WO2024043282A1

WO2024043282A1 - エステル化タンパク質及びその製造方法

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Publication number: WO2024043282A1
Application number: PCT/JP2023/030366
Authority: WO
Inventors: ジェイコブリチャードハウザー; 一樹坂田; 秀樹加賀田; 拓高見
Original assignee: Ｓｐｉｂｅｒ株式会社
Priority date: 2022-08-23
Filing date: 2023-08-23
Publication date: 2024-02-29

Abstract

本発明は、タンパク質とアシル化剤を含む混合物をメカノケミカル法で処理して、修飾タンパク質を得る工程を含む、修飾タンパク質の製造方法を提供する。

Description

エステル化タンパク質及びその製造方法

　本発明は、エステル化タンパク質及びその製造方法に関する。

　近年、環境汚染への関心の高まりに伴って、石油由来素材の代替素材として、生分解性を有するタンパク質素材が注目されている。タンパク質素材は、そのタンパク質の種類に応じた物性を発揮するため、その用途に応じて必要とされる物性を備えたタンパク質を準備する必要がある。

　例えば、特許文献１には、医薬又は化粧料に用いるタンパク質として、所望のアミノ酸配列を発現するように修飾核酸を調製し、修飾スパイダーシルクタンパク質を得ることが開示されており、その修飾スパイダーシルクタンパク質にポリペプチド、多糖類、マーカー分子、量子ドット、金属、核酸、脂質、低分子薬物等の物質を更に結合させることが開示されている。このように、リジン、セリン及び／又はシステインを利用して他の物質を結合させることにより、タンパク質固有の特性とは別の特性を付与できる。

国際公開第２００７／０２５７１９号国際公開第２０２１／１８７５０２号特許第５６７８２８３号公報特許第５７８２５８０号公報特許第５７９６１４７号公報特許第５８２３０７９号公報特許第６８３０６０４号公報

Ochiai B. et al. ACSOmega4,2019,17542-17546. Weissbach U. et al.BeilsteinJ.Org. Chem. 2017, 13, 1788-1795.

　通常、タンパク質を修飾する場合、タンパク質を溶解可能な溶媒中で結合させる物質と反応させる。しかし、タンパク質を溶解可能な溶媒は限定的であるため、修飾方法の自由度が小さく、結果として製造可能な修飾タンパク質も制限されるという問題がある。加えて、溶媒中の反応では、使用される溶媒の種類によってはタンパク質が溶媒と反応してしまい、不必要な副生物が生じる場合もある。具体的には、タンパク質を溶解できる溶媒の種類として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）等がよく知られているが、これら溶媒にタンパク質を溶解させてアシル化剤を加えると、Ｓｗｅｒｎ酸化型の酸化反応やアルコール系溶媒のアシル化が進行することがある。そこで、本発明は、修飾タンパク質の新たな製造方法を提供することを目的とする。

　本発明者は、メカノケミカル条件でタンパク質をアシル化することによって、所望の修飾タンパク質を得ることができることを見出した。すなわち、本発明は、以下の（１）～（６６）を提供する。
（１）　タンパク質とアシル化剤を含む混合物をメカノケミカル法で処理して、修飾タンパク質を得る工程を含む、修飾タンパク質の製造方法。
（２）　混合物が塩基及び／又は反応促進剤を更に含む、（１）に記載の方法。
（３）　混合物が溶媒を更に含む、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）　溶媒の量がタンパク質の量に対して１～１００重量％である、（３）に記載の方法。
（５）　メカノケミカル法で処理された生成物を洗浄する工程を更に含む、（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（６）　洗浄する工程の後、洗浄された生成物を乾燥する工程を更に含む、（５）に記載の方法。
（７）　タンパク質が疎水性タンパク質を含む、（１）～（６）のいずれかに記載の方法。
（８）　疎水性タンパクのハイドロパシー・インデックスが０超である、（７）に記載の方法。
（９）　タンパク質が人工タンパク質を含む、（１）～（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）　人工タンパク質が人工構造タンパク質を含む、（９）に記載の方法。
（１１）　微生物学的手法により前記タンパク質を得る工程を更に含む、（１）～（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）　前記アシル化剤が親水性基を含む、（１）に記載の修飾タンパク質の製造方法。
（１３）　前記アシル化剤がヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基、スルホ基、ホスフェート基からなる群から選択される少なくとも１種を含む、（１）に記載の修飾タンパク質の製造方法。
（１４）　前記アシル化剤が疎水性基を含む、（１）に記載の修飾タンパク質の製造方法。
（１５）　前記アシル化剤がアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基からなる群から選択される少なくとも１種を含む、（１）に記載の修飾タンパク質の製造方法。
（１６）　前記アシル化剤が難燃性元素（難燃性を付与できる原子）を含む、（１）に記載の修飾タンパク質の製造方法。
（１７）　前記アシル化剤が硫黄原子またはリン原子を含む、（１）に記載の修飾タンパク質の製造方法。
（１８）　前記修飾タンパク質が、難燃性元素（難燃性を付与できる原子）を含む、（１）に記載の修飾タンパク質の製造方法。
（１９）　前記修飾タンパク質が、硫黄原子またはリン原子を含む、（１）に記載の修飾タンパク質の製造方法。
（２０）　前記アシル化剤が、無水コハク酸または無水マレイン酸である、（１）に記載の修飾タンパク質の製造方法。
（２１）　前記アシル化剤が、スクシニル基およびマレイル基からなる群から選択される少なくとも１種の構造を含む、（１）に記載の修飾タンパク質の製造方法。
（２２）　前記アシル化剤が炭素数６以上のアルキル基を含む、（１）に記載の修飾タンパク質の製造方法。
（２３）　前記アシル化剤が、脂肪酸および不飽和脂肪酸からなる群から選択される少なくとも１種の構造を含む、（１）に記載の修飾タンパク質の製造方法。
（２４）　メカノケミカル法での処理が、前記混合物に対してせん断力を加えることによって実現される、（１）に記載の方法。
（２５）　せん断力が、ミキサーミル又はエクストルーダーを用いて前記混合物に加えられる、（２４）に記載の方法。
（２６）　（１）～（２５）のいずれかに記載の方法によって得られる修飾タンパク質。
（２７）　（２６）に記載の修飾タンパク質を含む修飾タンパク質組成物。
（２８）　（２７）に記載の修飾タンパク質組成物を成形してなる修飾タンパク質成形体。
（２９）　（２６）に記載の修飾タンパク質を含む成形用材料。
（３０）　（２９）に記載の成形用材料を成形してなる修飾タンパク質成形体。（３１）　修飾タンパク質成形体が、繊維、フィルム、ゲル、多孔質体、パーティクル、及び樹脂からなる群のうちのいずれかである、（２８）に記載の修飾タンパク質成形体。
（３２）　（１）～（２５）のいずれかに記載の方法によって得られた修飾タンパク質を含む繊維。
（３３）　（１）～（２５）のいずれかに記載の方法によって得られた修飾タンパク質を含むフィルム。
（３４）　（１）～（２５）のいずれかに記載の方法によって得られた修飾タンパク質を含むヒドロゲル。
（３５）　（１）～（２５）のいずれかに記載の方法によって得られた修飾タンパク質を含む多孔質体。
（３６）　（１）～（２５）のいずれかに記載の方法によって得られた修飾タンパク質を含むパーティクル。
（３７）　（１）～（２５）のいずれかに記載の方法によって得られた修飾タンパク質を含む樹脂。
（３８）　タンパク質とアシル化剤を含む混合物をメカノケミカル法で処理して、修飾タンパク質を得る工程と、得られた修飾タンパク質を紡糸する工程と、を含む、タンパク質繊維の製造方法。
（３９）　（１）に記載の方法によって得られた修飾タンパク質を溶媒に溶解させる工程を含む、溶液状接着剤の製造方法。
（４０）　（１）に記載の方法によって得られた修飾タンパク質を水性媒体に分散させる工程を含む、水分散性接着剤の製造方法。
（４１）　（１）に記載の方法によって得られた修飾タンパク質が溶解した溶液からフィルムを成形する工程を含む、フィルム状接着剤の製造方法。
（４１－１）　（１）に記載の方法によって修飾タンパク質を得る工程と、得られた修飾タンパク質を溶媒に溶解させて、フィルムを成形する工程と、を含む、フィルム状接着剤の製造方法。
（４２）　（１）に記載の方法によって得られた修飾タンパク質を含む粉末を得る工程を含む、粉末状接着剤の製造方法。
（４２－１）　（１）に記載の方法によって得られた修飾タンパク質を粉末化する工程を含む、粉末状接着剤の製造方法。
（４２－２）　（１）に記載の方法によって修飾タンパク質を得る工程と、得られた修飾タンパク質を粉末化する工程と、を含む、粉末状接着剤の製造方法。
（４２－３）　（１）に記載の方法によって得られた修飾タンパク質と、粘着向上剤又は接着向上剤とを含む粉末組成物を得る工程を含む、粉末状接着剤の製造方法。
（４２－４）　（１）に記載の方法によって得られた修飾タンパク質に粘着向上剤又は接着向上剤を加えて組成物を得る工程と、得られた組成物を粉末化する工程とを含む、粉末状接着剤の製造方法。
（４２－５）　（１）に記載の方法によって修飾タンパク質を得る工程と、得られた修飾タンパク質と粘着向上剤又は接着向上剤とを含む粉末組成物を得る工程を含む、粉末状接着剤の製造方法。
（４２－６）　（１）に記載の方法によって修飾タンパク質を得る工程と、得られた修飾タンパク質に粘着向上剤又は接着向上剤を加えて組成物を得る工程と、得られた組成物を粉末化する工程と、を含む、粉末状接着剤の製造方法。
（４３）　修飾タンパク質が、マレイン酸エステル化タンパク質、コハク酸エステル化タンパク質、スルホン酸エステル化タンパク質、及びリン酸エステル化タンパク質からなる群から選択される少なくとも１種である、（３９）～（４２）のいずれかに記載の接着剤の製造方法。
（４４）　修飾タンパク質が、マレイン酸エステル化タンパク質、コハク酸エステル化タンパク質、スルホン酸エステル化タンパク質、及びリン酸エステル化タンパク質からなる群から選択される少なくとも１種であり、溶媒が塩基性水溶液である、（３９）に記載の溶液状接着剤の製造方法。
（４５）　修飾タンパク質が、マレイン酸エステル化タンパク質、コハク酸エステル化タンパク質、スルホン酸エステル化タンパク質、及びリン酸エステル化タンパク質からなる群から選択される少なくとも１種であり、フィルムを成形する工程が、修飾タンパク質を塩基性水溶液に溶解することを含む、（４１）又は（４１－１）に記載のフィルム状接着剤の製造方法。
（４６）　（１）に記載の方法によって得られた修飾タンパク質を溶媒に溶解してなる溶液を複数の被着体の間に介在させた後、前記溶液から前記溶媒を除去して、前記修飾タンパク質を固化させることにより、被着体同士を接着することを含む、接着体の製造方法。
（４６－１）　（１）に記載の方法によって修飾タンパク質を得る工程と、得られた修飾タンパク質に溶媒に溶解させて溶液を得る工程と、得られた溶液を複数の被着体の間に介在させた後、前記溶液から前記溶媒を除去して、前記修飾タンパク質を固化させることにより、被着体同士を接着する工程を含む、接着体の製造方法。
（４７）　（１）に記載の方法によって得られた修飾タンパク質を水性媒体に分散してなる水分散液を、複数の被着体の間に介在させた後、前記水分散液から前記水性媒体を除去して、前記修飾タンパク質を固化させることにより、被着体同士を接着することを含む、接着体の製造方法。
（４７－１）　（１）に記載の方法によって修飾タンパク質を得る工程と、得られた修飾タンパク質に水性媒体に分散させて水分散液を得る工程と、得られた水分散液を複数の被着体の間に介在させた後、前記水分散液から前記水性媒体を除去して、前記修飾タンパク質を固化させることにより、被着体同士を接着する工程を含む、接着体の製造方法。
（４８）　（１）に記載の方法によって得られた修飾タンパク質を含むフィルムを膨潤又は加熱により軟化させると共に、複数の被着体の間に介在させた後、前記フィルムを前記被着体に圧接させた状態で硬化させることにより、前記被着体同士を接着することを含む、接着体の製造方法。
（４８－１）　（１）に記載の方法によって修飾タンパク質を得る工程と、得られた修飾タンパク質に溶媒に溶解させて、フィルムを成形する工程と、得られたフィルムを膨潤又は加熱により軟化させると共に、複数の被着体の間に介在させた後、前記フィルムを前記被着体に圧接させた状態で硬化させることにより、前記被着体同士を接着する工程を含む、接着体の製造方法。
（４９）　（１）に記載の方法によって得られた修飾タンパク質を含む粉末を複数の被着体の間に介在させた状態で、前記粉末を加熱すると共に、前記被着体を介して前記粉末を加圧して、固化させることにより、前記被着体同士を接着することを特徴とする接着体の製造方法。
（４９－１）　（１）に記載の方法によって得られた修飾タンパク質を粉末化する工程と、得られた粉末を複数の被着体の間に介在させた状態で、前記粉末を加熱すると共に、前記被着体を介して前記粉末を加圧して、固化させることにより、前記被着体同士を接着する工程を含む、接着体の製造方法。
（４９－２）　（１）に記載の方法によって修飾タンパク質を得る工程と、得られた修飾タンパク質を粉末化する工程と、得られた粉末を複数の被着体の間に介在させた状態で、前記粉末を加熱すると共に、前記被着体を介して前記粉末を加圧して、固化させることにより、前記被着体同士を接着する工程を含む、接着体の製造方法。
（４９－３）　（１）に記載の方法によって得られた修飾タンパク質と、粘着向上剤又は接着向上剤とを含む粉末組成物を得る工程と、得られた粉末組成物を複数の被着体の間に介在させた状態で、前記粉末組成物を加熱すると共に、前記被着体を介して前記粉末組成物を加圧して、固化させることにより、前記被着体同士を接着する工程を含む、接着体の製造方法。
（４９－４）　（１）に記載の方法によって得られた修飾タンパク質に粘着向上剤又は接着向上剤を加えて組成物を得る工程と、得られた組成物を粉末化する工程と、得られた粉末組成物を複数の被着体の間に介在させた状態で、前記粉末組成物を加熱すると共に、前記被着体を介して前記粉末組成物を加圧して、固化させることにより、前記被着体同士を接着する工程を含む、接着体の製造方法。
（４９－５）　（１）に記載の方法によって修飾タンパク質を得る工程と、得られた修飾タンパク質と粘着向上剤又は接着向上剤とを含む粉末組成物を得る工程と、得られた粉末組成物を複数の被着体の間に介在させた状態で、前記粉末組成物を加熱すると共に、前記被着体を介して前記粉末組成物を加圧して、固化させることにより、前記被着体同士を接着する工程を含む、接着体の製造方法。
（４９－６）　（１）に記載の方法によって修飾タンパク質を得る工程と、得られた修飾タンパク質に粘着向上剤又は接着向上剤を加えて組成物を得る工程と、得られた組成物を粉末化する工程と、得られた粉末組成物を複数の被着体の間に介在させた状態で、前記粉末組成物を加熱すると共に、前記被着体を介して前記粉末組成物を加圧して、固化させることにより、前記被着体同士を接着する工程を含む、接着体の製造方法。
（５０）　修飾タンパク質が、マレイン酸エステル化タンパク質、コハク酸エステル化タンパク質、スルホン酸エステル化タンパク質、及びリン酸エステル化タンパク質からなる群から選択される少なくとも１種である、（４６）～（４９）に記載の接着体の製造方法。
（５１）　修飾タンパク質が、マレイン酸エステル化タンパク質、コハク酸エステル化タンパク質、スルホン酸エステル化タンパク質、及びリン酸エステル化タンパク質からなる群から選択される少なくとも１種であり、溶媒が塩基性水溶液である、（４６）に記載の接着体の製造方法。
（５２）　フィルムが、マレイン酸エステル化タンパク質、コハクエステル化タンパク質、スルホン酸エステル化タンパク質、及びリン酸エステル化タンパク質からなる群から選択される少なくとも１種の前記修飾タンパク質が塩基性水溶液に溶解した溶液をキャスト成形して得られるものである、（４８）に記載の接着体の製造方法。
（５２－１）　修飾タンパク質が、マレイン酸エステル化タンパク質、コハクエステル化タンパク質、スルホン酸エステル化タンパク質、及びリン酸エステル化タンパク質からなる群から選択される少なくとも１種であり、フィルムを成形する工程が修飾タンパク質を塩基性水溶液に溶解した後、キャスト成形する工程である、（４８－１）に記載の接着体の製造方法。
（５３）　（１）に記載の方法によって得られた修飾タンパク質を溶媒に溶解させる工程を含む、溶液状コーティング剤の製造方法。
（５３－１）　（１）に記載の方法によって修飾タンパク質を得る工程と、得られた修飾タンパク質を溶媒に溶解させる工程と、を含む、溶液状コーティング剤の製造方法。
（５４）　（１）に記載の方法によって得られた修飾タンパク質を水性媒体に分散させる工程を含む、水分散性コーティング剤の製造方法。
（５４－１）　（１）に記載の方法によって修飾タンパク質を得る工程と、得られた修飾タンパク質を水性媒体に分散させる工程と、を含む、水分散性コーティング剤の製造方法。
（５５）　（１）に記載の方法によって得られた修飾タンパク質が溶解した溶液からフィルムを成形する工程を含む、フィルム状コーティング剤の製造方法。
（５５－１）　（１）に記載の方法によって修飾タンパク質を得る工程と、得られた修飾タンパク質を溶媒に溶解させて、フィルムを成形する工程と、を含む、フィルム状コーティング剤の製造方法。
（５６）　（１）に記載の方法によって得られた修飾タンパク質を含む粉末を得る工程を含む、粉末状コーティング剤の製造方法。
（５６－１）　（１）に記載の方法によって得られた修飾タンパク質を粉末化する工程を含む、粉末状コーティング剤の製造方法。
（５６－２）　（１）に記載の方法によって修飾タンパク質を得る工程と、得られた修飾タンパク質を粉末化する工程と、を含む、粉末状コーティング剤の製造方法。
（５６－３）　（１）に記載の方法によって得られた修飾タンパク質と、粘着向上剤又は接着向上剤とを含む粉末組成物を得る工程を含む、粉末状コーティング剤の製造方法。
（５６－４）　（１）に記載の方法によって得られた修飾タンパク質に粘着向上剤又は接着向上剤を加えて組成物を得る工程と、得られた組成物を粉末化する工程とを含む、粉末状コーティング剤の製造方法。
（５６－５）　（１）に記載の方法によって修飾タンパク質を得る工程と、得られた修飾タンパク質と粘着向上剤又は接着向上剤とを含む粉末組成物を得る工程を含む、粉末状コーティング剤の製造方法。
（５６－６）　（１）に記載の方法によって修飾タンパク質を得る工程と、得られた修飾タンパク質に粘着向上剤又は接着向上剤を加えて組成物を得る工程と、得られた組成物を粉末化する工程と、を含む、粉末状コーティング剤の製造方法。
（５７）　修飾タンパク質が、マレイン酸エステル化タンパク質、コハク酸エステル化タンパク質、スルホン酸エステル化タンパク質、及びリン酸エステル化タンパク質からなる群から選択される少なくとも１種である、（４１）～（４４）に記載のコーティング剤の製造方法。
（５８）　修飾タンパク質が、マレイン酸エステル化タンパク質、コハク酸エステル化タンパク質、スルホン酸エステル化タンパク質、及びリン酸エステル化タンパク質からなる群から選択される少なくとも１種であり、溶媒が塩基性水溶液である、（５１）に記載の溶液状コーティング剤の製造方法。
（５９）　修飾タンパク質が、マレイン酸エステル化タンパク質、コハク酸エステル化タンパク質、スルホン酸エステル化タンパク質、及びリン酸エステル化タンパク質からなる群から選択される少なくとも１種であり、前記修飾タンパク質を塩基性水溶液に溶解する工程を含む、（５５）に記載のフィルム状コーティング剤の製造方法。
（６０）　基材と、前記基材の表面の少なくとも一部に積層形成されたコーティング層とを有する積層体の製造方法であって、（１）に記載の方法によって得られた修飾タンパク質が溶媒に溶解してなる溶液を前記基材の表面の少なくとも一部に供給して、前記基材の表面の少なくとも一部を前記溶液でコーティングした後、前記溶液から前記溶媒を除去して、前記修飾タンパク質を固化させることにより、前記基材の表面の少なくとも一部に前記コーティング層を積層形成することを特徴とする積層体の製造方法。
（６０－１）　基材と、前記基材の表面の少なくとも一部に形成されたコーティング層とを有する積層体の製造方法であって、（１）に記載の方法によって修飾タンパク質を得る工程と、得られた修飾タンパク質を溶媒に溶解して溶液を得る工程と、前記基材の表面の少なくとも一部に前記溶液を供給して、前記基材の表面の少なくとも一部を前記溶液でコーティングする工程と、前記コーティングから前記溶媒を除去して、前記コーティング層を形成する工程と、を含む、積層体の製造方法。
（６１）　基材と、前記基材の表面の少なくとも一部に積層形成されたコーティング層とを有する積層体の製造方法であって、（１）に記載の方法によって得られた修飾タンパク質が水性媒体に分散してなる水分散液を前記基材の表面の少なくとも一部に供給して、前記基材の表面の少なくとも一部を前記水分散液でコーティングした後、前記水分散液から前記水性媒体を除去して、前記修飾タンパク質を固化させることにより、前記基材の表面の少なくとも一部にコーティング層を積層形成することを特徴とする積層体の製造方法。
（６１－１）　基材と、前記基材の表面の少なくとも一部に形成されたコーティング層とを有する積層体の製造方法であって、（１）に記載の方法によって修飾タンパク質を得る工程と、得られた修飾タンパク質を水性媒体に分散させて水分散液を得る工程と、前記基材の表面の少なくとも一部に前記水分散液を供給して、前記基材の表面の少なくとも一部を前記水分散液でコーティングする工程と、前記コーティングから前記水性媒体を除去して、前記コーティング層を形成する工程と、を含む、積層体の製造方法。
（６２）　基材と、前記基材の表面の少なくとも一部に積層形成されたコーティング層とを有する積層体の製造方法であって、（１）に記載の方法によって得られた修飾タンパク質を含むフィルムを、膨潤又は加熱により軟化させると共に、前記基材の表面の少なくとも一部に載置した後、前記フィルムを前記基材に圧接させた状態で硬化させることにより、前記基材の表面の少なくとも一部にコーティング層を積層形成することを特徴とする積層体の製造方法。
（６２－１）　基材と、前記基材の表面の少なくとも一部に形成されたコーティング層とを有する積層体の製造方法であって、（１）に記載の方法によって修飾タンパク質を得る工程と、得られた修飾タンパク質を溶媒に溶解してフィルムを成形する工程と、前記フィルムを膨潤又は加熱により軟化させると共に、前記基材の表面の少なくとも一部に載置する工程と、前記フィルムを前記基材に圧接させた状態で硬化させて、前記コーティング層を形成する工程と、を含む、積層体の製造方法。
（６３）　基材と、前記基材の表面の少なくとも一部に積層形成されたコーティング層とを有する積層体の製造方法であって、（１）に記載の方法によって得られた修飾タンパク質を含む粉末を前記基材の表面の少なくとも一部に載置した状態で、前記粉末を加熱すると共に、加圧体と前記基材との間で前記粉末を加圧して、固化させることにより、前記基材の表面の少なくとも一部にコーティング層を積層形成することを特徴とする積層体の製造方法。
（６３－１）　基材と、前記基材の表面の少なくとも一部に形成されたコーティング層とを有する積層体の製造方法であって、（１）に記載の方法によって得られた修飾タンパク質を粉末化する工程と、得られた粉末を前記基材の表面の少なくとも一部に載置した状態で、前記粉末を加熱すると共に、加圧体と前記基材との間で前記粉末を加圧して、固化させることにより、前記基材の表面の少なくとも一部にコーティング層を積層形成することを特徴とする積層体の製造方法。
（６３－２）　基材と、前記基材の表面の少なくとも一部に形成されたコーティング層とを有する積層体の製造方法であって、（１）に記載の方法によって修飾タンパク質を得る工程と、得られた修飾タンパク質を粉末化する工程と、得られた粉末を前記基材の表面の少なくとも一部に載置した状態で、前記粉末を加熱すると共に、加圧体と前記基材との間で前記粉末を加圧して、固化させることにより、前記基材の表面の少なくとも一部にコーティング層を積層形成することを特徴とする積層体の製造方法。
（６３－３）　基材と、前記基材の表面の少なくとも一部に形成されたコーティング層とを有する積層体の製造方法であって、（１）に記載の方法によって得られた修飾タンパク質と、粘着向上剤又は接着向上剤とを含む粉末組成物を得る工程と、得られた粉末組成物を前記基材の表面の少なくとも一部に載置した状態で、前記粉末組成物を加熱すると共に、加圧体と前記基材との間で前記粉末組成物を加圧して、固化させることにより、前記基材の表面の少なくとも一部にコーティング層を積層形成することを特徴とする積層体の製造方法。
（６３－４）　基材と、前記基材の表面の少なくとも一部に形成されたコーティング層とを有する積層体の製造方法であって、（１）に記載の方法によって得られた修飾タンパク質に粘着向上剤又は接着向上剤を加えて組成物を得る工程と、得られた組成物を粉末化する工程と、得られた粉末組成物を前記基材の表面の少なくとも一部に載置した状態で、前記粉末組成物を加熱すると共に、加圧体と前記基材との間で前記粉末組成物を加圧して、固化させることにより、前記基材の表面の少なくとも一部にコーティング層を積層形成することを特徴とする積層体の製造方法。
（６３－５）　基材と、前記基材の表面の少なくとも一部に形成されたコーティング層とを有する積層体の製造方法であって、（１）に記載の方法によって修飾タンパク質を得る工程と、得られた修飾タンパク質と粘着向上剤又は接着向上剤とを含む粉末組成物を得る工程と、得られた粉末組成物を前記基材の表面の少なくとも一部に載置した状態で、前記粉末組成物を加熱すると共に、加圧体と前記基材との間で前記粉末組成物を加圧して、固化させることにより、前記基材の表面の少なくとも一部にコーティング層を積層形成することを特徴とする積層体の製造方法。
（６３－６）　基材と、前記基材の表面の少なくとも一部に形成されたコーティング層とを有する積層体の製造方法であって、（１）に記載の方法によって修飾タンパク質を得る工程と、得られた修飾タンパク質に粘着向上剤又は接着向上剤を加えて組成物を得る工程と、得られた組成物を粉末化する工程と、得られた粉末組成物を前記基材の表面の少なくとも一部に載置した状態で、前記粉末組成物を加熱すると共に、加圧体と前記基材との間で前記粉末組成物を加圧して、固化させることにより、前記基材の表面の少なくとも一部にコーティング層を積層形成することを特徴とする積層体の製造方法。
（６３－７）　基材と、前記基材の表面の少なくとも一部に形成されたコーティング層とを有する積層体の製造方法であって、（１）に記載の方法によって得られた修飾タンパク質を粉末化する工程と、得られた修飾タンパク質に粘着向上剤又は接着向上剤を加えて粉末組成物を得る工程と、前記粉末組成物を加熱すると共に、前記基材の表面の少なくとも一部に載置する工程と、加圧体と前記基材との間で前記粉末組成物を加圧して、前記コーティング層を形成する工程と、を含む、積層体の製造方法。
（６４）　修飾タンパク質が、マレイン酸エステル化タンパク質、コハク酸エステル化タンパク質、スルホン酸エステル化タンパク質、及びリン酸エステル化タンパク質からなる群から選択される少なくとも１種である、（６０）～（６３）に記載の積層体の製造方法。
（６５）　修飾タンパク質が、マレイン酸エステル化タンパク質、コハク酸エステル化タンパク質、スルホン酸エステル化タンパク質、及びリン酸エステル化タンパク質からなる群から選択される少なくとも１種であり、溶媒が塩基性水溶液である、（６０）に記載の積層体の製造方法。
（６６）　フィルムが、マレイン酸エステル化タンパク質、コハク酸エステル化タンパク質、スルホン酸エステル化タンパク質、及びリン酸エステル化タンパク質からなる群から選択される少なくとも１種の修飾タンパク質が塩基性水溶液に溶解した溶液から成形して得られるものである、（６２）に記載の積層体の製造方法。
（６６－１）　修飾タンパク質が、マレイン酸エステル化タンパク質、コハク酸エステル化タンパク質、スルホン酸エステル化タンパク質、及びリン酸エステル化タンパク質からなる群から選択される少なくとも１種であり、フィルムを成形する工程が、修飾タンパク質を塩基性水溶液に溶解して成形することである、（６２）に記載の積層体の製造方法。

