JPWO2019194146A1 - 成形体及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]
改変フィブロインと耐水性付与物質とを含む、成形体。
[2]
上記改変フィブロインと上記耐水性付与物質とが共有結合している、[1]に記載の成形体。
[3]
上記耐水性付与物質が、シリコーン系ポリマー及びフッ素系ポリマーから選ばれる少なくとも1種である、[1]又は[2]に記載の成形体。
[4]
上記改変フィブロインが、改変クモ糸フィブロインである、[1]〜[3]のいずれかに記載の成形体。
[5]
改変フィブロインを含む前駆成形体に耐水性付与物質を結合させる工程を備える、成形体を製造する方法。
[6]
上記前記成形体に上記耐水性付与物質を結合させる上記工程が、上記前駆成形体に上記耐水性付与物質又は耐水性付与物質の前駆体を接触させた状態でプラズマを照射し、それにより上記改変フィブロインと上記耐水性付与物質とを共有結合させることを含む、[5]に記載の方法。
[7]
上記耐水性付与物質が、シリコーン系ポリマー及びフッ素系ポリマーから選ばれる少なくとも1種である、[5]又は[6]に記載の方法。
[8]
上記改変フィブロインが、改変クモ糸フィブロインである、[5]〜[7]のいずれかに記載の方法。
[9]
改変フィブロイン及び耐水性付与物質を含有する原料を成形して成形体を得る工程を備える、成形体を製造する方法。
本発明に係る成形体は、改変フィブロインと耐水性付与物質とを含む。
本実施形態に係る改変フィブロインは、式1:[(A)nモチーフ−REP]m、又は式2:[(A)nモチーフ−REP]m−(A)nモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。改変フィブロインは、ドメイン配列のN末端側及びC末端側のいずれか一方又は両方に更にアミノ酸配列(N末端配列及びC末端配列)が付加されていてもよい。N末端配列及びC末端配列は、これに限定されるものではないが、典型的には、フィブロインに特徴的なアミノ酸モチーフの反復を有さない領域であり、100残基程度のアミノ酸からなる。
式1:[(A)nモチーフ−REP]m、又は式2:[(A)nモチーフ−REP]m−(A)nモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロイン(改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン)において、最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのREPにおいて、その領域に含まれるGPGXXモチーフの個数の総数を3倍した数(即ち、GPGXXモチーフ中のG及びPの総数に相当)をsとし、最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除き、更に(A)nモチーフを除いた全REPのアミノ酸残基の総数をtとしたときに、GPGXXモチーフ含有率はs/tとして算出される。
式1:[(A)nモチーフ−REP]m、又は式2:[(A)nモチーフ−REP]m−(A)nモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロイン(改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン)において、最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除いた配列(図5の「領域A」に相当する配列。)に含まれる全てのREPにおいて、その領域に含まれるグルタミン残基の総数をuとし、最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除き、更に(A)nモチーフを除いた全REPのアミノ酸残基の総数をtとしたときに、グルタミン残基含有率はu/tとして算出される。グルタミン残基含有率の算出において、「最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。
式1:[(A)nモチーフ−REP]m、又は式2:[(A)nモチーフ−REP]m−(A)nモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロイン(改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン)において、最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除いた配列(図5の「領域A」に相当する配列。)に含まれる全てのREPにおいて、その領域の各アミノ酸残基の疎水性指標の総和をvとし、最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除き、更に(A)nモチーフを除いた全REPのアミノ酸残基の総数をtとしたときに、REPの疎水性度はv/tとして算出される。REPの疎水性度の算出において、「最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。
