WO2019151437A1 - タンパク質紡績糸の製造方法 - Google Patents

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WO2019151437A1
WO2019151437A1 PCT/JP2019/003480 JP2019003480W WO2019151437A1 WO 2019151437 A1 WO2019151437 A1 WO 2019151437A1 JP 2019003480 W JP2019003480 W JP 2019003480W WO 2019151437 A1 WO2019151437 A1 WO 2019151437A1
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WO
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amino acid
seq
fibroin
sequence
acid sequence
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Application number
PCT/JP2019/003480
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
皓斗 佐藤
佑之介 安部
昌三 鳥越
下田　誠治
Original Assignee
Ｓｐｉｂｅｒ株式会社
株式会社島精機製作所
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Filing date
Publication date
Application filed by Ｓｐｉｂｅｒ株式会社, 株式会社島精機製作所 filed Critical Ｓｐｉｂｅｒ株式会社
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    • D—TEXTILES; PAPER
    • D01—NATURAL OR MAN-MADE THREADS OR FIBRES; SPINNING
    • D01F—CHEMICAL FEATURES IN THE MANUFACTURE OF ARTIFICIAL FILAMENTS, THREADS, FIBRES, BRISTLES OR RIBBONS; APPARATUS SPECIALLY ADAPTED FOR THE MANUFACTURE OF CARBON FILAMENTS
    • D01F4/00—Monocomponent artificial filaments or the like of proteins; Manufacture thereof
    • D01F4/02—Monocomponent artificial filaments or the like of proteins; Manufacture thereof from fibroin
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D02—YARNS; MECHANICAL FINISHING OF YARNS OR ROPES; WARPING OR BEAMING
    • D02G—CRIMPING OR CURLING FIBRES, FILAMENTS, THREADS, OR YARNS; YARNS OR THREADS
    • D02G1/00—Producing crimped or curled fibres, filaments, yarns, or threads, giving them latent characteristics
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D02—YARNS; MECHANICAL FINISHING OF YARNS OR ROPES; WARPING OR BEAMING
    • D02G—CRIMPING OR CURLING FIBRES, FILAMENTS, THREADS, OR YARNS; YARNS OR THREADS
    • D02G3/00—Yarns or threads, e.g. fancy yarns; Processes or apparatus for the production thereof, not otherwise provided for
    • D02G3/02—Yarns or threads characterised by the material or by the materials from which they are made

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a protein spun yarn.
  • Protein fibers unlike synthetic fibers, are biodegradable and require less energy for production and processing. As a result, the demand for various fields is expected to increase in response to the recent increase in environmental conservation awareness. It is.
  • filaments such as silk and staples such as wool are known
  • the former has a supple texture
  • the latter has a soft feeling and heat retention, and each has its own characteristics. Yes.
  • Patent Documents 1 and 2 natural silk filaments are crimped and processed into long-fiber nonwoven fabrics or long-fiber fibers.
  • a method for producing a crimped yarn has been proposed.
  • it has been partially studied to produce a protein crimped staple from a protein filament and obtain a spun yarn or a nonwoven fabric using the protein crimped staple.
  • a silk crimped staple cut by a crimping method disclosed in the above publication is cut to produce a silk crimped staple.
  • a method of spinning silk crimped staples can be considered.
  • JP 2006-207069 A Japanese Patent Laid-Open No. 9-119033
  • the crimping method described in Patent Document 1 crimps a protein filament by a machining method such as an indentation method. Therefore, using this crimping method, a spun yarn is produced using a protein crimped staple. In the case of manufacturing, there is a problem that a dedicated crimping device is required and the processing cost is increased. Further, in the crimping method described in Patent Document 2, it is necessary to perform a pretreatment for imparting untwisted latent crimpability to natural silk prior to the crimping step. When producing a spun yarn using protein crimped staples, there is a problem that the number of steps increases and the productivity is inevitably lowered.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a method for producing a protein crimped yarn from a protein filament efficiently and at low cost.
  • the present invention relates to the following inventions, for example.
  • [1] a) providing an artificial fibroin filament containing the modified fibroin; b) cutting the artificial fibroin filament to obtain an artificial fibroin staple; and prior to the cutting step, the artificial fibroin filament is crimped by contacting with an aqueous medium, or after the cutting step, Obtaining an artificial fibroin crimped staple by performing a crimping step of crimping the fibroin staple in contact with an aqueous medium; and c) a spinning step of spinning the artificial fibroin crimped staple;
  • a method for producing a protein spun yarn comprising: [2] [1] The method for producing a protein spun yarn according to [1], wherein the artificial fibroin filament has a shrinkage ratio after drying defined by the following formula of more than 7%.
  • the production method of the protein spun yarn production method of the present invention employs a simple and only crimping process in which the raw protein fiber is simply brought into contact with an aqueous medium without using a dedicated crimping device. Protein spun yarn can be easily and efficiently produced at low cost.
  • the method for producing a protein crimped staple according to an embodiment of the present invention includes a process a, a process b, and a process c described later.
  • the step is a step of preparing an artificial fibroin filament containing modified fibroin.
  • the filament also referred to as “long fiber”
  • the staple also referred to as “short fiber”
  • the modified fibroin according to the present embodiment has a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m or Formula 2: [(A) n motif-REP] m- (A) n motif. It is a protein containing.
  • an amino acid sequence (N-terminal sequence and C-terminal sequence) may be further added to either one or both of the N-terminal side and the C-terminal side of the domain sequence.
  • the N-terminal sequence and the C-terminal sequence are not limited to these, but are typically regions having no amino acid motif repeat characteristic of fibroin and consisting of about 100 amino acids.
  • modified fibroin means an artificially produced fibroin (artificial fibroin).
  • the modified fibroin may be a fibroin whose domain sequence is different from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin, or may be a fibroin having the same amino acid sequence as that of naturally occurring fibroin.
  • Natural fibroin as used herein is also represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m or Formula 2: [(A) n motif-REP] m- (A) n motif.
  • a protein comprising a domain sequence to be processed.
  • the amino acid sequence of naturally-occurring fibroin may be used as it is, and it depends on the amino acid sequence of naturally-occurring fibroin.
  • the amino acid sequence may be modified (for example, the amino acid sequence may be modified by modifying the gene sequence of a naturally-derived fibroin that has been cloned), or it may be artificially designed without relying on the naturally-occurring fibroin. And those synthesized (for example, those having a desired amino acid sequence by chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence).
  • domain sequence refers to a fibroin-specific crystal region (typically corresponding to the (A) n motif in the amino acid sequence) and an amorphous region (typically in the REP of the amino acid sequence).
  • (A) n motif represents an amino acid sequence mainly composed of alanine residues, and the number of amino acid residues is 2 to 27.
  • the number of amino acid residues of the n motif may be an integer of 2 to 20, 4 to 27, 4 to 20, 8 to 20, 10 to 20, 4 to 16, 8 to 16, or 10 to 16 .
  • the ratio of the number of alanine residues to the total number of amino acid residues in the (A) n motif may be 40% or more, such as 60% or more, 70% or more, 80% or more, 83% or more, 85% or more, It may be 86% or more, 90% or more, 95% or more, or 100% (meaning that it is composed only of alanine residues).
  • a plurality of (A) n motifs present in the domain sequence may be composed of at least seven alanine residues alone.
  • REP indicates an amino acid sequence composed of 2 to 200 amino acid residues.
  • REP may be an amino acid sequence composed of 10 to 200 amino acid residues.
  • m represents an integer of 2 to 300, and may be an integer of 10 to 300.
  • a plurality of (A) n motifs may have the same amino acid sequence or different amino acid sequences.
  • Plural REPs may have the same amino acid sequence or different amino acid sequences.
  • the modified fibroin is, for example, a modification of the amino acid sequence corresponding to, for example, substitution, deletion, insertion and / or addition of one or more amino acid residues to the cloned natural fibroin gene sequence. Can be obtained at Substitution, deletion, insertion and / or addition of amino acid residues can be carried out by methods well known to those skilled in the art such as partial-directed mutagenesis. Specifically, Nucleic Acid Res. 10, 6487 (1982), Methods in Enzymology, 100, 448 (1983), and the like.
  • Naturally-derived fibroin is a protein containing a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m or Formula 2: [(A) n motif-REP] m- (A) n motif.
  • Specific examples include fibroin produced by insects or spiders.
  • fibroin produced by insects include, for example, Bombyxmori, Kwako (Bombyx mandaraina), Tengea (Antereaeamanaii), ⁇ ⁇ (Anteraeaperiii), and ⁇ ⁇ (Eriothyraminepia).
  • Silk protein produced by silkworms such as cocoon (Samia cythia), chestnut worm (Caligula japonica), Chussa moth (Anthereaea mylitta), moth moth (Antheraea assama), etc. Examples include proteins.
  • fibroin produced by insects include silkworm fibroin L chain (GenBank accession number M76430 (base sequence), AAA27840.1 (amino acid sequence)).
  • Fibroin produced by spiders includes, for example, spiders belonging to the genus spider (Araneus spp.) Such as the spider spider, the spider spider, the red spider spider, and the bean spider, the genus spiders of the genus Araneus, the spider spider spider, the spider spider genus e Spiders, spiders such as spiders, spiders belonging to the genus Spider, spiders belonging to the genus Pronos, spiders belonging to the genus Trinofunda, such as Torinofundamas (genus Cyrtarachne) Spiders belonging to the genus (Gasteracantha), spiders belonging to the genus Spider (Ordgarius genus), such as the spiders, the spiders, and the spiders belonging to the genus Ordgarius Spiders belonging to the genus Argiope, such as the genus Argiope, spiders belonging to the genus Arachnura, such as the white-tailed spider, spiders belonging to the
  • Spiders belonging to the genus Azumigumi (Menosira), spiders belonging to the genus Dyschiriognatha (genus Dyschiriognatha) such as the common spider spider, the black spider spider, the genus Spider genus belonging to the genus Spider belonging to the genus (L) and the genus Spider belonging to the genus Usd Produced by spiders belonging to the family Tetragnathidae such as spiders belonging to the genus Prostenops
  • Examples include spider silk protein.
  • the spider silk protein include dragline proteins such as MaSp (MaSp1 and MaSp2) and ADF (ADF3 and ADF4), MiSp (MiSp1 and MiSp2), and the like.
  • spider silk proteins produced by spiders include, for example, fibroin-3 (adf-3) [derived from Araneus diadematus] (GenBank accession numbers AAC47010 (amino acid sequence), U47855 (base sequence)), fibroin-4 (adf-4) [derived from Araneus diadematus] (GenBank accession number AAC47011 (amino acid sequence), U47856 (base sequence)), dragline silk protein spiroin 1 [derived from Nephila clavipes] (GenBank accession number 4) ), U37520 (base sequence)), major ampulate spidro n 1 [derived from Latroductus hesperus] (GenBank accession number ABR68856 (amino acid sequence), EF595246 (base sequence)), dragline silk protein spidolin 2 [derived from Nephila clavata (GenBank accession number AAL32 base sequence 44 AAL32 base sequence amino acid 44, amino acid sequence 44 AAL47)
  • Naturally derived fibroin include fibroin whose sequence information is registered in NCBI GenBank.
  • sequence information is registered in NCBI GenBank.
  • spidin, sample, fibroin, “silk and polypeptide”, or “silk and protein” is described as a keyword in DEFINITION from sequences including INV as DIVISION among the sequence information registered in NCBI GenBank. It can be confirmed by extracting a character string of a specific product from the sequence, CDS, and a sequence in which the specific character string is described from SOURCE to TISSUE TYPE.
  • the modified fibroin may be modified silk fibroin (modified silk protein amino acid sequence produced by silkworm), modified spider silk fibroin (modified spider silk protein amino acid sequence produced by spiders) Thing). Among them, modified spider silk fibroin is preferably used.
  • modified fibroin examples include a modified fibroin derived from a large sphincter bookmark silk protein produced in a spider large bottle gland, a modified fibroin with a reduced content of glycine residues, (A) an n motif Modified fibroin with reduced content, content of glycine residue, and (A) modified fibroin with reduced content of n motif.
  • Examples of the modified fibroin derived from the large sphincter bookmark silk protein produced in the spider large bottle gland include a protein containing a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m .
  • (A) The number of amino acid residues of the n motif is preferably an integer of 3 to 20, and an integer of 4 to 20 Is more preferable, an integer of 8 to 20 is more preferable, an integer of 10 to 20 is still more preferable, an integer of 4 to 16 is still more preferable, an integer of 8 to 16 is particularly preferable, and an integer of 10 to 16 is most preferable preferable.
  • the number of amino acid residues constituting REP is preferably 10 to 200 residues. More preferably, it is ⁇ 150 residues, more preferably 20-100 residues, and even more preferably 20-75 residues.
  • a modified fibroin derived from the large sphincter bookmark silk protein produced in the spider large bottle gland is a glycine residue contained in the amino acid sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m ,
  • the total number of residues of serine residues and alanine residues is preferably 40% or more, more preferably 60% or more, still more preferably 70% or more based on the total number of amino acid residues. .
  • the modified fibroin derived from the large sphincter bookmark silk protein produced in the spider large bottle gland comprises a unit of an amino acid sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m and has a C-terminal. It may be a polypeptide whose sequence is an amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 14 to 16 or an amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 14 to 16.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 is the same as the amino acid sequence consisting of 50 amino acids at the C-terminal of the amino acid sequence of ADF3 (GI: 1263287, NCBI), and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15 is the sequence
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 is identical to the amino acid sequence obtained by removing 20 residues from the C-terminus, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 is 29 residues removed from the C-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14. It is identical to the amino acid sequence.
  • modified fibroin derived from a large sphincter bookmark silk protein produced in the spider large bottle-like gland
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, or (1-ii) sequence Mention may be made of modified fibroin comprising an amino acid sequence having a sequence identity of 90% or more with the amino acid sequence indicated by number 17. The sequence identity is preferably 95% or more.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 is an amino acid sequence of ADF3 in which an amino acid sequence (SEQ ID NO: 18) consisting of a start codon, His10 tag and an HRV3C protease (Human rhinovirus 3C protease) recognition site is added to the N-terminus.
  • the 13th repeat region was increased to approximately double, and the translation was mutated to terminate at the 1154th amino acid residue.
  • the C-terminal amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17 is identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16.
  • the modified fibroin (1-i) may be composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17.
  • the modified fibroin with a reduced content of glycine residues has an amino acid sequence with a reduced content of glycine residues in the domain sequence compared to naturally occurring fibroin. It can be said that the modified fibroin has an amino acid sequence corresponding to at least one or more glycine residues in REP substituted with another amino acid residue as compared with naturally occurring fibroin.
  • Modified fibroin with a reduced content of glycine residues has a domain sequence of GGX and GPGXX in REP (where G is a glycine residue, P is a proline residue, X Is an amino acid residue other than glycine.)
  • G is a glycine residue
  • P is a proline residue
  • X is an amino acid residue other than glycine.
  • this corresponds to substitution of one glycine residue in at least one or more of the motif sequences with another amino acid residue. It may have an amino acid sequence.
  • the ratio of the motif sequence in which the above glycine residue is replaced with another amino acid residue may be 10% or more with respect to the total motif sequence.
  • the modified fibroin with a reduced content of glycine residues includes a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m , and is located on the most C-terminal side from the domain sequence (A )
  • An amino acid sequence consisting of XGX (where G represents a glycine residue and X represents an amino acid residue other than glycine) contained in all REPs in the sequence excluding the sequence from the n motif to the C-terminal of the domain sequence.
  • Z is the total number of amino acid residues in the sequence, and (A) the total number of amino acid residues in the sequence excluding the sequence from the n motif located at the most C-terminal side to the C-terminus of the domain sequence is w
  • the z / w may have an amino acid sequence of 30% or more, 40% or more, 50% or more, or 50.9% or more.
  • the number of alanine residues relative to the total number of amino acid residues in the n motif may be 83% or more, preferably 86% or more, more preferably 90% or more, and 95% or more. More preferably, it is 100% (meaning that it is composed only of alanine residues).
  • one glycine residue in the GGX motif is replaced with another amino acid residue. It is preferable that the content ratio of the amino acid sequence consisting of XGX is increased.
  • the content ratio of the amino acid sequence consisting of GGX in the domain sequence is preferably 30% or less, more preferably 20% or less, and more preferably 10% or less. More preferably, it is 6% or less, still more preferably 4% or less, still more preferably 2% or less.
  • the content ratio of the amino acid sequence consisting of GGX in the domain sequence can be calculated by the same method as the method for calculating the content ratio (z / w) of the amino acid sequence consisting of XGX below.
  • a fibroin modified fibroin or naturally-occurring fibroin containing a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m , (A) n located closest to the C-terminal side from the domain sequence
  • An amino acid sequence consisting of XGX is extracted from all REPs included in the sequence excluding the sequence from the motif to the C-terminal of the domain sequence.
  • z / w (%) can be calculated by dividing z by w.
  • z / w is preferably 50.9% or more, more preferably 56.1% or more, and 58.7% or more. Is more preferably 70% or more, still more preferably 80% or more. Although there is no restriction
  • a modified fibroin with a reduced content of glycine residues encodes another amino acid residue by substituting at least a part of the base sequence encoding the glycine residue from the cloned gene sequence of naturally occurring fibroin. It can obtain by modifying so that. At this time, one glycine residue in GGX motif and GPGXX motif may be selected as a glycine residue to be modified, or substitution may be performed so that z / w is 50.9% or more.
  • an amino acid sequence satisfying the above-described aspect can be designed from the amino acid sequence of naturally derived fibroin, and a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence can be obtained by chemical synthesis.
  • one or more amino acid residues are further substituted or deleted.
  • the amino acid sequence corresponding to the insertion and / or addition may be modified.
  • the other amino acid residue is not particularly limited as long as it is an amino acid residue other than glycine residue, but valine (V) residue, leucine (L) residue, isoleucine (I) residue, methionine ( M) hydrophobic amino acid residues such as proline (P) residue, phenylalanine (F) residue and tryptophan (W) residue, glutamine (Q) residue, asparagine (N) residue, serine (S ) Residues, lysine (K) residues and glutamic acid (E) residues are preferred, and valine (V) residues, leucine (L) residues, isoleucine (I) residues and glutamine ( Q) residue is more preferable, and glutamine (Q) residue is more preferable.
  • modified fibroin with a reduced content of glycine residues (2-i) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12, or (2- ii)
  • SEQ ID NO: 3 amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12, or
  • 2- ii A modified fibroin containing an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12 can be mentioned.
  • the modified fibroin (2-i) will be described.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is obtained by substituting GQX for all GGX in the REP of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 corresponding to naturally occurring fibroin.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, in which every two (A) n motifs are deleted from the N-terminal side to the C-terminal side, and further before the C-terminal sequence.
  • One [(A) n motif-REP] is inserted into the.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 has two alanine residues inserted in the C-terminal side of each (A) n motif of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, and a part of glutamine (Q) residues. Substituted with a serine (S) residue and a part of the amino acid at the N-terminal side is deleted so as to be almost the same as the molecular weight of SEQ ID NO: 4.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 is a region of 20 domain sequences present in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 (however, several amino acid residues on the C-terminal side of the region are substituted). Is a sequence in which a His tag is added to the C-terminal of the sequence repeated four times.