　本発明によれば、修飾タンパク質の新たな製造方法を提供することができ、従来の溶媒中で行うタンパク質の修飾と比べて、反応条件の自由度が高く、より広汎な修飾タンパク質を得ることができる。また、本発明によれば、所望の用途に応じた適切な物性を有する修飾タンパク質を製造することができる。

　メカノケミカル法でのエステル化は、セルロースのアセチル化（非特許文献１参照）、酵素を用いたリグニンモデル化合物の選択的エステル化（非特許文献２参照）が知られているが、タンパク質のエステル化に適用した事例は知られていない。

（ａ）は、比較例１及び２、実施例１及び２の修飾タンパク質の外観を示す写真である、（ｂ）は、未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６と修飾タンパク質のＧＰＣにおける保持時間を比較したグラフである。（ａ）は、比較例１及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、（ｂ）は、比較例１及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムである。（ａ）は、比較例２及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、（ｂ）は、比較例２及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムである。（ａ）は、実施例１及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、（ｂ）は、実施例１及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムである。（ａ）は、実施例２及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、（ｂ）は、実施例２及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムである。（ａ）は、実施例３及び未修飾タンパク質ＰＲＴ２８８２のＩＲスペクトルであり、（ｂ）は、実施例３及び未修飾タンパク質ＰＲＴ２８８２のＧＰＣクロマトグラムである。（ａ）は、実施例４及び未修飾タンパク質ＰＲＴ２８４１のＩＲスペクトルであり、（ｂ）は、実施例４及び未修飾タンパク質ＰＲＴ２８４１のＧＰＣクロマトグラムである。（ａ）は、実施例５及び未修飾タンパク質ＰＲＴ２６６２のＩＲスペクトルであり、（ｂ）は、実施例５及び未修飾タンパク質ＰＲＴ２６６２のＧＰＣクロマトグラムである。（ａ）は、実施例６及び未修飾タンパク質ＰＲＴ１０００のＩＲスペクトルであり、（ｂ）は、実施例６及び未修飾タンパク質ＰＲＴ１０００のＧＰＣクロマトグラムである。（ａ）は、実施例７及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９１８のＩＲスペクトルであり、（ｂ）は、実施例７及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９１８のＧＰＣクロマトグラムである。（ａ）は、実施例８及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、（ｂ）は、実施例８及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムである。（ａ）は、実施例９及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、（ｂ）は、実施例９及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムである。（ａ）は、実施例１０及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、（ｂ）は、実施例１０及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムである。（ａ）は、実施例１１及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、（ｂ）は、実施例１１及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムである。（ａ）は、実施例１２及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、（ｂ）は、実施例１２及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムである。（ａ）は、実施例１３及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、（ｂ）は、実施例１３及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムである。（ａ）は、実施例１４及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、（ｂ）は、実施例１４及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムである。（ａ）は、実施例１５及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、（ｂ）は、実施例１５及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムである。（ａ）は、実施例１６及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、（ｂ）は、実施例１６及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムである。（ａ）は、実施例１７及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、（ｂ）は、実施例１７及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムである。（ａ）は、実施例１８及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、（ｂ）は、実施例１８及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムである。（ａ）は、実施例１９及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、（ｂ）は、実施例１９及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムである。（ａ）は、実施例２０及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、（ｂ）は、実施例２０及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムである。（ａ）は、実施例２１及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、（ｂ）は、実施例２１及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムである。（ａ）は、実施例２２及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、（ｂ）は、実施例２２及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムである。（ａ）は、タンパク質又は修飾タンパク質に水を加えた状態を示す写真であり、（ｂ）は、タンパク質又は修飾タンパク質にアセトンを加えた状態を示す写真であり、（ｃ）は、タンパク質又は修飾タンパク質に０．５ｗ／ｖ％水酸化ナトリウム水溶液を加えた状態を示す写真である。（ａ）は、ＤＭＳＯを加えた直後のタンパク質の状態を示す写真であり、（ｂ）は、ＤＭＳＯに溶解した状態を示す写真であり、（ｃ）は、各タンパク質のゲル化状態を比較した写真である。（ａ）は、実施例２４及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、（ｂ）は、実施例２４及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムである。（ａ）は、実施例２５及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、（ｂ）は、実施例２５及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムである。押出機のスクリューセグメントを示す写真である。図３０において、ＦＣは前進搬送要素を示し、Ｒは逆転要素を示し、Ｋは混練要素を示し、Ｃは圧縮要素を示す。（ａ）は、実施例２６及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、（ｂ）は、実施例２６及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムである。（ａ）は、実施例２７及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、（ｂ）は、実施例２７及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムである。（ａ）は、実施例２８及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、（ｂ）は、実施例２８及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムである。（ａ）は、実施例２９及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、（ｂ）は、実施例２９及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムである。（ａ）は、実施例３０及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、（ｂ）は、実施例３０及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムである。（ａ）は、実施例３１及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、（ｂ）は、実施例３１及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムである。（ａ）は、実施例３２及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、（ｂ）は、実施例３２及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムである。ａ～ｄは、それぞれＰＲＴ９６６、Ａｃ－ＰＲＴ、Ｓｕｃｃ－ＰＲＴ、およびＳｔ－ＰＲＴのキャストフィルムを示す写真である。（ａ）は各サンプルの燃焼時間を示すグラフであり、（ｂ）は各サンプルの質量損失を示すグラフである。未修飾ＰＲＴ９６６及び各修飾タンパク質の軟化点、Ｔｇオンセット、融解温度Ｔｍを示すグラフである。

　以下、本開示を実施するための形態について、場合によって図面を参照し、詳細に説明する。ただし、以下の実施形態は本開示を説明するための例示であり、本開示を以下の内容に限定する趣旨ではない。

　本明細書において例示する材料は特に断らない限り、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。組成物中の各成分の含有量は、組成物中の各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。

　本発明の第一実施形態は、タンパク質とアシル化剤を含む混合物をメカノケミカル法で処理して、修飾タンパク質を得る工程を含む、修飾タンパク質の製造方法である。

　本明細書において、「修飾タンパク質」とは、原料となるタンパク質中のリジン残基、セリン残基、スレオニン残基、チロシン残基又はシステイン残基の少なくとも一部又は全部がアシル化されたタンパク質である。すなわち、原料となるタンパク質は、そのアミノ酸配列中に少なくとも１つのリジン残基、セリン残基、スレオニン残基、チロシン残基又はシステイン残基を有する。

＜タンパク質＞
　タンパク質は、天然のタンパク質であっても、人工タンパク質であってもよい。例えば、所望の用途に求められる物性に近い物性を有するタンパク質を採用することができる。また、タンパク質としては、工業用に利用できるタンパク質、医療用に利用できるタンパク質等を挙げることができる。工業用に利用可能とは、例えば、屋内や屋外で使用される様々な汎用材料等に利用し得ることをいう。工業用に利用できるタンパク質の具体例としては、構造タンパク質を挙げることができる。また、構造タンパク質の具体例としては、スパイダーシルク（クモ糸）、カイコシルク、ケラチン、コラーゲン、エラスチン及びレシリン、並びにこれら由来のタンパク質等を挙げることができる。使用するタンパク質としては、人工フィブロイン、或いは人工クモ糸フィブロイン（人工改変クモ糸フィブロイン）であってもよい。医療用に利用できるタンパク質の具体例としては、酵素、制御タンパク質、受容体、ペプチドホルモン、サイトカイン、膜又は輸送タンパク質、予防接種に利用する抗原、ワクチン、抗原結合タンパク質、免疫刺激タンパク質、アレルゲン、完全長抗体又は抗体フラグメント若しくは誘導体を挙げることができる。

　人工タンパク質は、組換え（リコンビナント）タンパク質と合成タンパク質とを含む。つまり、本明細書において「人工タンパク質」とは、人為的に製造されたタンパク質を意味する。人工タンパク質は、そのドメイン配列が、天然由来のタンパク質のアミノ酸配列とは異なるタンパク質であってもよく、天然由来のタンパク質のアミノ酸配列と同一であるタンパク質であってもよい。また、「人工タンパク質」は、天然由来のタンパク質のアミノ酸配列をそのまま利用したものであってもよく、天然由来のタンパク質のアミノ酸配列に依拠してそのアミノ酸配列を改変したもの（例えば、クローニングした天然由来のタンパク質の遺伝子配列を改変することによりアミノ酸配列を改変したもの）であってもよく、また天然由来のタンパク質に依らず人工的に設計及び合成したもの（例えば、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより所望のアミノ酸配列を有するもの）であってもよい。なお、人工タンパク質は、天然タンパク質とは異なり、アミノ酸配列を自由に設計し得るものであることから、かかる人工タンパク質が、後述する本実施形態の成形材料や成形体に含有される場合には、人工タンパク質のアミノ酸配列を適宜にデザインすることによって成形材料や成形体の機能や特性、物性等を任意にコントロールすることができる。また、常に均一な分子デザインが可能であるため、目的タンパク質との相同性の高い、目的に応じたタンパク質を安定的に得ることができる。以て、人工タンパク質を用いて得られる成形材料や成形体の品質の安定化が有利に図られる。その点からして、人工タンパク質としては、人工構造タンパク質が有利に用いられる。

　本実施形態に係るタンパク質及び修飾タンパク質のアミノ酸残基数が、特に限定されないが、例えば、５０以上であってよい。また、当該アミノ酸残基数は、例えば、１００以上、１５０以上、２００以上、２５０以上、３００以上、３５０以上、４００以上、４５０以上又は５００以上である。当該アミノ酸残基数は、例えば、５０００以下、４５００以下、４０００以下、３５００以下、３０００以下、２５００以下、２０００以下、１５００以下、１０００以下であってもよい。アミノ酸残基数が少ない程、溶媒への溶解度が高まる傾向にある。

　本実施形態に係るタンパク質の分子量は、特に限定されないが、例えば、２ｋＤａ以上５００ｋＤａ以下であってよい。また、本実施形態に係るタンパク質の分子量は、例えば、２ｋＤａ以上、３ｋＤａ以上、４ｋＤａ以上、５ｋＤａ以上、６ｋＤａ以上、７ｋＤａ以上、８ｋＤａ以上、９ｋＤａ以上、１０ｋＤａ以上、２０ｋＤａ以上、３０ｋＤａ以上、４０ｋＤａ以上、５０ｋＤａ以上、６０ｋＤａ以上、７０ｋＤａ以上、８０ｋＤａ以上、９０ｋＤａ以上、又は１００ｋＤａ以上であってよく、５００ｋＤａ以下、４００ｋＤａ以下、３６０ｋＤａ未満、３００ｋＤａ以下、又は２００ｋＤａ以下であってよい。

　本実施形態に係るタンパク質は、セリン残基、スレオニン残基、チロシン残基、リジン残基、システイン残基等の求核性官能基を少なくとも１つ含む。修飾タンパク質は、タンパク質中のセリン残基、スレオニン残基、又はチロシン残基が有する水酸基、リジン残基等が有するアミノ基、又はシステイン残基が有するスルフヒドリル基がアシル化されている。タンパク質がセリン残基、スレオニン残基、又はチロシン残基を有すると、アシル化剤によって、より効率的にアシル化され得る。タンパク質とアシル化剤との反応性の向上、修飾タンパク質の生産性の向上等を考慮した場合、タンパク質は、セリン残基、スレオニン残基及びチロシン残基の各含有率の合計（全アミノ酸残基数に対するセリン残基、スレオニン残基、チロシン残基の合計残基数の割合）が、例えば、４％以上であってよく、４．５％以上であってよく、５％以上であってよく、５．５％以上であってよく、６％以上であってよく、６．５％以上であってよく、７％以上であってよい。なお、セリン残基、スレオニン残基及びチロシン残基の各含有率の合計の上限値は特に限定されるものでないが、本実施形態に係るタンパク質及び修飾タンパク質として好適に使用可能な種々のタンパク質のアミノ酸組成を考慮すると、例えば、３５％以下であってよく、３３％以下であってよく、３０％以下であってよく、２５％以下であってよく、２０％以下であってよい。

（疎水性タンパク質）
　タンパク質は、例えば、疎水性タンパク質であってよい。タンパク質が疎水性タンパク質である場合には、修飾タンパク質を原料の少なくとも一部として成形体を製造した際に、かかる成形体の耐水性が向上し、例えば、成形体が工業用の汎用材料として使用される場合に、使用寿命の延命化が有利に図られ得る。加えて、修飾タンパク質は、例えば、機能性物質が結合された際に、機能性物質の疎水性乃至親水性をコントロールすることで、機能性物質と修飾タンパク質の結合体全体の疎水性乃至親水性を任意に調整可能となり得る。タンパク質が疎水性を有する場合（すなわち、タンパク質が疎水性タンパク質である場合）には、タンパク質が親水性を有する場合に比して、結合体全体を疎水性側にシフトすることができ、以て結合体全体の疎水性乃至親水性をより幅広い範囲にわたってコントロール可能となり得る。

　タンパク質における疎水性は、平均ハイドロパシー・インデックス（以下「ＨＩ」とも記す。）の値を指標として推定することができる。本明細書において、疎水性タンパク質の平均ハイドロパシー・インデックスの値は０超であればよく、例えば、０．００以上、０．１０以上、０．２０以上、０．２２以上、０．２５以上、０．３０以上、０．３５以上、０．４０以上、０．４５以上、０．５０以上、０．５５以上、０．６０以上、０．６５以上、又は０．７０以上であってよい。また、その上限値は特に制限されるものではないものの、例えば、１．００以下であってもよく、０．７以下であってもよい。

　なお、疎水性タンパク質の平均ハイドロパシー・インデックス（ＨＩ：Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ　ｉｎｄｅｘ）の値、及び後述する反復配列単位の疎水性度は、アミノ酸残基の公知の疎水性指標を用いて（）公知の方法に従って求められる。アミノ酸残基の公知の疎水性指標を表１に示す。例えば、疎水性度は、Ｋｙｔｅ　Ｊ、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ　Ｒ（１９８２）“Ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ　ｔｈｅ　ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ　ｃｈａｒａｃｔｅｒ　ｏｆ　ａ　ｐｒｏｔｅｉｎ”、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５７、ｐｐ．１０５－１３２に記載の方法にしたがって算出してもよい。

　疎水性タンパク質は、６０℃における臭化リチウム水溶液（濃度：９Ｍ）に対する溶解性の低いものが好ましい。すなわち、疎水性タンパク質としては、例えば、６０℃における臭化リチウム水溶液（濃度：９Ｍ）に溶解させた場合の最大濃度が、例えば、３０質量％未満、２５質量％未満、２０質量％未満、１５質量％未満、１０質量％未満、５質量％未満、又は１質量％未満のものであってよい。なお、疎水性タンパク質としては、６０℃における臭化リチウム水溶液（濃度：９Ｍ）に対して全く溶解しないものであってもよい。疎水性タンパク質が６０℃における臭化リチウム水溶液に対する溶解性が低いと、得られる修飾タンパク質が良好な耐水性（特に工業用途に適した耐水性）を得やすい。

　疎水性タンパク質は、水への接触角が５５°以上であるものであることが好ましい。疎水性タンパク質の水への接触角は、６０°以上、６５°以上、又は７０°以上であるとより好ましい。水への接触角は、基材上に疎水性タンパク質からなる膜を形成し、膜上に水を滴下して、５秒間経過後の接触角を測定することで評価できる。疎水性タンパク質の水への接触角が５５°以上であると、得られる修飾タンパク質が良好な耐水性（特に工業用途に適した耐水性）を得やすい。

　疎水性タンパク質は、耐熱水性に優れたものであることが好ましい。耐熱水性は、例えば、５ｗ／ｖ％の疎水性タンパク質の水分散液を調製し、当該分散液を１００℃に加熱してもタンパク質が少なくとも５時間分解しないものが好ましい。疎水性タンパク質が耐熱水性に優れるものであると、得られる修飾タンパク質は良好な耐水性（特に工業用途に適した耐水性）および耐熱水性を得やすい。

＜構造タンパク質＞
　本実施形態に係るタンパク質は、例えば、構造タンパク質であってよい。構造タンパク質とは、工業用に利用できるタンパク質の一種であり、生体の構造に関わるタンパク質、若しくは生体が作り出す構造体を構成するタンパク質、又はそれらに由来するタンパク質を意味する。例えば、構造タンパク質は、生化学反応には直接かかわらないが、爪、毛髪、皮膚、腱、軟骨、細胞内外マトリクスを構成するタンパク質であり、コラーゲンやケラチンのように分子自体が繊維状で疎水性のコアがないタンパク質と、アクチンのように単量体では球状タンパク質であるが、繊維状に多数重合しているタンパク質重合体であり得る。構造タンパク質は、また、一定の条件下において自己凝集し、繊維、フィルム、樹脂、ゲル、ミセル、ナノパーティクル等の構造体を形成するタンパク質のことをいう。さらに、構造タンパク質は、特徴的なアミノ酸配列もしくはアミノ酸数残基からなるモチーフが繰り返し存在し、生物や材料の骨格を形成するタンパク質とも言える。構造タンパク質は、天然においては、例えば、フィブロイン、ケラチン、コラ－ゲン、エラスチン及びレシリンが挙げられる。絹のフィブロインは、βシートのポリペプチド鎖が伸びた構造で繊維を形成しており、ケラチンは、αヘリックスの複数のポリペプチド鎖がロープ状に束になっている。エラスチンは、比較的球状に近いポリペプチド鎖が共有結合によって架橋を作り、ゴムのような弾力性のある網目を形成している。コラーゲンは、細長い繊維状のポリペプチド鎖が三重らせん構造を形成しており（「コラーゲン原繊維」とも呼ばれる。）、各ポリペプチド鎖は、グリシン残基が３残基目ごとにあり、プロリン残基が全アミノ酸残基の２０％以上あり、その約半分がヒドロキシプロリンであり、三重らせん構造の安定化に寄与している。

　構造タンパク質は、人工構造タンパク質であってもよい。本明細書において「人工構造タンパク質」とは、人為的に製造された構造タンパク質を意味する。人工構造タンパク質は、遺伝子組換え技術により微生物から生産した構造タンパク質であってよく、天然の構造タンパク質と同じアミノ酸配列を有するものであってもよく、生産性又は成形性等の観点から改良したアミノ酸配列を有するものであってもよい。

　構造タンパク質を成形する際、比較的小さな側鎖を有するアミノ酸ほど水素結合を形成しやすく、強度のより高い成形体を得やすい。また、アラニン残基及びグリシン残基は、側鎖が非極性アミノ酸であるため、ポリペプチド生成における折りたたみの過程で内側に向くように配置され、αヘリックス構造又はβシート構造を取りやすい。よって、グリシン残基、アラニン残基等のアミノ酸の割合が高いことが望ましい。強度により優れる成形体を得る観点から、アラニン残基含有率は、例えば、１０～４０％であればよく、１２～４０％、１５～４０％、１８～４０％、２０～４０％、又は、２２～４０％であってよい。強度により優れる成形体を得る観点から、グリシン残基含有率は、例えば、１０～５５％であればよく、１１～５５％、１３～５５％、１５～５５％、１８～５５％、２０～５５％、２２～５５％、又は２５～５５％であってよい。

