－ｉｖ）配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４若しくは配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
　配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１７、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。
　（３－ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（３－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（３－ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（３－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＮ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８～１１．３となる隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが６４．２％以上であることが好ましい。
　第３の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
　第４の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたことに加え、グリシン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有するものである。第４の改変フィブロインのドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、少なくとも１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに加え、更に少なくともＲＥＰ中の１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。すなわち、第４の改変フィブロインは、上述した第２の改変フィブロインと、第３の改変フィブロインの特徴を併せ持つ改変フィブロインである。具体的な態様等は、第２の改変フィブロイン、及び第３の改変フィブロインで説明したとおりである。
　第４の改変フィブロインのより具体的な例として、（４－ｉ）配列番号７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）、配列番号８（Ｍｅｔ－ＰＲＴ５２５）、配列番号９（Ｍｅｔ－ＰＲＴ７９９）、配列番号１３（ＰＲＴ４１０）、配列番号１４（ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号１５（ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（４－ｉｉ）配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４若しくは配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロインの具体的な態様は上述のとおりである。
　第５の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むアミノ酸配列を有するものであってよい。
　局所的に疎水性指標の大きい領域は、連続する２～４アミノ酸残基で構成されていることが好ましい。
　上述の疎水性指標の大きいアミノ酸残基は、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）から選ばれるアミノ酸残基であることがより好ましい。
　第５の改変フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する改変に加え、更に、天然由来のフィブロインと比較して、１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変があってもよい。
　第５の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がマイナスであるアミノ酸残基）を疎水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基）に置換すること、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基に置換したこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基に置換したこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
　第５の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を上記ドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を上記ドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であるアミノ酸配列を有してもよい。
　アミノ酸残基の疎水性指標については、公知の指標（Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ　ｉｎｄｅｘ：Ｋｙｔｅ　Ｊ，＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ　Ｒ（１９８２）“Ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ　ｔｈｅ　ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ　ｃｈａｒａｃｔｅｒ　ｏｆ　ａ　ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７，ｐｐ．１０５－１３２）を使用する。具体的には、各アミノ酸の疎水性指標（ハイドロパシー・インデックス、以下「ＨＩ」とも記す。）は、下記表１に示すとおりである。
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　ｐ／ｑの算出方法を更に詳細に説明する。算出には、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列（以下、「配列Ａ」とする）を用いる。まず、配列Ａに含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値を算出する。疎水性指標の平均値は、連続する４アミノ酸残基に含まれる各アミノ酸残基のＨＩの総和を４（アミノ酸残基数）で除して求める。疎水性指標の平均値は、全ての連続する４アミノ酸残基について求める（各アミノ酸残基は、１～４回平均値の算出に用いられる。）。次いで、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域を特定する。あるアミノ酸残基が、複数の「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」に該当する場合であっても、領域中には１アミノ酸残基として含まれることになる。そして、当該領域に含まれるアミノ酸残基の総数がｐである。また、配列Ａに含まれるアミノ酸残基の総数がｑである。
　例えば、「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が２０カ所抽出された場合（重複はなし）、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域には、連続する４アミノ酸残基（重複はなし）が２０含まれることになり、ｐは２０×４＝８０である。また、例えば、２つの「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が１アミノ酸残基だけ重複して存在する場合、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域には、７アミノ酸残基含まれることになる（ｐ＝２×４－１＝７。「－１」は重複分の控除である。）。例えば、図４に示したドメイン配列の場合、「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が重複せずに７つ存在するため、ｐは７×４＝２８となる。また、例えば、図４に示したドメイン配列の場合、ｑは４＋５０＋４＋４０＋４＋１０＋４＋２０＋４＋３０＝１７０である（Ｃ末端側の最後に存在する（Ａ）ｎモチーフは含めない）。次に、ｐをｑで除すことによって、ｐ／ｑ（％）を算出することができる。図４の場合２８／１７０＝１６．４７％となる。