  • the value of z / w in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is 46.8%.
  • the z / w values in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 are 58.7%, 70.1%, 66.1% and 70.0%.
  • the value of x / y at the ratio of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 12 (described later) 1: 1.8 to 11.3 is: 15.0%, 15.0%, 93.4%, 92.7% and 89.3%, respectively.
  • the modified fibroin (2-i) may be composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12.
  • the modified fibroin (2-ii) includes an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12.
  • the modified fibroin of (2-ii) is also a protein containing a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m .
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the modified fibroin of (2-ii) has a sequence identity of 90% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12, and is contained in REP (XGX (where G is a glycine residue, and X is an amino acid residue other than glycine.)
  • Z is the total number of amino acid residues
  • w is the total number of REP amino acids in the domain sequence. Sometimes, it is preferable that z / w is 50.9% or more.
  • modified fibroin may contain a tag sequence at one or both of the N-terminal and C-terminal. This makes it possible to isolate, immobilize, detect and visualize the modified fibroin.
  • tag sequences include affinity tags that use specific affinity (binding property, affinity) with other molecules.
  • affinity tag include a histidine tag (His tag).
  • His tag is a short peptide with about 4 to 10 histidine residues, and has the property of binding specifically to metal ions such as nickel. Therefore, the isolation of modified fibroin by metal chelating chromatography (chelating metal chromatography) Can be used.
  • Specific examples of the tag sequence include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 (amino acid sequence containing a His tag).
  • GST glutathione-S-transferase
  • MBP maltose-binding protein
  • an “epitope tag” using an antigen-antibody reaction can also be used.
  • a peptide (epitope) exhibiting antigenicity as a tag sequence, an antibody against the epitope can be bound.
  • HA peptide sequence of hemagglutinin of influenza virus
  • myc tag peptide sequence of hemagglutinin of influenza virus
  • FLAG tag peptide sequence of hemagglutinin of influenza virus
  • a tag sequence that can be separated with a specific protease can also be used.
  • the modified fibroin from which the tag sequence has been separated can also be recovered.
  • modified fibroin containing the tag sequence examples include (2-iii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, or (2-iv) SEQ ID NO: 8 And a modified fibroin containing an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13.
  • amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 13 are SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, respectively.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 (including His tag sequence and hinge sequence) is added to the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12.
  • the modified fibroin may be composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13.
  • the modified fibroin (2-iv) includes an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13.
  • the modified fibroin of (2-iv) is also a protein containing a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m .
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the modified fibroin (2-iv) has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 with a sequence identity of 90% or more, and is contained in XREP ( Where G is a glycine residue, and X is an amino acid residue other than glycine.) Z is the total number of amino acid residues, and w is the total number of REP amino acids in the domain sequence. Sometimes, it is preferable that z / w is 50.9% or more.
  • the aforementioned modified fibroin may contain a secretion signal for releasing the protein produced in the recombinant protein production system to the outside of the host.
  • the sequence of the secretion signal can be appropriately set according to the type of host.
  • (A) modified fibroin content of n motifs has been reduced, the domain sequence is compared to the naturally occurring fibroin, having an amino acid sequence reduced the content of (A) n motif. It can be said that the domain sequence of the modified fibroin has an amino acid sequence corresponding to the deletion of at least one or more (A) n motifs as compared to naturally occurring fibroin.
  • the modified fibroin in which the content of n motif is reduced may have an amino acid sequence corresponding to 10% to 40% deletion of (A) n motif from naturally occurring fibroin.
  • the modified fibroin with a reduced content of n motif has 1 to 3 (A) n motifs in which the domain sequence is at least from the N-terminal side to the C-terminal side compared to naturally occurring fibroin. Each may have an amino acid sequence corresponding to the deletion of one (A) n motif.
  • the domain sequence of the modified fibroin is at least two consecutive from the N-terminal side to the C-terminal side compared to the naturally derived fibroin (A) n motif And an amino acid sequence corresponding to the deletion of one (A) n motif repeated in this order.
  • (A) modified fibroin content of n motifs has been reduced, the domain sequence, amino acids corresponding to at least the N-terminal side 2 every other towards the C-terminal side (A) n motifs lacking It may have a sequence.
  • a modified fibroin with a reduced content of n- motif contains a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n- motif-REP] m , and is adjacent to the C-terminal side from the N-terminal side.
  • the number of alanine residues relative to the total number of amino acid residues in the n motif may be 83% or more, preferably 86% or more, more preferably 90% or more, and 95% or more. More preferably, it is 100% (meaning that it is composed only of alanine residues).
  • FIG. 1 shows a domain sequence obtained by removing the N-terminal sequence and the C-terminal sequence from the modified fibroin.
  • the domain sequence is from the N-terminal side (left side): (A) n motif-first REP (50 amino acid residues)-(A) n motif-second REP (100 amino acid residues)-(A) n Motif-third REP (10 amino acid residues)-(A) n motif-fourth REP (20 amino acid residues)-(A) n motif-fifth REP (30 amino acid residues)-(A) It has a sequence called n motif.
  • FIG. 1 includes pattern 1 (comparison between the first REP and the second REP, and comparison between the third REP and the fourth REP), pattern 2 (comparison between the first REP and the second REP, and 4th REP and 5th REP), pattern 3 (2nd REP and 3rd REP comparison, 4th REP and 5th REP comparison), pattern 4 (first REP and Comparison of the second REP).
  • pattern 1 compare between the first REP and the second REP, and comparison between the third REP and the fourth REP
  • pattern 2 comparison between the first REP and the second REP, and 4th REP and 5th REP
  • pattern 3 (2nd REP and 3rd REP comparison, 4th REP and 5th REP comparison
  • pattern 4 first REP and Comparison of the second REP
  • the number of amino acid residues of each REP in the two adjacent [(A) n motif-REP] units selected is compared.
  • each pattern the number of all amino acid residues of two adjacent [(A) n motif-REP] units indicated by solid lines is added (not only REP but also (A) the number of amino acid residues of the n motif. is there.). Then, the total value added is compared, and the total value (maximum value of the total value) of the pattern having the maximum total value is set as x. In the example shown in FIG. 1, the total value of pattern 1 is the maximum.
  • x / y (%) can be calculated by dividing x by the total number of amino acid residues y of the domain sequence.
  • x / y is preferably 50% or more, more preferably 60% or more, still more preferably 65% or more, It is still more preferably 70% or more, still more preferably 75% or more, and particularly preferably 80% or more.
  • x / y is preferably 50% or more, more preferably 60% or more, still more preferably 65% or more, It is still more preferably 70% or more, still more preferably 75% or more, and particularly preferably 80% or more.
  • x / y is preferably 89.6% or more, and when the jagged ratio is 1: 1.8 to 3.4, x / y / Y is preferably 77.1% or more, and when the jagged ratio is 1: 1.9 to 8.4, x / y is preferably 75.9% or more, and the jagged ratio is 1 In the case of 1.9 to 4.1, x / y is preferably 64.2% or more.
  • x / y is 46.4% or more, preferably 50% or more, more preferably 55% or more, still more preferably 60% or more, and 70% or more. Even more preferable, 80% or more is particularly preferable.
  • x / y is 46.4% or more, preferably 50% or more, more preferably 55% or more, still more preferably 60% or more, and 70% or more. Even more preferable, 80% or more is particularly preferable.
  • x / y is 46.4% or more, preferably 50% or more, more preferably 55% or more, still more preferably 60% or more, and 70% or more. Even more preferable, 80% or more is particularly preferable.
  • (A) modified fibroin content of n motif is reduced, for example, encoding a cloned naturally occurring fibroin gene sequences, as x / y is more than 64.2% of the (A) n motif It can be obtained by deleting one or more of the sequences.
  • an amino acid sequence corresponding to the deletion of one or more (A) n motifs is designed so that x / y is 64.2% or more from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin. It can also be obtained by chemically synthesizing a nucleic acid encoding the amino acid sequence.
  • one or more amino acid residues are further substituted, deleted, inserted and / or added.
  • the amino acid sequence corresponding to this may be modified.
  • the modified fibroin (3-i) will be described.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 corresponding to naturally occurring fibroin deleted from the N-terminal side to the C-terminal side every two (A) n motifs Furthermore, one [(A) n motif-REP] is inserted in front of the C-terminal sequence.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is obtained by substituting all GGX in REP of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 with GQX.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 has two alanine residues inserted in the C-terminal side of each (A) n motif of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, and a part of glutamine (Q) residues. Substituted with a serine (S) residue and a part of the amino acid at the N-terminal side is deleted so as to be almost the same as the molecular weight of SEQ ID NO: 4.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 is a region of 20 domain sequences present in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 (however, several amino acid residues on the C-terminal side of the region are substituted). Is a sequence in which a His tag is added to the C-terminal of the sequence repeated four times.
  • the value of x / y of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (corresponding to naturally-occurring fibroin) at a jagged ratio of 1: 1.8 to 11.3 is 15.0%.
  • the value of x / y in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is 93.4%.
  • the value of x / y in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 is 92.7%.
  • the value of x / y in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 is 89.3%.
  • the z / w values in the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 12 are 46.8%, 56.2%, 70.1% and 66. respectively. 1% and 70.0%.
  • the modified fibroin (3-i) may be composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12.
  • the modified fibroin (3-ii) includes an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12.
  • the modified fibroin of (3-ii) is also a protein containing a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m .
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the modified fibroin of (3-ii) has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12, and from the N-terminal side to the C-terminal side
  • the number of amino acid residues of REP of two adjacent [(A) n motif-REP] units is sequentially compared, and the number of amino acid residues of REP having a small number of amino acid residues is 1, the other
  • x / y is 64.2% or more, where x is the maximum total value of the total number of bases and y is the total number of amino acid residues in the domain sequence.
  • the above-described modified fibroin may contain the above-described tag sequence at one or both of the N-terminal and C-terminal.
  • modified fibroin containing the tag sequence examples include (3-iii) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, or (2-iv) SEQ ID NO: 7 And a modified fibroin containing an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13.
  • amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 13 are SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, respectively.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 (including His tag) is added to the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12.
  • the modified fibroin may be composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13.
  • the modified fibroin (3-iv) includes an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13.
  • the modified fibroin of (3-iv) is also a protein containing a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m .
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the modified fibroin (3-iv) has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, and from the N-terminal side to the C-terminal side.
  • the other X is the maximum total value of the total number of amino acid residues of two adjacent [(A) n motif-REP] units with a ratio of the number of amino acid residues of REP of 1.8 to 11.3.
  • x / y is preferably 64.2% or more.
  • the aforementioned modified fibroin may contain a secretion signal for releasing the protein produced in the recombinant protein production system to the outside of the host.
  • the sequence of the secretion signal can be appropriately set according to the type of host.
  • the domain sequence of the modified fibroin is different from that of naturally occurring fibroin in addition to at least one or more glycine residues in REP. It can be said to have an amino acid sequence corresponding to substitution with an amino acid residue.
  • it is a modified fibroin having the characteristics of the modified fibroin in which the content of the glycine residue is reduced and (A) the modified fibroin in which the content of the n motif is reduced.
  • Specific embodiments and the like are as described in the modified fibroin in which the content of glycine residues is reduced and (A) the modified fibroin in which the content of n motif is reduced.
  • modified fibroin with reduced glycine residue content and (A) n- motif content (4-i) the amino acid represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12
  • modified fibroin comprising a sequence or (4-ii) an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12.
  • Specific embodiments of the modified fibroin comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12 are as described above.
  • the modified fibroin according to another embodiment has a domain sequence in which one or more amino acid residues in REP are replaced with amino acid residues having a large hydrophobicity index as compared to naturally occurring fibroin, and It may have an amino acid sequence including a region having a large hydrophobic index locally, corresponding to the insertion of one or more amino acid residues having a large hydrophobic index in REP.
  • the region where the hydrophobic index is locally large is preferably composed of 2 to 4 amino acid residues.
  • the amino acid residue having a large hydrophobicity index is an amino acid selected from isoleucine (I), valine (V), leucine (L), phenylalanine (F), cysteine (C), methionine (M) and alanine (A). More preferably, it is a residue.
  • the modified fibroin according to the present embodiment has one or more amino acid residues in REP substituted with amino acid residues having a large hydrophobicity index and / or 1 in REP compared to naturally occurring fibroin.
  • one or more amino acid residues are substituted, deleted, inserted and / or compared with naturally occurring fibroin.
  • the modified fibroin according to the present embodiment for example, hydrophobicizes one or more hydrophilic amino acid residues (for example, amino acid residues having a negative hydrophobicity index) in REP from the gene sequence of naturally-derived fibroin that has been cloned. It can be obtained by substituting amino acid residues (for example, amino acid residues having a positive hydrophobicity index) and / or inserting one or more hydrophobic amino acid residues in REP.
  • hydrophilic amino acid residues for example, amino acid residues having a negative hydrophobicity index
  • one or more hydrophilic amino acid residues in REP are substituted with hydrophobic amino acid residues from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin, and / or one or more hydrophobic amino acid residues in REP It can also be obtained by designing an amino acid sequence corresponding to insertion of, and chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence.
  • one or more hydrophilic amino acid residues in REP have been replaced with hydrophobic amino acid residues from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin and / or one or more hydrophobic amino acids in REP
  • the amino acid sequence corresponding to the substitution, deletion, insertion and / or addition of one or more amino acid residues may be further modified.
  • the modified fibroin according to another embodiment includes a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m , and (A) located at the most C-terminal side of the domain sequence from the n motif.
  • P, and (A) where the total number of amino acid residues contained in the sequence excluding the sequence from the n motif to the C terminus of the domain sequence from the domain sequence is q / Q may have an amino acid sequence of 6.2% or more.
  • hydrophobicity index of amino acid residues As for the hydrophobicity index of amino acid residues, a known index (Hydropathy index: Kyte J, & Doolittle R (1982) “A simple method for displaying the hydropathic character of bio.p. 7”. 105-132). Specifically, the hydrophobicity index (hydropathic index, hereinafter also referred to as “HI”) of each amino acid is as shown in Table 1 below.
  • a sequence obtained by removing the sequence from the domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m to the most C-terminal side from the domain (A) n motif to the C terminus of the domain sequence. (Hereinafter referred to as “array A”).
  • array A the average value of the hydrophobicity index of four consecutive amino acid residues is calculated.
  • the average value of the hydrophobicity index is obtained by dividing the total HI of each amino acid residue contained in the four consecutive amino acid residues by 4 (number of amino acid residues).
  • the average value of the hydrophobicity index is obtained for all four consecutive amino acid residues (each amino acid residue is used for calculating the average value 1 to 4 times). Next, a region where the average value of the hydrophobicity index of four consecutive amino acid residues is 2.6 or more is specified. Even if a certain amino acid residue corresponds to a plurality of “four consecutive amino acid residues whose average value of hydrophobicity index is 2.6 or more”, it should be included as one amino acid residue in the region. become.
  • the total number of amino acid residues contained in the region is p.
  • the total number of amino acid residues contained in sequence A is q.
  • the average value of the hydrophobicity index of four consecutive amino acid residues is 2
  • p / q is preferably 6.2% or more, more preferably 7% or more, further preferably 10% or more, and 20% or more. Even more preferably, it is still more preferably 30% or more.
  • the upper limit of p / q is not particularly limited, but may be 45% or less, for example.
  • the modified fibroin according to this embodiment includes, for example, one or a plurality of hydrophilic amino acid residues (for example, hydrophobicity) in the REP so that the amino acid sequence of the naturally-derived fibroin thus cloned satisfies the above p / q condition.
  • hydrophilic amino acid residues for example, hydrophobicity
  • Substituting a hydrophobic amino acid residue (for example, an amino acid residue having a positive hydrophobicity index) and / or one or more hydrophobic amino acid residues during REP Can be obtained by locally modifying the amino acid sequence to include a region having a large hydrophobicity index.
  • an amino acid sequence satisfying the above p / q conditions can be designed from the amino acid sequence of naturally derived fibroin, and a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence can be obtained by chemical synthesis.
  • one or more amino acid residues in REP were replaced with amino acid residues having a higher hydrophobicity index and / or one or more amino acid residues in REP.
  • modifications corresponding to substitution, deletion, insertion and / or addition of one or more amino acid residues may be performed. .
  • the amino acid residue having a large hydrophobicity index is not particularly limited, but isoleucine (I), valine (V), leucine (L), phenylalanine (F), cysteine (C), methionine (M) and alanine (A ) are preferred, and valine (V), leucine (L) and isoleucine (I) are more preferred.
  • modified fibroin (5-i) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23, or (5-ii) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23 And a modified fibroin comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by
  • the modified fibroin (5-i) will be described.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19 is an amino acid sequence in which the alanine residues in the (A) n motif of (A) naturally derived fibroin are deleted so that the number of consecutive alanine residues is five.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 is inserted into the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 by two amino acid sequences (VLI) each consisting of 3 amino acid residues every other REP, and represented by SEQ ID NO: 19. A part of the amino acid on the N-terminal side is deleted so that the molecular weight of the amino acid sequence is almost the same.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 is obtained by inserting two alanine residues at the C-terminal side of each (A) n motif with respect to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, and further adding some glutamine (Q) residues. A group is substituted with a serine (S) residue, and a part of amino acids on the N-terminal side are deleted so that the molecular weight of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19 is almost the same.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 is obtained by inserting one amino acid sequence (VLI) consisting of 3 amino acid residues at every other REP to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23 is obtained by inserting two amino acid sequences (VLI) each consisting of 3 amino acid residues into the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21 every other REP.
  • the modified fibroin (5-i) may be composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23.
  • the modified fibroin (5-ii) includes an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23.
  • the modified fibroin of (5-ii) is also a protein containing a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m .
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the modified fibroin of (5-ii) has a sequence identity of 90% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23, and is located at the most C-terminal side (A) n
  • the amino acids included in the region where the average value of the hydrophobicity index of 4 consecutive amino acid residues is 2.6 or more P is the total number of residues
  • P / q is preferably 6.2% or more.
  • the above-mentioned modified fibroin may contain a tag sequence at one or both of the N-terminal and C-terminal.
  • modified fibroin comprising a tag sequence
  • 5-iii the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 26, or (5-iv) SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 or Mention may be made of modified fibroin comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26.
  • amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, and SEQ ID NO: 26 are the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 5 at the N-terminus of the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 23, respectively (His tag). Including a sequence and a hinge sequence).
  • the modified fibroin may consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 26.
  • the modified fibroin (5-iv) includes an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 26.
  • the modified fibroin of (5-iv) is also a protein containing a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m .
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the modified fibroin (5-iv) has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 26, and is located at the most C-terminal side (A) n
  • the amino acids included in the region where the average value of the hydrophobicity index of 4 consecutive amino acid residues is 2.6 or more P is the total number of residues
  • P / q is preferably 6.2% or more.
  • the aforementioned modified fibroin may contain a secretion signal for releasing the protein produced in the recombinant protein production system to the outside of the host.
  • the sequence of the secretion signal can be appropriately set according to the type of host.