　本明細書において、「アラニン残基の含有率」とは、タンパク質を構成する全アミノ酸残基数に対するアラニン残基の数を意味し、下記式で表される値である。

　アラニン残基の含有率＝（タンパク質に含まれるアラニン残基の数／タンパク質の全アミノ酸残基の数）×１００（％）

　また、グリシン残基含有率、セリン残基含有率、スレオニン残基含有率、プロリン残基含有率及びチロシン残基含有率は、上記式において、アラニン残基をそれぞれグリシン残基、セリン残基、スレオニン残基、プロリン残基及びチロシン残基と読み替えたものと同義である。

　構造タンパク質は、比較的大きな側鎖を有するアミノ酸又は屈曲性を有するアミノ酸が一定程度、配列全体に均質に含まれていることが好ましい。具体的には、構造タンパク質は、チロシン残基、スレオニン残基、プロリン残基が含まれるモチーフを繰り返して周期で入っていてもよい。このような構造タンパク質であると、成形して得た成形体の加工時に、強固な分子間水素結合の形成を阻害しやすく、加工性が向上しやすくなる。例えば、任意の連続した２０アミノ酸残基の中、プロリン残基、スレオニン残基及びチロシン残基の含有率の合計が、５％以上、５．５％超、６．０％以上、６．５％超、７．０％以上、７．５％超、８．０％以上、８．５％超、９．０％以上、１０．０％以上、又は１５．０％以上であってよい。また例えば、任意の連続した２０アミノ酸残基の中、プロリン残基、スレオニン残基及びチロシン残基の各含有率の合計が、５０％以下、４０％以下、３０％以下、又は２０％以下であってよい。

　一実施形態に係る人工構造タンパク質は、上述したタンパク質と同様に、アシル化剤との反応性の向上、更にはアシル化剤との反応によって得られる反応修飾タンパク質の生産性の向上等の観点から、セリン残基、スレオニン残基及びチロシン残基の各含有率の合計が、例えば、４％以上、４．５％以上、５％以上、５．５％以上、６％以上、６．５％以上、又は７％以上であってよい。セリン残基、スレオニン残基及びチロシン残基の各含有率の合計は、例えば、３５％以下、３３％以下、３０％以下、２５％以下、又は２０％以下であってよい。

　一実施形態に係る人工構造タンパク質は、反復配列を有するものであってよい。すなわち、本実施形態に係る人工構造タンパク質は、人工構造タンパク質内に配列同一性が高いアミノ酸配列（反復配列単位）が複数存在するものであってよい。反復配列単位のアミノ酸残基数は６～２００であることが好ましい。また、反復配列単位間の配列同一性は、例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上であってよい。また、反復配列単位の疎水性度（ハイドロパシー・インデックス）は、例えば、－０．８０以上、－０．７０以上、－０．６０以上、－０．５０以上、－０．４０以上、－０．３０以上、－０．２０以上、－０．１０以上、０．００以上、０．２２以上、０．２５以上、０．３０以上、０．３５以上、０．４０以上、０．４５以上、０．５０以上、０．５５以上、０．６０以上、０．６５以上、又は０．７０以上であってよい。なお、反復配列単位の疎水性度の上限値は特に制限されるものではないものの、例えば、１．０以下であってもよく、０．７以下であってもよい。

　一実施形態に係る人工構造タンパク質は、（Ａ）_ｎモチーフを含むものであってよい。本明細書において、（Ａ）_ｎモチーフとは、アラニン残基を主とするアミノ酸配列を意味する。（Ａ）_ｎモチーフのアミノ酸残基数は２～２７であってよく、２～２０、２～１６、又は２～１２の整数であってよい。また、（Ａ）_ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は４０％以上であってよく、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％（アラニン残基のみで構成されることを意味する。）であってもよい。

　人工構造タンパク質は、人工フィブロインであってもよい。フィブロインとしては、例えば、天然由来のフィブロインが挙げられる。天然由来のフィブロインとしては、例えば、昆虫又はクモ類が産生するフィブロインが挙げられる。天然のフィブロインは繊維状のタンパク質であり、分子量が約３７万であり、２つのサブユニットで構成され、グリシン残基、アラニン残基、セリン残基及びチロシン残基の含有率が高く、これらのアミノ酸残基が全アミノ酸残基数の９０％近くを占める。天然のフィブロインは、グリシン、アラニン及びセリン等の比較的小さな側鎖を有するアミノ酸残基が豊富な結晶領域と、チロシン等の比較的大きな側鎖を有するアミノ酸残基を有する非晶領域を有する。

　天然由来のフィブロインのより具体的な例としては、ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋに配列情報が登録されているフィブロインを挙げることができる。例えば、ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報のうちＤＩＶＩＳＩＯＮとしてＩＮＶを含む配列の中から、ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮにｓｐｉｄｒｏｉｎ、ａｍｐｕｌｌａｔｅ、ｆｉｂｒｏｉｎ、「ｓｉｌｋ及びｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」、又は「ｓｉｌｋ及びｐｒｏｔｅｉｎ」がキーワードとして記載されている配列、ＣＤＳから特定のｐｒｏｄｕｃｔの文字列、ＳＯＵＲＣＥからＴＩＳＳＵＥ　ＴＹＰＥに特定の文字列の記載された配列を抽出することにより確認することができる。

　本明細書において「人工フィブロイン」とは、人為的に製造されたフィブロイン（人造フィブロイン）を意味する。人工フィブロインは、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列とは異なるフィブロインであってもよく、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列と同一であるフィブロインであってもよい。人工フィブロインは、公知の方法によって製造でき、例えば、国際公開第２０２１／１８７５０２号に記載の方法で製造できる。

　人工フィブロインは、天然由来フィブロインに準ずる構造を有する繊維状タンパク質であってよく、天然由来フィブロインが有する反復配列と同様の配列を有するフィブロインであってもよい。「フィブロインが有する反復配列と同様の配列」とは、実際に天然由来フィブロインが有する配列であってもよく、それと類似する配列であってもよい。

　「人工フィブロイン」は、本開示で特定されるアミノ酸配列を有するものであれば、天然由来のフィブロインに依拠してそのアミノ酸配列を改変したもの（例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列を改変することによりアミノ酸配列を改変したもの）であってもよく、また天然由来のフィブロインに依らず人工的にアミノ酸配列を設計したもの（例えば、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより所望のアミノ酸配列を有するもの）であってもよい。なお、人工フィブロインのアミノ酸配列を改変したものも、そのアミノ酸配列が天然由来のフィブロインのアミノ酸配列とは異なるものであれば、人工フィブロインに含まれる。人工フィブロインとしては、例えば、人工絹（シルク）フィブロイン（カイコが産生する絹タンパク質のアミノ酸配列を改変したもの）、及び人工クモ糸フィブロイン（クモ類が産生するスパイダーシルクタンパク質のアミノ酸配列を改変したもの）などが挙げられる。人工フィブロインは、比較的にフィブリル化が容易で繊維形成能が高いことから、成形材料として好ましくは人工クモ糸フィブロインを含み、より好ましくは人工クモ糸フィブロインからなる。

　本実施形態に係る人工フィブロインは、式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ、又は式２：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ－（Ａ）_ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質であってよい。人工フィブロインは、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側のいずれか一方又は両方に更にアミノ酸配列（Ｎ末端配列及びＣ末端配列）が付加されていてもよい。Ｎ末端配列及びＣ末端配列は、これに限定されるものではないが、典型的には、フィブロインに特徴的なアミノ酸モチーフの反復を有さない領域であり、１００残基程度のアミノ酸からなる。

　本明細書において「ドメイン配列」とは、フィブロイン特有の結晶領域（典型的には、アミノ酸配列の（Ａ）_ｎモチーフに相当する。）と非晶領域（典型的には、アミノ酸配列のＲＥＰに相当する。）を生じるアミノ酸配列であり、式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ、又は式２：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ－（Ａ）_ｎモチーフで表されるアミノ酸配列を意味する。ここで、（Ａ）_ｎモチーフは、アラニン残基を主とするアミノ酸配列を示し、アミノ酸残基数は２～２７である。（Ａ）_ｎモチーフのアミノ酸残基数は、２～２０、４～２７、４～２０、８～２０、１０～２０、４～１６、８～１６、又は１０～１６の整数であってよい。また、（Ａ）_ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は４０％以上であればよく、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％（アラニン残基のみで構成されることを意味する。）であってもよい。ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）_ｎモチーフは、少なくとも７つがアラニン残基のみで構成されてもよい。ＲＥＰは２～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ＲＥＰは、１０～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列であってもよい。ｍは２～３００の整数を示し、３～３００、４～３００、５～３００、６～３００、１０～３００の整数であってもよい。複数存在する（Ａ）_ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。

　人工フィブロインの具体的な例として、例えば、国際公開第２０２１／１８７５０２号に記載されるようなクモの大瓶状腺で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する人工フィブロイン（第１の人工フィブロイン）、グリシン残基の含有量が低減されたドメイン配列を有する人工フィブロイン（第２の人工フィブロイン）、（Ａ）_ｎモチーフの含有量が低減されたドメイン配列を有する人工フィブロイン（第３の人工フィブロイン）、グリシン残基の含有量、及び（Ａ）_ｎモチーフの含有量が低減された人工フィブロイン（第４の人工フィブロイン）、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むドメイン配列を有する人工フィブロイン（第５の人工フィブロイン）、並びにグルタミン残基の含有量が低減されたドメイン配列を有する人工フィブロイン（第６の人工フィブロイン）が挙げられる。第１～第６の各人工フィブロインの定義は、国際公開第２０２１／１８７５０２号に記載の内容を参照により本明細書に取り込まれる。

　人工フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、人工フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。ＰＲＴ９６６は、タグ配列を含む第６の人工フィブロインである。

　タグ配列として、例えば、他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用したアフィニティタグを挙げることができる。アフィニティタグの具体例として、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を挙げることができる。Ｈｉｓタグは、ヒスチジン残基が４から１０個程度並んだ短いペプチドで、ニッケル等の金属イオンと特異的に結合する性質があるため、金属キレートクロマトグラフィー（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　ｍｅｔａｌ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による人工フィブロインの単離に利用することができる。タグ配列の具体例として、例えば、配列番号１２で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含むアミノ酸配列）が挙げられる。

　また、グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列を利用することもできる。

　さらに、抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用することもできる。抗原性を示すペプチド（エピトープ）をタグ配列として付加することにより、当該エピトープに対する抗体を結合させることができる。エピトープタグとして、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列）タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等を挙げることができる。エピトープタグを利用することにより、高い特異性で容易に人工フィブロインを精製することができる。

　さらにタグ配列を特定のプロテアーゼで切り離せるようにしたものも使用することができる。当該タグ配列を介して吸着したタンパク質をプロテアーゼ処理することにより、タグ配列を切り離した人工フィブロインを回収することもできる。

　人工フィブロインの具体例としては、例えば、下記表２に示す人工フィブロインが挙げられる。

　人工フィブロインは、第１の人工フィブロイン、第２の人工フィブロイン、第３の人工フィブロイン、第４の人工フィブロイン、第５の人工フィブロイン、及び第６の人工フィブロインが有する特徴のうち、少なくとも２つ以上の特徴を併せ持つ人工フィブロインであってもよい。

　本実施形態に係る人工フィブロインの分子量は、特に限定されないが、例えば、２ｋＤａ以上７００ｋＤａ以下であってよい。本実施形態に係る人工フィブロインの分子量は、例えば、２ｋＤａ以上、３ｋＤａ以上、４ｋＤａ以上、５ｋＤａ以上、６ｋＤａ以上、７ｋＤａ以上、８ｋＤａ以上、９ｋＤａ以上、１０ｋＤａ以上、２０ｋＤａ以上、３０ｋＤａ以上、４０ｋＤａ以上、５０ｋＤａ以上、６０ｋＤａ以上、７０ｋＤａ以上、８０ｋＤａ以上、９０ｋＤａ以上、又は１００ｋＤａ以上であってよく、７００ｋＤａ以下、６００ｋＤａ以下、５００ｋＤａ以下、４００ｋＤａ以下、３６０ｋＤａ未満、３００ｋＤａ以下、又は２００ｋＤａ以下であってよい。

　本実施形態では、上述のタンパク質をアシル化剤と混合して、得られた混合物をメカノケミカル法で処理して、タンパク質を化学的に修飾する。

　アシル化剤としては、水酸基、アミノ基、又はスルフヒドリル基をアシル化できる試薬であればよく、例えば、カルボン酸ハライド（例えば、カルボン酸塩化物、カルボン酸臭化物）、カルボン酸無水物（例えば、酸無水物、環状酸無水物）等の活性化されたカルボン酸誘導体、スルホン酸ハライド（例えば、スルホン酸塩化物、スルホン酸臭化物）、スルホン酸無水物等の活性化されたスルホン酸誘導体、ハロゲン化リン（例えば、三塩化リン、オキシ塩化リン）、リン酸トリエステル（例えば、トリス（ビストリフルオロエチル）ホスフェート）等のリン酸誘導体が挙げられる。これらアシル化剤により、カルボン酸、スルホン酸又はリン酸に対応するアシル基が導入される。カルボン酸としては、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸（ヘプタン酸）、カプリル酸（オクタン酸）、ペラルゴン酸（ノナン酸）、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸等の飽和モノカルボン酸；オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸等の不飽和モノカルボン酸；マレイン酸等のジカルボン酸が挙げられる。これらのカルボン酸に対応する酸ハライドとしては、例えば、塩化アセチル、臭化アセチル、塩化プロピオニル、臭化プロピオニル、塩化ラウロイル、塩化ミリストイル、塩化パルミトイル、塩化ステアロイル等が挙げられる。これらのカルボン酸に対応する酸無水物としては、無水酢酸、無水プロピオン酸、無水マレイン酸等が挙げられる。スルホン酸としては、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、プロパンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ノナフルオロブタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、ｍ－トルエンスルホン酸、ｏ－トルエンスルホン酸等が挙げられる。これらのスルホン酸に対応する酸ハライドとしては、例えば、塩化メタンスルホニル、臭化メタンスルホニル、塩化エタンスルホニル、臭化エタンスルホニル、塩化プロパンスルホニル、臭化プロパンスルホニル、塩化ベンゼンスルホニル、塩化ｐ－トルエンスルホニル、塩化ｍ－トルエンスルホニル、塩化ｏ－トルエンスルホニル等が挙げられる。これらのカルボン酸に対応する酸無水物としては、メタンスルホン酸無水物、エタンスルホン酸無水物、トリフルオロメタンスルホン酸無水物、ノナフルオロブタンスルホン酸無水物等が挙げられる。

　アシル化剤が無水マレイン酸である場合、得られる修飾タンパク質（マレイン酸エステル化タンパク質）は末端カルボキシ基を有する。マレイン酸エステル化タンパク質は、さらに亜硫酸水素ナトリウムとメカノケミカル法で反応させることにより、スルホスクシニル化タンパク質へ変換できる。マレイン酸エステル化タンパク質は、さらにジアルキルホスファイトとメカノケミカル法で反応させることにより、（ジアルコキシホスホリル）スクシニル化タンパク質へ変換できる。

　アシル化剤の使用量は、タンパク質中に含まれる求核性官能基１つあたり、１．５～７当量を使用することができる。アシル化剤の使用量は、好ましくは、１求核性官能基あたり、１．５～６．５当量、１．５～６当量、１．５～５．５当量、１．５～５当量、１．５～４当量、２～７当量、２～６．５当量、２～６当量、２～５．５当量、２～５当量、２～４．５当量、２．５～７当量、２．５～６．５当量、２．５～６当量、２．５～５．５当量、２．５～５当量、又は２．５～４．５当量であってもよい。「求核性官能基１つあたりの当量」とは、タンパク質に含まれる求核性官能基の数１個に対するアシル化剤のモル当量のことを意味する。アシル化剤の使用量を上記のような範囲内の値とすることで、メカノケミカル処理でのタンパク質とアシル化剤との反応性乃至は反応効率が高められて、目的とする修飾タンパク質が、より効率的に得られる。

　メカノケミカル法による処理は、機械的エネルギーを直接吸収することによって引き起こされる化学反応を行う処理である。かかる機械的エネルギーは、例えば、衝撃力やせん断力によって発揮されるものであってよい。このようなメカノケミカル処理は、具体的には転動ボールミル、媒体撹拌ミル、遊星ミル、ジェットミル、、ミキサーミル、エクストルーダー（二軸押出機）を用いて行われる。具体的には、タンパク質とアシル化剤を粉砕ジャーに入れ、使用するミルの種類に応じて媒体ボール等を投入する。その後、粉砕ジャーをミキサーミル装置にセットし、所定の周波数及び反応時間で振動させる。このとき、粉砕ジャーには、溶媒、塩基、反応促進剤等をさらに加えてもよい。或いは、タンパク質とアシル化剤をミキサーミルに投入し、ミリング手順を開始して、反応物を連続的にニーディングする。このとき、ミキサーミルには、溶媒、塩基、反応促進剤等をさらに加えてもよい。また、タンパク質とアシル化剤をエクストルーダーに投入して、それらを混錬する。このとき、エクストルーダーには、溶媒、塩基、反応促進剤等をさらに加えてもよい。なお、エクストルーダーを用いてメカノケミカル処理を行えば、目的とするエステル化タンパク質（修飾タンパク質）を連続的生産することが可能となる。

　周波数は、反応に応じて、当業者が適宜調整することができ、例えば、１０～５０Ｈｚ、１０～４５Ｈｚ、１０～４０Ｈｚ、１０～３５Ｈｚ、１５～５０Ｈｚ、１５～４５Ｈｚ、１５～４０Ｈｚ、１５～３５Ｈｚ、２０～５０Ｈｚ、２０～４５Ｈｚ、２０～４０Ｈｚ、又は２０～３５Ｈｚであってもよい。

　反応時間は、赤外（ＩＲ）吸収スペクトル、ゲルろ過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）等において、原料となるタンパク質が消失するか、アシル化タンパク質（修飾タンパク質）の検出が一定以上に観察される時点までとすることができる。反応時間としては、任意の時間であってよく、例えば、３０～１５０分間、３０～１２０分間、３０～１１０分間、３０～１００分間、３０～９５分間、６０～１５０分間、６０～１２０分間、６０～１１０分間、６０～１００分間、６０～９５分間、７０～１５０分間、７０～１２０分間、７０～１１０分間、７０～１００分間、７０～９５分間、８０～１５０分間、８０～１２０分間、８０～１１０分間、８０～１００分間、又は８０～９５分間であってよい。

　溶媒は、タンパク質を膨潤できる溶媒であるか、タンパク質及びアシル化剤の少なくとも一方を溶解できる溶媒であればよいが、常温常圧で液体であって、且つタンパク質と化学反応しない化合物でなければならない。このような溶媒を添加したメカノケミカル処理は、リキッドアシステッドグラインディング（ＬＡＧ）として知られ、粉砕ジャーの中に少量の溶媒を添加することにより、所望の反応をより効率的に進行させる方法である。かかる溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ－メチルピペリドン（ＮＭＰ）、ジヒドロレボグルコセノン、イオン液体等が挙げられる。溶媒の使用量は、タンパク質の質量１ｇに対して、例えば、０．０１ｇ～１ｇであればよく、０．０１ｇ～０．８ｇが好ましく、０．０１ｇ～０．６ｇがより好ましく、０．０１ｇ～０．４ｇがより好ましく、０．０１ｇ～０．２ｇが最も好ましい。換言すれば、溶媒の使用量は、タンパク質に対して、例えば、１～１００重量％であればよく、１～８０重量％が好ましく、１～６０重量％がより好ましく、１～４０重量％が更に好ましく、１～２０重量％が最も好ましい。極微量の溶媒は、タンパク質を膨潤させたり、局所的に溶解状態にする等により、ミクロな反応場を形成すると考えられる。なお、溶媒の添加は必ずしも必要ではなく、例えば、アシル化剤が常温常圧で液体であって、上記の溶媒としての機能を有するときには、溶媒の添加が不要となる場合もある。

　塩基は、タンパク質中のセリン残基、スレオニン残基、又はチロシン残基の水酸基、リジン残基のアミノ基、システイン残基のスルフヒドリル基がアシル化するのを補助できる塩基であればよい。塩基としては、３級アミン、含窒素芳香族化合物、無機塩基が挙げられ、より具体的にはトリエチルアミン、ＤＩＰＥＡ（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン）、ＤＡＢＣＯ（１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン）、キヌクリジン、ＤＢＵ（１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク－７－エン）、ＤＢＮ（１，５－ジアザビシクロ［４．３．０］ノン－５－エン）、ピリジン、イミダゾール、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム、リン酸三カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等が挙げられる。使用される塩基の物質量は、タンパク質に含まれる求核性官能基の物質量を１とした時、例えば、１～１０がであってもよく、１～８であってもよく、１～７であってもよく、１～６であってもよく、１～５であってもよい。なお、かかる塩基の物質量は、使用される塩基の種類等によって好ましい範囲が存在し、例えば、塩基として水酸化ナトリウム等の無機塩基を使用する場合には、上記物質量が、好ましくは１～５、より好ましくは１～２であり、塩基としてＤＩＰＥＡ等の３級アミンを用いる場合には、上記物質量が、好ましくは１～５、より好ましくは３．５～５である。

　反応促進剤は、有機化学分野でアシル化反応を促進させることが知られているものであればよく、例えば、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）が挙げられる。アシル化がアセチル化である場合、反応促進剤を使用する必要はない。

　アシル化がサクシニル化である場合、反応促進剤を加えるとアシル化反応の速度が向上し得る。この場合、反応促進剤の使用量は、タンパク質に含まれる求核性官能基の物質量１（求核性官能基を有するアミノ酸残基１つ）に対して、０当量超５当量以下であればよく、３．５当量～５当量が好ましい。また、反応促進剤の使用量は、塩基の使用量１モルに対して、０モル超１モル以下の量であればよく、０．３モル～１モルであってもよい。

　アシル化がステアリル化である場合、反応促進剤を加えるとアシル化反応の速度が向上し得る。この場合、反応促進剤の使用量は、タンパク質に含まれる求核性官能基の物質量１（求核性官能基を有するアミノ酸残基１つ）に対して、１当量～５当量であればよく、３．５当量～５当量が好ましい。反応促進剤の使用量は、塩基の使用量１モルに対して、０．２～１モルの量であればよく、０．７～１モルであってもよい。

　反応終了後、粉砕ジャーから混合物を取り出し、溶媒で洗浄してもよい。洗浄により、未反応のアシル化剤及び反応により生じた酸を除去することができる。洗浄に使用する溶媒としては、水、アセトニトリル、アセトン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、ヘキサンなどが挙げられる。洗浄した後、生成物を乾燥することにより洗浄に用いた溶媒を留去してもよい。乾燥は、減圧下行ってもよい。

　修飾タンパク質が、その末端に親水性基（例えば、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基、スルホ基、ホスフェート基）を有する場合、接触角が小さくなる。このような修飾タンパク質を含有するコーティングを使用すると、濡れ性及び親水性がより高まる。修飾タンパク質が、その末端に疎水性基（例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基）を有する場合、接触角が大きくなる。このような修飾タンパク質を含有するコーティングを使用すると、撥水性及び疎水性がより高まる。接触角が９０°～１５０°であると、防水・撥水の目的で使用するのに適しており、１１０°～１５０°であると、その素材の優れた撥水性のため、水滴を表面汚れごと落とす自己洗浄効果が期待できる。接触角が７０～９０°であると、保湿の目的で使用するのに適しており、４０～９０°であると、液体の浸透効果、分散効果の向上により、素材の染色が容易とする効果が期待できる。