　第５の改変フィブロインにおいて、ｐ／ｑは、６．２％以上であることが好ましく、７％以上であることがより好ましく、１０％以上であることが更に好ましく、２０％以上であることが更により好ましく、３０％以上であることが更によりまた好ましい。ｐ／ｑの上限は、特に制限されないが、例えば、４５％以下であってもよい。
　第５の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインのアミノ酸配列を、上記のｐ／ｑの条件を満たすように、ＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がマイナスであるアミノ酸残基）を疎水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基）に置換すること、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入することにより、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むアミノ酸配列に改変することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から上記のｐ／ｑの条件を満たすアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当する改変を行ってもよい。
　疎水性指標の大きいアミノ酸残基としては、特に制限はないが、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）が好ましく、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びイソロイシン（Ｉ）がより好ましい。
　第５の改変フィブロインのより具体的な例として、（５－ｉ）配列番号１９（Ｍｅｔ－ＰＲＴ７２０）、配列番号２０（Ｍｅｔ－ＰＲＴ６６５）若しくは配列番号２１（Ｍｅｔ－ＰＲＴ６６６）で示されるアミノ酸配列、又は（５－ｉｉ）配列番号１９、配列番号２０若しくは配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
　（５－ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号１９で示されるアミノ酸配列は、配列番号７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）で示されるアミノ酸配列に対し、Ｃ末端側の端末のドメイン配列を除いて、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を２カ所挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、かつＣ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号２０で示されるアミノ酸配列は、配列番号８（Ｍｅｔ－ＰＲＴ５２５）で示されるアミノ酸配列に対し、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を１カ所挿入したものである。配列番号２１で示されるアミノ酸配列は、配列番号８で示されるアミノ酸配列に対し、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を２カ所挿入したものである。
　（５－ｉ）の改変フィブロインは、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（５－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（５－ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（５－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であることが好ましい。
　第５の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。
　タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（５－ｉｉｉ）配列番号２２（ＰＲＴ７２０）、配列番号２３（ＰＲＴ６６５）若しくは配列番号２４（ＰＲＴ６６６）で示されるアミノ酸配列、又は（５－ｉｖ）配列番号２２、配列番号２３若しくは配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
　配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２４で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。
　（５－ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号２２、配列番号２３又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（５－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号２２、配列番号２３又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（５－ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（５－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号２２、配列番号２３又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であることが好ましい。
　第５の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
　第６の改変フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、グルタミン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。
　第６の改変フィブロインは、ＲＥＰのアミノ酸配列中に、ＧＧＸモチーフ及びＧＰＧＸＸモチーフから選ばれる少なくとも一つのモチーフが含まれていることが好ましい。
　第６の改変フィブロインが、ＲＥＰ中にＧＰＧＸＸモチーフを含む場合、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率は、通常１％以上であり、５％以上であってもよく、１０％以上であるのが好ましい。ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の上限に特に制限はなく、５０％以下であってよく、３０％以下であってもよい。
　本明細書において、「ＧＰＧＸＸモチーフ含有率」は、以下の方法により算出される値である。
　式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロイン（改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン）において、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域に含まれるＧＰＧＸＸモチーフの個数の総数を３倍した数（即ち、ＧＰＧＸＸモチーフ中のＧ及びＰの総数に相当）をｓとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率はｓ／ｔとして算出される。
　ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としているのは、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列」（ＲＥＰに相当する配列）には、フィブロインに特徴的な配列と相関性の低い配列が含まれることがあり、ｍが小さい場合（つまり、ドメイン配列が短い場合）、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出結果に影響するので、この影響を排除するためである。なお、ＲＥＰのＣ末端に「ＧＰＧＸＸモチーフ」が位置する場合、「ＸＸ」が例えば「ＡＡ」の場合であっても、「ＧＰＧＸＸモチーフ」として扱う。