  • the modified fibroin according to still another embodiment has an amino acid sequence in which the content of glutamine residues is reduced as compared with naturally occurring fibroin.
  • the modified fibroin according to this embodiment preferably includes at least one motif selected from a GGX motif and a GPGXX motif in the amino acid sequence of REP.
  • the content ratio of the GPGXX motif is usually 1% or more, may be 5% or more, and is preferably 10% or more.
  • the upper limit of GPGXX motif content rate 50% or less may be sufficient and 30% or less may be sufficient.
  • GPGXX motif content is a value calculated by the following method.
  • Formula 1 [(A) n motif-REP] m
  • Formula 2 [(A) n motif-REP] m- (A) fibroin (modified fibroin or naturally derived) containing a domain sequence represented by the n motif In fibroin), the number of GPGXX motifs contained in the region in all REPs contained in the sequence excluding the sequence from the domain sequence (A) n motif located at the most C-terminal side to the C-terminus of the domain sequence.
  • the number obtained by multiplying the total number by three is s, and is located at the most C-terminal side.
  • the sequence from the n motif to the C-terminal of the domain sequence is determined from the domain sequence.
  • the content ratio of the GPGXX motif is calculated as s / t, where t is the total number of amino acid residues of all REPs excluding the n motif. It is.
  • “A sequence located at the most C-terminal side (A) excluding the sequence from the n motif to the C-terminal of the domain sequence from the domain sequence” (A)
  • the sequence from the n motif to the C terminus of the domain sequence ”(sequence corresponding to REP) may include a sequence that is not highly correlated with the sequence characteristic of fibroin, and m is small In this case (that is, when the domain sequence is short), the calculation result of the content ratio of the GPGXX motif is affected, so this influence is excluded.
  • the “GPGXX motif” is located at the C-terminus of REP, even if “XX” is, for example, “AA”, it is treated as “GPGXX motif”.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing the domain sequence of the modified fibroin.
  • the modified fibroin according to this embodiment preferably has a glutamine residue content of 9% or less, more preferably 7% or less, still more preferably 4% or less, and preferably 0%. Particularly preferred.
  • the “glutamine residue content” is a value calculated by the following method.
  • Formula 1 [(A) n motif-REP] m
  • Formula 2 [(A) n motif-REP] m-
  • the total number of glutamine residues contained in the region is u
  • the sequence from the (A) n motif located at the most C-terminal side to the C-terminus of the domain sequence is excluded from the domain sequence
  • (A) n The glutamine residue content is calculated as u / t, where t is the total number of amino acid residues in all REPs excluding the motif.
  • the reason why "A sequence located at the most C-terminal side (A) excluding the sequence from the n motif to the C-terminus of the domain sequence from the domain sequence" is the reason described above. It is the same.
  • the domain sequence has one or more glutamine residues in REP deleted or substituted with other amino acid residues as compared to naturally occurring fibroin. It may have a corresponding amino acid sequence.
  • the “other amino acid residue” may be an amino acid residue other than a glutamine residue, but is preferably an amino acid residue having a larger hydrophobicity index than the glutamine residue. Table 1 shows the hydrophobicity index of amino acid residues.
  • amino acid residues having a larger hydrophobicity index than glutamine residues include isoleucine (I), valine (V), leucine (L), phenylalanine (F), cysteine (C), methionine (M ) Amino acid residues selected from alanine (A), glycine (G), threonine (T), serine (S), tryptophan (W), tyrosine (Y), proline (P) and histidine (H). it can.
  • an amino acid residue selected from isoleucine (I), valine (V), leucine (L), phenylalanine (F), cysteine (C), methionine (M) and alanine (A) is more preferable. More preferred is an amino acid residue selected from among isoleucine (I), valine (V), leucine (L) and phenylalanine (F).
  • the hydrophobicity of REP is preferably ⁇ 0.8 or more, more preferably ⁇ 0.7 or more, still more preferably 0 or more, and It is still more preferable that it is 3 or more, and it is especially preferable that it is 0.4 or more.
  • the “hydrophobicity of REP” is a value calculated by the following method.
  • Formula 1 [(A) n motif-REP] m
  • Formula 2 [(A) n motif-REP] m-
  • A) the sequence from the n- motif to the C-terminus of the domain sequence located on the most C-terminal side (sequence corresponding to “region A” in FIG. 1) is included.
  • the sum of the hydrophobicity index of each amino acid residue in the region is represented by v, and the sequence from the (A) n motif located at the most C-terminal side to the C-terminus of the domain sequence is removed from the domain sequence, A)
  • the hydrophobicity of REP is calculated as v / t, where t is the total number of amino acid residues of all REPs excluding the n motif.
  • the reason why “A sequence located at the most C-terminal side (A) excluding the sequence from the n motif to the C-terminal of the domain sequence from the domain sequence” is the reason described above. It is the same.
  • the modified fibroin according to the present embodiment has a domain sequence in which one or more glutamine residues in REP are deleted compared to naturally-occurring fibroin and / or one or more glutamine in REP.
  • modifications corresponding to substitution of residues with other amino acid residues there are further alterations in amino acid sequence corresponding to substitution, deletion, insertion and / or addition of one or more amino acid residues. Also good.
  • the modified fibroin according to the present embodiment includes, for example, deletion of one or more glutamine residues in REP from the cloned gene sequence of natural fibroin and / or one or more glutamine residues in REP. Can be obtained by substituting with other amino acid residues.
  • one or more glutamine residues in REP are deleted from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin, and / or one or more glutamine residues in REP are replaced with other amino acid residues.
  • it can also be obtained by designing a corresponding amino acid sequence and chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence.
  • modified fibroin As more specific examples of the modified fibroin according to the present invention, (6-i) the amino acid represented by SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 38 or SEQ ID NO: 39 90% or more of the modified fibroin containing the sequence, or (6-ii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 38 or SEQ ID NO: 39 Mention may be made of modified fibroin comprising amino acid sequences having sequence identity.
  • the (6-i) modified fibroin will be described.
  • Amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is a fibroin naturally occurring Nephila clavipes (GenBank accession number: P46804.1, GI: 1174415) based on the nucleotide sequence and amino acid sequence of, (A) n
  • the amino acid sequence in which the alanine residue in the motif is continued is modified with an amino acid to improve productivity, such as the number of consecutive alanine residues is five.
  • Met-PRT410 since Met-PRT410 has not altered the glutamine residue (Q), the glutamine residue content is comparable to the glutamine residue content of naturally occurring fibroin.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 (M_PRT888) is obtained by replacing all QQs in Met-PRT410 (SEQ ID NO: 4) with VL.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 28 (M_PRT965) is obtained by substituting all QQs in Met-PRT410 (SEQ ID NO: 4) with TS and substituting the remaining Q with A.
  • the amino acid sequence (M_PRT889) represented by SEQ ID NO: 29 is obtained by replacing all QQs in Met-PRT410 (SEQ ID NO: 4) with VL and replacing the remaining Q with I.
  • the amino acid sequence (M_PRT916) represented by SEQ ID NO: 30 is obtained by substituting all QQs in Met-PRT410 (SEQ ID NO: 4) with VI and replacing the remaining Q with L.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 31 is obtained by replacing all QQs in Met-PRT410 (SEQ ID NO: 4) with VF and replacing the remaining Q with I.
  • the amino acid sequence (M_PRT525) represented by SEQ ID NO: 37 is obtained by inserting two alanine residues into a region (A 5 ) where alanine residues are continuous with respect to Met-PRT410 (SEQ ID NO: 4).
  • the two C-terminal domain sequences were deleted and 13 glutamine residues (Q) were replaced with serine residues (S) or proline residues (P) so that they were almost the same as those in FIG.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 38 (M_PRT699) is obtained by substituting VL for all QQs in M_PRT525 (SEQ ID NO: 37).
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 39 is obtained by replacing all QQs in M_PRT525 (SEQ ID NO: 37) with VL and replacing the remaining Q with I.
  • amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 38, and SEQ ID NO: 39 all have a glutamine residue content of 9% or less (Table 2). ).
  • the modified fibroin (6-i) may be composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 38 or SEQ ID NO: 39. .
  • the modified fibroin of (6-ii) has a sequence identity of 90% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 38 or SEQ ID NO: 39.
  • the amino acid sequence having The modified fibroin of (6-ii) is also represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m or the formula 2: [(A) n motif-REP] m- (A) n motif.
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the modified fibroin (6-ii) preferably has a glutamine residue content of 9% or less.
  • the modified fibroin (6-ii) preferably has a GPGXX motif content of 10% or more.
  • modified fibroin may contain a tag sequence at one or both of the N-terminal and C-terminal. This makes it possible to isolate, immobilize, detect and visualize the modified fibroin.
  • modified fibroin containing a tag sequence (6-iii) amino acids represented by SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 40 or SEQ ID NO: 41 90% or more of the modified fibroin containing the sequence, or (6-iv) SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 40 or SEQ ID NO: 41 Mention may be made of modified fibroin comprising amino acid sequences having sequence identity.
  • amino acid sequences shown by SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 40 and SEQ ID NO: 41 are SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, respectively.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 (including His tag sequence and hinge sequence) is added to the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 38 and SEQ ID NO: 39.
  • the modified fibroin of (6-iii) may be composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 40 or SEQ ID NO: 41. .
  • the modified fibroin (6-iv) has a sequence identity of 90% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 40 or SEQ ID NO: 41.
  • the amino acid sequence having The modified fibroin of (6-iv) is also a domain represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m or Formula 2: [(A) n motif-REP] m- (A) n motif.
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the modified fibroin (6-iv) preferably has a glutamine residue content of 9% or less.
  • the modified fibroin (6-iv) preferably has a GPGXX motif content of 10% or more.
  • the aforementioned modified fibroin may contain a secretion signal for releasing the protein produced in the recombinant protein production system to the outside of the host.
  • the sequence of the secretion signal can be appropriately set according to the type of host.
  • the modified fibroin according to the present embodiment includes, for example, a nucleic acid sequence encoding the modified fibroin and one or more regulatory sequences operably linked to the nucleic acid sequence. It can be produced by expressing the nucleic acid in a host transformed with an expression vector having
  • the method for producing the nucleic acid encoding the modified fibroin is not particularly limited.
  • the nucleic acid is produced by a method such as amplification by polymerase chain reaction (PCR), cloning, modification by genetic engineering techniques, or chemical synthesis. can do.
  • the method for chemically synthesizing nucleic acids is not particularly limited.
  • AKTA oligopilot plus 10/100 (GE Healthcare Japan Co., Ltd.) is used based on the amino acid sequence information of proteins obtained from the NCBI web database.
  • a gene can be chemically synthesized by a method of linking oligonucleotides that are synthesized automatically by PCR or the like.
  • nucleic acid encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which an amino acid sequence consisting of a start codon and a His10 tag is added to the N terminus of the above amino acid sequence is synthesized. Also good.
  • Regulatory sequences are sequences that control the expression of modified fibroin in the host (for example, promoters, enhancers, ribosome binding sequences, transcription termination sequences, etc.), and can be appropriately selected depending on the type of host.
  • an inducible promoter that functions in the host cell and can induce expression of the modified fibroin may be used.
  • An inducible promoter is a promoter that can control transcription by the presence of an inducer (expression inducer), absence of a repressor molecule, or physical factors such as an increase or decrease in temperature, osmotic pressure or pH value.
  • the type of expression vector can be appropriately selected according to the type of host, such as a plasmid vector, virus vector, cosmid vector, fosmid vector, artificial chromosome vector, and the like.
  • a vector which can replicate autonomously in a host cell or can be integrated into a host chromosome and contains a promoter at a position where a nucleic acid encoding a protein can be transcribed is preferably used.
  • any of prokaryotes and eukaryotes such as yeast, filamentous fungi, insect cells, animal cells and plant cells can be preferably used.
  • prokaryotic hosts include bacteria belonging to the genus Escherichia, Brevibacillus, Serratia, Bacillus, Microbacterium, Brevibacterium, Corynebacterium, Pseudomonas and the like.
  • microorganisms belonging to the genus Escherichia include Escherichia coli.
  • microorganisms belonging to the genus Brevibacillus include Brevibacillus agri and the like.
  • microorganisms belonging to the genus Serratia include Serratia liqufaciens and the like.
  • microorganisms belonging to the genus Bacillus include Bacillus subtilis.
  • microorganisms belonging to the genus Microbacterium include microbacterium / ammonia film.
  • microorganisms belonging to the genus Brevibacterium include Brevibacterium divaricatam.
  • microorganisms belonging to the genus Corynebacterium include Corynebacterium ammoniagenes.
  • microorganisms belonging to the genus Pseudomonas include Pseudomonas putida.
  • examples of a vector for introducing a nucleic acid encoding a protein include pBTrp2 (manufactured by Boehringer Mannheim), pGEX (manufactured by Pharmacia), pUC18, pBluescriptII, pSupex, pET22b, pCold, pUB110, pNCO2 (Japanese Patent Laid-Open No. 2002-238696) and the like.
  • Examples of eukaryotic hosts include yeast and filamentous fungi (molds, etc.).
  • yeast include yeasts belonging to the genus Saccharomyces, Pichia, Schizosaccharomyces and the like.
  • Examples of the filamentous fungi include filamentous fungi belonging to the genus Aspergillus, the genus Penicillium, the genus Trichoderma and the like.
  • examples of a vector into which a nucleic acid encoding a modified fibroin is introduced include YEp13 (ATCC37115) and YEp24 (ATCC37051).
  • a method for introducing the expression vector into the host cell any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into the host cell.
  • a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)]
  • electroporation method electroporation method
  • spheroplast method protoplast method
  • lithium acetate method competent method, and the like.
  • a method for expressing a nucleic acid by a host transformed with an expression vector in addition to direct expression, secretory production, fusion protein expression, etc. can be performed according to the method described in Molecular Cloning 2nd edition, etc. .
  • the modified fibroin can be produced, for example, by culturing a host transformed with an expression vector in a culture medium, producing and accumulating the protein in the culture medium, and collecting the protein from the culture medium.
  • the method for culturing a host in a culture medium can be performed according to a method usually used for culturing a host.
  • the culture medium contains a carbon source, nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the host, and can efficiently culture the host. If so, either a natural medium or a synthetic medium may be used.
  • Any carbon source may be used as long as it can be assimilated by the above-mentioned transformed microorganism.
  • Examples thereof include glucose, fructose, sucrose, and carbohydrates such as molasses, starch and starch hydrolyzate, acetic acid and propionic acid, etc.
  • Organic acids and alcohols such as ethanol and propanol can be used.
  • the nitrogen source examples include ammonium salts of inorganic acids or organic acids such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, and ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, and peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, Casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells and digested products thereof can be used.
  • inorganic salts for example, monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate and calcium carbonate can be used.
  • Cultivation of prokaryotes such as E. coli or eukaryotes such as yeast can be performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration and agitation culture.
  • the culture temperature is, for example, 15 to 40 ° C.
  • the culture time is usually 16 hours to 7 days.
  • the pH of the culture medium during the culture is preferably maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH of the culture medium can be adjusted using an inorganic acid, an organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like.
  • antibiotics such as ampicillin and tetracycline may be added to the culture medium as necessary.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside is used when cultivating a microorganism transformed with an expression vector using the lac promoter
  • indole acrylic is used when culturing a microorganism transformed with an expression vector using the trp promoter.
  • An acid or the like may be added to the medium.
  • Isolation and purification of the expressed protein can be performed by a commonly used method.
  • the host cell is recovered by centrifugation after culturing, suspended in an aqueous buffer, and then subjected to an ultrasonic crusher, a French press, a Manton Gaurin.
  • the host cells are disrupted with a homogenizer, dynomill, or the like to obtain a cell-free extract.
  • a method usually used for protein isolation and purification that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, an organic solvent, etc.
  • Precipitation method anion exchange chromatography method using resin such as diethylaminoethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Kasei), positive using resin such as S-Sepharose FF (manufactured by Pharmacia)
  • Electrophoresis methods such as ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography using resins such as butyl sepharose and phenyl sepharose, gel filtration using molecular sieve, affinity chromatography, chromatofocusing, isoelectric focusing Using methods such as these alone or in combination, purification It is possible to obtain the goods.
  • the host cell when the protein is expressed by forming an insoluble substance in the cell, the host cell is similarly collected and then crushed and centrifuged to collect the protein insoluble substance as a precipitate fraction.
  • the recovered protein insoluble matter can be solubilized with a protein denaturant.
  • a purified protein preparation can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the protein when the protein is secreted extracellularly, the protein can be recovered from the culture supernatant. That is, a culture supernatant is obtained by treating the culture with a technique such as centrifugation, and a purified preparation can be obtained from the culture supernatant by using the same isolation and purification method as described above.
  • the artificial fibroin filament (hereinafter sometimes referred to as “artificial protein filament” or simply “protein fiber”) may contain other proteins and impurities as long as it contains artificial spider silk fibroin as a main component.
  • the artificial fibroin filament can be produced by a known spinning method. That is, for example, when a protein filament containing modified fibroin as a main component is produced, first, the modified fibroin produced according to the above-described method is converted into dimethyl sulfoxide (DMSO), N, N-dimethylformamide (DMF), formic acid.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • DMF N-dimethylformamide
  • a solvent such as hexafluoroisopropanol (HFIP)
  • HFIP hexafluoroisopropanol
  • a dissolution accelerator if necessary, and dissolved to prepare a dope solution.
  • a protein filament can be obtained by spinning by a known spinning method such as wet spinning, dry spinning, dry wet spinning or melt spinning.
  • Preferred spinning methods include wet spinning or dry wet spinning.
  • FIG. 3 is an explanatory view schematically showing an example of a spinning device for producing protein filaments.
  • a spinning device 10 illustrated in FIG. 3 is an example of a spinning device for dry and wet spinning, and includes an extrusion device 1, an undrawn yarn production device 2, a wet heat drawing device 3, and a drying device 4.
  • the dope solution 6 stored in the storage tank 7 is pushed out from the base 9 by the gear pump 8.
  • the dope solution may be filled into a cylinder and extruded from a nozzle using a syringe pump.
  • the extruded dope liquid 6 is supplied into the coagulating liquid 11 in the coagulating liquid tank 20 through the air gap 19, the solvent is removed, the modified fibroin is coagulated, and a fibrous coagulated body is formed.
  • the fibrous solidified body is supplied into the hot water 12 in the drawing bath 21 and drawn.
  • the draw ratio is determined by the speed ratio between the supply nip roller 13 and the take-up nip roller 14.
  • the stretched fibrous solidified body is supplied to the drying device 4 and dried in the yarn path 22 to obtain the protein filament 36 as the wound body 5.
  • Reference numerals 18a to 18g denote thread guides.
  • the coagulation liquid 11 may be any solvent that can be desolvated, and examples thereof include lower alcohols having 1 to 5 carbon atoms such as methanol, ethanol and 2-propanol, and acetone.
  • the coagulation liquid 11 may appropriately contain water.
  • the temperature of the coagulation liquid 11 is preferably 0 to 30 ° C.