　修飾タンパク質が、難燃性元素を含む場合（例えば、スルホン化若しくはリン酸化されたスクシニル化タンパク質、スルホン酸エステル化タンパク質又はリン酸エステル化タンパク質である場合）、このような修飾タンパク質を含有するコーティングを使用すると、難燃性がより高まる。このような修飾タンパク質を含有するコーティングは、関連する製品の安全性及び耐久性向上の目的で使用するのに適している。従来、タンパク質にポリリン酸の塩又はポリヌクレオチドの塩を配合すると、難燃性を付与できることが知られている。難燃剤としては、例えば、日本ゴム協会誌「総説特集　有機系配合剤　難燃剤」（西沢仁、２００６年、３１６～３２２頁）に記載のものが知られている。しかし、単に配合するだけでは、水に浸すとポリリン酸の塩及びポリヌクレオチドの塩が流出してしまい、効果が減弱することがある。本実施形態に係る修飾タンパク質であれば、水に浸しても付与された難燃性が減弱されにくいという効果を奏する。難燃性元素は、難燃剤の構造によく見られる原子（難燃性を付与できる原子）であり、難燃性元素としてはハロゲン原子、リン原子、硫黄原子、ホウ素原子、ケイ素原子が挙げられる。

　修飾タンパク質の限界酸素指数（ＬＯＩ）値は、１８以上であってよく、２０以上であってもよく、２２以上であってもよく、２４以上であってもよく、２６以上であってもよく、２７以上であってもよく、２８以上であってもよく、２９以上であってもよく、３０以上であってもよい。本明細書において、ＬＯＩ値は、消防庁危険物規制課長消防危５０号平成７年５月３１日の粉粒状又は融点の低い合成樹脂の試験方法に準拠して測定される値である。

　修飾タンパク質が、その末端に親水性基を有する場合、（例えば、スクシニル化タンパク質又はマレイン酸エステル化タンパク質である場合）は水分子を取り込むことで長鎖のアルキル基（炭素数４以上のアルキル基が好ましく、炭素数６以上のアルキル基がより好ましく、炭素数８以上のアルキル基がさらに好ましい）を有する場合は、鎖間の相互作用を減少させることで、ポリマー間の動きを促進する効果が期待できるため、未修飾タンパク質と比べて軟化点がより低く、ガラス転移温度（Ｔｇ）もより低くなる。未修飾タンパク質は、１５０℃付近に加熱すると、分解挙動が顕著になるため、１５０℃以上に加熱して軟化させることは困難であった。しかし、本実施形態に係る修飾タンパク質であれば、軟化点及びガラス転移温度が低下しているため、１５０℃より低い温度で軟化させることができ、加工又は成形しやすい。より低い温度ではより分解による影響を抑えることができ素材の変質、色の大幅な変化、強度の低下を防ぐことができる。この観点では、軟化点を１３０℃以下にすることが望ましく、１００℃以下にすることがさらに望ましい。上記修飾タンパク質は、エクストルーダー等を用いた成形加工、軟化点以下の温度での素材柔軟性の向上の目的で使用するのに適している。

　また、修飾タンパク質を含有する成形体がさらに可塑剤を含有する場合、その成形体は軟化点及びガラス転移温度がさらに低くなる。可塑剤としては、当業界で知られた成分を使用することができ、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、グリセロールのような多価アルコールが挙げられる。しかし、単に可塑剤を配合するだけでは、加工の際あるいは経時的な変化により可塑剤が流出してしまい、効果が減弱することがある。本実施形態に係る修飾タンパク質であれば、加工時の加熱や長期間の保存を想定した場合においても成形体は軟化点及びガラス転移温度を低下させる効果が減弱されにくいという効果を奏する。

　本実施形態に係る修飾タンパク質は、例えば、単独で、或いは固体状乃至は液体状の他の成分が配合されたり、添加されたり、混合されたりして構成された組成物として用いられ得る。すなわち、修飾タンパク質は、それを含む修飾タンパク質組成物として構成され得る。このような修飾タンパク質組成物は、修飾タンパク質以外の成分によって、固体状や液体状の形態を有する。また、修飾タンパク質組成物は、例えば、繊維、フィルム、ゲル、多孔質体、パーティクル、樹脂等を成形する成形材料として用いられ得る。換言すれば、修飾タンパク質組成物を所定の方法で成形することで、修飾タンパク質組成物成形体が得られる。固体状乃至は液体状の修飾タンパク質組成物に含まれる他の成分としては、水や、有機溶媒、イオン性液体、超臨界液体等が採用可能である。なお、修飾タンパク質組成物は、特に接着剤やコーティング剤等として用いられる場合、粘着向上剤や接着向上剤を含んでいてもよい。この粘着向上剤としては、例えば、ロジン誘導体が挙げられ、また、接着向上剤としては、例えば、デンプンやスクロース等の糖類が例示され得る。

　なお、修飾タンパク質組成物を成形してなる成形体は、成形体の種類等に応じた公知の方法で製造が可能である。例えば、繊維、修飾タンパク質と溶媒とを含むドープ液を用いた、湿式紡糸法や乾湿式紡糸法、乾式紡糸法等の公知の紡糸方法によって得られる。また、フィルム、ゲル、多孔質体、パーティクル、樹脂等は、例えば、特許第５６７８２８３号公報、特許第５７８２５８０号公報、特許第５７９６１４７号公報、特許第５８２３０７９号公報、特許第６８３０６０４号公報等に記載の方法に準じて製造することができる。さらに、樹脂は、例えば、修飾タンパク質と所定の溶媒乃至分散媒体等を含む修飾タンパク質組成物（例えばゲル状）から溶媒や分散媒体を離脱させて固化させる等して得ることもできる。
上述の成形体は、修飾タンパク質のみを材料として用いて成形することもできる。この場合、修飾タンパク質は、成形体の成形用材料とも言える。

　本実施形態に係る修飾タンパク質は、それを主成分とする、溶液の状態、水分散液の状態、フィルムの状態、又は粉末の状態で、被着体を接着する接着剤、或いは基材にコーティング層を積層形成するコーティング剤として使用できる。それら溶液状接着剤や溶液状コーティング剤、水分散性接着剤や水分散性コーティング剤、フィルム状接着剤やフィルム状コーティング剤、粉末状接着剤や粉末状コーティング剤は、例えば、以下の製造方法によって得ることができる。以下に示す接着剤の実施形態の説明において、「積層体」とは、基材上に１枚以上のフィルムを載せて圧着加工した状態を指し、「接着体」とは、圧着加工により基材に瀬着できる性質を有するフィルム自体を指します。また、コーティング剤の実施形態の説明において、コーティング剤層が基材表面に密着するようにコーティング剤層に圧力を架ける部材のことを「押圧体」又は「加圧体」という。

　修飾タンパク質を含む溶液状接着剤や溶液状コーティング剤は、本実施形態手法によって得られる修飾タンパク質を溶媒に溶解させる工程を含んだ方法によって製造できる。このような方法によれば、従来の石油由来の成分を含む溶液状接着剤や溶液状コーティング剤とは異なって、生分解性を有する溶液状接着剤や溶液状コーティング剤が容易に得られることとなる。

　溶液状接着剤や溶液状コーティング剤の製造に用いられる溶媒は、修飾タンパク質を溶解可能な液体であればよく、水、塩基性水溶液、酸性水溶液、無機塩を含む水溶液等の水性媒体、有機溶媒、これらの混合溶媒等が挙げられる。有機溶媒としては、ギ酸、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ－メチルピペリドン（ＮＭＰ）、ジヒドロレボグルコセノン等が例示される。

　溶液状接着剤や溶液状コーティング剤に含まれる修飾タンパク質は、本実施形態に係る製法によって得られるものであって、前記した溶媒に溶解可能なものであれば特に限定されるものではない。修飾タンパク質が水性媒体に溶解した接着剤やコーティング剤は、修飾タンパク質が有機溶媒に溶解した接着剤やコーティング剤よりも取扱い性等が優れるといった利点がある。このような水溶液状接着剤や水溶液状コーティング剤としては、例えば、マレイン酸エステル化タンパク質、コハク酸エステル化タンパク質、スルホン酸エステル化タンパク質、リン酸エステル化タンパク質等の修飾タンパク質を塩基性水溶液に溶解したものが好適に用いられる。それらの修飾タンパク質は、塩基性水溶液に対する溶解度が高い。このため、上記の修飾タンパク質が塩基性水溶液に溶解した水溶液状接着剤や水溶液状コーティング剤を用いれば、後述する被着体の被着面や積層体表面により高濃度の接着剤又はコーティング剤を塗布することができ、その接着強度の向上が期待できる。特に水溶液状接着剤又はコーティング剤であれば、修飾タンパク質の分子がほぐれやすくなり、被着体の表面上に存在する微細な凹みに入り込みやすくなり、接着力が向上し得る。

　溶液状接着剤や溶液状コーティング剤中の修飾タンパク質の濃度は、修飾タンパク質の溶媒に対する溶解度等に基づいて適宜に決定される。かかる濃度は、例えば、５～４０質量％であってもよく、１０～３５質量％であってもよく、１５～２０質量％であってもよく、２０～２５質量％であってもよい。また、溶液状接着剤や溶液状コーティング剤には、必要に応じて、公知の溶液状接着剤や溶液状コーティング剤に含まれる各種の添加剤等の修飾タンパク質以外の成分が含まれていてもよい。

　修飾タンパク質を含む溶液状接着剤は、複数の被着体が互いに接着された接着体を製造するのに用いられる。例えば、接着されるべき複数の被着体の間に溶液状接着剤を介在させた後、溶液状接着剤中の溶媒を除去して、修飾タンパク質を固化させることにより、被着体同士を接着して接着体を得ることができる。このような方法によれば、生分解性を有する接着剤を用いて接着体が得られるため、廃棄時の環境負荷を低減可能な接着体が容易に製造できるといったメリットがある。なお、被着体は、修飾タンパク質を含む溶液状接着剤にて接着可能なものであれば、その材質は特に限定されるものではなく、有機物質（例えば、紙、木材等のセルロース製品や合成樹脂、タンパク質製品）であっても、無機物質（金属やガラス等の非金属）であってもよい。

　溶液状接着剤を用いて接着体を製造する際の具体的な方法も何等限定されるものではない。例えば、互いに接着される被着体のうちの少なくとも何れか一方の被着面に溶液状接着剤を塗布したり、滴下したり、或いは被着体の被着面を溶液状接着剤の液面に接触させたり、浸漬したりして、被着面に溶液状接着剤を存在させた後、被着体を被着面同士において重ね合わせ乃至は突き合わせることで、複数の被着体の間に溶液状接着剤を介在させるようにしてもよい。また、複数の被着体の間に介在する溶液状接着剤中の溶媒を除去して、修飾タンパク質を固化させる際には、例えば、重ね合わされた、又は突き合わされた被着面同士が互い密接されるように、複数の被着体に対して、被着面の重合せ方向乃至突合せ方向の少なくとも何れか一方側から圧力を加えた状態で、加熱したり、風乾したり、自然乾燥させたりしてもよい。勿論、そのような圧力を加えなくとも接着が可能な場合は、圧力を加える必要がない。

　修飾タンパク質を含む溶液状コーティング剤は、基材の表面の全体又は一部にコーティング層が積層形成された積層体を製造するのに用いられる。例えば、コーティング層が積層されるべき基材の表面の少なくとも一部に溶液状コーティング剤を供給して、かかる基材の表面部分を溶液状コーティング剤でコーティングした後、溶液状接着剤中の溶媒を除去して、修飾タンパク質を固化させる。これにより、基材の表面の少なくとも一部にコーティング層を積層形成して積層体を得ることができる。このような方法によっても、生分解性を有するコーティング剤を用いて積層体が得られるため、廃棄時の環境負荷を低減可能な積層体が容易に製造できるといったメリットがある。なお、基材は、修飾タンパク質を含む溶液状コーティング剤が接着可能なものであれば、その材質は特に限定されるものではなく、前記した溶液状接着剤にて接着される被着体と同様なものであってよい。

　溶液状コーティング剤を用いて積層体を製造する際の具体的な方法も何等限定されるものではない。例えば、基材表面の少なくとも一部に溶液状コーティング剤を塗布したり、滴下したり、或いは基材表面の少なくとも一部を溶液状コーティング剤の液面に接触させたり、浸漬したりして、基材の少なくとも一部に溶液状コーティング剤を所定厚さの層となるように供給してコーティングしてもよい。また、基材表面に積層されたコーティング剤層（溶液状コーティング剤）中の修飾タンパク質を固化させる際には、例えば、基材表面上のコーティング剤層を加熱したり、風乾したり、自然乾燥させたりして、コーティング剤層中の溶媒を除去するようにしてもよい。なお、その際には、必要に応じて、コーティング剤層上に、所定の押圧体（加圧体）を、コーティング剤層の全面を覆うように載置し、コーティング剤層が基材表面に密着するようにコーティング剤層を基材表面側に押圧（加圧）してもよい。このとき、押圧体が溶液状コーティング剤に接着しないようにするのが好ましい。例えば、押圧体のコーティング剤層との接触面に、離型剤を塗布したり、離型紙を貼り付けておいたり、或いは接触面に対して、コーティング剤が接着しないような表面処理したり、若しくは押圧体として、溶液状コーティング剤に接着しない材質のものを用いたりすることで、押圧体に対する溶液状コーティング剤の接着が防止できる。なお、押圧体としては、例えば、ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）、ＰＰ（ポリプロピレン）、ＰＥ（ポリエチレン）、シリコンゴム等、溶液状コーティング剤に対して離型性を示す材料が挙げられ、また、押圧体の表面処理としては、例えば、シリコーンオイルのコーティング処理等が例示され得る。

　修飾タンパク質を含む水分散性接着剤や水分散性コーティング剤は、本実施形態手法によって得られる修飾タンパク質を水性媒体（水性液体）に分散させる工程を含んだ方法によって製造できる。このような方法によれば、従来の石油由来の成分を含む水分散性接着剤や水分散性コーティング剤とは異なって、生分解性を有する水分散性接着剤や水分散性コーティング剤が容易に得られることとなる。

　水分散性接着剤や水分散性コーティング剤の製造に用いられる水性媒体は、修飾タンパク質が分散可能な水や、塩基性水溶液、酸性水溶液、無機塩を含む水溶液等が例示され得る。使用する溶媒が修飾タンパク質を溶解する場合、当該溶媒は、溶液状接着剤又はコーティング剤を調製するのに適しており、使用する溶媒が修飾タンパク質を完全に溶解しない場合は、当該溶媒は、水分散性接着剤又はコーティング剤を調製するのに適している。

　水分散性接着剤や水分散性コーティング剤に含まれる修飾タンパク質は、本実施形態に係る製法によって得られるものであって、前記した水性媒体に分散可能なものであれば特に限定されるものではない。かかる修飾タンパク質としては、例えば、マレイン酸エステル化タンパク質や、コハク酸エステル化タンパク質、スルホン酸エステル化タンパク質、リン酸エステル化タンパク質等が挙げられる。これらの修飾タンパク質は、比較的に高い吸水性を有するため、水性媒体により多くの量が分散され得る。このため、それらの修飾タンパク質を含む水分散性コーティング剤においては、修飾タンパク質の含有割合を有利に高めることが可能となって、水性媒体の含有割合を効果的に低減できる。そして、それによって、水性媒体の除去による修飾タンパク質の固化速度の向上が期待でき、以て、被着体に対する接着速度を高め得るといった利点が得られる。なお、水分散性接着剤や水分散性コーティング剤には、必要に応じて、公知の水分散性接着剤や水分散性コーティング剤に含まれる各種の添加剤等の修飾タンパク質以外の成分が含まれていてもよい。

　修飾タンパク質を含む水分散性接着剤は、複数の被着体が互いに接着された接着体を製造するのに用いられる。例えば、接着されるべき複数の被着体の間に水分散性接着剤を介在させた後、水分散性接着剤中の水性媒体を除去して、修飾タンパク質を固化させることにより、被着体同士を接着して接着体を得ることができる。このような方法によれば、生分解性を有する接着剤を用いて接着体が得られるため、廃棄時の環境負荷を低減可能な接着体が容易に製造できるといったメリットがある。なお、被着体は、修飾タンパク質を含む水分散性接着剤にて接着可能なものであれば、その材質は特に限定されるものではなく、修飾タンパク質を含む溶液性接着剤にて接着される被着体と同様なものであってもよい。

　水分散性接着剤を用いて接着体を製造する際の具体的な方法も何等限定されるものではない。例えば、接着されるべき複数の被着体の間に水分散性接着剤を介在させる際は、前記した溶液状接着剤を複数の被着体の間に水分散性接着剤を介在させる際と同様な方法が採用され得る。また、被着体間に介在する水分散性接着剤中の水性媒体を除去して、修飾タンパク質を固化させる際も、被着体間に介在する溶液状接着剤中の溶媒を除去して、修飾タンパク質を固化させる際と同様な方法が採用され得る。

　修飾タンパク質を含む水分散性コーティング剤は、基材の表面の全体又は一部にコーティング層が積層形成された積層体を製造するのに用いられる。例えば、コーティング層が積層されるべき基材の表面の少なくとも一部に水分散性コーティング剤を供給して、かかる基材の表面部分を溶液状コーティング剤でコーティングした後、水分散性接着剤中の水性媒体を除去して、修飾タンパク質を固化させる。これにより、基材の表面の少なくとも一部にコーティング層を積層形成して積層体を得ることができる。このような方法によっても、生分解性を有するコーティング剤を用いて積層体が得られるため、廃棄時の環境負荷を低減可能な積層体が容易に製造できるといったメリットがある。なお、基材は、修飾タンパク質を含む水分散性コーティング剤が接着可能なものであれば、その材質は特に限定されるものではなく、前記した溶液状コーティング剤にてコーティング層が形成される基材と同様なものであってもよい。

　水分散性コーティング剤を用いて積層体を製造する際の具体的な方法も何等限定されるものではない。例えば、基材表面の少なくとも一部に水分散性コーティング剤を供給する際には、前記した溶液状コーティング剤を基材表面に供給する際と同様な方法が採用され得る。また、基材表面に供給された水分散性コーティング剤中の水性媒体を除去して修飾タンパク質を固化させる際には、基材表面に供給された溶液状コーティング剤中の溶媒を除去して修飾タンパク質を固化させる際と同様な方法が採用され得る。

　修飾タンパク質を含むフィルム状接着剤やフィルム状コーティング剤は、本実施形態手法によって得られる修飾タンパク質が溶解した修飾タンパク質溶液からフィルムを成形する工程を含んだ方法によって製造できる。このような方法によれば、従来の石油由来の成分を含むフィルム状接着剤やフィルム状コーティング剤とは異なって、生分解性を有するフィルム状接着剤やフィルム状コーティング剤が容易に得られることとなる。

　フィルム状接着剤やフィルム状コーティング剤の製造に用いられる溶液としては、例えば、溶液状接着剤や溶液状コーティング剤として使用される修飾タンパク質溶液が好適に使用される。その中でも、マレイン酸エステル化タンパク質や、コハク酸エステル化タンパク質、スルホン酸エステル化タンパク質、リン酸エステル化タンパク質等の修飾タンパク質が塩基性水溶液に溶解したものが好適に用いられる。そのような修飾タンパク質溶液をキャスト成形してなるフィルム状接着剤やフィルム状コーティング剤は、水との親和性が高い。そのため、後述するように接着体や積層体を得るに際して、フィルム状接着剤やフィルム状コーティング剤を被着体の間や基材表面上に存在させて膨潤させるときに、フィルム状接着剤やフィルム状コーティング剤がより多くの水分を吸収して、十分に軟化する。これによって、フィルム状接着剤やフィルムコーティング剤の被着体や基材に対する接着強度の向上が望まれ得る。なお、修飾タンパク質溶液からフィルムを成形する方法としては、例えば、タンパク質溶液をキャスト成形する方法が採用される。このキャスト成形の実施には、一般的な公知の手順や公知の条件が採用され得る。

　修飾タンパク質を含むフィルム状接着剤は、複数の被着体が互いに接着された接着体を製造するのに用いられる。例えば、接着されるべき複数の被着体の間にフィルム状接着剤を介在させた状態で、フィルム状接着剤を膨潤させたり、加熱したりして、軟化させ、その後、フィルム状接着剤を被着体に圧接させた状態で硬化させることにより、被着体同士を接着して接着体を得ることができる。また、フィルム状接着剤を、予め膨潤乃至加熱して軟化させてから、複数の被着体の間に介在させ、その後、フィルム状接着剤を被着体に圧接させた状態で硬化させるようにしてもよい。これらの方法によれば、生分解性を有する接着剤を用いて接着体が得られるため、廃棄時の環境負荷を低減可能な接着体が容易に製造できるといったメリットがある。なお、被着体は、修飾タンパク質を含むフィルム状接着剤にて接着可能なものであればよく、修飾タンパク質を含む溶液性接着剤にて接着される被着体と同様なものであってもよい。

　フィルム状接着剤は、水分を吸収したり、加熱されたりすると軟化し、その後の乾燥や冷却によって硬化する。また、フィルム状接着剤に含まれる修飾タンパク質（アシル化前のタンパク質であってもよい）が、フィルムを成形したときに水との接触や加熱によって収縮挙動を示す特性を有するものである場合には、フィルム状接着剤も水との接触や加熱によって収縮する。このため、修飾タンパク質を含むフィルム状接着剤は、被着体間で膨潤乃至加熱されると、軟化して被着体の被着面に存在する隙間に部分的に食い込み、特に、修飾タンパク質が上記の収縮特性を有する場合には、被着面の隙間に食い込んだ状態で収縮する。そして、その状態でフィルム状接着剤が硬化すると、アンカー効果により、フィルム状接着剤と被着体とが接着して、被着体同士が接着されると考えられる。また、フィルム状接着剤に含まれる修飾タンパク質と被着体との間で水素結合が生じることにより、フィルム状接着剤と被着体とが接着されることも考えられる。

　従って、フィルム状接着剤を膨潤させて軟化させる際には、フィルム状接着剤に吸収され、また、フィルム状接着剤を収縮させ得る水や、水を含む溶液や分散液等の水性液体が好適に用いられる。そして、例えば、上記の水性液体を滴下したり、水性液体中に浸漬したりして、フィルム状接着剤に水を吸収させることで、フィルム状接着剤を膨潤、軟化させるようにしてもよい。また、膨潤により軟化したフィルム状接着剤を硬化させる際には、例えば、フィルム状接着剤を被着体間に介在させた状態で、加熱乾燥したり、風乾したり、自然乾燥させたりする方法が採用され得る。

　フィルム状接着剤を加熱して軟化させる際には、フィルム状接着剤を被着体間に介在させる前に、加熱してもよいし、フィルム状接着剤を被着体間に介在させた後に被着体とフィルム状接着剤の全体を加熱するようにしてもよい。加熱温度は、フィルム状接着剤を軟化させ得る温度で、且つフィルム状接着剤に含まれる修飾タンパク質に悪影響を与えない（例えば分解させない）温度であれば特に限定されない。加熱により軟化したフィルム状接着剤を硬化する際には、冷却装置で冷却したり、放冷したりする方法が採用され得る。

　膨潤乃至加熱により軟化したフィルム状接着剤を被着体の被着面の隙間に十分に食い込ませるには、軟化したフィルム状接着剤と被着体との界面を密接させることが望ましい。そこで、例えば、複数の被着体に対して、被着面の重合せ方向乃至突合せ方向の少なくとも何れか一方側から圧力を加えて、軟化したフィルム状接着剤を被着体に圧接しつつ、硬化させることが好ましい。ここでの被着体に対する加圧方法は、一般的な方法が何れも採用可能である。