本実施形態に係る改変フィブロインは、例えば、当該改変フィブロインをコードする核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された1又は複数の調節配列とを有する発現ベクターで形質転換された宿主により、当該核酸を発現させることにより生産することができる。
耐水性付与物質は、改変フィブロインを含む成形体の耐水性を向上させ得る物質である。成形体が耐水性付与物質を含むことにより、例えば、成形体の撥水性が向上する、成形体の水接触時の収縮が抑制される等の効果が発揮される。
本実施形態に係る成形体は、改変フィブロインと耐水性付与物質とを少なくとも含むものである。本実施形態に係る成形体は、改変フィブロインと耐水性付与物質とが共有結合しているものであってもよい。
(1)発現ベクターの構築
配列番号15で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン(PRT799)及び配列番号37で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン(PRT918)を設計した。
得られた発現ベクターで、それぞれ大腸菌BLR(DE3)を形質転換した。当該形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む2mLのLB培地で15時間培養した。当該培養液をアンピシリンを含む100mLのシード培養用培地(表4)にOD600が0.005となるように添加した。培養液温度を30℃に保ち、OD600が5になるまで、約15時間のフラスコ培養を行い、シード培養液を得た。
IPTGを添加してから2時間後に回収した菌体を20mM Tris−HCl buffer(pH7.4)で洗浄した。洗浄後の菌体を約1mMのPMSFを含む20mMTris−HCl緩衝液(pH7.4)に懸濁させ、高圧ホモジナイザー(GEA Niro Soavi社)で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで20mMTris−HCl緩衝液(pH7.4)で洗浄した。洗浄後の沈殿物を100mg/mLの濃度になるように8M グアニジン緩衝液(8Mグアニジン塩酸塩、10mMリン酸二水素ナトリウム、20mMNaCl、1mMTris−HCl、pH7.0)で懸濁した。懸濁液を60℃で30分間、スターラーで撹拌し、沈殿物を緩衝液に溶解させた。溶解後、透析チューブ(三光純薬株式会社製のセルロースチューブ36/32)を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分を除き、凍結乾燥粉末を回収した。
(1)紡糸液(ドープ液)の調製
濃度4質量%で塩化リチウムを溶解したDMSOを溶媒として用いた。上記で製造した改変フィブロイン(PRT799)の凍結乾燥粉末を、濃度24質量%となるように溶媒に添加した。90℃のアルミブロックヒーターで1時間加熱することにより、改変フィブロインを溶媒に溶解させた。溶液から不溶物と泡を取り除き、紡糸液(ドープ液)を得た。
紡糸液をリザーブタンクに充填した。紡糸液を0.1又は0.2mm径のモノホールノズルからギアポンプを用い100質量%メタノール凝固浴槽中へ吐出させた。吐出量は0.01〜0.08mL/分に調整した。紡糸液の凝固により形成された繊維を、100質量%メタノール洗浄浴槽で洗浄及び延伸した。洗浄及び延伸後、繊維を乾熱板を用いて乾燥させ、得られた原糸(改変フィブロイン繊維)を巻き取った。
得られた改変フィブロイン繊維から諸撚糸を作製した。作製した諸撚糸を平織りして織生地を得た。
得られた織生地にフッ素系コーティング用モノマーを塗布した。モノマーが塗布された織生地に対して、プラズマ処理装置(Europlasma社製)を用いてプラズマ処理を施した。プラズマ処理により、フッ素系コーティング用モノマーの重合により形成されたフッ素系ポリマー(耐水性付与物質)が共有結合した織生地を得た。フッ素系コーティング用モノマーとして、Nanofics110(実施例1)及びNanofics120(実施例2)(いずれもEuroplasma社製)を使用した。