  • the extrusion speed is preferably 0.2 to 6.0 mL / hour per hole, and 1.4 to 4.0 mL / hour More preferably it is time.
  • the distance through which the coagulated modified fibroin passes through the coagulating liquid 11 may be long enough to efficiently remove the solvent. 500 mm.
  • the take-up speed of the undrawn yarn may be, for example, 1 to 20 m / min, and preferably 1 to 3 m / min.
  • the residence time in the coagulating liquid 11 may be, for example, 0.01 to 3 minutes, and preferably 0.05 to 0.15 minutes.
  • stretching pre-stretching
  • the coagulating liquid tank 20 may be provided in multiple stages, and the stretching may be performed in each stage or a specific stage as necessary.
  • the stretching performed when obtaining the protein filament for example, the pre-stretching performed in the coagulating liquid tank 20 and the wet heat stretching performed in the stretching bath 21 are used, and dry heat stretching is also employed.
  • Wet heat stretching can be performed in warm water, in a solution obtained by adding an organic solvent or the like to warm water, or in steam heating.
  • the temperature may be, for example, 50 to 90 ° C., and preferably 75 to 85 ° C.
  • undrawn yarn or predrawn yarn
  • Dry heat stretching can be performed using an electric tubular furnace, a dry heat plate, or the like.
  • the temperature may be, for example, 140 ° C. to 270 ° C., and preferably 160 ° C. to 230 ° C.
  • an undrawn yarn or predrawn yarn
  • an undrawn yarn can be drawn, for example, 0.5 to 8 times, and preferably 1 to 4 times.
  • Wet heat stretching and dry heat stretching may be performed independently, or may be performed in multiple stages or in combination. That is, the first stage stretching is performed by wet heat stretching, the second stage stretching is performed by dry heat stretching, or the first stage stretching is performed by wet heat stretching, the second stage stretching is performed by wet heat stretching, and the third stage stretching is performed by dry heat stretching.
  • wet heat stretching and dry heat stretching can be appropriately combined.
  • the final draw ratio of the lower limit of the undrawn yarn (or predrawn yarn) is preferably more than 1 time, 2 times or more, 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, 6 times. Above, 7 times or more, 8 times or more, 9 times or more, and upper limit is preferably 40 times or less, 30 times or less, 20 times or less, 15 times or less, 14 times or less, 13 times or less 12 times or less, 11 times or less, and 10 times or less.
  • the length of the protein filament obtained by the above method can be appropriately adjusted depending on the spinning conditions, and preferably exceeds 1500 m, and may be 10,000 m or more, 15000 m or more, or 20000 m or more.
  • the artificial fibroin filament preferably has a shrinkage ratio (shrinkage ratio after drying) of more than 7% when brought into contact with an aqueous medium (for example, water having a boiling point below) and then dried. It may be 10% or more, 15% or more, 25% or more, 32% or more, 40% or more, 48% or more, 56% or more, 64% or more, or 72% or more.
  • the shrinkage after drying is usually 80% or less.
  • the artificial fibroin filament has a shrinkage ratio (shrinkage ratio when wet) of, for example, 2% or more when brought into a wet state by contacting with an aqueous medium (for example, water having a boiling point below). It may be 2.5% or more, 3% or more, 3.5% or more, 4% or more, 4.5% or more, 5% or more, 5.5% or more, or 6% or more.
  • the upper limit of the shrinkage rate when wet is not particularly limited, but 80% or less, 60% or less, 40% or less, 20% or less, 10% or less, 7% or less, 6% or less, 5% or less, 4% or less, or 3 % Or less.
  • Step b cuts the artificial fibroin filament to obtain an artificial fibroin staple, and prior to the cutting step, the artificial fibroin filament is crimped by contacting with an aqueous medium, or after the cutting step, the artificial fibroin staple A step of crimping by contacting with an aqueous medium to obtain an artificial fibroin crimped staple.
  • the process b includes a cutting process and a crimping process, and the crimping process may be performed before the cutting process or may be performed after the cutting process.
  • the cutting step is performed before the crimping step, the artificial fibroin filament before crimping is cut, and the artificial fibroin staple obtained by cutting is crimped.
  • the cutting step is performed after the crimping step, it is the artificial fibroin filament that is crimped, and the artificial fibroin filament that has been crimped is cut.
  • the cutting step can be performed using any apparatus that can cut protein fibers.
  • An example of such an apparatus is a table type fiber cutting machine (s / NO. IT-160201-NP-300).
  • the length of the staple is not particularly limited, but is preferably 20 mm or more, and may be 20 to 140 mm, 70 to 140 mm, or 20 to 70 mm.
  • the crimping step is a step in which the artificial fibroin filament or the artificial fibroin staple is brought into contact with an aqueous medium to be crimped (hereinafter sometimes referred to as “water crimping”).
  • the aqueous medium is a liquid or gas (steam) medium containing water (including water vapor).
  • the aqueous medium may be water or a mixed solution of water and a hydrophilic solvent.
  • a hydrophilic solvent it is also possible to use volatile solvents, such as ethanol and methanol, or its vapor
  • the aqueous medium may be a mixed liquid of water and a volatile solvent such as ethanol and methanol, and is preferably water or a mixed liquid of water and ethanol.
  • the drying speed after water crimping can be improved, and further, a soft texture can be imparted to the final crimped staple.
  • the ratio of water to the volatile solvent or the vapor thereof is not particularly limited.
  • the water: volatile solvent or the vapor thereof may be 10:90 to 90:10 by mass ratio.
  • the proportion of water is preferably 30% by mass or more, and may be 40% by mass or 50% by mass or more.
  • the aqueous medium is a liquid, it is preferable to disperse an oil agent in the aqueous medium. In this case, water crimping and oil adhesion can be performed simultaneously.
  • the oil agent may be, for example, a known oil agent used for general purposes such as process passability and functionality imparting such as antistatic, friction reducing, flexibility imparting, or water repellency imparting. Any of them can be used.
  • the amount of the oil agent is not particularly limited, and may be, for example, 1 to 10% by mass or 2 to 5% by mass with respect to the total amount of the oil agent and the aqueous medium.
  • the aqueous medium is preferably a liquid or gas at 10 to 230 ° C. containing water (including water vapor).
  • the temperature of the aqueous medium may be 10 ° C or higher, 25 ° C or higher, 40 ° C or higher, 60 ° C or higher, or 100 ° C or higher, and 230 ° C or lower, 120 ° C or lower, or 100 ° C or lower. More specifically, when the aqueous medium is a gas (steam), the temperature of the aqueous medium is preferably from 100 to 230 ° C, more preferably from 100 to 120 ° C. When the steam of the aqueous medium is 230 ° C. or lower, heat denaturation of the protein filament can be prevented.
  • the temperature of the aqueous medium is preferably 10 ° C. or higher, 25 ° C. or higher, or 40 ° C. or higher from the viewpoint of efficiently imparting crimp, and from the viewpoint of keeping the fiber strength of the protein filament high, 60 degrees C or less is preferable.
  • the time of contact with the aqueous medium is not particularly limited, but may be 30 seconds or more, may be 1 minute or more, or 2 minutes or more, and is preferably 10 minutes or less from the viewpoint of productivity. In the case of steam, it is considered that a large contraction rate can be obtained in a shorter time than liquid.
  • the contact with the aqueous medium may be performed under normal pressure or under reduced pressure (for example, vacuum).
  • an artificial fibroin filament or an artificial fibroin staple is immersed in an aqueous medium, an artificial medium broth filament or an artificial fibroin staple is sprayed with an aqueous medium steam, and an aqueous medium steam is filled. And a method of exposing an artificial fibroin filament or an artificial fibroin staple to the environment.
  • the aqueous medium is steam
  • the contact of the aqueous medium with the artificial fibroin filament or the artificial fibroin staple can be performed using a general steam setting apparatus.
  • the steam setting device include devices such as product name: FMSA type steam setter (manufactured by Fukushin Kogyo Co., Ltd.) and product name: EPS-400 (manufactured by Sakurai Dyeing Machinery Co., Ltd.).
  • the method for crimping the artificial fibroin filament or the artificial fibroin staple by the steam of the aqueous medium the artificial fibroin filament or the artificial fibroin staple is accommodated in the predetermined accommodation chamber, while the aqueous medium steam is introduced into the accommodation chamber. Then, the steam is brought into contact with the artificial fibroin filament or the artificial fibroin staple while adjusting the temperature in the storage chamber to the predetermined temperature (for example, 100 ° C. to 230 ° C.).
  • the crimping step of the artificial fibroin filament or the artificial fibroin staple by contact with the aqueous medium preferably no tensile force is applied to the single fiber or bundle (such as wrinkles) of the artificial fibroin filament or the artificial fibroin staple ( It is carried out in a state in which no tension is applied in the fiber axis direction, or in a state where a predetermined amount is added (a tension is applied in a predetermined amount in the fiber axis direction).
  • the degree of crimping can be controlled by adjusting the tensile force applied to the artificial fibroin filament or the artificial fibroin staple.
  • a weight of various weights is hung on the artificial fibroin filament or the artificial fibroin staple, and the filament or the staple is loaded.
  • a method of adjusting the load, fixing both ends with the filament or staple loosened, changing the amount of looseness, winding the filament around a wound body such as a paper tube or bobbin, and at that time examples thereof include a method of appropriately changing the winding force (clamping force to the paper tube or bobbin).
  • the artificial fibroin filament or the artificial fibroin staple may be further dried after contacting with an aqueous medium (for example, water having a boiling point or less).
  • an aqueous medium for example, water having a boiling point or less.
  • the drying method is not particularly limited, and the drying may be natural drying or hot air or a hot roller.
  • the drying temperature is not particularly limited, and may be, for example, 20 to 150 ° C., preferably 40 to 120 ° C., and more preferably 60 to 100 ° C.
  • the shrinkage ratio (shrinkage ratio after drying) of the artificial fibroin filament or the artificial fibroin staple after crimping and then drying is preferably more than 7%, 10% or more, 15% or more, 25 % Or more, 32% or more, 40% or more, 48% or more, 56% or more, 64% or more, or 72% or more.
  • the shrinkage after drying is usually 80% or less.
  • the artificial fibroin filament or the artificial fibroin staple has a shrinkage rate (shrinkage rate when wet) of 2% or more when brought into a wet state by contacting with an aqueous medium (for example, water having a boiling point or less). May be 2.5% or more, 3% or more, 3.5% or more, 4% or more, 4.5% or more, 5% or more, 5.5% or more, or 6% or more, Good.
  • the upper limit of the shrinkage rate when wet is not particularly limited, but 80% or less, 60% or less, 40% or less, 20% or less, 10% or less, 7% or less, 6% or less, 5% or less, 4% or less, or 3 % Or less.
  • shrinkage rate when wet can be calculated by the following equation.
  • Shrinkage ratio when wet ⁇ 1- (length of artificial fibroin filament or artificial fibroin staple made wet by contact with water / length of artificial fibroin fiber after spinning and before contact with water) ⁇ ⁇ 100 (%)
  • the cutting process and crimping process may be performed batchwise or continuously.
  • artificial fibroin staples obtained by cutting artificial fibroin filaments are put into a container containing an aqueous solvent at an appropriate temperature, contacted for a certain time, and then taken out and dried.
  • the filament is sent out from a bobbin wound with an artificial fibroin filament, immersed in an aqueous medium at an appropriate temperature, and then dried by blowing hot air or sending it on a hot roller, Cut continuously.
  • the protein-crimped staple obtained in step b is a single fiber that exhibits a soft feel and can be used for the production of composite materials such as spun yarn, nonwoven fabric, and composite.
  • the artificial fibroin fiber may shrink by a predetermined amount when it comes into contact with an aqueous medium for the first time after spinning. Since the protein crimped staple obtained by the production method of the present invention is already in contact with moisture (aqueous solvent), it absorbs moisture during storage after the staple is produced or during the production process of the product using the staple. It is possible to suppress the change (shrinkage) of the staple due to.
  • Step c is a spinning step of spinning the artificial fibroin crimped staple obtained above.
  • the spinning method is not particularly limited, and any known spinning method can be used. For example, methods such as a cotton spinning method, a lashing method, and a spinning method can be mentioned, and the spinning method is preferable from the viewpoint of bulging which is a crimping effect.
  • the machine used for these spinning methods is not particularly limited, any machine that is normally used may be used.
  • the artificial fibroin crimped staple is first opened and defibrated by a hair opener (opener), a fiber breaker (breaker) or the like.
  • spun yarn examples include, for example, a spun yarn of 100% artificial fibroin, a blended yarn of a crimped staple of 100% artificial fibroin and another protein crimped staple or a chemical fiber crimped staple, artificial fibroin and other components. And a mixed yarn of a crimped staple containing an artificial fibroin and other components and another protein crimped staple or a chemical fiber crimped staple.
  • an oil agent in advance.
  • the oil agent deposition can be performed at any stage in the production method.
  • the oil agent may be attached before the crimping process, simultaneously with the crimping process, or after the crimping process.
  • the oil agent is not particularly limited as long as it is a well-known oil agent used for general purposes such as process passability and functionality imparting such as antistatic, friction reducing, flexibility imparting, or water repellency imparting. Either can be used.
  • the protein spun yarn obtained by the method according to the present invention includes a protein crimped staple having a soft texture, and thus exhibits a relatively soft feel.
  • a protein crimped staple having a soft texture, and thus exhibits a relatively soft feel.
  • moisture aqueous medium
  • the dimensional change of the spun yarn due to moisture absorption during storage after the spun yarn production and during the production process of the product (knitted fabric etc.) using the spun yarn (Shrinkage) can be suppressed.
  • nucleic acid encoding PRT799 was synthesized.
  • the nucleic acid was added with an NdeI site at the 5 'end and an EcoRI site downstream of the stop codon.
  • the nucleic acid was cloned into a cloning vector (pUC118). Thereafter, the nucleic acid was cleaved by restriction enzyme treatment with NdeI and EcoRI, and then recombined with the protein expression vector pET-22b (+) to obtain an expression vector.
  • the seed culture was added to a jar fermenter to which 500 mL of production medium (Table 5) was added so that the OD 600 was 0.05.
  • the culture solution temperature was maintained at 37 ° C., and the culture was performed at a constant pH of 6.9. Further, the dissolved oxygen concentration in the culture solution was maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
  • a feed solution (glucose 455 g / 1 L, Yeast Extract 120 g / 1 L) was added at a rate of 1 mL / min.
  • the culture solution temperature was maintained at 37 ° C., and the culture was performed at a constant pH of 6.9.
  • the dissolved oxygen concentration in the culture solution was maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration, and cultured for 20 hours.
  • 1M isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) was added to the culture solution to a final concentration of 1 mM to induce expression of the modified fibroin.
  • the culture solution was centrifuged, and the cells were collected. Perform SDS-PAGE using cells prepared from the culture solution before and after IPTG addition, and confirm the expression of the desired modified fibroin by the appearance of the desired modified fibroin size band depending on the addition of IPTG did.
  • the washed precipitate is suspended in 8 M guanidine buffer (8 M guanidine hydrochloride, 10 mM sodium dihydrogen phosphate, 20 mM NaCl, 1 mM Tris-HCl, pH 7.0) to a concentration of 100 mg / mL, and 30 ° C. at 30 ° C. Stir with a stirrer for minutes to dissolve.
  • dialysis was performed with water using a dialysis tube (cellulose tube 36/32 manufactured by Sanko Junyaku Co., Ltd.).
  • the white aggregated protein obtained after dialysis was collected by centrifugation, water was removed with a freeze dryer, and the lyophilized powder was collected to obtain a modified spider silk fibroin “PRT799”.
  • a known dry-wet spinning was performed using the dope obtained as described above and the spinning device 10 shown in FIG. 4, and the artificial spider silk fibroin fiber was wound around a bobbin.
  • dry and wet spinning was performed under the following conditions.
  • Example 1 Artificial spider silk protein staples were produced by bundling a plurality of artificial spider silk filaments obtained in the artificial spider silk protein production example and wound on bobbins and cutting them into an average length of 40 mm with a desktop fiber cutter. .
  • the produced artificial spider silk protein staple was crimped by being immersed in water at 40 ° C. for 1 minute and then crimped, and then dried at 40 ° C. for 18 hours to obtain a crimped staple.
  • the obtained crimped staple was spun by a known spinning device.
  • the obtained spun yarn was a single yarn having a yarn count (hair number) of about 18.5 Nm. A photograph of the spun yarn is shown in FIG.
  • Example 2 Artificial spider silk protein staples were produced by bundling a plurality of artificial spider silk filaments obtained in the artificial spider silk protein production example and wound on bobbins and cutting them into an average length of 40 mm with a desktop fiber cutter. .
  • a commercially available antistatic oil was dispersed in water to a concentration of 1% by weight to obtain an oil dispersion.
  • the produced artificial spider silk protein staple was crimped by being immersed in an oil dispersion at 20 ° C. for 1 minute to be crimped, and then dried at 40 ° C. for 18 hours to obtain a crimped staple.
  • the obtained crimped staple was spun by a known spinning device.
  • the obtained spun yarn was a single yarn having a yarn count (hair number) of about 18.5 Nm. A photograph of the spun yarn is shown in FIG.
  • Artificial spider silk protein staples were produced by bundling a plurality of artificial spider silk filaments obtained in the artificial spider silk protein production example and wound on bobbins and cutting them into an average length of 40 mm with a desktop fiber cutter. .
  • the produced artificial spider silk protein staple was crimped by being immersed in a mixture of water and methanol (methanol concentration 50% by mass) at 20 ° C. for 1 minute, and then dried at 40 ° C. for 18 hours. Obtained crimped staples.
  • the obtained crimped staple was spun by a known spinning device.
  • the obtained spun yarn was a single yarn having a yarn count (hair number) of about 18.5 Nm.