　修飾タンパク質を含むフィルム状コーティング剤は、基材の表面の全体又は一部にコーティング層が積層形成された積層体を製造するのに用いられる。例えば、フィルム状コーティング剤を基材の表面の少なくとも一部を覆うように載置した状態で、フィルム状コーティング剤を膨潤させたり、加熱したりして、軟化させ、その後、フィルム状コーティング剤を基材表面に圧接させた状態で硬化させることにより、基材表面の少なくとも一部にコーティング層を積層形成して積層体を得ることができる。また、フィルム状コーティング剤を、予め膨潤乃至加熱して軟化させてから、基材の表面の少なくとも一部を覆うように載置し、その後、フィルム状コーティング剤を被着体に圧接させた状態で硬化させるようにしてもよい。これらの方法によれば、生分解性を有するコーティング剤を用いて積層が得られるため、廃棄時の環境負荷を低減可能な積層体が容易に製造できるといったメリットがある。なお、基材は、修飾タンパク質を含むフィルム状コーティング剤が接着可能なものであればよく、修飾タンパク質を含むフィルム状接着剤にて接着される被着体と同様なものであってもよい。

　フィルム状コーティング剤が基材表面に接着するメカニズムは、フィルム状接着剤が被着体の被着面に接着するメカニズムと同様と考えられる。従って、フィルム状コーティング剤を用いて積層体を製造する際の具体的な方法も、フィルム状接着剤を用いて接着体を得る際と同様な方法が採用され得る。なお、軟化したフィルム状コーティング剤を基材表面に圧接して硬化させる際には、例えば、基材上にコーティングされた溶液状コーティング剤を基材表面の側に押圧する際に用いられる押圧体と同様な押圧体を用いて、フィルム状コーティング剤を基材表面側に押圧してもよい。

　修飾タンパク質を含む粉末状接着剤や粉末状コーティング剤には、本実施形態手法によって得られる修飾タンパク質の粉末を含む粉末組成物が用いられる。この粉末組成物は、修飾タンパク質が主成分として含まれておれば、各種の添加残等の副成分が含まれていてもよい。

　粉末状接着剤や粉末状コーティング剤に含まれる修飾タンパク質は、本実施形態に係る製法によって得られるものであれば特に限定されるものではない。かかる修飾タンパク質としては、例えば、マレイン酸エステル化タンパク質や、コハク酸エステル化タンパク質、スルホン酸エステル化タンパク質、リン酸エステル化タンパク質等が挙げられる。前述のように、これらの修飾タンパク質は、他の修飾タンパク質に比して吸水性が高い。それ故、そのような修飾タンパク質を含む粉末状接着剤や粉末状コーティング剤は比較的に高い含水率を有する。そのため、被着体の被着面や基材表面に載置された状態で樹脂化（固化）させるのに必要な加熱温度や加圧量を可及的に低くすることができる。その結果、上記の修飾タンパク質を含む粉末状接着剤や粉末コーティング剤を用いれば、被着体や基材に対する接着操作が有利に簡便化され得るといったメリットが期待される。なお、粉末状性接着剤や粉末状コーティング剤には、必要に応じて、公知の粉末状接着剤や粉末状コーティング剤に含まれる各種の添加剤等の修飾タンパク質以外の成分が含まれていてもよい。

　修飾タンパク質を含む粉末状接着剤も、複数の被着体が互いに接着された接着体を製造するのに用いられる。例えば、接着されるべき複数の被着体の間に粉末状接着剤を介在させた状態で、粉末状接着剤を加熱すると共に、被着体を介して加圧して、固化させることにより、被着体同士を接着して接着体を得ることができる。このような方法によれば、生分解性を有する接着剤を用いて接着体が得られるため、廃棄時の環境負荷を低減可能な接着体が容易に製造できるといったメリットがある。なお、被着体は、修飾タンパク質を含む粉末状接着剤にて接着可能なものであればよく、例えば、修飾タンパク質を含む溶液性接着剤にて接着される被着体と同様なものであってもよい。

　粉末状接着剤を用いて接着体を製造する際の具体的な方法も何等限定されるものではない。例えば、接着されるべき複数の被着体の間に介在した粉末状接着剤を加熱・加圧する際には、被着体を金属板等にて被着面側とは反対の両側から挟み、金属板を加熱することで、被着体間に介在した粉末状接着剤を被着体と共に加熱する。それと同時に、ハンドプレス機等で金属板を加圧し、被着体を介して、粉末状接着剤を所定時間加圧する。これにより、粉末状接着剤を樹脂化させ固化して被着体を接着する。なお、粉末状接着剤を固化させる際の加熱温度や加圧量、加熱・加圧時間は、粉末状接着剤中に含まれる修飾タンパク質の種類に応じて、修飾タンパク質を樹脂化させ得る範囲の中から適宜に選択される。

　修飾タンパク質を含む粉末状コーティング剤も、基材の表面の全体又は一部にコーティング層が積層形成された積層体を製造するのに用いられる。例えば、粉末状コーティング剤を基材の表面の少なくとも一部に載置した状態で、粉末状コーティング剤を加熱すると共に、加圧体と基材との間で加圧して、固化させることにより、前記基材の表面の少なくとも一部にコーティング層を積層形成する。

　粉末状コーティング剤を用いて積層体を製造する際の具体的な方法も何等限定されるものではない。例えば、基材表面に載置した粉末状接着剤の全体を覆うように金属板等を配置し、金属板を加熱することで、粉末状接着剤を加熱する。それと同時に、ハンドプレス機等で金属板と基材との間で粉末状接着剤を所定時間加圧することで、粉末状コーティング剤を樹脂化させて固化させる。なお、粉末状コーティング剤の加熱温度や加圧量、或いは加熱・加圧時間は、粉末状接着剤を用いて接着体を得る際と同様とされる。

　本発明について、以下により詳細に説明する。

　実施例において使用する略語は、特記しない限り、有機化学又は遺伝子工学の分野で一般的に使用される意味で使用される。以下にいくつかの例を示す。
Ａｃ_２Ｏ：無水酢酸
ＤＢＵ：１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク－７－エン
ＤＩＰＥＡ：Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＡＰ：４－ジメチルアミノピリジン
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＦＴ－ＩＲスペクトル：フーリエ変換赤外分光分析スペクトル
ＧＰＣ：ゲルろ過クロマトグラフィー
ＨＦＩＰ：ヘキサフルオロイソプロパノール
ＲＯ水：逆浸透膜（ＲＯ膜）を用いて処理した水
ＴＣＥＰ：トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン

　組換えタンパク質の化学修飾におけるボールミルの可能性を評価するために、組換えタンパク質のアシル化をメカノケミカル法と従来の溶液法の両方で実施し、生成物を様々な分析手法で評価した。

１．溶液法によるアセチル化
（比較例１）１００ｋＤａ組換えタンパク質のアセチル化（塩基非存在下）
　組換えタンパク質ＰＲＴ９６６（５００ｍｇ、４．８０μｍｏｌ）をマグネチックスターラー・ホットプレートを用いて撹拌しながらＤＭＳＯ（１０ｍＬ）に懸濁させた後、混合物の連続加熱撹拌（８０℃、１時間）により溶解し、透明な茶色溶液を得た。次いで、Ａｃ_２Ｏ（３１１μＬ、３．３０ｍｍｏｌ、１水酸基あたり３．５当量）を反応溶液に添加し、その後撹拌させた（８０℃、６時間）。その後、反応混合物を室温まで冷却し、氷冷（０℃）したＲＯ水（５００ｍＬ）に穏やかに攪拌しながら徐々に分液して生成物を沈殿させた（１時間）。その後、減圧下濾過し、ＲＯ水、アセトンで十分に洗浄した。その後、真空オーブンで減圧下に完全に乾燥させて（８０℃、１時間）、粘着性のある茶色固体を得、そのまま分析に供した。

（比較例２）１００ｋＤａ組換えタンパク質のアセチル化（塩基存在下）
　組換えタンパク質ＰＲＴ９６６（５００ｍｇ、４．８０μｍｏｌ）をマグネチックスターラー・ホットプレートを用いて撹拌しながらＤＭＳＯ（１０ｍＬ）に懸濁させた後、混合物の連続加熱撹拌（８０℃、１時間）により溶解し、透明な茶色溶液を得た。次に、Ａｃ_２Ｏ（３１１μＬ、３．３０ｍｍｏｌ、１水酸基あたり３．５当量）及びＤＩＰＥＡ（５７４μＬ、３．３０ｍｍｏｌ、１水酸基あたり３．５当量）を反応溶液に加え、撹拌した（８０℃、６時間）。その後、反応混合物を室温まで冷却し、氷冷（０℃）したＲＯ水（５００ｍＬ）に穏やかに攪拌しながら徐々に添加して生成物を沈殿させた（１時間）。その後、生成物を減圧下濾過し、ＲＯ水、アセトンで十分に洗浄した。その後、真空オーブンで減圧下に完全に乾燥させて（８０℃、１時間）、薄茶色固体を得、そのまま分析に供した。

２．メカノケミカル法によるアセチル化
（実施例１）１００ｋＤａ組換えタンパク質のアセチル化（塩基非存在下）
　組換えタンパク質ＰＲＴ９６６（５００ｍｇ、４．８０μｍｏｌ）、Ａｃ_２Ｏ（３１１μＬ、３．３０ｍｍｏｌ、１水酸基あたり３．５当量）を１０ｍＬのステンレス製カップ（レッチェ社製）に加え、２０個のステンレス製ボール（直径５ｍｍ、レッチェ社製）を入れ、ミキサーミル型ボールミル（ミキサーミルＭＭ４００、レッチェ社製）でミリング（振動数：３０Ｈｚ、９０分間）して弱黄白色非晶質固形分を得た。この反応混合物を粉砕ジャーから取り出し、攪拌しながらＲＯ水（２５ｍＬ）に懸濁した（１０分）。その後、生成物を減圧下濾過し、ＲＯ水、アセトンで十分に洗浄した。その後、真空オーブンで減圧下に完全に乾燥させて（８０℃、１時間）、白色非晶質粉末を得、これをそのまま分析に供した。

（実施例２）１００ｋＤａ組換えタンパク質のアセチル化（塩基存在下）
　１００ｋＤａの組換えタンパク質ＰＲＴ９６６（５００ｍｇ、４．８０μｍｏｌ）、Ａｃ_２Ｏ（３１１μＬ、３．３０ｍｍｏｌ、１水酸基あたり３．５当量）、ＤＩＰＥＡ（５７４μＬ、３．３０ｍｍｏｌ、１水酸基あたり３．５当量）を１０ｍＬステンレス製カップ（レッチェ社製）に入れ、２０個のステンレス製ボール（直径５ｍｍ、レッチェ社製）を加え、ミキサーミル型ボールミル（商品名：ミキサーミルＭＭ４００、レッチェ社製）を用いてミリング（振動数：３０Ｈｚ、９０分間）してワックス状の茶色固体を得た。この反応混合物を粉砕ジャーから取り出し、攪拌しながらＲＯ水（２５ｍＬ）に懸濁した（１０分間）。その後、生成物を減圧下濾過し、ＲＯ水、アセトンで十分に洗浄した。その後、真空オーブンで減圧下、完全に乾燥させて（８０℃、１時間）、弱黄白色アモルファス粉末を得、これをそのまま分析に供した。

３．液相法とメカノケミカル法のアセチル化生成物の比較
（１）ＩＲ吸収スペクトル分析
　フーリエ変換赤外吸収（ＦＴ－ＩＲ）スペクトルは、Nicolet iS50 FT-IR spectrometer（商品名、Thermo Fisher Scientific社製）を用いて実施した。ニート状態の試料を、ダイヤモンド結晶の減衰全反射（ＡＴＲ）を用いて分析し、吸収周波数は波数（ｃｍ^－１）で０．１ｃｍ^－１単位まで記録した。スペクトルは、７６０－３８００ｃｍ^－１の範囲で４ｃｍ^－１の分解能で収集され、６４回スキャンした値の平均値を算出した。

（２）ＧＰＣ分析
　ＧＰＣは、屈折率（ＲＩ）検出器を備えた液体クロマトグラフィーシステム（商品名：Agilent 1260 Infinity II、Agilent Technologies Inc.社製）及び０．５μｍガードカラムフィルター（商品名：Ｓｈｏｄｅｘ　ＧＰＣ　ＨＫ－Ｇ、昭和電工（株）製）を装着したスチレン－ジビニルベンゼン共重合体カラム（内径４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）固定相とＨＦＩＰ（セントラル硝子株式会社製）を用いて分析物の分離を行った。移動相を流速０．１５ｍＬ／ｍｉｎで、４０℃でAgilent 1260 Infinity II refractive index detector（ＲＩＤ）（Agilent Technologies Inc.社製）を用いてモニターした。タンパク質は、ＨＦＩＰにトリフルオロ酢酸ナトリウムを加えた０．１ｗｔ％溶液（最終濃度１ｍＭ）として分析した。システイン残基を有するタンパク質には、ジスルフィド結合の生成を防ぐために、ＴＣＥＰ（最終濃度１０ｍＭ）を添加した。試料を加熱加振器（商品名：Ｆｒｏｎｔ　Ｌａｂ　ＭｙＢＬ－１００Ｓ、ＡＳ　ＯＮＥ（株）製）を用いて溶解し（４５℃、１５００ｒｐｍ、１時間）、０．４５μｍの親水性ＰＴＦＥメンブランフィルター（商品名：Ｄｉｓｍｉｃ　２５ＨＰ、Ａｄｖａｎ　Ｔｅｃｈ社製）を通過させて残った不溶物を除去した。

　図１（ａ）は、比較例１及び２、実施例１及び２の外観を比較したものであり、図１（ｂ）は、比較例１及び２、実施例１及び２、未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６の各ＧＰＣクロマトグラムを重ね合わせたグラフである。溶液法で調製した比較例１及び２の修飾タンパク質は茶色塊状であり、使用するためには粉砕する必要があった。一方、メカノケミカル法で調製した実施例１及び２は白色粉末として得られ、取り扱い性にも優れていた。

　比較例１及び２、実施例１及び２のＩＲスペクトル及びＧＰＣ分析の結果を、それぞれ図２～５に示す。図２（ａ）は、比較例１及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、１７４０ｃｍ^－１にピークが現れたことから、アセチル化が進行したことがわかった。図２（ｂ）は、比較例１及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムであり、保持時間が未修飾タンパク質のものより短くなった。図３（ａ）は、比較例２及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、１７３０ｃｍ^－１にピークが現れたことから、アセチル化が進行したことがわかった。図３（ｂ）は、比較例２及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムであり、保持時間が未修飾タンパク質のものよりわずかに短くなった。図４（ａ）は、実施例１及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、１７４０ｃｍ^－１にピークが現れたことから、アセチル化が進行したことがわかった。図４（ｂ）は、実施例１及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムであり、保持時間が未修飾タンパク質のものよりわずかに短くなった。図５（ａ）は、実施例２及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、１７４３ｃｍ^－１にピークが現れたことから、アセチル化が進行したことがわかった。図５（ｂ）は、実施例２及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムであり、保持時間が未修飾タンパク質のものよりわずかに短くなった。

（３）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析
　ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）は、プレキャスト分離ゲル（商品名：４－２０％　Mini-PROTEAN TGX、Bio-Rad Laboratories Inc.社製）を用いて行った。ゲルを電極アセンブリ（商品名：Mini-PROTEAN Tetra Electrode Assembly、Bio-RadLaboratoriesInc.社製）に挿入し、ＳＤＳランニングバッファ（Bio-RadLaboratories Inc.社製）とともに電気泳動タンクの内側に設置した。タンパク質をＤＭＳＯに溶解し、塩化リチウム（最終濃度２Ｍ）を加えて加熱シェーカー（商品名：TMS-200 Turbo Thermoshaker Incubator、HangzhouAllshengInstrumentsCo. Ltd.製）を使用して最終濃度１ｗｔ％で溶解した後（８０℃、２０００ｒｐｍ、４５分間）、１０Ｍ尿素水溶液で５０倍に希釈した。その後、３－メルカプト－１、２－プロパンジオールを含む同量のサンプルバッファと混合し、９５℃に加熱（５分間）した（商品名：Genius Dry Bath Incubator MD-01N、MajorScienceCo.Ltd社製）後、ゲル（１０μＬ）上に供し、参考用に分子量ラダー（商品名：ＸＬ－Ｌａｄｄｅｒ　Ｂｒｏｏｄ、ApproscienceCo.社製）を加えた。電気泳動は、定電圧（２００Ｖ、３０分）で行った（商品名：PowerPacUniversal Power Supply、Bio-RadLaboratoriesInc.社製）。タンパク質は、Oriole Fluorescent GelStain（Bio-RadLaboratories Inc.社製）を用いてゲル（商品名：Ｄｕｏｍａｘ　１０３０、HeidolphInstruments社製）を穏やかに撹拌（３０ｒｐｍ、１時間）して染色し、イメージングソフトウェア（GelDoc EZ gel imaging system及びImageLabsoftware（Bio-Rad Laboratories Inc.社製））で視覚化した。

　ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果によれば、溶液としてＤＭＳＯを用いた溶液法では、系中の酸化ストレスによりタンパク質主鎖が分解して生じる低分子量タンパク質のバンドが見られたが、メカノケミカル法では、そのようなバンドは見られなかった。

４．分子量の違い（７．５ｋＤａから３００ｋＤａまで）による影響
（実施例３）７．５ｋＤａ組換えタンパク質のアセチル化
　組換えタンパク質ＰＲＴ２８８２（配列番号８、５００ｍｇ、５０．５μｍｏｌ）、Ａｃ_２Ｏ（３０１μＬ、３．１８ｍｍｏｌ、１水酸基あたり３．５当量）、及びＤＩＰＥＡ（３１７μＬ、１．８２ｍｍｏｌ、１水酸基あたり２当量）を、１０ｍＬステンレス製カップ（レッチェ社製）に２０個のステンレス製ボール（直径５ｍｍ、レッチェ社製）を加え、ミキサーミル型ボールミル（商品名：ミキサーミルＭＭ４００、レッチェ社製）を用いてミリング（振動数：３０Ｈｚ、９０分間）して濃灰色の塊状の固形分を得た。この反応混合物を粉砕ジャーから取り出し、攪拌しながらＲＯ水（２５ｍＬ）中に懸濁した（１０分間）。その後、生成物を減圧下濾過し、ＲＯ水、アセトンで十分に洗浄した。その後、真空オーブンで減圧下、完全に乾燥させて（８０℃、１時間）て濃灰色非晶質粉末を得、これをさらに処理することなく分析に供した。

（実施例４）１５ｋＤａ組換えタンパク質のアセチル化
　組換えタンパク質ＰＲＴ２８４１（配列番号９、５００ｍｇ、２８．１μｍｏｌ）、Ａｃ_２Ｏ（３１６μＬ、３．３４ｍｍｏｌ、１水酸基あたり３．５当量）、ＤＩＰＥＡ（３３３μＬ、１．９１ｍｍｏｌ、１水酸基あたり２当量）を、１０ｍＬステンレス製カップ（レッチェ社製）に２０個のステンレス製ボール（直径５ｍｍ、レッチェ社製）を加え、ミキサーミル型ボールミル（商品名：ミキサーミルＭＭ４００、レッチェ社製）を用いてミリング（振動数：３０Ｈｚ、９０分間）して薄灰色塊状固体を得た。この反応混合物を粉砕ジャーから取り出し、攪拌しながらＲＯ水（２５ｍＬ）に懸濁した（１０分）。その後、生成物を減圧下濾過し、ＲＯ水、アセトンで十分に洗浄した。その後、真空オーブンで減圧下、完全に乾燥させて（８０℃、１時間）、淡灰色非晶質粉末を得、これをさらに処理することなく分析に供した。

（実施例５）２５ｋＤａ組換えタンパク質のアセチル化
　組換えタンパク質ＰＲＴ２６６２（配列番号１０、５００ｍｇ、１８．２μｍｏｌ）、Ａｃ_２Ｏ（３３１μＬ、３．５０ｍｍｏｌ、１水酸基あたり３．５当量）およびＤＩＰＥＡ（３４９μＬ、２．００ｍｍｏｌ、１水酸基あたり２当量）を、１０ｍＬステンレス製カップ（レッチェ社製）に２０個のステンレス製ボール（直径５ｍｍ、レッチェ社製）を加え、ミキサーミル型ボールミル（商品名：ミキサーミルＭＭ４００、レッチェ社製）を用いてミリング（振動数：３０Ｈｚ、９０分間）して淡灰色ワックス状の固体を得た。この反応混合物を粉砕ジャーから取り出し、攪拌しながらＲＯ水（２５ｍＬ）中に懸濁した（１０分間）。その後、生成物を減圧下濾過し、ＲＯ水、アセトンで十分に洗浄した。その後、真空オーブンで減圧下、完全に乾燥させて（８０℃、１時間）、淡灰色非晶質粉末を得、これをさらに処理することなく分析に供した。

（実施例６）５０ｋＤａ組換えタンパク質のアセチル化
　組換えタンパク質ＰＲＴ１０００（５００ｍｇ、９．４４μｍｏｌ）、Ａｃ_２Ｏ（３１９μＬ、３．３７ｍｍｏｌ、１水酸基あたり３．５ｅｑ．）及びＤＩＰＥＡ（３３６μＬ、１．９３ｍｍｏｌ、１水酸基あたり２ｅｑ）を、１０ｍＬステンレス製カップ（レッチェ社製）に加え、２０個のステンレス製ボール（直径５ｍｍ、レッチェ社製）を用いてミキサーミル型ボールミル（商品名：ミキサーミルＭＭ４００、レッチェ社製）でミリング（振動数：３０Ｈｚ、９０分間）して白色非晶質固形物を得た。この反応混合物を粉砕ジャーから取り出し、攪拌しながらＲＯ水（２５ｍＬ）に懸濁した（１０分）。その後、生成物を減圧下濾過し、ＲＯ水、アセトンで十分に洗浄した。その後、真空オーブンで減圧下、完全に乾燥させて（８０℃、１時間）、白色非晶質粉末を得、これをそのまま分析に供した。

（実施例７）５０ｋＤａ組換えタンパク質のアセチル化
　組換えタンパク質ＰＲＴ９１８（５００ｍｇ、９．４８μｍｏｌ）、Ａｃ_２Ｏ（３１４μＬ、３．３２ｍｍｏｌ、１水酸基あたり３．５当量）及びＤＩＰＥＡ（３３０μＬ、１．９０ｍｍｏｌ、１水酸基あたり２当量）を１０ｍＬステンレス製カップ（レッチェ社製）に加え、２０個のステンレス製ボール（直径５ｍｍ、レッチェ社製）を入れて、ミキサーミル型ボールミル（商品名：ミキサーミルＭＭ４００、レッチェ社製）でミリング（振動数：３０Ｈｚ、９０分間）し、白色非晶質固形分を得た。この反応混合物を粉砕ジャーから取り出し、攪拌しながらＲＯ水（２５ｍＬ）に懸濁した（１０分）。その後、生成物を減圧下濾過し、ＲＯ水、アセトンで十分に洗浄した。その後、真空オーブンで減圧下、完全に乾燥させて（８０℃、１時間）て白色非晶質粉末を得、これをそのまま分析に供した。

（実施例８）１００ｋＤａ組換えタンパク質のアセチル化
　組換えタンパク質ＰＲＴ９６６（５００ｍｇ、４．８０μｍｏｌ）、Ａｃ_２Ｏ（３１１μＬ、３．３０ｍｍｏｌ、１水酸基あたり３．５当量）、及びＤＩＰＥＡ（３２８μＬ、１．８８ｍｍｏｌ、１水酸基あたり２当量）を、１０ｍＬステンレス製カップ（レッチェ社製）に２０個のステンレス製ボール（直径５ｍｍ、レッチェ社製）を加え、ミキサーミル型ボールミル（商品名：ミキサーミルＭＭ４００、レッチェ社製）を用いてミリング（振動数：３０Ｈｚ、９０分間）し、薄茶色ペーストを得た。この反応混合物を粉砕ジャーから取り出し、ＲＯ水（２５ｍＬ）に撹拌しながら懸濁した（１０分間）。その後、生成物を減圧下濾過し、ＲＯ水、アセトンで十分に洗浄した。その後、真空オーブンで減圧下、完全に乾燥させて（８０℃、１時間）、淡いベージュ色非晶質粉末を得、これをそのまま分析に供した。

