WO2018164195A1 - 精製されたタンパク質を製造する方法 - Google Patents

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WO2018164195A1
WO2018164195A1 PCT/JP2018/008825 JP2018008825W WO2018164195A1 WO 2018164195 A1 WO2018164195 A1 WO 2018164195A1 JP 2018008825 W JP2018008825 W JP 2018008825W WO 2018164195 A1 WO2018164195 A1 WO 2018164195A1
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WO
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protein
aqueous solution
acidic
solution
amino acid
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Application number
PCT/JP2018/008825
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English (en)
French (fr)
Inventor
安沙子 石塚
良太 佐藤
Original Assignee
Ｓｐｉｂｅｒ株式会社
小島プレス工業株式会社
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a purified protein.
  • Non-patent Document 1 a method using hexafluoro-2-propanol (HFIP)
  • Patent Document 2 a method using a solvent containing an organic acid
  • Patent Document 2 A method using dimethyl sulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF) has been studied.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • DMF dimethylformamide
  • the method using a solvent containing an organic acid can be carried out using relatively inexpensive materials and equipment, and has the advantage that the purification operation is simple. However, it has been difficult to purify proteins to a sufficiently high purity by this method.
  • an object of one aspect of the present invention is to provide a method by which a protein purified with high purity can be easily produced.
  • One aspect of the present invention is to raise the pH of an acidic protein aqueous solution containing the target protein, impurities and acids and water in which they are dissolved, thereby precipitating a precipitate containing the impurities,
  • a method for producing a purified protein comprising: separating a deposited precipitate and a supernatant containing a target protein.
  • a highly purified protein can be easily produced.
  • FIG. 6 is a photograph showing the results of SDS-PAGE analysis of a supernatant obtained from an aqueous protein solution examined in Test Example 1.
  • FIG. 6 is a photograph showing the results of SDS-PAGE analysis of a precipitate obtained from an aqueous protein solution examined in Test Example 1.
  • FIG. 6 is a photograph showing the results of SDS-PAGE analysis of a supernatant obtained from an aqueous protein solution examined in Test Example 2.
  • FIG. 6 is a photograph showing the results of SDS-PAGE analysis of a precipitate obtained from an aqueous protein solution examined in Test Example 2.
  • FIG. 6 is a photograph showing the results of SDS-PAGE analysis of a precipitate obtained from an aqueous protein solution examined in Test Example 3.
  • FIG. 6 is a photograph showing the results of SDS-PAGE analysis of a precipitate obtained from an aqueous protein solution examined in Test Example 3.
  • FIG. 6 is a photograph showing the results of SDS-PAGE analysis of a precipitate obtained from an aqueous protein solution examined in Test Example 3.
  • FIG. 6 is a photograph showing the results of SDS-PAGE analysis of a precipitate obtained from an aqueous protein solution examined in Test Example 3.
  • FIG. 6 is a photograph showing the results of SDS-PAGE analysis of supernatant and precipitate obtained from an aqueous protein solution examined in Test Example 4.
  • FIG. 6 is a photograph showing the results of SDS-PAGE analysis of the supernatant and precipitate obtained from an aqueous protein solution examined in Test Example 5.
  • One embodiment of a method for producing a purified protein is to raise the pH of an aqueous acidic protein solution containing the target protein and contaminants and the water in which they are dissolved, thereby removing the precipitate containing the contaminants.
  • a step of precipitating, and a step of separating the precipitated precipitate and the supernatant containing the target protein is to raise the pH of an aqueous acidic protein solution containing the target protein and contaminants and the water in which they are dissolved.
  • target protein There is no restriction on the type of target protein.
  • the target protein may be produced by a microorganism or the like by a gene recombination technique, or may be produced by chemical synthesis.
  • the target protein may be a protein obtained from a natural raw material.
  • the target protein may in particular be a structural protein.
  • the structural protein is a protein having a role of constructing a biological structure, and is different from functional proteins such as enzymes, hormones, and antibodies. Since the structural protein easily maintains its three-dimensional structure in an aqueous solution, it is considered that the structural protein is difficult to aggregate and precipitate as a precipitate when the pH of the aqueous solution changes. Therefore, the method of the present embodiment accompanied by an increase in pH is particularly easy to apply for purification of structural proteins.
  • structural proteins include natural structural proteins such as fibroin, collagen, resilin, elastin and keratin.
  • the structural protein may be fibroin.
  • fibroin include fibroin produced by insects or spiders.
  • fibroin produced by insects include, for example, Bombyx mori, Kwako (Bombyx mandaraina), Tengea (Antheraea yamanai), ⁇ ⁇ (Antereaperanii), ⁇ ⁇ (Eriothyraminey) ), Silkworms (Samia cythia), chestnut worms (Caligula japonica), Chussa moth (Anthereaea mylitta), silkworms (Anthereaea assama), etc. Hornet silk tongue discharged by larvae Click quality, and the like.
  • Silk fibroin is made from natural or domestic silkworms, or used or discarded silk fabric as a raw material, and purified by removing sericin covering fibroin and other fats.
  • Silk fibroin may be a powder obtained by freeze-drying purified fibroin.
  • fibroin produced by insects include silkworm fibroin L chain (GenBank accession number M76430 (base sequence), AAA27840.1 (amino acid sequence)).
  • Spiders have a maximum of 7 types of silk glands, and produce fibroin (spider silk fibroin or spider silk protein) having different properties from each other. Examples include large sputum bookmarker protein, weft protein, and small bottle-like gland protein. Spider silk protein has different forms depending on the organ of its source, for example, a large bottle-shaped spider protein (MaSp) having high toughness, a small bottle-shaped spider protein (minor sample) having high elongation. There are spider protein, MiSp, as well as flagellate (Flag), tubular, aggregate, agileform, or piriform spider silk proteins.
  • MiSp large bottle-shaped spider protein
  • flagellate flagellate
  • spiders that produce spider silk fibroin include, for example, spiders belonging to the genus spider (Araneus spp.) Such as the spider, elder spider, red-tailed spider, blue-tailed spider, and the bean spider, the white spider spider, the spider silkworm, the white spider spider Spiders belonging to the genus Spider of the genus Neoscona, spiders belonging to the genus Spider of the genus Pronus, such as the spider, Pronos, spiders belonging to the genus Cynoptera (genus Cyrtarachne), It belongs to the genus Spider (genus Ordgarius) such as the spider belonging to the genus Spider (Gasteracantha) such as the spider spider and the scab spider.
  • spiders belonging to the genus spider (Araneus spp.)
  • the spider elder spider, red-tailed spider, blue-tailed spider, and the bean spider
  • the white spider spider the spider silkworm
  • Spiders belonging to the genus Argiope such as spiders, Argiope spp., Argiope spp. And spiders belonging to the genus Cyborga, such as spiders belonging to the genus Cytophora such as Harabirosumi spider, spiders belonging to the genus Poltys such as Gehoro spider, and spiders belonging to the genus Cyclosa such as spider Examples include spiders belonging to the genus Canazo (Corizopes) such as the spider spider and spiders belonging to the family Tetragnatidae.
  • spider silk spider that produces spider silk fibroin (or spider silk protein)
  • spiders belonging to the genus Tetragnatha such as Spider Spider, Spider Spider, Spider Spider Spider, and Spider Silk Spider
  • Spiders belonging to the genus Leucaugue such as spiders and white spiders
  • spiders belonging to the genus Nephila such as spiders and giant spiders
  • spiders belonging to the genus Nephila spiders belonging to the genus Menosira such as spiders
  • Spiders belonging to the genus (Dyschiriognata) such as spiders, black widow spiders, red widow spiders, gray widow spiders and juvenile spider spiders Spiders belonging to the spider genus (Latrodectus spp.)