　図５は、改変フィブロインのドメイン配列を示す模式図である。図５を参照しながらＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出方法を具体的に説明する。まず、図５に示した改変フィブロインのドメイン配列（「［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフ」タイプである。）では、全てのＲＥＰが「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」（図５中、「領域Ａ」で示した配列。）に含まれているため、ｓを算出するためのＧＰＧＸＸモチーフの個数は７であり、ｓは７×３＝２１となる。同様に、全てのＲＥＰが「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」（図５中、「領域Ａ」で示した配列。）に含まれているため、当該配列から更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数ｔは５０＋４０＋１０＋２０＋３０＝１５０である。次に、ｓをｔで除すことによって、ｓ／ｔ（％）を算出することができ、図５の改変フィブロインの場合２１／１５０＝１４．０％となる。
　第６の改変フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましく、７％以下であることがより好ましく、４％以下であることが更に好ましく、０％であることが特に好ましい。
　本明細書において、「グルタミン残基含有率」は、以下の方法により算出される値である。
　式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロイン（改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン）において、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列（図５の「領域Ａ」に相当する配列。）に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域に含まれるグルタミン残基の総数をｕとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、グルタミン残基含有率はｕ／ｔとして算出される。グルタミン残基含有率の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。
　第６の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、又は他のアミノ酸残基に置換したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってよい。
　「他のアミノ酸残基」は、グルタミン残基以外のアミノ酸残基であればよいが、グルタミン残基よりも疎水性指標の大きいアミノ酸残基であることが好ましい。アミノ酸残基の疎水性指標は表１に示すとおりである。
　表１に示すとおり、グルタミン残基よりも疎水性指標の大きいアミノ酸残基としては、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、プロリン（Ｐ）及びヒスチジン（Ｈ）から選ばれるアミノ酸残基を挙げることができる。これらの中でも、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）から選ばれるアミノ酸残基であることがより好ましく、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びフェニルアラニン（Ｆ）から選ばれるアミノ酸残基であることが更に好ましい。
　第６の改変フィブロインは、ＲＥＰの疎水性度が、－０．８以上であることが好ましく、－０．７以上であることがより好ましく、０以上であることが更に好ましく、０．３以上であることが更により好ましく、０．４以上であることが特に好ましい。ＲＥＰの疎水性度の上限に特に制限はなく、１．０以下であってよく、０．７以下であってもよい。
　本明細書において、「ＲＥＰの疎水性度」は、以下の方法により算出される値である。
　式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロイン（改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン）において、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列（図５の「領域Ａ」に相当する配列。）に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域の各アミノ酸残基の疎水性指標の総和をｖとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、ＲＥＰの疎水性度はｖ／ｔとして算出される。ＲＥＰの疎水性度の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。
　第６の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変があってもよい。
　第６の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列からＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失させること、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。
　第６の改変フィブロインのより具体的な例として、（６－ｉ）配列番号２５（Ｍｅｔ－ＰＲＴ８８８）、配列番号２６（Ｍｅｔ－ＰＲＴ９６５）、配列番号２７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ８８９）、配列番号２８（Ｍｅｔ－ＰＲＴ９１６）、配列番号２９（Ｍｅｔ－ＰＲＴ９１８）、配列番号３０（Ｍｅｔ－ＰＲＴ６９９）、配列番号３１（Ｍｅｔ－ＰＲＴ６９８）、配列番号３２（Ｍｅｔ－ＰＲＴ９６６）、配列番号４１（Ｍｅｔ－ＰＲＴ９１７）若しくは配列番号４２（Ｍｅｔ－ＰＲＴ１０２８）で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロイン、又は（６－ｉｉ）配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１若しくは配列番号４２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変フィブロインを挙げることができる。
　（６－ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号２５で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）中のＱＱを全てＶＬに置換したものである。配列番号２６で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＴＳに置換し、かつ残りのＱをＡに置換したものである。配列番号２７で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＬに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。配列番号２８で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＩに置換し、かつ残りのＱをＬに置換したものである。配列番号２９で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＦに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。
　配列番号３０で示されるアミノ酸配列は、配列番号８で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ－ＰＲＴ５２５）中のＱＱを全てＶＬに置換したものである。配列番号３１で示されるアミノ酸配列は、配列番号８で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＬに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。