プラズマ処理を施した実施例1及び実施例2の織生地、並びにプラズマ処理を施していない織生地(比較例1)の撥水性を、撥水度試験(スプレー試験)により評価した。撥水度試験(スプレー試験)は、ISO4920:2012に準じて実施した。以下に示す6段階(スコア0〜5)の評価基準に従い、目視で撥水性を判定した。
スコア5:表面に湿潤及び水滴の付着がない。
スコア4:表面に湿潤しないが,水滴の付着がある。
スコア3:表面に小さな湿潤がある。
スコア2:湿潤が広がり,いくつかは互いに接続している。
スコア1:水が当たった部分に完全な湿潤を示す。
スコア0:表面全体に湿潤を示す。
実施例1及び実施例2並びに比較例1の織生地から、一辺5cmの正方形状の試験片をそれぞれ切り出した。試験片の一方の表面に、鉛筆で一辺30mmの正方形の頂点に対応する4点の位置にマークした。各試験片を40℃の水に10分間浸漬した後、次いで室温で真空乾燥させる工程を5サイクル繰り返した。真空乾燥は、真空定温乾燥機(VOS−310C,東京理化器械(株)製)を用いて、設定圧力−0.1MPaで30分間行った。各サイクル終了時に、触感を官能評価すると共に、マークした4点間の距離を測定して収縮率を求めた。
評点5:オリジナルと同様に良好である。
評点4:良好であるが、オリジナルと比べて若干劣る。
評点3:悪くはないが、やや堅い。
評点2:悪く、かつ堅いが、曲げられる。
評点1:とても悪く、堅く、かつ曲げられない。
収縮率(%)={1−(各辺の長さの平均値(mm)/30mm)}×100
結果を表8に示す。プラズマ処理を施した実施例1及び実施例2の織生地はいずれもプラズマ処理を施していない比較例1の織生地と比べて収縮率が小さかった。
(1)紡糸液(ドープ液)の調製
濃度4質量%で塩化リチウムを溶解したDMSOを溶媒として用いた。上記で製造した改変フィブロイン(PRT918)の凍結乾燥粉末を、濃度24質量%となるように溶媒に添加した。90℃のアルミブロックヒーターで1時間加熱することにより、改変フィブロインを溶媒に溶解させた。溶液から不溶物と泡を取り除き、紡糸液(ドープ液)を得た。
紡糸液をリザーブタンクに充填した。紡糸液を0.1又は0.2mm径のモノホールノズルからギアポンプを用い100質量%メタノール凝固浴槽中へ吐出させた。吐出量は0.01〜0.08mL/分に調整した。紡糸液の凝固により形成された繊維を、100質量%メタノール洗浄浴槽で洗浄及び延伸した。洗浄及び延伸後、繊維を乾熱板を用いて乾燥させ、得られた原糸(改変フィブロイン繊維)を巻き取った。
得られた改変フィブロイン繊維を裁断して改変フィブロインステープルを作製した。作製した改変フィブロインステープルを開繊開毛した後、公知の紡績装置により紡績し、紡績糸を得た。得られた紡績糸を、ホールガーメント横編機(MACH2XS,島精機製)を使用して編み、編生地を得た。
得られた編生地にフッ素系コーティング用モノマーを塗布した。モノマーが塗布された編生地に対してプラズマ処理装置(Europlasma社製)を用いてプラズマ処理を施した。プラズマ処理により、フッ素系コーティング用モノマーの重合により形成されたフッ素系ポリマー(耐水性付与物質)が共有結合した編生地を得た(実施例3)。フッ素系コーティング用モノマーとして、Nanofics120(Europlasma社製)を使用した。
プラズマ処理を施した実施例3の編生地、及びプラズマ処理を施していない編生地(比較例2)の撥水性を、試験例1と同様の方法の撥水度試験(スプレー試験)によって評価した。結果を表9に示す。プラズマ処理を施していない比較例2の編生地はスコア0であったのに対し、プラズマ処理を施した実施例3の編生地はスコア5であり、耐水性(撥水性)が付与されていた。
実施例3及び比較例2の編生地から、一辺5cmの正方形状の試験片をそれぞれ切り出した。試験片の一方の表面に、鉛筆で一辺30mmの正方形の頂点に対応する4点の位置にマークした。予備処理として、各試験片を40℃の水に10分間浸漬した後、次いで室温で真空乾燥させる工程を5サイクル繰り返した。真空乾燥は、真空定温乾燥機(VOS−310C,東京理化器械(株)製)を用いて、設定圧力−0.1MPaで30分間行った。
(1)紡糸液(ドープ液)の調製
濃度4質量%で塩化リチウムを溶解したDMSOを溶媒として用いた。上記で製造した改変フィブロイン(PRT799)の凍結乾燥粉末を、濃度24質量%となるように溶媒に添加した。シェーカーを使用して、改変フィブロインを3時間かけて溶解させた後、溶液中の不溶物(ゴミ等)と泡を取り除き、紡糸液(ドープ液)を得た。ドープ液の溶液粘度は90℃において5000cP(センチポアズ)であった。
得られたドープ液と公知の乾湿式紡糸装置とを用いて乾湿式紡糸を行って、改変フィブロインからなるモノフィラメントを得た。ここでは、乾湿式紡糸を下記の条件で行った。
凝固液(メタノール)の温度:5〜10℃
