WO2020067548A1 - 難燃性タンパク質成形体及びその製造方法 - Google Patents

難燃性タンパク質成形体及びその製造方法 Download PDF

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WO2020067548A1
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seq
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アリナ クダシェワ
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Ｓｐｉｂｅｒ株式会社
小島プレス工業株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a flame-retardant protein molded product and a method for producing the same.
  • Patent Document 1 describes that a molded article obtained by molding a polypeptide derived from a natural spider silk protein has a high flexural modulus.
  • Synthetic resins such as acrylic resins and polystyrene resins are known to exhibit flammability, and many attempts to impart flame retardancy have been reported (for example, Patent Document 2).
  • natural protein fibers such as wool are known to exhibit flame retardancy, and are also used for flame retardant materials used inside the outer walls of houses, interiors of aircrafts, and firefighting suits. For this reason, few attempts to impart further flame retardancy to protein fibers have been reported.
  • an object of the present invention is to provide a protein molded product having more excellent flame retardancy.
  • the present invention provides the following [1] to [18].
  • [1] A protein molded product comprising a polypeptide and a flame retardant selected from salts of polyphosphate and salts of polynucleotide.
  • the polyphosphate salt includes ammonium polyphosphate.
  • [5] The protein molded product according to [4], wherein the salt of polydeoxynucleotide includes a sodium salt of polydeoxynucleotide.
  • [7] a step of mixing a polypeptide and a flame retardant selected from a salt of polyphosphate and a salt of a polynucleotide to obtain a composition, and a step of molding the composition by heating and pressing.
  • [8] The method for producing a protein molded product according to [7], wherein the flame retardant contains a salt of polyphosphoric acid.
  • the polyphosphate salt includes ammonium polyphosphate.
  • a method for improving the flame retardancy of a protein molded article comprising: mixing a polypeptide and a flame retardant selected from a salt of polyphosphate and a salt of a polynucleotide to obtain a composition; Heating and pressing the composition to form the composition.
  • the flame retardant comprises a polyphosphoric acid salt.
  • the salt of polyphosphoric acid comprises ammonium polyphosphate.
  • the flame retardant comprises a polydeoxynucleotide salt.
  • polydeoxynucleotide salt includes a polydeoxynucleotide sodium salt.
  • polypeptide is a structural protein.
  • 3 is a graph showing the results of thermogravimetric analysis of the protein molded products of Examples 1 to 3 and Comparative Example 1.
  • 4 is a graph showing the results of thermogravimetric analysis of the protein molded products of Examples 4, 5 and Comparative Example 1.
  • 4 is a photograph showing the appearance of the protein molded products of Example 2 and Comparative Example 1 before the test. It is a photograph which shows the external appearance of the protein molded object of Example 2 and the comparative example 1 10 seconds after the start of flame contact.
  • 1 is a photograph showing the appearance of the protein molded bodies of Example 2 and Comparative Example 1 one minute after the start of flame contact.
  • 3 is a photograph showing the appearance of the protein molded bodies of Example 2 and Comparative Example 1 two minutes after the start of flame contact.
  • FIG. 2 is a schematic cross-sectional view showing a press forming machine in a state in which the pressing is performed.
  • the protein molded product according to one embodiment of the present invention is obtained by molding a composition containing a polypeptide and a flame retardant selected from a salt of polyphosphate, a salt of polyribonucleic acid, and a salt of polydeoxyribonucleic acid as a mold. , And molded.
  • the polypeptide is a structural protein.
  • a structural protein is a protein having a role of constructing a biological structure, and is different from functional proteins such as enzymes, hormones, and antibodies. Examples of structural proteins include naturally occurring structural proteins such as naturally occurring fibroin, collagen, resilin, elastin, and keratin. Fibroin produced by insects and spiders is known as a naturally occurring fibroin.
  • the structural protein preferably contains at least one selected from the group consisting of a natural spider silk protein and a polypeptide derived from the natural spider silk protein.
  • fibroin produced by insects examples include Bombyx @ mori, Bombyx @ mandarina, natural silkworm (Antheraea @ yamamai), tussah (Anterea @ pernii), and maple silkworm (Erioganyerii). ), Silkworms (Samia cynthia), chestnut worms (Caligura japonica), tussah silkworms (Antheraea mylitta), silkworms such as Moga silkworms (Antheraea assama), and silkworms produced by silkworms.
  • Silk proteins Silk proteins.
  • fibroin produced by insects include, for example, silkworm fibroin L chain (GenBank Accession No. M76430 (base sequence), AAA27840.1 (amino acid sequence)).
  • Spiders have up to seven types of silk glands, each producing fibroin (spider silk protein) with different properties. Spider silk proteins are classified according to their source organs into large tough spider proteins (major ampullate spider protein, MaSp), highly elongating small bottle spider proteins (minor spider protein, MiSp), and whip. It has been named a spider silk protein of flagelliform (Flag), tubular (tubuliform), aggregate (aggregate), grape-like (aciniform) and pear-like (pyriform).
  • flagelliform flagelliform
  • tubular tubuliform
  • aggregate aggregate
  • grape-like aciniform
  • pear-like pear-like
  • Examples of the fibroin produced by spiders include spiders belonging to the genus Araneus (genus Araneus), such as Orion spider, Elder spider, Red-colored Spider, Blue-colored Spider, etc. Spiders belonging to the genus Argiope genus (Genus Pronus), such as spiders belonging to the genus Procarpus spp., Spiders belonging to the genus Pronus, and spider spiders belonging to the genus Cynotarachne, such as the genus Cyrtarachne, such as Torinofundamashi and Otorinofundamashi.
  • Genus Araneus such as Orion spider, Elder spider, Red-colored Spider, Blue-colored Spider, etc.
  • Spiders belonging to the genus Argiope genus such as spiders belonging to the genus Procarpus spp.
  • Spiders belonging to the genus Pronus and spider spiders belonging to the genus Cynotarachne, such as the genus Cyrtarachne, such
  • Spiders belonging to the genus Ordgarius such as spiders belonging to the genus (Gasteracantha), spiders belonging to the genus Orbalis, and spiders belonging to the genus Ordgarius, such as the spiders belonging to the genus Ordgarius.
  • Spiders belonging to the genus Argiope such as Argiope bruennichi, spiders belonging to the genus Argiope sp.
  • Spiders belonging to the genus Spider such as spiders belonging to the genus (Cytophora) and spiders belonging to the genus (Potys), spiders belonging to the genus Spiders (genus Cyclosa) such as the spiders belonging to the genus Cyclosa and spiders belonging to the genus Cygnus spp.
  • Spider silk proteins produced by spiders belonging to the genus Chorizopes), and asina such as red-headed spiders, red-backed spiders, blue-backed spiders and urocore-red spiders Spiders belonging to the genus Tetragnatha, spiders belonging to the genus Tetragnatha, spiders belonging to the genus Leucaegium, such as the spiders Argiope bruennichi and spiders spiders belonging to the genus Leucauge, such as the spiders belonging to the genus Nephila sp.
  • Spiders belonging to the genus Dyschiriognatha such as spiders belonging to the genus Menosira and spiders belonging to the genus Dyschiriognatha, such as the spiders belonging to the genus Latus and the spiders belonging to the genus Lastroconidae belonging to the genus Latus sp.
  • Spiders belonging to the family Tetragnathidae such as spiders belonging to the genus Prostenops (Euprosthenops) are produced.
  • Spider silk protein examples include dragline proteins such as MaSp (MaSp1 and MaSp2) and ADF (ADF3 and ADF4), and MiSp (MiSp1 and MiSp2).
  • fibroin produced by spiders include, for example, fibroin-3 (adf-3) [derived from Araneus diadematus] (GenBank Accession No. AAC47010 (amino acid sequence), U47855 (base sequence)), fibroin- 4 (adf-4) [from Araneus diadiamatus] (GenBank accession number AAC47011 (amino acid sequence), U47856 (base sequence)), dragline silk protein spidroin 1 [from Nephila la clavipes amino acid sequence (GenBank accession number 4) U37520 (base sequence)), major ⁇ angu11ate ⁇ spidroin ⁇ 1 [La rodectus @ heperus) (GenBank accession number ABR68856 (amino acid sequence), EF595246 (base sequence)), dragline @ silk ⁇ protein ⁇ spidroin ⁇ 2 [from Nephila ⁇ clavata] (GenBank accession number AAL32472,
  • CAJ00428 (amino acid sequence), AJ973155 (base sequence)), and major @ ampullate @ spidroin @ 2 [Euprosastroentrospo].
  • nk accession number CAM32249.1 (amino acid sequence), AM490169 (base sequence)), minor amplitude silk protein 1 [Nephila laclavipes] (GenBank accession number AAC14589. (GenBank Accession No. AAC14591.1 (amino acid sequence)), minor amplilate @ spidroin-like @ protein [Nephilengys @ cruentata] (GenBank Accession No. ABR37278.1 (amino acid sequence)) and the like.
  • fibroin in which sequence information is registered in NCBI GenBank.
  • sequence information is registered in NCBI GenBank.
