WO2019151425A1 - 紡糸原液、フィブロイン繊維及びその製造方法 - Google Patents

紡糸原液、フィブロイン繊維及びその製造方法 Download PDF

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WO2019151425A1
WO2019151425A1 PCT/JP2019/003457 JP2019003457W WO2019151425A1 WO 2019151425 A1 WO2019151425 A1 WO 2019151425A1 JP 2019003457 W JP2019003457 W JP 2019003457W WO 2019151425 A1 WO2019151425 A1 WO 2019151425A1
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seq
amino acid
fibroin
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acid sequence
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PCT/JP2019/003457
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佑之介 安部
岡田　亮二
秀人 石井
久弘 工藤
オリバ－ セイエッド シャファ－ト
Original Assignee
Ｓｐｉｂｅｒ株式会社
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    • D—TEXTILES; PAPER
    • D01—NATURAL OR MAN-MADE THREADS OR FIBRES; SPINNING
    • D01D—MECHANICAL METHODS OR APPARATUS IN THE MANUFACTURE OF ARTIFICIAL FILAMENTS, THREADS, FIBRES, BRISTLES OR RIBBONS
    • D01D5/00—Formation of filaments, threads, or the like
    • D01D5/04—Dry spinning methods
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D01—NATURAL OR MAN-MADE THREADS OR FIBRES; SPINNING
    • D01F—CHEMICAL FEATURES IN THE MANUFACTURE OF ARTIFICIAL FILAMENTS, THREADS, FIBRES, BRISTLES OR RIBBONS; APPARATUS SPECIALLY ADAPTED FOR THE MANUFACTURE OF CARBON FILAMENTS
    • D01F1/00—General methods for the manufacture of artificial filaments or the like
    • D01F1/02—Addition of substances to the spinning solution or to the melt
    • D01F1/10—Other agents for modifying properties
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D01—NATURAL OR MAN-MADE THREADS OR FIBRES; SPINNING
    • D01F—CHEMICAL FEATURES IN THE MANUFACTURE OF ARTIFICIAL FILAMENTS, THREADS, FIBRES, BRISTLES OR RIBBONS; APPARATUS SPECIALLY ADAPTED FOR THE MANUFACTURE OF CARBON FILAMENTS
    • D01F4/00—Monocomponent artificial filaments or the like of proteins; Manufacture thereof
    • D01F4/02—Monocomponent artificial filaments or the like of proteins; Manufacture thereof from fibroin

Definitions

  • the present invention relates to a spinning dope, fibroin fiber and a method for producing the same.
  • the invention also relates to a product comprising the fibroin fiber.
  • fibroin fibers are regenerated silk fibroin fibers and spider silk fibroin fibers.
  • a number of wet spinning methods and dry wet spinning methods have been reported as methods for producing these fibroin fibers.
  • a dry spinning method for example, a method of forming a fiber by discharging a dope, in which a refined silk silk fibroin is dissolved in a mixed organic solvent of calcium chloride and formic acid, is discharged from a syringe into the air (non-patent document). Reference 1).
  • Non-Patent Document 1 In the production method as disclosed in Non-Patent Document 1, in order to obtain a predetermined strength, a fiber is formed and then impregnated into a liquid such as water or a lower alcohol, and a liquid is attached to the fiber. Such complicated post-processes are necessary. Therefore, the number of processes is inevitably increased, the cost is heavy, the productivity is low, and it is industrially disadvantageous.
  • the present inventors have intensively studied to solve the above-mentioned problems of the prior art.
  • a spinning stock solution containing fibroin, a surfactant, and an organic solvent is spun by a dry spinning method, so that the fiber has a predetermined strength without going through a liquid impregnation step and a step attached thereto. It has been found that fibroin fibers can be obtained.
  • the present invention is based on this novel finding.
  • the present invention relates to the following inventions, for example.
  • a spinning dope comprising fibroin, a surfactant, and an organic solvent, The fibroin concentration is 5 to 40% by weight based on the total amount of the spinning dope, A spinning dope in which the concentration of the surfactant is 0.01 to 10% by weight based on the total amount of the spinning dope.
  • the organic solvent is at least one selected from the group consisting of hexafluoroisopropanol (HFIP), hexafluoroacetone (HFA), dimethyl sulfoxide (DMSO), N, N-dimethylformamide (DMF), and formic acid.
  • HFIP hexafluoroisopropanol
  • HFA hexafluoroacetone
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • DMF N-dimethylformamide
  • formic acid formic acid.
  • the spinning dope according to [1] or [2].
  • the surfactant is a nonionic surfactant.
  • the nonionic surfactant comprises polyoxyethylene alkyl ether.
  • the fibroin is SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 or SEQ ID NO: 43, or SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40,
  • the spinning dope according to any one of [1] to [5], comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 41 or 43.
  • a fibroin fiber comprising fibroin and a surfactant, Fibroin fiber, wherein the surfactant content is 0.001 to 50% by weight based on the fibroin content.
  • a method for producing fibroin fiber comprising: A step of preparing a spinning dope according to any one of [1] to [6]; Discharging the spinning stock solution from a spinneret into the air, and heating to vaporize the organic solvent to form fibroin fibers; and A method for producing fibroin fibers.
  • the method for producing fibroin fiber according to [10] further comprising a step of dry-heat stretching the fibroin fiber.
  • the method for producing fibroin fibers according to [11] wherein a draw ratio in the dry heat drawing step is 2 to 30 times.
  • the present invention it is possible to provide a spinning dope useful for producing fibroin fibers having a predetermined strength with excellent productivity. Moreover, according to this invention, the fibroin fiber which has predetermined intensity
  • the spinning dope according to the present embodiment is essential to contain a surfactant, and further contains fibroin and an organic solvent.
  • the spinning dope according to this embodiment can also be referred to as a spinning dope obtained by dissolving fibroin and a surfactant in an organic solvent.
  • the spinning dope according to this embodiment can be suitably used as a spinning dope for dry spinning.
  • the organic solvent contained in the spinning dope may be any one that can dissolve fibroin.
  • the organic solvent include hexafluoroisopropanol (HFIP), hexafluoroacetone (HFA), dimethyl sulfoxide (DMSO), N, N-dimethylformamide (DMF), and formic acid. These organic solvents may contain water. These organic solvents may be used individually by 1 type, and 2 or more types may be mixed and used for them.
  • the organic solvent is preferably one kind selected from hexafluoroisopropanol (HFIP), hexafluoroacetone (HFA) and formic acid, or a mixed solvent of two or more kinds.
  • the surfactant contained in the spinning dope may be either an ionic surfactant or a nonionic surfactant.
  • the ionic surfactant include a cationic surfactant, an anionic surfactant, and an amphoteric surfactant.
  • the surfactant contained in the spinning dope may be appropriately selected depending on the type of fibroin and the characteristics of the organic solvent. By containing the surfactant in the spinning dope, it is possible to obtain fibroin fibers having more excellent mechanical properties.
  • cationic surfactant examples include octyltrimethylammonium chloride, decyltrimethylammonium chloride, lauryltrimethylammonium chloride, alkyltrimethylammonium chloride such as cetyltrimethylammonium chloride and stearyltrimethylammonium chloride, lauryltrimethylammonium bromide, cetyltrimethyl bromide.
  • Alkyl trimethylammonium bromides such as ammonium and stearyltrimethylammonium bromide and tetrasteyl such as distearyldimethylammonium chloride, dicetyldimethylammonium chloride, dicocoyldimethylammonium chloride, dodecyldimethylethylammonium chloride and polyoxypropylenemethyldiethylammonium chloride.
  • Alkyl quaternary ammonium salt type cationic surfactant Quaternary ammonium salt type cationic surfactants such as benzalkonium chloride, benzalkonium bromide, lanolin acid sulfate ethylaminopropylethyldimethylammonium, cetyltrimethylammonium saccharin, and stearyltrimethylammonium saccharin, and butylpyridinium chloride, chloride Examples include alkyl pyridinium salt type cationic surfactants such as dodecylpyridinium and cetylpyridinium chloride.
  • anionic surfactant examples include carboxylic acid type anionic surfactants such as sodium laurate, sodium myristate, sodium palmitate and sodium stearate, sodium 1-hexanesulfonate, sodium 1-octanesulfonate, 1- Sulfonic acid type anionic surfactants such as sodium decane sulfonate and sodium octylbenzene sulfonate, sulfate type anionic surfactants such as sodium lauryl sulfate, sodium myristyl sulfate, sodium laureth sulfate and ammonium lauryl sulfate, and lauryl phosphate and Examples thereof include phosphate ester type anionic surfactants such as sodium lauryl phosphate.
  • carboxylic acid type anionic surfactants such as sodium laurate, sodium myristate, sodium palmitate and sodium stearate
  • sodium 1-hexanesulfonate sodium 1-octanesulfonate
  • amphoteric surfactants examples include alkylbetaine-type amphoteric surfactants such as stearyldimethylaminoacetic acid betaine and dodecylaminomethyldimethylsulfopropylbetaine, 2-heptadecyl-N-carboxymethyl-N-hydroxyethylimidazolinium betaine, etc. And alkylamine-type amphoteric surfactants such as lauryldimethylamine N-oxide and oleyldimethylamine N-oxide.
  • Nonionic surfactants include, for example, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene phenyl ether, polyoxyethylene alkyl phenyl ether, polyoxypropylene alkyl ether, polyoxyethylene polyoxypropylene glycol, polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl Ether type nonionic surfactants such as ether, polyoxyalkylene alkenyl ether and polyoxyethylene castor oil, ester type nonionic surfactants such as glycerin fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, glycerin fatty acid ester borate ester and sucrose fatty acid ester Agent, polyoxyethylene alkyl ester, polyoxyalkylene glycol rosin acid ester, polyoxyethylene sorbitan Polyoxyls such as fatty acid esters (eg, polyoxyethylene sorbitan monolaurate, polyoxyethylene sorbitan monostearate, polyoxyethylene sorbitan tristearate, polyoxyethylene sorbitan monoo
  • Polyoxyethylene fatty acid esters are composed of saturated fatty acid alkyl ester molecules, monounsaturated fatty acid alkyl ester molecules, diunsaturated fatty acid alkyl ester molecules, and polyunsaturated fatty acid alkyl ester molecules (ie, three or more carbon-carbon double bonds). Fatty acid alkyl ester molecules).
  • Surfactants may be used alone or in combination of two or more.
  • a commercially available surfactant can be used as the surfactant.
  • the surfactant preferably includes a nonionic surfactant (nonionic surfactant), more preferably includes a polyoxyethylene alkyl ether or a polyoxyethylene fatty acid ester, More preferably, it contains polyoxyethylene alkyl ether or polyoxyethylene alkyl ester.
  • Examples of the polyoxyethylene alkyl ether include polyethylene glycol bis (3-aminopropyl) ether, polyoxyethylene nonylphenyl ether, polyethylene glycol mono-4-nonylphenyl ether, polyoxyethylene octylphenyl ether, polyoxyethylene monododecyl Examples include ether, polyoxyethylene cetyl ether, polyoxyethylene monooleyl ether, polyoxyethylene stearyl ether, polyoxyethylene oleyl cetyl ether, polyoxyethylene octyldodecyl ether, and polyoxyethylene docosyl ether.
  • Examples of the polyoxyethylene alkyl ester include polyoxyethylene monolaurate, polyoxyethylene monostearate, polyoxyethylene monooleate, and polyoxyethylene distearate.
  • Fibroin is a modified fibroin having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 (Met-PRT410, Met-PRT468, Met-PRT799, PRT410, PRT468 and PRT799), or SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, Modified fibroin having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 and SEQ ID NO: 43 (Met-PRT888, Met-PRT965, Met-PRT889, Met-PRT916, Met-PRT918, Met -PRT699, Me -PRT 698
  • M in the formula is preferably 4 to 50, more preferably 10 to 40, and even more preferably 10 to 25.
  • polyoxyethylene nonyl phenyl ether polyoxyethylene nonyl phenyl ether, polyoxyethylene octyl phenyl ether, polyoxyethylene cetyl ether, polyoxyethylene oleyl ether, polyoxyethylene oleyl cetyl ether, polyoxyethylene stearyl ether, polyoxyethylene lauryl Ether, polyoxyethylene docosyl ether, etc. are mentioned.
  • M in the formula is preferably 4 to 50, more preferably 10 to 40, and even more preferably 10 to 25.
  • Specific examples include polyethylene glycol monolaurate and polyethylene glycol monostearate.
  • the concentration of the surfactant contained in the spinning dope is not particularly limited, and may be appropriately selected according to the type of fibroin, the concentration of fibroin, the type of organic solvent, and the like.
  • the concentration of the surfactant may be 0.01% to 10% by weight, 0.1% to 10% by weight, It may be from 01 wt% to 5.5 wt%, may be from 0.01 wt% to 5.0 wt%, may be from 0.1 wt% to 5.5 wt%, and may be 0.1 wt% % To 5.0% by weight, 0.2% to 5.0% by weight, 0.3% to 5.0% by weight, 0.4% to It may be 5.0% by weight, preferably 0.5% to 5.5% by weight, more preferably 0.5% to 5.0% by weight, and 0.8% to 4.5% by weight.
  • the lower limit of the surfactant concentration may be 0.01% by weight or more, 0.03% by weight or more, and 0.05% % By weight or more, 0.1% by weight or more, 0.2% by weight or more, 0.3% by weight or more, 0.4% by weight or more, It may be 0.5% by weight or more, 0.6% by weight or more, 0.7% by weight or more, 0.8% by weight or more, 0.9% by weight % Or more.
  • the upper limit value of the surfactant concentration may be 10% by weight or less, may be less than 10% by weight, or 9.0% by weight or less. 4. It may be 8.0% by weight or less, 7.0% by weight or less, 6.0% by weight or less, 5.8% by weight or less. 5 wt% or less, 5.3 wt% or less, 5.0 wt% or less, 4.8 wt% or less, 4.5 wt% or less. It may be 4.2% by weight or less, may be 3.8% by weight or less, and may be 3.5% by weight or less.
  • the concentration of the surfactant is less than 0.01% by weight, the effect of improving the strength and elongation of the fibroin fiber cannot be sufficiently obtained. If the concentration of the surfactant is 10% by weight, a sufficient effect is obtained. If the concentration exceeds 10% by weight, the production cost increases, which is not preferable.
  • the concentration of fibroin in the stock solution for spinning is preferably 5 to 40% by weight, more preferably 10 to 35% by weight, and more preferably 12 to 35% by weight when the total amount of the stock solution for spinning is 100% by weight. Is more preferably 15 to 35% by weight, more preferably 12 to 30% by weight, more preferably 15 to 30% by weight, and more preferably 20 to 35% by weight. It is preferably 25 to 35% by weight, more preferably 15 to 25% by weight.
  • concentration of fibroin is less than 5% by weight, it is difficult to sufficiently improve the stress and elongation of the fibroin fiber even when the surfactant is added. If the fibroin concentration exceeds 40% by weight, the viscosity of the spinning dope significantly increases or poor dissolution occurs, and the holes in the die are likely to be clogged when discharged from the spinneret, resulting in decreased productivity.
  • the viscosity of the spinning solution is not particularly limited as long as it can be dry-spun, but is preferably 10,000 to 100,000 mPa ⁇ sec at 25 ° C. and 20,000 to 100,000 mPa from the viewpoint of productivity. ⁇ Sec is more preferable, 20,000 to 80,000 mPa ⁇ sec is more preferable, and 30,000 to 50,000 mPa ⁇ sec is particularly preferable.
  • the viscosity of the spinning dope can be measured using, for example, a trade name “EMS viscometer” manufactured by Kyoto Electronics Industry Co., Ltd.
  • the spinning dope preferably contains no metal element from the viewpoint of performing dry spinning.
  • the method for preparing the spinning dope is not particularly limited, and fibroin, surfactant, and organic solvent may be mixed in any order. Fibroin may be dissolved after mixing the surfactant and the organic solvent, or the surfactant may be mixed after dissolving the fibroin in the organic solvent.
  • the spinning dope may be stirred or shaken for some time to promote dissolution. At that time, if necessary, the spinning dope may be heated to a temperature at which it can be dissolved depending on the fibroin and the organic solvent to be used.
  • the spinning dope may be heated to, for example, 30 ° C or higher, 40 ° C or higher, 50 ° C or higher, 60 ° C or higher, 70 ° C or higher, 80 ° C or higher, or 90 ° C or higher.
  • the upper limit of the heating temperature is, for example, not more than the boiling point of the organic solvent.
  • the fibroin according to the present invention includes naturally derived fibroin and modified fibroin.
  • naturally-occurring fibroin means fibroin having the same amino acid sequence as naturally-occurring fibroin
  • modified fibroin means fibroin having an amino acid sequence different from that of naturally-occurring fibroin. To do.
  • the fibroin according to the present embodiment is preferably spider silk fibroin.
  • Spider silk fibroin includes natural spider silk fibroin and modified fibroin derived from natural spider silk fibroin. Examples of natural spider silk fibroin include spider silk protein produced by spiders.
  • the fibroin according to the present embodiment is, for example, a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m or Formula 2: [(A) n motif-REP] m- (A) n motif. It may be a protein containing
  • an amino acid sequence (N-terminal sequence and C-terminal sequence) may be further added to either one or both of the N-terminal side and the C-terminal side of the domain sequence.
  • the N-terminal sequence and the C-terminal sequence are not limited to these, but are typically regions having no amino acid motif repeat characteristic of fibroin and consisting of about 100 amino acids.
  • domain sequence refers to a fibroin-specific crystal region (typically corresponding to the (A) n motif in the amino acid sequence) and an amorphous region (typically in the REP of the amino acid sequence).
  • (A) n motif represents an amino acid sequence mainly composed of alanine residues, and n is 2 to 27. n may be an integer from 2 to 20, 4 to 27, 4 to 20, 8 to 20, 10 to 20, 4 to 16, 8 to 16, or 10 to 16.
  • the ratio of the number of alanine residues to the total number of amino acid residues in the (A) n motif may be 40% or more, such as 60% or more, 70% or more, 80% or more, 83% or more, 85% or more, It may be 86% or more, 90% or more, 95% or more, or 100% (meaning that it is composed only of alanine residues).
  • a plurality of (A) n motifs present in the domain sequence may be composed of at least seven alanine residues alone.
  • REP indicates an amino acid sequence composed of 2 to 200 amino acid residues.
  • REP may be an amino acid sequence composed of 10 to 200 amino acid residues.
  • m represents an integer of 2 to 300, and may be an integer of 10 to 300.
  • a plurality of (A) n motifs may have the same amino acid sequence or different amino acid sequences.
  • Plural REPs may have the same amino acid sequence or different amino acid sequences.
  • Naturally occurring fibroin examples include a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m or Formula 2: [(A) n motif-REP] m- (A) n motif. Mention may be made of proteins containing. Specific examples of naturally occurring fibroin include fibroin produced by insects or spiders.
  • fibroin produced by insects include, for example, Bombyx mori, Kwako (Bombyx mandaraina), Tengea (Antheraea yamanai), ⁇ ⁇ (Antereaperanii), ⁇ ⁇ (Eriothyraminey) ), Silkworms produced by silkworms, such as Samia cythia, chestnut worms (Caligula japonica), Chuser moth (Antherea mylitta), Antheraea assama, and vespax (Vespaxia spp.) Hornet silk protein.
  • fibroin produced by insects include silkworm fibroin L chain (GenBank accession number M76430 (base sequence) and AAA27840.1 (amino acid sequence)).
  • Fibroin produced by spiders includes, for example, spiders belonging to the genus spider (Araneus spp.) Such as the spider spider, the spider spider, the red spider spider, and the bean spider, the genus spiders of the genus Araneus, the spider spider spider, the spider spider genus e Spiders, spiders such as spiders, spiders belonging to the genus Spider, spiders belonging to the genus Pronos, spiders belonging to the genus Trinofunda, such as Torinofundamas (genus Cyrtarachne) Spiders belonging to the genus (Gasteracantha), spiders belonging to the genus Spider (Ordgarius genus), such as the spiders, the spiders, and the spiders belonging to the genus Ordgarius Spiders belonging to the genus Argiope, such as the genus Argiope, spiders belonging to the genus Arachnura, such as the white-tailed spider, spiders belonging to the
  • Spiders belonging to the genus Azumigumi (Menosira), spiders belonging to the genus Dyschiriognatha (genus Dyschiriognatha) such as the common spider spider, the black spider spider, the genus Spider genus belonging to the genus Spider belonging to the genus (L) and the genus Spider belonging to the genus Usd Produced by spiders belonging to the family Tetragnathidae such as spiders belonging to the genus Prostenops
  • Examples include spider silk protein.
  • the spider silk protein include dragline proteins such as MaSp (MaSp1 and MaSp2) and ADF (ADF3 and ADF4), MiSp (MiSp1 and MiSp2), and the like.