　配列番号３２で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）中に存在する２０個のドメイン配列の領域を２回繰り返した配列中のＱＱを全てＶＦに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。
　配列番号４１で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ－ＰＲＴ９１７）は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＬＩに置換し、かつ残りのＱをＶに置換したものである。配列番号４２で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ－ＰＲＴ１０２８）は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＩＦに置換し、かつ残りのＱをＴに置換したものである。
　配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１及び配列番号４２で示されるアミノ酸配列は、いずれもグルタミン残基含有率は９％以下である（表２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（６－ｉ）の改変フィブロインは、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１又は配列番号４２で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（６－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１又は配列番号４２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（６－ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（６－ｉｉ）の改変フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましい。また、（６－ｉｉ）の改変フィブロインは、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率が１０％以上であることが好ましい。
　第６の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、改変フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
　タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（６－ｉｉｉ）配列番号３３（ＰＲＴ８８８）、配列番号３４（ＰＲＴ９６５）、配列番号３５（ＰＲＴ８８９）、配列番号３６（ＰＲＴ９１６）、配列番号３７（ＰＲＴ９１８）、配列番号３８（ＰＲＴ６９９）、配列番号３９（ＰＲＴ６９８）、配列番号４０（ＰＲＴ９６６）、配列番号４３（ＰＲＴ９１７）若しくは配列番号４４（ＰＲＴ１０２８）で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロイン、又は（６－ｉｖ）配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４３若しくは配列番号４４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変フィブロインを挙げることができる。
　配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４３及び配列番号４４で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１及び配列番号４２で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。Ｎ末端にタグ配列を付加しただけであるため、グルタミン残基含有率に変化はなく、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４３及び配列番号４４で示されるアミノ酸配列は、いずれもグルタミン残基含有率が９％以下である（表３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　（６－ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４３又は配列番号４４で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（６－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４３又は配列番号４４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（６－ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（６－ｉｖ）の改変フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましい。また、（６－ｉｖ）の改変フィブロインは、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率が１０％以上であることが好ましい。
　第６の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
　改変フィブロインは、第１の改変フィブロイン、第２の改変フィブロイン、第３の改変フィブロイン、第４の改変フィブロイン、第５の改変フィブロイン、及び第６の改変フィブロインが有する特徴のうち、少なくとも２つ以上の特徴を併せ持つ改変フィブロインであってもよい。
　改変フィブロインとしては、難燃性により優れることから、親水性改変フィブロインであることが好ましい。本明細書において、「親水性改変フィブロイン」とは、改変フィブロインを構成する全てのアミノ酸残基の疎水性指標（ＨＩ）の総和を求め、次にその総和を全アミノ酸残基数で除した値（平均ＨＩ）が０以下である改変フィブロインである。疎水性指標は表１に示したとおりである。また、平均ＨＩが０超である改変フィブロインを疎水性改変フィブロインと呼ぶこともある。
　親水性改変フィブロインとしては、例えば、配列番号４で示されるアミノ酸配列、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列、配列番号１３、配列番号１１、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列、配列番号１８、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列、配列番号１７、配列番号１１、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロインが挙げられる。
　疎水性改変フィブロインとしては、例えば、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３又は配列番号４３で示されるアミノ酸配列、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１又は配列番号４４で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロインが挙げられる。
（改変フィブロインの製造方法）
　上記いずれの実施形態に係る改変フィブロインも、例えば、当該改変フィブロインをコードする核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する発現ベクターで形質転換された宿主により、当該核酸を発現させることにより生産することができる。
　改変フィブロインをコードする核酸の製造方法は、特に制限されない。例えば、天然のフィブロインをコードする遺伝子を利用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅しクローニングし、遺伝子工学的手法により改変する方法、又は、化学的に合成する方法によって、当該核酸を製造することができる。核酸の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどより入手したフィブロインのアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ　１０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結する方法によって遺伝子を化学的に合成することができる。この際に、改変フィブロインの精製及び／又は確認を容易にするため、上記のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなる改変フィブロインをコードする核酸を合成してもよい。