（実施例９）２００ｋＤａ組換えタンパク質のアセチル化
　組換えタンパク質ＰＲＴ７９９（５００ｍｇ、２．３７μｍｏｌ）、Ａｃ_２Ｏ（３０５μＬ、３．２３ｍｍｏｌ、１水酸基あたり３．５当量）、及びＤＩＰＥＡ（３２１μＬ、１．８４ｍｍｏｌ、１水酸基あたり２当量）を１０ｍＬステンレス製カップ（レッチェ社製）に加え、２０個のステンレス製ボール（直径５ｍｍ、レッチェ社製）を入れ、ミキサーミル型ボールミル（商品名：ミキサーミルＭＭ４００、レッチェ社製）でミリング（振動数：３０Ｈｚ、９０分間）して淡灰色グミ状の固形物を得た。この反応混合物を粉砕ジャーから取り出し、攪拌しながらＲＯ水（２５ｍＬ）に懸濁した（１０分）。その後、生成物を減圧下濾過し、ＲＯ水、アセトンで十分に洗浄した。その後、真空オーブンで減圧下、完全に乾燥させて（８０℃、１時間）、淡灰色非晶質粉末を得、これをさらに処理することなく分析に供した。

（実施例１０）３００ｋＤａ組換えタンパク質のアセチル化
　組換えタンパク質ＰＲＴ１１８６（配列番号１１、５００ｍｇ、１．５９μｍｏｌ）、Ａｃ_２Ｏ（３０７μＬ、３．２５ｍｍｏｌ、１水酸基あたり３．５当量）、ＤＩＰＥＡ（３２４μＬ、１．８６ｍｍｏｌ、１水酸基あたり２当量）を１０ｍＬステンレス製カップ（レッチェ社製）に加え、２０個のステンレス製ボール（直径５ｍｍ、レッチェ社製）を入れ、ミキサーミル型ボールミル（商品名：ミキサーミルＭＭ４００、レッチェ社製）でミリング（振動数：３０Ｈｚ、９０分間）して薄灰色グミ状の固形物を得た。この反応混合物を粉砕ジャーから取り出し、攪拌しながらＲＯ水（２５ｍＬ）に懸濁した（１０分）。その後、生成物を減圧下濾過し、ＲＯ水、アセトンで十分に洗浄した。その後、真空オーブンで減圧下、完全に乾燥させて（８０℃、１時間）、白色非晶質固体を得、そのまま分析に供した。

　実施例３～１０のＩＲスペクトル及びＧＰＣ分析の結果を、それぞれ図６～１３に示す。図６（ａ）は、実施例３及び未修飾タンパク質ＰＲＴ２８８２のＩＲスペクトルであり、１７４１ｃｍ^－１にピークが現れたことから、アセチル化が進行したことがわかった。図６（ｂ）は、実施例３及び未修飾タンパク質ＰＲＴ２８８２のＧＰＣクロマトグラムであり、保持時間が未修飾タンパク質のものよりわずかに短くなった。図７（ａ）は、実施例４及び未修飾タンパク質ＰＲＴ２８４１のＩＲスペクトルであり、１７４２ｃｍ^－１にピークが現れたことから、アセチル化が進行したことがわかった。図７（ｂ）は、実施例４及び未修飾タンパク質ＰＲＴ２８４１のＧＰＣクロマトグラムであり、保持時間が未修飾タンパク質のものよりわずかに短くなった。図８（ａ）は、実施例５及び未修飾タンパク質ＰＲＴ２６６２のＩＲスペクトルであり、１７４３ｃｍ^－１にピークが現れたことから、アセチル化が進行したことがわかった。図８（ｂ）は、実施例５及び未修飾タンパク質ＰＲＴ２６６２のＧＰＣクロマトグラムであり、保持時間が未修飾タンパク質のものよりわずかに短くなった。図９（ａ）は、実施例６及び未修飾タンパク質ＰＲＴ１０００のＩＲスペクトルであり、１７４４ｃｍ^－１にピークが現れたことから、アセチル化が進行したことがわかった。図９（ｂ）は、実施例６及び未修飾タンパク質ＰＲＴ１０００のＧＰＣクロマトグラムであり、保持時間が未修飾タンパク質のものよりわずかに短くなった。

　図１０（ａ）は、実施例７及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９１８のＩＲスペクトルであり、１７４４ｃｍ^－１にピークが現れたことから、アセチル化が進行したことがわかった。図１０（ｂ）は、実施例７及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９１８のＧＰＣクロマトグラムであり、保持時間が未修飾タンパク質のものよりわずかに短くなった。図１１（ａ）は、実施例８及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、１７４４ｃｍ^－１にピークが現れたことから、アセチル化が進行したことがわかった。図１１（ｂ）は、実施例８及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムであり、保持時間が未修飾タンパク質のものよりわずかに短くなった。図１２（ａ）は、実施例９及び未修飾タンパク質ＰＲＴ７９９のＩＲスペクトルであり、１７３０ｃｍ^－１にピークが現れたことから、アセチル化が進行したことがわかった。図１２（ｂ）は、実施例９及び未修飾タンパク質ＰＲＴ７９９のＧＰＣクロマトグラムであり、保持時間が未修飾タンパク質のものよりわずかに短くなった。図１３（ａ）は、実施例１０及び未修飾タンパク質ＰＲＴ１１８６のＩＲスペクトルであり、１７３１ｃｍ^－１にピークが現れたことから、アセチル化が進行したことがわかった。図１３（ｂ）は、実施例１０及び未修飾タンパク質ＰＲＴ１１８６のＧＰＣクロマトグラムであり、保持時間が未修飾タンパク質のものよりわずかに短くなった。

５．塩基の種類による影響
（実施例１１）１００ｋＤａ組換えタンパク質のアセチル化
　組換えタンパク質ＰＲＴ９６６（５００ｍｇ、４．８０μｍｏｌ）、Ａｃ_２Ｏ（３１１μＬ、３．３０ｍｍｏｌ、１水酸基あたり３．５当量）、水酸化ナトリウム（４１．５ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ、１水酸基あたり１．１当量）を１０ｍＬステンレス製カップ（レッチェ社製）に加え、２０個のステンレス製ボール（直径５ｍｍ、レッチェ社製）を入れ、ミキサーミル型ボールミル（商品名：ミキサーミルＭＭ４００、レッチェ社製）を用いてミリング（振動数：３０Ｈｚ、９０分間）し、白色非晶質固形分を得た。この反応混合物を粉砕ジャーから取り出し、攪拌しながらＲＯ水（２５ｍＬ）に懸濁した（１０分）。その後、生成物を減圧下濾過し、ＲＯ水、アセトンで十分に洗浄した。その後、真空オーブンで減圧下、完全に乾燥させて（８０℃、１時間）、白色非晶質の微粉末を得、これをそのまま分析に供した。

（実施例１２）１００ｋＤａ組換えタンパク質のアセチル化
　組換えタンパク質ＰＲＴ９６６（５００ｍｇ、４．８０μｍｏｌ）、Ａｃ_２Ｏ（３１１μＬ、３．３０ｍｍｏｌ、１水酸基あたり３．５当量）、及び炭酸ナトリウム（１１０ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ、１水酸基あたり１．１当量）を１０ｍＬステンレス製カップ（レッチェ社製）に加え、２０個のステンレス製ボール（直径５ｍｍ、レッチェ社製）を入れ、ミキサーミル型ボールミル（商品名：ミキサーミルＭＭ４００、レッチェ社製）を用いてミリング（振動数：３０Ｈｚ、９０分間）し、白色非晶質固体を得た。この反応混合物を粉砕ジャーから取り出し、攪拌しながらＲＯ水（２５ｍＬ）に懸濁した（１０分）。その後、生成物を減圧下濾過し、ＲＯ水、アセトンで十分に洗浄した。その後、真空オーブンで減圧下、完全に乾燥させて（８０℃、１時間）、白色非晶質の微粉末を得、これをそのまま分析に供した。

（実施例１３）１００ｋＤａ組換えタンパク質のアセチル化
　組換えタンパク質ＰＲＴ９６６（５００ｍｇ、４．８０μｍｏｌ）、Ａｃ_２Ｏ（４４５μＬ、４．７１ｍｍｏｌ、１水酸基あたり５当量）、ＤＩＰＥＡ（８２０μＬ、４．７１ｍｍｏｌ、１水酸基あたり５当量）、及びＤＭＡＰ（５７５ｍｇ、４．７１ｍｍｏｌ、水酸基残基当たり５当量）を、１０ｍＬのステンレス製カップ（レッチェ社製）に加え、２０個のステンレス製ボール（直径５ｍｍ、レッチェ社製）を入れ、ミキサーミル型ボールミル（商品名：ミキサーミルＭＭ４００、レッチェ社製）でミリング（振動数：３０Ｈｚ、８．６時間）して黒褐色ワックス状の固体を得た。この反応混合物を粉砕ジャーから取り出し、攪拌しながらＲＯ水に懸濁した（１０分間）。その後、生成物を減圧下濾過し、ＲＯ水、アセトンで十分に洗浄した。その後、真空オーブンで減圧下、完全に乾燥させて（８０℃、１時間）、褐色非晶質粉末を得、これをそのまま分析に供した。

　実施例１１～１３のＩＲスペクトル及びＧＰＣ分析の結果を、それぞれ図１４～１６に示す。図１４（ａ）は、実施例１１及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、１７４３ｃｍ^－１にピークが現れたことから、アセチル化が進行したことがわかった。図１４（ｂ）は、実施例１１及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムであり、保持時間が未修飾タンパク質のものよりわずかに短くなった。図１５（ａ）は、実施例１２及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、１７４５ｃｍ^－１にピークが現れたことから、アセチル化が進行したことがわかった。図１５（ｂ）は、実施例１２及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムであり、保持時間が未修飾タンパク質のものよりわずかに短くなった。図１６（ａ）は、実施例１３及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、１７３７ｃｍ^－１にピークが現れたことから、アセチル化が進行したことがわかった。図１６（ｂ）は、実施例１３及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムであり、保持時間が未修飾タンパク質のものよりわずかに短くなった。

６．メカノケミカル法でのサクシニル化
（実施例１４）１００ｋＤａ組換えタンパク質のサクシニル化
　組換えタンパク質ＰＲＴ９６６（５００ｍｇ、４．８０μｍｏｌ）、無水コハク酸（３３０ｍｇ、３．３０ｍｍｏｌ、１水酸基あたり３．５当量）、ＤＩＰＥＡ（１８１μＬ、１．０４ｍｍｏｌ、１水酸基あたり１．１当量）、及びＤＭＡＰ（１２７ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ、１水酸基あたり１．１当量）を１０ｍＬのステンレス製カップ（レッチェ社製）に加え、２０個のステンレス製ボール（直径５ｍｍ、レッチェ社製）を入れ、ミキサーミル型ボールミル（商品名：ミキサーミルＭＭ４００、レッチェ社製）でミリング（振動数：３０Ｈｚ、９０分間）して弱黄白色非晶質固形物を得た。この反応混合物を粉砕ジャーから取り出し、攪拌しながらＲＯ水（２５ｍＬ）に懸濁した（１０分）。その後、生成物を減圧下濾過し、ＲＯ水、アセトンで十分に洗浄した。その後、真空オーブンで減圧下、完全に乾燥させて（８０℃、１時間）、白色非晶質固体を得、そのまま分析に供した。

（実施例１５）１００ｋＤａ組換えタンパク質のサクシニル化
　組換えタンパク質ＰＲＴ９６６（５００ｍｇ、４．８０μｍｏｌ）、無水コハク酸（３３０ｍｇ、３．３０ｍｍｏｌ、１水酸基あたり３．５当量）、ＤＩＰＥＡ（１８１μＬ、１．０４ｍｍｏｌ、１水酸基あたり１．１当量）、及びＤＢＵ（１５５μＬ、１．０４ｍｍｏｌ、１水酸基あたり１．１当量）を１０ｍＬステンレス製カップ（レッチェ社製）に加え、２０個のステンレス製ボール（直径５ｍｍ、レッチェ社製）を入れ、ミキサーミル型ボールミル（商品名：ミキサーミルＭＭ４００、レッチェ社製）でミリング（振動数：３０Ｈｚ、９０分間）して粘着性のある黒褐色のペーストを得た。この反応混合物を粉砕ジャーから取り出し、攪拌しながらＲＯ水（２５ｍＬ）に懸濁した（１０分間）。その後、生成物を減圧下濾過し、ＲＯ水、アセトンで十分に洗浄した。その後、真空オーブンで減圧下、完全に乾燥させて（８０℃、１時間）、灰褐色非晶質固体を得、そのまま分析に供した。

（実施例１６）１００ｋＤａ組換えタンパク質のサクシニル化
　組換えタンパク質ＰＲＴ９６６（５００ｍｇ、４．８０μｍｏｌ）、無水コハク酸（３３０ｍｇ、３．３０ｍｍｏｌ、１水酸基あたり３．５当量）、及び炭酸カリウム（４５５ｍｇ、３．３０ｍｍｏｌ、１水酸基あたり３．５当量）を１０ｍＬステンレス製カップ（レッチェ社製）に入れ、２０個のステンレス製ボール（直径５ｍｍ、レッチェ社製）を加え、ミキサーミル型ボールミル（商品名：ミキサーミルＭＭ４００、レッチェ社製）を用いてミリング（振動数３０Ｈｚ、９０分間）してワックス状の弱黄白色固形物を得た。この反応混合物を粉砕ジャーから取り出し、攪拌しながらＲＯ水（２５ｍＬ）に懸濁した（１０分）。その後、生成物を減圧下濾過し、ＲＯ水、アセトンで十分に洗浄した。その後、真空オーブンで減圧下、完全に乾燥させて（８０℃、１時間）、弱黄白色非晶質粉末を得、これをそのまま分析に供した。

（実施例１７）１００ｋＤａ組換えタンパク質のサクシニル化
　組換えタンパク質ＰＲＴ９６６（５００ｍｇ、４．８０μｍｏｌ）、無水コハク酸（４７１ｍｇ、４．７１ｍｍｏｌ、１水酸基あたり５当量）、ＤＩＰＥＡ（８２０μＬ、４．７１ｍｍｏｌ、１水酸基あたり５当量）、ＤＭＡＰ（５７５ｍｇ、４．７１ｍｍｏｌ、１水酸基あたり５当量）を加えた。水酸基残基あたり）を１０ｍＬのステンレス製カップ（レッチェ社製）に加え、２０個のステンレス製ボール（直径５ｍｍ、レッチェ社製）を入れ、ミキサーミル型ボールミル（商品名：ミキサーミルＭＭ４００、レッチェ社製）でミリング（振動数：３０Ｈｚ、８．６時間）して、白亜の非晶質固形物を得た。この反応混合物を粉砕ジャーから取り出し、攪拌しながらＲＯ水（２５ｍＬ）に懸濁した（１０分間）。その後、生成物を減圧下濾過し、ＲＯ水、アセトンで十分に洗浄した。その後、真空オーブンで減圧下、完全に乾燥させて（８０℃、１時間）、白色非晶質粉末を得、これをそのまま分析に供した。

（実施例１８）１００ｋＤａ組換えタンパク質のサクシニル化
　組換えタンパク質ＰＲＴ９６６（５００ｍｇ、４．８０μｍｏｌ）、無水コハク酸（４７１ｍｇ、４．７１ｍｍｏｌ、１水酸基あたり５当量）、ＤＩＰＥＡ（８２０μＬ、４．７１ｍｍｏｌ、１水酸基あたり５当量）、ＤＭＡＰ（５７５ｍｇ、４．７１ｍｍｏｌ、１水酸基あたり５当量）を１０ｍＬステンレス製カップ（レッチェ社製）に加え、２０個のステンレス製ボール（直径５ｍｍ、レッチェ社製）を入れ、ミキサーミル型ボールミル（商品名：ミキサーミルＭＭ４００、レッチェ社製）でミリング（振動数：２０Ｈｚ、２時間）して弱黄白色のペーストを得た。この反応混合物を粉砕ジャーから取り出し、攪拌しながらＲＯ水（２５ｍＬ）に懸濁した（１０分間）。その後、生成物を減圧下濾過し、ＲＯ水、アセトンで十分に洗浄した。その後、真空オーブンで減圧下、完全に乾燥させて（８０℃、１時間）、白色非晶質粉末を得、これをそのまま分析に供した。

　実施例１４～１８のＩＲスペクトル及びＧＰＣ分析の結果を、それぞれ図１７～２１に示す。図１７（ａ）は、実施例１４及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、１７１３ｃｍ^－１にピークが現れたことから、サクシニル化が進行したことがわかった。図１７（ｂ）は、実施例１４及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムであり、保持時間が未修飾タンパク質のものとほぼ同じだった。図１８（ａ）は、実施例１５及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、１７４０ｃｍ^－１にピークが現れたことから、サクシニル化が進行したことがわかった。図１８（ｂ）は、実施例１５及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムであり、保持時間が未修飾タンパク質のものとほぼ同じだった。図１９（ａ）は、実施例１６及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、１７４０ｃｍ^－１にピークが現れたことから、サクシニル化が進行したことがわかった。図１９（ｂ）は、実施例１６及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムであり、保持時間が未修飾タンパク質のものとほぼ同じだった。図２０（ａ）は、実施例１７及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、１７２１ｃｍ^－１にピークが現れたことから、サクシニル化が進行したことがわかった。図２０（ｂ）は、実施例１７及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムであり、保持時間が未修飾タンパク質のものとほぼ同じだった。図２１（ａ）は、実施例１８及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、１７３７ｃｍ^－１にピークが現れたことから、サクシニル化が進行したことがわかった。図２１（ｂ）は、実施例１８及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムであり、保持時間が未修飾タンパク質のものよりわずかに短くなった。

７．メカノケミカル法でのステアリル化
（実施例１９）１００ｋＤａ組換えタンパク質のステアリル化
　組換えタンパク質ＰＲＴ９６６（５００ｍｇ、４．８０μｍｏｌ）、無水ステアリン酸（１．８２ｇ、３．３０ｍｍｏｌ、１水酸基あたり３．５当量）とＤＩＰＥＡ（５７４μＬ、３．３０ｍｍｏｌ、１水酸基あたり３．５当量）を１０ｍＬステンレス製カップ（レッチェ社製）に加え、２０個のステンレス製ボール（直径５ｍｍ、レッチェ社製）を入れ、ミキサーミル型ボールミル（商品名：ミキサーミルＭＭ４００、レッチェ社製）を用いてミリング（振動数：３０Ｈｚ、９０分間）してワックス状の非晶質固体を得た。この反応混合物を粉砕ジャーから取り出し、攪拌しながらＲＯ水（２５ｍＬ）に懸濁した（１０分間）。次に、粗生成物を減圧下濾過し、ＲＯ水、アセトンで十分に洗浄した。その後、生成物をろ紙上で部分的に乾燥させ、酢酸エチル（２５ｍＬ）に懸濁し、マグネティックスターラーを使用して撹拌した（１０分間）。その後、真空濾過により生成物を回収し、酢酸エチルで十分に洗浄した後、真空オーブン（８０℃、１時間）で白色アモルファス粉末を得、これをそのまま分析に供した。

（実施例２０）１００ｋＤａ組換えタンパク質のステアリル化
　組換えタンパク質ＰＲＴ９６６（５００ｍｇ、４．８０μｍｏｌ）、塩化ステアロイル（９９８ｍｇ、３．３０ｍｍｏｌ、１水酸基あたり３．５当量）及びＤＩＰＥＡ（５７４μＬ、３．３０ｍｍｏｌ、１水酸基あたり３．５当量）を１０ｍＬステンレス製カップ（レッチェ社製）に入れ、２０個のステンレス製ボール（直径５ｍｍ、レッチェ社製）を加え、ミキサーミル型ボールミル（商品名：ミキサーミルＭＭ４００、レッチェ社製）を用いてミリング（振動数：３０Ｈｚ、９０分間）してワックス状の黄色ペーストを得た。この反応混合物を粉砕ジャーから取り出し、攪拌しながらＲＯ水（２５ｍＬ）に懸濁した（１０分間）。次に、粗生成物を減圧下濾過し、ＲＯ水、アセトンで十分に洗浄した。その後、生成物をろ紙上で部分的に乾燥させ、酢酸エチル（２５ｍＬ）に懸濁し、マグネティックスターラーを使用して撹拌した（１０分間）。その後、真空濾過により生成物を回収し、酢酸エチルで十分に洗浄した後、真空オーブンで乾燥させて（８０℃、１時間）、弱黄白色非晶質粉末を得、これをそのまま分析に供した。

（実施例２１）１００ｋＤａ組換えタンパク質のステアリル化
　組換えタンパク質ＰＲＴ９６６（５００ｍｇ、４．８０μｍｏｌ）、無水ステアリン酸（１．８２ｇ、３．３０ｍｍｏｌ、１水酸基あたり３．５当量）、ＤＩＰＥＡ（５７４μＬ、３．３０ｍｍｏｌ、１水酸基あたり３．５当量）、及びＤＭＡＰ（４０３ｍｇ、３．３０ｍｍｏｌ、１水酸基あたり３．５当量）を１０ｍＬステンレス製カップ（レッチェ社製）に加え、２０個のステンレス製ボール（直径５ｍｍ、レッチェ社製）を入れ、ミキサーミル型ボールミル（商品名：ミキサーミルＭＭ４００、レッチェ社製）でミリング（振動数：３０Ｈｚ、９０分間）してワックス状の非晶質固形物を得た。この反応混合物を粉砕ジャーから取り出し、攪拌しながらＲＯ水（２５ｍＬ）に懸濁した（１０分間）。次に、粗生成物を減圧下濾過し、ＲＯ水、アセトンで十分に洗浄した。その後、生成物をろ紙上で部分的に乾燥させ、酢酸エチル（２５ｍＬ）に懸濁し、マグネティックスターラーを使用して撹拌した（１０分間）。その後、減圧下濾過することにより生成物を回収し、酢酸エチルで十分に洗浄した後、真空オーブンで乾燥させて（８０℃、１時間）、白色非晶質粉末を得、これをそのまま分析に供した。

（実施例２２）１００ｋＤａ組換えタンパク質のステアリル化
　組換えタンパク質ＰＲＴ９６６（５００ｍｇ、４．８０μｍｏｌ）、塩化ステアロイル（９９８ｍｇ、３．３０ｍｍｏｌ、１水酸基あたり３．５当量）、ＤＩＰＥＡ（５７４μＬ、３．３０ｍｍｏｌ、１水酸基あたり３．５当量）、及びＤＭＡＰ（４０３ｍｇ、３．３０ｍｍｏｌ、１水酸基あたり３．５当量）を１０ｍＬステンレス製カップ（レッチェ社製）に加え、２０個のステンレス製ボール（直径５ｍｍ、レッチェ社製）を入れ、ミキサーミル型ボールミル（商品名：ミキサーミルＭＭ４００、レッチェ社製）でミリング（振動数：３０Ｈｚ、９０分間）してワックス状の黄色ペーストを得た。この反応混合物を粉砕ジャーから取り出し、攪拌しながらＲＯ水（２５ｍＬ）に懸濁した（１０分間）。次に、粗生成物を減圧下濾過し、ＲＯ水、アセトンで十分に洗浄した。その後、生成物をろ紙上で部分的に乾燥させ、酢酸エチル（２５ｍＬ）に懸濁し、マグネティックスターラーを使用して撹拌した（１０分間）。その後、減圧下濾過することにより生成物を回収し、酢酸エチルで十分に洗浄した後、真空オーブンで乾燥させて（８０℃、１時間）、ベージュ色の非晶質粉末を得、そのまま分析に供した。