  • spider silk proteins examples include dragline proteins such as MaSp (MaSp1 and MaSp2) and ADF (ADF3 and ADF4), MiSp (MiSp1 and MiSp2), and the like.
  • spider silk fibroin produced by spiders include, for example, fibroin-3 (adf-3) [derived from Araneus diadematus] (GenBank accession numbers AAC47010 (amino acid sequence), U47855 (base sequence)), fibroin -4 (adf-4) [derived from Araneus diadematus] (GenBank accession number AAC47011 (amino acid sequence), U47856 (base sequence)), dragline silk protein spidrin 1 [derived from Nephila clavipes] (GenBank accession number AAC4 amino acid sequence A04) , U37520 (base sequence)), major sample spidroin 1 [ atroductus hesperus derived] (GenBank accession number ABR68856 (amino acid sequence), EF595246 (base sequence)), dragline silk protein spidroin 2 [Nephila clavata derived] (GenBank accession number AAL32447 (amino acid sequence, AAL
  • Naturally derived fibroin include fibroin whose sequence information is registered in NCBI GenBank.
  • sequence information is registered in NCBI GenBank.
  • spidin, sample, fibroin, “silk and polypeptide”, or “silk and protein” is described as a keyword in DEFINITION from sequences including INV as DIVISION among the sequence information registered in NCBI GenBank. It can be confirmed by extracting a character string of a specific product from the sequence, CDS, and a sequence in which the specific character string is described from SOURCE to TISSUE TYPE.
  • the target protein may be a polypeptide derived from the natural protein exemplified above, that is, an artificial polypeptide.
  • an artificial polypeptide for example, recombinant fibroin, which is an artificial polypeptide, is produced in several heterologous protein production systems, and as a production method thereof, a transgenic goat, a transgenic silkworm, or a recombinant plant or mammalian cell is used. Yes.
  • the recombinant fibroin may be, for example, the amino acid sequence of naturally-occurring fibroin, or one obtained by substituting, deleting, inserting and / or adding one or more amino acid residues to the amino acid sequence of naturally-occurring fibroin.
  • a recombinant fibroin can also be obtained by designing the amino acid sequence modified in this way and chemically synthesizing the nucleic acid encoding it.
  • a recombinant polypeptide of a large sphincter bookmark silk protein which is a kind of spider silk fibroin, is represented by, for example, Formula 1: [(A) n motif-REP] m or Formula 2: [(A) n motif-REP].
  • Examples thereof include proteins containing a domain sequence represented by m- (A) n motif.
  • (A) n motif represents an amino acid sequence mainly composed of alanine residues, and n is an integer of 2 to 27. n may be an integer from 2 to 20, 4 to 27, 4 to 20, 8 to 20, 10 to 20, 4 to 16, 8 to 16, or 10 to 16.
  • the ratio of the number of alanine residues to the total number of amino acid residues in the n motif may be 40% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 83% or more, 85% or more, 86% As mentioned above, it may be 90% or more, or 95% or more, and may be 100% ((A) means that the n motif is composed only of alanine residues). At least seven (A) n motifs present in the domain sequence represented by Formula 1 or 2 may be composed of only alanine residues.
  • REP indicates an amino acid sequence composed of 2 to 200 amino acid residues.
  • REP may be an amino acid sequence composed of 10 to 200 amino acid residues.
  • m represents an integer of 2 to 300, and may be an integer of 10 to 300.
  • a plurality of (A) n motifs present in the domain sequence represented by Formula 1 or 2 may be the same amino acid sequence or different amino acid sequences.
  • a plurality of REPs present in the domain sequence represented by Formula 1 or 2 may be the same amino acid sequence or different amino acid sequences.
  • a protein derived from a large sputum bookmarker thread a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 can be mentioned.
  • Examples of the protein derived from the weft protein include a protein containing a domain sequence represented by Formula 3: [REP2] o (in Formula 3, REP2 is an amino acid sequence composed of Gly-Pro-Gly-Gly-X). X represents one amino acid selected from the group consisting of alanine (Ala), serine (Ser), tyrosine (Tyr) and valine (Val), and o represents an integer of 8 to 300. it can.
  • Specific examples of the protein derived from the weft protein include a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is an N-terminal corresponding to a repeat part and a motif of a partial sequence (NCBI accession number: AAF36090, GI: 7106224) of a partial sequence of flagella silk protein of American spider spider obtained from the NCBI database.
  • Amino acid sequence from residue 1220 to residue 1659 (referred to as PR1 sequence), and a partial sequence of American yellow spider flagellar silk protein obtained from the NCBI database (NCBI accession numbers: AAC38847, GI: 2833649)
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 was added to the N-terminus of the combined sequence. Is.
  • a collagen recombinant polypeptide for example, a protein comprising a domain sequence represented by Formula 4: [REP3] p (wherein, p represents an integer of 5 to 300.
  • REP3 is expressed from Gly 1 X 1 Y And X and Y represent any amino acid residue other than Gly, and a plurality of REP3 may be the same amino acid sequence or different amino acid sequences.
  • Specific examples of the collagen recombinant polypeptide include a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 corresponds to the repeat part and motif of the partial sequence of human collagen type 4 (NCBI Genbank accession number: CAA56335.1, GI: 3702452) obtained from the NCBI database.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (tag sequence and hinge sequence) is added to the N-terminus of the amino acid sequence from the 301st residue to the 540th residue.
  • a protein comprising a domain sequence represented by Formula 5: [REP4] q (in Formula 5, q represents an integer of 4 to 300.
  • REP4 represents Ser 1 J 1 J 1 Tyr. 1 represents an amino acid sequence composed of one Gly and one U-Pro, J represents any amino acid residue, and in particular may be an amino acid residue selected from the group consisting of Asp, Ser and Thr. (Indicates amino acid residues, and may be amino acid residues selected from the group consisting of Pro, Ala, Thr and Ser.
  • Plural REP3s may be the same or different amino acid sequences.) Can be mentioned.
  • resilin recombinant polypeptide examples include a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is the amino acid sequence of resilin (NCBI Genbank accession number NP 611157, Gl: 24654243), wherein Thr at the 87th residue is replaced with Ser, and the Asn at the 95th residue.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 (tag sequence and hinge sequence) is added to the N-terminus of the amino acid sequence from the 19th residue to the 321st residue of the sequence in which is replaced with Asp.
  • Examples of recombinant polypeptides of elastin include proteins having amino acid sequences such as NCBI Genbank accession numbers AAC98395 (human), I47076 (sheep), and NP786966 (bovine).
  • Specific examples of the elastin recombinant polypeptide include a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 at the N-terminus of the amino acid sequence from residue 121 to residue 390 of the amino acid sequence of NCBI Genbank accession number AAC98395 (tag sequence). And a hinge arrangement).
  • the recombinant polypeptide as the target protein may be a polypeptide containing an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence of the exemplified recombinant polypeptide.
  • the recombinant polypeptide may contain a tag sequence at one or both of the N-terminal and C-terminal. This makes it possible to isolate, immobilize, detect and visualize recombinant fibroin.
  • tag sequences include affinity tags that use specific affinity (binding property, affinity) with other molecules.
  • affinity tag include a histidine tag (His tag).