  • spider silk proteins produced by spiders include, for example, fibroin-3 (adf-3) [derived from Araneus diadematus] (GenBank accession numbers AAC47010 (amino acid sequence), U47855 (base sequence)), fibroin-4 (adf-4) [derived from Araneus diadematus] (GenBank accession number AAC47011 (amino acid sequence), U47856 (base sequence)), dragline silk protein spiroin 1 [derived from Nephila clavipes] (GenBank accession number 4) ), U37520 (base sequence)), major ampulate spidro n 1 [derived from Latroductus hesperus] (GenBank accession number ABR68856 (amino acid sequence), EF595246 (base sequence)), dragline silk protein spidolin 2 [derived from Nephila clavata (GenBank accession number AAL32 base sequence 44 AAL32 base sequence amino acid 44, amino acid sequence 44 AAL47)
  • Naturally derived fibroin include fibroin whose sequence information is registered in NCBI GenBank.
  • sequence information is registered in NCBI GenBank.
  • spidin, sample, fibroin, “silk and polypeptide”, or “silk and protein” is described as a keyword in DEFINITION from sequences including INV as DIVISION among the sequence information registered in NCBI GenBank. It can be confirmed by extracting a character string of a specific product from the sequence, CDS, and a sequence in which the specific character string is described from SOURCE to TISSUE TYPE.
  • the modified fibroin is, for example, a modified amino acid sequence based on the amino acid sequence of naturally occurring fibroin (for example, a modified amino acid sequence by modifying the gene sequence of a cloned naturally occurring fibroin). Alternatively, it may be one that is artificially designed and synthesized without relying on natural fibroin (for example, one having a desired amino acid sequence by chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence). .
  • the modified fibroin is, for example, a modification of the amino acid sequence corresponding to, for example, substitution, deletion, insertion and / or addition of one or more amino acid residues to the cloned natural fibroin gene sequence. Can be obtained at Substitution, deletion, insertion and / or addition of amino acid residues can be carried out by methods well known to those skilled in the art such as partial-directed mutagenesis. Specifically, Nucleic Acid Res. 10, 6487 (1982), Methods in Enzymology, 100, 448 (1983), and the like.
  • the modified fibroin may be, for example, a modified fibroin derived from a silk protein produced by a silkworm, or a modified fibroin derived from a spider silk protein produced by a spider.
  • modified fibroin examples include modified fibroin (first modified fibroin) derived from the large sphincter bookmark silk protein produced in the spider large bottle gland, modified fibroin with reduced glycine residue content (Second modified fibroin), (A) modified fibroin with reduced n- motif content (third modified fibroin), glycine residue content, and (A) n- motif content reduced
  • modified fibroin fourth modified fibroin
  • a modified fibroin having a domain sequence that locally includes a region having a large hydrophobicity index fifth modified fibroin
  • a domain sequence having a reduced glutamine residue content Modified fibroin may be mentioned.
  • the modified fibroin derived from the large sphincter bookmark silk protein produced in the spider large bottle-like gland includes a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m
  • the protein containing is mentioned.
  • n is preferably an integer of 3 to 20, more preferably an integer of 4 to 20, still more preferably an integer of 8 to 20, still more preferably an integer of 10 to 20.
  • An integer of ⁇ 16 is even more preferred, an integer of 8-16 is particularly preferred, and an integer of 10-16 is most preferred.
  • the number of amino acid residues constituting REP is preferably 10 to 200 residues, more preferably 10 to 150 residues, and 20 to 100 residues. More preferably, it is more preferably 20 to 75 residues.
  • the total number of glycine residues, serine residues and alanine residues contained in the amino acid sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m is an amino acid residue. The total number is preferably 40% or more, more preferably 60% or more, and even more preferably 70% or more.
  • the first modified fibroin comprises an amino acid sequence unit represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m , and the C-terminal sequence is represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 3, Alternatively, it may be a polypeptide that is an amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is identical to the amino acid sequence consisting of 50 amino acids at the C-terminal of the amino acid sequence of ADF3 (GI: 1263287, NCBI), and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is the sequence
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is identical to the amino acid sequence obtained by removing 20 residues from the C-terminal, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 has 29 residues removed from the C-terminal of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. It is identical to the amino acid sequence.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or (1-ii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 has a sequence identity of 90% or more. Mention may be made of modified fibroin comprising an amino acid sequence having. The sequence identity is preferably 95% or more.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is an amino acid sequence of ADF3 in which an amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) consisting of a start codon, a His10 tag and an HRV3C protease (Human rhinovirus 3C protease) recognition site is added to the N-terminus.
  • the 13th repeat region was increased to approximately double, and the translation was mutated to terminate at the 1154th amino acid residue.
  • the C-terminal amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • the modified fibroin (1-i) may be composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • the modified fibroin in which the content of glycine residues is reduced has an amino acid sequence in which the domain sequence of the modified fibroin has a reduced content of glycine residues compared to naturally occurring fibroin. It can be said that the second modified fibroin has an amino acid sequence corresponding to at least one or more glycine residues in REP substituted with another amino acid residue as compared with naturally occurring fibroin. .
  • the second modified fibroin has a domain sequence of GGX and GPGXX in REP (where G is a glycine residue, P is a proline residue, and X is an amino acid residue other than glycine) as compared to naturally occurring fibroin.
  • G is a glycine residue
  • P is a proline residue
  • X is an amino acid residue other than glycine
  • at least one glycine residue in at least one or more of the motif sequences is substituted with another amino acid residue. May be.
  • the ratio of the motif sequence in which the above glycine residue is replaced with another amino acid residue may be 10% or more with respect to the entire motif sequence.
  • the second modified fibroin comprises a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m , and is located on the most C-terminal side from the domain sequence (A) from the n motif to the domain sequence.
  • the number of alanine residues relative to the total number of amino acid residues in the n motif may be 83% or more, preferably 86% or more, more preferably 90% or more, and 95% or more. More preferably, it is 100% (meaning that it is composed only of alanine residues).
  • the second modified fibroin is preferably one in which the content ratio of the amino acid sequence consisting of XGX is increased by substituting one glycine residue of the GGX motif with another amino acid residue.
  • the content ratio of the amino acid sequence consisting of GGX in the domain sequence is preferably 30% or less, more preferably 20% or less, still more preferably 10% or less, % Or less is even more preferable, 4% or less is even more preferable, and 2% or less is particularly preferable.
  • the content ratio of the amino acid sequence consisting of GGX in the domain sequence can be calculated by the same method as the method for calculating the content ratio (z / w) of the amino acid sequence consisting of XGX below.
  • a fibroin modified fibroin or naturally-occurring fibroin containing a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m , (A) n located closest to the C-terminal side from the domain sequence
  • An amino acid sequence consisting of XGX is extracted from all REPs included in the sequence excluding the sequence from the motif to the C-terminal of the domain sequence.
  • z / w (%) can be calculated by dividing z by w.
  • z / w is preferably 50.9% or more, more preferably 56.1% or more, further preferably 58.7% or more, and 70% or more. It is still more preferable that it is 80% or more. Although there is no restriction
  • the second modified fibroin is obtained by, for example, modifying a cloned natural fibroin gene sequence so as to encode another amino acid residue by substituting at least a part of a base sequence encoding a glycine residue. Can be obtained. At this time, one glycine residue in GGX motif and GPGXX motif may be selected as a glycine residue to be modified, or substitution may be performed so that z / w is 50.9% or more.
  • an amino acid sequence satisfying the above-described aspect can be designed from the amino acid sequence of naturally derived fibroin, and a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence can be obtained by chemical synthesis.
  • one or more amino acid residues are further substituted or deleted.
  • the amino acid sequence corresponding to the insertion and / or addition may be modified.
  • the other amino acid residue is not particularly limited as long as it is an amino acid residue other than glycine residue, but valine (V) residue, leucine (L) residue, isoleucine (I) residue, methionine ( M) hydrophobic amino acid residues such as proline (P) residue, phenylalanine (F) residue and tryptophan (W) residue, glutamine (Q) residue, asparagine (N) residue, serine (S ) Residues, lysine (K) residues and glutamic acid (E) residues are preferred, and valine (V) residues, leucine (L) residues, isoleucine (I) residues and glutamine ( Q) residue is more preferable, and glutamine (Q) residue is more preferable.
  • modified fibroin (2-i) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9, or (2-ii) SEQ ID NO: 6, sequence Mention may be made of modified fibroin comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in No. 7, SEQ ID No. 8 or SEQ ID No. 9.
  • the modified fibroin (2-i) will be described.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 is obtained by substituting all GGX in REP of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 corresponding to naturally occurring fibroin with GQX.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, wherein every two (A) n motifs are deleted from the N-terminal side to the C-terminal side, and further before the C-terminal sequence.
  • One [(A) n motif-REP] is inserted into the.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 has two alanine residues inserted at the C-terminal side of each (A) n motif of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, and a part of glutamine (Q) residues. Substituted with a serine (S) residue and a part of the amino acid at the N-terminal side was deleted so as to be almost the same as the molecular weight of SEQ ID NO: 7.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 is a region of 20 domain sequences present in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 (however, several amino acid residues on the C-terminal side of the region are substituted). Is a sequence in which a His tag is added to the C-terminal of the sequence repeated four times.
  • the value of z / w in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 (corresponding to naturally occurring fibroin) is 46.8%.
  • the z / w values of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 6, the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 7, the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 8, and the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 9 are 58.7%, 70.1%, 66.1% and 70.0%.
  • the value of x / y at the ratio of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 (described later) 1: 1.8 to 11.3 is: 15.0%, 15.0%, 93.4%, 92.7% and 89.3%, respectively.
  • the modified fibroin (2-i) may be composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9.
  • the modified fibroin (2-ii) includes an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9.
  • the modified fibroin of (2-ii) is also a protein containing a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m .
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the modified fibroin of (2-ii) has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9, and is contained in REP (XGX ( Where X is an amino acid residue other than glycine.) Z / w where z is the total number of amino acid residues of the amino acid sequence consisting of z and w is the total number of amino acid residues of REP in the domain sequence. Is preferably 50.9% or more.
  • the second modified fibroin may contain a tag sequence at one or both of the N-terminal and C-terminal. This makes it possible to isolate, immobilize, detect and visualize the modified fibroin.
  • tag sequences include affinity tags that use specific affinity (binding property, affinity) with other molecules.
  • affinity tag include a histidine tag (His tag).
  • His tag is a short peptide with about 4 to 10 histidine residues, and has the property of binding specifically to metal ions such as nickel. Therefore, the isolation of modified fibroin by metal chelating chromatography (chelating metal chromatography) Can be used.
  • Specific examples of the tag sequence include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 (amino acid sequence including His tag sequence and hinge sequence).
  • GST glutathione-S-transferase
  • MBP maltose-binding protein
  • an “epitope tag” using an antigen-antibody reaction can also be used.
  • a peptide (epitope) exhibiting antigenicity as a tag sequence, an antibody against the epitope can be bound.
  • HA peptide sequence of hemagglutinin of influenza virus
  • myc tag peptide sequence of hemagglutinin of influenza virus
  • FLAG tag peptide sequence of hemagglutinin of influenza virus
  • a tag sequence that can be separated with a specific protease can also be used.
  • the modified fibroin from which the tag sequence has been separated can also be recovered.
  • modified fibroin containing the tag sequence (2-iii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15, or (2-iv) Mention may be made of modified fibroin comprising an amino acid sequence having a sequence identity of 90% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15.
  • amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 are SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, respectively.
  • an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 (including a His tag sequence and a hinge sequence) is added to the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9.
  • the modified fibroin (2-iii) may be composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15.
  • the modified fibroin (2-iv) includes an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15.
  • the modified fibroin of (2-iv) is also a protein containing a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m .
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the modified fibroin of (2-iv) has an XGX (which has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15 and is contained in REP ( Where X is an amino acid residue other than glycine.) Z / w where z is the total number of amino acid residues of the amino acid sequence consisting of z and w is the total number of amino acid residues of REP in the domain sequence. Is preferably 50.9% or more.
  • the second modified fibroin may contain a secretion signal for releasing the protein produced in the recombinant protein production system to the outside of the host.
  • the sequence of the secretion signal can be appropriately set according to the type of host.
  • a modified fibroin with a reduced content of n motif is a domain sequence whose amino acid sequence has a reduced content of n motif compared to naturally occurring fibroin (A) Has an array. It can be said that the domain sequence of the third modified fibroin has an amino acid sequence corresponding to the deletion of at least one or more (A) n motifs, as compared to naturally occurring fibroin.
  • the third modified fibroin may have an amino acid sequence corresponding to 10% to 40% deletion of the (A) n motif from naturally occurring fibroin.
  • the third modification fibroin its domain sequence, compared to the naturally occurring fibroin, at least from the N-terminal side toward the C-terminal one to three (A) n motif every one (A) n motif May have an amino acid sequence corresponding to deletion of.
  • the third modified fibroin has a domain sequence that is at least two consecutive from the N-terminal side to the C-terminal side compared to the naturally occurring fibroin (A) deletion of the n motif, and one (A ) It may have an amino acid sequence corresponding to the deletion of the n motif repeated in this order.
  • the third modified fibroin may have an amino acid sequence whose domain sequence corresponds to that at least every two (A) n motifs are deleted from the N-terminal side to the C-terminal side. .
  • the third modified fibroin includes a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m , and two adjacent [(A) n motifs from the N-terminal side toward the C-terminal side. -REP]
  • the ratio of the number of amino acid residues in the other REP is 1.8 to
  • x the maximum total value of the total number of amino acid residues of two adjacent [(A) n motif-REP] units that becomes 11.3
  • x the total number of amino acid residues in the domain sequence is y
  • it may have an amino acid sequence in which x / y is 20% or more, 30% or more, 40% or more, or 50% or more.
  • the number of alanine residues relative to the total number of amino acid residues in the n motif may be 83% or more, preferably 86% or more, more preferably 90% or more, and 95% or more. More preferably, it is 100% (meaning that it is composed only of alanine residues).
  • FIG. 1 shows a domain sequence obtained by removing N-terminal sequence and C-terminal sequence from fibroin.
  • the domain sequence is from the N-terminal side (left side): (A) n motif-first REP (50 amino acid residues)-(A) n motif-second REP (100 amino acid residues)-(A) n Motif-third REP (10 amino acid residues)-(A) n motif-fourth REP (20 amino acid residues)-(A) n motif-fifth REP (30 amino acid residues)-(A) It has a sequence called n motif.
  • FIG. 1 includes pattern 1 (comparison between the first REP and the second REP, and comparison between the third REP and the fourth REP), pattern 2 (comparison between the first REP and the second REP, and 4th REP and 5th REP), pattern 3 (2nd REP and 3rd REP comparison, 4th REP and 5th REP comparison), pattern 4 (first REP and Comparison of the second REP).
  • pattern 1 compare between the first REP and the second REP, and comparison between the third REP and the fourth REP
  • pattern 2 comparison between the first REP and the second REP, and 4th REP and 5th REP
  • pattern 3 (2nd REP and 3rd REP comparison, 4th REP and 5th REP comparison
  • pattern 4 first REP and Comparison of the second REP
  • the number of amino acid residues of each REP in the two adjacent [(A) n motif-REP] units selected is compared.
  • each pattern the number of all amino acid residues of two adjacent [(A) n motif-REP] units indicated by solid lines is added (not only REP but also (A) the number of amino acid residues of the n motif. is there.). Then, the total value added is compared, and the total value (maximum value of the total value) of the pattern having the maximum total value is set as x. In the example shown in FIG. 1, the total value of pattern 1 is the maximum.
  • x / y (%) can be calculated by dividing x by the total number of amino acid residues y of the domain sequence.
  • x / y is preferably 50% or more, more preferably 60% or more, still more preferably 65% or more, and even more preferably 70% or more. Preferably, it is still more preferably 75% or more, and particularly preferably 80% or more. There is no restriction
  • x / y is preferably 89.6% or more, and when the jagged ratio is 1: 1.8 to 3.4, x / y / Y is preferably 77.1% or more, and when the jagged ratio is 1: 1.9 to 8.4, x / y is preferably 75.9% or more, and the jagged ratio is 1 In the case of 1.9 to 4.1, x / y is preferably 64.2% or more.
  • a plurality of third modified fibroins are present in the domain sequence (A)
  • x / y is 46.4% or more It is preferably 50% or more, more preferably 55% or more, still more preferably 60% or more, still more preferably 70% or more, and more preferably 80% or more. It is particularly preferred.
  • one or a plurality of sequences encoding the n motif is deleted so that x / y is 64.2% or more from the cloned gene sequence of naturally occurring fibroin.
  • an amino acid sequence corresponding to the deletion of one or more (A) n motifs is designed so that x / y is 64.2% or more from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin. It can also be obtained by chemically synthesizing a nucleic acid encoding the amino acid sequence.
  • one or more amino acid residues are further substituted, deleted, inserted and / or added.
  • the amino acid sequence corresponding to this may be modified.
  • modified fibroin As more specific examples of the third modified fibroin, (3-i) SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9, or (3-ii) SEQ ID NO: 18, sequence Mention may be made of modified fibroin comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in No. 7, SEQ ID No. 8 or SEQ ID No. 9.
  • the modified fibroin (3-i) will be described.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 corresponding to naturally occurring fibroin, wherein (A) n motif is deleted every two from the N-terminal side to the C-terminal side. Furthermore, one [(A) n motif-REP] is inserted in front of the C-terminal sequence.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 is obtained by substituting all GGX in REP of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18 with GQX.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 has two alanine residues inserted at the C-terminal side of each (A) n motif of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, and a part of glutamine (Q) residues. Substituted with a serine (S) residue and a part of the amino acid at the N-terminal side was deleted so as to be almost the same as the molecular weight of SEQ ID NO: 7.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 is a region of 20 domain sequences present in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 (however, several amino acid residues on the C-terminal side of the region are substituted). Is a sequence in which a His tag is added to the C-terminal of the sequence repeated four times.
  • the value of x / y in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 (corresponding to naturally-occurring fibroin) at a jagged ratio of 1: 1.8 to 11.3 is 15.0%.
  • the value of x / y in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 18 and the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 7 are both 93.4%.
  • the value of x / y in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 is 92.7%.
  • the value of x / y in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 is 89.3%.
  • the z / w values in the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 are 46.8%, 56.2%, 70.1% and 66. respectively. 1% and 70.0%.
  • the modified fibroin (3-i) may consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9.
  • the modified fibroin (3-ii) includes an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9.
  • the modified fibroin of (3-ii) is also a protein containing a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m .
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the modified fibroin of (3-ii) has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9, and from the N-terminal side to the C-terminal side
  • the number of amino acid residues of REP of two adjacent [(A) n motif-REP] units is sequentially compared, and the number of amino acid residues of REP having a small number of amino acid residues is 1, the other
  • x / y is 64.2% or more, where x is the maximum total value of the total number of bases and y is the total number of amino acid residues in the domain sequence.
  • the third modified fibroin may contain the tag sequence described above at one or both of the N-terminal and C-terminal.
  • modified fibroin containing the tag sequence (3-iii) SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15, or (2-iv) sequence
  • modified fibroin comprising an amino acid sequence having a sequence identity of 90% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15.
  • amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 are SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, respectively.
  • an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 (including a His tag sequence and a hinge sequence) is added to the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9.
  • the modified fibroin may be composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15.
  • the modified fibroin (3-iv) includes an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15.
  • the modified fibroin of (3-iv) is also a protein containing a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m .
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the modified fibroin (3-iv) has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15, and from the N-terminal side to the C-terminal side.
  • the other X is the maximum total value of the total number of amino acid residues of two adjacent [(A) n motif-REP] units with a ratio of the number of amino acid residues of REP of 1.8 to 11.3.
  • x / y is preferably 64.2% or more.
  • the third modified fibroin may contain a secretion signal for releasing the protein produced in the recombinant protein production system to the outside of the host.
  • the sequence of the secretion signal can be appropriately set according to the type of host.
  • the content of glycine residues, and (A) n motifs modified fibroin content is reduced in the (fourth modified fibroin), the domain sequence is compared to the naturally occurring fibroin, (A) n motif In addition to having a reduced content of glycine residues, it has an amino acid sequence with a reduced content of glycine residues.
  • the domain sequence of the fourth modified fibroin has at least one or more (A) n motifs deleted as compared to naturally occurring fibroin, and at least one or more glycine residues in the REP. It can be said to have an amino acid sequence corresponding to the substitution with another amino acid residue.
  • the fourth modified fibroin includes the modified fibroin (second modified fibroin) in which the content of the glycine residue described above is reduced, and (A) the modified fibroin (third in which the content of the n motif is reduced). It is a modified fibroin having the characteristics of modified fibroin). Specific embodiments and the like are as described in the second modified fibroin and the third modified fibroin.
  • modified fibroin (4-i) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9, (4-ii) SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: Mention may be made of modified fibroin comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in FIG.