延伸倍率:6倍
乾燥温度:80℃
上記のようにして得た改変フィブロイン繊維を用いて公知の方法により紡績糸を製造し、この改変フィブロイン繊維からなる紡績糸と公知の編機とを用いて、横編みにより5cm角の編生地を得た。改変フィブロイン繊維からなる紡績糸の番手は58.1Nmであり、編機のゲージ数は18であった。
得られた5cm角の編生地を、ヘキサンジイソアネート(HDI,第一の反応剤)20mL中に浸漬した。次いで、HDIが含浸した編生地をアルミホイルに挟み、130℃で30分加熱した。加熱後、編生地を取り出し、ブタノール(BuOH,第二の反応剤)20ml中に浸漬し、100℃で240分反応させた。反応後の編生地をTHFで洗浄して、耐水性付与物質(第一の反応剤及び第二の反応剤)が結合した、実施例4の編生地を得た。
(3)で得られた5cm角の編生地を、比較例3の編生地として評価した。
(3)で得られた5cm角の編生地を、ヘキサンジイソアネート(HDI,第一の反応剤)20mL中に浸漬した。次いで、HDIが含浸した編生地をアルミホイルに挟み、130℃で30分加熱した。その後、編生地をTHFで洗浄して、第一の反応剤のみが結合した、比較例4の編生地を得た。
実施例4の編生地、並びに比較例3及び比較例4の編生地について、収縮性を評価した。各編生地に鉛筆で3cm角の正方形を描き、評価サンプルとした。評価サンプルをパナソニック(株)製洗濯機(NA−VG1100L)の洗濯モード「お家クリーニング」で洗濯した。次いで、同じ洗濯機で15分脱水し、120分自然乾燥させた。洗濯前後の正方形の縦横の長さをそれぞれ測定し、縦向及び横方向の収縮率を求めた。同じ試験を3回行い、3回の平均値を評価結果とした。結果を表12に示す。
実施例4の編生地、並びに比較例3及び比較例4の編生地について、肌触りを三段階で評価した。比較例3の編生地の肌触りを基準(B)とし、それより風合いに優れる場合をA、肌触りが荒く風合いに劣る場合をCとして評価した。結果を表12に示す。
<実施例5>
(1)紡糸液(ドープ液)の調製
デンプン(和光純薬工業株式会社製)200mgを11400mgの溶媒(4重量%のLiClを含むジメチルスルホキシド(DMSO))に溶解させた。得られた溶液にフェニルイソシアネート(東京化成工業株式会社製)400mgを添加し、溶液を90℃で4時間撹拌した。これにより、デンプンのヒドロキシル基とフェニルイソシアネートのイソシアネート基とが反応して、フェニル基(機能性官能基)が、ウレタン結合を介して結合した修飾デンプン(修飾ヒドロキシル基含有ポリマー)を得た。仕込み比から求めた修飾率(ヒドロキシル基が機能性官能基に変換された割合)が100%であった。
調製した紡糸液を60℃にて目開き5μmの金属フィルターで濾過した。濾過後の紡糸液を30mLのステンレスシリンジ内で静置し、脱泡させた。その後、紡糸液を、ニードル径0.2mmのソリッドノズルから窒素ガスを用い100質量%メタノール凝固浴槽中へ吐出させた。吐出温度は60℃であり、吐出圧は0.3MPaであった。凝固後、形成された原糸を巻き取り速度3.00m/分で巻き取り、自然乾燥させて、改変フィブロインと耐水性付与物質(修飾デンプン)を含む繊維を得た。
得られた繊維を長さ約10cmに切断し、水への浸漬前の糸の長さ(cm)を測定した。次いで、糸を40℃の水浴に1分間浸漬した。その後、糸を水浴から取り出して、15分間室温で真空乾燥させた後、乾燥後の糸の長さを測定した。繊維の収縮率を以下の式に従って算出した。結果を表13に示す。
収縮率(%)={1−(浸漬・乾燥後の長さ/浸漬前の長さ)}×100
(1)紡糸液(ドープ液)の調製
デンプン(和光純薬工業株式会社製)253mgを7600mgの溶媒(4重量%のLiClを含むジメチルスルホキシド(DMSO))に溶解させた。得られた反応液に無水酢酸(和光純薬工業株式会社製)147mgを添加し、反応液を90℃で4時間撹拌した。これにより、デンプンのヒドロキシル基と無水酢酸とが反応して、アセチル基(機能性官能基)が結合した修飾デンプン(修飾ヒドロキシル基含有ポリマー)を得た。仕込み比から求めた修飾率(ヒドロキシル基が機能性官能基に変換された割合)が100%であった。
調製した紡糸液を使用して、実施例5と同様の手順で改変フィブロインと耐水性付与物質(修飾デンプン)を含む繊維を得た。
得られた繊維について、実施例5と同様の手順で収縮性評価を実施した。結果を表13に示す。
(1)紡糸液(ドープ液)の調製
デンプン(和光純薬工業株式会社製)215mgを7600mgの溶媒(4重量%のLiClを含むジメチルスルホキシド(DMSO))に溶解させた。得られた反応液に無水酢酸(和光純薬工業株式会社製)185mgを添加し、反応液を90℃で4時間撹拌した。これにより、デンプンのヒドロキシル基と無水酢酸とが反応して、アセチル基(機能性官能基)が結合した修飾デンプン(修飾ヒドロキシル基含有ポリマー)を得た。修飾デンプンは、仕込み比から求めた修飾率(ヒドロキシル基が機能性官能基に変換された割合)が50%であった。