  • His tag is a short peptide with about 4 to 10 histidine residues, and has a property of specifically binding to metal ions such as nickel. Therefore, the His tag is used for recombinant fibroin by metal chelation chromatography (chelating metal chromatography). Can be used for isolation.
  • Specific examples of the tag sequence include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 (amino acid sequence containing a His tag).
  • GST glutathione-S-transferase
  • MBP maltose-binding protein
  • an “epitope tag” using an antigen-antibody reaction can also be used.
  • a peptide (epitope) exhibiting antigenicity as a tag sequence an antibody against the epitope can be bound.
  • the epitope tag include HA (peptide sequence of hemagglutinin of influenza virus) tag, myc tag, FLAG tag and the like.
  • a tag sequence that can be cleaved with a specific protease can also be used.
  • Recombinant fibroin from which the tag sequence has been cleaved can also be recovered by treating the protein adsorbed via this tag sequence with a protease.
  • the aqueous protein solution is an acidic aqueous solution containing the target protein and contaminants and water in which they are dissolved.
  • the aqueous protein solution may contain an insoluble matter derived from a culture or the like that produced the target protein, or may be prepared from a supernatant recovered from a crude material containing an insoluble matter by centrifugation or the like. .
  • the protein aqueous solution is produced, for example, by mixing a crude material containing the target protein and impurities and an acid aqueous solution containing an acidic compound, and dissolving the target protein in the acid aqueous solution in the obtained mixture.
  • An acidic compound is a compound that dissolves in water to form an acidic aqueous solution.
  • the acidic compound and the aqueous acid solution containing the acidic compound are not particularly limited as long as the target protein contained in the crude material can be dissolved, and depending on the type of protein contained in the raw material, To be determined.
  • the acidic compound contained in the acid aqueous solution may be an organic acid such as carboxylic acid.
  • the carboxylic acid may be at least one selected from the group consisting of acetic acid, formic acid, and propionic acid, for example. Since spider silk fibroin tends to have high solubility in an acid aqueous solution containing a carboxylic acid as an acidic compound, a high-concentration protein aqueous solution can be easily obtained by using carboxylic acid.
  • the aqueous acid solution or aqueous protein solution may contain other solvent compatible with water as long as the target protein can be dissolved.
  • solvents include methyl sulfoxide (DMSO), N-methyl-2-pyrrolidone (NMP), 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone (DMI), dimethylacetamide (DMA), hexamethylphosphoric acid
  • examples include triamide (HMPA), acetone, trichloroacetic acid, acetonitrile, butylene carbonate, propylene carbonate, ethylene carbonate, butyrolactone, tetrahydrofuran, and alcohol (methanol, ethanol, propanol, etc.).
  • the concentration of the acidic compound in the acid aqueous solution is not limited in any way, and is appropriately determined according to the type of target protein contained in the raw material, the type of acid, and the like.
  • a carboxylic acid especially a monocarboxylic acid
  • an aqueous protein solution especially a spider silk fibroin aqueous solution
  • the concentration of the carboxylic acid aqueous solution is 5.0 mol based on the volume of the carboxylic acid aqueous solution. / L or more and 15.0 mol / L or less may be sufficient.
  • the concentration of the carboxylic acid aqueous solution is less than 5.0 mol / L or exceeds 15.0 mol / L, the amount of the target protein dissolved in the carboxylic acid aqueous solution becomes small, and the purification efficiency may be relatively lowered.
  • the concentration of the carboxylic acid aqueous solution exceeds 5.2 mol / L and less than 15 mol / L, exceeds 5.2 mol / L and is 13.1 mol / L or less, or 8.7 to 12.2 mol / L or less. It may be.
  • an inorganic salt may be added to the acid aqueous solution or the mixture of the acid aqueous solution and the crude raw material.
  • This inorganic salt can improve the solubility of the protein in the protein aqueous solution (the amount of protein dissolved in the acid aqueous solution). That is, an inorganic salt can be used as a protein dissolution promoter.
  • inorganic salts that can be used as a dissolution accelerator include alkali metal halides, alkaline earth metal halides, alkaline earth metal nitrates, and thiocyanates. More specifically, the inorganic salt is, for example, aluminum phosphate, lithium carbonate, aluminum carbonate, aluminum sulfate, aluminum fluoride, ferric acetate, aluminum acetate, zinc hydroxide, magnesium hydroxide, ferrous hydroxide , Manganese hydroxide, chromium hydroxide, ferric hydroxide, aluminum hydroxide, nickel chloride, cobalt chloride, zinc chloride, ferrous chloride, manganese chloride, chromium chloride, ferric chloride, aluminum chloride, lithium nitrate, Strontium nitrate, nickel nitrate, calcium nitrate, cobalt nitrate, zinc nitrate, magnesium nitrate, ferrous nitrate, manganese nitrate, chromium nitrate,
  • the amount of the inorganic salt added to the acid aqueous solution or the mixture of the acid aqueous solution and the crude material is not particularly limited, and is appropriately determined according to the type of the inorganic salt, the amount of the target protein, and the like.
  • the target protein and impurities may be dissolved in the aqueous acid solution to produce an acidic aqueous protein solution.
  • the amount of protein in the raw material dissolved in the acid aqueous solution is improved, and the target protein can be purified from the raw material more efficiently.
  • the warmed acid aqueous solution may be mixed with the crude material, or the acid aqueous solution and the crude material may be mixed and then the mixture may be warmed.
  • the aqueous acid solution may be continuously heated from before mixing with the raw material to after mixing.
  • the temperature control method for heating is not limited at all.
  • the temperature may be kept constant, or temperature control may be performed in a state where variation between predetermined temperature ranges is allowed.
  • the aqueous acid solution or mixture may be heated until the protein in the raw material is uniformly dissolved in the aqueous acid solution.
  • the protein aqueous solution is continuously heated from purification to molding. Also good.
  • the temperature may be kept at the same constant temperature, or after the protein is uniformly dissolved in the acid aqueous solution, the aqueous solution may be kept at a lower temperature or a higher temperature.
  • the range of the temperature at which the aqueous acid solution or the mixture containing it is heated is not particularly limited, but in order to obtain the effect of heating more reliably and prevent the quality of the finally obtained protein from being lowered, It may be higher than (25 ° C.) and lower than the protein denaturation temperature or the boiling point of the acid aqueous solution. If the protein denaturation temperature exceeds the boiling point of the aqueous acid solution, the temperature for heating the aqueous acid solution or the mixture containing it is preferably lower than the boiling point of the aqueous acid solution from the viewpoint of workability and handling. . Specifically, the temperature at which the aqueous acid solution or the mixture containing it is heated may be 30 to 80 ° C.
  • the lower limit of the temperature at which the aqueous acid solution or the mixture containing it is heated is about 30 ° C, about 36 ° C, about 38 ° C, about 40 ° C, about 45 ° C, about 50 ° C, about 55 ° C, or about 60 ° C. May be.
  • the upper limit of the temperature at which the aqueous acid solution or the mixture containing it is heated is, for example, about 45 ° C, about 50 ° C, about 55 ° C, about 60 ° C, about 65 ° C, about 70 ° C, about 75 ° C, or about 80 ° C. It may be. These lower limits and upper limits are arbitrarily combined.
  • the numerical value of the temperature with “about” means a numerical value in a range from 90% to 110% of the numerical value.
  • about 40 ° C. means 36 ° C. to 44 ° C.
  • about 60 ° C. refers to 54 ° C. to 66 ° C.