  • spidroin, ampullate, fibroin, "silk and polypeptide", or “silk and protein” is described as a keyword in DEFINITION from among sequences including INV as DIVISION in the sequence information registered in NCBI @ GenBank. It can be confirmed by extracting a character string of a specific product from a sequence or CDS, and extracting a sequence in which a specific character string is described in TISSUE @ TYPE from SOURCE.
  • the structural protein may be a polypeptide derived from the above-mentioned natural type structural protein, that is, a recombinant polypeptide.
  • recombinant fibroin is produced in several heterologous protein production systems, and its production method uses transgenic goats, transgenic silkworms, or recombinant plant or mammalian cells (Science, 2002, 295, pp. 472-476).
  • Recombinant fibroin can be obtained, for example, by deleting one or more of the sequences encoding the (A) n motif from the cloned gene sequence of naturally occurring fibroin. Further, for example, it is obtained by designing an amino acid sequence corresponding to deletion of one or more (A) n motifs from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin, and chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence. You can also. In any case, in addition to the modification corresponding to the deletion of the (A) n motif from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin, one or more amino acid residues are further substituted, deleted, inserted and / or added. Amino acid sequence modification corresponding to the above may be performed.
  • Substitution, deletion, insertion and / or addition of amino acid residues can be performed by methods well known to those skilled in the art, such as partial specific mutagenesis. Specifically, Nucleic Acid Res. 10, 6487 (1982), and Methods in Enzymology, 100, 448 (1983).
  • a recombinant polypeptide of the large suture tube marker thread protein is a protein containing a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m (where (A) n The motif indicates an amino acid sequence composed of 4 to 20 amino acid residues, and (A) the number of alanine residues is 80% or more of the total number of amino acid residues in the n motif. And m represents an integer of 8 to 300.
  • the plural (A) n motifs may have the same amino acid sequence or may have different amino acid sequences. May be the same amino acid sequence or different amino acid sequences).
  • a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 can be mentioned.
  • a protein containing a domain sequence represented by the formula 2: [REP2] o (where, in the formula 2, o represents an integer of 5 to 300.
  • REP2 is Gly-X And X and Y each represent an amino acid residue other than Gly.
  • a plurality of REP2s may have the same amino acid sequence or different amino acid sequences.)
  • SEQ ID NO: 13 a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 can be mentioned.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 corresponds to a repeat portion and a motif of a partial sequence of human collagen type 4 obtained from the NCBI database (Genbank accession number of NCBI: CAA56335.1, GI: 3702452).
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 (tag sequence and hinge sequence) is added to the N-terminal of the amino acid sequence from residues 301 to 540.
  • REP3 As a recombinant polypeptide of resilin, for example, a protein containing a domain sequence represented by Formula 3: [REP3] p (where p is an integer of 4 to 300 in Formula 3, REP3 is Ser-J- 1 shows an amino acid sequence composed of J-Tyr-Gly-U-Pro, wherein J represents an arbitrary amino acid residue, and is particularly preferably an amino acid residue selected from the group consisting of Asp, Ser, and Thr. Represents an arbitrary amino acid residue, particularly preferably an amino acid residue selected from the group consisting of Pro, Ala, Thr and Ser .. A plurality of REP3s may have the same amino acid sequence or different amino acid sequences. Good)).
  • a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 can be mentioned.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 in the amino acid sequence of resilin (NCBI Genbank accession number NP61157, GI: 246654243), Thr at the 87th residue is replaced with Ser, and Asn at the 95th residue is replaced with Ser.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 (tag sequence) is added to the N-terminal of the amino acid sequence from the 19th residue to the 321st residue of the sequence substituted with Asp.
  • elastin recombinant polypeptides include proteins having an amino acid sequence such as NCBI Genbank accession numbers AAC98395 (human), I47076 (sheep), and NP786966 (bovine).
  • a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 can be mentioned.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 corresponds to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 (tag sequence) at the N-terminal of the amino acid sequence from residue 121 to residue 390 of the amino acid sequence of Genbank accession number AAC98395 of NCBI. And a hinge sequence).
  • ⁇ ⁇ ⁇ Keratin recombinant polypeptides include, for example, Capra hircus type I keratin and the like. Specific examples include a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 (the amino acid sequence of NCBI Genbank accession number ACY30466).
  • the recombinant polypeptide has 90% or more of (i) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 10, or (ii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 10 It may be a recombinant fibroin comprising an amino acid sequence having the following sequence identity.
  • (I) Recombinant fibroin containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 10 will be described.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is obtained from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 corresponding to naturally occurring fibroin (corresponding to naturally occurring fibroin), from the N-terminal side to every two C-terminal sides ( A) The n- motif is deleted, and one [(A) n- motif-REP] is inserted before the C-terminal sequence.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is obtained by substituting all GGX in the REP of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 with GQX.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 has two alanine residues inserted at the C-terminal side of each (A) n motif of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, and further has a partial glutamine (Q) residue. It has been replaced with a serine (S) residue, and some N-terminal amino acids have been deleted so that the molecular weight becomes almost the same as that of SEQ ID NO: 4.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is obtained by substituting all GGXs in the REP of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 with GQX.
  • a recombinant fibroin comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 10 will be described.
  • the recombinant fibroin contains an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 10.
  • Recombinant fibroin is also a protein containing a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m .
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the above-mentioned recombinant fibroin may contain a tag sequence at one or both of the N-terminus and the C-terminus. Thereby, isolation, immobilization, detection, visualization, and the like of the recombinant fibroin can be performed.
  • the tag sequence examples include an affinity tag utilizing specific affinity (binding property, affinity) with another molecule.
  • affinity tag is a histidine tag (His tag).
  • His tag is a short peptide in which about 4 to 10 histidine residues are arranged, and has a property of specifically binding to a metal ion such as nickel. Can be used for separation.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 amino acid sequence containing a His tag
  • tag sequences such as glutathione-S-transferase (GST), which specifically binds to glutathione, and maltose binding protein (MBP), which specifically binds to maltose, can be used.
  • GST glutathione-S-transferase
  • MBP maltose binding protein
  • an “epitope tag” utilizing an antigen-antibody reaction can be used.
  • a peptide (epitope) showing antigenicity as a tag sequence an antibody against the epitope can be bound.
  • the epitope tag include an HA (peptide sequence of hemagglutinin of influenza virus) tag, myc tag, and FLAG tag.
  • a tag sequence that can be cleaved by a specific protease can be used.
  • the recombinant fibroin from which the tag sequence has been separated can also be recovered.
  • the recombinant fibroin containing a tag sequence (iii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, or SEQ ID NO: 11, or (iv) SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, or SEQ ID NO: 11 And a recombinant fibroin comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by.
  • the recombinant polypeptide has 90% or more of the amino acid sequence represented by (iii) SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11, or (iv) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11 It may be a recombinant fibroin comprising an amino acid sequence having the following sequence identity.
  • the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 6, 7, 8, 9 and 11 correspond to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 (His tag) at the N-terminal of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4 and 10, respectively. Is included).
  • Recombinant fibroin is also a protein containing a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m .
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the structural protein preferably contains a recombinant polypeptide.
  • a recombinant polypeptide By including the recombinant polypeptide as a structural protein, it is possible to adjust the flexural modulus, flexural strength and hardness of the obtained molded article to desired values.
  • the method for producing a recombinant polypeptide is described in detail below.
  • the recombinant polypeptide of interest can be prepared, for example, by a host transformed with an expression vector having a gene sequence encoding a structural protein and one or more regulatory sequences operably linked to the gene sequence. It can be produced by expressing a gene.
  • the method for producing the gene encoding the desired recombinant polypeptide is not particularly limited.
  • the gene can be produced by a method of amplifying and cloning by the polymerase chain reaction (PCR) using a gene encoding a natural structural protein, or by chemical synthesis.
  • the method for chemically synthesizing genes is not particularly limited.
  • AKTA oligopilot ⁇ plus 10/100 GE Healthcare Japan Co., Ltd.
  • the gene can be chemically synthesized by a method of linking the oligonucleotides automatically synthesized by the method such as PCR.
  • a gene encoding a polypeptide having an amino acid sequence consisting of an initiation codon and a His10 tag added to the N-terminal of the above amino acid sequence may be synthesized.
  • the regulatory sequence is a sequence that controls the expression of the recombinant protein in the host (for example, a promoter, an enhancer, a ribosome binding sequence, a transcription termination sequence, and the like), and can be appropriately selected depending on the type of the host.
  • An inducible promoter that functions in a host cell and can induce the expression of a target protein may be used as the promoter.
  • An inducible promoter is a promoter that can control transcription by the presence of an inducer (expression inducer), the absence of a repressor molecule, or a physical factor such as an increase or decrease in temperature, osmotic pressure, or pH value.
  • the type of expression vector can be appropriately selected depending on the type of host, such as a plasmid vector, a virus vector, a cosmid vector, a fosmid vector, an artificial chromosome vector, and the like.
  • a plasmid vector a virus vector
  • a cosmid vector a fosmid vector
  • an artificial chromosome vector an artificial chromosome vector
  • those capable of autonomous replication in a host cell or integration into the host chromosome and containing a promoter at a position where the gene encoding the recombinant polypeptide of interest can be transcribed are preferable. Used for
  • any of prokaryotes and eukaryotes such as yeast, filamentous fungi, insect cells, animal cells, and plant cells can be suitably used.