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Abstract

本発明は、タンパク質フィラメントからタンパク質捲縮紡績糸を効率的に且つ低コストに製造する法を提供することを目的とする。本発明に係るタンパク質紡績糸の製造方法は、ａ）改変フィブロインを含む人工フィブロインフィラメントを準備する工程と、ｂ）上記人工フィブロインフィラメントをカットして、人工フィブロインステープルを得るカット工程と、該カット工程に先だって、上記人工フィブロインフィラメントを水性媒体と接触させて捲縮させるか、若しくは上記カット工程後に、上記人工フィブロインステープルを水性媒体と接触させて捲縮させる捲縮工程とを行うことによって人工フィブロイン捲縮ステープルを得る工程と、ｃ）上記人工フィブロイン捲縮ステープルを紡績する紡績工程と、を含む。

Description

タンパク質紡績糸の製造方法
　本発明は、タンパク質紡績糸の製造方法に関する。
　タンパク質繊維は、合成繊維とは異なって、生分解性を有し、生産や加工のエネルギーが小さいこと等から、近年の環境保全意識の高まりに応じて、様々な分野への需要の増大が見込まれている。
　天然タンパク質繊維として、シルク等のフィラメントとウール等のステープル等が知られており、前者はしなやかな風合いを有し、また後者はソフト感や保温性を有する等、それぞれが独自の特性を備えている。
　最近では、タンパク質繊維を加工して、より広い用途に適用する試みが為されており、例えば、特許文献１及び２には、天然のシルクフィラメントを捲縮加工して長繊維不織布や長繊維捲縮糸を製造する方法が提案されている。また、タンパク質フィラメントからタンパク質捲縮ステープルを製造し、このタンパク質捲縮ステープルを用いて紡績糸や不織布等を得ることも、一部で検討されている。
　タンパク質フィラメントからタンパク質捲縮紡績糸を得る方法としては、例えば、上記公報に開示の捲縮加工法にて捲縮されたシルク捲縮フィラメントをカットして、シルク捲縮ステープルを作製し、そしてこのシルク捲縮ステープルを紡績する方法が考えられる。
特開２００６－２０７０６９号公報 特開平９－１１９０３３号公報
　ところが、特許文献１に記載の捲縮方法は、押込み法等の機械加工法によってタンパク質フィラメントを捲縮するものであるため、この捲縮法を利用してタンパク質捲縮ステープルを用いて紡績糸を製造する場合には、専用の捲縮装置が必要となり、加工コストも高くなるという問題点があった。また、特許文献２に記載の捲縮方法では、捲縮工程に先だって、天然のシルクに対して無撚の潜在捲縮性を付与する前処理を行う必要があるため、この捲縮法を利用してタンパク質捲縮ステープルを用いて紡績糸を製造する際には、工程数が増え、生産性が不可避的に低下する可能性が高いという問題点があった。
　本発明は上記課題に鑑みてなされたものであり、タンパク質フィラメントからタンパク質捲縮紡績糸を効率的に且つ低コストに製造する法を提供することを目的とする。
　本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
［１］
　ａ）改変フィブロインを含む人工フィブロインフィラメントを準備する工程と、
　ｂ）上記人工フィブロインフィラメントをカットして、人工フィブロインステープルを得るカット工程と、該カット工程に先だって、上記人工フィブロインフィラメントを水性媒体と接触させて捲縮させるか、若しくは上記カット工程後に、上記人工フィブロインステープルを水性媒体と接触させて捲縮させる捲縮工程とを行うことによって人工フィブロイン捲縮ステープルを得る工程と、
　ｃ）上記人工フィブロイン捲縮ステープルを紡績する紡績工程と、
を含む、タンパク質紡績糸の製造方法。
［２］
　上記人工フィブロインフィラメントの、下記式で定義される、乾燥後の収縮率が７％超である、［１］のタンパク質紡績糸の製造方法。
　乾燥後の収縮率＝｛１－（水性媒体に接触させた後の人工フィブロインフィラメントの長さ／水性媒体に接触させる前の人工フィブロインフィラメントの長さ）｝×１００（％）。
［３］
　上記人工フィブロインフィラメントの、下記式で定義される、湿潤時収縮率が２％以上である、［１］又は［２］のタンパク質紡績糸の製造方法。
　湿潤時収縮率＝｛１－（水性溶媒に接触させて湿潤状態にした人工フィブロインフィラメントの長さ／水性溶媒と接触する前の人工フィブロインフィラメントの長さ）｝×１００（％）
［４］
　上記改変フィブロインが改変クモ糸フィブロインであり、且つ、上記人工フィブロインフィラメントが人工クモ糸フィブロインフィラメントである、［１］～［３］のいずれかのタンパク質紡績糸の製造方法。
［５］
　上記捲縮工程で使用する上記水性媒体が、水を含む１０～２３０℃の液体又は気体である、［１］～［４］のいずれかのタンパク質紡績糸の製造方法。
［６］
　上記捲縮工程が、上記人工フィブロインフィラメント又は上記人工フィブロインステープルを上記水性媒体と接触させた後に、さらに乾燥させることを含む、［１］～［５］のいずれかのタンパク質紡績糸の製造方法。
［７］
　上記捲縮工程で使用する上記水性媒体が揮発性溶媒を含む、［１］～［６］のいずれかのタンパク質紡績糸の製造方法。
　本発明のタンパク質紡績糸の製造方法の製造方法は、専用の捲縮装置を用いることなく、単に、原料のタンパク質繊維を水性媒体と接触させるだけの簡便かつ唯一の捲縮工程を採用することによって、タンパク質紡績糸を容易に効率よく低コストに製造することができる。
改変フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。 改変フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。 改変フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。 タンパク質フィラメントを製造するための紡糸装置の一例を概略的に示す説明図である。 実施例１で得られたタンパク質紡績糸の写真である。 実施例１で得られたタンパク質紡績糸の写真である。 比較例で得られたタンパク質紡績糸の写真である。
　本発明の一形態のタンパク質捲縮ステープルの製造方法は、後述の工程ａ、工程ｂ及び工程ｃを含む。
＜工程ａ＞
　工程は、改変フィブロインを含む人工フィブロインフィラメントを準備する工程である。ここで、フィラメント（「長繊維」ともいう）はステープル（「短繊維」ともいう）と共に当業者にとって自明なことである。
（改変フィブロイン）
　本実施形態に係る改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。改変フィブロインは、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側のいずれか一方又は両方に更にアミノ酸配列（Ｎ末端配列及びＣ末端配列）が付加されていてもよい。Ｎ末端配列及びＣ末端配列は、これに限定されるものではないが、典型的には、フィブロインに特徴的なアミノ酸モチーフの反復を有さない領域であり、１００残基程度のアミノ酸からなる。
　本明細書において「改変フィブロイン」とは、人為的に製造されたフィブロイン（人造フィブロイン）を意味する。改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列とは異なるフィブロインであってもよく、天然由来のフィブロインとアミノ酸配列と同一であるフィブロインであってもよい。本明細書でいう「天然由来のフィブロイン」もまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。
　「改変フィブロイン」は、本実施形態で特定されるアミノ酸配列を有するものであれば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列をそのまま利用したものであってもよく、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列に依拠してそのアミノ酸配列を改変したもの（例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列を改変することによりアミノ酸配列を改変したもの）であってもよく、また天然由来のフィブロインに依らず人工的に設計及び合成したもの（例えば、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより所望のアミノ酸配列を有するもの）であってもよい。
　本明細書において「ドメイン配列」とは、フィブロイン特有の結晶領域（典型的には、アミノ酸配列の（Ａ）ｎモチーフに相当する。）と非晶領域（典型的には、アミノ酸配列のＲＥＰに相当する。）を生じるアミノ酸配列であり、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるアミノ酸配列を意味する。ここで、（Ａ）ｎモチーフは、アラニン残基を主とするアミノ酸配列を示し、アミノ酸残基数は２～２７である。（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数は、２～２０、４～２７、４～２０、８～２０、１０～２０、４～１６、８～１６、又は１０～１６の整数であってよい。また、（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は４０％以上であればよく、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％（アラニン残基のみで構成されることを意味する。）であってもよい。ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、少なくとも７つがアラニン残基のみで構成されてもよい。ＲＥＰは２～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ＲＥＰは、１０～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列であってもよい。ｍは２～３００の整数を示し、１０～３００の整数であってもよい。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。
　改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列に対し、例えば、１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行うことで得ることができる。アミノ酸残基の置換、欠失、挿入及び／又は付加は、部分特異的突然変異誘発法等の当業者に周知の方法により行うことができる。具体的には、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１０，６４８７（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４４８（１９８３）等の文献に記載されている方法に準じて行うことができる。
　天然由来のフィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質であり、具体的には、例えば、昆虫又はクモ類が産生するフィブロインが挙げられる。
　昆虫が産生するフィブロインとしては、例えば、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍａｎｄａｒｉｎａ）、天蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ｙａｍａｍａｉ）、柞蚕（Ａｎｔｅｒａｅａ　ｐｅｒｎｙｉ）、楓蚕（Ｅｒｉｏｇｙｎａ　ｐｙｒｅｔｏｒｕｍ）、蓖蚕（Ｐｉｌｏｓａｍｉａ　Ｃｙｎｔｈｉａ　ｒｉｃｉｎｉ）、樗蚕（Ｓａｍｉａ　ｃｙｎｔｈｉａ）、栗虫（Ｃａｌｉｇｕｒａ　ｊａｐｏｎｉｃａ）、チュッサー蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ｍｙｌｉｔｔａ）、ムガ蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ａｓｓａｍａ）等のカイコが産生する絹タンパク質、スズメバチ（Ｖｅｓｐａ　ｓｉｍｉｌｌｉｍａ　ｘａｎｔｈｏｐｔｅｒａ）の幼虫が吐出するホーネットシルクタンパク質が挙げられる。
　昆虫が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、カイコ・フィブロインＬ鎖（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ７６４３０（塩基配列）、ＡＡＡ２７８４０．１（アミノ酸配列））が挙げられる。
　クモ類が産生するフィブロインとしては、例えば、オニグモ、ニワオニグモ、アカオニグモ、アオオニグモ及びマメオニグモ等のオニグモ属（Ａｒａｎｅｕｓ属）に属するクモ、ヤマシロオニグモ、イエオニグモ、ドヨウオニグモ及びサツマノミダマシ等のヒメオニグモ属（Ｎｅｏｓｃｏｎａ属）に属するクモ、コオニグモモドキ等のコオニグモモドキ属（Ｐｒｏｎｕｓ属）に属するクモ、トリノフンダマシ及びオオトリノフンダマシ等のトリノフンダマシ属（Ｃｙｒｔａｒａｃｈｎｅ属）に属するクモ、トゲグモ及びチブサトゲグモ等のトゲグモ属（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ属）に属するクモ、マメイタイセキグモ及びムツトゲイセキグモ等のイセキグモ属（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ属）に属するクモ、コガネグモ、コガタコガネグモ及びナガコガネグモ等のコガネグモ属（Ａｒｇｉｏｐｅ属）に属するクモ、キジロオヒキグモ等のオヒキグモ属（Ａｒａｃｈｎｕｒａ属）に属するクモ、ハツリグモ等のハツリグモ属（Ａｃｕｓｉｌａｓ属）に属するクモ、スズミグモ、キヌアミグモ及びハラビロスズミグモ等のスズミグモ属（Ｃｙｔｏｐｈｏｒａ属）に属するクモ、ゲホウグモ等のゲホウグモ属（Ｐｏｌｔｙｓ属）に属するクモ、ゴミグモ、ヨツデゴミグモ、マルゴミグモ及びカラスゴミグモ等のゴミグモ属（Ｃｙｃｌｏｓａ属）に属するクモ、及びヤマトカナエグモ等のカナエグモ属（Ｃｈｏｒｉｚｏｐｅｓ属）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質、並びにアシナガグモ、ヤサガタアシナガグモ、ハラビロアシダカグモ及びウロコアシナガグモ等のアシナガグモ属（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、オオシロカネグモ、チュウガタシロカネグモ及びコシロカネグモ等のシロカネグモ属（Ｌｅｕｃａｕｇｅ属）に属するクモ、ジョロウグモ及びオオジョロウグモ等のジョロウグモ属（Ｎｅｐｈｉｌａ属）に属するクモ、キンヨウグモ等のアズミグモ属（Ｍｅｎｏｓｉｒａ属）に属するクモ、ヒメアシナガグモ等のヒメアシナガグモ属（Ｄｙｓｃｈｉｒｉｏｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、クロゴケグモ、セアカゴケグモ、ハイイロゴケグモ及びジュウサンボシゴケグモ等のゴケグモ属（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ属）に属するクモ、及びユープロステノプス属（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ属）に属するクモ等のアシナガグモ科（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈｉｄａｅ科）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質が挙げられる。スパイダーシルクタンパク質としては、例えば、ＭａＳｐ（ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２）、ＡＤＦ（ＡＤＦ３及びＡＤＦ４）等の牽引糸タンパク質、ＭｉＳｐ（ＭｉＳｐ１及びＭｉＳｐ２）等が挙げられる。
　クモ類が産生するスパイダーシルクタンパク質のより具体的な例としては、例えば、ｆｉｂｒｏｉｎ－３（ａｄｆ－３）［Ａｒａｎｅｕｓ　ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１０（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５５（塩基配列））、ｆｉｂｒｏｉｎ－４（ａｄｆ－４）［Ａｒａｎｅｕｓ　ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１１（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ０４５０４（アミノ酸配列）、Ｕ３７５２０（塩基配列））、ｍａｊｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ　ｈｅｓｐｅｒｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ６８８５６（アミノ酸配列）、ＥＦ５９５２４６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　２［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖａｔａ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ３２４７２（アミノ酸配列）、ＡＦ４４１２４５（塩基配列））、ｍａｊｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ　ａｕｓｔｒａｌｉｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＪ００４２８（アミノ酸配列）、ＡＪ９７３１５５（塩基配列））、及びｍａｊｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　２［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ　ａｕｓｔｒａｌｉｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＭ３２２４９．１（アミノ酸配列）、ＡＭ４９０１６９（塩基配列））、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５８９．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５９１．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ－ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｎｅｐｈｉｌｅｎｇｙｓ　ｃｒｕｅｎｔａｔａ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ３７２７８．１（アミノ酸配列）等が挙げられる。
　天然由来のフィブロインのより具体的な例としては、更に、ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋに配列情報が登録されているフィブロインを挙げることができる。例えば、ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報のうちＤＩＶＩＳＩＯＮとしてＩＮＶを含む配列の中から、ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮにｓｐｉｄｒｏｉｎ、ａｍｐｕｌｌａｔｅ、ｆｉｂｒｏｉｎ、「ｓｉｌｋ及びｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」、又は「ｓｉｌｋ及びｐｒｏｔｅｉｎ」がキーワードとして記載されている配列、ＣＤＳから特定のｐｒｏｄｕｃｔの文字列、ＳＯＵＲＣＥからＴＩＳＳＵＥ　ＴＹＰＥに特定の文字列の記載された配列を抽出することにより確認することができる。
　改変フィブロインは、改変絹（シルク）フィブロイン（カイコが産生する絹タンパク質のアミノ酸配列を改変したもの）であってもよく、改変クモ糸フィブロイン（クモ類が産生するスパイダーシルクタンパク質のアミノ酸配列を改変したもの）であってもよい。それらのうちでも改変クモ糸フィブロインが、好適に用いられる。
　改変フィブロインの具体的な例として、クモの大瓶状腺で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する改変フィブロイン、グリシン残基の含有量が低減された改変フィブロイン、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロイン、グリシン残基の含有量、及び（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインが挙げられる。
　クモの大瓶状腺で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する改変フィブロインとしては、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質が挙げられる。クモの大瓶状腺で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する改変フィブロインにおいて、（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数は、ｎは３～２０の整数が好ましく、４～２０の整数がより好ましく、８～２０の整数が更に好ましく、１０～２０の整数が更により好ましく、４～１６の整数が更によりまた好ましく、８～１６の整数が特に好ましく、１０～１６の整数が最も好ましい。クモの大瓶状腺で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する改変フィブロインは、式１中、ＲＥＰを構成するアミノ酸残基の数は、１０～２００残基であることが好ましく、１０～１５０残基であることがより好ましく、２０～１００残基であることが更に好ましく、２０～７５残基であることが更により好ましい。クモの大瓶状腺で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるアミノ酸配列中に含まれるグリシン残基、セリン残基及びアラニン残基の合計残基数がアミノ酸残基数全体に対して、４０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることが更に好ましい。
　クモの大瓶状腺で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるアミノ酸配列の単位を含み、かつＣ末端配列が配列番号１４～１６のいずれかに示されるアミノ酸配列又は配列番号１４～１６のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であるポリペプチドであってもよい。
　配列番号１４に示されるアミノ酸配列は、ＡＤＦ３（ＧＩ：１２６３２８７、ＮＣＢＩ）のアミノ酸配列のＣ末端の５０残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列と同一であり、配列番号１５に示されるアミノ酸配列は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２０残基取り除いたアミノ酸配列と同一であり、配列番号１６に示されるアミノ酸配列は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２９残基取り除いたアミノ酸配列と同一である。
　クモの大瓶状腺で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する改変フィブロインのより具体的な例として、（１－ｉ）配列番号１７で示されるアミノ酸配列、又は（１－ｉｉ）配列番号１７で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　配列番号１７で示されるアミノ酸配列は、Ｎ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ　ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ　３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号１８）を付加したＡＤＦ３のアミノ酸配列において、第１～１３番目の反復領域をおよそ２倍になるように増やすとともに、翻訳が第１１５４番目アミノ酸残基で終止するように変異させたものである。配列番号１７で示されるアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸配列は、配列番号１６で示されるアミノ酸配列と同一である。
　（１－ｉ）の改変フィブロインは、配列番号１７で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　グリシン残基の含有量が低減された改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、グリシン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。当該改変フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＲＥＰ中の１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。
　グリシン残基の含有量が低減された改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中のＧＧＸ及びＧＰＧＸＸ（但し、Ｇはグリシン残基、Ｐはプロリン残基、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）から選ばれる少なくとも一つのモチーフ配列において、少なくとも１又は複数の当該モチーフ配列中の１つのグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
　グリシン残基の含有量が低減された改変フィブロインは、上述のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたモチーフ配列の割合が、全モチーフ配列に対して、１０％以上であってもよい。
　グリシン残基の含有量が低減された改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、上記ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列中の全ＲＥＰに含まれるＸＧＸ（但し、Ｇはグリシン残基、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列中の総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが３０％以上、４０％以上、５０％以上又は５０．９％以上であるアミノ酸配列を有するものであってもよい。（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は８３％以上であってよいが、８６％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、１００％であること（アラニン残基のみで構成されることを意味する）が更により好ましい。
　グリシン残基の含有量が低減された改変フィブロインは、ＧＧＸモチーフの１つのグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換することにより。ＸＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合を高めたものであることが好ましい。グリシン残基の含有量が低減された改変フィブロインは、ドメイン配列中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合が３０％以下であることが好ましく、２０％以下であることがより好ましく、１０％以下であることが更に好ましく、６％以下であることが更により好ましく、４％以下であることが更によりまた好ましく、２％以下であることが特に好ましい。ドメイン配列中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合は、下記ＸＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合（ｚ／ｗ）の算出方法と同様の方法で算出することができる。
　ｚ／ｗの算出方法を更に詳細に説明する。まず、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むフィブロイン（改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン）において、ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列に含まれる全てのＲＥＰから、ＸＧＸからなるアミノ酸配列を抽出する。ＸＧＸを構成するアミノ酸残基の総数がｚである。例えば、ＸＧＸからなるアミノ酸配列が５０個抽出された場合（重複はなし）、ｚは５０×３＝１５０である。また、例えば、ＸＧＸＧＸからなるアミノ酸配列の場合のように２つのＸＧＸに含まれるＸ（中央のＸ）が存在する場合は、重複分を控除して計算する（ＸＧＸＧＸの場合は５アミノ酸残基である）。ｗは、ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列に含まれる総アミノ酸残基数である。例えば、図１に示したドメイン配列の場合、ｗは４＋５０＋４＋１００＋４＋１０＋４＋２０＋４＋３０＝２３０である（最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフは除いている。）。次に、ｚをｗで除すことによって、ｚ／ｗ（％）を算出することができる。
　グリシン残基の含有量が低減された改変フィブロインにおいて、ｚ／ｗは、５０．９％以上であることが好ましく、５６．１％以上であることがより好ましく、５８．７％以上であることが更に好ましく、７０％以上であることが更により好ましく、８０％以上であることが更によりまた好ましい。ｚ／ｗの上限に特に制限はないが、例えば、９５％以下であってもよい。
　グリシン残基の含有量が低減された改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列から、グリシン残基をコードする塩基配列の少なくとも一部を置換して別のアミノ酸残基をコードするように改変することにより得ることができる。このとき、改変するグリシン残基として、ＧＧＸモチーフ及びＧＰＧＸＸモチーフにおける１つのグリシン残基を選択してもよいし、またｚ／ｗが５０．９％以上になるように置換してもよい。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から上記態様を満たすアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中のグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