　調節配列は、宿主における改変フィブロインの発現を制御する配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等）であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。プロモーターとして、宿主細胞中で機能し、改変フィブロインを発現誘導可能な誘導性プロモーターを用いてもよい。誘導性プロモーターは、誘導物質（発現誘導剤）の存在、リプレッサー分子の非存在、又は温度、浸透圧若しくはｐＨ値の上昇若しくは低下等の物理的要因により、転写を制御できるプロモーターである。
　発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主の染色体中への組込みが可能で、改変フィブロインをコードする核酸を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが好適に用いられる。
　宿主として、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも好適に用いることができる。
　原核生物の宿主の好ましい例として、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する細菌を挙げることができる。エシェリヒア属に属する微生物として、例えば、エシェリヒア・コリ等を挙げることができる。ブレビバチルス属に属する微生物として、例えば、ブレビバチルス・アグリ等を挙げることができる。セラチア属に属する微生物として、例えば、セラチア・リクエファシエンス等を挙げることができる。バチルス属に属する微生物として、例えば、バチルス・サチラス等を挙げることができる。ミクロバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム等を挙げることができる。ブレビバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ブレビバクテリウム・ディバリカタム等を挙げることができる。コリネバクテリウム属に属する微生物として、例えば、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス等を挙げることができる。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物として、例えば、シュードモナス・プチダ等を挙げることができる。
　原核生物を宿主とする場合、改変フィブロインをコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２（ベーリンガーマンハイム社製）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＣｏｌｄ、ｐＵＢ１１０、ｐＮＣＯ２（特開２００２－２３８５６９号公報）等を挙げることができる。
　真核生物の宿主としては、例えば、酵母及び糸状真菌（カビ等）を挙げることができる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属等に属する酵母を挙げることができる。糸状真菌としては、例えば、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属等に属する糸状真菌を挙げることができる。
　真核生物を宿主とする場合、改変フィブロインをコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）等を挙げることができる。上記宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、コンピテント法等を挙げることができる。
　発現ベクターで形質転換された宿主による核酸の発現方法としては、直接発現のほか、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
　改変フィブロインは、例えば、発現ベクターで形質転換された宿主を培養培地中で培養し、培養培地中に当該改変フィブロインを生成及び蓄積させ、該培養培地から採取することにより製造することができる。宿主を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。
　宿主が、大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、培養培地として、宿主が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有し、宿主の培養を効率的に行える培地であれば天然培地及び合成培地のいずれを用いてもよい。
　炭素源としては、上記形質転換微生物が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類を用いることができる。窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。無機塩類としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。
　大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物の培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は、例えば、１５～４０℃である。培養時間は、通常１６時間～７日間である。培養中の培養培地のｐＨは３．０～９．０に保持することが好ましい。培養培地のｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。
　また、培養中、必要に応じて、アンピシリン及びテトラサイクリン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
　発現させた改変フィブロインの単離及び精製は通常用いられている方法で行うことができる。例えば、当該改変フィブロインが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、宿主細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁した後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー及びダイノミル等により宿主細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法、すなわち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ　ＨＰＡ－７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の方法を単独又は組み合わせて使用し、精製標品を得ることができる。
　また、改変フィブロインが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に宿主細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として改変フィブロインの不溶体を回収する。回収した改変フィブロインの不溶体はタンパク質変性剤で可溶化することができる。該操作の後、上記と同様の単離精製法により改変フィブロインの精製標品を得ることができる。当該改変フィブロインが細胞外に分泌された場合には、培養上清から当該改変フィブロインを回収することができる。すなわち、培養物を遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、その培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
＜原材料＞