調製した紡糸液を使用して、実施例5と同様の手順で改変フィブロインと耐水性付与物質(修飾デンプン)を含む繊維を得た。
得られた繊維について、実施例5と同様の手順で収縮性評価を実施した。結果を表13に示す。
(1)紡糸液(ドープ液)の調製
ポリビニルアルコール(PVA)(和光純薬工業株式会社製)128mgを7600mgの溶媒(4重量%のLiClを含むジメチルスルホキシド(DMSO))に溶解させた。得られた反応液にフェニルイソシアネート(東京化成工業株式会社製)272mgを添加し、反応液を90℃で4時間撹拌した。これにより、PVAのヒドロキシル基とフェニルイソシアネートとが反応して、フェニル基(機能性官能基)が、ウレタン結合を介して結合した修飾PVA(修飾ヒドロキシル基含有ポリマー)を得た。仕込み比から求めた修飾率(ヒドロキシル基が機能性官能基に変換された割合)が100%であった。
調製した紡糸液を使用して、実施例5と同様の手順で改変フィブロインと耐水性付与物質(修飾PVA)を含む繊維を得た。
得られた繊維について、実施例5と同様の手順で収縮性評価を実施した。結果を表13に示す。
(1)紡糸液(ドープ液)の調製
ポリビニルアルコール(PVA)(和光純薬工業株式会社製)193mgを7600mgの溶媒(4重量%のLiClを含むジメチルスルホキシド(DMSO))に溶解させた。反応液にフェニルイソシアネート(東京化成工業株式会社製)207mgを添加し、反応液を90℃で4時間撹拌した。これにより、PVAのヒドロキシル基とフェニルイソシアネートとが反応して、フェニル基(機能性官能基)が、ウレタン結合を介して結合した修飾PVA(修飾ヒドロキシル基含有ポリマー)を得た。仕込み比から求めた修飾率(ヒドロキシル基が機能性官能基に変換された割合)が50%であった。
調製した紡糸液を使用して、実施例5と同様の手順で改変フィブロインと耐水性付与物質(修飾PVA)を含む繊維を得た。
得られた繊維について、実施例5と同様の手順で収縮性評価を実施した。結果を表13に示す。
(1)紡糸液(ドープ液)の調製
改変フィブロイン(PRT799)の凍結乾燥粉末1200mgを溶媒(4重量%のLiClを含むジメチルスルホキシド(DMSO))に添加し、90℃で12時間撹拌して溶解させ、透明な紡糸液(ドープ液)を得た。
調製した紡糸液を使用して、実施例5と同様の手順で繊維を得た。
得られた繊維について、実施例5と同様の手順で収縮性評価を実施した。結果を表13に示す。
(1)紡糸液(ドープ液)の調製
改変フィブロイン(PRT799)の凍結乾燥粉末3000mg、及びデンプン(和光純薬工業株式会社製)600mgを溶媒(4重量%のLiClを含むジメチルスルホキシド(DMSO))に添加した。溶液を90℃で12時間撹拌して改変フィブロインを溶液に溶解させ、透明な紡糸液(ドープ液)を得た。
調製した紡糸液を使用して、実施例5と同様の手順で繊維を得た。
得られた繊維について、実施例5と同様の手順で収縮性評価を実施した。結果を表13に示す。
Claims (9)
- 改変フィブロインと耐水性付与物質とを含む、成形体。
- 前記改変フィブロインと前記耐水性付与物質とが共有結合している、請求項1に記載の成形体。
- 前記耐水性付与物質が、シリコーン系ポリマー及びフッ素系ポリマーから選ばれる少なくとも1種である、請求項1又は2に記載の成形体。
- 前記改変フィブロインが、改変クモ糸フィブロインである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の成形体。
- 改変フィブロインを含む前駆成形体に耐水性付与物質を結合させる工程を備える、成形体を製造する方法。
- 前記前駆成形体に前記耐水性付与物質を結合させる前記工程が、前記前駆成形体に前記耐水性付与物質又は耐水性付与物質の前駆体を接触させた状態でプラズマを照射し、それにより前記改変フィブロインと前記耐水性付与物質とを共有結合させることを含む、請求項5に記載の方法。
- 前記耐水性付与物質が、シリコーン系ポリマー及びフッ素系ポリマーから選ばれる少なくとも1種である、請求項5又は6に記載の方法。
- 前記改変フィブロインが、改変クモ糸フィブロインである、請求項5〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 改変フィブロイン及び耐水性付与物質を含有する原料を成形して成形体を得る工程を備える、成形体を製造する方法。
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