　上記の別のアミノ酸残基としては、グリシン残基以外のアミノ酸残基であれば特に制限はないが、バリン（Ｖ）残基、ロイシン（Ｌ）残基、イソロイシン（Ｉ）残基、メチオニン（Ｍ）残基、プロリン（Ｐ）残基、フェニルアラニン（Ｆ）残基及びトリプトファン（Ｗ）残基等の疎水性アミノ酸残基、グルタミン（Ｑ）残基、アスパラギン（Ｎ）残基、セリン（Ｓ）残基、リシン（Ｋ）残基及びグルタミン酸（Ｅ）残基等の親水性アミノ酸残基が好ましく、バリン（Ｖ）残基、ロイシン（Ｌ）残基、イソロイシン（Ｉ）残基及びグルタミン（Ｑ）残基がより好ましく、グルタミン（Ｑ）残基が更に好ましい。
　グリシン残基の含有量が低減された改変フィブロインのより具体的な例として、（２－ｉ）配列番号３、配列番号４、配列番号１０若しくは配列番号１２で示されるアミノ酸配列、又は（２－ｉｉ）配列番号３、配列番号４、配列番号１０若しくは配列番号１２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
　（２－ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号３で示されるアミノ酸配列は、天然由来のフィブロインに相当する配列番号１で示されるアミノ酸配列のＲＥＰ中の全てのＧＧＸをＧＱＸに置換したものである。配列番号４で示されるアミノ酸配列は、配列番号３で示されるアミノ酸配列から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号１０で示されるアミノ酸配列は、配列番号４で示されるアミノ酸配列の各（Ａ）ｎモチーフのＣ末端側に２つのアラニン残基を挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、配列番号４の分子量とほぼ同じとなるようにＮ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号１２で示されるアミノ酸配列は、配列番号９で示されるアミノ酸配列中に存在する２０個のドメイン配列の領域（但し、当該領域のＣ末端側の数アミノ酸残基が置換されている。）を４回繰り返した配列のＣ末端にＨｉｓタグが付加されたものである。
　配列番号１で示されるアミノ酸配列（天然由来のフィブロインに相当）におけるｚ／ｗの値は、４６．８％である。配列番号３で示されるアミノ酸配列、配列番号４で示されるアミノ酸配列、配列番号１０で示されるアミノ酸配列、及び配列番号１２で示されるアミノ酸配列におけるｚ／ｗの値は、それぞれ５８．７％、７０．１％、６６．１％及び７０．０％である。また、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号１０及び配列番号１２で示されるアミノ酸配列のギザ比率（後述する）１：１．８～１１．３におけるｘ／ｙの値は、それぞれ１５．０％、１５．０％、９３．４％、９２．７％及び８９．３％である。
　（２－ｉ）の改変フィブロインは、配列番号３、配列番号４、配列番号１０又は配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（２－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号３、配列番号４、配列番号１０又は配列番号１２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（２－ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（２－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号３、配列番号４、配列番号１０又は配列番号１２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＲＥＰ中に含まれるＸＧＸ（但し、Ｇはグリシン残基、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列中のＲＥＰの総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが５０．９％以上であることが好ましい。
　上述の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、改変フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
　タグ配列として、例えば、他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用したアフィニティタグを挙げることができる。アフィニティタグの具体例として、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を挙げることができる。Ｈｉｓタグは、ヒスチジン残基が４から１０個程度並んだ短いペプチドで、ニッケル等の金属イオンと特異的に結合する性質があるため、金属キレートクロマトグラフィー（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　ｍｅｔａｌ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による改変フィブロインの単離に利用することができる。タグ配列の具体例として、例えば、配列番号５で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグを含むアミノ酸配列）が挙げられる。
　また、グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列を利用することもできる。
　さらに、抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用することもできる。抗原性を示すペプチド（エピトープ）をタグ配列として付加することにより、当該エピトープに対する抗体を結合させることができる。エピトープタグとして、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列）タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等を挙げることができる。エピトープタグを利用することにより、高い特異性で容易に改変フィブロインを精製することができる。
　さらにタグ配列を特定のプロテアーゼで切り離せるようにしたものも使用することができる。当該タグ配列を介して吸着したタンパク質をプロテアーゼ処理することにより、タグ配列を切り離した改変フィブロインを回収することもできる。
　タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（２－ｉｉｉ）配列番号８、配列番号９、配列番号１１若しく配列番号１３で示されるアミノ酸配列、又は（２－ｉｖ）配列番号８、配列番号９、配列番号１１若しく配列番号１３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
　配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１１及び配列番号１３で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１０及び配列番号１２で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号５で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。
　（２－ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号８、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（２－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号８、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（２－ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（２－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号８、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＲＥＰ中に含まれるＸＧＸ（但し、Ｇはグリシン残基、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列中のＲＥＰの総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが５０．９％以上であることが好ましい。
　上述の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
　（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。当該改変フィブロインのドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、少なくとも１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。
　（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインは、天然由来のフィブロインから（Ａ）ｎモチーフを１０～４０％欠失させたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
　（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって１～３つの（Ａ）ｎモチーフ毎に１つの（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
　（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって２つ連続した（Ａ）ｎモチーフの欠失、及び１つの（Ａ）ｎモチーフの欠失がこの順に繰り返されたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
　（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインは、そのドメイン配列が、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
　（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８～１１．３となる隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが２０％以上、３０％以上、４０％以上又は５０％以上であるアミノ酸配列を有するものであってもよい。（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は８３％以上であってよいが、８６％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、１００％であること（アラニン残基のみで構成されることを意味する）が更により好ましい。
　ｘ／ｙの算出方法を図１を参照しながら更に詳細に説明する。図１には、改変フィブロインからＮ末端配列及びＣ末端配列を除いたドメイン配列を示す。当該ドメイン配列は、Ｎ末端側（左側）から（Ａ）ｎモチーフ－第１のＲＥＰ（５０アミノ酸残基）－（Ａ）ｎモチーフ－第２のＲＥＰ（１００アミノ酸残基）－（Ａ）ｎモチーフ－第３のＲＥＰ（１０アミノ酸残基）－（Ａ）ｎモチーフ－第４のＲＥＰ（２０アミノ酸残基）－（Ａ）ｎモチーフ－第５のＲＥＰ（３０アミノ酸残基）－（Ａ）ｎモチーフという配列を有する。
　隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットは、重複がないように、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、順次選択する。このとき、選択されない［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットが存在してもよい。図１には、パターン１（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較、及び第３のＲＥＰと第４のＲＥＰの比較）、パターン２（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較、及び第４のＲＥＰと第５のＲＥＰの比較）、パターン３（第２のＲＥＰと第３のＲＥＰの比較、及び第４のＲＥＰと第５のＲＥＰの比較）、パターン４（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較）を示した。なお、これ以外にも選択方法は存在する。
　次に各パターンについて、選択した隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニット中の各ＲＥＰのアミノ酸残基数を比較する。比較は、よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときの、他方のアミノ酸残基数の比を求めることによって行う。例えば、第１のＲＥＰ（５０アミノ酸残基）と第２のＲＥＰ（１００アミノ酸残基）の比較の場合、よりアミノ酸残基数の少ない第１のＲＥＰを１としたとき、第２のＲＥＰのアミノ酸残基数の比は、１００／５０＝２である。同様に、第４のＲＥＰ（２０アミノ酸残基）と第５のＲＥＰ（３０アミノ酸残基）の比較の場合、よりアミノ酸残基数の少ない第４のＲＥＰを１としたとき、第５のＲＥＰのアミノ酸残基数の比は、３０／２０＝１．５である。
　図１中、よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときに、他方のアミノ酸残基数の比が１．８～１１．３となる［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットの組を実線で示した。以下このような比をギザ比率と呼ぶ。よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときに、他方のアミノ酸残基数の比が１．８未満又は１１．３超となる［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットの組は破線で示した。
　各パターンにおいて、実線で示した隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットの全てのアミノ酸残基数を足し合わせる（ＲＥＰのみではなく、（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数もである。）。そして、足し合わせた合計値を比較して、当該合計値が最大となるパターンの合計値（合計値の最大値）をｘとする。図１に示した例では、パターン１の合計値が最大である。
　次に、ｘをドメイン配列の総アミノ酸残基数ｙで除すことによって、ｘ／ｙ（％）を算出することができる。
　（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインにおいて、ｘ／ｙは、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、６５％以上であることが更に好ましく、７０％以上であることが更により好ましく、７５％以上であることが更によりまた好ましく、８０％以上であることが特に好ましい。ｘ／ｙの上限に特に制限はなく、例えば、１００％以下であってよい。ギザ比率が１：１．９～１１．３の場合には、ｘ／ｙは８９．６％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．８～３．４の場合には、ｘ／ｙは７７．１％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．９～８．４の場合には、ｘ／ｙは７５．９％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．９～４．１の場合には、ｘ／ｙは６４．２％以上であることが好ましい。
　（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインが、ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）ｎモチーフの少なくとも７つがアラニン残基のみで構成される改変フィブロインである場合、ｘ／ｙは、４６．４％以上であることが好ましく、５０％以上であることがより好ましく、５５％以上であることが更に好ましく、６０％以上であることが更により好ましく、７０％以上であることが更によりまた好ましく、８０％以上であることが特に好ましい。ｘ／ｙの上限に特に制限はなく、１００％以下であればよい。
　（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列から、ｘ／ｙが６４．２％以上になるように（Ａ）ｎモチーフをコードする配列の１又は複数を欠失させることにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、ｘ／ｙが６４．２％以上になるように１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
　（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインのより具体的な例として、（３－ｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号１０若しくは配列番号１２で示されるアミノ酸配列、又は（３－ｉｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号１０若しくは配列番号１２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
　（３－ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号２で示されるアミノ酸配列は、天然由来のフィブロインに相当する配列番号１で示されるアミノ酸配列から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号４で示されるアミノ酸配列は、配列番号２で示されるアミノ酸配列のＲＥＰ中の全てのＧＧＸをＧＱＸに置換したものである。配列番号１０で示されるアミノ酸配列は、配列番号４で示されるアミノ酸配列の各（Ａ）ｎモチーフのＣ末端側に２つのアラニン残基を挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、配列番号４の分子量とほぼ同じとなるようにＮ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号１２で示されるアミノ酸配列は、配列番号９で示されるアミノ酸配列中に存在する２０個のドメイン配列の領域（但し、当該領域のＣ末端側の数アミノ酸残基が置換されている。）を４回繰り返した配列のＣ末端にＨｉｓタグが付加されたものである。
　配列番号１で示されるアミノ酸配列（天然由来のフィブロインに相当）のギザ比率１：１．８～１１．３におけるｘ／ｙの値は１５．０％である。配列番号２で示されるアミノ酸配列、及び配列番号４で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、いずれも９３．４％である。配列番号１０で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、９２．７％である。配列番号１２で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、８９．３％である。配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号１０及び配列番号１２で示されるアミノ酸配列におけるｚ／ｗの値は、それぞれ４６．８％、５６．２％、７０．１％、６６．１％及び７０．０％である。
　（３－ｉ）の改変フィブロインは、配列番号２、配列番号４、配列番号１０又は配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（３－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号２、配列番号４、配列番号１０又は配列番号１２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（３－ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（３－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号２、配列番号４、配列番号１０又は配列番号１２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＮ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８～１１．３（ギザ比率が１：１．８～１１．３）となる隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが６４．２％以上であることが好ましい。
　上述の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方に上述したタグ配列を含んでいてもよい。
　タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（３－ｉｉｉ）配列番号７、配列番号９、配列番号１１若しく配列番号１３で示されるアミノ酸配列、又は（２－ｉｖ）配列番号７、配列番号９、配列番号１１若しく配列番号１３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
　配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１１及び配列番号１３で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１０及び配列番号１２で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号５で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグを含む）を付加したものである。
　（３－ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号７、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（３－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号７、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（３－ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（３－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号７、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＮ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８～１１．３となる隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが６４．２％以上であることが好ましい。
　上述の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
　グリシン残基の含有量、及び（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたことに加え、グリシン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有するものである。当該改変フィブロインのドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、少なくとも１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに加え、更に少なくともＲＥＰ中の１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。すなわち、上述したグリシン残基の含有量が低減された改変フィブロインと、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインの特徴を併せ持つ改変フィブロインである。具体的な態様等は、グリシン残基の含有量が低減された改変フィブロイン、及び、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインで説明したとおりである。
　グリシン残基の含有量、及び（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインのより具体的な例として、（４－ｉ）配列番号４、配列番号１０若しくは配列番号１２で示されるアミノ酸配列、又は（４－ｉｉ）配列番号４、配列番号１０若しくは配列番号１２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。配列番号４、配列番号１０若しくは配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロインの具体的な態様は上述のとおりである。
　他の実施形態に係る改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むアミノ酸配列を有するものであってよい。
　局所的に疎水性指標の大きい領域は、連続する２～４アミノ酸残基で構成されていることが好ましい。
　上述の疎水性指標の大きいアミノ酸残基は、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）から選ばれるアミノ酸残基であることがより好ましい。
　本実施形態に係る改変フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する改変に加え、更に、天然由来のフィブロインと比較して、１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変があってもよい。
　本実施形態に係る改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がマイナスであるアミノ酸残基）を疎水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基）に置換すること、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基に置換したこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基に置換したこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
　さらに他の実施形態に係る改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を上記ドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を上記ドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であるアミノ酸配列を有してもよい。
　アミノ酸残基の疎水性指標については、公知の指標（Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ　ｉｎｄｅｘ：Ｋｙｔｅ　Ｊ，＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ　Ｒ（１９８２）“Ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ　ｔｈｅ　ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ　ｃｈａｒａｃｔｅｒ　ｏｆ　ａ　ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７，ｐｐ．１０５－１３２）を使用する。具体的には、各アミノ酸の疎水性指標（ハイドロパシー・インデックス、以下「ＨＩ」とも記す。）は、下記表１に示すとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ｐ／ｑの算出方法を更に詳細に説明する。算出には、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列（以下、「配列Ａ」とする）を用いる。まず、配列Ａに含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値を算出する。疎水性指標の平均値は、連続する４アミノ酸残基に含まれる各アミノ酸残基のＨＩの総和を４（アミノ酸残基数）で除して求める。疎水性指標の平均値は、全ての連続する４アミノ酸残基について求める（各アミノ酸残基は、１～４回平均値の算出に用いられる。）。次いで、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域を特定する。あるアミノ酸残基が、複数の「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」に該当する場合であっても、領域中には１アミノ酸残基として含まれることになる。そして、当該領域に含まれるアミノ酸残基の総数がｐである。また、配列Ａに含まれるアミノ酸残基の総数がｑである。