　本実施形態に係る原材料は、難燃性を付与する必要のある材料であり、かつ、タンパク質を含浸させ又はタンパク質でコーティングできる材料あれば特に限定されない。例えば、木材、木質ボード、紙、段ボールやそれらの混合物である木質材や、草、竹、稲わらなどのセルロース系材料、陶器、石、セメント、ガラスなどの無機材料、ポリエステル、ポリアミド、アクリル、ポリプロピレンなどの合成系材料（樹脂等）を挙げることができる。材料全体の生分解性を保つという観点から木質材やセルロース材料がより好ましい。
　また、難燃性の需要の観点から、建築材料若しくは建設材料、電気電化製品、日用品、衣服などが挙げられるが、特に建築材料であることが好ましい。建築材料は、建築物の構造や仕上げに使用される材料の総称であり、例えば建築基準法に基づくがこれに限られない。建設材料は、建設構造物を構成する材料の総称であり、その材質は例えば鉄鋼、コンクリート、木材、石材、高分子材料、繊維材料が挙げられるが、これらに限られない。建築材料又は建設材料としては、構造躯体に使用する構造材、外装材及び内装材などの仕上げ材などが挙げられる、材質としては、特にセルロース材（繊維材）等が挙げられ、木質材であることが好ましい。木質材として、丸太や製材製品のほかに、集成材、合板なども含まれる。
＜難燃性材料＞
　本実施形態に係る難燃性材料は、原材料に１種以上の難燃性かつ難溶性のタンパク質を含浸させ、及び／又は、上記原材料の表面を１種以上の難燃性かつ難溶性のタンパク質でコーティングしたものであり、好ましくは原材料に１種以上の難燃性かつ難溶性のタンパク質を含浸させたものであり、また、原材料に１種以上の難燃性かつ難溶性のタンパク質を含浸させ、かつ、上記原材料の表面を１種以上の難燃性かつ難溶性のタンパク質でコーティングしたものであってもよい。一実施形態の難燃性材料は、原材料に１種以上の改変フィブロインを含浸させたものであり、また、原材料に１種以上の改変フィブロインを含浸させ、かつ、原材料の表面を１種以上の改変フィブロインでコーティングしたものであってもよい。
　１種以上のタンパク質を含浸させた難燃性材料において、該１種以上のタンパク質が原材料の内部に浸透しており、均一又は不均一に原材料の内部に分散され、原材料と一体となる。含浸させ乾燥させた後の難燃性材料の重量と、含浸前の原材料の重量との重量差を含浸量とすることができる。原材料の表面を１種以上のタンパク質でコーティングした難燃性材料において、該１種以上のタンパク質が原材料の表面においてフィルム状に存在しており、連続的に又は断続的に原材料の表面の少なくとも一部を覆う。コーティングし乾燥させた後の難燃性材料の重量と、コーティング前の原材料の重量との重量差をコーティング量とすることができる。また、コーティングの場合の塗膜の厚さは所望の難燃性及び／又は強度によって適宜に設定することができるが、例えば、０．０１μｍ～５００μｍであってよく、１μｍ～１００μｍであることが好ましい。タンパク質を含浸又はコーティングすることで、原材料の強度が向上させることもできる。なお、含浸方法及びコーティング方法に関しては、後述の製造方法にて詳細に説明する。
　難燃性材料における難燃性付与剤であるタンパク質の含有量（含浸及びコーティングの両方を合わせた含有量）は、難燃性材料全量を基準として、１質量％以上であることが好ましく、５質量％以上であることがより好ましく、１０質量％以上であることが更に好ましく、２０質量％以上であることが更により好ましい。タンパク質の含有量の上限は、難燃性材料全量を基準として、９９質量％であってもよく、５０質量％以下であってもよい。難燃性材料におけるタンパク質の含有量を調節することで、難燃性材料の難燃性を制御することができる。すなわち、本発明に係るタンパク質は、難燃性に優れているため、難燃性材料におけるタンパク質の含有量を高めるにつれて、難燃性材料の難燃性をより高くすることができる。
　難燃性材料を水に２４時間浸漬した後のタンパク質の含有量が、浸漬前の難燃性材料におけるタンパク質の含有量と比較して質量比で５０％以上維持されることが好ましく、６０％以上、７０％以上、８０％以上、又は９０％以上維持されることがより好ましい。ここで、実験条件としては、室温（２５℃前後）である。
〔タンパク質含有材の製造方法〕
　本発明のタンパク質含有材の製造方法は、１種以上の難燃性かつ難溶性のタンパク質を含むタンパク質含有液を原材料に含浸させて上記原材料の内部にタンパク質含有部を形成する工程、及び／又は、上記タンパク質含有液で上記原材料の表面をコーティングして上記原材料の表面にタンパク質含有部を形成する工程を含む。１種以上の難燃性かつ難溶性のタンパク質（難燃性付与剤）及び原材料は、上述のとおりである。
（タンパク質含有材）
　本発明の製造方法によって製造されるタンパク質含有材は、１種以上の難燃性かつ難溶性のタンパク質が含浸及び／又はコーティングされた原材料であり、難燃性材料であり得る。難燃性材料は上述のとおりである。タンパク質含有部とは、タンパク質を含有する領域といい、原材料の内部におけるタンパク質含有部は、タンパク質が原材料の一部又は全部に均一又は不均一に分散された領域をいい、原材料の表面におけるタンパク質含有部とは、原材料の表面にフィルム状のタンパク質（タンパク質の塗膜）が連続的に又は断続的に存在する領域をいう。タンパク質含有材は、難燃性材料であり得る。
（タンパク質含有液）
　本実施形態に係るタンパク質含有液は、タンパク質を分散又は溶解した液体であってよく、タンパク質の溶液であることが好ましい。溶媒としては、特に限定されないが、環境への負荷を低減する観点から、水であることが好ましい。タンパク質含有液の調製方法は特に限定されない。タンパク質は溶媒中に分散していてもよく、溶解していてもいい。材料に含浸させるためには溶解させることがより好ましい。
　例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ギ酸、及びヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）等のような有機溶媒や、尿素等のカオトロビック剤を用いた水溶液に溶解しても良い。当該溶媒には、溶解促進剤として無機塩を添加してもよい。
　タンパク質を含有する水分散液に圧力を印加することにより、タンパク質の水への溶解性を向上させることが可能である。例えば、０．１０２ＭＰａ以上の圧力、より好ましくは０．１０６ＭＰａ以上の圧力、より好ましくは０．１１０ＭＰａ、より好ましくは０．１５０ＭＰａ、さらに好ましくは０．２００ＭＰａ、特に好ましくは０．５００ＭＰａ以上の圧力を印加することが好ましい。ここで、圧力は上述のとおり絶対圧である。尿素や金属塩のような可溶化剤を使用せずにタンパク質を容易に水に溶かすことができる。そのため、透析等の工程を経ずとも、簡便に高濃度のタンパク質溶液を調製することができる。このように溶解後の精製に係る労力が省けるため、この溶液調製法がより好ましいといえる。こうした調製法が適用できるタンパク質にはフィブロインや大豆タンパク質が挙げられ、これらから１種類又は２種類以上を選択し難燃性付与剤として使用することが好ましい。
　タンパク質溶液を作製する場合には熱をかけてもよく、温度は特に限定されない。５０℃以上が好ましく、８０℃以上がより好ましく、１００℃以上がさらに好ましい。タンパク質水溶液を効率よく作製でき、また高い難燃性を示す傾向がみられることから疎水性指標の平均値（平均ＨＩ）が０以下のタンパク質を用いることがより好ましい。
　タンパク質を含有する分散液に圧力を印加することによりタンパク質溶液をつくるために必要な条件、すなわち、溶解溶媒、対象となるタンパク質の種類、温度、圧力等についてはＷＯ２０１７／０９４７２２に記載されている。
（含浸工程）
　含浸工程において、１種以上の難燃性かつ難溶性のタンパク質を含むタンパク質含有液を原材料に含浸させて原材料の内部にタンパク質含有部を形成する工程である。含浸方法は特に限定されないが、タンパク質含有液と原材料の一部又は全部とを接触させることによりタンパク質を原材料の内部に導入できる方法であればよい。例えば、原材料をあらかじめ乾燥させた後、タンパク質含有液と接触させながら、加圧と減圧を行うことで、効率よくタンパク質を原材料の内部に導入することができる。例えば、オートクレーブなどの装置を使い、高温条件で加圧と減圧を行うとより原材料へのタンパク質導入効率が向上する。高圧力高温（例えば４０～２００℃）、長時間（例えば５～３００分）、及び、加圧（例えば０．１０２ＭＰａ～１００ＭＰａの圧力）と減圧（例えば、加圧状態から常圧への減圧あるいは０．００１ＭＰａ～０．１０ＭＰａの減圧）との繰り返しによりタンパク質の導入量を増加させることができる。詳しい工程は、例えば特開２００３－２１１４１２号公報に記載されている。
（コーティング工程）