  • the temperature here is a temperature at normal pressure.
  • the normal pressure refers to an atmospheric pressure at which the boiling point of pure water is about 95 ° C to 105 ° C.
  • the method for heating the acid aqueous solution or the mixture containing the acid aqueous solution is not particularly limited, and any ordinary method can be employed.
  • ⁇ PH raising operation By increasing the pH of the acidic protein aqueous solution containing the target protein and impurities, a precipitate containing dissolved components (contaminants) other than the target protein in the protein aqueous solution is precipitated. By separating the deposited precipitate and the supernatant containing the target protein, a protein aqueous solution containing the purified target protein can be obtained.
  • the method for increasing the pH of the protein aqueous solution is not particularly limited.
  • the pH can be raised by a method of adding a basic compound, water, a pH buffer, or other pH adjuster to the protein aqueous solution.
  • a precipitate (insoluble residue) in the aqueous protein solution may be removed before raising the pH of the aqueous protein solution.
  • a normal method such as centrifugation is appropriately employed.
  • the range of raising the pH of the acidic protein aqueous solution is adjusted so that impurities other than the target protein precipitate from the protein aqueous solution.
  • the pH increase of the aqueous protein solution may be less than 2.8, 2.6 or less, or 2.3 or less.
  • the upper limit of the pH after the rise is appropriately determined depending on, for example, the type of the acid aqueous solution used for preparing the protein aqueous solution.
  • the pH of the protein aqueous solution may be raised to less than 4.8, 4.6 or less, or 4.3 or less. These pH ranges are particularly easily applied when the aqueous acid solution is an aqueous carboxylic acid solution.
  • the kind of basic compound that can be added to the aqueous protein solution to increase the pH is not particularly limited.
  • the basic compound may be at least one selected from the group consisting of NaOH, K 2 HPO 4 , and Na 2 HPO 4 , for example. By using these basic compounds, the target protein tends to be easily obtained with a higher purification purity.
  • the addition amount is adjusted to a range in which other impurities are precipitated while suppressing the precipitation of the target protein as much as possible.
  • the amount of the basic compound added to the protein aqueous solution can be determined according to the acid concentration in the protein aqueous solution.
  • the ratio of the base equivalent C1 of the basic compound to be added and the acid equivalent C2 of the acid: C1 / C2 may be less than 0.55. If this ratio C1 / C2 is 0.55 or more, the target protein may be likely to precipitate gradually. From the same viewpoint, the ratio C1 / C2 may be 0.5 or less, or 0.45 or less. If the ratio C1 / C2 is excessively small, the amount of impurities deposited becomes small, and as a result, the purity of the final target protein may be reduced. Therefore, the ratio C1 / C2 may be 0.04 or more.
  • the precipitate and the supernatant containing the target protein are separated.
  • the separation method is not particularly limited.
  • the supernatant separated from the precipitate can be collected by a usual method such as centrifugation or filtration.
  • the target protein may be precipitated from the obtained supernatant to recover the solid target protein.
  • the recovered supernatant can be used as it is, for example, as a dope solution for forming various molded articles such as fibers, films, gels, sponges and the like.
  • the term “supernatant” is used as a term meaning a clarified portion other than a precipitate, and includes not only a clarified liquid formed by centrifugation or the like but also a filtrate recovered by filtration. It is possible that the supernatant contains a trace amount of precipitate.
  • a method for producing a protein includes a step of producing a target protein in a host cell in a culture, a step of obtaining a raw material containing the target protein and impurities from the culture, A step of mixing an acid aqueous solution to obtain an acidic protein aqueous solution.
  • the target protein is obtained, for example, by the host cell transformed with an expression vector having a nucleic acid sequence encoding the protein and one or more regulatory sequences operably linked to the nucleic acid sequence. Can be produced.
  • the method for producing a gene encoding a protein is not particularly limited.
  • a gene encoding a natural structural protein can be used to produce the gene by a method of amplification and cloning by polymerase chain reaction (PCR) or the like, or chemical synthesis.
  • the method of chemical synthesis of the gene is not particularly limited.
  • AKTA oligopilot plus 10/100 GE Healthcare Japan Co., Ltd.
  • a gene can be chemically synthesized by a method of linking oligonucleotides automatically synthesized in step 1 by PCR or the like.
  • a gene encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which an amino acid sequence consisting of a start codon and a His10 tag is added to the N terminus of the above amino acid sequence may be synthesized.
  • Regulatory sequences are sequences that control the expression of recombinant proteins in the host (for example, promoters, enhancers, ribosome binding sequences, transcription termination sequences, etc.), and can be appropriately selected depending on the type of host.
  • an inducible promoter that functions in a host cell and can induce expression of a target protein may be used.
  • An inducible promoter is a promoter that can control transcription by the presence of an inducer (expression inducer), absence of a repressor molecule, or physical factors such as an increase or decrease in temperature, osmotic pressure or pH value.
  • the type of expression vector can be appropriately selected according to the type of host, such as a plasmid vector, virus vector, cosmid vector, fosmid vector, artificial chromosome vector, and the like.
  • the expression vector may be capable of autonomous replication in a host cell, or can be integrated into a host chromosome, and may contain a promoter at a position where a nucleic acid encoding a target protein can be transcribed.
  • prokaryotes and eukaryotes such as yeast, filamentous fungi, insect cells, animal cells and plant cells can be used.
  • prokaryotes examples include bacteria belonging to the genus Escherichia, Brevibacillus, Serratia, Bacillus, Microbacterium, Brevibacterium, Corynebacterium, Pseudomonas, and the like.
  • vectors for introducing a nucleic acid encoding a protein include pBTrp2 (manufactured by Boehringer Mannheim), pGEX (manufactured by Pharmacia), pUC18, pBluescriptII, pSupex, pET22b, pCold, pUB110, and pNCO2 (Japanese Patent Laid-Open No. 2002-238869). And the like.
  • Examples of eukaryotic hosts include yeast and filamentous fungi (molds, etc.).
  • yeast examples include yeasts belonging to the genus Saccharomyces, Pichia, Schizosaccharomyces and the like.
  • filamentous fungi examples include filamentous fungi belonging to the genus Aspergillus, the genus Penicillium, the genus Trichoderma and the like.
  • vectors examples include YEP13 (ATCC 37115) and YEp24 (ATCC 37051).
  • Any method can be used for introducing an expression vector into a host cell as long as it is a method for introducing DNA into the host cell.
  • a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], electroporation method, spheroplast method, protoplast method, lithium acetate method, and competent method.
  • a method for expressing a nucleic acid by a host transformed with an expression vector in addition to direct expression, secretory production, fusion protein expression, etc. can be performed according to the method described in Molecular Cloning 2nd edition, etc. .
  • the protein can be produced, for example, by culturing a host transformed with an expression vector in a culture medium, producing and accumulating the protein in the culture medium, and collecting the protein from the culture medium.
  • the method for culturing a host in a culture medium can be performed according to a method usually used for culturing a host.
  • the host culture medium contains a carbon source, nitrogen source and inorganic salts that can be assimilated by the host, and the host can be cultured efficiently.
  • Either a natural medium or a synthetic medium may be used as long as it is a medium.
  • the carbon source may be anything that can be assimilated by the host, such as glucose, fructose, sucrose, and molasses containing them, carbohydrates such as starch and starch hydrolysate, organic acids such as acetic acid and propionic acid, In addition, alcohols such as ethanol and propanol can be used.