　例えば、「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が２０カ所抽出された場合（重複はなし）、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域には、連続する４アミノ酸残基（重複はなし）が２０含まれることになり、ｐは２０×４＝８０である。また、例えば、２つの「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が１アミノ酸残基だけ重複して存在する場合、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域には、７アミノ酸残基含まれることになる（ｐ＝２×４－１＝７。「－１」は重複分の控除である。）。例えば、図２に示したドメイン配列の場合、「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が重複せずに７つ存在するため、ｐは７×４＝２８となる。また、例えば、図２に示したドメイン配列の場合、ｑは４＋５０＋４＋４０＋４＋１０＋４＋２０＋４＋３０＝１７０である（Ｃ末端側の最後に存在する（Ａ）ｎモチーフは含めない）。次に、ｐをｑで除すことによって、ｐ／ｑ（％）を算出することができる。図２の場合２８／１７０＝１６．４７％となる。
　本実施形態に係る改変フィブロインにおいて、ｐ／ｑは、６．２％以上であることが好ましく、７％以上であることがより好ましく、１０％以上であることが更に好ましく、２０％以上であることが更により好ましく、３０％以上であることが更によりまた好ましい。ｐ／ｑの上限は、特に制限されないが、例えば、４５％以下であってもよい。
　本実施形態に係る改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインのアミノ酸配列を、上記のｐ／ｑの条件を満たすように、ＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がマイナスであるアミノ酸残基）を疎水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基）に置換すること、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入することにより、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むアミノ酸配列に改変することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から上記のｐ／ｑの条件を満たすアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当する改変を行ってもよい。
　疎水性指標の大きいアミノ酸残基としては、特に制限はないが、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）が好ましく、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びイソロイシン（Ｉ）がより好ましい。
　改変フィブロインの別の具体的な例として、（５－ｉ）配列番号２０、配列番号２２若しくは配列番号２３で示されるアミノ酸配列、又は（５－ｉｉ）配列番号２０、配列番号２２若しくは配列番号２３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
　（５－ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号１９で示されるアミノ酸配列は、天然由来のフィブロインの（Ａ）ｎモチーフ中のアラニン残基が連続するアミノ酸配列をアラニン残基が連続する数を５つになるよう欠失したものである。配列番号２０で示されるアミノ酸配列は、配列番号１９で示されるアミノ酸配列に対し、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を２カ所挿入し、かつ配列番号１９で示されるアミノ酸配列の分子量とほぼ同じとなるようにＮ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号２１で示されるアミノ酸配列は、配列番号１９で示されるアミノ酸配列に対し、各（Ａ）ｎモチーフのＣ末端側に２つのアラニン残基を挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、かつ配列番号１９で示されるアミノ酸配列の分子量とほぼ同じとなるようにＮ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号２２で示されるアミノ酸配列は、配列番号２１で示されるアミノ酸配列に対し、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を１カ所挿入したものである。配列番号２３で示されるアミノ酸配列は、配列番号２１で示されるアミノ酸配列に対し、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を２カ所挿入したものである。
　（５－ｉ）の改変フィブロインは、配列番号２０、配列番号２２又は配列番号２３で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（５－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号２０、配列番号２２又は配列番号２３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（５－ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（５－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号２０、配列番号２２又は配列番号２３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であることが好ましい。
　上述の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。
　タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（５－ｉｉｉ）配列番号２４、配列番号２５若しくは配列番号２６で示されるアミノ酸配列、又は（５－ｉｖ）配列番号２４、配列番号２５若しくは配列番号２６で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
　配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２０、配列番号２２及び配列番号２３で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号５で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。
　（５－ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号２４、配列番号２５若しくは配列番号２６で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（５－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号２４、配列番号２５若しくは配列番号２６で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（５－ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（５－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号２４、配列番号２５若しくは配列番号２６で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であることが好ましい。
　上述の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
　さらに他の実施形態に係る改変フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、グルタミン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。
　本実施形態に係る改変フィブロインは、ＲＥＰのアミノ酸配列中に、ＧＧＸモチーフ及びＧＰＧＸＸモチーフから選ばれる少なくとも一つのモチーフが含まれていることが好ましい。
　本実施形態に係る改変フィブロインが、ＲＥＰ中にＧＰＧＸＸモチーフを含む場合、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率は、通常１％以上であり、５％以上であってもよく、１０％以上であるのが好ましい。ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の上限に特に制限はなく、５０％以下であってよく、３０％以下であってもよい。
　本明細書において、「ＧＰＧＸＸモチーフ含有率」は、以下の方法により算出される値である。
　式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロイン（改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン）において、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域に含まれるＧＰＧＸＸモチーフの個数の総数を３倍した数（即ち、ＧＰＧＸＸモチーフ中のＧ及びＰの総数に相当）をｓとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率はｓ／ｔとして算出される。
　ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としているのは、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列」（ＲＥＰに相当する配列）には、フィブロインに特徴的な配列と相関性の低い配列が含まれることがあり、ｍが小さい場合（つまり、ドメイン配列が短い場合）、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出結果に影響するので、この影響を排除するためである。なお、ＲＥＰのＣ末端に「ＧＰＧＸＸモチーフ」が位置する場合、「ＸＸ」が例えば「ＡＡ」の場合であっても、「ＧＰＧＸＸモチーフ」として扱う。
　図３は、改変フィブロインのドメイン配列を示す模式図である。図３を参照しながらＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出方法を具体的に説明する。まず、図３に示した改変フィブロインのドメイン配列（「［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフ」タイプである。）では、全てのＲＥＰが「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」（図３中、「領域Ａ」で示した配列。）に含まれているため、ｓを算出するためのＧＰＧＸＸモチーフの個数は７であり、ｓは７×３＝２１となる。同様に、全てのＲＥＰが「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」（図１中、「領域Ａ」で示した配列。）に含まれているため、当該配列から更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数ｔは５０＋４０＋１０＋２０＋３０＝１５０である。次に、ｓをｔで除すことによって、ｓ／ｔ（％）を算出することができ、図３の改変フィブロインの場合２１／１５０＝１４．０％となる。
　本実施形態に係る改変フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましく、７％以下であることがより好ましく、４％以下であることが更に好ましく、０％であることが特に好ましい。
　本明細書において、「グルタミン残基含有率」は、以下の方法により算出される値である。
　式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロイン（改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン）において、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列（図３の「領域Ａ」に相当する配列。）に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域に含まれるグルタミン残基の総数をｕとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、グルタミン残基含有率はｕ／ｔとして算出される。グルタミン残基含有率の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。
　本実施形態に係る改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、又は他のアミノ酸残基に置換したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってよい。
　「他のアミノ酸残基」は、グルタミン残基以外のアミノ酸残基であればよいが、グルタミン残基よりも疎水性指標の大きいアミノ酸残基であることが好ましい。アミノ酸残基の疎水性指標は表１に示すとおりである。
　表１に示すとおり、グルタミン残基よりも疎水性指標の大きいアミノ酸残基としては、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、プロリン（Ｐ）及びヒスチジン（Ｈ）から選ばれるアミノ酸残基を挙げることができる。これらの中でも、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）から選ばれるアミノ酸残基であることがより好ましく、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びフェニルアラニン（Ｆ）から選ばれるアミノ酸残基であることが更に好ましい。
　本実施形態に係る改変フィブロインは、ＲＥＰの疎水性度が、－０．８以上であることが好ましく、－０．７以上であることがより好ましく、０以上であることが更に好ましく、０．３以上であることが更により好ましく、０．４以上であることが特に好ましい。ＲＥＰの疎水性度の上限に特に制限はなく、１．０以下であってよく、０．７以下であってもよい。
　本明細書において、「ＲＥＰの疎水性度」は、以下の方法により算出される値である。
　式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロイン（改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン）において、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列（図１の「領域Ａ」に相当する配列。）に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域の各アミノ酸残基の疎水性指標の総和をｖとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、ＲＥＰの疎水性度はｖ／ｔとして算出される。ＲＥＰの疎水性度の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。
　本実施形態に係る改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変があってもよい。
　本実施形態に係る改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列からＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失させること、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。
　本発明に係る改変フィブロインのより具体的な例として、（６－ｉ）配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３８若しくは配列番号３９で示されるアミノ酸配列を含む、改変フィブロイン、又は（６－ｉｉ）配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３８若しくは配列番号３９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
　（６－ｉ）の改変フィブロインについて説明する。
　配列番号４で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）は、天然由来のフィブロインであるＮｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、（Ａ）ｎモチーフ中のアラニン残基が連続するアミノ酸配列をアラニン残基が連続する数を５つにする等の生産性を向上させるためのアミノ酸の改変を行ったものである。一方、Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０は、グルタミン残基（Ｑ）の改変は行っていないため、グルタミン残基含有率は、天然由来のフィブロインのグルタミン残基含有率と同程度である。
　配列番号２７で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ８８８）は、Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０（配列番号４）中のＱＱを全てＶＬに置換したものである。
　配列番号２８で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ９６５）は、Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０（配列番号４）中のＱＱを全てＴＳに置換し、かつ残りのＱをＡに置換したものである。
　配列番号２９で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ８８９）は、Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０（配列番号４）中のＱＱを全てＶＬに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。
　配列番号３０で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ９１６）は、Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０（配列番号４）中のＱＱを全てＶＩに置換し、かつ残りのＱをＬに置換したものである。
　配列番号３１で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ９１８）は、Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０（配列番号４）中のＱＱを全てＶＦに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。
　配列番号３７で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ５２５）は、Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０（配列番号４）に対し、アラニン残基が連続する領域（Ａ５）に２つのアラニン残基を挿入し、Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０の分子量とほぼ同じになるよう、Ｃ末端側のドメイン配列２つを欠失させ、かつグルタミン残基（Ｑ）１３箇所をセリン残基（Ｓ）又はプロリン残基（Ｐ）に置換したものである。
　配列番号３８で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ６９９）は、Ｍ＿ＰＲＴ５２５（配列番号３７）中のＱＱを全てＶＬに置換したものである。
　配列番号３９で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ６９８）は、Ｍ＿ＰＲＴ５２５（配列番号３７）中のＱＱを全てＶＬに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。
　配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３８及び配列番号３９で示されるアミノ酸配列は、いずれもグルタミン残基含有率は９％以下である（表２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（６－ｉ）の改変フィブロインは、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３８又は配列番号３９で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（６－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３８又は配列番号３９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（６－ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（６－ｉｉ）の改変フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましい。また、（６－ｉｉ）の改変フィブロインは、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率が１０％以上であることが好ましい。
　上述の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、改変フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
　タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（６－ｉｉｉ）配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号４０若しくは配列番号４１で示されるアミノ酸配列を含む、改変フィブロイン、又は（６－ｉｖ）配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号４０若しくは配列番号４１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
　配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号４０及び配列番号４１で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３８及び配列番号３９で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号５で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。Ｎ末端にタグ配列を付加しただけであるため、グルタミン残基含有率に変化はなく、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号４０及び配列番号４１で示されるアミノ酸配列は、いずれもグルタミン残基含有率が９％以下である（表３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　（６－ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号４０又は配列番号４１で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（６－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号４０又は配列番号４１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（６－ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（６－ｉｖ）の改変フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましい。また、（６－ｉｖ）の改変フィブロインは、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率が１０％以上であることが好ましい。
　上述の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
（改変フィブロインの製造方法）
　本実施形態に係る改変フィブロイン（以下、単に「タンパク質」ともいう場合がある）は、例えば、当該改変フィブロインをコードする核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する発現ベクターで形質転換された宿主により、当該核酸を発現させることにより生産することができる。
　改変フィブロインをコードする核酸の製造方法は、特に制限されない。例えば、天然のフィブロインをコードする遺伝子を利用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅しクローニングし、遺伝子工学的手法により改変する方法、又は、化学的に合成する方法によって、当該核酸を製造することができる。核酸の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどより入手したタンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ　１０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結する方法によって遺伝子を化学的に合成することができる。この際に、タンパク質の精製及び／又は確認を容易にするため、上記のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸を合成してもよい。
　調節配列は、宿主における改変フィブロインの発現を制御する配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等）であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。プロモーターとして、宿主細胞中で機能し、改変フィブロインを発現誘導可能な誘導性プロモーターを用いてもよい。誘導性プロモーターは、誘導物質（発現誘導剤）の存在、リプレッサー分子の非存在、又は温度、浸透圧若しくはｐＨ値の上昇若しくは低下等の物理的要因により、転写を制御できるプロモーターである。
　発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主の染色体中への組込みが可能で、タンパク質をコードする核酸を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが好適に用いられる。
　宿主として、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも好適に用いることができる。
　原核生物の宿主の好ましい例として、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する細菌を挙げることができる。エシェリヒア属に属する微生物として、例えば、エシェリヒア・コリ等を挙げることができる。ブレビバチルス属に属する微生物として、例えば、ブレビバチルス・アグリ等を挙げることができる。セラチア属に属する微生物として、例えば、セラチア・リクエファシエンス等を挙げることができる。バチルス属に属する微生物として、例えば、バチルス・サチラス等を挙げることができる。ミクロバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム等を挙げることができる。ブレビバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ブレビバクテリウム・ディバリカタム等を挙げることができる。コリネバクテリウム属に属する微生物として、例えば、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス等を挙げることができる。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物として、例えば、シュードモナス・プチダ等を挙げることができる。
　原核生物を宿主とする場合、タンパク質をコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２（ベーリンガーマンハイム社製）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＣｏｌｄ、ｐＵＢ１１０、ｐＮＣＯ２（特開２００２－２３８５６９号公報）等を挙げることができる。
　真核生物の宿主としては、例えば、酵母及び糸状真菌（カビ等）を挙げることができる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属等に属する酵母を挙げることができる。糸状真菌としては、例えば、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属等に属する糸状真菌を挙げることができる。
　真核生物を宿主とする場合、改変フィブロインをコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）等を挙げることができる。上記宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、コンピテント法等を挙げることができる。
　発現ベクターで形質転換された宿主による核酸の発現方法としては、直接発現のほか、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
　改変フィブロインは、例えば、発現ベクターで形質転換された宿主を培養培地中で培養し、培養培地中に当該タンパク質を生成蓄積させ、該培養培地から採取することにより製造することができる。宿主を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。
　宿主が、大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、培養培地として、宿主が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有し、宿主の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