  • modified fibroin comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 are as described above.
  • the fourth modified fibroin containing the tag sequence (4-i) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15, or (4-ii) SEQ ID NO: 11, sequence A modified fibroin containing an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in No. 14 or SEQ ID No. 15 can be mentioned.
  • a modified fibroin having a domain sequence including a region having a large hydrophobic index locally has a domain sequence of one or more amino acid residues in REP as compared to naturally occurring fibroin. Is replaced with an amino acid residue having a large hydrophobicity index and / or one or more amino acid residues having a large hydrophobicity index are inserted into REP. It may have an amino acid sequence including a region.
  • the region where the hydrophobic index is locally large is preferably composed of 2 to 4 amino acid residues.
  • the amino acid residue having a large hydrophobicity index is an amino acid selected from isoleucine (I), valine (V), leucine (L), phenylalanine (F), cysteine (C), methionine (M) and alanine (A). More preferably, it is a residue.
  • the fifth modified fibroin has one or more amino acid residues in REP substituted with amino acid residues having a higher hydrophobicity index and / or one or more in REP compared to naturally occurring fibroin.
  • substitution, deletion, insertion and / or addition of one or more amino acid residues as compared with naturally occurring fibroin There may be amino acid sequence modifications corresponding to the above.
  • the fifth modified fibroin is obtained by removing one or more hydrophilic amino acid residues (for example, amino acid residues having a negative hydrophobicity index) in the REP from the cloned natural fibroin gene sequence. It can be obtained by substituting a group (for example, an amino acid residue having a positive hydrophobicity index) and / or inserting one or more hydrophobic amino acid residues in REP.
  • hydrophilic amino acid residues for example, amino acid residues having a negative hydrophobicity index
  • a group for example, an amino acid residue having a positive hydrophobicity index
  • one or more hydrophilic amino acid residues in REP are substituted with hydrophobic amino acid residues from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin, and / or one or more hydrophobic amino acid residues in REP It can also be obtained by designing an amino acid sequence corresponding to insertion of, and chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence.
  • one or more hydrophilic amino acid residues in REP have been replaced with hydrophobic amino acid residues from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin and / or one or more hydrophobic amino acids in REP
  • the amino acid sequence corresponding to the substitution, deletion, insertion and / or addition of one or more amino acid residues may be further modified.
  • the fifth modified fibroin comprises a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m , and is located on the most C-terminal side (A) from the n motif to the C terminus of the domain sequence.
  • p is the total number of amino acid residues included in the region where the average value of the hydrophobicity index of four consecutive amino acid residues is 2.6 or more
  • (A) When the total number of amino acid residues contained in the sequence excluding the sequence from the n motif to the C terminus of the domain sequence, which is located at the most C-terminal side, from the domain sequence is q, p / q is 6 It may have an amino acid sequence that is 2% or more.
  • hydrophobicity index of amino acid residues As for the hydrophobicity index of amino acid residues, a known index (Hydropathy index: Kyte J, & Doolittle R (1982) “A simple method for displaying the hydropathic character of bio.p. 7”. 105-132). Specifically, the hydrophobicity index (hydropathic index, hereinafter also referred to as “HI”) of each amino acid is as shown in Table 1 below.
  • a sequence obtained by removing the sequence from the domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m to the most C-terminal side from the domain (A) n motif to the C terminus of the domain sequence. (Hereinafter referred to as “array A”).
  • array A the average value of the hydrophobicity index of four consecutive amino acid residues is calculated.
  • the average value of the hydrophobicity index is obtained by dividing the total HI of each amino acid residue contained in the four consecutive amino acid residues by 4 (number of amino acid residues).
  • the average value of the hydrophobicity index is obtained for all four consecutive amino acid residues (each amino acid residue is used for calculating the average value 1 to 4 times). Next, a region where the average value of the hydrophobicity index of four consecutive amino acid residues is 2.6 or more is specified. Even if a certain amino acid residue corresponds to a plurality of “four consecutive amino acid residues whose average value of hydrophobicity index is 2.6 or more”, it should be included as one amino acid residue in the region. become.
  • the total number of amino acid residues contained in the region is p.
  • the total number of amino acid residues contained in sequence A is q.
  • the average value of the hydrophobicity index of four consecutive amino acid residues is 2
  • p / q is preferably 6.2% or more, more preferably 7% or more, further preferably 10% or more, and preferably 20% or more. Even more preferably, it is still more preferably 30% or more.
  • the upper limit of p / q is not particularly limited, but may be 45% or less, for example.
  • the fifth modified fibroin is, for example, one or a plurality of hydrophilic amino acid residues (for example, a hydrophobicity index) in the REP so that the amino acid sequence of the naturally-derived fibroin thus cloned satisfies the above p / q condition. Is replaced with a hydrophobic amino acid residue (for example, an amino acid residue with a positive hydrophobicity index) and / or one or more hydrophobic amino acid residues are inserted in the REP By doing so, it can be obtained by locally modifying the amino acid sequence to include a region having a large hydrophobicity index.
  • hydrophilic amino acid residues for example, a hydrophobicity index
  • an amino acid sequence satisfying the above p / q conditions can be designed from the amino acid sequence of naturally derived fibroin, and a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence can be obtained by chemical synthesis.
  • one or more amino acid residues in REP were replaced with amino acid residues having a higher hydrophobicity index and / or one or more amino acid residues in REP.
  • modifications corresponding to substitution, deletion, insertion and / or addition of one or more amino acid residues may be performed. .
  • the amino acid residue having a large hydrophobicity index is not particularly limited, but isoleucine (I), valine (V), leucine (L), phenylalanine (F), cysteine (C), methionine (M) and alanine (A ) are preferred, and valine (V), leucine (L) and isoleucine (I) are more preferred.
  • modified fibroin As specific examples of the fifth modified fibroin, (5-i) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21, or (5-ii) SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: Mention may be made of modified fibroin comprising an amino acid sequence having a sequence identity of 90% or more with the amino acid sequence shown in FIG.
  • the modified fibroin (5-i) will be described.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 is an amino acid sequence in which alanine residues in the (A) n motif of (A) naturally derived fibroin are deleted so that the number of consecutive alanine residues is five.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 has two amino acid sequences (VLI) each consisting of 3 amino acid residues inserted into every other REP with respect to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, and represented by SEQ ID NO: 22. A part of amino acids on the C-terminal side are deleted so that the molecular weight of the amino acid sequence is almost the same.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23 is obtained by inserting two alanine residues at the C-terminal side of each (A) n motif with respect to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, and further adding some glutamine (Q) residues. A group is substituted with a serine (S) residue, and a part of amino acids on the C-terminal side is deleted so as to be approximately the same as the molecular weight of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 is obtained by inserting one amino acid sequence (VLI) consisting of 3 amino acid residues every other REP to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21 is obtained by inserting two amino acid sequences (VLI) each consisting of 3 amino acid residues into the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23 every other REP.
  • the modified fibroin (5-i) may be composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21.
  • the modified fibroin (5-ii) comprises an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21.
  • the modified fibroin of (5-ii) is also a protein containing a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m .
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the modified fibroin of (5-ii) has a sequence identity of 90% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21, and is located on the most C-terminal side (A) n
  • the amino acids included in the region where the average value of the hydrophobicity index of 4 consecutive amino acid residues is 2.6 or more P is the total number of residues
  • P / q is preferably 6.2% or more.
  • the fifth modified fibroin may contain a tag sequence at one or both of the N-terminal and C-terminal.
  • modified fibroin containing a tag sequence (-iii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 26, or (5-iv) SEQ ID NO: 24, sequence Mention may be made of modified fibroin comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in No. 25 or SEQ ID No. 26.
  • amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, and SEQ ID NO: 26 are the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 12 at the N-terminus of the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21, respectively (His tag Including a sequence and a hinge sequence).
  • the modified fibroin may consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 26.
  • the modified fibroin (5-iv) includes an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 26.
  • the modified fibroin of (5-iv) is also a protein containing a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m .
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the modified fibroin (5-iv) has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 26, and is located at the most C-terminal side (A) n
  • the amino acids included in the region where the average value of the hydrophobicity index of 4 consecutive amino acid residues is 2.6 or more P is the total number of residues
  • P / q is preferably 6.2% or more.
  • the fifth modified fibroin may contain a secretion signal for releasing the protein produced in the recombinant protein production system to the outside of the host.
  • the sequence of the secretion signal can be appropriately set according to the type of host.
  • the modified fibroin having a domain sequence in which the content of glutamine residues is reduced (sixth modified fibroin) has an amino acid sequence in which the content of glutamine residues is reduced compared to naturally occurring fibroin.
  • the sixth modified fibroin preferably contains at least one motif selected from GGX motif and GPGXX motif in the amino acid sequence of REP.
  • the content ratio of the GPGXX motif is usually 1% or more, may be 5% or more, and is preferably 10% or more.
  • the upper limit of GPGXX motif content rate 50% or less may be sufficient and 30% or less may be sufficient.
  • the “GPGXX motif content” is a value calculated by the following method.
  • Formula 1 [(A) n motif-REP] m or Formula 2: [(A) n motif-REP] m-
  • A) In the fibroin containing the domain sequence represented by the n motif, the most C-terminal side (A) In all REPs included in the sequence excluding the sequence from the n motif to the C-terminal of the domain sequence from the domain sequence, the total number of GPGXX motifs included in the region is tripled (ie, (Corresponding to the total number of G and P in the GPGXX motif) is defined as s, the sequence from the (A) n motif located at the most C-terminal side to the C-terminus of the domain sequence is excluded from the domain sequence, and (A) the n motif
  • the content ratio of GPGXX motif is calculated as s / t, where t is the total number of amino acid residues of all REPs removed.
  • “A sequence located at the most C-terminal side (A) excluding the sequence from the n motif to the C-terminal of the domain sequence from the domain sequence” (A)
  • the sequence from the n motif to the C terminus of the domain sequence ”(sequence corresponding to REP) may include a sequence that is not highly correlated with the sequence characteristic of fibroin, and m is small In this case (that is, when the domain sequence is short), the calculation result of the content ratio of the GPGXX motif is affected, so this influence is excluded.
  • the “GPGXX motif” is located at the C-terminus of REP, even if “XX” is, for example, “AA”, it is treated as “GPGXX motif”.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing the domain sequence of fibroin.
  • the calculation method of the content ratio of GPGXX motif will be specifically described with reference to FIG.
  • all REPs are “most C-terminally located ( A) GPGXX for calculating s because it is included in the “sequence excluding the sequence from the n motif to the C-terminal of the domain sequence from the domain sequence” (the sequence indicated by “region A” in FIG. 3).
  • the sixth modified fibroin preferably has a glutamine residue content of 9% or less, more preferably 7% or less, still more preferably 4% or less, and particularly preferably 0%. .
  • the “glutamine residue content” is a value calculated by the following method.
  • Formula 1 [(A) n motif-REP] m or Formula 2: [(A) n motif-REP] m- (A) In the fibroin containing the domain sequence represented by the n motif, the most C-terminal side Located in (A) all REPs included in the sequence (sequence corresponding to “region A” in FIG.
  • the total number of glutamine residues is u, the sequence from the (A) n- motif located at the most C-terminal side to the C-terminus of the domain sequence is removed from the domain sequence, and (A) the amino acid residues of all REPs excluding the n- motif
  • the glutamine residue content is calculated as u / t. In the calculation of the glutamine residue content rate, the reason why "A sequence located at the most C-terminal side (A) excluding the sequence from the n motif to the C-terminus of the domain sequence from the domain sequence" is the reason described above. It is the same.
  • the sixth modified fibroin corresponds to its domain sequence having one or more glutamine residues in REP deleted or replaced with other amino acid residues compared to naturally occurring fibroin. It may have an amino acid sequence.
  • the “other amino acid residue” may be an amino acid residue other than a glutamine residue, but is preferably an amino acid residue having a larger hydrophobicity index than the glutamine residue. Table 1 shows the hydrophobicity index of amino acid residues.
  • amino acid residues having a larger hydrophobicity index than glutamine residues include isoleucine (I), valine (V), leucine (L), phenylalanine (F), cysteine (C), methionine (M ) Amino acid residues selected from alanine (A), glycine (G), threonine (T), serine (S), tryptophan (W), tyrosine (Y), proline (P) and histidine (H). it can.
  • an amino acid residue selected from isoleucine (I), valine (V), leucine (L), phenylalanine (F), cysteine (C), methionine (M) and alanine (A) is more preferable. More preferred is an amino acid residue selected from among isoleucine (I), valine (V), leucine (L) and phenylalanine (F).
  • the hydrophobicity of REP is preferably ⁇ 0.8 or more, more preferably ⁇ 0.7 or more, still more preferably 0 or more, and 0.3 or more. It is still more preferable that it is and it is especially preferable that it is 0.4 or more.
  • the “hydrophobicity of REP” is a value calculated by the following method.
  • Formula 1 [(A) n motif-REP] m or Formula 2: [(A) n motif-REP] m- (A) In the fibroin containing the domain sequence represented by the n motif, the most C-terminal side (A) In all REPs included in the sequence (sequence corresponding to “region A” in FIG. 3) obtained by removing the sequence from the n motif to the C-terminal of the domain sequence from the domain sequence (each corresponding to “region A” in FIG.
  • each amino acid in the region Let v be the sum of the hydrophobicity indices of the residues, remove the sequence from the (A) n motif located at the most C-terminal side to the C-terminus of the domain sequence from the domain sequence, and (A) all REPs excluding the n motif
  • the hydrophobicity of REP is calculated as v / t, where t is the total number of amino acid residues.
  • the reason why “A sequence located at the most C-terminal side (A) excluding the sequence from the n motif to the C-terminal of the domain sequence from the domain sequence” is the reason described above. It is the same.
  • the sixth modified fibroin has its domain sequence deleted one or more glutamine residues in REP and / or one or more glutamine residues in REP compared to naturally occurring fibroin.
  • modifications corresponding to substitution of other amino acid residues there may also be amino acid sequence modifications corresponding to substitution, deletion, insertion and / or addition of one or more amino acid residues. .
  • the sixth modified fibroin is, for example, deleting one or more glutamine residues in REP from the cloned gene sequence of naturally occurring fibroin and / or other one or more glutamine residues in REP. It can obtain by substituting to the amino acid residue.
  • one or more glutamine residues in REP are deleted from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin, and / or one or more glutamine residues in REP are replaced with other amino acid residues.
  • it can also be obtained by designing a corresponding amino acid sequence and chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence.
  • modified fibroin (6-i) SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 or SEQ ID NO: 42
  • Modified fibroin comprising the amino acid sequence shown, or (6-ii) represented by SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 or SEQ ID NO: 42
  • Mention may be made of modified fibroin comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence.
  • the (6-i) modified fibroin will be described.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 is based on the base sequence and amino acid sequence of Nephila clapes (GenBank accession numbers: P46804.1, GI: 1174415), which is a naturally occurring fibroin, based on (A) n
  • the amino acid sequence in which the alanine residue in the motif is continued is modified with an amino acid to improve productivity, such as the number of consecutive alanine residues is five.
  • Met-PRT410 since Met-PRT410 has not altered the glutamine residue (Q), the glutamine residue content is comparable to the glutamine residue content of naturally occurring fibroin.
  • the amino acid sequence (M_PRT888) represented by SEQ ID NO: 27 is obtained by replacing all QQs in Met-PRT410 (SEQ ID NO: 7) with VL.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 28 (M_PRT965) is obtained by substituting all QQs in Met-PRT410 (SEQ ID NO: 7) with TS and replacing the remaining Q with A.
  • the amino acid sequence (M_PRT889) shown in SEQ ID NO: 29 is obtained by substituting all QQs in Met-PRT410 (SEQ ID NO: 7) with VL and replacing the remaining Q with I.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30 (M_PRT916) is obtained by substituting all QQs in Met-PRT410 (SEQ ID NO: 7) with VI and replacing the remaining Q with L.
  • the amino acid sequence (M_PRT918) represented by SEQ ID NO: 31 is obtained by replacing all QQs in Met-PRT410 (SEQ ID NO: 7) with VF and replacing the remaining Q with I.
  • the amino acid sequence (M_PRT525) represented by SEQ ID NO: 34 is obtained by inserting two alanine residues into a region (A 5 ) where alanine residues are continuous with respect to Met-PRT410 (SEQ ID NO: 7).
  • the two C-terminal domain sequences were deleted and 13 glutamine residues (Q) were replaced with serine residues (S) or proline residues (P) so that they were almost the same as those in FIG.
  • the amino acid sequence (M_PRT699) represented by SEQ ID NO: 32 is obtained by substituting VL for all QQs in M_PRT525 (SEQ ID NO: 34).
  • the amino acid sequence (M_PRT698) represented by SEQ ID NO: 33 is obtained by substituting all QQs in M_PRT525 (SEQ ID NO: 34) with VL and replacing the remaining Q with I.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42 (Met-PRT966) has the same QQ in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 (the amino acid sequence before the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 is added to the N-terminus). And the remaining Q is replaced with I.
  • amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, and SEQ ID NO: 42 all have a glutamine residue content of 9% or less. Yes (Table 2).
  • the modified fibroin (6-i) comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 or SEQ ID NO: 42. There may be.
  • the modified fibroin of (6-ii) has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 or SEQ ID NO: 42 and 90% or more.
  • An amino acid sequence having the following sequence identity is included.
  • the modified fibroin of (6-ii) is also represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m or the formula 2: [(A) n motif-REP] m- (A) n motif.
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the modified fibroin (6-ii) preferably has a glutamine residue content of 9% or less.
  • the modified fibroin (6-ii) preferably has a GPGXX motif content of 10% or more.
  • the sixth modified fibroin may contain a tag sequence at one or both of the N-terminal and C-terminal. This makes it possible to isolate, immobilize, detect and visualize the modified fibroin.
  • the sixth modified fibroin containing the tag sequence (6-iii) SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 or Modified fibroin comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 43, or (6-iv) SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 or SEQ ID NO: Mention may be made of modified fibroin comprising an amino acid sequence having a sequence identity of 90% or more with the amino acid sequence shown in 43.
  • amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, and SEQ ID NO: 43 are SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, respectively.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 (including His tag sequence and hinge sequence) was added to the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 42. Is.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 43 has a glutamine residue content of 9% or less (Table 3).
  • the modified fibroin of (6-iii) consists of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 or SEQ ID NO: 43. There may be.
  • the modified fibroin of (6-iv) has 90% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 or SEQ ID NO: 43.
  • An amino acid sequence having the following sequence identity is included.
  • the modified fibroin of (6-iv) is also a domain represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m or Formula 2: [(A) n motif-REP] m- (A) n motif.
  • the modified fibroin (6-iv) preferably has a glutamine residue content of 9% or less.
  • the modified fibroin (6-iv) preferably has a GPGXX motif content of 10% or more.
  • the sixth modified fibroin may contain a secretion signal for releasing the protein produced in the recombinant protein production system to the outside of the host.
  • the sequence of the secretion signal can be appropriately set according to the type of host.
  • the modified fibroin according to the present embodiment is characterized in that the first modified fibroin, the second modified fibroin, the third modified fibroin, the fourth modified fibroin, the fifth modified fibroin, and the sixth modified fibroin Alternatively, it may be a modified fibroin having at least two or more characteristics.
  • Fibroin production method Fibroin production method
  • Fibroin protein is expressed, for example, by a host transformed with an expression vector having a nucleic acid sequence encoding the protein and one or more regulatory sequences operably linked to the nucleic acid sequence. Can be produced.
  • the method for producing a nucleic acid encoding fibroin is not particularly limited. For example, using a gene encoding natural fibroin, amplified and cloned by polymerase chain reaction (PCR) or the like, modified by genetic engineering techniques as necessary, or chemically synthesized, The nucleic acid can be produced.
  • the method for chemically synthesizing nucleic acids is not particularly limited. For example, AKTA oligopilot plus 10/100 (GE Healthcare Japan Co., Ltd.) is used based on the amino acid sequence information of proteins obtained from the NCBI web database.
  • a gene can be chemically synthesized by a method of linking oligonucleotides that are synthesized automatically by PCR or the like.
  • a nucleic acid encoding fibroin consisting of an amino acid sequence in which an amino acid sequence consisting of a start codon and a His10 tag is added to the N-terminus of the above amino acid sequence is synthesized. Also good.
  • the regulatory sequence is a sequence that controls the expression of fibroin in the host (for example, promoter, enhancer, ribosome binding sequence, transcription termination sequence, etc.), and can be appropriately selected according to the type of host.
  • a promoter an inducible promoter that functions in a host cell and can induce expression of fibroin may be used.
  • An inducible promoter is a promoter that can control transcription by the presence of an inducer (expression inducer), absence of a repressor molecule, or physical factors such as an increase or decrease in temperature, osmotic pressure or pH value.