  • prokaryotes include bacteria belonging to the genus Escherichia, Brevibacillus, Serratia, Bacillus, Microbacterium, Brevibacterium, Corynebacterium, Pseudomonas, and the like.
  • Examples of a vector into which a gene encoding a recombinant polypeptide of interest is introduced include, for example, pBTrp2 (manufactured by Boehringer Mannheim), pGEX (manufactured by Pharmacia), pUC18, pBluescriptII, pSupex, pET22b, pCold, pUB110, pNCO2 See JP-A-2002-238569) and the like.
  • eukaryotic hosts include yeast and filamentous fungi (such as mold).
  • yeast examples include yeast belonging to the genera Saccharomyces, Pichia, Schizosaccharomyces, and the like.
  • filamentous fungi examples include filamentous fungi belonging to the genus Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, and the like.
  • vectors examples include YEp13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051) and the like.
  • any method for introducing the expression vector into the host cell any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into the host cell.
  • a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], electroporation, spheroplast, protoplast, lithium acetate, and competent methods.
  • the target recombinant polypeptide is obtained, for example, by culturing a host transformed with the expression vector according to the present embodiment in a culture medium, producing and accumulating the protein in the culture medium, and collecting the protein from the culture medium.
  • culturing a host transformed with the expression vector according to the present embodiment in a culture medium producing and accumulating the protein in the culture medium, and collecting the protein from the culture medium.
  • the method of culturing the host according to the present embodiment in a culture medium can be performed according to a method generally used for culturing a host.
  • the host according to the present embodiment is a prokaryote such as Escherichia coli or a eukaryote such as yeast
  • a culture medium for the host according to the present embodiment a carbon source, a nitrogen source, and inorganic salts that the host can assimilate.
  • a natural medium and a synthetic medium may be used as long as the medium can efficiently culture the host.
  • the carbon source may be any as long as the transformed microorganism can assimilate, for example, glucose, fructose, sucrose, and molasses containing these, carbohydrates such as starch and starch hydrolyzate, acetic acid and propionic acid Organic acids and alcohols such as ethanol and propanol can be used.
  • assimilate for example, glucose, fructose, sucrose, and molasses containing these, carbohydrates such as starch and starch hydrolyzate, acetic acid and propionic acid Organic acids and alcohols such as ethanol and propanol can be used.
  • the nitrogen source for example, ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium salts of inorganic or organic acids such as ammonium acetate and ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, and peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, Casein hydrolyzate, soybean meal, soybean meal hydrolyzate, various fermented cells and digests thereof can be used.
  • ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium salts of inorganic or organic acids such as ammonium acetate and ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, and peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, Casein hydrolyzate, soybean meal, soybean meal hydrolyzate, various fermented cells and digests thereof can be used.
  • potassium (I) phosphate potassium (II) phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, and calcium carbonate
  • potassium (I) phosphate potassium (II) phosphate
  • magnesium phosphate magnesium phosphate
  • magnesium sulfate sodium chloride
  • ferrous sulfate manganese sulfate
  • copper sulfate copper sulfate
  • calcium carbonate calcium carbonate
  • ⁇ Cultivation of prokaryotes such as Escherichia coli or eukaryotes such as yeast can be performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature is, for example, 15 to 40 ° C.
  • the culturing time is usually 16 hours to 7 days.
  • the pH of the culture medium during the culture is preferably maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH of the culture medium can be adjusted using an inorganic acid, an organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like.
  • antibiotics such as ampicillin and tetracycline may be added to the culture medium during the culture.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside or the like is used.
  • An acid or the like may be added to the medium.
  • the recombinant polypeptide according to the present embodiment can be isolated and purified by a method usually used for isolating and purifying a protein. For example, when the recombinant polypeptide is expressed in a lysed state in cells, after completion of the culture, the host cells are collected by centrifugation, suspended in an aqueous buffer, and then sonicated by a sonicator, French press. The host cells are crushed with a Manton Gaulin homogenizer and Dynomill to obtain a cell-free extract.
  • a method usually used for isolating and purifying proteins that is, a solvent extraction method, a salting out method using ammonium sulfate or the like, a desalting method, an organic solvent Precipitation method, anion-exchange chromatography using a resin such as diethylaminoethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION @ HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Kasei), and cation using a resin such as S-Sepharose @ FF (manufactured by Pharmacia).
  • a resin such as diethylaminoethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION @ HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Kasei)
  • cation using a resin such as S-Sepharose @ FF (manufactured by Pharmacia).
  • Electrophoretic methods such as ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography using resins such as butyl sepharose and phenyl sepharose, gel filtration using molecular sieves, affinity chromatography, chromatofocusing, and isoelectric focusing Etc. alone or in combination And use, it is possible to obtain a purified product.
  • the host cells When the recombinant polypeptide is expressed as an insoluble form in the cells, the host cells are similarly recovered, crushed, and centrifuged to obtain an insoluble form of the recombinant polypeptide as a precipitate fraction. Collect.
  • the recovered insoluble form of the recombinant polypeptide can be solubilized with a protein denaturant. After this operation, a purified preparation of the recombinant polypeptide can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the recombinant polypeptide When the recombinant polypeptide is secreted extracellularly, the recombinant polypeptide can be recovered from the culture supernatant. That is, a culture supernatant is obtained by treating the culture by a technique such as centrifugation, and a purified sample can be obtained from the culture supernatant by using the same isolation and purification method as described above.
  • the shape of the polypeptide to be blended in the composition is not particularly limited, and may have, for example, a powder (lyophilized powder or the like) or fibrous (spinning or the like) shape.
  • the molded article according to the present embodiment may be a fused article of the composition containing the polypeptide having the shape as described above.
  • the polypeptide incorporated into the composition may be in the form of a powder (polypeptide powder).
  • the average particle size d 1 of the polypeptide powders may be for example 0.1 ⁇ m or more, preferably 1 ⁇ m or more.
  • the average particle size d 1 of the polypeptide powders may be for example 200 ⁇ m or less, preferably 100 ⁇ m or less.
  • the average particle size d 1 of the polypeptide powder shows a value measured by particle size distribution measurement device.
  • the content of the polypeptide in the protein molded product may be 50 to 99% by mass, 60 to 95% by mass, or 70 to 90% by mass based on the total mass of the protein molded product.
  • the flame retardant according to the present embodiment is selected from a polyphosphate salt and a polynucleotide salt.
  • a polynucleotide is a polymer having a nucleotide unit composed of a nucleobase, a sugar and a phosphate as a monomer unit, and has a main chain in which a sugar and a phosphate are alternately bonded.
  • the nucleobase constituting the nucleotide is a group having a heteroaromatic ring structure such as a purine skeleton or a pyrimidine skeleton, and specific examples include adenine, guanine, cytosine, thymine, and uracil.
  • the polynucleotide has the same or different nucleobases for each nucleotide unit, and each nucleobase may be any of adenine, guanine, cytosine, thymine, and uracil.
  • the sugar constituting the nucleotide is usually pentose (pentose) or hexose (hexose), and specific examples include ribose, deoxyribose, glucose, galactose, acetylglucosamine, xylose, mannose, and fucose. .
  • pentose pentose
  • hexose hexose
  • specific examples include ribose, deoxyribose, glucose, galactose, acetylglucosamine, xylose, mannose, and fucose.
  • RNA ribonucleic acid
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • the flame retardant is a salt composed of polyphosphate or a polynucleotide and a cation.
  • the cation may be an organic cation such as an onium ion or a metal ion.
  • Examples of the onium ion include an ammonium ion.
  • Examples of the metal ion include an alkali metal ion such as a lithium ion, a sodium ion, and a potassium ion, and an alkaline earth metal ion such as a magnesium ion and a calcium ion.
  • Preferred cations are ammonium ions or alkali metal ions.
  • Preferred flame retardants are ammonium polyphosphate or sodium deoxyribonucleic acid.
  • the content of the flame retardant in the protein molded product may be 1 to 50% by mass, 5 to 40% by mass, or 10 to 30% by mass based on the total mass of the protein molded product.
  • the method for producing a molded article according to the embodiment includes a mixing step of mixing a polypeptide and a flame retardant to obtain a composition, and a molding step of introducing the composition into a mold and molding. .
  • the mixing step may be a step of adding a flame retardant to the composition containing the polypeptide, or may be a step of adding the polypeptide to the composition to which the flame retardant is added. It may be a step of adding and mixing.
  • the composition may further contain components other than the polypeptide and the flame retardant (for example, a plasticizer, a coloring agent, a filler, a synthetic resin, and the like).
  • the content of these other components is preferably 20 parts by mass or less based on 100 parts by mass of the polypeptide.
  • the amount of the flame retardant mixed in the mixing step may be, for example, 1.01 part by mass or more, preferably 5.26 parts by mass or more, more preferably 11.11 parts by mass, based on 100 parts by mass of the polypeptide. That is all.
  • the amount of the flame retardant blended in the composition may be, for example, 100 parts by mass or less, preferably 66.67 parts by mass or less, more preferably 42.86 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the polypeptide. It is as follows.
  • the polypeptide to be mixed in the mixing step may have a powdery (eg, freeze-dried powder) or fibrous (eg, spun) shape, and the molded article may have a composition containing the polypeptide having such a shape. It may be a fusion product of the object.