　炭素源としては、上記形質転換微生物が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類を用いることができる。窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。無機塩類としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。
　大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物の培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は、例えば、１５～４０℃である。培養時間は、通常１６時間～７日間である。培養中の培養培地のｐＨは３．０～９．０に保持することが好ましい。培養培地のｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。
　また、培養中、必要に応じて、アンピシリン及びテトラサイクリン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
　発現させたタンパク質の単離、精製は通常用いられている方法で行うことができる。例えば、当該タンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、宿主細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁した後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー及びダイノミル等により宿主細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法、すなわち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ　ＨＰＡ－７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の方法を単独又は組み合わせて使用し、精製標品を得ることができる。
　また、タンパク質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に宿主細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてタンパク質の不溶体を回収する。回収したタンパク質の不溶体はタンパク質変性剤で可溶化することができる。該操作の後、上記と同様の単離精製法によりタンパク質の精製標品を得ることができる。当該タンパク質が細胞外に分泌された場合には、培養上清から当該タンパク質を回収することができる。すなわち、培養物を遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、その培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
（人工フィブロインフィラメントの製造方法）
　人工フィブロインフィラメント（以下、「人工タンパク質フィラメント」や単に「タンパク質繊維」という場合がある）は、人工クモ糸フィブロインを主成分として含んでいれば、その他のタンパク質や夾雑物を含んでいてもよい。人工フィブロインフィラメントは、公知の紡糸方法によって製造することができる。すなわち、例えば、改変フィブロインを主成分として含むタンパク質フィラメントを製造する際には、まず、上述した方法に準じて製造した改変フィブロインをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ギ酸、又はヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）等の溶媒に、必要に応じて、溶解促進剤としての無機塩と共に添加し、溶解してドープ液を作製する。次いで、このドープ液を用いて、湿式紡糸、乾式紡糸、乾湿式紡糸又は溶融紡糸等の公知の紡糸方法により紡糸して、タンパク質フィラメントを得ることができる。好ましい紡糸方法としては、湿式紡糸又は乾湿式紡糸を挙げることができる。
　図３は、タンパク質フィラメントを製造するための紡糸装置の一例を概略的に示す説明図である。図３に示す紡糸装置１０は、乾湿式紡糸用の紡糸装置の一例であり、押出し装置１と、未延伸糸製造装置２と、湿熱延伸装置３と、乾燥装置４とを有している。
　紡糸装置１０を使用した紡糸方法を説明する。まず、貯槽７に貯蔵されたドープ液６が、ギアポンプ８により口金９から押し出される。ラボスケールにおいては、ドープ液をシリンダーに充填し、シリンジポンプを用いてノズルから押し出してもよい。次いで、押し出されたドープ液６は、エアギャップ１９を経て、凝固液槽２０の凝固液１１内に供給され、溶媒が除去されて、改変フィブロインが凝固し、繊維状凝固体が形成される。次いで、繊維状凝固体が、延伸浴槽２１内の温水１２中に供給されて、延伸される。延伸倍率は供給ニップローラ１３と引き取りニップローラ１４との速度比によって決まる。その後、延伸された繊維状凝固体が、乾燥装置４に供給され、糸道２２内で乾燥されて、タンパク質フィラメント３６が、巻糸体５として得られる。１８ａ～１８ｇは糸ガイドである。
　凝固液１１としては、脱溶媒できる溶媒であればよく、例えば、メタノール、エタノール及び２－プロパノール等の炭素数１～５の低級アルコール、並びにアセトン等を挙げることができる。凝固液１１は、適宜水を含んでいてもよい。凝固液１１の温度は、０～３０℃であることが好ましい。口金９として、直径０．１～０．６ｍｍのノズルを有するシリンジポンプを使用する場合、押出し速度は１ホール当たり、０．２～６．０ｍＬ／時間が好ましく、１．４～４．０ｍＬ／時間であることがより好ましい。凝固した改変フィブロインが凝固液１１中を通過する距離（実質的には、糸ガイド１８ａから糸ガイド１８ｂまでの距離）は、脱溶媒が効率的に行える長さがあればよく、例えば、２００～５００ｍｍである。未延伸糸の引き取り速度は、例えば、１～２０ｍ／分であってよく、１～３ｍ／分であることが好ましい。凝固液１１中での滞留時間は、例えば、０．０１～３分であってよく、０．０５～０．１５分であることが好ましい。また、凝固液１１中で延伸（前延伸）をしてもよい。凝固液槽２０は多段設けてもよく、また延伸は必要に応じて、各段、又は特定の段で行ってもよい。
　なお、タンパク質フィラメントを得る際に実施される延伸は、例えば、上記した凝固液槽２０内で行う前延伸、及び延伸浴槽２１内で行う湿熱延伸の他、乾熱延伸も採用される。
　湿熱延伸は、温水中、温水に有機溶剤等を加えた溶液中、又はスチーム加熱中で行うことができる。温度としては、例えば、５０～９０℃であってよく、７５～８５℃が好ましい。湿熱延伸では、未延伸糸（又は前延伸糸）を、例えば、１～１０倍延伸することができ、２～８倍延伸することが好ましい。
　乾熱延伸は、電気管状炉、乾熱板等を使用して行うことができる。温度としては、例えば、１４０℃～２７０℃であってよく、１６０℃～２３０℃が好ましい。乾熱延伸では、未延伸糸（又は前延伸糸）を、例えば、０．５～８倍延伸することができ、１～４倍延伸することが好ましい。
　湿熱延伸及び乾熱延伸はそれぞれ単独で行ってもよく、またこれらを多段で、又は組み合わせて行ってもよい。すなわち、一段目延伸を湿熱延伸で行い、二段目延伸を乾熱延伸で行う、又は一段目延伸を湿熱延伸行い、二段目延伸を湿熱延伸行い、更に三段目延伸を乾熱延伸で行う等、湿熱延伸及び乾熱延伸を適宜組み合わせて行うことができる。
　最終的な延伸倍率は、その下限値が、未延伸糸（又は前延伸糸）に対して、好ましくは、１倍超、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上のうちのいずれかであり、上限値が、好ましくは４０倍以下、３０倍以下、２０倍以下、１５倍以下、１４倍以下、１３倍以下、１２倍以下、１１倍以下、１０倍以下である。
　以上の方法により得られるタンパク質フィラメントの長さは、紡糸の条件により適宜調節することができ、１５００ｍを超えることが好ましく、１００００ｍ以上、１５０００ｍ以上、又は２００００ｍ以上であってもよい。
　人工フィブロインフィラメントは、後述する水性媒体（例えば、沸点未満の水等）と接触させ、次いで乾燥させた際の収縮率（乾燥後の収縮率）が、７％超となるものであることが好ましく、１０％以上、１５％以上、２５％以上、３２％以上、４０％以上、４８％以上、５６％以上、６４％以上、又は７２％以上であってもよい。乾燥後の収縮率は、通常、８０％以下である。ここで、フィブロインフィラメントの乾燥後の収縮率は下式で定義される。
　乾燥後の収縮率＝｛１－（水性媒体に接触させ、次いで乾燥させた後の人工フィブロインフィラメントの長さ／水性媒体に接触させる前の人工フィブロインフィラメントの長さ）｝×１００（％）
　また、人工フィブロインフィラメントは、後述する水性媒体（例えば、沸点未満の水等）と接触して湿潤状態とされたときの収縮率（湿潤時収縮率）が、例えば、２％以上となるものであってもよく、２．５％以上、３％以上、３．５％以上、４％以上、４．５％以上、５％以上、５．５％以上、又は６％以上であってよい。湿潤時収縮率の上限は特に限定されないが、８０％以下、６０％以下、４０％以下、２０％以下、１０％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、又は３％以下であってよい。ここで、湿潤時収縮率は、以下の式によって計算することができる。
　湿潤時収縮率＝｛１－（水性媒体に接触させて湿潤状態にした人工フィブロインフィラメントの長さの長さ／水性媒体と接触する前の人工フィブロインフィラメントの長さ）｝×１００（％）
＜工程ｂ＞
　工程ｂは、人工フィブロインフィラメントをカットして、人工フィブロインステープルを得るカット工程と、該カット工程に先だって、人工フィブロインフィラメントを水性媒体と接触させて捲縮させるか、若しくはカット工程後に、人工フィブロインステープルを水性媒体と接触させて捲縮させる捲縮工程とを行うことによって人工フィブロイン捲縮ステープルを得る工程である。すなわち、工程ｂはカット工程と捲縮工程とを含み、捲縮工程はカット工程の前に行われてもよく、カット工程の後に行われてもよい。カット工程が捲縮工程の前に行われる場合は、カットするのは捲縮される前の人工フィブロインフィラメントであり、捲縮させるのはカットして得られた人工フィブロインステープルである。カット工程が捲縮工程の後に行われる場合は、捲縮させるのは人工フィブロインフィラメントであり、カットするのは捲縮された後の人工フィブロインフィラメントである。
　カット工程は、タンパク質繊維を裁断できる任意の装置を用いて行うことができる。このような装置としては、例えば、卓上型繊維裁断機（ｓ／ＮＯ．ＩＴ－１６０２０１－ＮＰ－３００）を挙げられる。
　ステープルの長さは、特に限定しないが、２０ｍｍ以上であることが好ましく、２０～１４０ｍｍ、又は７０～１４０ｍｍ、２０～７０ｍｍであってもよい。
　捲縮工程は、人工フィブロインフィラメント又は人工フィブロインステープルを水性媒体と接触させて捲縮させる（以下、「水捲縮」という場合がある）工程である。
　水性媒体に接触させることによれば、外力によらずに、人工フィブロインフィラメント又は人工フィブロインステープルを捲縮させることができる。水性媒体とは、水（水蒸気を含む。）を含む液体又は気体（スチーム）の媒体である。水性媒体は水であってもよいし、水と親水性溶媒との混合液であってもよい。また、親水性溶媒としては、例えば、エタノール及びメタノール等の揮発性溶媒又はその蒸気を用いることも可能である。水性媒体は、水とエタノール、メタノールなどの揮発性溶媒との混合液体であってよく、水又は水とエタノールとの混合液体であることが好ましい。揮発性溶媒又はその蒸気を含む水性媒体を使用することで、水捲縮後の乾燥速度が向上させることができ、更には最終的に得られる捲縮ステープルに柔らかな風合いを付与し得る可能性がある。水と揮発性溶媒又はその蒸気との比率は、特に限定されず、例えば、水：揮発性溶媒又はその蒸気は、質量比で１０：９０～９０：１０であってもよい。水の割合が３０質量％以上であることが好ましく、４０質量％又は５０質量％以上であってもよい。水性媒体が液体である場合、水性媒体には油剤を分散させることが好ましい。この場合は、水捲縮と油剤付着を同時に行うことができる。なお、油剤としては、例えば、帯電防止用、摩擦軽減用、柔軟性付与用、又は撥水性付与用等の工程通過性や機能性付与等の一般的な目的で使用される公知の油剤であれば何れも使用可能である。なお、油剤の量は、特に限定されず、例えば、油剤と水性媒体の全量に対して１～１０質量％であってもよく、或いは２～５質量％であってよい。
　水性媒体は、水（水蒸気を含む）を含む１０～２３０℃の液体又は気体であることが好ましい。水性媒体の温度は、１０℃以上、２５℃以上、４０℃以上、６０℃以上、又は１００℃以上であってよく、２３０℃以下、１２０℃以下、又は１００℃以下であってよい。より具体的には、水性媒体が気体（スチーム）である場合、水性媒体の温度は１００～２３０℃が好ましく、１００～１２０℃がより好ましい。水性媒体のスチームが２３０℃以下であると、タンパク質フィラメントの熱変性を防ぐことができる。水性媒体が液体である場合、水性媒体の温度は、効率良く捲縮を付与する観点から、１０℃以上、２５℃以上、又は４０℃以上が好ましく、タンパク質フィラメントの繊維強度を高く保つ観点から、６０℃以下が好ましい。
　水性媒体と接触する時間は、特に制限されないが、３０秒以上であればよく、１分以上、又は２分以上であってよく、生産性の観点から１０分以下であることが好ましい。また、スチームの場合は、液体に比べて短い時間で大きな収縮率が得られると考えられる。水性媒体との接触は、常圧下で行ってもよく、減圧下（例えば、真空）で行ってもよい。
　水性媒体と接触させる方法としては、人工フィブロインフィラメント又は人工フィブロインステープルを水性媒体に浸漬する方法、人工フィブロインフィラメント又は人工フィブロインステープルに対して水性媒体のスチームを噴霧する方法、水性媒体のスチームが充満した環境に人工フィブロインフィラメント又は人工フィブロインステープルを暴露する方法等が挙げられる。水性媒体がスチームである場合、人工フィブロインフィラメント又は人工フィブロインステープルへの水性媒体の接触は、一般的なスチームセット装置を使用して行うことができる。スチームセット装置の具体例としては、製品名：ＦＭＳＡ型スチームセッター（福伸工業株式会社製）、製品名：ＥＰＳ－４００（辻井染機工業株式会社製）等の装置を挙げることができる。水性媒体のスチームにより人工フィブロインフィラメント又は人工フィブロインステープルを捲縮する方法の具体例としては、所定の収容室内に人工フィブロインフィラメント又は人工フィブロインステープルを収容する一方、収容室内に水性媒体のスチームを導入して、収容室内の温度を上記所定温度（例えば、１００℃～２３０℃）に調整しつつ、人工フィブロインフィラメント又は人工フィブロインステープルにスチームを接触させることが挙げられる。
　なお、水性媒体との接触による人工フィブロインフィラメント又は人工フィブロインステープルの捲縮工程は、好ましくは人工フィブロインフィラメントや人工フィブロインステープルの単繊維や束（綛等）に対して引張力が何ら加えられない（繊維軸方向に何ら緊張されない）状態、若しくは所定の大きさだけ加えられた（繊維軸方向に所定量だけ緊張させられた）状態で実施される。その際に人工フィブロインフィラメント又は人工フィブロインステープルに加えられる引張力を調整することで、捲縮の程度をコントロールすることが可能となる。人工フィブロインフィラメントや人工フィブロインステープルに加えられる引張力の調製方法としては、例えば、人工フィブロインフィラメントや人工フィブロインステープルに様々な重さの重りを吊す等して、それらフィラメントやステープルに対して負荷される荷重を調整する方法、フィラメントやステープルを弛ませた状態で両末端を固定すると共に、その弛み量を種々変更する方法、フィラメントを紙管又はボビン等の被巻回体に巻き付けると共に、その際の巻き付け力（紙管やボビンへの締付力）を適宜に変更する方法等が挙げられる。
　人工フィブロインフィラメント又は人工フィブロインステープルを水性媒体（例えば沸点未満の水等）と接触させた後に、さらに乾燥させてもよい。乾燥方法は、特に限定されず、乾燥は、自然乾燥でもよく、熱風やホットローラーで乾燥してもよい。乾燥温度としては、特に限定されず、例えば、２０～１５０℃であってよく、４０～１２０℃であることが好ましく、６０～１００℃であることがより好ましい。
　捲縮させ、次いで乾燥させた後の人工フィブロインフィラメント若しくは人工フィブロインステープルの収縮率（乾燥後の収縮率）が、７％超となるものであることが好ましく、１０％以上、１５％以上、２５％以上、３２％以上、４０％以上、４８％以上、５６％以上、６４％以上、又は７２％以上であってもよい。乾燥後の収縮率は、通常、８０％以下である。ここで、乾燥後の収縮率は、以下の式によって計算することができる。
　乾燥後の収縮率＝｛１－（捲縮させ、次いで乾燥させたの人工フィブロインフィラメント若しくは人工フィブロイン質ステープルの長さ／水性媒体に接触させる前の人工フィブロインフィラメント若しくは人工フィブロインステープルの長さ）｝×１００（％）
　また、人工フィブロインフィラメント若しくは人工フィブロインステープルは、水性媒体（例えば、沸点未満の水等）と接触して湿潤状態とされたときの収縮率（湿潤時収縮率）が、例えば、２％以上となるものであってもよく、２．５％以上、３％以上、３．５％以上、４％以上、４．５％以上、５％以上、５．５％以上、又は６％以上であってよい。湿潤時収縮率の上限は特に限定されないが、８０％以下、６０％以下、４０％以下、２０％以下、１０％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、又は３％以下であってよい。ここで、湿潤時収縮率は、以下の式によって計算することができる。
　湿潤時収縮率＝｛１－（水に接触させて湿潤状態にした人工フィブロインフィラメント若しくは人工フィブロイン質ステープルの長さの長さ／紡糸後、水と接触する前の人造フィブロイン繊維の長さ）｝×１００（％）
　カット工程及び捲縮工程は、バッチ式で行ってもよく、連続式で行ってもよい。バッチ式の場合、例えば、人工フィブロインフィラメントをカットして得られた人工フィブロインステープルを適切な温度の水性溶媒が入った容器に投入し、一定時間接触させた後、取り出して乾燥させることが挙げられる。連続式の場合、例えば、人工フィブロインフィラメントを巻き取ったボビンからフィラメントを送り出しながら、適切な温度の水性媒体に浸漬した後、熱風を吹き付けるか、又はホットローラー上に送り出すことで乾燥し、その後、連続的にカットする。
　工程ｂによって得られたタンパク質捲縮ステープルは、柔らかい感触を呈する単繊維であり、紡績糸、不織布、コンポジットなどの複合材の製造に用いることができる。
　人工フィブロイン繊維は、紡糸後に最初に水性媒体と接触した際に所定量だけ収縮する可能性がある。本発明の製造方法によって得られたタンパク質捲縮ステープルは、既に水分（水性溶媒）と接触させたものであるため、ステープル製造後の保管中や、ステープルを用いた製品の製造工程中での吸湿によるステープルの寸法変化（収縮）を抑制することができる。
＜工程ｃ＞
　工程ｃは、上記得られた人工フィブロイン捲縮ステープルを紡績する紡績工程である。紡績方法は、特に限定されず、いずれの公知の紡績方法も用いることができる。例えば、綿紡式、梳毛式、紡毛式などの方法が挙げられ、捲縮の効果である膨らみの面から紡毛式が好ましい。これらの紡績方法に使用される機械は、特に限定されないが、通常使用される機械であればよい。また、紡績工程において、まず人工フィブロイン捲縮ステープルを開毛機（オープナ）や解維機（ブレーカ）等によって開毛、解繊することが好ましい。
　紡績糸の種類としては、例えば、人工フィブロイン１００％の紡績糸、人工フィブロイン１００％の捲縮ステープルと他のタンパク質捲縮ステープル若しくは化学繊維捲縮ステープルとの混紡糸、人工フィブロインとそれ以外の成分とを含む捲縮ステープルを用いた紡績糸、人工フィブロインとそれ以外の成分とを含む捲縮ステープルと他のタンパク質捲縮ステープル若しくは化学繊維捲縮ステープルとの混紡糸が挙げられる。
　人工フィブロイン捲縮ステープルがほぐれやすくするため、予め油剤を付着させることが好ましい。油剤付着は、製造方法における任意の段階で実施することができる。例えば、捲縮工程の前、捲縮工程と同時、又は捲縮工程後に油剤付着を実施してもよい。油剤は特に限定されず、帯電防止用、摩擦軽減用、柔軟性付与用、又は撥水性付与用等の工程通過性や機能性付与等の一般的な目的で使用される公知の油剤であれば何れも使用可能である。
　本発明にかかる方法によって得られたタンパク質紡績糸は、柔らかな風合いを有するタンパク質捲縮ステープルを含むことで、比較的柔らかい感触を呈する。また、水分（水性媒体）と接触させたものであるため、紡績糸製造後の保管中や、紡績糸を用いた製品（編織物等）の製造工程中での吸湿による紡績糸の寸法変化（収縮）を抑制することができる。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
＜人工クモ糸タンパク質（人工クモ糸フィブロイン）フィラメントの製造例＞
（１）プラスミド発現株の作製
　ネフィラ・クラビペス（Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ）由来のフィブロイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン（以下、「ＰＲＴ７９９」ともいう。）を設計した。なお、配列番号１３で示されるアミノ酸配列は、ネフィラ・クラビペス由来のフィブロインのアミノ酸配列に対して、生産性の向上を目的としてアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を施したアミノ酸配列を有し、さらにＮ末端に配列番号５で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されている。
　次に、ＰＲＴ７９９をコードする核酸を合成した。当該核酸には、５’末端にＮｄｅＩサイト及び終止コドン下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した。当該核酸をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。その後、同核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した後、タンパク質発現ベクターｐＥＴ－２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。
（２）タンパク質の発現
　配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸を含むｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターで、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。当該形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。当該培養液を、アンピシリンを含む１００ｍＬのシード培養用培地（表４）にＯＤ６００が０．００５となるように添加した。培養液温度を３０℃に保ち、ＯＤ６００が５になるまでフラスコ培養を行い（約１５時間）、シード培養液を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　当該シード培養液を５００ｍＬの生産培地（表５）を添加したジャーファーメンターにＯＤ６００が０．０５となるように添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ　１２０ｇ／１Ｌ）を１ｍＬ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにし、２０時間培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、改変フィブロインを発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存した目的とする改変フィブロインサイズのバンドの出現により、目的とする改変フィブロインの発現を確認した。
（３）タンパク質の精製
　ＩＰＴＧを添加してから２時間後に回収した菌体を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の菌体を約１ｍＭのＰＭＳＦを含む２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ　Ｎｉｒｏ　Ｓｏａｖｉ社製）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８Ｍ　グアニジン緩衝液（８Ｍグアニジン塩酸塩、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で懸濁し、６０℃で３０分間、スターラーで撹拌し、溶解させた。溶解後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分を除き、凍結乾燥粉末を回収することにより、改変クモ糸フィブロイン「ＰＲＴ７９９」を得た。
（４）タンパク質フィラメントの製造
　ＤＭＳＯに、上述の改変フィブロイン（ＰＲＴ７９９）を濃度２４質量％となるよう添加した後、溶解促進剤としてＬｉＣｌを濃度４．０質量％となるように添加した。その後、シェーカーを使用して、改変フィブロインを３時間かけて溶解させ、ＤＭＳＯ溶液を得た。得られたＤＭＳＯ溶液中のゴミと泡を取り除き、ドープ液とした。ドープ液の溶液粘度は９０℃において５０００ｃＰ（センチポアズ）であった。
　上記のようにして得られたドープ液と図４に示される紡糸装置１０を用いて公知の乾湿式紡糸を行って、人工クモ糸フィブロイン繊維はボビンに巻きとった。なお、ここでは、乾湿式紡糸を下記の条件で行った。
　凝固液（メタノール）の温度：５～１０℃
　延伸倍率：４．５２倍
　乾燥温度：８０℃
＜実施例１＞
　人工クモ糸タンパク質の製造例で得られてボビンに巻きとられた人工クモ糸フィラメントを複数本束ねて卓上型繊維裁断機で平均４０ｍｍの長さに裁断して、人工クモ糸タンパク質ステープルを作製した。作製した人工クモ糸タンパク質ステープルを４０℃の水に１分浸漬して縮れさせることで捲縮させた後、４０℃で１８時間乾燥させて、捲縮ステープルを得た。得られた捲縮ステープルを公知の紡績装置により紡績した。得られた紡績糸は糸番手（毛番）が約１８．５Ｎｍの単糸であった。紡績糸の写真を図５に示す。
＜実施例２＞
　人工クモ糸タンパク質の製造例で得られてボビンに巻きとられた人工クモ糸フィラメントを複数本束ねて卓上型繊維裁断機で平均４０ｍｍの長さに裁断して、人工クモ糸タンパク質ステープルを作製した。市販の帯電防止用油剤を１重量％の濃度となるように水に分散させて油剤分散液を得た。作製した人工クモ糸タンパク質ステープルを２０℃の油剤分散液に１分浸漬して縮れさせることで捲縮させた後、４０℃で１８時間乾燥させて、捲縮ステープルを得た。得られた捲縮ステープルを公知の紡績装置により紡績した。得られた紡績糸は糸番手（毛番）が約１８．５Ｎｍの単糸であった。紡績糸の写真を図６に示す。
＜比較例＞
　人工クモ糸タンパク質フィラメントを単にカットして、無捲縮ステープルを得た。得られた無捲縮ステープルの写真を図７に示す。
＜実施例３＞
　人工クモ糸タンパク質の製造例で得られてボビンに巻きとられた人工クモ糸フィラメントを複数本束ねて卓上型繊維裁断機で平均４０ｍｍの長さに裁断して、人工クモ糸タンパク質ステープルを作製した。作製した人工クモ糸タンパク質ステープルを、２０℃の水とメタノールの混合液（メタノール濃度５０質量％）に、１分浸漬して縮れさせることで捲縮させた後、４０℃で１８時間乾燥させて、捲縮ステープルを得た。得られた捲縮ステープルを公知の紡績装置により紡績した。得られた紡績糸は糸番手（毛番）が約１８．５Ｎｍの単糸であった。
　水１００％浸漬して得た実施例１の紡績糸と、水とメタノールの混合液に浸漬して得た実施例３の紡績糸のそれぞれの感触を感応試験によって確かめた。水とメタノールの混合液に浸漬して得た実施例３の紡績糸のほうがより柔らかい感触を有することを判明した。油剤の添加により、繊維の硬化を抑制できることが示唆された。
　１…押出し装置、２…未延伸糸製造装置、３…湿熱延伸装置、４…乾燥装置、６…ドープ液、１０…紡糸装置、２０…凝固液槽、２１…延伸浴槽、３６…タンパク質フィラメント。

Claims (7)

  1. 　ａ）改変フィブロインを含む人工フィブロインフィラメントを準備する工程と、
    　ｂ）前記人工フィブロインフィラメントをカットして、人工フィブロインステープルを得るカット工程と、該カット工程に先だって、前記人工フィブロインフィラメントを水性媒体と接触させて捲縮させるか、若しくは前記カット工程後に、前記人工フィブロインステープルを水性媒体と接触させて捲縮させる捲縮工程とを行うことによって人工フィブロイン捲縮ステープルを得る工程と、
    　ｃ）前記人工フィブロイン捲縮ステープルを紡績する紡績工程と、
    を含む、タンパク質紡績糸の製造方法。
  2. 　前記人工フィブロインフィラメントの、下記式で定義される、乾燥後の収縮率が７％超である、請求項１に記載のタンパク質紡績糸の製造方法。
    　乾燥後の収縮率＝｛１－（水性媒体に接触させ、次いで乾燥させた後の人工フィブロインフィラメントの長さ／水性媒体に接触させる前の人工フィブロインフィラメントの長さ）｝×１００（％）。
  3. 　前記人工フィブロインフィラメントの、下記式で定義される、湿潤時収縮率が２％以上である、請求項１又は２に記載のタンパク質紡績糸の製造方法。
    　湿潤時収縮率＝｛１－（水性溶媒に接触させて湿潤状態にした人工フィブロインフィラメントの長さ／紡糸後、水性溶媒と接触する前の人工フィブロインフィラメントの長さ）｝×１００（％）
  4. 　前記改変フィブロインが改変クモ糸フィブロインであり、且つ、前記人工フィブロインフィラメントが人工クモ糸フィブロインフィラメントである、請求項１～３のいずれか一項に記載のタンパク質紡績糸の製造方法。
  5. 　前記捲縮工程で使用する前記水性媒体が、水を含む１０～２３０℃の液体又は気体である、請求項１～４のいずれか一項に記載のタンパク質紡績糸の製造方法。
  6. 　前記捲縮工程が、前記人工フィブロインフィラメント又は前記人工フィブロインステープルを前記水性媒体と接触させた後に、さらに乾燥させることを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のタンパク質紡績糸の製造方法。
  7. 　前記捲縮工程で使用する前記水性媒体が揮発性溶媒を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のタンパク質紡績糸の製造方法。
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