  • the type of expression vector can be appropriately selected according to the type of host, such as a plasmid vector, virus vector, cosmid vector, fosmid vector, artificial chromosome vector, and the like.
  • a vector that can replicate autonomously in a host cell or can be integrated into a host chromosome and contains a promoter at a position where a nucleic acid encoding fibroin can be transcribed is preferably used.
  • any of prokaryotes and eukaryotes such as yeast, filamentous fungi, insect cells, animal cells and plant cells can be preferably used.
  • prokaryotic hosts include bacteria belonging to the genus Escherichia, Brevibacillus, Serratia, Bacillus, Microbacterium, Brevibacterium, Corynebacterium, Pseudomonas and the like.
  • microorganisms belonging to the genus Escherichia include Escherichia coli.
  • microorganisms belonging to the genus Brevibacillus include Brevibacillus agri and the like.
  • microorganisms belonging to the genus Serratia include Serratia liqufaciens and the like.
  • microorganisms belonging to the genus Bacillus include Bacillus subtilis.
  • microorganisms belonging to the genus Microbacterium include microbacterium / ammonia film.
  • microorganisms belonging to the genus Brevibacterium include Brevibacterium divaricatam.
  • microorganisms belonging to the genus Corynebacterium include Corynebacterium ammoniagenes.
  • microorganisms belonging to the genus Pseudomonas include Pseudomonas putida.
  • vectors for introducing a nucleic acid encoding fibroin include, for example, pBTrp2 (manufactured by Boehringer Mannheim), pGEX (manufactured by Pharmacia), pUC18, pBluescriptII, pSupex, pET22b, pCold, pNCO2 (Japanese Patent Laid-Open No. 2002-238696) and the like.
  • Examples of eukaryotic hosts include yeast and filamentous fungi (molds, etc.).
  • yeast include yeasts belonging to the genus Saccharomyces, Pichia, Schizosaccharomyces and the like.
  • Examples of the filamentous fungi include filamentous fungi belonging to the genus Aspergillus, the genus Penicillium, the genus Trichoderma and the like.
  • examples of a vector into which a nucleic acid encoding fibroin is introduced include YEp13 (ATCC37115) and YEp24 (ATCC37051).
  • a method for introducing the expression vector into the host cell any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into the host cell.
  • a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)]
  • electroporation method electroporation method
  • spheroplast method protoplast method
  • lithium acetate method competent method, and the like.
  • a method for expressing a nucleic acid by a host transformed with an expression vector in addition to direct expression, secretory production, fusion protein expression, etc. can be performed according to the method described in Molecular Cloning 2nd edition, etc. .
  • Fibroin can be produced, for example, by culturing a host transformed with an expression vector in a culture medium, producing and accumulating the protein in the culture medium, and collecting the protein from the culture medium.
  • the method for culturing a host in a culture medium can be performed according to a method usually used for culturing a host.
  • the culture medium contains a carbon source, nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the host, and can efficiently culture the host. If so, either a natural medium or a synthetic medium may be used.
  • Any carbon source may be used as long as it can be assimilated by the above-mentioned transformed microorganism.
  • Examples thereof include glucose, fructose, sucrose, and carbohydrates such as molasses, starch and starch hydrolyzate, acetic acid and propionic acid, etc.
  • Organic acids and alcohols such as ethanol and propanol can be used.
  • the nitrogen source examples include ammonium salts of inorganic acids or organic acids such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, and ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, and peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, Casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells and digested products thereof can be used.
  • inorganic salts for example, monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate and calcium carbonate can be used.
  • Cultivation of prokaryotes such as E. coli or eukaryotes such as yeast can be performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration and agitation culture.
  • the culture temperature is, for example, 15 to 40 ° C.
  • the culture time is usually 16 hours to 7 days.
  • the pH of the culture medium during the culture is preferably maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH of the culture medium can be adjusted using an inorganic acid, an organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like.
  • antibiotics such as ampicillin and tetracycline may be added to the culture medium as necessary.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside is used when cultivating a microorganism transformed with an expression vector using the lac promoter
  • indole acrylic is used when culturing a microorganism transformed with an expression vector using the trp promoter.
  • An acid or the like may be added to the medium.
  • Isolation and purification of the expressed fibroin can be performed by a commonly used method.
  • the host cell is recovered by centrifugation after culturing, suspended in an aqueous buffer, and then subjected to an ultrasonic crusher, a French press, a Manton Gaurin.
  • the host cells are disrupted with a homogenizer, dynomill, or the like to obtain a cell-free extract.
  • a method usually used for protein isolation and purification that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, an organic solvent, etc.
  • Precipitation method anion exchange chromatography method using resin such as diethylaminoethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Kasei), positive using resin such as S-Sepharose FF (manufactured by Pharmacia)
  • Electrophoresis methods such as ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography using resins such as butyl sepharose and phenyl sepharose, gel filtration using molecular sieve, affinity chromatography, chromatofocusing, isoelectric focusing Using methods such as these alone or in combination, purification It is possible to obtain the goods.
  • fibroin when fibroin is expressed by forming an insoluble substance in the cell, the host cell is similarly collected, crushed, and centrifuged to recover the fibroin insoluble substance as a precipitate fraction.
  • the recovered insoluble matter of fibroin can be solubilized with a protein denaturant.
  • a purified fibroin preparation can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the protein when the protein is secreted extracellularly, the protein can be recovered from the culture supernatant. That is, a culture supernatant is obtained by treating the culture with a technique such as centrifugation, and a purified preparation can be obtained from the culture supernatant by using the same isolation and purification method as described above.
  • the manufacturing method of the fibroin fiber which concerns on this invention spins a fibroin fiber by the dry-spinning method using the spinning dope which concerns on this invention mentioned above. That is, the method for producing the fibroin fiber according to the present invention comprises the steps of preparing the above-described spinning stock solution according to the present invention, and discharging the spinning stock solution from the spinneret into the air, followed by heating to vaporize the organic solvent. At least a step of forming fibroin fibers (spinning step). You may use the fibroin fiber obtained by the said each process for arbitrary uses as it is. Moreover, the process (dry heat drawing process) of dry-drawing fibroin fiber may be further performed to obtain a fibroin fiber drawn at an arbitrary draw ratio, and the obtained fibroin fiber may be used for any application.
  • the manufacturing method according to the present embodiment may further include a step of filtering the spinning dope before discharging (filtering step) and / or a step of defoaming the spinning dope before discharging (defoaming step). .
  • the spinning step can be carried out by a known dry spinning method, for example, except that the spinning stock solution according to the present invention is used as the spinning stock solution.
  • the spinning process can be carried out by an electrospinning method (electrostatic spinning method), but it is preferably carried out by a method other than the electrospinning method from the viewpoint of simplifying the production process.
  • the shape, hole shape, number of holes, etc. of the spinneret are not particularly limited, and can be appropriately selected according to the desired fiber diameter, the number of single yarns, and the like.
  • a hole diameter of 0.1 mm to 0.6 mm can be exemplified.
  • a pore diameter of 0.1 mm or more is preferable because pressure loss can be reduced and equipment costs can be reduced. Further, it is preferable that the hole diameter is 0.6 mm or less because the necessity of the stretching operation for reducing the fiber diameter is reduced, and the possibility of causing a stretching break between discharge and take-up can be reduced.
  • the method for discharging the spinning dope from the spinneret is not particularly limited, but for example, a method using a metering pump as a means for feeding the spinning dope can be used.
  • the discharge amount can be appropriately adjusted according to the production speed.
  • the temperature of the spinning dope when passing through the spinneret and the temperature of the spinneret are not particularly limited, and may be appropriately adjusted depending on the concentration and viscosity of the spinning dope used, the type of organic solvent, and the like.
  • the temperature is preferably 30 ° C. to 100 ° C. from the viewpoint of preventing fibroin deterioration and the like.
  • the upper limit of the temperature is less than the boiling point of the organic solvent used from the viewpoint of reducing the possibility of pressure increase due to volatilization of the organic solvent and clogging in the piping due to solidification of the spinning dope. Is preferred. Thereby, process stability improves.
  • the undrawn yarn (or predrawn yarn) obtained in the spinning process can be converted into a drawn yarn through the drawing process.
  • Examples of the stretching method include dry heat stretching.
  • An oil agent may be added.
  • the kind of oil agent to be applied, the amount to be applied, and the like are not particularly limited, and can be appropriately adjusted in consideration of the use of fibroin fibers, the handleability of fibroin fibers, and the like.
  • the undrawn yarn (or predrawn yarn) after drying is hot drawn.
  • the heating temperature at this time is not particularly limited as long as sufficient stretching and strength are exhibited, but may be, for example, 100 ° C. to 270 ° C., 140 ° C. to 230 ° C., 140 It may be from 200 ° C to 200 ° C, may be from 160 ° C to 200 ° C, and may be from 160 ° C to 180 ° C. Further, the dry heat drawing process may be performed in multiple stages as required, without any problem. Examples of the apparatus used for dry heat drawing include a contact-type hot plate and a non-contact type furnace, but are not particularly limited. The temperature of the fiber is raised to a predetermined temperature, and a predetermined temperature is used. Any device that can be stretched at a magnification of 1 can be used.
  • the draw ratio in the dry heat drawing step may be, for example, 2 to 30 times, 2 to 20 times, or 3 to 15 times the undrawn yarn (or predrawn yarn). It is preferably 3 to 10 times, and more preferably 4 to 8 times, but is not limited as long as desired properties such as fiber thickness and mechanical properties can be obtained.
  • the fibroin fiber after dry heat drawing may be wound with a winder.
  • a winder about the winding method with a winder, it can wind up using well-known winders, adjusting winding conditions, such as tension
  • the fibroin fiber of the present invention obtained by the above method has a linear shape.
  • the fibroin fiber according to the present invention may be wound with a winder after further wet heat stretching treatment.
  • the wet heat stretching can be performed in warm water, a solution obtained by adding an organic solvent to warm water, or steam heating.
  • the temperature may be, for example, 40 to 200 ° C., 50 to 180 ° C., 50 to 150 ° C., and preferably 75 to 90 ° C.
  • the fibroin fiber can be stretched, for example, 1 to 10 times, preferably 2 to 8 times, and more preferably 2 to 4 times.
  • a higher stress (strength) can be imparted to the fibroin fiber by performing a wet heat stretching treatment. Further, this wet heat stretching step may be performed in multiple stages as necessary.
  • the final draw ratio of the lower limit of the undrawn yarn (or predrawn yarn) is preferably more than 1 time, 2 times or more, 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, 6 times. Above, 7 times or more, 8 times or more, 9 times or more, and upper limit is preferably 40 times or less, 30 times or less, 20 times or less, 15 times or less, 14 times or less, 13 times or less 12 times or less, 11 times or less, and 10 times or less.
  • the fibroin fiber according to the present invention contains fibroin and a surfactant.
  • the lower limit of the surfactant content is 0.001% by weight or more, 0.01% by weight or more, 0.1% by weight or more, 0.2% by weight or more, 0.3% based on the fibroin content.
  • % Or less 2.5% by weight or less, 3.0% by weight or less, 4.0% by weight or less, 5.0% by weight or less, 6.0% by weight or less, 7.0% by weight or less, 8.0% by weight 9.0% or less, 10% or less, 10% or less, 15% or less, 20% or less, 25% or less, 30% or less
  • 35 wt% or less, 40 wt% or less, 45 wt% or less, or 50 wt% or less 35 wt% or less.
  • the fibroin fiber according to the present embodiment contains a surfactant in the spinning dope, when the surfactant is attached to the surface of the fibroin fiber, encapsulated in the fibroin fiber, or the surface of the fibroin fiber And may be encapsulated in the fiber. Therefore, the surfactant adhering to the fibroin fiber surface and / or the surfactant encapsulated in the fibroin fiber may be removed as necessary.
  • the removal method is not particularly limited, but the fibroin fiber may be washed with water, warm water, or steam. From the viewpoint that a drying process or the like is unnecessary, it is preferable to wash the fibroin fiber with superheated steam.
  • the fibroin fiber according to the present embodiment may be further chemically cross-linked between polypeptide molecules in the fibroin fiber.
  • functional groups that can be crosslinked include amino groups, carboxyl groups, thiol groups, and hydroxy groups.
  • the amino group of the lysine side chain contained in the polypeptide can be crosslinked with an amide bond by dehydration condensation with the carboxyl group of the glutamic acid or aspartic acid side chain.
  • Crosslinking may be performed by performing a dehydration condensation reaction under vacuum heating, or by a dehydration condensation agent such as carbodiimide.
  • Crosslinking between polypeptide molecules may be performed using a crosslinking agent such as carbodiimide or glutaraldehyde, or may be performed using an enzyme such as transglutaminase.
  • the carbodiimide is represented by the general formula R 1 N ⁇ C ⁇ NR 2 (wherein R 1 and R 2 each independently represents an organic group containing a C 1-6 alkyl group or a cycloalkyl group). A compound.
  • carbodiimide examples include 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC), N, N′-dicyclohexylcarbodiimide (DCC), 1-cyclohexyl-3- (2-morpholinoethyl) carbodiimide And diisopropylcarbodiimide (DIC).
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • DCC N, N′-dicyclohexylcarbodiimide
  • DIC diisopropylcarbodiimide
  • EDC and DIC are preferable because they have a high ability to form an amide bond between polypeptide molecules and easily undergo a crosslinking reaction.
  • the cross-linking treatment is preferably performed by applying a cross-linking agent to the fibroin fiber and performing cross-linking by vacuum heating and drying.
  • a cross-linking agent a pure product may be imparted to the fibroin fiber, or a product diluted to a concentration of 0.005 to 10% by mass with a lower alcohol having 1 to 5 carbon atoms or a buffer solution may be imparted to the fibroin fiber.
  • the crosslinking treatment is preferably performed at a temperature of 20 to 45 ° C. for 3 to 42 hours. By the crosslinking treatment, higher stress (strength) can be applied to the fibroin fiber.
  • the fibroin fiber according to the present embodiment can be applied to various products.
  • products include fibers, yarns, fabrics, knitted fabrics, braids, non-woven fabrics, paper, and cotton.
  • the fibers include long fibers, short fibers, monofilaments, and multifilaments.
  • the threads include spun yarns, twisted yarns, false twisted yarns, processed yarns, mixed yarns, and mixed yarns. Can do.
  • fabrics such as woven fabrics, knitted fabrics, braided fabrics, nonwoven fabrics, paper, cotton, and the like can be produced. These products can be produced by known methods.
  • the fibroin fiber was cut in a direction perpendicular to the fibroin fiber axis, the cross section of the fiber was observed using ECLIPSE LV100ND manufactured by Nikon, and the fiber diameter was measured using image processing software (NIS-Elements D manufactured by Nikon).
  • the test was carried out based on JIS L1013.
  • the strength (tensile strength) and elongation of the fibroin fiber were measured using a 3345 series tensile tester manufactured by Instron Corporation under the test conditions of a test length of 300 mm and a test speed of 30 mm / min.
  • amino acid sequence (tag sequence and hinge sequence) represented by SEQ ID NO: 12 is added to the N-terminus.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 43 (PRT966) is an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 (amino acid sequence before the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 is added to the N-terminus) for the purpose of improving hydrophobicity.
  • the QQ in the inside is all substituted with VF, the remaining Q is substituted with I, and the amino acid sequence (tag sequence and hinge sequence) represented by SEQ ID NO: 12 is added to the N-terminus.
  • nucleic acids encoding PRT799 and PRT966 were synthesized.
  • the nucleic acid was added with an NdeI site at the 5 'end and an EcoRI site downstream of the stop codon.
  • the nucleic acid was cloned into a cloning vector (pUC118). Thereafter, the nucleic acid was cleaved by restriction enzyme treatment with NdeI and EcoRI, and then recombined into the protein expression vector pET-22b (+) to obtain expression vectors.
  • the seed culture was added to a jar fermenter to which 500 mL of production medium (Table 5) was added so that the OD 600 was 0.05.
  • the culture solution temperature was maintained at 37 ° C., and the culture was performed at a constant pH of 6.9. Further, the dissolved oxygen concentration in the culture solution was maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
  • a feed solution (glucose 455 g / 1 L, Yeast Extract 120 g / 1 L) was added at a rate of 1 mL / min.
  • the culture solution temperature was maintained at 37 ° C., and the culture was performed at a constant pH of 6.9.
  • the dissolved oxygen concentration in the culture solution was maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration, and cultured for 20 hours.
  • 1M isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) was added to the culture solution to a final concentration of 1 mM to induce expression of the modified fibroin.
  • the culture solution was centrifuged, and the cells were collected. Perform SDS-PAGE using cells prepared from the culture solution before and after IPTG addition, and confirm the expression of the desired modified fibroin by the appearance of the desired modified fibroin size band depending on the addition of IPTG did.
  • the washed precipitate was suspended in 8M guanidine buffer (8M guanidine hydrochloride, 10 mM sodium dihydrogen phosphate, 20 mM NaCl, 1 mM Tris-HCl, pH 7.0) to a concentration of 100 mg / mL, and 60 ° C. And stirred for 30 minutes with a stirrer to dissolve. After dissolution, dialysis was performed with water using a dialysis tube (cellulose tube 36/32 manufactured by Sanko Junyaku Co., Ltd.). The white aggregated protein obtained after dialysis was collected by centrifugation, water was removed with a freeze dryer, and freeze-dried powder was collected to obtain modified fibroin (PRT799 and PRT966).
  • 8M guanidine buffer 8M guanidine hydrochloride, 10 mM sodium dihydrogen phosphate, 20 mM NaCl, 1 mM Tris-HCl, pH 7.0
  • the prepared spinning dope was filtered through a metal filter having a mesh size of 1 ⁇ m, defoamed, and then discharged downward using a spinneret having a diameter of 0.2 mm.
  • the spinning solution discharged from the spinneret was heated in a cylindrical heating furnace at 100 ° C. for 30 seconds, and then taken up with a roller to obtain fibroin fibers.
  • Example 2 Spinning was carried out in the same manner as in Example 1 except that the solute in the spinning dope was the modified fibroin (PRT799) obtained as described above, and the formic acid concentration and surfactant concentration were changed as shown in Table 6.
  • Stock solutions were prepared.
  • the prepared spinning solution was processed in the same manner as in Example 1, and discharged downward using a spinneret having a diameter of 0.2 mm.
  • the spinning dope discharged from the spinneret was heated in a cylindrical heating furnace at 100 ° C. for 30 seconds, then taken up by a roller, and further dry-heated by 5 times to obtain fibroin fibers.
  • Example 1 A spinning stock solution was prepared in the same manner as in Example 1 except that the concentration of formic acid in the spinning stock solution was changed as shown in Table 6 and the surfactant was not added.
  • the prepared spinning dope was processed in the same manner as in Example 1 and discharged from the spinneret in the same manner as in Example 1. As a result, the spinning dope after discharge could not be stretched and fibers could not be formed.
  • Example 2 A spinning stock solution was prepared in the same manner as in Example 2 except that the concentration of formic acid in the spinning stock solution was changed as shown in Table 6 and the surfactant was not added.
  • the prepared spinning dope was processed in the same manner as in Example 1 and discharged from the spinneret in the same manner as in Example 1. As a result, the spinning dope after discharge could not be stretched and fibers could not be formed.
  • the fiber diameter evaluation and mechanical property evaluation of the fibroin fiber obtained in Example 2 were performed.
  • the fiber diameter, mechanical properties and production conditions of the fibroin fiber were as shown in Table 7.
  • Example 3 A spinning stock solution was prepared in the same manner as in Example 2 except that the fibroin concentration, the formic acid concentration, and the surfactant concentration in the spinning stock solution were changed as shown in Table 7. Fibroin fibers were obtained. The fiber diameter, mechanical properties and production conditions of the obtained fibroin fiber were as shown in Table 7.
  • Example 4 A spinning dope was prepared in the same manner as in Example 2 except that the fibroin concentration, formic acid concentration, and surfactant concentration in the spinning dope were changed as shown in Table 7 and the draw ratio was changed to 4 times. A fibroin fiber was obtained. The fiber diameter, mechanical properties and production conditions of the obtained fibroin fiber were as shown in Table 7.
  • Example 5 A spinning stock solution was prepared in the same manner as in Example 2 except that the fibroin concentration, the formic acid concentration, and the surfactant concentration in the spinning stock solution were changed as shown in Table 7. Fibroin fibers were obtained. The fiber diameter, mechanical properties and production conditions of the obtained fibroin fiber were as shown in Table 7.
  • Example 3 A spinning stock solution was prepared in the same manner as in Example 2 except that the concentration of fibroin and the concentration of formic acid in the spinning stock solution were changed as shown in Table 7 and the surfactant was not added.
  • the prepared spinning dope was treated in the same manner as in Example 2 and discharged from the spinneret in the same manner as in Example 2. Although fiberization was possible, the draw ratio in the drawing step could not be increased, and The mechanical properties of the obtained fibroin fiber were low (Table 7).