　コーティング工程において、１種以上の難燃性かつ難溶性のタンパク質を含むタンパク質含有液で原材料の表面をコーティングして原材料の表面にタンパク質含有部を形成する工程である。コーティング方法は特に限定されないが、原材料に好適な方法を適用することができる。例示的な方法としては、タンパク質含有液に原材料の一部又は全部を漬ける方法、原材料に対してタンパク質含有液を吹き付ける方法、又は、原材料にタンパク質含有液を塗布する方法などが挙げられる。あらかじめ作成したフィルム状のタンパク質薄膜を貼り付けてもよい。コーティングの塗膜の厚みが厚いほど高い難燃効果を得ることができる。
　以下、実施例等に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
〔改変フィブロインの製造〕
（１）発現ベクターの作製
　配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン（ＰＲＴ７９９）を設計した。設計した改変フィブロインをコードする核酸を合成した。当該核酸には、５’末端にＮｄｅＩサイト、終止コドン下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した。この核酸をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。その後、同核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した後、タンパク質発現ベクターｐＥＴ－２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。
（２）タンパク質の発現
　得られた発現ベクターで、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。当該形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。当該培養液を、アンピシリンを含む１００ｍＬのシード培養用培地（表４）にＯＤ６００が０．００５となるように添加した。培養液温度を３０℃に保ち、ＯＤ６００が５になるまでフラスコ培養を行い（約１５時間）、シード培養液を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　当該シード培養液を５００ｍＬの生産培地（表５）を添加したジャーファーメンターにＯＤ６００が０．０５となるように添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ　１２０ｇ／１Ｌ）を１ｍＬ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにし、２０時間培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、改変フィブロインを発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存した目的とする改変フィブロインサイズのバンドの出現により、目的とする改変フィブロインの発現を確認した。
（３）タンパク質の精製
　ＩＰＴＧを添加してから２時間後に回収した菌体を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の菌体を約１ｍＭのＰＭＳＦを含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ　Ｎｉｒｏ　Ｓｏａｖｉ社製）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８Ｍ　グアニジン緩衝液（８Ｍ　グアニジン塩酸塩、１０ｍＭ　リン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で懸濁し、６０℃で３０分間、スターラーで撹拌し、溶解させた。溶解後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分を除き、凍結乾燥粉末を回収することにより、改変フィブロイン（ＰＲＴ７９９、２００ｋＤａ）を得た。
＜実施例１：タンパク質そのものの難燃性の測定＞
〔タンパク質水溶液の製造〕
　４．０質量％になるようにＬｉＣｌを溶解させたジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を溶媒として用意し、そこに改変フィブロインの凍結乾燥粉末を、濃度２４質量％となるよう添加し、シェーカーを使用して３時間溶解させた。その後、不溶物と泡を取り除き、改変フィブロイン溶液（紡糸原液）を得た。
　調製した紡糸原液を９０℃にて目開き５μｍの金属フィルターで濾過し、次いで３０ｍＬのステンレスシリンジ内で静置し、脱泡させた後に、ニードル径０．２ｍｍのソリッドノズルから１００質量％メタノール凝固浴槽中へ吐出させた。吐出温度は９０℃であった。凝固後、得られた原糸を巻き取り、自然乾燥させて改変フィブロイン繊維（原料繊維）を得た。
〔編地の製造〕
　得られた原料繊維（撚り合せたフィラメント糸）を使用して、丸編機を使用した丸編みで編地を製造した。編地は、太さ１８０デニール、ゲージ数１８とした。得られた編地から２０ｇ切り出して試験片とした。
〔燃焼性試験〕
　燃焼性試験は、消防庁危険物規制課長　消防危５０号平成７年５月３１日の粉粒状又は融点の低い合成樹脂の試験方法に準拠した。試験は、温度２２℃、相対湿度４５％、気圧１０２１ｈＰａの条件下で実施した。測定結果（酸素濃度（％）、燃焼率（％）、換算燃焼率（％））を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　難燃性試験の結果、改変フィブロイン（ＰＲＴ７９９）繊維で編んだ編地の限界酸素指数（ＬＯＩ）値は２７．２であった。一般にＬＯＩ値が２６以上あれば自己消火性の特性があり、難燃性があるとされる。改変フィブロインは、難燃性に優れていることが分かる。したがって、改変フィブロイン単独で、又は改変フィブロインを他の材料と混ぜ込む等して物品を製造することにより、難燃性に優れる物品を得ることができる。
　続く試験ではＰＲＴ７９９と同じ配列であり、分子量の異なるＰＲＴ４１０（５０ｋＤａ）とＰＲＴ５８７（１００ｋＤａ）を用いる。これらの難燃性については、同様の数値が得られることが期待される。なお、ＰＲＴ４１０及び５８７の凍結乾燥粉末はＰＲＴ７９９と同様に発現させ、精製した。
＜難燃タンパク質水溶液の作製＞
〔クモ糸ポリペプチドの溶液の作製〕
［実施例２－１、２－２］
　クモ糸ポリペプチド（クモ糸フィブロイン）の凍結乾燥粉末（ＰＲＴ４１０及び５８７）２０ｇと、水８０ｇとを混合し、クモ糸ポリペプチドが水中に分散している分散液を調製した。得られた分散液をオートクレーブに入れ、１２０℃になるように加熱した。その際、オートクレーブ内は蒸気圧により少なくとも０．１０２ＭＰａ以上に加圧された状態となっている。その後、オートクレーブ内を室温まで冷却した。ＰＲＴ４１０を用いたものを実施例２－１、ＰＲＴ５８７を用いたものを実施例２－２とした。
〔シルク水溶液の作製〕
［実施例２－３］
　非特許文献「Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ　ｓｉｌｋ　ｆｉｂｒｏｉｎ」（Ｄ．Ｌ．Ｋａｐｌａｎら，Ｎａｔｕｒｅ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，６，２０１１，１６１２－１６３１）に記載の方法によりシルクタンパク質（少なくとも２００ｋＤａ）の水溶液を作製し、透析法により濃縮することで、１５％水溶液とした（実施例２－３）。
〔ホウ酸溶液の作製〕
［比較例２－１］
　容量３００ｍｌのビーカー内で沸騰させた蒸留水７８．６ｇに、ホウ酸９．６ｇとホウ砂１１．９ｇを添加して得られた混合溶液を撹拌しながら電熱器で加熱し、濁りのない比較例２－１の難燃薬剤を得た。
〔リン酸ナトリウム溶液の作製〕
［比較例２－２］
　容量３００ｍｌのビーカー内で沸騰させた蒸留水８０．０ｇに、リン酸ナトリウム２０．０ｇを添加して得られた混合溶液を撹拌しながら電熱器で加熱し、濁りのない比較例２－２の難燃薬剤を得た。
＜難燃木材の作製＞
［実施例３－１］
　８０℃で２４時間乾燥させた５２ｍｍ×２０ｍｍ×２．３ｍｍに裁断した杉材を用いて、含浸試験を行った。オートクレーブ中で、実施例２－１で作製した難燃性タンパク質水溶液を杉材に含浸させ、温度１２０℃、圧力０．２ＭＰａで２４時間、加圧・加熱処理を行った。次いで、オートクレーブから杉材を取り出して８０℃で２４時間乾燥させ、実施例３－１の難燃木材を得た。難溶性タンパク質の含浸量を評価するため、原材料の杉材の絶乾質量に対する難燃木材の質量増加率（％）を求めた。質量増加率を図６に示す。
［実施例３－２］