  • the mixing step may be a step of mixing the polypeptide powder and the flame retardant.
  • the composition obtained in the mixing step may be a mixed powder containing the polypeptide powder and the flame retardant.
  • the molding step is a step of introducing the composition obtained in the mixing step into a mold and molding.
  • the composition may be heated and / or pressurized, preferably heated and pressurized during the molding process.
  • FIG. 9 is a schematic sectional view showing a pressure molding machine that can be used for producing a molded article.
  • the press forming machine 10 shown in FIG. 9 includes a mold 2 having a through hole formed therein and capable of heating, and an upper pin 4 and a lower pin 6 which can move up and down in the through hole of the mold 2. It is.
  • the above-described composition is introduced into a space formed by inserting the upper pin 4 or the lower pin 6 into the mold 2, and the composition is heated by the upper pin 4 and the lower pin 6 while heating the mold 2. , A molded article can be obtained.
  • FIG. 10 shows a process chart for obtaining a molded article, in which (a) is before introduction of the composition, (b) is immediately after introduction of the composition, and (c) is heating and pressing of the composition.
  • It is a schematic cross section which shows the press molding machine in a state.
  • the composition is introduced into the through hole of the mold 2 with only the lower pin 6 inserted into the through hole.
  • the upper pin 4 is inserted into the through-hole of the mold 2 and lowered to start heating of the mold 2, and the composition 8a before heating and pressurizing is passed through the through-hole. Heat and pressurize inside.
  • the upper pin 4 is lowered until a predetermined pressure is applied, and heating and pressing are continued until the composition reaches a predetermined temperature in the state shown in FIG. 8b is obtained. Thereafter, the temperature of the mold 2 is lowered using a cooler (for example, a spot cooler), and when the composition 8b has reached a predetermined temperature, the upper pin 4 or the lower pin 6 is removed from the mold 2, and the contents are removed. Take out. Pressing may be performed by lowering the upper pin 4 with the lower pin 6 fixed, but both lowering of the upper pin 4 and raising of the lower pin 6 may be performed.
  • a cooler for example, a spot cooler
  • the heating is preferably performed at a mold temperature of 80 to 250 ° C, more preferably 100 to 200 ° C.
  • the pressurization is preferably performed at a pressure of 20 MPa or more.
  • the obtained seed culture solution was added to a jar fermenter to which 500 mL of the production medium shown in Table 2 was added so that the OD 600 became 0.05.
  • the temperature of the culture was maintained at 37 ° C., the pH was controlled to be constant at 6.9, and the culture was performed so that the dissolved oxygen concentration in the culture was maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
  • Adekanol LG-295S (manufactured by ADEKA Corporation) was used as an antifoaming agent.
  • a feed solution (455 g / 1 L of glucose, Yeast Extract 120 g / 1 L) was added at a rate of 1 mL / min.
  • the temperature of the culture was maintained at 37 ° C., and the culture was performed at a constant pH of 6.9. Further, the culture was performed for 20 hours while maintaining the dissolved oxygen concentration in the culture solution at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
  • a 1M aqueous solution of isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) was added to the culture solution to a final concentration of 1 mM to induce the expression of the target protein.
  • the precipitate after washing is suspended in an 8 M guanidine buffer (8 M guanidine hydrochloride, 10 mM sodium dihydrogen phosphate, 20 mM NaCl, 1 mM Tris-HCl, pH 7.0) so as to have a concentration of 100 mg / mL. For 30 minutes with a stirrer to dissolve. After dissolution, dialysis was performed with water using a dialysis tube (cellulose tube 36/32 manufactured by Sanko Junyaku Co., Ltd.). The white aggregated protein obtained after the dialysis was collected by centrifugation, and water was removed with a freeze dryer to collect a freeze-dried powder.
  • 8 M guanidine buffer 8 M guanidine hydrochloride, 10 mM sodium dihydrogen phosphate, 20 mM NaCl, 1 mM Tris-HCl, pH 7.0
  • Exolit AP 422 (manufactured by Clariant) or sodium deoxyribonucleic acid (manufactured by Nissei Bio Inc.) was used as ammonium polyphosphate.
  • Example 1 Ammonium polyphosphate (25 wt%) was added to the purified powder of PRT587, and the mixture was mixed at 1000 rpm for 20 minutes using an attritor mill, and then classified with a sieve having openings of 100 ⁇ m to obtain a mixed powder. The obtained mixed powder was put into a mold, and heated and compressed at 150 ° C. and 30 MPa for 5 minutes to obtain a protein molded product of Example 1.
  • Example 2 A protein-protein molded product of Example 2 was obtained in the same manner as in Example 1 except that the content of ammonium polyphosphate was changed to 20% by weight.
  • Example 3 A protein-protein molded product of Example 3 was obtained in the same manner as in Example 1, except that the content of ammonium polyphosphate was changed to 15% by weight.
  • Example 4 A protein-protein molded product of Example 4 was obtained in the same manner as in Example 1 except that sodium deoxyribonucleic acid (20 wt%) was used instead of ammonium polyphosphate (25 wt%).
  • Example 5 A protein molded product of Example 5 was obtained in the same manner as in Example 1 except that ammonium polyphosphate (10 wt%) and sodium deoxyribonucleic acid (10 wt%) were used instead of ammonium polyphosphate (25 wt%).
  • Comparative Example 1 The purified powder of PRT587 was stirred at 1000 rpm for 20 minutes using an attritor mill, and then classified with a sieve having openings of 100 ⁇ m to obtain a powder. The obtained powder was put into a mold and heated and compressed at 150 ° C. and 30 MPa for 5 minutes to obtain a protein molded product of Comparative Example 1.
  • Table 3 shows the compositions of Examples 1 to 5 and Comparative Example 1.
  • the numerical values in Table 3 mean mass%.
  • Thermogravimetric analysis was performed using a thermal analyzer (DTG-60H, manufactured by Shimadzu Corporation).
  • Example 5 the weight change was smaller than that of Comparative Example 1 between 400 and 1200 ° C.
  • Table 4 shows the resin residues of Examples 2, 4, 5 and Comparative Example 1 when the temperature reached 600 ° C, 700 ° C, 800 ° C or 1000 ° C.
  • the numerical values in Table 4 mean mass%.
  • Example 2 The protein molded products of Example 2 and Comparative Example 1 were prepared so as to have a size of 6 cm ⁇ 18 cm ⁇ 0.4 cm. The flame was brought into direct contact with one main surface (a surface of 6 cm ⁇ 18 cm) of each protein molded product, and the appearance was visually observed.
  • FIG. 3 to 7 are photographs showing changes over time in the appearance of the protein molded article from the start of flame contact.
  • FIG. 8 is a photograph comparing the changes in the appearance of the protein molded article before and after the test.
  • Example 2 had a wider range of scorching than Comparative Example 1, but in Comparative Example 1, needle-like flames were observed, indicating that combustion was progressing more. (See FIG. 3).
  • One minute after the start of the flame contact the acicular flame of Comparative Example 1 became larger, and the scorched area was almost the same as that of Example 2 (see FIG. 4).
  • Comparative Example 1 When the indirect flame was continued for further 1 minute (2 minutes after the start of flame contact), the decomposition of Comparative Example 1 proceeded remarkably and the original shape could not be maintained, whereas the appearance of Example 2 was shown in FIG. Did not change much compared to (see FIG. 5). Thereafter, in Comparative Example 1, the test was terminated at 2 minutes and 15 seconds after the start of flame contact because decomposition or deformation proceeded also on the side surface (18 cm ⁇ 2 cm surface).
  • FIG. 6 shows the appearance of the protein molded body at 2 minutes after the start of flame contact.
  • Example 2 in order to further investigate the influence on the opposite side of the flame-contacted surface, the flame was continuously applied to the entire surface of the flame-contacted surface until it was scorched (3 minutes and 20 seconds after the start of the flame-contact). Finished.
  • FIG. 7 shows the appearance of the protein molded body of Example 2 at a time point of 3 minutes and 15 seconds after the start of flame contact.
  • FIG. 8 in the protein molded product of Example 2, only the surface in contact with the flame was scorched, and the appearance of the opposite surface and side surfaces did not change significantly from the appearance before the test. That is, it was confirmed that the protein molded product of Example 2 was difficult to spread.