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Abstract

本発明は、フィブロインと、界面活性剤と、有機溶媒と、を含む、紡糸原液であって、フィブロインの濃度が、紡糸原液全量を基準として５～４０重量％であり、界面活性剤の濃度が、紡糸原液全量を基準として０．０１～１０重量％である、紡糸原液に関する。

Description

紡糸原液、フィブロイン繊維及びその製造方法
　本発明は、紡糸原液、フィブロイン繊維及びその製造方法に関する。本発明はまた、上記フィブロイン繊維を含む製品にも関する。
　各種産業分野において、利用価値の高い新素材としてフィブロイン繊維に関心が寄せられている。フィブロイン繊維として、従来から再生絹フィブロイン繊維及びクモ糸フィブロイン繊維が知られている。これらのフィブロイン繊維の製造方法として、湿式紡糸法及び乾湿式紡糸法が多数報告されている。しかしながら、上記の製造方法においては、凝固浴及び水洗浴において液体を多量に用いる必要があり、生産性の向上には限度がある。
　乾式紡糸法としては、例えば、塩化カルシウムとギ酸の混合有機溶媒に精錬後の蚕絹フィブロインを溶解させたドープをシリンジから気中に吐出させて繊維を形成させる方法が報告されている（非特許文献１）。
Ｘｉａｏｘｉａｏ　Ｙｕｅ　ｅｔ　ａｌ，Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，１２８，２０１４年，ｐｐ．１７５－１７８
　非特許文献１に開示されるような製造方法では、所定の強度を得るために、繊維を形成させた後、水や低級アルコール等の液体中への含浸工程、繊維に付着した液体の乾燥工程等の煩雑な後工程が必要であった。それ故、不可避的に工程数が増加するとともに、コストが重み、生産性が低く工業的に不利であった。
　本発明は、所定の強度を有するフィブロイン繊維を優れた生産性で製造するのに有用な紡糸原液を提供することを目的とする。本発明はまた、優れた生産性と所定の強度を有するフィブロイン繊維、及び当該フィブロイン繊維を優れた生産性で製造できる製造方法の提供も目的とする。
　本発明者らは、上記従来技術の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた。その結果、フィブロインと界面活性剤と有機溶媒とを含む紡糸原液を、乾式紡糸法によって紡糸することで、繊維の液体中への含浸工程及びそれに付属する工程を経ずに、所定の強度を有するフィブロイン繊維が得られることを見出した。本発明はこの新規な知見に基づく。
　すなわち、本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
［１］
　フィブロインと、界面活性剤と、有機溶媒と、を含む、紡糸原液であって、
　上記フィブロインの濃度が、紡糸原液全量を基準として５～４０重量％であり、
　上記界面活性剤の濃度が、紡糸原液全量を基準として０．０１～１０重量％である、紡糸原液。
［２］
　上記フィブロインが、クモ糸フィブロインである、［１］に記載の紡糸原液。
［３］
　上記有機溶媒が、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、ヘキサフルオロアセトン（ＨＦＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、及びギ酸からなる群より選ばれる少なくとも１種以上である、［１］又は［２］に記載の紡糸原液。
［４］
　上記界面活性剤が、非イオン界面活性剤である、［１］～［３］のいずれかに記載の紡糸原液。
［５］
　上記非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルエーテルを含む、［１］～［４］のいずれかに記載の紡糸原液。
［６］
　上記フィブロインが、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１若しくは配列番号４３で示されるアミノ酸配列を含む、又は配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１若しくは配列番号４３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、［１］～［５］のいずれかに記載の紡糸原液。
［７］
　フィブロインと、界面活性剤と、を含むフィブロイン繊維であって、
　上記界面活性剤の含有量が、上記フィブロインの含有量を基準として、０．００１～５０重量％である、フィブロイン繊維。
［８］
　上記フィブロインが、クモ糸フィブロインである、［７］に記載のフィブロイン繊維。
［９］
　［７］又は［８］に記載のフィブロイン繊維を含む製品であって、
　上記製品が、繊維、糸、布帛、編み物、組み物、不織布、紙、及び綿からなる群から選択される、製品。
［１０］
　フィブロイン繊維の製造方法であって、
　［１］～［６］のいずれかに記載の紡糸原液を用意する工程と、
　上記紡糸原液を紡糸口金から空気中に吐出した後、加熱して上記有機溶媒を気化させてフィブロイン繊維を形成する工程と、
を備える、フィブロイン繊維の製造方法。
［１１］
　上記フィブロイン繊維を乾熱延伸する工程を更に備える、［１０］に記載のフィブロイン繊維の製造方法。
［１２］
　上記乾熱延伸する工程における延伸倍率が２～３０倍である、［１１］に記載のフィブロイン繊維の製造方法。
　本発明によれば、所定の強度を有するフィブロイン繊維を優れた生産性で製造するのに有用な紡糸原液を提供することが可能となる。また、本発明によれば、所定の強度を有するフィブロイン繊維をより優れた生産性をもって製造することができる。
フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。 フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。 フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。
　以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
〔紡糸原液〕
　本実施形態に係る紡糸原液は、界面活性剤を含むことを必須の構成とし、さらにフィブロインと、有機溶媒と、を含む。本実施形態に係る紡糸原液は、フィブロインと界面活性剤を有機溶媒に溶解させた紡糸原液ということもできる。本実施形態に係る紡糸原液は、乾式紡糸用の紡糸原液として好適に用いることができる。
　紡糸原液に含まれる有機溶媒は、フィブロインを溶解し得るものであればよい。有機溶媒としては、例えば、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、ヘキサフルオロアセトン（ＨＦＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、及びギ酸等が挙げられる。これらの有機溶媒は、水を含んでいてもよい。これらの有機溶媒は、１種単独で使用してもよく、２種以上を混合して使用してもよい。有機溶媒としては、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、ヘキサフルオロアセトン（ＨＦＡ）及びギ酸から選ばれる１種、又は２種以上の混合溶媒であることが好ましい。
　紡糸原液に含まれる界面活性剤は、イオン性界面活性剤、非イオン界面活性剤のいずれであってもよい。イオン性界面活性剤としては、カチオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、両性界面活性剤が挙げられる。紡糸原液に含まれる界面活性剤は、フィブロインの種類及び有機溶媒の特性等によって適宜選択すればよい。紡糸原液に界面活性剤が含まれることで、より機械物性に優れたフィブロイン繊維を得ることができる。
　カチオン界面活性剤としては、例えば、塩化オクチルトリメチルアンモニウム、塩化デシルトリメチルアンモニウム、塩化ラウリルトリメチルアンモニウム、塩化セチルトリメチルアンモニウム及び塩化ステアリルトリメチルアンモニウム等の塩化アルキルトリメチルアンモニウム、臭化ラウリルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム及び臭化ステアリルトリメチルアンモニウム等の臭化アルキルトリメチルアンモニウム、及び塩化ジステアリルジメチルアンモニウム、塩化ジセチルジメチルアンモニウム、塩化ジココイルジメチルアンモニウム、塩化ドデシルジメチルエチルアンモニウム及び塩化ポリオキシプロピレンメチルジエチルアンモニウム等のテトラアルキル第４級アンモニウム塩型カチオン界面活性剤、塩化ベンザルコニウム、臭化ベンザルコニウム、エチル硫酸ラノリン脂肪酸アミノプロピルエチルジメチルアンモニウム、セチルトリメチルアンモニウムサッカリン、及びステアリルトリメチルアンモニウムサッカリン等の第４級アンモニウム塩型カチオン界面活性剤、並びに塩化ブチルピリジニウム、塩化ドデシルピリジニウム及び塩化セチルピリジニウム等のアルキルピリジニウム塩型カチオン界面活性剤が挙げられる。
　アニオン界面活性剤としては、例えば、ラウリン酸ナトリウム、ミリスチン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム及びステアリン酸ナトリウム等のカルボン酸型アニオン界面活性剤、１－ヘキサンスルホン酸ナトリウム、１－オクタンスルホン酸ナトリウム、１－デカンスルホン酸ナトリウム及びオクチルベンゼンスルホン酸ナトリウム等のスルホン酸型アニオン界面活性剤、ラウリル硫酸ナトリウム、ミリスチル硫酸ナトリウム、ラウレス硫酸ナトリウム及びラウリル硫酸アンモニウム、等の硫酸エステル型アニオン界面活性剤、並びにラウリルリン酸及びラウリルリン酸ナトリウム等のリン酸エステル型アニオン界面活性剤が挙げられる。
　両性界面活性剤としては、例えば、ステアリルジメチルアミノ酢酸ベタイン及びドデシルアミノメチルジメチルスルホプロピルベタイン等のアルキルベタイン型両性界面活性剤、２－ヘプタデシル－Ｎ－カルボキシメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン等のアルキルイミダゾール型両性界面活性剤、並びにラウリルジメチルアミンＮ－オキシド及びオレイルジメチルアミンＮ－オキシド等のアミンオキシド型両性界面活性剤が挙げられる。
　非イオン界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルケニルエーテル及びポリオキシエチレンヒマシ油等のエーテル型非イオン界面活性剤、グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステルホウ酸エステル及びショ糖脂肪酸エステル等のエステル型非イオン界面活性剤、並びにポリオキシエチレンアルキルエステル、ポリオキシアルキレングリコールロジン酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート及びポリオキシエチレンソルビタントリオレエート等）等のポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンプロピレングリコール脂肪酸エステル及びポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステルホウ酸エステル等のエステル・エーテル型非イオン界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルアミン等のアミノエーテル型非イオン界面活性剤、脂肪酸モノエタノールアミド及び脂肪酸ジエタノールアミド等のアルカノールアミド型非イオン界面活性剤が挙げられる。ポリオキシエチレン脂肪酸エステルは、飽和脂肪酸アルキルエステル分子、モノ不飽和脂肪酸アルキルエステル分子、ジ不飽和脂肪酸アルキルエステル分子、及びポリ不飽和脂肪酸アルキルエステル分子（すなわち、３つ以上の炭素－炭素二重結合を有する脂肪酸アルキルエステル分子）であってよい。
　界面活性剤は、１種単独で使用してもよく、２種以上を混合して使用してもよい。界面活性剤としては、市販のものを用いることができる。
　有機溶媒がギ酸である場合は、界面活性剤としては、非イオン界面活性剤（ノニオン界面活性剤）を含むことが好ましく、ポリオキシエチレンアルキルエーテル又はポリオキシエチレン脂肪酸エステルを含むことがより好ましく、ポリオキシエチレンアルキルエーテル又はポリオキシエチレンアルキルエステルを含むことが更に好ましい。
　ポリオキシエチレンアルキルエーテルは、式：Ｒ１－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－Ｒ２（Ｒ１＝ＣｎＨ２ｎ＋１、Ｒ２＝Ｈ）で表される。ポリオキシエチレンアルキルエーテルとしては、例えば、ポリエチレングリコールビス（３－アミノプロピル）エーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリエチレングリコールモノ－４－ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンモノドデシルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンモノオレイルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルセチルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルドデシルエーテル、及びポリオキシエチレンドコシルエーテル等が挙げられる。
　ポリオキシエチレンアルキルエステルは、式：Ｒ３－ＯＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－Ｒ４（Ｒ３＝ＣｎＨ２ｎ＋１、Ｒ４＝Ｈ）で表される。ポリオキシエチレンアルキルエステルとしては、例えば、ポリオキシエチレンモノラウレート、ポリオキシエチレンモノステアレート、ポリオキシエチレンモノオレエート、及びポリオキシエチレンジステアレート等が挙げられる。
　フィブロインが、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１４及び配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０、Ｍｅｔ－ＰＲＴ４６８、Ｍｅｔ－ＰＲＴ７９９、ＰＲＴ４１０、ＰＲＴ４６８及びＰＲＴ７９９）、又は配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号４２、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１及び配列番号４３で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン（Ｍｅｔ－ＰＲＴ８８８、Ｍｅｔ－ＰＲＴ９６５、Ｍｅｔ－ＰＲＴ８８９、Ｍｅｔ－ＰＲＴ９１６、Ｍｅｔ－ＰＲＴ９１８、Ｍｅｔ－ＰＲＴ６９９、Ｍｅｔ－ＰＲＴ６９８、Ｍｅｔ－ＰＲＴ６９９、ＰＲＴ８８８、ＰＲＴ９６５、ＰＲＴ８８９、ＰＲＴ９１６、ＰＲＴ９１８、ＰＲＴ６９９、ＰＲＴ６９８及びＰＲＴ６９９）である場合は、界面活性剤としては、非イオン界面活性剤を含むことが好ましく、ポリオキシエチレンアルキルエーテル又はポリオキシエチレンアルキルエステルを含むことがより好ましく、ポリオキシエチレンアルキルエーテルを含むことが更に好ましい。また、ポリオキシエチレンアルキルエーテルとしては、式：Ｒ１－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－Ｒ２（Ｒ１＝ＣｎＨ２ｎ＋１、Ｒ２＝Ｈ）中のアルキル基Ｒ１のｎは４～２２であることが好ましく、１２～２２であることがより好ましく、１８～２０であることがさらに好ましい。式中のｍは４～５０であることが好ましく、１０～４０であることがより好ましく、１０～２５であることがさらに好ましい。具体的には、例えば、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、及びポリオキシエチレンドコシルエーテル等が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルエステルとしては、式：Ｒ３－ＯＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－Ｒ４（Ｒ３＝ＣｎＨ２ｎ＋１、Ｒ４＝Ｈ）中のアルキル基Ｒ３のｎは４～２２であることが好ましく、１２～２２であることがより好ましく、１８～２０であることがさらに好ましい。式中のｍは４～５０であることが好ましく、１０～４０であることがより好ましく、１０～２５であることがさらに好ましい。具体的には、例えば、ポリエチレングリコールモノラウレート及びポリエチレングリコールモノステアレート等が挙げられる。
　紡糸原液に含まれる界面活性剤の濃度は、特に限定されず、フィブロインの種類、フィブロインの濃度、有機溶媒の種類等に応じて適宜選択すればよい。例えば、紡糸原液全量を１００重量％としたとき、界面活性剤の濃度は、０．０１重量％～１０重量％であってよく、０．１重量％～１０重量％であってよく、０．０１重量％～５．５重量％であってよく、０．０１重量％～５．０重量％であってよく、０．１重量％～５．５重量％であってよく、０．１重量％～５．０重量％であってよく、０．２重量％～５．０重量％であってよく、０．３重量％～５．０重量％であってよく、０．４重量％～５．０重量％であってよく、０．５重量％～５．５重量％が好ましく、０．５重量％～５．０重量％がより好ましく、０．８重量％～４．５重量％がより好ましく、０．８重量％～４．０重量％がより好ましく、０．８重量％～３．０重量％がより好ましく、１．０重量％～３．０重量％がさらに好ましく、１．０重量％～２．０重量％が特に好ましい。また、例えば、紡糸原液全量を１００重量％としたとき、界面活性剤の濃度の下限値は、０．０１重量％以上であってよく、０．０３重量％以上であってよく、０．０５重量％以上であってよく、０．１重量％以上であってよく、０．２重量％以上であってよく、０．３重量％以上であってよく、０．４重量％以上であってよく、０．５重量％以上であってよく、０．６重量％以上であってよく、０．７重量％以上であってよく、０．８重量％以上であってよく、０．９重量％以上であってよい。また、例えば、紡糸原液全量を１００重量％としたとき、界面活性剤の濃度の上限値は、１０重量％以下であってよく、１０重量％未満であってよく、９．０重量％以下であってよく、８．０重量％以下であってよく、７．０重量％以下であってよく、６．０重量％以下であってよく、５．８重量％以下であってよく、５．５重量％以下であってよく、５．３重量％以下であってよく、５．０重量％以下であってよく、４．８重量％以下であってよく、４．５重量％以下であってよく、４．２重量％以下であってよく、３．８重量％以下であってよく、３．５重量％以下であってよい。界面活性剤の濃度が０．０１重量％より少ない場合は、フィブロイン繊維の強度及び伸度向上効果を十分に得ることができない。界面活性剤の濃度が１０重量％であれば十分な効果があり、１０重量％を超えて濃度を高めた場合は製造コストが高くなるため好ましくない。
　紡糸原液におけるフィブロインの濃度は、紡糸原液全量を１００重量％としたとき、５～４０重量％であることが好ましく、１０～３５重量％であることがより好ましく、１２～３５重量％であることがより好ましく、１５～３５重量％であることがより好ましく、１２～３０重量％であることがより好ましく、１５～３０重量％であることがより好ましく、２０～３５重量％であることがより好ましく、２５～３５重量％であることがより好ましく、１５～２５重量％であることが特に好ましい。フィブロインの濃度が５重量％未満である場合は、上記の界面活性剤を添加しても、フィブロイン繊維の応力、及び伸度を十分に向上させることが困難となる。フィブロインの濃度が４０重量％を超えると、紡糸原液の粘度が著しく増大、又は溶解不良が発生し、紡糸口金から吐出した際に口金の孔が閉塞しやすく、生産性が低下する。
　紡糸原液の粘度は、乾式紡糸可能な粘度であれば特に限定する必要はないが、生産性の観点から、２５℃において１０，０００～１００，０００ｍＰａ・ｓｅｃが好ましく、２０，０００～１００，０００ｍＰａ・ｓｅｃがより好ましく、２０，０００～８０，０００ｍＰａ・ｓｅｃが更に好ましく、３０，０００～５０，０００ｍＰａ・ｓｅｃが特に好ましい。紡糸原液の粘度は、例えば京都電子工業社製の商品名“ＥＭＳ粘度計”を使用して測定することができる。
　紡糸原液は、乾式紡糸を行う観点から、金属元素を含まないことが好ましい。これにより、最終的に得られるフィブロイン繊維の品質が安定する他、繊維を後加工する際に油剤等を付与した場合でも、静電気の発生がより抑制される等、工程通過性が良好になる。
　紡糸原液の調製法は、特に限定されるものではなく、フィブロインと界面活性剤と有機溶媒とをそれぞれ任意の順序で混合してよい。界面活性剤と有機溶媒とを混合した後にフィブロインを溶解させてもよく、フィブロインを有機溶媒に溶解させた後に界面活性剤を混合してもよい。
　紡糸原液は、溶解を促進するために、ある程度の時間撹拌又は振とうしてもよい。その際、紡糸原液は必要により、使用するフィブロイン及び有機溶媒に応じて溶解可能な温度に加熱してもよい。紡糸原液は、例えば、３０℃以上、４０℃以上、５０℃以上、６０℃以上、７０℃以上、８０℃以上、又は、９０℃以上に加熱してもよい。加熱温度の上限は、例えば、有機溶媒の沸点以下である。
〔フィブロイン〕
　本発明に係るフィブロインは、天然由来のフィブロインと改変フィブロインとを含む。本明細書において「天然由来のフィブロイン」とは、天然由来のフィブロインと同一のアミノ酸配列を有するフィブロインを意味し、「改変フィブロイン」とは、天然由来のフィブロインとは異なるアミノ酸配列を有するフィブロインを意味する。
　本実施形態に係るフィブロインは、クモ糸フィブロインであることが好ましい。クモ糸フィブロインには、天然クモ糸フィブロイン、及び天然クモ糸フィブロインに由来する改変フィブロインが含まれる。天然クモ糸フィブロインとしては、例えば、クモ類が産生するスパイダーシルクタンパク質が挙げられる。
　本実施形態に係るフィブロインは、例えば、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質であってもよい。本実施形態に係るフィブロインは、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側のいずれか一方又は両方に更にアミノ酸配列（Ｎ末端配列及びＣ末端配列）が付加されていてもよい。Ｎ末端配列及びＣ末端配列は、これに限定されるものではないが、典型的には、フィブロインに特徴的なアミノ酸モチーフの反復を有さない領域であり、１００残基程度のアミノ酸からなる。
　本明細書において「ドメイン配列」とは、フィブロイン特有の結晶領域（典型的には、アミノ酸配列の（Ａ）ｎモチーフに相当する。）と非晶領域（典型的には、アミノ酸配列のＲＥＰに相当する。）を生じるアミノ酸配列であり、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるアミノ酸配列を意味する。ここで、（Ａ）ｎモチーフは、アラニン残基を主とするアミノ酸配列を示し、ｎは２～２７である。ｎは、２～２０、４～２７、４～２０、８～２０、１０～２０、４～１６、８～１６、又は１０～１６の整数であってよい。また、（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は４０％以上であればよく、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％（アラニン残基のみで構成されることを意味する。）であってもよい。ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、少なくとも７つがアラニン残基のみで構成されてもよい。ＲＥＰは２～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ＲＥＰは、１０～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列であってもよい。ｍは２～３００の整数を示し、１０～３００の整数であってもよい。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。
　天然由来のフィブロインとしては、例えば、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質を挙げることができる。天然由来のフィブロインの具体例としては、例えば、昆虫又はクモ類が産生するフィブロインが挙げられる。
　昆虫が産生するフィブロインとしては、例えば、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ）、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍａｎｄａｒｉｎａ）、天蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ｙａｍａｍａｉ）、柞蚕（Ａｎｔｅｒａｅａ　ｐｅｒｎｙｉ）、楓蚕（Ｅｒｉｏｇｙｎａ　ｐｙｒｅｔｏｒｕｍ）、蓖蚕（Ｐｉｌｏｓａｍｉａ　Ｃｙｎｔｈｉａ　ｒｉｃｉｎｉ）、樗蚕（Ｓａｍｉａ　ｃｙｎｔｈｉａ）、栗虫（Ｃａｌｉｇｕｒａ　ｊａｐｏｎｉｃａ）、チュッサー蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ｍｙｌｉｔｔａ）、ムガ蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ａｓｓａｍａ）等のカイコが産生する絹タンパク質、及びスズメバチ（Ｖｅｓｐａ　ｓｉｍｉｌｌｉｍａ　ｘａｎｔｈｏｐｔｅｒａ）の幼虫が吐出するホーネットシルクタンパク質が挙げられる。
　昆虫が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、カイコ・フィブロインＬ鎖（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ７６４３０（塩基配列）、及びＡＡＡ２７８４０．１（アミノ酸配列））が挙げられる。
　クモ類が産生するフィブロインとしては、例えば、オニグモ、ニワオニグモ、アカオニグモ、アオオニグモ及びマメオニグモ等のオニグモ属（Ａｒａｎｅｕｓ属）に属するクモ、ヤマシロオニグモ、イエオニグモ、ドヨウオニグモ及びサツマノミダマシ等のヒメオニグモ属（Ｎｅｏｓｃｏｎａ属）に属するクモ、コオニグモモドキ等のコオニグモモドキ属（Ｐｒｏｎｕｓ属）に属するクモ、トリノフンダマシ及びオオトリノフンダマシ等のトリノフンダマシ属（Ｃｙｒｔａｒａｃｈｎｅ属）に属するクモ、トゲグモ及びチブサトゲグモ等のトゲグモ属（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ属）に属するクモ、マメイタイセキグモ及びムツトゲイセキグモ等のイセキグモ属（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ属）に属するクモ、コガネグモ、コガタコガネグモ及びナガコガネグモ等のコガネグモ属（Ａｒｇｉｏｐｅ属）に属するクモ、キジロオヒキグモ等のオヒキグモ属（Ａｒａｃｈｎｕｒａ属）に属するクモ、ハツリグモ等のハツリグモ属（Ａｃｕｓｉｌａｓ属）に属するクモ、スズミグモ、キヌアミグモ及びハラビロスズミグモ等のスズミグモ属（Ｃｙｔｏｐｈｏｒａ属）に属するクモ、ゲホウグモ等のゲホウグモ属（Ｐｏｌｔｙｓ属）に属するクモ、ゴミグモ、ヨツデゴミグモ、マルゴミグモ及びカラスゴミグモ等のゴミグモ属（Ｃｙｃｌｏｓａ属）に属するクモ、及びヤマトカナエグモ等のカナエグモ属（Ｃｈｏｒｉｚｏｐｅｓ属）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質、並びにアシナガグモ、ヤサガタアシナガグモ、ハラビロアシダカグモ及びウロコアシナガグモ等のアシナガグモ属（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、オオシロカネグモ、チュウガタシロカネグモ及びコシロカネグモ等のシロカネグモ属（Ｌｅｕｃａｕｇｅ属）に属するクモ、ジョロウグモ及びオオジョロウグモ等のジョロウグモ属（Ｎｅｐｈｉｌａ属）に属するクモ、キンヨウグモ等のアズミグモ属（Ｍｅｎｏｓｉｒａ属）に属するクモ、ヒメアシナガグモ等のヒメアシナガグモ属（Ｄｙｓｃｈｉｒｉｏｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、クロゴケグモ、セアカゴケグモ、ハイイロゴケグモ及びジュウサンボシゴケグモ等のゴケグモ属（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ属）に属するクモ、及びユープロステノプス属（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ属）に属するクモ等のアシナガグモ科（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈｉｄａｅ科）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質が挙げられる。スパイダーシルクタンパク質としては、例えば、ＭａＳｐ（ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２）、ＡＤＦ（ＡＤＦ３及びＡＤＦ４）等の牽引糸タンパク質、ＭｉＳｐ（ＭｉＳｐ１及びＭｉＳｐ２）等が挙げられる。
　クモ類が産生するスパイダーシルクタンパク質のより具体的な例としては、例えば、ｆｉｂｒｏｉｎ－３（ａｄｆ－３）［Ａｒａｎｅｕｓ　ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１０（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５５（塩基配列））、ｆｉｂｒｏｉｎ－４（ａｄｆ－４）［Ａｒａｎｅｕｓ　ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１１（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ０４５０４（アミノ酸配列）、Ｕ３７５２０（塩基配列））、ｍａｊｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ　ｈｅｓｐｅｒｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ６８８５６（アミノ酸配列）、ＥＦ５９５２４６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　２［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖａｔａ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ３２４７２（アミノ酸配列）、ＡＦ４４１２４５（塩基配列））、ｍａｊｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ　ａｕｓｔｒａｌｉｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＪ００４２８（アミノ酸配列）、ＡＪ９７３１５５（塩基配列））、及びｍａｊｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　２［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ　ａｕｓｔｒａｌｉｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＭ３２２４９．１（アミノ酸配列）、ＡＭ４９０１６９（塩基配列））、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５８９．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５９１．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ－ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｎｅｐｈｉｌｅｎｇｙｓ　ｃｒｕｅｎｔａｔａ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ３７２７８．１（アミノ酸配列）等が挙げられる。