  • nitrogen source examples include ammonium salts of inorganic acids or organic acids such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, and ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, and peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, Casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells and digested products thereof can be used.
  • inorganic acids or organic acids such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, and ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, and peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, Casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells and digested products thereof can be used.
  • inorganic salts examples include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, and calcium carbonate.
  • Cultivation of prokaryotes such as E. coli or eukaryotes such as yeast can be performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration and agitation culture.
  • the culture temperature is, for example, 15 to 40 ° C.
  • the culture time is usually 16 hours to 7 days.
  • the pH of the culture medium during the culture may be maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH of the culture medium can be adjusted using an inorganic acid, an organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like.
  • antibiotics such as ampicillin and tetracycline may be added to the culture medium as necessary.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside is used when cultivating a microorganism transformed with an expression vector using the lac promoter
  • indole acrylic is used when culturing a microorganism transformed with an expression vector using the trp promoter.
  • An acid or the like may be added to the medium.
  • the above-mentioned acidic protein aqueous solution can be prepared using a crude material taken out from the culture that produced the target protein.
  • the aqueous solution of the protein can be obtained by mixing the host cell as a raw material recovered by centrifugation or the like and the aqueous acid solution after completion of the culture.
  • the protein forms an insoluble substance in the cell, it may be solubilized with a protein denaturant.
  • the aqueous solution of the protein can be obtained by mixing the culture supernatant as a crude material and an aqueous acid solution.
  • spider silk fibroin-encoding gene and expression of spider silk fibroin Based on the nucleotide sequence and amino acid sequence of spider silk fibroin from Nephila clavipes (GenBank accession numbers: P46804.1, GI: 1174415) A modified spider silk fibroin (hereinafter also referred to as “PRT410”) having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 was designed.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is an amino acid sequence obtained by substituting, inserting, and deleting amino acid residues for the purpose of improving productivity with respect to the amino acid sequence of spider silk fibroin derived from Nephila clavipes, It has an amino acid sequence (tag sequence and hinge sequence) represented by SEQ ID NO: 6 added to the N-terminus.
  • a nucleic acid encoding the designed PRT410 was synthesized.
  • the nucleic acid was added with an NdeI site at the 5 'end and an EcoRI site downstream of the stop codon.
  • the nucleic acid was cloned into a cloning vector (pUC118). Thereafter, the nucleic acid was cleaved by restriction enzyme treatment with NdeI and EcoRI, and then recombined with the protein expression vector pET-22b (+) to obtain an expression vector.
  • Escherichia coli BLR (DE3) was transformed with the obtained pET22b (+) expression vector.
  • the transformed Escherichia coli was cultured in 2 mL of LB medium containing ampicillin for 15 hours.
  • the culture solution was added to 100 mL of a seed culture medium (Table 1) containing ampicillin so that the OD 600 was 0.005.
  • the culture temperature was kept at 30 ° C., and the flask culture was performed for about 15 hours until the OD 600 reached 5 to obtain a seed culture.
  • the seed culture was added to a jar fermenter to which 500 ml of production medium (Table 2) was added so that the OD 600 was 0.05.
  • the culture solution temperature was maintained at 37 ° C., and the culture was performed at a constant pH of 6.9.
  • the dissolved oxygen concentration in the culture solution was maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
  • a feed solution (glucose 455 g / 1 L, Yeast Extract 120 g / 1 L) was added at a rate of 1 ml / min.
  • the culture solution temperature was maintained at 37 ° C., and the culture was performed at a constant pH of 6.9.
  • the culture was performed for 20 hours while maintaining the dissolved oxygen concentration in the culture solution at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
  • 1M isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) was added to the culture solution to a final concentration of 1 mM to induce expression of the target spider silk fibroin.
  • the culture solution was centrifuged, and the cells were collected. The collected cells were dried to obtain a predetermined amount of Escherichia coli dry cells expressing spider silk fibroin.
  • Bacteria prepared from the culture solution before and after the addition of IPTG were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) method. Due to the appearance of a target spider silk fibroin size band depending on the addition of IPTG, The expression of the target spider silk fibroin was confirmed.
  • Example 1 50 mg each of the dry Escherichia coli cells expressing spider silk fibroin obtained as described above was put into five eppendle tubes, and 8.7 M (50 mass%) in these five eppendle tubes. 1 mL of acetic acid aqueous solution was added. Next, the eppendle tube was stirred for 30 minutes while being heated to 60 ° C. with a heat block shaker. Thereafter, the sample in each Eppendle tube was centrifuged at 11,000 ⁇ g and 20 ° C. for 10 minutes, and the supernatant (acidic protein aqueous solution) and the precipitate were collected.
  • Table 3 shows the pH of each sample after adjusting the pH by adding an aqueous NaOH solution or RO water, and the increase in pH from before the adjustment.
  • the supernatant and precipitate collected from each sample were mixed with a sample buffer containing 2-mercaptoethanol and boiled and reduced according to a conventional method. Thereafter, electrophoresis was directly performed on the sample buffer of each supernatant by SDS-PAGE. Further, each precipitate sample was further centrifuged to separate the supernatant, and the remaining precipitate was electrophoresed by SDS-PAGE. The gel after electrophoresis was stained with oriole, and the electrophoresis pattern of each sample was recorded on a photograph as an electropherogram by fluorescence.
  • the supernatant and precipitate are also collected from one eppendle tube to which no NaOH aqueous solution or RO water has been added, and the supernatant and the precipitate are subjected to electrophoresis in the same manner as described above, and the electrophoresis pattern is obtained. Photographs were recorded as electropherograms.
  • FIG. 1 is a photograph showing the analysis result of the supernatant by SDS-PAGE
  • FIG. 2 is a photograph showing the analysis result of the precipitate by SDS-PAGE.
  • lane 1 is 0.5 M NaOH
  • lane 2 is 1 M NaOH
  • lane 3 is 2 M NaOH
  • lane 4 is a sample in which the pH of the protein aqueous solution is increased by RO water
  • lane 5 is an aqueous NaOH solution.
  • the sample is a sample in which RO water is not added to the protein aqueous solution
  • Lane 6 is a separately prepared spider silk fibroin (SSP).
  • SSP spider silk fibroin
  • XL Ladder indicates a commercially available molecular weight marker (manufactured by Apro Science Co., Ltd.) (the same applies to FIGS. 2 to 9).
  • the pH of the protein aqueous solution obtained by adding an aqueous acetic acid solution to dry cells of Escherichia coli expressing spider silk fibroin is increased by adding an aqueous NaOH solution or RO water.
  • a spider silk fibroin purification test was carried out in the same manner as in Test Example 1 except that the above was performed.
  • Table 4 shows the pH of each protein aqueous solution after the pH is increased by the addition of a K 2 HPO 4 aqueous solution or a Na 2 PO 4 aqueous solution, and the increase in pH from before the adjustment.
  • FIG. 3 is a photograph showing a result of SDS-PAGE analysis of a sample using a K 2 HPO 4 aqueous solution
  • FIG. 4 is a photograph showing a result of SDS-PAGE analysis of a sample using a Na 2 HPO 4 aqueous solution. is there.
  • lane 1 is 0.5M K 2 HPO 4 aqueous solution
  • lane 2 is 1M K 2 HPO 4 aqueous solution
  • lane 3 is 2M K 2 HPO 4 aqueous solution
  • lane 4 is 5M K 2 HPO 4 aqueous solution.