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Abstract

本発明は、ポリペプチドと、ポリリン酸の塩及びポリヌクレオチドの塩から選択される難燃剤と、を含む、タンパク質成形体を提供する。

Description

難燃性タンパク質成形体及びその製造方法
　本発明は、難燃性タンパク質成形体及びその製造方法に関する。
　近年、環境保全意識の高まりから、石油由来プラスチックの代替としてバイオプラスチックが注目されている。例えば、特許文献１には、天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドをモールド成形したモールド成形体が、高い曲げ弾性率を有することが記載されている。
国際公開第２０１７／０４７５０４号 特開２０１７－１０５９２８号公報
　アクリル樹脂、ポリスチロール樹脂等の合成樹脂は、易燃性を示すことが知られており、難燃性を付与する試みが多く報告されている（例えば、特許文献２）。
　一方、ウール等の天然のタンパク質繊維は、難燃性を示すことが知られており、家屋の外壁内部に使用される難燃材料、航空機の内装または消防服にも利用されている。そのため、タンパク質繊維に更なる難燃性を付与する試みは、あまり報告されていない。
　そこで、本発明の目的は、より優れた難燃性を示すタンパク質成形体を提供することである。
　本発明は、以下の［１］～［１８］を提供する。
［１］　ポリペプチドと、ポリリン酸の塩及びポリヌクレオチドの塩から選択される難燃剤と、を含む、タンパク質成形体。
［２］　難燃剤がポリリン酸の塩を含む、［１］に記載のタンパク質成形体。
［３］　ポリリン酸の塩がポリリン酸アンモニウムを含む、［２］に記載のタンパク質成形体。
［４］　難燃剤がポリデオキシヌクレオチドの塩を含む、［１］～［３］のいずれかに記載のタンパク質成形体。
［５］　ポリデオキシヌクレオチドの塩がポリデオキシヌクレオチドのナトリウム塩を含む、［４］に記載のタンパク質成形体。
［６］　ポリペプチドが構造タンパク質である、［１］～［５］のいずれかに記載のタンパク質成形体。
［７］　ポリペプチドと、ポリリン酸の塩及びポリヌクレオチドの塩から選択される難燃剤と、を混合して組成物を得る工程と、当該組成物を加熱及び加圧して成形する工程と、を含む、タンパク質成形体の製造方法。
［８］　難燃剤がポリリン酸の塩を含む、［７］に記載のタンパク質成形体の製造方法。
［９］　ポリリン酸の塩がポリリン酸アンモニウムを含む、［８］に記載のタンパク質成形体の製造方法。
［１０］　難燃剤がポリデオキシヌクレオチドの塩を含む、［７］～［９］のいずれかに記載のタンパク質成形体の製造方法。
［１１］　ポリデオキシヌクレオチドの塩がポリデオキシヌクレオチドのナトリウム塩を含む、［１０］に記載のタンパク質成形体の製造方法。
［１２］　ポリペプチドが構造タンパク質である、［７］～［１１］のいずれかに記載のタンパク質成形体の製造方法。
［１３］　タンパク質成形体の難燃性を向上する方法であって、ポリペプチドと、ポリリン酸の塩及びポリヌクレオチドの塩から選択される難燃剤と、を混合して組成物を得る工程と、当該組成物を加熱及び加圧して成形する工程と、を含む、方法。
［１４］　難燃剤がポリリン酸の塩を含む、［１３］に記載の方法。
［１５］　ポリリン酸の塩がポリリン酸アンモニウムを含む、［１４］に記載の方法。
［１６］　難燃剤がポリデオキシヌクレオチドの塩を含む、［１３］～［１５］のいずれかに記載の方法。
［１７］　ポリデオキシヌクレオチドの塩がポリデオキシヌクレオチドのナトリウム塩を含む、［１６］に記載の方法。
［１８］　ポリペプチドが構造タンパク質である、［１３］～［１７］のいずれかに記載の方法。
　本発明によれば、より優れた難燃性を示すタンパク質成形体を提供することができる。
実施例１～３及び比較例１のタンパク質成形体の熱重量分析の結果を示すグラフである。 実施例４、５及び比較例１のタンパク質成形体の熱重量分析の結果を示すグラフである。 試験前の実施例２及び比較例１のタンパク質成形体の外観を示す写真である。 接炎開始から１０秒後の実施例２及び比較例１のタンパク質成形体の外観を示す写真である。 接炎開始から１分後の実施例２及び比較例１のタンパク質成形体の外観を示す写真である。 接炎開始から２分後の実施例２及び比較例１のタンパク質成形体の外観を示す写真である。 接炎開始から３分１５秒後の実施例２及び比較例１のタンパク質成形体の外観を示す写真である。 試験前後における実施例２及び比較例１のタンパク質成形体の外観の変化を比較した写真である。 加圧成形機を示す模式断面図である。 （ａ）は組成物導入前の加圧成形機を示す模式断面図であり、（ｂ）は組成物導入直後の加圧成形機を示す模式断面図であり、（ｃ）は組成物を加熱及び加圧している状態の加圧成形機を示す模式断面図である。
　以下、図面を参照しつつ、本発明の好適な実施形態について説明する。なお、図面は理解を容易にするため一部を誇張して描いており、寸法比率等は図面に記載のものに限定されるものではない。
　本発明の一実施形態に係るタンパク成形体は、ポリペプチドと、ポリリン酸の塩、ポリリボ核酸の塩およびポリデオキシリボ核酸の塩から選択される難燃剤と、を含有する組成物を鋳型（モールド）に導入し、成形加工すること等により得られるものである。
（ポリペプチド）
　ポリペプチドは、構造タンパク質であることが好ましい。構造タンパク質とは、生体構造を構築する役割を有するタンパク質であり、酵素、ホルモン、抗体等の機能タンパク質とは異なる。構造タンパク質としては、天然に存在するフィブロイン、コラーゲン、レシリン、エラスチン及びケラチン等の天然型構造タンパク質を挙げることができる。天然に存在するフィブロインとして、昆虫及びクモ類が産生するフィブロインが知られている。本実施形態において、構造タンパク質は、天然クモ糸タンパク質及び天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種を含むことが好ましい。
　昆虫が産生するフィブロインとしては、例えば、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ）、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍａｎｄａｒｉｎａ）、天蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ｙａｍａｍａｉ）、柞蚕（Ａｎｔｅｒａｅａ　ｐｅｒｎｙｉ）、楓蚕（Ｅｒｉｏｇｙｎａ　ｐｙｒｅｔｏｒｕｍ）、蓖蚕（Ｐｉｌｏｓａｍｉａ　Ｃｙｎｔｈｉａ　ｒｉｃｉｎｉ）、樗蚕（Ｓａｍｉａ　ｃｙｎｔｈｉａ）、栗虫（Ｃａｌｉｇｕｒａ　ｊａｐｏｎｉｃａ）、チュッサー蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ｍｙｌｉｔｔａ）、ムガ蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ａｓｓａｍａ）等のカイコが産生する絹タンパク質、スズメバチ（Ｖｅｓｐａ　ｓｉｍｉｌｌｉｍａ　ｘａｎｔｈｏｐｔｅｒａ）の幼虫が吐出するホーネットシルクタンパク質が挙げられる。
　昆虫が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、カイコ・フィブロインＬ鎖（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ７６４３０（塩基配列）、ＡＡＡ２７８４０．１（アミノ酸配列））が挙げられる。
　クモには最大７種類の絹糸腺が存在し、それぞれ性質の異なるフィブロイン（スパイダーシルクタンパク質）を産生する。スパイダーシルクタンパク質は、その源泉の器官にしたがって、高い靭性を有する大瓶状スパイダータンパク質（ｍａｊｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭａＳｐ）、高度な伸長力を有する小瓶状スパイダータンパク質（ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭｉＳｐ）、並びに鞭状（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ（Ｆｌａｇ））、管状（ｔｕｂｕｌｉｆｏｒｍ）、集合（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）、ブドウ状（ａｃｉｎｉｆｏｒｍ）及びナシ状（ｐｙｒｉｆｏｒｍ）の各スパイダーシルクタンパク質と命名されている。
　クモ類が産生するフィブロインとしては、例えば、オニグモ、ニワオニグモ、アカオニグモ、アオオニグモ及びマメオニグモ等のオニグモ属（Ａｒａｎｅｕｓ属）に属するクモ、ヤマシロオニグモ、イエオニグモ、ドヨウオニグモ及びサツマノミダマシ等のヒメオニグモ属（Ｎｅｏｓｃｏｎａ属）に属するクモ、コオニグモモドキ等のコオニグモモドキ属（Ｐｒｏｎｕｓ属）に属するクモ、トリノフンダマシ及びオオトリノフンダマシ等のトリノフンダマシ属（Ｃｙｒｔａｒａｃｈｎｅ属）に属するクモ、トゲグモ及びチブサトゲグモ等のトゲグモ属（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ属）に属するクモ、マメイタイセキグモ及びムツトゲイセキグモ等のイセキグモ属（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ属）に属するクモ、コガネグモ、コガタコガネグモ及びナガコガネグモ等のコガネグモ属（Ａｒｇｉｏｐｅ属）に属するクモ、キジロオヒキグモ等のオヒキグモ属（Ａｒａｃｈｎｕｒａ属）に属するクモ、ハツリグモ等のハツリグモ属（Ａｃｕｓｉｌａｓ属）に属するクモ、スズミグモ、キヌアミグモ及びハラビロスズミグモ等のスズミグモ属（Ｃｙｔｏｐｈｏｒａ属）に属するクモ、ゲホウグモ等のゲホウグモ属（Ｐｏｌｔｙｓ属）に属するクモ、ゴミグモ、ヨツデゴミグモ、マルゴミグモ及びカラスゴミグモ等のゴミグモ属（Ｃｙｃｌｏｓａ属）に属するクモ、及びヤマトカナエグモ等のカナエグモ属（Ｃｈｏｒｉｚｏｐｅｓ属）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質、並びにアシナガグモ、ヤサガタアシナガグモ、ハラビロアシダカグモ及びウロコアシナガグモ等のアシナガグモ属（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、オオシロカネグモ、チュウガタシロカネグモ及びコシロカネグモ等のシロカネグモ属（Ｌｅｕｃａｕｇｅ属）に属するクモ、ジョロウグモ及びオオジョロウグモ等のジョロウグモ属（Ｎｅｐｈｉｌａ属）に属するクモ、キンヨウグモ等のアズミグモ属（Ｍｅｎｏｓｉｒａ属）に属するクモ、ヒメアシナガグモ等のヒメアシナガグモ属（Ｄｙｓｃｈｉｒｉｏｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、クロゴケグモ、セアカゴケグモ、ハイイロゴケグモ及びジュウサンボシゴケグモ等のゴケグモ属（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ属）に属するクモ、及びユープロステノプス属（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ属）に属するクモ等のアシナガグモ科（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈｉｄａｅ科）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質が挙げられる。スパイダーシルクタンパク質としては、例えば、ＭａＳｐ（ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２）、ＡＤＦ（ＡＤＦ３及びＡＤＦ４）等の牽引糸タンパク質、ＭｉＳｐ（ＭｉＳｐ１及びＭｉＳｐ２）等が挙げられる。