　実施例１９～２２のＩＲスペクトル及びＧＰＣ分析の結果を、それぞれ図２２～２５に示す。図２２（ａ）は、実施例１９及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、１７３３ｃｍ^－１にピークが現れたことから、ステアリル化が進行したことがわかった。図２２（ｂ）は、実施例１９及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムであり、保持時間が未修飾タンパク質のものよりわずかに短くなった。図２３（ａ）は、実施例２０及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、１７４０ｃｍ^－１にピークが現れたことから、ステアリル化が進行したことがわかった。図２３（ｂ）は、実施例２０及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムであり、保持時間が未修飾タンパク質のものとほぼ同じだった。図２４（ａ）は、実施例２１及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、１７３６ｃｍ^－１にピークが現れたことから、ステアリル化が進行したことがわかった。図２４（ｂ）は、実施例２１及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムであり、保持時間が未修飾タンパク質のものよりわずかに短くなった。図２５（ａ）は、実施例２２及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＩＲスペクトルであり、１７４２ｃｍ^－１にピークが現れたことから、ステアリル化が進行したことがわかった。図２５（ｂ）は、実施例２２及び未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６のＧＰＣクロマトグラムであり、保持時間が未修飾タンパク質のものよりわずかに短くなった。

８．エステル化度
　以下の手順で、得られた修飾タンパク質のエステル化度を算出した。まず、修飾タンパク質と未修飾タンパク質をそれぞれＦＴ－ＩＲスペクトル分析を行った。得られた各スペクトルから、形成されたエステル及びタンパク質のアミド結合に対応するＣ＝Ｏ伸縮振動ピークのピーク面積を算出した。修飾タンパク質中のアミド結合のＣ＝Ｏ伸縮振動ピークのピーク面積に対する、エステル結合のＣ＝Ｏ伸縮振動ピークのピーク面積を算出した。各計算式を以下に示す。

　エステル／アミド比率＝［（修飾タンパク質のエステルＣ＝Ｏ伸縮振動ピークのピーク面積）－（未修飾タンパク質のエステルＣ＝Ｏ伸縮振動ピークのピーク面積）］／（修飾タンパク質のアミドＣ＝Ｏ伸縮振動ピークのピーク面積）
　エステル化残基推定数＝エステル／アミド比×タンパク質中の全アミノ酸残基数
　エステル化度（％）＝（推定エステル化残基数／水酸基の総数）×１００

　各修飾タンパク質のエステル化度を表３に示す。

　エステル化度は、タンパク質を構成するアミノ酸残基の水酸基がどの程度エステル化されたかを示す指標である。タンパク質中の水酸基以外の求核性官能基（アミノ基、スルフヒドリル基）のアセチル化は、アミド結合またはチオエステル結合を形成し、エステルのＣ＝Ｏ伸縮振動ピークに影響しない。

（４）修飾タンパク質の分散性
　１００ｋＤａ組換えタンパク質ＰＲＴ９６６、実施例１１で得られたアセチル化タンパク質、実施例１４で得られたサクシニル化タンパク質を、水、アセトン、０．５ｗ／ｖ％水酸化ナトリウム水溶液のいずれかに懸濁させ（最終濃度１ｗｔ％）、室温でボルテックスミキサー（フロントラボＦＬＸ－Ｓ５０、ＡＳ　ＯＮＥ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）で混合した（２５００ｒｐｍ、３０秒）。

　結果を図２６及び表４に示す。図２６は、組換えタンパク質ＰＲＴ９６６、アセチル化タンパク質ＰＲＴ９６６、サクシニル化タンパク質ＰＲＴ９６６に、それぞれ溶媒を加えたものを写す写真である。図２６（ａ）、（ｂ）、（ｃ）で使用した溶媒は、それぞれ水、アセトン、０．５ｗ／ｖ％水酸化ナトリウム水溶液である。タンパク質は、いずれの溶媒にもあまり分散しなかったが、アセチル化タンパク質はアセトンに対して均一に分散した。また、サクシニル化タンパク質は、水中で均一に分散し、アルカリ性溶液に溶解した。

（５）修飾タンパク質の分散性
　１００ｋＤａ組換えタンパク質ＰＲＴ９６６、アセチル化タンパク質、サクシニル化タンパク質を、ＤＭＳＯに懸濁させ（最終濃度５ｗｔ％）、加熱加振器で加熱した（９０℃、１５００ｒｐｍ、１時間）。

　加熱振盪後の溶液の状態を図２７に示す。図２７（ａ）は、ＤＭＳＯを加えた直後のタンパク質の状態を示す写真であり、図２７（ｂ）は、ＤＭＳＯに溶解した状態を示す写真であり、図２７（ｃ）は、各タンパク質のゲル化状態を比較した写真である。いずれも透明な粘性溶液（ゲル状）となり、沈殿は見られなかった。ゲル化の程度は、大きい順に、実施例１１（アセチル化タンパク質）、実施例１２（アセチル化タンパク質）、未修飾タンパク質ＰＲＴ９６６、比較例２（アセチル化タンパク質）、実施例１４（サクシニル化タンパク質）であった。

９．紡糸
　組換えタンパク質ＰＲＴ９６６及び実施例８（アセチル化ＰＲＴ９６６）を所定の割合（重量）で混合した。得られた混合物にＤＭＳＯ（最終濃度：２０ｗｔ％）及び塩化リチウム（最終濃度：４ｗｔ％）を加え、マグネティックスターラー・ホットプレートで加熱撹拌（１００℃、３０分）して、タンパク質を完全に溶解させてドープ液を得た（最終濃度：２０ｗｔ％）。得られたドープ液を、使い捨て２２Ｇルアーロック針（商品名：Ｎｅｏｌｕｓ　ＮＮ－２２２５Ｒ、テルモ（株）製、内径０．４１３ｍｍ）を装着したプラスチック製注射器（商品名：ｓｓ－０５Ｌｚ、テルモ（株）製）に装填した。そして、針の先端を凝固浴（７５℃のＲＯ水）中に浸し、針を常に凝固浴の周辺でゆっくり移動させながら、ドープ液をゆっくりと一定に凝固浴中に注入した。

　結果を表５に示す。アセチル化タンパク質の割合が大きいほど、紡糸した後の癒着が抑制された。また、未修飾タンパク質は、凝固浴中で平べったい形状をしていたが、アセチル化タンパク質を含むドープ液を使用すると、断面形状がより円形に近い状態で凝固することがわかった。

１０．修飾タンパク質含有接着剤
＜溶液状接着剤の製造＞
　５０ｍＬのステンレス製カップ（レッチェ社製）に、１００ｋＤａの組換えタンパク質ＰＲＴ９６６（７．５ｇ、７２．１μｍｏｌ）と水酸化ナトリウム（６２１ｍｇ、１５．５ｍｍｏｌ、１水酸基あたり１．１当量）とを加えると共に、１個のステンレス製ボール（直径２５ｍｍ、レッチェ社製）を投入した後、ミキサーミル型ボールミル（ミキサーミルＭＭ４００、レッチェ社製）でミリング（振動数：３０Ｈｚ、３０分間）して、均質なオフホワイトの非晶質粉体を得た。次に、無水マレイン酸（４．８５ｇ、４９．４ｍｍｏｌ、１水酸基あたり３．５当量）をステンレス製カップ内に投入した後、ミキサーミル型ボールミル（ミキサーミルＭＭ４００、レッチェ社製）で更にミリング（振動数：３０Ｈｚ、６０分間）して、均質なオフホワイトの非晶質粉末を得た。この反応混合物をステンレス製カップから取り出して、ＲＯ水（２００ｍＬ）中に投入し、撹拌しながら懸濁した（５分間）。次に、得られた懸濁液中に１ＭのＨＣｌ水溶液（５０ｍＬ）を添加して、懸濁液を酸性化し、更に継続して撹拌した（５分間）。引き続き、懸濁液にアセトニトリル（１００ｍＬ）を加えた後、生成物を真空濾過（キリヤマ５Ａ号、φ６０ｍｍろ紙、桐山製作所：ＰＧ２０１ダイヤフラム真空ポンプ、大和科学株式会社）により回収した。その後、回収物をＲＯ水及びアセトンで十分に洗浄した後、真空オーブン（ＶＯＳ－３１０Ｃ真空オーブン、ＥＹＥＬＡ東京理化器械株式会社：ＧＣＤ－０５１Ｘ　油回転真空ポンプ、アルバック株式会社）で減圧下に完全乾燥して(８０℃、１時間）、薄黄色のアモルファス固体からなるマレイン化（マレイン酸エステル化）タンパク質の粉末を得た。次に、かくして得られたマレイン化タンパク質の粉末の１ｇを、８０℃に加熱した１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（５ｍＬ）に投入して、１時間急速撹拌し、溶解させた。これにより、マレイン化タンパク質が塩基性水溶液に２０ｗｔ％の濃度で溶解した溶液状接着剤を得た。これを実施例２３とした。

＜接着体の製造＞
　２枚の長手矩形の段ボール片（２０．４ｃｍ×５．９ｃｍ×０．３ｃｍ）と、２枚の長手矩形のガラス片（７．６ｃｍ×２．６ｃｍ×０．１ｃｍ）とを、それぞれ被着体として準備した。その後、１枚の段ボール片の片面の一部に実施例２３の溶液状接着剤を塗布した後、３分間放置した。次いで、１枚の段ボール片の接着剤を塗布した面に、別の段ボール片を重ね合わせた後、２枚の段ボール片の重ね合わされた部分の全体が互いに押圧されるように、２枚の段ボール片をクリップで挟んで一晩放置した。そうして、溶液状接着剤を乾燥させることにより、溶液状接着剤中の溶媒を除去し、溶液状接着剤を固化させて、２枚の段ボール片を接着した、これにより、２枚の段ボール片が接着した接着体Ａを得た。また、２枚の段ボール片に代えて２枚のガラス片を用いる以外、接着体Ａを得る際と同様な操作を行って、２枚のガラス片が接着された接着体Ｂを得た。

＜接着体Ａの強度＞
　次に、接着体Ａにおける１枚の段ボール片の上端部を固定して中空に吊るす一方、別の１枚の段ボール片の下端部に７７０ｇの錘をつけて、上下方向中間部に位置する接着部分で剥離が生ずるか否かを観察した。その結果、接着部分で剥離が生ずることがなく、十分な接着強度を有していることが判明した。

＜接着体Ｂの強度＞
　次に、接着体Ｂを水平方向に延びるように配置した状態で、下側に位置する１枚の段ボール片の接着側とは反対側の部分を固定する一方、上側に位置する別の１枚の段ボール片の接着側とは反対側の端部１９０ｇの錘を載置して、接着部分での剥がれの発生の有無を観察した。その結果、接着部分で剥離が生ずることがなく、十分な接着強度を有していることが判明した。

１１．ローラー型ミキサーミルを用いたメカノケミカルエステル化
　反応には、異方向回転ローラー形ミキサーとして、ローラーミキサー型式Ｒ６０（東洋精機製作所製、ブレード形状：ローラー形）を備えた試験用混錬機（ラボプラストミル３Ｓ１５０、東洋精機製作所製）を使用した。

（実施例２４）ＰＲＴ９６６のアセチル化
　反応を行う前に、ミキサーミルのフィードチャンバー（６０ｍＬ）内の温度を６５℃に調整した。ミキサーミルのブレードをインチング（１０ｒｐｍ）させながら、フィードチャンバー内に、１００ｋＤａの組換えタンパク質ＰＲＴ９６６（２０．０ｇ、０．１９２ｍｍｏｌ）と水酸化ナトリウム（１．６６ｇ、４１．４ｍｍｏｌ、１求核残基あたり１．１当量）の粉砕済み混合物を投入した。続いて、無水酢酸（１７．８ｍＬ，１８８ｍｍｏｌ、１求核残基あたり５当量）を慎重に分割投入した。反応物が均質化するまでインチング（１０ｒｐｍ）を行い、ミキサーのブレードが自由に回転し、トルクおよび温度の両方が安定していることを確認した後、ミリング手順を開始させ、反応物を連続的にニーディング（５０ｒｐｍ、６５℃、１．５時間）して、ベージュ色の非晶質粉末を得た。反応混合物をフィードチャンバーから取り出し、１０分間攪拌しながらＲＯ水（２００ｍＬ）中に懸濁した。真空濾過により生成物を回収した後、ＲＯ水およびアセトンで十分に洗浄した後、真空オーブンで減圧下に完全乾燥して（１時間、８０℃）、微細なオフホワイトの非晶質粉末を得た。得られた粉末をさらに処理することなく、ＦＴ－ＩＲおよびＧＰＣ分析に供した。

　得られた非晶質粉末のＦＴ－ＩＲ分析およびＧＰＣ分析の結果を、原料である組換えタンパク質ＰＲＴ９６６の結果とともに、それぞれ図２８（ａ）および（ｂ）に示す。実施例２４のＩＲスペクトルでは、１７５０ｃｍ^－１付近に新たなピークが観察され、アセチル化が進行したと考えられる。

（実施例２５）ＰＲＴ９６６のサクシニル化
　反応を行う前に、ミキサーミルのフィードチャンバー（６０ｍＬ）内の温度を６５℃に調整した。ミキサーミルのブレードをインチング（１０ｒｐｍ）させながら、フィードチャンバー内に、１００ｋＤａの組換えタンパク質ＰＲＴ９６６（２０．０ｇ、０．１９２ｍｍｏｌ）と水酸化ナトリウム（１．６６ｇ、４１．４ｍｍｏｌ、１求核残基あたり１．１当量）の粉砕済み混合物を投入した。続いて、無水コハク酸（１８．８ｇ、１８８ｍｍｏｌ、１求核残基あたり５当量）を慎重に分割投入した。反応物が均質化するまでインチング（１０ｒｐｍ）を行い、ミキサーのブレードが自由に回転し、トルクおよび温度の両方が安定していることを確認した後、ミリング手順を開始させ、反応物を連続的にニーディング（５０ｒｐｍ、６５℃、１．５時間）して、ベージュ色の非晶質粉末を得た。反応混合物をフィードチャンバーから取り出し、５分間攪拌しながらＲＯ水（２００ｍＬ）中に懸濁した。その後、１Ｍ塩酸（５０ｍＬ）の添加により懸濁液を酸性化し、さらに５分間撹拌した。アセトニトリル（２００ｍＬ）を懸濁液に添加し、さらに５分間撹拌した。真空濾過により生成物を回収した後、ＲＯ水およびアセトンで十分に洗浄した後、真空オーブンで減圧下に完全乾燥して（１時間、８０℃）、微細なオフホワイトの非晶質粉末を得た。得られた粉末をさらに処理することなく、ＦＴ－ＩＲおよびＧＰＣ分析に供した。

　得られた非晶質粉末のＦＴ－ＩＲ分析およびＧＰＣ分析の結果を、原料である組換えタンパク質ＰＲＴ９６６の結果とともに、それぞれ図２９（ａ）および（ｂ）に示す。実施例２５のＩＲスペクトルでは、１７５０ｃｍ^－１付近に新たなピークが観察され、サクシニル化が進行したと考えられる。

１２．二軸押出機を用いたメカノケミカルエステル化
　反応には、ダイヘッドを取り外した同方向回転二軸押出機（２Ｄ１５Ｗ型、東洋精機製作所製）を備えた試験用混錬機（ラボプラストミル３Ｓ１５０型、東洋精機製作所製）を使用した。押出機のスクリューセグメントは、図３０に示すように構成し、混練部の隣接するディスク間のスタッガー角度は４５°となるように調整した。図３０において、ＦＣは前進搬送要素を示し、Ｒは逆転要素を示し、Ｋは混練要素を示し、Ｃは圧縮要素を示す。

（実施例２６）ＰＲＴ９６６のサクシニル化
　反応を行う前に、押出機バレルの温度は１６０℃に調整した。反応の間中、スクリューの回転速度（１００ｒｐｍ）は維持された。スクリューを潤滑にするために、押出機に無水コハク酸（５．０ｇ、５０．０ｍｍｏｌ）を徐々に添加した。溶融無水コハク酸の押し出しが確認された後、トルクが４０Ｎ・ｍを超えないようにしながら、１００ｋＤａ組換えタンパク質ＰＲＴ９６６（５０．０ｇ、０．４８０ｍｍｏｌ）、水酸化ナトリウム（４．１４ｇ、１０３ｍｍｏｌ、１求核残基あたり１．１当量）、無水コハク酸（３３．０ｇ、３３０ｍｍｏｌ、１求核残基あたり３．５当量）の混合物を１５分かけて押出機に徐々に添加した。反応混合物を薄茶色の非晶質粉末として押し出し、回収し、１０分間撹拌しながらＲＯ水（４００ｍＬ）に懸濁した。その後、１Ｍ塩酸（１００ｍＬ）の添加により懸濁液を酸性化し、さらに５分間撹拌した。アセトニトリル（４００ｍＬ）を懸濁液に添加し、さらに１０分間撹拌した。真空濾過により生成物を回収し、ＲＯ水およびアセトンにより十分に洗浄した後、真空オーブンで減圧下に完全乾燥（１時間、８０℃）して、微細なオフホワイトの非晶質粉末を得た。得られた粉末をさらに処理することなく、ＦＴ－ＩＲおよびＧＰＣ分析に供した。

　得られた非晶質粉末のＦＴ－ＩＲ分析およびＧＰＣ分析の結果を、原料である組換えタンパク質ＰＲＴ９６６の結果とともに、それぞれ図３１（ａ）および（ｂ）に示す。実施例２６のＩＲスペクトルでは、１７５０ｃｍ^－１付近に新たなピークが観察され、サクシニル化が進行したと考えられる。

１３．メカノケミカル法によるアシル化
（実施例２７）１００ｋＤａ組換えタンパク質のスルホン化
　組換えタンパク質ＰＲＴ９６６（７．５ｇ、７２．１μｍｏｌ）、三酸化硫黄ピリジン錯体（７．８７ｇ、４９．４ｍｍｏｌ、求核残基あたり３．５当量）を１２５ｍＬの硬化スチール製粉砕ジャー（レッチェ社製）にステンレス製粉砕メディア（８×φ２０ｍｍ、レッチェ製）と一緒に入れ、ミキサーミル型ボールミル（商品名：ミキサーミルＭＭ５００　コントロール、レッチェ社製）を用いて粉砕（振動数：３０Ｈｚ、９０分）した後、３０分間静置し、再度粉砕（振動数：３０Ｈｚ、９０分）して、オフホワイトのアモルファス粉末を得た。次に、２－エチルヘキサン酸ナトリウム（８．２ｇ、４９．４ｍｍｏｌ、求核残基あたり３．５当量）を粉砕ジャーに加え、反応物を粉砕（振動数：３０Ｈｚ、１０分）し、オフホワイトの柔らかいペーストを得た。反応混合物をジャーから取り出し、粗生成物をクリンソルブ（登録商標）　Ｐ－７（日本アルコール販売株式会社製、２×１００ｍＬ）、ＲＯ水（２×１００ｍＬ）およびアセトン（２×１００ｍＬ）で順次懸濁および分離して洗浄した。その後、生成物を真空ろ過（キリヤマ５Ａ号、φ９５ｍｍろ紙、桐山製作所；ＰＧ２０１ダイヤフラム真空ポンプ、ヤマト科学株式会社）で回収し、アセトンで十分に洗浄した。真空オーブンを用いて生成物を減圧下、８０℃で１時間乾燥させた後、オフホワイトの微細な非晶質粉末（ＮａＳＯ_３－ＰＲＴ）が得られ、そのまま分析に供した。

　得られた非晶質粉末のＦＴ－ＩＲ分析およびＧＰＣ分析の結果を、原料である組換えタンパク質ＰＲＴ９６６の結果とともに、それぞれ図３２（ａ）および（ｂ）に示す。

（実施例２８）１００ｋＤａ組換えタンパク質のスルホン化
　組換えタンパク質ＰＲＴ９６６（７．５ｇ、７２．１μｍｏｌ）、三酸化硫黄ピリジン錯体（７．８７ｇ、４９．４ｍｍｏｌ、求核残基あたり３．５当量）を１２５ｍＬの硬化スチール製粉砕ジャー（レッチェ社製）にステンレス製粉砕メディア（８×φ２０ｍｍ、レッチェ製）と一緒に入れ、ミキサーミル型ボールミル（商品名：ミキサーミルＭＭ５００　コントロール、レッチェ社製）を用いて粉砕（振動数：３０Ｈｚ、９０分）した後、３０分間静置し、再度粉砕（振動数：３０Ｈｚ、９０分）してオフホワイトのアモルファス粉末を得た。次に、２－エチルヘキサン酸ナトリウム（８．２ｇ、４９．４ｍｍｏｌ、求核残基あたり３．５当量）を粉砕ジャーに加え、反応物を粉砕（振動数：３０Ｈｚ、１０分）し、オフホワイトの柔らかいペーストを得た。反応混合物をジャーから取り出し、粗生成物をクリンソルブ（登録商標）　Ｐ－７（日本アルコール販売株式会社製、２×１００ｍＬ）、ＲＯ水（２×１００ｍＬ）およびアセトン（２×１００ｍＬ）で順次懸濁および分離して洗浄した。粗生成物を０．１Ｍ塩酸（１００ｍＬ）に懸濁して酸性化し、撹拌を５分間続けた。その後、生成物を真空ろ過（キリヤマ５Ａ号、φ９５ｍｍろ紙、桐山製作所；ＰＧ２０１ダイヤフラム真空ポンプ、ヤマト科学株式会社）で回収し、アセトンで十分に洗浄。真空オーブンを用いて生成物を減圧下、８０℃で１時間乾燥させた後、オフホワイトの微細な非晶質粉末（ＨＳＯ_３－ＰＲＴ）が得られ、そのまま分析に供した。

　得られた非晶質粉末のＦＴ－ＩＲ分析およびＧＰＣ分析の結果を、原料である組換えタンパク質ＰＲＴ９６６の結果とともに、それぞれ図３３（ａ）および（ｂ）に示す。

（実施例２９）１００ｋＤａ組換えタンパク質のステアリル化
　ステアリン酸（７．５０ｇ、２６．４ｍｍｏｌ、求核残基あたり３．５当量）と１、１－カルボニルジイミダゾール（４．２７ｇ、２６．４ｍｍｏｌ、求核残基あたり３．５当量）を５０ｍＬステンレス製粉砕ジャー（レッチェ製）にステンレス製粉砕媒体（１×φ２５ｍｍボール、レッチェ製）を加え、ミキサーミル型ボールミル（商品名：ミキサーミルＭＭ４００、レッチェ社製）を用いて粉砕（振動数：３０Ｈｚ、３０分）し、無色アモルファス粉末を得た。次に、１００ｋＤａの組換えタンパク質ＰＲＴ９６６（４．０ｇ、３８．４μｍｏｌ）を粉砕ジャーに加え、粉砕（振動数：３０Ｈｚ、９０分）して無色のアモルファス粉末を得た。反応混合物を粉砕ジャーから取り出し、撹拌しながらテトラヒドロフラン（２００ｍＬ）に１０分間かけて懸濁した。その後、生成物を真空ろ過（キリヤマ５Ａ号、φ９５ｍｍろ紙、桐山製作所；ＰＧ２０１ダイヤフラム真空ポンプ、ヤマト科学株式会社）で回収し、アセトンで十分に洗浄。真空オーブンを用いて生成物を減圧下、８０℃で１時間乾燥させた後、オフホワイトの微細な非晶質粉末（Ｓｔ－ＰＲＴ）が得られ、そのまま分析に供した。