  • Lane 5 is a 0.5 M K 2 HPO 4 aqueous solution
  • lane 6 is a 1 M K 2 HPO 4 aqueous solution
  • lane 7 is a 2 M K 2 HPO 4 aqueous solution
  • lane 8 is 5 M.
  • the precipitate of the sample was obtained by raising the pH of the protein aqueous solution with the aqueous K 2 HPO 4 solution
  • Lane 9 is separately prepared spider silk fibroin (SSP).
  • lane 1 is the supernatant of the sample to raise the pH of the aqueous protein solution by aqueous solution of Na 2 HPO 4 in 0.5M
  • lane 2 the pH of the aqueous protein solution by aqueous solution of Na 2 HPO 4 in 0.5M
  • the sample precipitate is raised
  • lane 3 is a separately prepared spider silk fibroin (SSP).
  • SSP spider silk fibroin
  • the pH of the protein aqueous solution obtained by adding the acetic acid aqueous solution to the dry cells of Escherichia coli expressing spider silk fibroin was adjusted to the pH of the aqueous solution of K 2 HPO 4 or Na 2 HPO 4 .
  • the supernatant of the sample obtained by raising by addition contains spider silk fibroin purified with high purity compared to the supernatant of the sample that did not raise the pH of the aqueous protein solution (see FIGS. 1 and 2). It was out.
  • K 2 HPO 4 aqueous solution sample pH of the protein solution was 5.2 by the addition of (lane 4), 3.4,3.8 the pH of the aqueous protein solution by addition of K 2 HPO 4 aqueous solution, or 4.4 Compared with the samples (lanes 1 to 3), the amount of spider silk fibroin contained in the precipitate tends to increase and the amount of purification tends to decrease.
  • ⁇ Test Example 3> In order to confirm the relationship between the pH value and the purified amount of spider silk fibroin in more detail, a purification test for the spider silk polypeptide was performed in the same manner as in Test Example 1 while changing the concentrations of the aqueous acetic acid solution and the aqueous NaOH solution. The resulting sample precipitate was analyzed by SDS-PAGE. Table 5 shows combinations of acetic acid concentration and NaOH aqueous solution concentration, and pH of the protein aqueous solution of each sample after pH adjustment.
  • FIG. 5 is a photograph showing an analysis result by SDS-PAGE of a precipitate of a sample obtained using a 5M (30% by mass) acetic acid aqueous solution and an NaOH aqueous solution.
  • FIG. 6 is a photograph showing the results of SDS-PAGE analysis of a sample precipitate obtained using an 8.7 M (50% by mass) aqueous acetic acid solution and an aqueous NaOH solution.
  • FIG. 7 is a photograph showing the result of SDS-PAGE analysis of a sample precipitate obtained using a 12.2M (70% by mass) acetic acid aqueous solution and an NaOH aqueous solution.
  • ⁇ Test Example 4 Influence of temperature> 50 mg each of dried Escherichia coli cells expressing spider silk fibroin was put into a plurality of Eppendorf tubes, and 1 mL of an 8.7 M (50% by mass) acetic acid aqueous solution was added thereto. Next, the Eppendle tube was stirred for 30 minutes while being heated to 30 ° C., 40 ° C., 50 ° C., 60 ° C., 70 ° C., or 80 ° C. with a heat block shaker. The others were subjected to a purification test in the same manner as in Test Example 1, and the supernatant and the precipitate collected from each sample obtained were analyzed by the SDS-PAGE method.
  • FIG. 8 is a photograph showing the results of SDS-PAGE analysis of the supernatant and precipitate obtained from the protein aqueous solution.
  • FIG. 8 shows that the purification purity tends to increase as the temperature of the aqueous acetic acid solution increases.
  • ⁇ Test Example 5 Effect of concentration of aqueous acetic acid solution> Concentration is 2.6 mol / L (15 mass%), 5.2 mol / L (30 mass%), 8.7 mol / L (50 mass%), 12.2 mol / L (70 mass%) or 15 mol / L ( 87% by mass) of acetic acid aqueous solution was used to conduct a purification test for spider silk fibroin in the same manner as in Test Example 1. The supernatant and the precipitate collected from the obtained sample were analyzed by SDS-PAGE.
  • FIG. 9 is a photograph showing the results of SDS-PAGE analysis of the supernatant and precipitate obtained from the aqueous protein solution. From FIG. 9, when the acetic acid concentration exceeds 5.2 mol / L (30% by mass) and is less than 15 mol / L (85% by mass), the purification purity tends to be particularly high.

Abstract

目的タンパク質、夾雑物及び酸性化合物とこれらが溶解している水とを含有する酸性のタンパク質水溶液のｐＨを上昇させ、それによって夾雑物を含む沈殿物を析出させる工程と、析出した沈殿物と目的タンパク質を含む上清とを分離する工程と、を備える、精製されたタンパク質を製造する方法が開示される。

Description

精製されたタンパク質を製造する方法
　本発明は、精製されたタンパク質を製造する方法に関する。
　従来、目的タンパク質を精製する各種の方法が知られている。例えば、タンパク質の一種であるクモ糸フィブロインの精製方法として、ヘキサフルオロ－２－プロパノール（ＨＦＩＰ）を用いる方法（非特許文献１）、有機酸を含む溶媒を用いる方法（特許文献１）、及び、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を用いる方法（特許文献２）が検討されている。
特表２００４－５０３２０４号公報 特許第５４２７３２２号公報
Macromolecules, 31:6733(1998)
　有機酸を含む溶媒を用いる方法は、比較的安価な材料及び設備を用いて実施可能で、精製操作が簡便という利点を有している。しかし、この方法では十分に高い純度までタンパク質を精製することが困難であった。
　そこで、本発明の一側面の目的は、高い純度で精製されたタンパク質を簡便に製造できる方法を提供することにある。
　本発明の一側面は、目的タンパク質、夾雑物及び酸とこれらが溶解している水とを含有する酸性のタンパク質水溶液のｐＨを上昇させ、それによって夾雑物を含む沈殿物を析出させる工程と、析出した沈殿物と目的タンパク質を含む上清とを分離する工程と、を備える、精製されたタンパク質を製造する方法を提供する。
　この方法によれば、高い純度で精製されたタンパク質を簡便に製造することができる。
　本発明の一側面によれば、高い純度で精製されたタンパク質を簡便に製造することができる。