　クモ類が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、ｆｉｂｒｏｉｎ－３（ａｄｆ－３）［Ａｒａｎｅｕｓ　ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１０（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５５（塩基配列））、ｆｉｂｒｏｉｎ－４（ａｄｆ－４）［Ａｒａｎｅｕｓ　ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１１（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ０４５０４（アミノ酸配列）、Ｕ３７５２０（塩基配列））、ｍａｊｏｒ　ａｎｇｕ１１ａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ　ｈｅｓｐｅｒｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ６８８５６（アミノ酸配列）、ＥＦ５９５２４６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　２［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖａｔａ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ３２４７２（アミノ酸配列）、ＡＦ４４１２４５（塩基配列））、ｍａｊｏｒ　ａｎｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ　ａｕｓｔｒａｌｉｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＪ００４２８（アミノ酸配列）、ＡＪ９７３１５５（塩基配列））、及びｍａｊｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　２［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ　ａｕｓｔｒａｌｉｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＭ３２２４９．１（アミノ酸配列）、ＡＭ４９０１６９（塩基配列））、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５８９．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５９１．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ－ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｎｅｐｈｉｌｅｎｇｙｓ　ｃｒｕｅｎｔａｔａ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ３７２７８．１（アミノ酸配列）等が挙げられる。
　天然由来のフィブロインのより具体的な例としては、更に、ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋに配列情報が登録されているフィブロインを挙げることができる。例えば、ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報のうちＤＩＶＩＳＩＯＮとしてＩＮＶを含む配列の中から、ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮにｓｐｉｄｒｏｉｎ、ａｍｐｕｌｌａｔｅ、ｆｉｂｒｏｉｎ、「ｓｉｌｋ及びｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」、又は「ｓｉｌｋ及びｐｒｏｔｅｉｎ」がキーワードとして記載されている配列、ＣＤＳから特定のｐｒｏｄｕｃｔの文字列、ＳＯＵＲＣＥからＴＩＳＳＵＥ　ＴＹＰＥに特定の文字列の記載された配列を抽出することにより確認することができる。
　構造タンパク質は、上記天然型構造タンパク質に由来するポリペプチド、すなわち組換えポリペプチドであってもよい。例えば、組換えフィブロインは、いくつかの異種タンパク質生産系で産生されており、その製造方法として、トランスジェニック・ヤギ、トランスジェニック・カイコ、又は組換え植物若しくは哺乳類細胞が利用されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２年，２９５巻，ｐｐ．４７２－４７６参照）。
　組換えフィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列から（Ａ）ｎモチーフをコードする配列の１又は複数を欠失させることにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。アミノ酸残基の置換、欠失、挿入及び／又は付加は、部分特異的突然変異誘発法等の当業者に周知の方法により行うことができる。具体的には、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１０，６４８７（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４４８（１９８３）等の文献に記載されている方法に準じて行うことができる。
　大吐糸管しおり糸タンパク質の組換えポリペプチドは、例えば、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式１中、（Ａ）ｎモチーフは４～２０アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が８０％以上である。ＲＥＰは１０～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは８～３００の整数を示す。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）として表すことができる。具体的には配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をあげることができる。
　コラーゲンの組換えポリペプチドとして、例えば、式２：［ＲＥＰ２］ｏで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式２中、ｏは５～３００の整数を示す。ＲＥＰ２は、Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘ及びＹはＧｌｙ以外の任意のアミノ酸残基を示す。複数存在するＲＥＰ２は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。具体的には、配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号１３で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したヒトのコラーゲンタイプ４の部分的な配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号：ＣＡＡ５６３３５．１、ＧＩ：３７０２４５２）のリピート部分及びモチーフに該当する３０１残基目から５４０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号５で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
　レシリンの組換えポリペプチドとして、例えば、式３：［ＲＥＰ３］ｐで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式３中、ｐは４～３００の整数を示す。ＲＥＰ３はＳｅｒ－Ｊ－Ｊ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｕ－Ｐｒｏから構成されるアミノ酸配列を示す。Ｊは任意のアミノ酸残基を示し、特にＡｓｐ、Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。Ｕは任意のアミノ酸残基を示し、特にＰｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ及びＳｅｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。複数存在するＲＥＰ３は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。具体的には、配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号１４で示されるアミノ酸配列は、レシリン（ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＰ６１１１５７、ＧＩ：２４６５４２４３）のアミノ酸配列において、８７残基目のＴｈｒをＳｅｒに置換し、かつ９５残基目のＡｓｎをＡｓｐに置換した配列の１９残基目から３２１残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１７で示されるアミノ酸配列（タグ配列）が付加されたものである。
　エラスチンの組換えポリペプチドとして、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５（ヒト）、Ｉ４７０７６（ヒツジ）、ＮＰ７８６９６６（ウシ）等のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。具体的には、配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号１５で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５のアミノ酸配列の１２１残基目から３９０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号５で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
　ケラチンの組換えポリペプチドとして、例えば、カプラ・ヒルクス（Ｃａｐｒａ　ｈｉｒｃｕｓ）のタイプＩケラチン等を挙げることができる。具体的には、配列番号１６で示されるアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＡＣＹ３０４６６のアミノ酸配列）を含むタンパク質を挙げることができる。
　組換えポリペプチドは、（ｉ）配列番号２、配列番号４若しくは配列番号１０で示されるアミノ酸配列、又は（ｉｉ）配列番号２、配列番号４若しくは配列番号１０で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換えフィブロインであってもよい。
　（ｉ）配列番号２、配列番号４若しくは配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含む、組換えフィブロインについて説明する。配列番号２で示されるアミノ酸配列は、天然由来のフィブロインに相当する配列番号１で示されるアミノ酸配列（天然由来のフィブロインに相当）から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号４で示されるアミノ酸配列は、配列番号２で示されるアミノ酸配列のＲＥＰ中の全てのＧＧＸをＧＱＸに置換したものである。配列番号１０で示されるアミノ酸配列は、配列番号４で示されるアミノ酸配列の各（Ａ）ｎモチーフのＣ末端側に２つのアラニン残基を挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、配列番号４の分子量とほぼ同じとなるようにＮ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。なお、配列番号３で示されるアミノ酸配列は、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＲＥＰ中の全てのＧＧＸをＧＱＸに置換したものである。
　（ｉｉ）配列番号２、配列番号４若しくは配列番号１０で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換えフィブロインについて説明する。（ｉｉ）組換えフィブロインは、配列番号２、配列番号４又は配列番号１０で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（ｉｉ）組換えフィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　上述の組換えフィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、組換えフィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
　タグ配列として、例えば、他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用したアフィニティタグを挙げることができる。アフィニティタグの具体例として、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を挙げることができる。Ｈｉｓタグは、ヒスチジン残基が４から１０個程度並んだ短いペプチドで、ニッケル等の金属イオンと特異的に結合する性質があるため、金属キレートクロマトグラフィー（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　ｍｅｔａｌ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による組換えフィブロインの単離に利用することができる。タグ配列の具体例として、例えば、配列番号５で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグを含むアミノ酸配列）が挙げられる。
　また、グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列を利用することもできる。
　さらに、抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用することもできる。抗原性を示すペプチド（エピトープ）をタグ配列として付加することにより、当該エピトープに対する抗体を結合させることができる。エピトープタグとして、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列）タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等を挙げることができる。エピトープタグを利用することにより、高い特異性で容易に組換えフィブロインを精製することができる。