　天然由来のフィブロインのより具体的な例としては、更に、ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋに配列情報が登録されているフィブロインを挙げることができる。例えば、ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報のうちＤＩＶＩＳＩＯＮとしてＩＮＶを含む配列の中から、ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮにｓｐｉｄｒｏｉｎ、ａｍｐｕｌｌａｔｅ、ｆｉｂｒｏｉｎ、「ｓｉｌｋ及びｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」、又は「ｓｉｌｋ及びｐｒｏｔｅｉｎ」がキーワードとして記載されている配列、ＣＤＳから特定のｐｒｏｄｕｃｔの文字列、ＳＯＵＲＣＥからＴＩＳＳＵＥ　ＴＹＰＥに特定の文字列の記載された配列を抽出することにより確認することができる。
（改変フィブロイン）
　改変フィブロインは、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列に依拠してそのアミノ酸配列を改変したもの（例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列を改変することによりアミノ酸配列を改変したもの）であってもよく、また天然由来のフィブロインに依らず人工的に設計及び合成したもの（例えば、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより所望のアミノ酸配列を有するもの）であってもよい。
　改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列に対し、例えば、１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行うことで得ることができる。アミノ酸残基の置換、欠失、挿入及び／又は付加は、部分特異的突然変異誘発法等の当業者に周知の方法により行うことができる。具体的には、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１０，６４８７（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４４８（１９８３）等の文献に記載されている方法に準じて行うことができる。
　改変フィブロインは、例えば、カイコが産生する絹タンパク質に由来する改変フィブロインであってもよく、クモ類が産生するスパイダーシルクタンパク質に由来する改変フィブロインであってもよい。
　改変フィブロインの具体的な例として、クモの大瓶状腺で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する改変フィブロイン（第１の改変フィブロイン）、グリシン残基の含有量が低減された改変フィブロイン（第２の改変フィブロイン）、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロイン（第３の改変フィブロイン）、グリシン残基の含有量、及び（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロイン（第４の改変フィブロイン）、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むドメイン配列を有する改変フィブロイン（第５の改変フィブロイン）、及びグルタミン残基の含有量が低減されたドメイン配列を有する改変フィブロイン（第６の改変フィブロイン）が挙げられる。
　クモの大瓶状腺で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する改変フィブロイン（第１の改変フィブロイン）としては、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質が挙げられる。第１の改変フィブロインは、式１中、ｎは３～２０の整数が好ましく、４～２０の整数がより好ましく、８～２０の整数が更に好ましく、１０～２０の整数が更により好ましく、４～１６の整数が更によりまた好ましく、８～１６の整数が特に好ましく、１０～１６の整数が最も好ましい。第１の改変フィブロインは、式１中、ＲＥＰを構成するアミノ酸残基の数は、１０～２００残基であることが好ましく、１０～１５０残基であることがより好ましく、２０～１００残基であることが更に好ましく、２０～７５残基であることが更により好ましい。第１の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるアミノ酸配列中に含まれるグリシン残基、セリン残基及びアラニン残基の合計残基数がアミノ酸残基数全体に対して、４０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることが更に好ましい。
　第１の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるアミノ酸配列の単位を含み、かつＣ末端配列が配列番号１～３のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は配列番号１～３のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列である、ポリペプチドであってもよい。
　配列番号１に示されるアミノ酸配列は、ＡＤＦ３（ＧＩ：１２６３２８７、ＮＣＢＩ）のアミノ酸配列のＣ末端の５０残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列と同一であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２０残基取り除いたアミノ酸配列と同一であり、配列番号３に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２９残基取り除いたアミノ酸配列と同一である。
　第１の改変フィブロインのより具体的な例として、（１－ｉ）配列番号４で示されるアミノ酸配列、又は（１－ｉｉ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　配列番号４で示されるアミノ酸配列は、Ｎ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ　ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ　３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号５）を付加したＡＤＦ３のアミノ酸配列において、第１～１３番目の反復領域をおよそ２倍になるように増やすとともに、翻訳が第１１５４番目アミノ酸残基で終止するように変異させたものである。配列番号４で示されるアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸配列は、配列番号３で示されるアミノ酸配列と同一である。
　（１－ｉ）の改変フィブロインは、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　グリシン残基の含有量が低減された改変フィブロイン（第２の改変フィブロイン）は、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、グリシン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。第２の改変フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＲＥＰ中の１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。
　第２の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中のＧＧＸ及びＧＰＧＸＸ（但し、Ｇはグリシン残基、Ｐはプロリン残基、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）から選ばれる少なくとも一つのモチーフ配列において、少なくとも１又は複数の当該モチーフ配列中の１つのグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
　第２の改変フィブロインは、上述のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたモチーフ配列の割合が、全モチーフ配列に対して、１０％以上であってもよい。
　第２の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、上記ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列中の全ＲＥＰに含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列中の総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが３０％以上、４０％以上、５０％以上又は５０．９％以上であるアミノ酸配列を有するものであってもよい。（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は８３％以上であってよいが、８６％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、１００％であること（アラニン残基のみで構成されることを意味する）が更により好ましい。
　第２の改変フィブロインは、ＧＧＸモチーフの１つのグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換することにより、ＸＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合を高めたものであることが好ましい。第２の改変フィブロインは、ドメイン配列中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合が３０％以下であることが好ましく、２０％以下であることがより好ましく、１０％以下であることが更に好ましく、６％以下であることが更により好ましく、４％以下であることが更によりまた好ましく、２％以下であることが特に好ましい。ドメイン配列中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合は、下記ＸＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合（ｚ／ｗ）の算出方法と同様の方法で算出することができる。
　ｚ／ｗの算出方法を更に詳細に説明する。まず、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むフィブロイン（改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン）において、ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列に含まれる全てのＲＥＰから、ＸＧＸからなるアミノ酸配列を抽出する。ＸＧＸを構成するアミノ酸残基の総数がｚである。例えば、ＸＧＸからなるアミノ酸配列が５０個抽出された場合（重複はなし）、ｚは５０×３＝１５０である。また、例えば、ＸＧＸＧＸからなるアミノ酸配列の場合のように２つのＸＧＸに含まれるＸ（中央のＸ）が存在する場合は、重複分を控除して計算する（ＸＧＸＧＸの場合は５アミノ酸残基である）。ｗは、ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列に含まれる総アミノ酸残基数である。例えば、図１に示したドメイン配列の場合、ｗは４＋５０＋４＋１００＋４＋１０＋４＋２０＋４＋３０＝２３０である（最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフは除いている。）。次に、ｚをｗで除すことによって、ｚ／ｗ（％）を算出することができる。
　第２の改変フィブロインにおいて、ｚ／ｗは、５０．９％以上であることが好ましく、５６．１％以上であることがより好ましく、５８．７％以上であることが更に好ましく、７０％以上であることが更により好ましく、８０％以上であることが更によりまた好ましい。ｚ／ｗの上限に特に制限はないが、例えば、９５％以下であってもよい。
　第２の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列から、グリシン残基をコードする塩基配列の少なくとも一部を置換して別のアミノ酸残基をコードするように改変することにより得ることができる。このとき、改変するグリシン残基として、ＧＧＸモチーフ及びＧＰＧＸＸモチーフにおける１つのグリシン残基を選択してもよいし、またｚ／ｗが５０．９％以上になるように置換してもよい。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から上記態様を満たすアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中のグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
　上記の別のアミノ酸残基としては、グリシン残基以外のアミノ酸残基であれば特に制限はないが、バリン（Ｖ）残基、ロイシン（Ｌ）残基、イソロイシン（Ｉ）残基、メチオニン（Ｍ）残基、プロリン（Ｐ）残基、フェニルアラニン（Ｆ）残基及びトリプトファン（Ｗ）残基等の疎水性アミノ酸残基、グルタミン（Ｑ）残基、アスパラギン（Ｎ）残基、セリン（Ｓ）残基、リシン（Ｋ）残基及びグルタミン酸（Ｅ）残基等の親水性アミノ酸残基が好ましく、バリン（Ｖ）残基、ロイシン（Ｌ）残基、イソロイシン（Ｉ）残基及びグルタミン（Ｑ）残基がより好ましく、グルタミン（Ｑ）残基が更に好ましい。
　第２の改変フィブロインのより具体的な例として、（２－ｉ）配列番号６、配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列、又は（２－ｉｉ）配列番号６、配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
　（２－ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号６で示されるアミノ酸配列は、天然由来のフィブロインに相当する配列番号１０で示されるアミノ酸配列のＲＥＰ中の全てのＧＧＸをＧＱＸに置換したものである。配列番号７で示されるアミノ酸配列は、配列番号６で示されるアミノ酸配列から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号８で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列の各（Ａ）ｎモチーフのＣ末端側に２つのアラニン残基を挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、配列番号７の分子量とほぼ同じとなるようにＮ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号９で示されるアミノ酸配列は、配列番号１１で示されるアミノ酸配列中に存在する２０個のドメイン配列の領域（但し、当該領域のＣ末端側の数アミノ酸残基が置換されている。）を４回繰り返した配列のＣ末端にＨｉｓタグが付加されたものである。
　配列番号１０で示されるアミノ酸配列（天然由来のフィブロインに相当）におけるｚ／ｗの値は、４６．８％である。配列番号６で示されるアミノ酸配列、配列番号７で示されるアミノ酸配列、配列番号８で示されるアミノ酸配列、及び配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｚ／ｗの値は、それぞれ５８．７％、７０．１％、６６．１％及び７０．０％である。また、配列番号１０、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列のギザ比率（後述する）１：１．８～１１．３におけるｘ／ｙの値は、それぞれ１５．０％、１５．０％、９３．４％、９２．７％及び８９．３％である。
　（２－ｉ）の改変フィブロインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（２－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（２－ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（２－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＲＥＰ中に含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列中のＲＥＰの総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが５０．９％以上であることが好ましい。
　第２の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、改変フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
　タグ配列として、例えば、他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用したアフィニティタグを挙げることができる。アフィニティタグの具体例として、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を挙げることができる。Ｈｉｓタグは、ヒスチジン残基が４から１０個程度並んだ短いペプチドで、ニッケル等の金属イオンと特異的に結合する性質があるため、金属キレートクロマトグラフィー（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　ｍｅｔａｌ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による改変フィブロインの単離に利用することができる。タグ配列の具体例として、例えば、配列番号１２で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含むアミノ酸配列）が挙げられる。
　また、グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列を利用することもできる。
　さらに、抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用することもできる。抗原性を示すペプチド（エピトープ）をタグ配列として付加することにより、当該エピトープに対する抗体を結合させることができる。エピトープタグとして、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列）タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等を挙げることができる。エピトープタグを利用することにより、高い特異性で容易に改変フィブロインを精製することができる。
　さらにタグ配列を特定のプロテアーゼで切り離せるようにしたものも使用することができる。当該タグ配列を介して吸着したタンパク質をプロテアーゼ処理することにより、タグ配列を切り離した改変フィブロインを回収することもできる。
　タグ配列を含む第２の改変フィブロインのより具体的な例として、（２－ｉｉｉ）配列番号１３、配列番号１１、配列番号１４若しく配列番号１５で示されるアミノ酸配列、又は（２－ｉｖ）配列番号１３、配列番号１１、配列番号１４若しく配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
　配列番号１６、配列番号１７、配列番号１３、配列番号１１、配列番号１４及び配列番号１５で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１０、配列番号１８、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１２で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。
　（２－ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１３、配列番号１１、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（２－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号１３、配列番号１１、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（２－ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（２－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号１３、配列番号１１、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＲＥＰ中に含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列中のＲＥＰの総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが５０．９％以上であることが好ましい。
　第２の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
　（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロイン（第３の改変フィブロイン）は、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。第３の改変フィブロインのドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、少なくとも１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。
　第３の改変フィブロインは、天然由来のフィブロインから（Ａ）ｎモチーフを１０～４０％欠失させたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
　第３の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって１～３つの（Ａ）ｎモチーフ毎に１つの（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
　第３の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって２つ連続した（Ａ）ｎモチーフの欠失、及び１つの（Ａ）ｎモチーフの欠失がこの順に繰り返されたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
　第３の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
　第３の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８～１１．３となる隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが２０％以上、３０％以上、４０％以上又は５０％以上であるアミノ酸配列を有するものであってもよい。（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は８３％以上であってよいが、８６％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、１００％であること（アラニン残基のみで構成されることを意味する）が更により好ましい。
　ｘ／ｙの算出方法を図１を参照しながら更に詳細に説明する。図１には、フィブロインからＮ末端配列及びＣ末端配列を除いたドメイン配列を示す。当該ドメイン配列は、Ｎ末端側（左側）から（Ａ）ｎモチーフ－第１のＲＥＰ（５０アミノ酸残基）－（Ａ）ｎモチーフ－第２のＲＥＰ（１００アミノ酸残基）－（Ａ）ｎモチーフ－第３のＲＥＰ（１０アミノ酸残基）－（Ａ）ｎモチーフ－第４のＲＥＰ（２０アミノ酸残基）－（Ａ）ｎモチーフ－第５のＲＥＰ（３０アミノ酸残基）－（Ａ）ｎモチーフという配列を有する。
　隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットは、重複がないように、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、順次選択する。このとき、選択されない［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットが存在してもよい。図１には、パターン１（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較、及び第３のＲＥＰと第４のＲＥＰの比較）、パターン２（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較、及び第４のＲＥＰと第５のＲＥＰの比較）、パターン３（第２のＲＥＰと第３のＲＥＰの比較、及び第４のＲＥＰと第５のＲＥＰの比較）、パターン４（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較）を示した。なお、これ以外にも選択方法は存在する。
　次に各パターンについて、選択した隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニット中の各ＲＥＰのアミノ酸残基数を比較する。比較は、よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときの、他方のアミノ酸残基数の比を求めることによって行う。例えば、第１のＲＥＰ（５０アミノ酸残基）と第２のＲＥＰ（１００アミノ酸残基）の比較の場合、よりアミノ酸残基数の少ない第１のＲＥＰを１としたとき、第２のＲＥＰのアミノ酸残基数の比は、１００／５０＝２である。同様に、第４のＲＥＰ（２０アミノ酸残基）と第５のＲＥＰ（３０アミノ酸残基）の比較の場合、よりアミノ酸残基数の少ない第４のＲＥＰを１としたとき、第５のＲＥＰのアミノ酸残基数の比は、３０／２０＝１．５である。
　図１中、よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときに、他方のアミノ酸残基数の比が１．８～１１．３となる［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットの組を実線で示した。以下このような比をギザ比率と呼ぶ。よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときに、他方のアミノ酸残基数の比が１．８未満又は１１．３超となる［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットの組は破線で示した。
　各パターンにおいて、実線で示した隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットの全てのアミノ酸残基数を足し合わせる（ＲＥＰのみではなく、（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数もである。）。そして、足し合わせた合計値を比較して、当該合計値が最大となるパターンの合計値（合計値の最大値）をｘとする。図１に示した例では、パターン１の合計値が最大である。
　次に、ｘをドメイン配列の総アミノ酸残基数ｙで除すことによって、ｘ／ｙ（％）を算出することができる。
　第３の改変フィブロインにおいて、ｘ／ｙは、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、６５％以上であることが更に好ましく、７０％以上であることが更により好ましく、７５％以上であることが更によりまた好ましく、８０％以上であることが特に好ましい。ｘ／ｙの上限に特に制限はなく、例えば、１００％以下であってよい。ギザ比率が１：１．９～１１．３の場合には、ｘ／ｙは８９．６％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．８～３．４の場合には、ｘ／ｙは７７．１％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．９～８．４の場合には、ｘ／ｙは７５．９％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．９～４．１の場合には、ｘ／ｙは６４．２％以上であることが好ましい。
　第３の改変フィブロインが、ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）ｎモチーフの少なくとも７つがアラニン残基のみで構成される改変フィブロインである場合、ｘ／ｙは、４６．４％以上であることが好ましく、５０％以上であることがより好ましく、５５％以上であることが更に好ましく、６０％以上であることが更により好ましく、７０％以上であることが更によりまた好ましく、８０％以上であることが特に好ましい。ｘ／ｙの上限に特に制限はなく、１００％以下であればよい。
　第３の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列から、ｘ／ｙが６４．２％以上になるように（Ａ）ｎモチーフをコードする配列の１又は複数を欠失させることにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、ｘ／ｙが６４．２％以上になるように１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
　第３の改変フィブロインのより具体的な例として、（３－ｉ）配列番号１８、配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列、又は（３－ｉｉ）配列番号１８、配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
　（３－ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号１８で示されるアミノ酸配列は、天然由来のフィブロインに相当する配列番号１０で示されるアミノ酸配列から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号７で示されるアミノ酸配列は、配列番号１８で示されるアミノ酸配列のＲＥＰ中の全てのＧＧＸをＧＱＸに置換したものである。配列番号８で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列の各（Ａ）ｎモチーフのＣ末端側に２つのアラニン残基を挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、配列番号７の分子量とほぼ同じとなるようにＮ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号９で示されるアミノ酸配列は、配列番号１１で示されるアミノ酸配列中に存在する２０個のドメイン配列の領域（但し、当該領域のＣ末端側の数アミノ酸残基が置換されている。）を４回繰り返した配列のＣ末端にＨｉｓタグが付加されたものである。
　配列番号１０で示されるアミノ酸配列（天然由来のフィブロインに相当）のギザ比率１：１．８～１１．３におけるｘ／ｙの値は１５．０％である。配列番号１８で示されるアミノ酸配列、及び配列番号７で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、いずれも９３．４％である。配列番号８で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、９２．７％である。配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、８９．３％である。配列番号１０、配列番号１８、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｚ／ｗの値は、それぞれ４６．８％、５６．２％、７０．１％、６６．１％及び７０．０％である。