試験例１で検討した、タンパク質水溶液から得た上清のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析の結果を示す写真である。 試験例１で検討した、タンパク質水溶液から得た沈殿物のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析の結果を示す写真である。 試験例２で検討した、タンパク質水溶液から得た上清のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析の結果を示す写真である。 試験例２で検討した、タンパク質水溶液から得た沈殿物のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析の結果を示す写真である。 試験例３で検討した、タンパク質水溶液から得た沈殿物のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析の結果を示す写真である。 試験例３で検討した、タンパク質水溶液から得た沈殿物のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析の結果を示す写真である。 試験例３で検討した、タンパク質水溶液から得た沈殿物のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析の結果を示す写真である。 試験例４で検討した、タンパク質水溶液から得た上清及び沈殿物のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析の結果を示す写真である。 試験例５で検討した、タンパク質水溶液から得た上清及び沈殿物のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析の結果を示す写真である。
　以下、本発明のいくつかの実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
　精製されたタンパク質を製造する方法の一実施形態は、目的タンパク質及び夾雑物とこれらが溶解している水とを含有する酸性のタンパク質水溶液のｐＨを上昇させ、それによって夾雑物を含む沈殿物を析出させる工程と、析出した沈殿物と目的タンパク質を含む上清とを分離する工程と、を備える。
　この方法によれば、精製すべき目的タンパク質と、目的タンパク質以外の夾雑物とを含む粗原料から、夾雑物の大部分を除去して、精製された目的タンパク質を回収することができる。
＜目的タンパク質＞
　目的タンパク質の種類に制限はない。目的タンパク質は、遺伝子組換え技術により微生物等で製造されたものであってもよく、化学合成によって製造されたものであってもよい。あるいは、目的タンパク質は、天然原料から取得したタンパク質であってもよい。
　目的タンパク質は、特に、構造タンパク質であってもよい。構造タンパク質は、生体構造を構築する役割を有するタンパク質であり、酵素、ホルモン、抗体等の機能タンパク質とは異なる。構造タンパク質は、水溶液中でその立体構造を維持し易いため、水溶液のｐＨが変化したときに、凝集して沈殿物として析出し難いと考えられる。そのため、ｐＨの上昇をともなう本実施形態の方法は、構造タンパク質の精製のために特に適用し易い。
　構造タンパク質の例としては、フィブロイン、コラ－ゲン、レシリン、エラスチン及びケラチン等の天然型構造タンパク質を挙げることができる。構造タンパク質は、フィブロインあってもよい。フィブロインの例としては、昆虫又はクモが産生するフィブロインが挙げられる。
　昆虫が産生するフィブロインとしては、例えば、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ）、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍａｎｄａｒｉｎａ）、天蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ｙａｍａｍａｉ）、柞蚕（Ａｎｔｅｒａｅａ　ｐｅｒｎｙｉ）、楓蚕（Ｅｒｉｏｇｙｎａ　ｐｙｒｅｔｏｒｕｍ）、蓖蚕（Ｐｉｌｏｓａｍｉａ　Ｃｙｎｔｈｉａ　ｒｉｃｉｎｉ）、樗蚕（Ｓａｍｉａ　ｃｙｎｔｈｉａ）、栗虫（Ｃａｌｉｇｕｒａ　ｊａｐｏｎｉｃａ）、チュッサー蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ｍｙｌｉｔｔａ）、及びムガ蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ａｓｓａｍａ）等のカイコが産生する絹タンパク質（絹フィブロイン）、並びに、スズメバチ（Ｖｅｓｐａ　ｓｉｍｉｌｌｉｍａ　ｘａｎｔｈｏｐｔｅｒａ）の幼虫が吐出するホーネットシルクタンパク質が挙げられる。
　絹フィブロインは、天然若しくは家蚕の繭、又は中古若しくは廃棄のシルク生地を原料とし、フィブロインを覆うセリシン、及びその他の脂肪分等を除去して精製したものである。絹フィブロインは、精製したフィブロインを凍結乾燥して得られた粉末でってもよい。
　昆虫が産生するフィブロインのより具体的な例としては、カイコ・フィブロインＬ鎖（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ７６４３０（塩基配列）、ＡＡＡ２７８４０．１（アミノ酸配列））が挙げられる。
　クモは、最大７種類の絹糸腺を有しており、それらから互いに性質の異なるフィブロイン（クモ糸フィブロイン、又はスパイダーシルクタンパク質）を産生する。その例としては、大吐糸管しおり糸タンパク質、横糸タンパク質、及び小瓶状腺タンパク質が挙げられる。スパイダーシルクタンパク質は、その源泉の器官によって異なる形態を有しており、例えば、高い靭性を有する大瓶状スパイダータンパク質（ｍａｊｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭａＳｐ）、高度な伸長力を有する小瓶状スパイダータンパク質（ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭｉＳｐ）、並びに鞭状（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ（Ｆｌａｇ））、管状（ｔｕｂｕｌｉｆｏｒｍ）、集合（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）、ブドウ状（ａｃｉｎｉｆｏｒｍ）又はナシ状（ｐｙｒｉｆｏｒｍ）のスパイダーシルクタンパク質がある。
　クモ糸フィブロイン（又はスパイダーシルクタンパク質）を産生するクモとしては、例えば、オニグモ、ニワオニグモ、アカオニグモ、アオオニグモ及びマメオニグモ等のオニグモ属（Ａｒａｎｅｕｓ属）に属するクモ、ヤマシロオニグモ、イエオニグモ、ドヨウオニグモ及びサツマノミダマシ等のヒメオニグモ属（Ｎｅｏｓｃｏｎａ属）に属するクモ、コオニグモモドキ等のコオニグモモドキ属（Ｐｒｏｎｕｓ属）に属するクモ、トリノフンダマシ及びオオトリノフンダマシ等のトリノフンダマシ属（Ｃｙｒｔａｒａｃｈｎｅ属）に属するクモ、トゲグモ及びチブサトゲグモ等のトゲグモ属（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ属）に属するクモ、マメイタイセキグモ及びムツトゲイセキグモ等のイセキグモ属（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ属）に属するクモ、コガネグモ、コガタコガネグモ及びナガコガネグモ等のコガネグモ属（Ａｒｇｉｏｐｅ属）に属するクモ、キジロオヒキグモ等のオヒキグモ属（Ａｒａｃｈｎｕｒａ属）に属するクモ、ハツリグモ等のハツリグモ属（Ａｃｕｓｉｌａｓ属）に属するクモ、スズミグモ、キヌアミグモ及びハラビロスズミグモ等のスズミグモ属（Ｃｙｔｏｐｈｏｒａ属）に属するクモ、ゲホウグモ等のゲホウグモ属（Ｐｏｌｔｙｓ属）に属するクモ、ゴミグモ、ヨツデゴミグモ、マルゴミグモ及びカラスゴミグモ等のゴミグモ属（Ｃｙｃｌｏｓａ属）に属するクモ、及びヤマトカナエグモ等のカナエグモ属（Ｃｈｏｒｉｚｏｐｅｓ属）に属するクモ、並びにアシナガグモ科（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈｉｄａｅ科）に属するクモが挙げられる。
　クモ糸フィブロイン（又はスパイダーシルクタンパク質）を産生するアシナガグモ科のクモとしては、例えば、アシナガグモ、ヤサガタアシナガグモ、ハラビロアシダカグモ及びウロコアシナガグモ等のアシナガグモ属（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、オオシロカネグモ、チュウガタシロカネグモ及びコシロカネグモ等のシロカネグモ属（Ｌｅｕｃａｕｇｅ属）に属するクモ、ジョロウグモ及びオオジョロウグモ等のジョロウグモ属（Ｎｅｐｈｉｌａ属）に属するクモ、キンヨウグモ等のアズミグモ属（Ｍｅｎｏｓｉｒａ属）に属するクモ、ヒメアシナガグモ等のヒメアシナガグモ属（Ｄｙｓｃｈｉｒｉｏｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、クロゴケグモ、セアカゴケグモ、ハイイロゴケグモ及びジュウサンボシゴケグモ等のゴケグモ属（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ属）に属するクモ、及びユープロステノプス属（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ属）に属するクモ等のアシナガグモ科（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈｉｄａｅ科）に属するクモが挙げられる。
　スパイダーシルクタンパク質としては、例えば、ＭａＳｐ（ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２）、ＡＤＦ（ＡＤＦ３及びＡＤＦ４）等の牽引糸タンパク質、ＭｉＳｐ（ＭｉＳｐ１及びＭｉＳｐ２）等が挙げられる。
　クモが産生するクモ糸フィブロインのより具体的な例としては、例えば、ｆｉｂｒｏｉｎ－３（ａｄｆ－３）［Ａｒａｎｅｕｓ　ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１０（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５５（塩基配列））、ｆｉｂｒｏｉｎ－４（ａｄｆ－４）［Ａｒａｎｅｕｓ　ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１１（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ０４５０４（アミノ酸配列）、Ｕ３７５２０（塩基配列））、ｍａｊｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ　ｈｅｓｐｅｒｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ６８８５６（アミノ酸配列）、ＥＦ５９５２４６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　２［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖａｔａ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ３２４７２（アミノ酸配列）、ＡＦ４４１２４５（塩基配列））、ｍａｊｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ　ａｕｓｔｒａｌｉｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＪ００４２８（アミノ酸配列）、ＡＪ９７３１５５（塩基配列））、及びｍａｊｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　２［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ　ａｕｓｔｒａｌｉｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＭ３２２４９．１（アミノ酸配列）、ＡＭ４９０１６９（塩基配列））、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５８９．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５９１．１（アミノ酸配列））、及び、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ－ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｎｅｐｈｉｌｅｎｇｙｓ　ｃｒｕｅｎｔａｔａ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ３７２７８．１（アミノ酸配列）が挙げられる。