　さらにタグ配列を特定のプロテアーゼで切り離せるようにしたものも使用することができる。当該タグ配列を介して吸着したタンパク質をプロテアーゼ処理することにより、タグ配列を切り離した組換えフィブロインを回収することもできる。
　タグ配列を含む組換えフィブロインのより具体的な例として、（ｉｉｉ）配列番号７、配列番号９若しくは配列番号１１で示されるアミノ酸配列、又は（ｉｖ）配列番号７、配列番号９若しくは配列番号１１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換えフィブロインを挙げることができる。
　組換えポリペプチドは、（ｉｉｉ）配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で示されるアミノ酸配列、又は（ｉｖ）配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換えフィブロインであってもよい。
　配列番号６、７、８、９及び１１で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、２、３、４及び１０で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号５で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグを含む）を付加したものである。（ｉｖ）組換えフィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　構造タンパク質は、組換えポリペプチドを含むことが好ましい。構造タンパク質として組換えポリペプチドを含むことにより、得られるモールド成形体の曲げ弾性率、曲げ強度及び硬度を所望の数値に調整することが可能である。
［構造タンパク質を発現する組換え細胞］
　組換えポリペプチドの製造方法について、以下に詳述する。目的とする組換えポリペプチドは、例えば、構造タンパク質をコードする遺伝子配列と、当該遺伝子配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する発現ベクターで形質転換された宿主により、当該遺伝子を発現させることにより生産することができる。
　目的とする組換えポリペプチドをコードする遺伝子の製造方法は特に制限されない。例えば、天然の構造タンパク質をコードする遺伝子を利用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅しクローニングする方法、又は、化学的な合成によって、遺伝子を製造することができる。遺伝子の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどより入手した構造タンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ　１０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結する方法によって遺伝子を化学的に合成することができる。この際に、タンパク質の精製や確認を容易にするため、上記のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したポリペプチドをコードする遺伝子を合成してもよい。
　調節配列は、宿主における組換えタンパク質の発現を制御する配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等）であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。プロモーターとして、宿主細胞中で機能し、目的とするタンパク質を発現誘導可能な誘導性プロモーターを用いても良い。誘導性プロモーターは、誘導物質（発現誘導剤）の存在、リプレッサー分子の非存在、又は温度、浸透圧若しくはｐＨ値の上昇若しくは低下等の物理的要因により、転写を制御できるプロモーターである。
　発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主の染色体中への組込みが可能で、目的とする組換えポリペプチドをコードする遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが好適に用いられる。
　宿主として、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも好適に用いることができる。
　原核生物の好ましい例として、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する細菌を挙げることができる。
　目的とする組換えポリペプチドをコードする遺伝子を導入するベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２（ベーリンガーマンハイム社製）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＣｏｌｄ、ｐＵＢ１１０、ｐＮＣＯ２（特開２００２－２３８５６９号公報を参照）等を挙げることができる。
　真核生物の宿主としては、例えば、酵母及び糸状真菌（カビ等）を挙げることができる。
　酵母としては、例えば、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属等に属する酵母を挙げることができる。糸状真菌としては、例えば、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属等に属する糸状真菌を挙げることができる。
　ベクターとしては、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）等を挙げることができる。
　上記宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、コンピテント法等を挙げることができる。
　発現ベクターで形質転換された宿主による遺伝子の発現方法としては、直接発現のほか、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
　目的とする組換えポリペプチドは、例えば、本実施形態に係る発現ベクターで形質転換された宿主を培養培地中で培養し、培養培地中に当該タンパク質を生成蓄積させ、該培養培地から採取することにより製造することができる。本実施形態に係る宿主を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。
　本実施形態に係る宿主が、大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、本実施形態に係る宿主の培養培地として、該宿主が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有し、該宿主の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
　炭素源としては、上記形質転換微生物が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類を用いることができる。
　窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。
　無機塩類としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。
　大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物の培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は、例えば、１５～４０℃である。培養時間は、通常１６時間～７日間である。培養中の培養培地のｐＨは３．０～９．０に保持することが好ましい。培養培地のｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。
　また、培養中必要に応じて、アンピシリン及びテトラサイクリン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
　本実施形態に係る組換えポリペプチドは、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法で単離及び精製することができる。例えば、当該組換えポリペプチドが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、宿主細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁した後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー及びダイノミル等により宿主細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法、すなわち、溶媒抽出法、硫酸アンモニウム等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ　ＨＰＡ－７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の方法を単独又は組み合わせて使用し、精製標品を得ることができる。
　また、組換えポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に宿主細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として組換えポリペプチドの不溶体を回収する。回収した組換えポリペプチドの不溶体は蛋白質変性剤で可溶化することができる。該操作の後、上記と同様の単離精製法により組換えポリペプチドの精製標品を得ることができる。
　組換えポリペプチドが細胞外に分泌された場合には、培養上清から組換えポリペプチドを回収することができる。すなわち、培養物を遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
　本実施形態において、組成物に配合されるポリペプチドの形状は特に限定されず、例えば、粉末状（凍結乾燥粉末等）又は繊維状（紡糸状等）の形状を有していてよい。本実施形態に係るモールド成形体は、上記のような形状のポリペプチドを含む組成物の融着体であり得る。
　好適な一態様において、組成物に配合されるポリペプチドは粉末状（ポリペプチド粉末）であってよい。ポリペプチド粉末の平均粒径ｄ１は、例えば０．１μｍ以上であってよく、好ましくは１μｍ以上である。また、ポリペプチド粉末の平均粒径ｄ１は、例えば２００μｍ以下であってよく、好ましくは１００μｍ以下である。なお、本明細書中、ポリペプチド粉末の平均粒径ｄ１は、粒子径分布測定装置で測定される値を示す。
　タンパク質成形体におけるポリペプチドの含有量は、タンパク質成形体の全質量を基準として、５０～９９質量％、６０～９５質量％、又は７０～９０質量％であってもよい。
（難燃剤）
　本実施形態に係る難燃剤は、ポリリン酸の塩及びポリヌクレオチドの塩から選択される。ポリヌクレオチドとは、核塩基、糖及びリン酸から構成されるヌクレオチドをモノマー単位とするポリマーであり、その主鎖は糖及びリン酸が交互に結合している。
　ヌクレオチドを構成する核塩基は、プリン骨格又はピリミジン骨格等のヘテロ芳香環構造を有する基であり、具体的には、アデニン、グアニン、シトシン、チミン及びウラシルが挙げられる。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド単位ごとに互いに同一又は異なる核塩基を有しており、各核塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミン及びウラシルのいずれであってもよい。
　ヌクレオチドを構成する糖は、通常、ペントース（五炭糖）又はヘキソース（六炭糖）であり、具体的には、リボース、デオキシリボース、グルコース、ガラクトース、アセチルグルコサミン、キシロース、マンノース、フコースが挙げられる。糖がリボースである場合、ポリヌクレオチドはリボ核酸（ＲＮＡ）とも呼ばれ、糖がデオキシリボースである場合、ポリヌクレオチドはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）とも呼ばれることがある。
　難燃剤は、ポリリン酸又はポリヌクレオチドと陽イオンからなる塩である。陽イオンは、オニウムイオン等の有機陽イオンであってもよく、金属イオンであってもよい。オニウムイオンとしては、例えば、アンモニウムイオンが挙げられる。金属イオンとしては、リチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン等のアルカリ金属イオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン等のアルカリ土類金属イオンが挙げられる。好ましいカチオンは、アンモニウムイオン又はアルカリ金属イオンである。
　好ましい難燃剤は、ポリリン酸アンモニウム又はデオキシリボ核酸ナトリウムである。
　タンパク質成形体における難燃剤の含有量は、タンパク質成形体の全質量を基準として、１～５０質量％、５～４０質量％、又は、１０～３０質量％であってもよい。