　（３－ｉ）の改変フィブロインは、配列番号１８、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（３－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１８、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（３－ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（３－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１８、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＮ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８～１１．３（ギザ比率が１：１．８～１１．３）となる隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが６４．２％以上であることが好ましい。
　第３の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方に上述したタグ配列を含んでいてもよい。
　タグ配列を含む第３の改変フィブロインのより具体的な例として、（３－ｉｉｉ）配列番号１７、配列番号１１、配列番号１４若しくは配列番号１５で示されるアミノ酸配列、又は（２－ｉｖ）配列番号１７、配列番号１１、配列番号１４若しくは配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
　配列番号１６、配列番号１７、配列番号１３、配列番号１１、配列番号１４及び配列番号１５で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１０、配列番号１８、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１２で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。
　（３－ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１７、配列番号１１、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（３－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号１７、配列番号１１、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（３－ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（３－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号１７、配列番号１１、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＮ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８～１１．３となる隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが６４．２％以上であることが好ましい。
　第３の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
　グリシン残基の含有量、及び（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロイン（第４の改変フィブロイン）は、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたことに加え、グリシン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有するものである。第４の改変フィブロインのドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、少なくとも１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに加え、更に少なくともＲＥＰ中の１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。すなわち、第４の改変フィブロインは、上述したグリシン残基の含有量が低減された改変フィブロイン（第２の改変フィブロイン）と、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロイン（第３の改変フィブロイン）の特徴を併せ持つ改変フィブロインである。具体的な態様等は、第２の改変フィブロイン、及び第３の改変フィブロインで説明したとおりである。
　第４の改変フィブロインのより具体的な例として、（４－ｉ）配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列、（４－ｉｉ）配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロインの具体的な態様は上述のとおりである。
　タグ配列を含む第４の改変フィブロインのより具体的な例として、（４－ｉ）配列番号１１、配列番号１４若しくは配列番号１５で示されるアミノ酸配列、又は（４－ｉｉ）配列番号１１、配列番号１４若しくは配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
　局所的に疎水性指標の大きい領域を含むドメイン配列を有する改変フィブロイン（第５の改変フィブロイン）は、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むアミノ酸配列を有するものであってよい。
　局所的に疎水性指標の大きい領域は、連続する２～４アミノ酸残基で構成されていることが好ましい。
　上述の疎水性指標の大きいアミノ酸残基は、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）から選ばれるアミノ酸残基であることがより好ましい。
　第５の改変フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する改変に加え、更に、天然由来のフィブロインと比較して、１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変があってもよい。
　第５の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がマイナスであるアミノ酸残基）を疎水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基）に置換すること、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基に置換したこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基に置換したこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
　第５の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を上記ドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を上記ドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であるアミノ酸配列を有してもよい。
　アミノ酸残基の疎水性指標については、公知の指標（Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ　ｉｎｄｅｘ：Ｋｙｔｅ　Ｊ，＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ　Ｒ（１９８２）“Ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ　ｔｈｅ　ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ　ｃｈａｒａｃｔｅｒ　ｏｆ　ａ　ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７，ｐｐ．１０５－１３２）を使用する。具体的には、各アミノ酸の疎水性指標（ハイドロパシー・インデックス、以下「ＨＩ」とも記す。）は、下記表１に示すとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ｐ／ｑの算出方法を更に詳細に説明する。算出には、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列（以下、「配列Ａ」とする）を用いる。まず、配列Ａに含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値を算出する。疎水性指標の平均値は、連続する４アミノ酸残基に含まれる各アミノ酸残基のＨＩの総和を４（アミノ酸残基数）で除して求める。疎水性指標の平均値は、全ての連続する４アミノ酸残基について求める（各アミノ酸残基は、１～４回平均値の算出に用いられる。）。次いで、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域を特定する。あるアミノ酸残基が、複数の「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」に該当する場合であっても、領域中には１アミノ酸残基として含まれることになる。そして、当該領域に含まれるアミノ酸残基の総数がｐである。また、配列Ａに含まれるアミノ酸残基の総数がｑである。
　例えば、「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が２０カ所抽出された場合（重複はなし）、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域には、連続する４アミノ酸残基（重複はなし）が２０含まれることになり、ｐは２０×４＝８０である。また、例えば、２つの「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が１アミノ酸残基だけ重複して存在する場合、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域には、７アミノ酸残基含まれることになる（ｐ＝２×４－１＝７。「－１」は重複分の控除である。）。例えば、図２に示したドメイン配列の場合、「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が重複せずに７つ存在するため、ｐは７×４＝２８となる。また、例えば、図２に示したドメイン配列の場合、ｑは４＋５０＋４＋４０＋４＋１０＋４＋２０＋４＋３０＝１７０である（Ｃ末端側の最後に存在する（Ａ）ｎモチーフは含めない）。次に、ｐをｑで除すことによって、ｐ／ｑ（％）を算出することができる。図２の場合２８／１７０＝１６．４７％となる。
　第５の改変フィブロインにおいて、ｐ／ｑは、６．２％以上であることが好ましく、７％以上であることがより好ましく、１０％以上であることが更に好ましく、２０％以上であることが更により好ましく、３０％以上であることが更によりまた好ましい。ｐ／ｑの上限は、特に制限されないが、例えば、４５％以下であってもよい。
　第５の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインのアミノ酸配列を、上記のｐ／ｑの条件を満たすように、ＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がマイナスであるアミノ酸残基）を疎水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基）に置換すること、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入することにより、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むアミノ酸配列に改変することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から上記のｐ／ｑの条件を満たすアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当する改変を行ってもよい。
　疎水性指標の大きいアミノ酸残基としては、特に制限はないが、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）が好ましく、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びイソロイシン（Ｉ）がより好ましい。
　第５の改変フィブロインの具体的な例として、（５－ｉ）配列番号１９、配列番号２０若しくは配列番号２１で示されるアミノ酸配列、又は（５－ｉｉ）配列番号１９、配列番号２０若しくは配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
　（５－ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号２２で示されるアミノ酸配列は、天然由来のフィブロインの（Ａ）ｎモチーフ中のアラニン残基が連続するアミノ酸配列をアラニン残基が連続する数を５つになるよう欠失したものである。配列番号１９で示されるアミノ酸配列は、配列番号２２で示されるアミノ酸配列に対し、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を２カ所挿入し、かつ配列番号２２で示されるアミノ酸配列の分子量とほぼ同じとなるようにＣ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号２３で示されるアミノ酸配列は、配列番号２２で示されるアミノ酸配列に対し、各（Ａ）ｎモチーフのＣ末端側に２つのアラニン残基を挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、かつ配列番号２２で示されるアミノ酸配列の分子量とほぼ同じとなるようにＣ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号２０で示されるアミノ酸配列は、配列番号２３で示されるアミノ酸配列に対し、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を１カ所挿入したものである。配列番号２１で示されるアミノ酸配列は、配列番号２３で示されるアミノ酸配列に対し、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を２カ所挿入したものである。
　（５－ｉ）の改変フィブロインは、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（５－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（５－ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（５－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であることが好ましい。
　第５の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。
　タグ配列を含む第５の改変フィブロインのより具体的な例として、（５－ｉｉｉ）配列番号２４、配列番号２５若しくは配列番号２６で示されるアミノ酸配列、又は（５－ｉｖ）配列番号２４、配列番号２５若しくは配列番号２６で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
　配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１２で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。
　（５－ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号２４、配列番号２５若しくは配列番号２６で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（５－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号２４、配列番号２５若しくは配列番号２６で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（５－ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（５－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号２４、配列番号２５若しくは配列番号２６で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であることが好ましい。
　第５の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
　グルタミン残基の含有量が低減されたドメイン配列を有する改変フィブロイン（第６の改変フィブロイン）は、天然由来のフィブロインと比較して、グルタミン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。
　第６の改変フィブロインは、ＲＥＰのアミノ酸配列中に、ＧＧＸモチーフ及びＧＰＧＸＸモチーフから選ばれる少なくとも一つのモチーフが含まれていることが好ましい。
　第６の改変フィブロインが、ＲＥＰ中にＧＰＧＸＸモチーフを含む場合、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率は、通常１％以上であり、５％以上であってもよく、１０％以上であるのが好ましい。ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の上限に特に制限はなく、５０％以下であってよく、３０％以下であってもよい。
　本明細書において、「ＧＰＧＸＸモチーフ含有率」は、以下の方法により算出される値である。
　式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロインにおいて、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域に含まれるＧＰＧＸＸモチーフの個数の総数を３倍した数（即ち、ＧＰＧＸＸモチーフ中のＧ及びＰの総数に相当）をｓとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率はｓ／ｔとして算出される。
　ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としているのは、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列」（ＲＥＰに相当する配列）には、フィブロインに特徴的な配列と相関性の低い配列が含まれることがあり、ｍが小さい場合（つまり、ドメイン配列が短い場合）、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出結果に影響するので、この影響を排除するためである。なお、ＲＥＰのＣ末端に「ＧＰＧＸＸモチーフ」が位置する場合、「ＸＸ」が例えば「ＡＡ」の場合であっても、「ＧＰＧＸＸモチーフ」として扱う。
　図３は、フィブロインのドメイン配列を示す模式図である。図３を参照しながらＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出方法を具体的に説明する。まず、図３に示したフィブロインのドメイン配列（「［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフ」タイプである。）では、全てのＲＥＰが「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」（図３中、「領域Ａ」で示した配列。）に含まれているため、ｓを算出するためのＧＰＧＸＸモチーフの個数は７であり、ｓは７×３＝２１となる。同様に、全てのＲＥＰが「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」（図３中、「領域Ａ」で示した配列。）に含まれているため、当該配列から更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数ｔは５０＋４０＋１０＋２０＋３０＝１５０である。次に、ｓをｔで除すことによって、ｓ／ｔ（％）を算出することができ、図３のフィブロインの場合２１／１５０＝１４．０％となる。
　第６の改変フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましく、７％以下であることがより好ましく、４％以下であることが更に好ましく、０％であることが特に好ましい。
　本明細書において、「グルタミン残基含有率」は、以下の方法により算出される値である。
　式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロインにおいて、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列（図３の「領域Ａ」に相当する配列。）に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域に含まれるグルタミン残基の総数をｕとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、グルタミン残基含有率はｕ／ｔとして算出される。グルタミン残基含有率の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。
　第６の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、又は他のアミノ酸残基に置換したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってよい。
　「他のアミノ酸残基」は、グルタミン残基以外のアミノ酸残基であればよいが、グルタミン残基よりも疎水性指標の大きいアミノ酸残基であることが好ましい。アミノ酸残基の疎水性指標は表１に示すとおりである。
　表１に示すとおり、グルタミン残基よりも疎水性指標の大きいアミノ酸残基としては、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、プロリン（Ｐ）及びヒスチジン（Ｈ）から選ばれるアミノ酸残基を挙げることができる。これらの中でも、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）から選ばれるアミノ酸残基であることがより好ましく、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びフェニルアラニン（Ｆ）から選ばれるアミノ酸残基であることが更に好ましい。
　第６の改変フィブロインは、ＲＥＰの疎水性度が、－０．８以上であることが好ましく、－０．７以上であることがより好ましく、０以上であることが更に好ましく、０．３以上であることが更により好ましく、０．４以上であることが特に好ましい。ＲＥＰの疎水性度の上限に特に制限はなく、１．０以下であってよく、０．７以下であってもよい。
　本明細書において、「ＲＥＰの疎水性度」は、以下の方法により算出される値である。
　式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロインにおいて、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列（図３の「領域Ａ」に相当する配列。）に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域の各アミノ酸残基の疎水性指標の総和をｖとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、ＲＥＰの疎水性度はｖ／ｔとして算出される。ＲＥＰの疎水性度の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。
　第６の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変があってもよい。
　第６の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列からＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失させること、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。
　第６の改変フィブロインのより具体的な例として、（６－ｉ）配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３若しくは配列番号４２で示されるアミノ酸配列を含む、改変フィブロイン、又は（６－ｉｉ）配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３若しくは配列番号４２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
　（６－ｉ）の改変フィブロインについて説明する。
　配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）は、天然由来のフィブロインであるＮｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、（Ａ）ｎモチーフ中のアラニン残基が連続するアミノ酸配列をアラニン残基が連続する数を５つにする等の生産性を向上させるためのアミノ酸の改変を行ったものである。一方、Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０は、グルタミン残基（Ｑ）の改変は行っていないため、グルタミン残基含有率は、天然由来のフィブロインのグルタミン残基含有率と同程度である。
　配列番号２７で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ８８８）は、Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０（配列番号７）中のＱＱを全てＶＬに置換したものである。
　配列番号２８で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ９６５）は、Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０（配列番号７）中のＱＱを全てＴＳに置換し、かつ残りのＱをＡに置換したものである。
　配列番号２９で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ８８９）は、Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０（配列番号７）中のＱＱを全てＶＬに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。
　配列番号３０で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ９１６）は、Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０（配列番号７）中のＱＱを全てＶＩに置換し、かつ残りのＱをＬに置換したものである。
　配列番号３１で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ９１８）は、Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０（配列番号７）中のＱＱを全てＶＦに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。
　配列番号３４で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ５２５）は、Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０（配列番号７）に対し、アラニン残基が連続する領域（Ａ５）に２つのアラニン残基を挿入し、Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０の分子量とほぼ同じになるよう、Ｃ末端側のドメイン配列２つを欠失させ、かつグルタミン残基（Ｑ）１３箇所をセリン残基（Ｓ）又はプロリン残基（Ｐ）に置換したものである。
　配列番号３２で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ６９９）は、Ｍ＿ＰＲＴ５２５（配列番号３４）中のＱＱを全てＶＬに置換したものである。
　配列番号３３で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ６９８）は、Ｍ＿ＰＲＴ５２５（配列番号３４）中のＱＱを全てＶＬに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。
　配列番号４２で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ－ＰＲＴ９６６）は、配列番号９で示されるアミノ酸配列（Ｎ末端に配列番号１２で示されるアミノ酸配列が付加される前のアミノ酸配列）中のＱＱを全てＶＦに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。
　配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３及び配列番号４２で示されるアミノ酸配列は、いずれもグルタミン残基含有率は９％以下である（表２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（６－ｉ）の改変フィブロインは、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３又は配列番号４２で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（６－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３又は配列番号４２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（６－ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（６－ｉｉ）の改変フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましい。また、（６－ｉｉ）の改変フィブロインは、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率が１０％以上であることが好ましい。
　第６の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、改変フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
　タグ配列を含む第６の改変フィブロインのより具体的な例として、（６－ｉｉｉ）配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１若しくは配列番号４３で示されるアミノ酸配列を含む、改変フィブロイン、又は（６－ｉｖ）配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１若しくは配列番号４３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