　得られた非晶質粉末のＦＴ－ＩＲ分析およびＧＰＣ分析の結果を、原料である組換えタンパク質ＰＲＴ９６６の結果とともに、それぞれ図３４（ａ）および（ｂ）に示す。

（実施例３０）１００ｋＤａ組換えタンパク質のオレイン化
　不活性窒素雰囲気下、オレイン酸（８．３２ｍＬ、２６．４ｍｍｏｌ、求核残基あたり３．５当量）と１、１－カルボニルジイミダゾール（４．２７ｇ、２６．４ｍｍｏｌ、求核残基あたり３．５当量）を密閉フラスコ中でマグネチックスターラー、ホットプレートを用いて攪拌しながら、反応混合物からの二酸化炭素の発生が停止するまで、混合物を６０℃で加熱攪拌し続けた。反応混合物を、組換えタンパク質ＰＲＴ９６６（４．０ｇ、３８．４μｍｏｌ）を５０ｍＬのステンレス製ミリングカップ（レッチェ製）に入れ、ステンレス製ミリングメディア（１×φ２５ｍｍボール、レッチェ製）を入れ、ミキサーミル型ボールミル（商品名：ミキサーミルＭＭ　４００、レッチェ製）を用いて粉砕（振動数：３０Ｈｚ、９０分）し、粒状の褐色粉末を得た。反応混合物を粉砕ジャーから取り出し、撹拌しながらテトラヒドロフラン（２００ｍＬ）に１０分間かけて懸濁した。その後、生成物を真空ろ過（キリヤマ５Ａ号、φ９５ｍｍろ紙、桐山製作所；ＰＧ２０１ダイヤフラム真空ポンプ、ヤマト科学株式会社）で回収し、アセトンで十分に洗浄した。真空オーブンを用いて生成物を減圧下、８０℃で１時間乾燥させた後、オフホワイトの微細な非晶質粉末（Ｏｌ－ＰＲＴ）が得られ、そのまま分析に供した。

　得られた非晶質粉末のＦＴ－ＩＲ分析およびＧＰＣ分析の結果を、原料である組換えタンパク質ＰＲＴ９６６の結果とともに、それぞれ図３５（ａ）および（ｂ）に示す。

（実施例３１）１００ｋＤａ組換えタンパク質のスルホスクシニル化
　１００ｋＤａのマレイン酸エステル化組換えタンパク質（５．０ｇ、４０．５μｍｏｌ）と亜硫酸水素ナトリウム（４．１３ｇ、３９．７ｍｍｏｌ、求核残基あたり５．０当量）を５０ｍＬのステンレス製粉砕ジャー（レッチェ製）にステンレス製粉砕媒体（１×φ２５ｍｍボール、レッチェ製）を加え、ミキサーミル型ボールミル（商品名：ミキサーミルＭＭ４００、レッチェ製）を用いてＲＯ水（１．０ｍＬ）で液体アシスト粉砕（振動数：３０Ｈｚ、１０分）し、薄いベージュ色のアモルファス粉末を得た。反応混合物を粉砕ジャーから取り出し、撹拌しながらＲＯ水（２００ｍＬ）に１０分間かけて懸濁した。アセトニトリル（１００ｍＬ）を懸濁液に加え、生成物を真空ろ過（キリヤマ５Ａ号、φ９５ｍｍろ紙、桐山製作所；ＰＧ２０１ダイヤフラム真空ポンプ、ヤマト科学株式会社）で回収し、アセトンで十分に洗浄した。真空オーブンを用いて生成物を減圧下、８０℃で１時間乾燥させた後、オフホワイトの微細な非晶質粉末（ＳｕｌｆｏＳｕｃｃ－ＰＲＴ）が得られ、そのまま分析に供した。

　得られた非晶質粉末のＦＴ－ＩＲ分析およびＧＰＣ分析の結果を、原料である組換えタンパク質ＰＲＴ９６６の結果とともに、それぞれ図３６（ａ）および（ｂ）に示す。

（実施例３２）１００ｋＤａ組換えタンパク質の（ジエトキシホスホリル）スクシニル化
　１００ｋＤａのマレイン酸エステル化ＰＲＴ９６６（５．０ｇ、４０．５μｍｏｌ）、ジエチルホスファイト（３．５９ｍＬ、２７．９ｍｍｏｌ、求核残基あたり３．５当量）、ナトリウムエトキシド（５７０ｍｇ、８．７６ｍｍｏｌ、求核残基あたり１．１当量）を５０ｍＬのステンレス製粉砕ジャー（レッチェ製）にステンレス製粉砕媒体（１×φ２５ｍｍボール）を加え、ミキサーミル型ボールミル（商品名：ミキサーミルＭＭ４００、レッチェ製）を用いてＲＯ水（１．０ｍＬ）で液体アシスト粉砕（振動数：３０Ｈｚ、１０分）し、薄いベージュ色のアモルファス粉末を得た。反応混合物を粉砕ジャーから取り出し、撹拌しながらＲＯ水（２００ｍＬ）に１０分間かけて懸濁した。アセトニトリル（１００ｍＬ）を懸濁液に加え、生成物を真空ろ過（キリヤマ５Ａ号、φ９５ｍｍろ紙、桐山製作所；ＰＧ２０１ダイヤフラム真空ポンプ、ヤマト科学株式会社）で回収し、アセトンで十分に洗浄した。真空オーブンを用いて、生成物を減圧下、８０℃で１時間乾燥させた後、オフホワイトの微細なアモルファス粉末（ＤＥＰＳ－ＰＲＴ）を得た。得られた非晶質粉末は、そのまま分析に供した。

　得られた非晶質粉末のＦＴ－ＩＲ分析およびＧＰＣ分析の結果を、原料である組換えタンパク質ＰＲＴ９６６の結果とともに、それぞれ図３７（ａ）および（ｂ）に示す。

１４．表面濡れ性試験
（１）分析用サンプルの製造
　５０ｍＬのステンレス製ミリングジャー（レッチェ製）に、分析対象となる組換えタンパク質誘導体をステンレス製ミリングメディア（１×φ２５ｍｍボール、レッチェ製）とともに加え、ミキサーミル型ボールミル（商品名：ミキサーミルＭＭ４００、レッチェ製）を用いて粉砕（振動数：３０Ｈｚ、５分間）し、均一な粉末にした。粉砕した試料は、恒湿恒温槽（温度範囲：２０～２５℃±３℃、湿度範囲：５０～６５％±５％ＲＨ）中に保管し、１時間かけて大気と平衡化させた。

（２）キャストフィルム
　得られた均一な組換えタンパク質粉末を８０℃で攪拌しながらＤＭＳＯに１時間かけて溶解し、１５ｗｔ％のドープ溶液を得た。このドープ溶液を、ポリエチレンテレフタレート製のバッキングシート（商品名：サンデーＰＥＴ　ＰＧ１、透明色、厚さ０．５ｍｍ、アクリサンデー株式会社）にキャストした。フィルムの厚さは、ドクターブレード式コーティングアプリケーター（８０ｍｍ×４００μｍ、株式会社井元製作所）を用いてコントロールし、４００μｍの均一な膜厚のフィルムを形成した。得られたフィルムを、恒温強制対流式オーブン（ＤＮ４１１Ｈ、ヤマト科学株式会社）を用いて、６０℃で４時間乾燥させ、次に真空オーブンを用いて減圧下、８０℃で８時間乾燥させた。得られたフィルムを３５ｍｍ×１５ｍｍの大きさに切断し、接触角分析時に平坦に保つため、粘着テープでスライドガラスに固定した。図３８のａ～ｄは、それぞれＰＲＴ９６６、Ａｃ－ＰＲＴ、Ｓｕｃｃ－ＰＲＴ、およびＳｔ－ＰＲＴのキャストフィルムを示す写真である。

（３）圧縮粉末
　得られた均一な組換えタンパク質粉末（１．２ｇ）をステンレス製金型（株式会社グローバルマシーン）に加え、卓上型ニュートンプレス（商品名：ＮＴ－１００Ｈ、三庄インダストリー株式会社）を用いて５０ＭＰａで圧縮し、加圧下で１分間保持した。使用した金型は、円柱形状であり、断面が３５ｍｍ×１５ｍｍの長方形状の貫通孔を有している。その後、圧力を解放し、金型からサンプルを取り出して、３５ｍｍ×１５ｍｍ×２ｍｍの直方体形状の圧縮サンプルを得た。

（４）接触角測定実験
　分析に先立ち、分析試料を恒湿恒温槽（温度範囲：２０～２５℃±３℃、湿度範囲：５０～６５％±５％ＲＨ）に保管し、１時間かけて大気と平衡化させた。表面の濡れ性は、ＲＯ水の１液滴（約２μＬ）と試料表面の静的接触角を測定することで評価した。接触角測定は、市販の接触角計（商品名：ＤＭｓ－６０１、協和界面科学株式会社）と画像キャプチャおよびデータフィッティングソフトウェア（ＦＡＭＡＳ、協和界面科学株式会社）を用いて、静滴法により行った。各組換えタンパク質誘導体について合計６回の測定を行い、接触角の平均値を算出した。実験結果は平均値±標準偏差で表し、接触角＜９０°の場合を「親水性」と評価し、接触角≧９０°の場合を「疎水性」と評価した。

（５）結果
　組換えタンパク質ＰＲＴ９６６、Ａｃ－ＰＲＴ（実施例８）、Ｓｕｃｃ－ＰＲＴ（実施例１４）、およびＳｔ－ＰＲＴ（実施例２９）のそれぞれから調製した圧縮粉末サンプル及びキャストフィルムの両方について、水接触角を測定した。図３８のａ～ｄは、それぞれＰＲＴ９６６、Ａｃ－ＰＲＴ、Ｓｕｃｃ－ＰＲＴ、およびＳｔ－ＰＲＴのキャストフィルムを示す写真である。

　各組換えタンパク質誘導体（ｎ＝６）について、測定した水の接触角を表６にまとめた。誤差は標準偏差を表す。表６中の「エリプス」とは、左右の接触角の平均値である。測定された水の接触角の急峻度から、圧縮粉末サンプルを用いた接触角分析の結果、最も疎水性の高いものから最も親水性の高いものへと、Ａｃ－ＰＲＴ＞Ｓｔ－ＰＲＴ＞ＰＲＴ９６６＞Ｓｕｃｃ－ＰＲＴの順であることが示された。いずれの実験でも、Ａｃ－ＰＲＴとＳｔ－ＰＲＴはＰＲＴ９６６よりも疎水性が高く、Ｓｕｃｃ－ＰＲＴは親水性が高いことが観察された。

１５．難燃性試験
（１）分析用サンプルの製造方法
　５０ｍＬのステンレス製ミリングジャー（レッチェ製）に、分析対象となる組換えタンパク質誘導体をステンレス製ミリングメディア（１×φ２５ｍｍボール）とともに加え、ミキサーミル型ボールミル（商品名：ミキサーミルＭＭ４００、レッチェ製）を用いて粉砕（振動数：３０Ｈｚ、５分間）し、均一な粉末にした。粉砕した試料は、恒湿恒温槽（温度範囲：２０～２５℃±３℃、湿度範囲：５０～６５％±５％ＲＨ）中に保管し、１時間かけて大気と平衡化させた。得られた均一なタンパク質粉末（１．２ｇ）をステンレス製金型（株式会社グローバルマシーン）に加え、卓上型ニュートンプレス（商品名：ＮＴ－１００Ｈ、三庄インダストリー株式会社）を用いて５０ＭＰａの圧力で１分間、加圧した。使用した金型は、円柱形状であり、断面が４５ｍｍ×１５ｍｍのダンベル形状の貫通孔を有している。その後、圧力を解放し、金型からサンプルを取り出して、４５ｍｍ×１５ｍｍ×２ｍｍのダンベル形状の圧縮サンプルを得た。

（２）難燃性分析
　分析に先立ち、分析試料を恒湿恒温槽（２０～２５℃±３℃、５０～６５％±５％ＲＨ）で、１時間かけて大気と平衡化させた。各試料は、試料の長さが水平になるように支持具に入れ、ストリップの少なくとも４０ｍｍを支持具から伸ばした。２５ｍｍのオレンジ色の炎がついた実験室用バーナーで、サンプルの延長端に点火した。炎を３０秒間試料に当て、その後炎を取り除き、炎が消えるまでの時間と試料質量の変化を記録した。各組換えタンパク質誘導体について測定を行い（ｎ＝６）、燃焼時間と質量損失の平均値を算出した。実験結果は平均値±標準誤差で表した。

（３）第一難燃性試験
　第一難燃性試験では、未修飾ＰＲＴ９６６、ＮａＳＯ_３－ＰＲＴ（実施例２７）、ＨＳＯ_３－ＰＲＴ（実施例２８）、及びＳｕｌｆｏＳｕｃｃ－ＰＲＴ（実施例３１）の難燃性を評価した。試験時の環境は、５～１０℃、３０～３５％ＲＨであった。

　各組換えタンパク質（ｎ＝６）の含水率、燃焼時間、質量損失を表７にまとめた。図３９（ａ）は各サンプルの燃焼時間を示すグラフであり、図３９（ｂ）は各サンプルの質量損失を示すグラフである。誤差は標準誤差を表す。測定された燃焼時間と質量損失から、すべてのタンパク質誘導体サンプルはＰＲＴ９６６よりも改善された耐火性を示し、実施例３１が最も優れた耐火性を示した。耐火性の順序は、実施例３１＞実施例２８＞実施例２７＞ＰＲＴ９６６であった。

（４）第二難燃性試験
　第二難燃性試験では、未修飾ＰＲＴ９６６、ＳｕｌｆｏＳｕｃｃ－ＰＲＴ（実施例３１）、及びＤＥＰＳ－ＰＲＴ（実施例３２）の耐火性を評価した。実験時の周囲環境条件は、２０～２５℃、７０～７５％ＲＨであった。

　各組換えタンパク質誘導体（ｎ＝６）について、含水率、燃焼時間、質量損失を表８にまとめた。誤差は標準誤差を表す。測定された燃焼時間と質量損失から、修飾タンパク質誘導体は未修飾ＰＲＴ９６６よりも改善された耐火性を示し、実施例３２が最も優れた耐火性を示した。耐火性の順序は、実施例３２＞実施例３１＞ＰＲＴ９６６であった。

１５．熱可塑性試験
（１）分析用樹脂サンプルの製造
　分析対象となる組換えタンパク質誘導体（ニート、または可塑剤として２０ｗｔ％のグリセロールを含む）を５０ｍＬのステンレス製ミリングジャー（レッチェ製）にステンレス製ミリングメディア（１×φ２５ｍｍボール）とともに加え、ミキサーミル型ボールミル（商品名：ミキサーミルＭＭ４００、レッチェ製）を用いて粉砕（振動数：３０Ｈｚ、５分間）し、均一な混合物を得た。得られた均一な混合物（３．０ｇ）をフッ素系離型剤（商品名：ダイフリーＭＳ－６００、ダイキン工業株式会社）を薄く塗布したステンレス製金型（株式会社グローバルマシーン）に加え、卓上型ニュートンプレス（商品名：ＮＴ－１００Ｈ、三庄インダストリー株式会社）で３０ＭＰａに加圧した。使用した金型は、円柱形状であり、断面が３５ｍｍ×１５ｍｍの長方形状の貫通孔を有している。圧縮された試料は、温度調節コントローラー（商品名：ＭＴＣＤ　１５－ＥＮ、株式会社ミスミグループ本社）を使って１７０℃に加熱され、その温度で５分間保持された。３０ＭＰａに加圧したまま、試料を６０℃まで冷却した。その後、圧力を解放し、サンプルを金型から取り出し、寸法３５ｍｍ×１５ｍｍ×４．５ｍｍの樹脂タブレットを得た。成形した樹脂タブレットを、ダイヤモンドディスクカッター（粒度：＃１５０、商品名：Ｋ－２１０－３、ホーザン株式会社）を装備した卓上丸鋸盤（商品名：Ｋ－２１０、ホーザン株式会社）を用いて、５ｍｍ×５ｍｍ×４．５ｍｍの分析試料に切断した。

（２）熱機械分析
　各組換えタンパク質樹脂サンプルのガラス転移点（Ｔｇ）の開始温度と軟化点は、４．９Ｎの荷重でサンプルに押し付けられた先端が平らな石英圧縮荷重プローブ（φ８ｍｍ圧縮検出棒　Ｐ／Ｎ　Ｔ１４４２－０４；圧縮支持管　Ｐ／Ｎ　Ｔ１４４２－０３、ＮＥＴＺＳＣＨｊａｐａｎ株式会社製）を備えた熱機械分析装置（商品名：ＴＭＡ４０００、ＮＥＴＺＳＣＨｊａｐａｎ株式会社製）を使用して決定された。その後、試料を一定速度（１０Ｋ・ｍｉｎ^－１）で２２０℃まで加熱し、試料の変形を記録した。分析した各組換えタンパク質誘導体について合計６回の測定を行い、Ｔｇの開始温度と軟化点の平均値を算出した。実験結果は平均値±標準偏差で表した。未修飾ＰＲＴ９６６、Ａｃ－ＰＲＴ（実施例８）、Ｓｕｃｃ－ＰＲＴ（実施例１４）、Ｍａｌ－ＰＲＴ（実施例２３）、Ｓｔ－ＰＲＴ（実施例２９）、およびＯｌ－ＰＲＴ（実施例３０）を用いて作製した各樹脂サンプルの熱機械分析を行った。分析は、ニートのタンパク質樹脂サンプルと、２０ｗｔ％のグリセロールで可塑化した樹脂サンプルの両方で行った。

（３）結果
　各組換えタンパク質樹脂サンプル（ｎ＝６）のＴｇの開始温度と軟化点を表９にまとめた。誤差は標準偏差を表す。図４０は、未修飾ＰＲＴ９６６及び各修飾タンパク質の軟化点、Ｔｇオンセット、融解温度Ｔｍを示すグラフである。熱機械分析によると、未修飾および可塑化組換えタンパク質樹脂サンプルの両方について、すべての修飾誘導体は、未修飾ＰＲＴ９６６よりも低いガラス転移点（Ｔｇ）と軟化点を有し、実施例３０が最も低いＴｇオンセットと軟化点を有することが判明した。さらに、可塑剤として２０ｗｔ％のグリセロールを添加することで、組換えタンパク質樹脂の熱加工性を改善できることが分析から示され、すべての可塑化サンプルで軟化点が最高温度（２２０℃）以下であることが確認された。

Claims

　タンパク質とアシル化剤を含む混合物をメカノケミカル法で処理して、修飾タンパク質を得ることを含む、修飾タンパク質の製造方法。
　前記混合物が、塩基及び／又は反応促進剤を更に含む、請求項１に記載の方法。
　前記タンパク質が疎水性タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
　前記疎水性タンパクのハイドロパシー・インデックスが０超である、請求項３に記載の方法。
　前記タンパク質が人工タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
　前記人工タンパク質が人工構造タンパク質を含む、請求項５に記載の方法。
　微生物学的手法により前記タンパク質を得る工程を更に含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
　前記メカノケミカル法での処理が、前記混合物に対してせん断力を加えることによって実現される、請求項１に記載の方法。
　前記せん断力が、ミキサーミル又はエクストルーダーを用いて前記混合物に加えられる、請求項８に記載の方法。
　請求項１～６のいずれか一項に記載の方法によって得られる修飾タンパク質。
　請求項７に記載の方法によって得られる修飾タンパク質。
　請求項１０に記載の修飾タンパク質を含む修飾タンパク質組成物。
　請求項１１に記載の修飾タンパク質を含む修飾タンパク質組成物。
　請求項１２に記載の修飾タンパク質組成物を成形してなる修飾タンパク質成形体。
　請求項１３に記載の修飾タンパク質組成物を成形してなる修飾タンパク質成形体。
　請求項１０に記載の修飾タンパク質を含む成形用材料。
　請求項１１に記載の修飾タンパク質を含む成形用材料。
　請求項１６に記載の成形用材料を成形してなる修飾タンパク質成形体。
　請求項１７に記載の成形用材料を成形してなる修飾タンパク質成形体。
　請求項１に記載の方法によって得られた修飾タンパク質を溶媒に溶解させる工程を含む、溶液状接着剤の製造方法。
　請求項１に記載の方法によって得られた修飾タンパク質を水性媒体に分散させる工程を含む、水分散性接着剤の製造方法。
　請求項１に記載の方法によって得られた修飾タンパク質が溶解した溶液からフィルムを成形する工程を含む、フィルム状接着剤の製造方法。
　請求項１に記載の方法によって得られた修飾タンパク質を含む粉末を得る工程を含む、粉末状接着剤の製造方法。
　請求項１に記載の方法によって得られた修飾タンパク質が溶媒に溶解してなる溶液を、複数の被着体の間に介在させた後、前記溶液から前記溶媒を除去して、前記修飾タンパク質を固化させることにより、前記被着体同士を接着することを特徴とする接着体の製造方法。
　請求項１に記載の方法によって得られた修飾タンパク質が水性媒体に分散してなる水分散液を、複数の被着体の間に介在させた後、前記水分散液から前記水性媒体を除去して、前記修飾タンパク質を固化させることにより、前記被着体同士を接着することを特徴とする接着体の製造方法。
　請求項１に記載の方法によって得られた修飾タンパク質を含むフィルムを、膨潤又は加熱により軟化させると共に、複数の被着体の間に介在させた後、前記フィルムを前記被着体に圧接させた状態で硬化させることにより、前記被着体同士を接着することを特徴とする接着体の製造方法。
　請求項１に記載の方法によって得られた修飾タンパク質を含む粉末を複数の被着体の間に介在させた状態で、前記粉末組成物を加熱すると共に、前記被着体を介して前記粉末を加圧して、固化させることにより、前記被着体同士を接着することを特徴とする接着体の製造方法。
　請求項１に記載の方法によって得られた修飾タンパク質を溶媒に溶解させる工程を含む、溶液状コーティング剤の製造方法。
　請求項１に記載の方法によって得られた修飾タンパク質を水性媒体に分散させる工程を含む、水分散性コーティング剤の製造方法。
　請求項１に記載の方法によって得られた修飾タンパク質が溶解した溶液からフィルムを成形する工程を含む、フィルム状コーティング剤の製造方法。
　請求項１に記載の方法によって得られた修飾タンパク質を含む粉末を得る工程を含む、粉末状コーティング剤の製造方法。
　基材と、前記基材の表面の少なくとも一部に積層形成されたコーティング層とを有する積層体の製造方法であって、
　請求項１に記載の方法によって得られた修飾タンパク質が溶媒に溶解してなる溶液を前記基材の表面の少なくとも一部に供給して、前記基材の表面の少なくとも一部を前記溶液でコーティングした後、前記溶液から前記溶媒を除去して、前記修飾タンパク質を固化させることにより、前記基材の表面の少なくとも一部にコーティング層を積層形成することを特徴とする積層体の製造方法。
　基材と、前記基材の表面の少なくとも一部に積層形成されたコーティング層とを有する積層体の製造方法であって、
請求項１に記載の方法によって得られた修飾タンパク質が水性媒体に分散してなる水分散液を前記基材の表面の少なくとも一部に供給して、前記基材の表面の少なくとも一部を前記水分散液でコーティングした後、前記水分散液から前記水性媒体を除去して、前記修飾タンパク質を固化させることにより、前記基材の表面の少なくとも一部にコーティング層を積層形成することを特徴とする積層体の製造方法。
　基材と、前記基材の表面の少なくとも一部に積層形成されたコーティング層とを有する積層体の製造方法であって、
　請求項１に記載の方法によって得られた修飾タンパク質を含むフィルムを膨潤又は加熱により軟化させると共に、前記基材の表面の少なくとも一部に載置した後、前記フィルムを前記基材に圧接させた状態で硬化させることにより、前記基材の表面の少なくとも一部に前記コーティング層を積層形成することを特徴とする積層体の製造方法。
　基材と、前記基材の表面の少なくとも一部に積層形成されたコーティング層とを有する積層体の製造方法であって、
　請求項１に記載の方法によって得られた修飾タンパク質を含む粉末を前記基材の表面の少なくとも一部に載置した状態で、前記粉末を加熱すると共に、加圧体と前記基材との間で前記粉末を加圧して、固化させることにより、前記基材の表面の少なくとも一部に前記コーティング層を積層形成することを特徴とする積層体の製造方法。