　実施例２－２で作製した難燃性タンパク質水溶液を用いた以外は、実施例３－１と同様の操作を行って実施例３－２の難燃木材を作製した。同様に難燃木材の質量増加率を求め、図６に示す。
［実施例３－３］
　実施例２－３で作製した難燃性タンパク質水溶液を用いた以外は、実施例３－１と同様の操作を行って実施例３－３の難燃木材を作製した。同様に難燃木材の質量増加率を求め、図６に示す。
［比較例３－１］
　比較例２－１で作製した難燃薬剤を用いた以外は、実施例３－１と同様の操作を行って比較例３－１の難燃木材を作製した。同様に難燃木材の質量増加率を求め、図６に示す。
［比較例３－２］
　比較例２－２で作製した難燃薬剤を用いた以外は、実施例３－１と同様の操作を行って比較例３－２の難燃木材を作製した。同様に難燃木材の質量増加率を求め、図６に示す。
　図６より、難溶性タンパク質は問題なく杉材に含浸されることが分かった。また、タンパク質の分子量が１００ｋＤａ（実施例３－２）のものよりは、分子量が５０ｋＤａ（実施例３－１）のものがより含浸させやすいことが分かった。
＜燃焼性確認試験＞
［実施例４－１］
　実施例３－１で得られた、難燃木材を５００℃に保持した電気炉（アズワン株式会社、ＲＯＰ－００１）で５分間加熱し、その際の重量減少率から燃焼性を評価した。結果を図７に示す。
［実施例４－２］
　実施例３－２で得られた、難燃木材を５００℃に保持した電気炉（アズワン株式会社、ＲＯＰ－００１）で５分間加熱し、その際の重量減少率から燃焼性を評価した。結果を図７に示す。
［実施例４－３］
　実施例３－３で得られた、難燃木材を５００℃に保持した電気炉で５分間加熱し、その際の重量減少率から燃焼性を評価した。結果を図７に示す。
［比較例４－１］
　比較例３－１で得られた、難燃木材を５００℃に保持した電気炉で５分間加熱し、その際の重量減少率から燃焼性を評価した。結果を図７に示す。
［比較例４－２］
　比較例３－２で得られた、難燃木材を５００℃に保持した電気炉で５分間加熱し、その際の重量減少率から燃焼性を評価した。結果を図７に示す。
［比較例４－３］
　難燃薬剤を含浸させていない木材を５００℃に保持した電気炉で５分間加熱し、その際の重量減少率から燃焼性を評価した。結果を図７に示す。
　ＰＲＴ５８７（実施例４－２）及びシルク（実施例４－３）を含浸させた木材について、どちらも比較例のホウ酸（比較例４－１）及びリン酸ナトリウム（比較例４－１）を含浸させたものには及ばないものの、未処理の木材（比較例４－３）よりも残存質量が高く難燃効果が得られていることが確認できた。
＜水浸漬試験と難燃剤含浸量の推移＞
　実施例５－２、比較例５－１及び比較例５－２は、それぞれ実施例３－２、比較例３－１及び３－２で得られた木材を使用した。各木材の含浸後の質量増加率については、含浸前の木材質量と比較し算出された質量増加率（％）を図８の「含浸後」に示す。水浸漬試験において、各木材を５０ｍｌの水に十分浸漬させ、２５℃で、２４時間静置した。水浸漬の後、８０℃で２４時間乾燥させ質量を測定し、上記と同様に含浸前の木材質量と比較し算出された質量増加率（％）を求めた。また、この工程をさらに２回繰り返し、計３回（浸漬１回目、浸漬２回目、浸漬３回目）の質量増加率（％）の推移を求めた。これら結果についても合わせて図８に示す。
　図８から、水に浸漬させることで、ホウ酸（比較例５－１）やリン酸（比較例５－２）の質量が大きく減少している。例えば、比較例５－２の場合、質量増加率が２５．９％であったところ、浸漬１回目で５．１％まで減少し、元の含浸量の約２０％しか残っていないことが分かった。一方、タンパク質（実施例５－１）は繰り返しの浸漬後においても水に溶け出さず殆どが残っている。具体的には、２２．２％であった質量増加率が、約２％しか減少しておらず、含浸された難溶性タンパク質のうち、９０％以上が溶け出さずに残っていることが分かる。タンパク質を含浸させた材料については水に２４時間、４８時間及び７２時間浸漬させた後でも少なくとも５０％以上のタンパク質が材料内部に留まっていることから、水に対し強い耐性を有していることがわかる。
[規則91に基づく訂正 20.07.2021]　
　また、上記方法と同様に、実施例３－２、比較例３－１、比較例３－２及び実施例３－３で得られた木材を水に２４時間浸漬し、８０℃で２４時間乾燥させ、水浸漬１回目の実施例５－１、比較例５－１、比較例５－２及び比較例５－３とした。図９は、左から実施例５－１、比較例５－１、比較例５－２及び実施例５－３の木材の写真を示す。タンパク質水溶液を含浸させた木材は見た目に変化がなかった一方、ホウ酸及びリン酸ナトリウムを含浸させた木材の表面に薬剤が析出していた。このことからタンパク質を含浸させた難燃性材料は白華が起こりにくいことがわかった。
[規則91に基づく訂正 20.07.2021]　
＜３回水浸漬後の難燃性確認試験＞
　実施例６－２、比較例６－１、比較例６－２は、それぞれ実施例３－２、比較例３－１、比較例３－２で得られた木材を用いた。各木材を上記水浸漬試験と同様に３回水に浸漬させた各木材を８０℃で２４時間乾燥させた後、５００℃に保持した電気炉で５分間加熱し、その際の重量減少率から燃焼性を評価した。結果を図１０に示す。
　実施例３－２、実施例３－１の結果と比較してタンパク質溶液を含浸させた木材（実施例６－２）の質量残存率に大きな変化がない一方、ホウ酸（比較例６－１）及びリン酸ナトリウム（比較例６－２）を含浸させた木材の質量残存率は大きく低下している。タンパク質含浸木材は水に浸漬させた後でも５０％以上の質量のタンパク質が残っていることから、実質的な難燃効果を維持できることが分かった。

Claims (18)

  1. 　原材料に１種以上の難燃性かつ難溶性のタンパク質を含浸させ、及び／又は、前記原材料の表面を１種以上の難燃性かつ難溶性のタンパク質でコーティングした、難燃性材料。
  2. 　前記難燃性材料を水に２４時間浸漬した後の前記タンパク質の含有量が、浸漬前の前記難燃性材料における前記タンパク質の含有量と比較して質量比で５０％以上維持される、請求項１に記載の難燃性材料。
  3. 　前記タンパク質が単離、精製又は合成されたタンパク質である、請求項１又は２に記載の難燃性材料。
  4. 　前記タンパク質の限界酸素指数（ＬＯＩ）値が２６以上である、請求項１～３のいずれか一項に記載の難燃性材料。
  5. 　前記原材料がセルロース材である、請求項１～４のいずれか一項に記載の難燃性材料。
  6. 　前記原材料が建築材料又は建設材料である、請求項１～５のいずれか一項に記載の難燃性材料。
  7. 　前記タンパク質が構造タンパク質である、請求項１～６のいずれか一項に記載の難燃性材料。
  8. 　前記タンパク質が改変フィブロイン又は大豆タンパク質である、請求項１～７のいずれか一項に記載の難燃性材料。
  9. 　前記タンパク質が改変クモ糸フィブロインである、請求項１～８のいずれか一項に記載の難燃性材料。
  10. 　前記タンパク質の疎水性指標の平均値（平均ＨＩ）が０以下の改変フィブロインである、請求項１～９のいずれか一項に記載の難燃性材料。
  11. 　前記タンパク質が０．１０２ＭＰａ以上の圧力で水溶性を示す、請求項１～１０のいずれか一項に記載の難燃性材料。
  12. 　前記タンパク質が１００℃以上の温度で水溶性を示す、請求項１１に記載の難燃性材料。
  13. 　前記タンパク質の分子量が１００ｋＤａ以下である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の難燃性材料。
  14. 　１種以上の難燃性かつ難溶性のタンパク質を含むタンパク質含有液を原材料に含浸させて前記原材料の内部にタンパク質含有部を形成する工程、及び／又は、前記タンパク質含有液で前記原材料の表面をコーティングして前記原材料の表面にタンパク質含有部を形成する工程を含む、タンパク質含有材の製造方法。
  15. 　前記タンパク質含有材が難燃性材料である、請求項１４に記載の製造方法。
  16. 　前記タンパク質含有液が前記１種以上の難燃性かつ難溶性のタンパク質の水溶液である、請求項１４又１５に記載の製造方法。
  17. 　前記タンパク質含有液は、前記１種以上の難燃性かつ難溶性のタンパク質を０．１０２ＭＰａ以上の圧力の印加により溶解させることによって調製される、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の製造方法。
  18. 　前記タンパク質含有液は、前記１種以上の難燃性かつ難溶性のタンパク質を１００℃以上の温度で溶解させることによって調製される、請求項１７に記載の製造方法。
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