　配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１及び配列番号４３で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３及び配列番号４２で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１２で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。Ｎ末端にタグ配列を付加しただけであるため、グルタミン残基含有率に変化はなく、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１及び配列番号４３で示されるアミノ酸配列は、いずれもグルタミン残基含有率が９％以下である（表３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　（６－ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１又は配列番号４３で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（６－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１又は配列番号４３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（６－ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（６－ｉｖ）の改変フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましい。また、（６－ｉｖ）の改変フィブロインは、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率が１０％以上であることが好ましい。
　第６の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
　本実施形態に係る改変フィブロインは、第１の改変フィブロイン、第２の改変フィブロイン、第３の改変フィブロイン、第４の改変フィブロイン、第５の改変フィブロイン、及び第６の改変フィブロインが有する特徴のうち、少なくとも２つ以上の特徴を併せ持つ改変フィブロインであってもよい。
（フィブロインの製造方法）
　フィブロイン（タンパク質）は、例えば、当該タンパク質をコードする核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する発現ベクターで形質転換された宿主により、当該核酸を発現させることにより生産することができる。
　フィブロインをコードする核酸の製造方法は、特に制限されない。例えば、天然のフィブロインをコードする遺伝子を利用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅しクローニングし、必要に応じて遺伝子工学的手法により改変する方法、又は、化学的に合成する方法によって、当該核酸を製造することができる。核酸の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどより入手したタンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ　１０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結する方法によって遺伝子を化学的に合成することができる。この際に、フィブロインの精製及び／又は確認を容易にするため、上記のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるフィブロインをコードする核酸を合成してもよい。
　調節配列は、宿主におけるフィブロインの発現を制御する配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等）であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。プロモーターとして、宿主細胞中で機能し、フィブロインを発現誘導可能な誘導性プロモーターを用いてもよい。誘導性プロモーターは、誘導物質（発現誘導剤）の存在、リプレッサー分子の非存在、又は温度、浸透圧若しくはｐＨ値の上昇若しくは低下等の物理的要因により、転写を制御できるプロモーターである。
　発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主の染色体中への組込みが可能で、フィブロインをコードする核酸を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが好適に用いられる。
　宿主として、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも好適に用いることができる。
　原核生物の宿主の好ましい例として、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する細菌を挙げることができる。エシェリヒア属に属する微生物として、例えば、エシェリヒア・コリ等を挙げることができる。ブレビバチルス属に属する微生物として、例えば、ブレビバチルス・アグリ等を挙げることができる。セラチア属に属する微生物として、例えば、セラチア・リクエファシエンス等を挙げることができる。バチルス属に属する微生物として、例えば、バチルス・サチラス等を挙げることができる。ミクロバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム等を挙げることができる。ブレビバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ブレビバクテリウム・ディバリカタム等を挙げることができる。コリネバクテリウム属に属する微生物として、例えば、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス等を挙げることができる。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物として、例えば、シュードモナス・プチダ等を挙げることができる。
　原核生物を宿主とする場合、フィブロインをコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２（ベーリンガーマンハイム社製）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＣｏｌｄ、ｐＵＢ１１０、ｐＮＣＯ２（特開２００２－２３８５６９号公報）等を挙げることができる。
　真核生物の宿主としては、例えば、酵母及び糸状真菌（カビ等）を挙げることができる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属等に属する酵母を挙げることができる。糸状真菌としては、例えば、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属等に属する糸状真菌を挙げることができる。
　真核生物を宿主とする場合、フィブロインをコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）等を挙げることができる。上記宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、コンピテント法等を挙げることができる。
　発現ベクターで形質転換された宿主による核酸の発現方法としては、直接発現のほか、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
　フィブロインは、例えば、発現ベクターで形質転換された宿主を培養培地中で培養し、培養培地中に当該タンパク質を生成蓄積させ、該培養培地から採取することにより製造することができる。宿主を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。
　宿主が、大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、培養培地として、宿主が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有し、宿主の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
　炭素源としては、上記形質転換微生物が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類を用いることができる。窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。無機塩類としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。
　大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物の培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は、例えば、１５～４０℃である。培養時間は、通常１６時間～７日間である。培養中の培養培地のｐＨは３．０～９．０に保持することが好ましい。培養培地のｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。
　また、培養中、必要に応じて、アンピシリン及びテトラサイクリン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
　発現させたフィブロインの単離、精製は通常用いられている方法で行うことができる。例えば、当該タンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、宿主細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁した後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー及びダイノミル等により宿主細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法、すなわち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ　ＨＰＡ－７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の方法を単独又は組み合わせて使用し、精製標品を得ることができる。
　また、フィブロインが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に宿主細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてフィブロインの不溶体を回収する。回収したフィブロインの不溶体は、タンパク質変性剤で可溶化することができる。該操作の後、上記と同様の単離精製法によりフィブロインの精製標品を得ることができる。当該タンパク質が細胞外に分泌された場合には、培養上清から当該タンパク質を回収することができる。すなわち、培養物を遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、その培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
〔フィブロイン繊維の製造方法〕
　本発明に係るフィブロイン繊維の製造方法は、上述した本発明に係る紡糸原液を用いて乾式紡糸法によりフィブロイン繊維を紡糸するものである。すなわち、本発明に係るフィブロイン繊維の製造方法は、上述した本発明に係る紡糸原液を用意する工程と、当該紡糸原液を紡糸口金から空気中に吐出した後、加熱して有機溶媒を気化させてフィブロイン繊維を形成する工程（紡糸工程）とを少なくとも備える。当該各工程により得られたフィブロイン繊維は、そのまま任意の用途に用いてもよい。また、フィブロイン繊維を乾熱延伸する工程（乾熱延伸工程）を更に行い、任意の延伸倍率に延伸したフィブロイン繊維を得て、得られたフィブロイン繊維を任意の用途に用いてもよい。
　本実施形態に係る製造方法は、吐出前に紡糸原液を濾過する工程（濾過工程）、及び／又は吐出前に紡糸原液を脱泡する工程（脱泡工程）を更に備えるものであってもよい。
　紡糸工程は、例えば、紡糸原液として本発明に係る紡糸原液を使用する他は、公知の乾式紡糸法により実施することができる。また、紡糸工程は、エレクトロスピニング法（静電紡糸法）により実施することもできるが、製造工程の簡易化という観点から、エレクトロスピニング法以外の方法で実施することが好ましい。
　紡糸工程において、紡糸口金の口金形状、ホール形状、ホール数などは特に限定されるものではなく、所望の繊維径及び単糸本数等に応じて適宜選択できる。
　紡糸口金のホール形状が円形である場合は、０．１ｍｍ以上０．６ｍｍ以下の孔径を例示できる。孔径が０．１ｍｍ以上であると、圧力損失を低減することができ設備費用を抑えられるので好ましい。また孔径が０．６ｍｍ以下であると、繊維径を細くするための延伸操作の必要性が低減され、吐出から引き取りまでの間で延伸切れを起こす可能性を低減できるので好ましい。
　紡糸口金から紡糸原液を吐出する方法に特に制限はないが、例えば、紡糸原液の送液手段として定量ポンプを用いる方法を使用することができる。吐出量は生産速度に応じて適宜調整することができる。
　紡糸口金を通過する際の紡糸原液の温度、及び紡糸口金の温度は、特に限定されるものではなく、用いる紡糸原液の濃度及び粘度、有機溶媒の種類等により適宜調整すればよい。当該温度は、フィブロインの劣化等を防止するという観点から、３０℃～１００℃が好ましい。また、当該温度は、有機溶媒の揮発による圧力上昇、紡糸原液の固形化による配管内の閉塞が発生する可能性を低減するという観点から、用いる有機溶媒の沸点に満たない温度を上限とすることが好ましい。これにより工程安定性が向上する。
　紡糸工程で得られた未延伸糸（又は前延伸糸）は、延伸工程を経て延伸糸とすることができる。延伸方法としては、例えば、乾熱延伸が挙げられる。
　乾熱延伸の前又は後、或いは、乾熱延伸の前及び後に、必要に応じて、未延伸糸（若しくは前延伸糸）又は延伸糸に対して、帯電抑制及び潤滑性等を付与する目的で油剤を付与してもよい。付与する油剤の種類及び付与する量等は、特に限定されるものではなく、フィブロイン繊維を使用する用途、フィブロイン繊維の取扱い性等を考慮し適宜調整することができる。
　乾熱延伸では、乾燥後の未延伸糸（又は前延伸糸）を熱延伸する。このときの加熱温度は十分な延伸及び強度が発現する条件であれば特に限定されるものではないが、例えば、１００℃～２７０℃であってよく、１４０℃～２３０℃であってよく、１４０℃～２００℃であってよく、１６０℃～２００℃であってよく、１６０℃～１８０℃であってよい。また、乾熱延伸工程は、必要に応じて多段階に分けて行っても特に差し支えはない。なお、乾熱延伸する際に用いる装置としては、接触型の熱板、及び非接触型の炉などがあるが、特に限定されるものではなく、繊維を所定の温度まで昇温させ、かつ所定の倍率で延伸が可能な装置であればよい。
　乾熱延伸工程における延伸倍率は、未延伸糸（又は前延伸糸）に対して、例えば、２～３０倍であってよく、２～２０倍であってよく、３～１５倍であってよく、３～１０倍であることが好ましく、４～８倍であることがより好ましいが、所望する繊維の太さ、機械物性などの特性が得られる範囲であれば限定されるものではない。
　乾熱延伸後のフィブロイン繊維はワインダーで巻取ってもよい。ワインダーでの巻取り方法については、公知のワインダーを用い、適宜張力及び接圧等の巻取り条件を調整して巻き取ることができる。
　以上の方法により得られる本発明のフィブロイン繊維は、線形の形状を有する。
　本発明に係るフィブロイン繊維は、さらに湿熱延伸処理を行った後、ワインダーで巻取ってもよい。湿熱延伸は、温水中、温水に有機溶剤等を加えた溶液中、又はスチーム加熱中で行うことができる。温度としては、例えば、４０～２００℃であってよく、５０～１８０℃であってよく、５０～１５０℃であってよく、７５～９０℃が好ましい。湿熱延伸では、フィブロイン繊維を、例えば、１～１０倍延伸することができ、２～８倍延伸することが好ましく、２～４倍延伸することがさらに好ましい。さらに湿熱延伸処理を行うことにより、フィブロイン繊維に更に高い応力（強度）を付与することができる。また、この湿熱延伸工程は、必要に応じて多段階に分けて行ってもよい。
　最終的な延伸倍率は、その下限値が、未延伸糸（又は前延伸糸）に対して、好ましくは、１倍超、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上のうちのいずれかであり、上限値が、好ましくは４０倍以下、３０倍以下、２０倍以下、１５倍以下、１４倍以下、１３倍以下、１２倍以下、１１倍以下、１０倍以下である。
〔フィブロイン繊維〕
　本発明に係るフィブロイン繊維は、フィブロインと、界面活性剤とを含有する。界面活性剤の含有量の下限値は、フィブロインの含有量を基準として、０．００１重量％以上、０．０１重量％以上、０．１重量％以上、０．２重量％以上、０．３重量％以上、０．４重量％以上、０．５重量％以上、０．６重量％以上、０．７重量％以上、０．８重量％以上、０．９重量％以上、１重量％以上、又は１．２重量％以上であってよく、界面活性剤の含有量の上限値は、フィブロインの含有量を基準として、１．５重量％以下、２．０重量％以下、２．０重量％以下、２．５重量％以下、３．０重量％以下、４．０重量％以下、５．０重量％以下、６．０重量％以下、７．０重量％以下、８．０重量％以下、９．０重量％以下、１０重量％以下、１０重量％以下、１５重量％以下、２０重量％以下、２５重量％以下、３０重量％以下、３５重量％以下、４０重量％以下、４５重量％以下、又は５０重量％以下であってよい。
　本実施形態に係るフィブロイン繊維は、紡糸原液に界面活性剤が含まれることから、界面活性剤が、フィブロイン繊維表面に付着している場合、フィブロイン繊維中に内包されている場合、又はフィブロイン繊維表面に付着し、かつ繊維中に内包されている場合がある。そのため、必要に応じてフィブロイン繊維表面に付着している界面活性剤、及び／又はフィブロイン繊維中に内包されている界面活性剤は、取り除いてもよい。界面活性剤を取り除く場合には、除去方法は特に限定されないが、フィブロイン繊維を水、温水、又は蒸気で洗浄してもよい。乾燥処理などが不必要であるという観点から、フィブロイン繊維を過熱水蒸気で洗浄するのが好ましい。
　本実施形態に係るフィブロイン繊維は、さらにフィブロイン繊維内のポリペプチド分子間で化学的に架橋させてもよい。架橋させることができる官能基は、例えば、アミノ基、カルボキシル基、チオール基及びヒドロキシ基等が挙げられる。例えば、ポリペプチドに含まれるリジン側鎖のアミノ基は、グルタミン酸又はアスパラギン酸側鎖のカルボキシル基と脱水縮合によりアミド結合で架橋できる。真空加熱下で脱水縮合反応を行なうことにより架橋してもよいし、カルボジイミド等の脱水縮合剤により架橋させてもよい。
　ポリペプチド分子間の架橋は、カルボジイミド、グルタルアルデヒド等の架橋剤を用いて行ってもよく、トランスグルタミナーゼ等の酵素を用いて行ってもよい。カルボジイミドは、一般式Ｒ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ２（但し、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、炭素数１～６のアルキル基、シクロアルキル基を含む有機基を示す。）で示される化合物である。カルボジイミドの具体例として、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１－シクロヘキシル－３－（２－モルホリノエチル）カルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）等が挙げられる。これらの中でも、ＥＤＣ及びＤＩＣはポリペプチド分子間のアミド結合形成能が高く、架橋反応し易いことから好ましい。
　架橋処理は、フィブロイン繊維に架橋剤を付与して真空加熱乾燥で架橋するのが好ましい。架橋剤は純品をフィブロイン繊維に付与してもよいし、炭素数１～５の低級アルコール及び緩衝液等で０．００５～１０質量％の濃度に希釈したものをフィブロイン繊維に付与してもよい。架橋処理は、温度２０～４５℃で３～４２時間行うのが好ましい。架橋処理により、フィブロイン繊維に更に高い応力（強度）を付与することができる。
〔製品〕
　本実施形態に係るフィブロイン繊維は、各種製品に応用できる。製品としては、例えば、繊維、糸、布帛、編み物、組み物、不織布、紙、及び綿を挙げることができる。繊維としては、例えば、長繊維、短繊維、モノフィラメント、又はマルチフィラメント等を挙げることができ、糸としては、紡績糸、撚糸、仮撚糸、加工糸、混繊糸、又は混紡糸等を挙げることができる。さらに、これらの繊維や糸から、織物等の布帛、編み物、組み物、若しくは不織布等、紙及び綿等を製造することができる。これらの製品は、公知の方法により製造することができる。また、ロープ、手術用縫合糸、電気部品用の可撓性止め具、さらには移植用生理活性材料（例えば、人工靭帯及び大動脈バンド）等の高強度用途にも応用できる。これらは、国際公開ＷＯ２０１３／０６５６５０号等に記載の方法に準じて製造することができる。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
〔フィブロイン繊維の評価方法〕
　フィブロイン繊維の各特性値は、以下の方法で評価した。
（フィブロイン繊維の繊維径評価）
　フィブロイン繊維軸に対して垂直方向にフィブロイン繊維を切断し、繊維断面をＮｉｋｏｎ社製ＥＣＬＩＰＳＥ　ＬＶ１００ＮＤを用いて観察し、画像処理ソフト（Ｎｉｋｏｎ社製ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ　Ｄ）を用いて繊維径を計測した。
（フィブロイン繊維の機械物性評価）
　ＪＩＳ　Ｌ１０１３に基づいて試験を実施した。インストロン社製３３４５シリーズの引張試験機を用いて、試験長３００ｍｍ、試験速度３０ｍｍ／分の試験条件でフィブロイン繊維の強度（引張強度）及び伸度を測定した。
〔改変フィブロインの製造〕
（１）発現ベクターの作製
　ネフィラ・クラビペス（Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ）由来のフィブロイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、配列番号１５及び配列番号４３で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン（以下、それぞれ「ＰＲＴ７９９」及び「ＰＲＴ９６６」ともいう。）を設計した。なお、配列番号１５で示されるアミノ酸配列は、ネフィラ・クラビペス由来のフィブロインのアミノ酸配列に対して、生産性の向上を目的としてアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を施したアミノ酸配列を有し、さらにＮ末端に配列番号１２で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されている。配列番号４３で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ９６６）は、疎水度の向上を目的として、配列番号９で示されるアミノ酸配列（Ｎ末端に配列番号１２で示されるアミノ酸配列が付加される前のアミノ酸配列）中のＱＱを全てＶＦに置換し、かつ残りのＱをＩに置換し、さらにＮ末端に配列番号１２で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）を付加したものである。
　次に、ＰＲＴ７９９及びＰＲＴ９６６をコードする核酸を合成した。当該核酸には、５’末端にＮｄｅＩサイト及び終止コドン下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した。当該核酸をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。その後、同核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した後、それぞれタンパク質発現ベクターｐＥＴ－２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。
（２）改変フィブロインの発現
　（１）で得られた発現ベクターで、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。当該形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。当該培養液を、アンピシリンを含む１００ｍＬのシード培養用培地（表４）にＯＤ６００が０．００５となるように添加した。培養液温度を３０℃に保ち、ＯＤ６００が５になるまでフラスコ培養を行い（約１５時間）、シード培養液を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　当該シード培養液を５００ｍＬの生産培地（表５）を添加したジャーファーメンターにＯＤ６００が０．０５となるように添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ　１２０ｇ／１Ｌ）を１ｍＬ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにし、２０時間培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、改変フィブロインを発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存した目的とする改変フィブロインサイズのバンドの出現により、目的とする改変フィブロインの発現を確認した。
（３）改変フィブロインの精製
　ＩＰＴＧを添加してから２時間後に回収した菌体を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の菌体を約１ｍＭのＰＭＳＦを含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ　Ｎｉｒｏ　Ｓｏａｖｉ社製）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８Ｍ　グアニジン緩衝液（８Ｍ　グアニジン塩酸塩、１０ｍＭ　リン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で懸濁し、６０℃で３０分間、スターラーで撹拌し、溶解させた。溶解後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分を除き、凍結乾燥粉末を回収することにより、改変フィブロイン（ＰＲＴ７９９及びＰＲＴ９６６）を得た。
〔フィブロイン繊維の製造及び評価〕
（実施例１）
　上記のようにして得られた改変フィブロイン（ＰＲＴ９６６）２５重量％と、有機溶媒としてギ酸７３．５重量％と、界面活性剤としてポリオキシエチレン（２０）ステアリルエーテル１．５重量％とを混合して溶解させ、紡糸原液を調製した。
　調製した紡糸原液を目開き１μｍの金属フィルターで濾過し、次いで脱泡させた後に、径０．２ｍｍの紡糸口金を用いて、下方向に吐出した。次に紡糸口金から吐出した紡糸原液を１００℃の円筒型加熱炉で３０秒間加熱した後、ローラーで引き取り、フィブロイン繊維を得た。
（実施例２）
　紡糸原液における溶質を、上記のようにして得られた改変フィブロイン（ＰＲＴ７９９）とし、ギ酸の濃度及び界面活性剤の濃度を表６に記載のとおり変更した他は、実施例１と同様にして紡糸原液を調製した。調製した紡糸原液を実施例１と同様に処理し、径０．２ｍｍの紡糸口金を用いて、下方向に吐出した。次に紡糸口金から吐出した紡糸原液を１００℃の円筒型加熱炉で３０秒間加熱した後、ローラーで引き取り、さらに５倍に乾熱延伸してフィブロイン繊維を得た。
（比較例１）
　紡糸原液におけるギ酸の濃度を表６に記載のとおり変更し、界面活性剤を添加しなかったことの他は、実施例１と同様にして紡糸原液を調製した。調製した紡糸原液を実施例１と同様に処理し、実施例１と同様に紡糸口金から吐出させたところ、吐出後の紡糸原液を引き延ばすことができず、繊維を形成させることができなかった。
（比較例２）
　紡糸原液におけるギ酸の濃度を表６に記載のとおり変更し、界面活性剤を添加しなかったことの他は、実施例２と同様にして紡糸原液を調製した。調製した紡糸原液を実施例１と同様に処理し、実施例１と同様に紡糸口金から吐出させたところ、吐出後の紡糸原液を引き延ばすことができず、繊維を形成させることができなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６に示した通り、紡糸原液におけるフィブロイン濃度を２５ｗｔ％とした場合、界面活性剤を添加した紡糸原液を用いた場合のみ、フィブロイン繊維を得ることができた。
　実施例２で得られたフィブロイン繊維の繊維径評価及び機械物性評価を行なった。フィブロイン繊維の繊維径、機械物性及び製造条件は表７に示されたとおりであった。
（実施例３）
　紡糸原液におけるフィブロインの濃度、ギ酸の濃度、及び界面活性剤の濃度を表７に記載のとおり変更した他は、実施例２と同様にして紡糸原液を調製し、フィブロイン繊維を得た。得られたフィブロイン繊維の繊維径、機械物性及び製造条件は表７に示された通りであった。
（実施例４）
　紡糸原液におけるフィブロインの濃度、ギ酸の濃度、及び界面活性剤の濃度を表７に記載のとおり変更し、延伸倍率を４倍に変更した他は、実施例２と同様にして紡糸原液を調製し、フィブロイン繊維を得た。得られたフィブロイン繊維の繊維径、機械物性及び製造条件は表７に示された通りであった。
（実施例５）
　紡糸原液におけるフィブロインの濃度、ギ酸の濃度、及び界面活性剤の濃度を表７に記載のとおり変更した他は、実施例２と同様にして紡糸原液を調製し、フィブロイン繊維を得た。得られたフィブロイン繊維の繊維径、機械物性及び製造条件は表７に示された通りであった。
（比較例３）
　紡糸原液におけるフィブロインの濃度、及びギ酸の濃度を表７に記載のとおり変更し、界面活性剤を添加しなかったことの他は、実施例２と同様に紡糸原液を調製した。調製した紡糸原液を実施例２と同様に処理し、実施例２と同様に紡糸口金から吐出させたところ、繊維化は可能であったものの、延伸工程における延伸倍率を高めることができず、得られたフィブロイン繊維の機械物性は低いものであった（表７）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007

Claims (12)

  1. 　フィブロインと、界面活性剤と、有機溶媒と、を含む、紡糸原液であって、
    　前記フィブロインの濃度が、紡糸原液全量を基準として５～４０重量％であり、
    　前記界面活性剤の濃度が、紡糸原液全量を基準として０．０１～１０重量％である、紡糸原液。
  2. 　前記フィブロインが、クモ糸フィブロインである、請求項１に記載の紡糸原液。
  3. 　前記有機溶媒が、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、ヘキサフルオロアセトン（ＨＦＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、及びギ酸からなる群より選ばれる少なくとも１種以上である、請求項１又は２に記載の紡糸原液。
  4. 　前記界面活性剤が、非イオン界面活性剤である、請求項１～３のいずれか一項に記載の紡糸原液。
  5. 　前記非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルエーテルを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の紡糸原液。
  6. 　前記フィブロインが、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１若しくは配列番号４３で示されるアミノ酸配列を含む、又は配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１若しくは配列番号４３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の紡糸原液。
  7. 　フィブロインと、界面活性剤と、を含むフィブロイン繊維であって、
    　前記界面活性剤の含有量が、前記フィブロインの含有量を基準として、０．００１～５０重量％である、フィブロイン繊維。
  8. 　前記フィブロインが、クモ糸フィブロインである、請求項７に記載のフィブロイン繊維。
  9. 　請求項７又は８に記載のフィブロイン繊維を含む製品であって、
    　前記製品が、繊維、糸、布帛、編み物、組み物、不織布、紙、及び綿からなる群から選択される、製品。
  10. 　フィブロイン繊維の製造方法であって、
    　請求項１～６のいずれか一項に記載の紡糸原液を用意する工程と、
    　前記紡糸原液を紡糸口金から空気中に吐出した後、加熱して前記有機溶媒を気化させてフィブロイン繊維を形成する工程と、
    を備える、フィブロイン繊維の製造方法。
  11. 　前記フィブロイン繊維を乾熱延伸する工程を更に備える、請求項１０に記載のフィブロイン繊維の製造方法。
  12. 　前記乾熱延伸する工程における延伸倍率が２～３０倍である、請求項１１に記載のフィブロイン繊維の製造方法。
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