［モールド成形体の製造方法］
　上記実施形態に係るモールド成形体の製造方法は、ポリペプチド及び難燃剤を混合して組成物を得る混合工程と、組成物を鋳型（モールド）に導入し、成形加工する成形工程と、を含む。
　混合工程は、ポリペプチドを含む組成物に難燃剤を添加する工程であってもよく、難燃剤を添加する組成物にポリペプチドを添加する工程であってもよく、ポリペプチド及び難燃剤を同時に添加して混合する工程であってもよい。
　上記組成物は、ポリペプチド及び難燃剤以外の他の成分（例えば、可塑剤、着色剤、フィラー、合成樹脂等）を更に含んでいてもよい。これらの他の成分の含有量は、ポリペプチド１００質量部に対して２０質量部以下にすることが好ましい。
　混合工程で混合される難燃剤の量は、ポリペプチド１００質量部に対して、例えば１．０１質量部以上であってよく、好ましくは５．２６質量部以上、より好ましくは１１．１１質量部以上である。また、組成物に配合される難燃剤の量は、ポリペプチド１００質量部に対して、例えば１００質量部以下であってよく、好ましくは６６．６７質量部以下、より好ましくは４２．８６質量部以下である。
　混合工程で混合されるポリペプチドは、粉末状（凍結乾燥粉末等）又は繊維状（紡糸状等）の形状を有していてよく、モールド成形体は、そのような形状のポリペプチドを含む組成物の融着体であり得る。
　好適な一態様において、混合工程は、ポリペプチド粉末及び難燃剤を混合する工程であってよい。このとき、混合工程で得られる組成物は、ポリペプチド粉末及び難燃剤を含む混合粉末であってよい。
　成形工程は、混合工程で得られた組成物を鋳型（モールド）に導入し、成形加工する工程である。成形工程では、成形加工に際して、組成物を加熱及び／又は加圧してよく、加熱及び加圧することが好ましい。
　成形工程では、例えば、加圧成形機を用いて成形することができる。図９は、モールド成形体を製造するために用いることのできる加圧成形機を示す模式断面図である。図９に示す加圧成形機１０は、貫通孔が形成され加温可能な金型２と、金型２の貫通孔内で上下動が可能な上側ピン４及び下側ピン６とを備えるものである。金型２に、上側ピン４又は下側ピン６を挿入して生じる空隙に、上記組成物を導入して、金型２を加温しつつ、上側ピン４及び下側ピン６で当該組成物を圧縮することで、モールド成形体を得ることができる。
　図１０は、モールド成形体を得る工程図を示すものであり、（ａ）は組成物の導入前、（ｂ）は組成物の導入直後、（ｃ）は組成物を加熱及び加圧している状態の加圧成形機を示す模式断面図である。図１０（ａ）に示すように、金型２の貫通孔に下側ピン６のみを挿入した状態で貫通孔内に組成物を導入する。続いて図１０（ｂ）に示すように、金型２の貫通孔に上側ピン４を挿入して下降させ、金型２の加熱を開始して、加熱加圧前の組成物８ａを貫通孔内で加熱加圧する。あらかじめ定めた加圧力に至るまで上側ピン４を下降させ、図１０（ｃ）に示す状態で組成物が所定の温度に達するまで、加熱及び加圧を継続して、加熱加圧後の組成物８ｂを得る。その後、冷却器（例えばスポットクーラー）を用いて金型２の温度を下降させ、組成物８ｂが所定の温度になったところで、上側ピン４又は下側ピン６を金型２から抜き取り、内容物を取り出す。加圧に関しては、下側ピン６を固定した状態で上側ピン４を下降させて実施してもよいが、上側ピン４の下降と下側ピン６の上昇の両方を実施してもよい。
　加熱は、金型の温度が８０～２５０℃で行うことが好ましく、１００～２００℃がより好ましい。加圧は、２０ＭＰａ以上の圧力で行うことが好ましい。
　以上、本発明の好適な実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
＜構造タンパク質の調製＞
（１）構造タンパク質発現株の作製
　ネフィラ・クラビペス（Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ）由来のフィブロイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）の塩基配列及びアミノ酸配列をＧｅｎＢａｎｋのウェブデータベースより取得した後、生産性の向上を目的としてアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を施し、さらにＮ末端に配列番号５で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）を付加して、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有する組換えフィブロイン（以下、「ＰＲＴ５８７」ともいう。）を設計した。
　次に、ＰＲＴ５８７をコードする遺伝子を合成委託した。その結果、遺伝子の５’末端直上流にＮｄｅＩサイト、及び３’末端直下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した遺伝子を得た。当該遺伝子をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした後、ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理し、タンパク質発現ベクターｐＥＴ－２２ｂ（＋）に組み換えた。
（２）タンパク質の発現
　上記で得られたＰＲＴ５８７をコードする遺伝子を含むｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターで、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。形質転換された大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養後、同培養液を、表１に示すシード培養用培地１００ｍＬに、ＯＤ６００が０．００５となるように添加した。培養液の温度を３０℃に保ち、ＯＤ６００が５になるまでフラスコにて、さらに約１５時間培養を行い、シード培養液を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　得られたシード培養液を、表２に示す生産培地５００ｍＬを添加したジャーファーメンターに、ＯＤ６００が０．０５となるように添加した。培養液の温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定になるように制御し、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにして培養した。なお、消泡剤として、アデカノールＬＧ－２９５Ｓ（（株）ＡＤＥＫＡ製）を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ　１２０ｇ／１Ｌ）を１ｍＬ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにし、２０時間培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）水溶液を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、目的のタンパク質を発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存した目的とするタンパク質サイズのバンドの出現により、目的とするタンパク質の発現を確認した。
（３）構造タンパク質の精製
　ＩＰＴＧを添加してから２時間後に回収した菌体を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の菌体を約１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ　Ｎｉｒｏ　Ｓｏａｖｉ社）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８Ｍ　グアニジン緩衝液（８Ｍグアニジン塩酸塩、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で懸濁し、６０℃で３０分間、スターラーで撹拌し、溶解させた。溶解後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分を除き、凍結乾燥粉末を回収した。
　ポリリン酸アンモニウムとして、Ｅｘｏｌｉｔ　ＡＰ　４２２（クラリアント社製）またはデオキシリボ核酸ナトリウム（日生バイオ社製）を使用した。
実施例１
　ＰＲＴ５８７の精製粉末にポリリン酸アンモニウム（２５ｗｔ％）を加え、アトライタミルを用いて１０００ｒｐｍで２０分間混合した後、目開き１００μｍの篩いで分級し、混合粉末を得た。得られた混合粉末を金型に投入し、１５０℃、３０ＭＰａの条件で５分間加熱圧縮して、実施例１のタンパク質成形体を得た。
実施例２
　ポリリン酸アンモニウムの含有量を２０ｗｔ％とした以外は実施例１と同様にして、実施例２のタンパク質タンパク質成形体を得た。
実施例３
　ポリリン酸アンモニウムの含有量を１５ｗｔ％とした以外は実施例１と同様にして、実施例３のタンパク質タンパク質成形体を得た。
実施例４
　ポリリン酸アンモニウム（２５ｗｔ％）に代えてデオキシリボ核酸ナトリウム（２０ｗｔ％）を用いた以外は実施例１と同様にして、実施例４のタンパク質タンパク質成形体を得た。
実施例５
　ポリリン酸アンモニウム（２５ｗｔ％）に代えてポリリン酸アンモニウム（１０ｗｔ％）及びデオキシリボ核酸ナトリウム（１０ｗｔ％）を用いた以外は実施例１と同様にして、実施例５のタンパク質成形体を得た。
比較例１
　ＰＲＴ５８７の精製粉末を、アトライタミルを用いて１０００ｒｐｍで２０分間撹拌した後、目開き１００μｍの篩いで分級して粉末を得た。得られた粉末を金型に投入し、１５０℃、３０ＭＰａの条件で５分間加熱圧縮して、比較例１のタンパク質成形体を得た。
　実施例１～５及び比較例１の各組成を表３に示す。表３中の数値は、質量％を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（熱重量分析）
　実施例１～５及び比較例１のタンパク質成形体の熱重量分析（ＴＧＡ）を、熱分析装置（株式会社島津製作所製、ＤＴＧ－６０Ｈ）を用いて実施した。
　結果を図１及び図２に示す。実施例１～３はいずれも、３５０～８００℃の間で、比較例１よりも重量変化が小さかった。実施例４は、６００～１２００℃の間で、比較例１よりも重量変化が小さかった。実施例５は、４００～１２００℃の間で、比較例１よりも重量変化が小さかった。
　熱重量分析において、６００℃、７００℃、８００℃又は１０００℃に達したときの実施例２、４、５及び比較例１の樹脂の残渣を表４に示す。表４中の数値は、質量％を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（接炎燃焼試験）
　６ｃｍ×１８ｃｍ×０．４ｃｍの大きさとなるように、実施例２及び比較例１のタンパク質成形体を調製した。各タンパク質成形体の片方の主表面（６ｃｍ×１８ｃｍの面）に、直接炎を接触させて外観を目視観察した。
　図３～７は、接炎開始からタンパク質成形体の外観の経時変化を示した写真である。図８は、試験の前後におけるタンパク質成形体の外観の変化を比較した写真である。
　接炎開始から１０秒後では、実施例２は比較例１より焦げている範囲が広いが、比較例１では針状の炎が観察されており、これは燃焼がより進行していることを示す（図３参照）。接炎開始から１分後、比較例１の針状の炎がさらに大きくなり、実施例２と比べて焦げている範囲も同程度となった（図４参照）。さらに１分間接炎を続けると（接炎開始から２分後）、比較例１の分解が顕著に進行し、元の形状を維持できていないのに対して、実施例２の外観は図４と比べてあまり変化しなかった（図５参照）。
　その後、比較例１については、その側面（１８ｃｍ×２ｃｍの面）においても分解または変形が進んだため、接炎開始から２分１５秒後の時点で試験を終了した。図６は、接炎開始から２分後の時点における、タンパク質成形体の外観を示す。
　一方、実施例２については、接炎した表面の反対側への影響をさらに調査するため、引き続き接炎した面全面にわたって焦げる程度まで炎を当て（接炎開始から３分２０秒後）、試験を終了した。図７は、接炎開始から３分１５秒後の時点における、実施例２のタンパク質成形体の外観を示す。図８に示すように、実施例２のタンパク質成形体では、炎が接触した面のみが焦げており、その反対面及び側面の外観は、試験前の外観から大きく変化しなかった。すなわち、実施例２のタンパク質成形体は延焼しにくいことが確認できた。

Claims (6)

  1. 　ポリペプチドと、ポリリン酸の塩及びポリヌクレオチドの塩から選択される難燃剤と、を含む、タンパク質成形体。
  2. 　前記難燃剤がポリリン酸の塩を含む、請求項１に記載のタンパク質成形体。
  3. 　前記ポリリン酸の塩がポリリン酸アンモニウムを含む、請求項２に記載のタンパク質成形体。
  4. 　前記難燃剤がポリデオキシヌクレオチドの塩を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のタンパク質成形体。
  5. 　前記ポリデオキシヌクレオチドの塩がポリデオキシヌクレオチドのナトリウム塩を含む、請求項４に記載のタンパク質成形体。
  6. 　前記ポリペプチドが構造タンパク質である、請求項１～５のいずれか一項に記載のタンパク質成形体。
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