　天然由来のフィブロインのより具体的な例としては、更に、ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋに配列情報が登録されているフィブロインを挙げることができる。例えば、ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報のうちＤＩＶＩＳＩＯＮとしてＩＮＶを含む配列の中から、ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮにｓｐｉｄｒｏｉｎ、ａｍｐｕｌｌａｔｅ、ｆｉｂｒｏｉｎ、「ｓｉｌｋ及びｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」、又は「ｓｉｌｋ及びｐｒｏｔｅｉｎ」がキーワードとして記載されている配列、ＣＤＳから特定のｐｒｏｄｕｃｔの文字列、ＳＯＵＲＣＥからＴＩＳＳＵＥ　ＴＹＰＥに特定の文字列の記載された配列を抽出することにより確認することができる。
　目的タンパク質は、以上例示した天然型タンパク質に由来するポリペプチド、すなわち人造ポリペプチドであってもよい。例えば、人造ポリペプチドたる組換えフィブロインは、いくつかの異種タンパク質生産系で産生されており、その製造方法として、トランスジェニック・ヤギ、トランスジェニック・カイコ、又は組換え植物若しくは哺乳類細胞が利用されている。
　組換えフィブロインは、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列、又は天然由来のフィブロインのアミノ酸配列に１若しくは複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／若しくは付加したものであってもよい。このように改変されたアミノ酸配列を設計し、それをコードする核酸を化学合成することにより、組換えフィブロインを得ることもできる。
　クモ糸フィブロインの一種である大吐糸管しおり糸タンパク質の組換えポリペプチドは、例えば、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質が挙げられる。ここで、（Ａ）ｎモチーフは、アラニン残基を主とするアミノ酸配列を示し、ｎは２～２７の整数である。ｎは、２～２０、４～２７、４～２０、８～２０、１０～２０、４～１６、８～１６、又は１０～１６の整数であってよい。（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は４０％以上であればよく、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、９０％以上、又は９５％以上であってもよく、１００％（（Ａ）ｎモチーフがアラニン残基のみで構成されることを意味する。）であってもよい。式１又は２で表されるドメイン配列中に複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、少なくとも７つがアラニン残基のみで構成されてもよい。ＲＥＰは２～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ＲＥＰは、１０～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列であってもよい。ｍは２～３００の整数を示し、１０～３００の整数であってもよい。式１又は２で表されるドメイン配列中に複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。式１又は２で表されるドメイン配列中に複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。大吐糸管しおり糸由来のタンパク質の具体例としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。
横糸タンパク質に由来するタンパク質としては、例えば、式３：［ＲＥＰ２］ｏで表されるドメイン配列を含むタンパク質（式３中、ＲＥＰ２はＧｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｘから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘはアラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｅｒ）、チロシン（Ｔｙｒ）及びバリン（Ｖａｌ）からなる群から選ばれる一つのアミノ酸を示す。ｏは８～３００の整数を示す。）を挙げることができる。横糸タンパク質に由来するタンパク質の具体例としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号２で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分的な配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＦ３６０９０、ＧＩ：７１０６２２４）のリピート部分及びモチーフに該当する、Ｎ末端から１２２０残基目から１６５９残基目までのアミノ酸配列（ＰＲ１配列と記す。）と、ＮＣＢＩデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＣ３８８４７、ＧＩ：２８３３６４９）のＣ末端から８１６残基目から９０７残基目までのＣ末端アミノ酸配列とを結合し、結合した配列のＮ末端に配列番号６で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
　コラーゲンの組換えポリペプチドとして、例えば、式４：［ＲＥＰ３］ｐで表されるドメイン配列を含むタンパク質（式４中、ｐは５～３００の整数を示す。ＲＥＰ３は、Ｇｌｙ一Ｘ一Ｙから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘ及びＹはＧｌｙ以外の任意のアミノ酸残基を示す。複数存在するＲＥＰ３は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。コラーゲンの組換えポリペプチドの具体例としては、配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号３で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したヒトのコラーゲンタイプ４の部分的な配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号：ＣＡＡ５６３３５．１、ＧＩ：３７０２４５２）のリピート部分及びモチーフに該当する、３０１残基目から５４０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に、配列番号６で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
　レシリンの組換えポリペプチドとして、例えば、式５：［ＲＥＰ４］ｑで表されるドメイン配列を含むタンパク質（式５中、ｑは４～３００の整数を示す。ＲＥＰ４はＳｅｒ一Ｊ一Ｊ一Ｔｙｒ一Ｇｌｙ一Ｕ－Ｐｒｏから構成されるアミノ酸配列を示す。Ｊは任意のアミノ酸残基を示し、特にＡｓｐ、Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であってもよい。Ｕは任意のアミノ酸残基を示し、特にＰｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ及びＳｅｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であってもよい。複数存在するＲＥＰ３は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。レシリンの組換えポリペプチドの具体例としては、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号４で示されるアミノ酸配列は、レシリン（ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＰ　６１１１５７、Ｇｌ：２４６５４２４３）のアミノ酸配列において、８７残基目のＴｈｒをＳｅｒに置換し、かつ９５残基目のＡｓｎをＡｓｐに置換した配列の１９残基目から３２１残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号６で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
　エラスチンの組換えポリペプチドとして、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５（ヒト）、Ｉ４７０７６（ヒツジ）、ＮＰ７８６９６６（ウシ）等のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。エラスチンの組換えポリペプチドの具体例としては、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号５で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５のアミノ酸配列の１２１残基目から３９０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号６で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
　目的タンパク質としての組換えポリペプチドは、以上例示した組換えポリペプチドのアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドであってもよい。
　組換えポリペプチドは、Ｎ末端又はＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、組換えフィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
　タグ配列として、例えば、他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用したアフィニティタグを挙げることができる。アフィニティタグの具体例として、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を挙げることができる。Ｈｉｓタグは、ヒスチジン残基が４から１０個程度並んだ短いペプチドであり、ニッケル等の金属イオンと特異的に結合する性質があるため、金属キレートクロマトグラフィー（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　ｍｅｔａｌ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による組換えフィブロインの単離に利用することができる。タグ配列の具体例として、例えば、配列番号６で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグを含むアミノ酸配列）が挙げられる。
　グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列を利用することもできる。
　抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用することもできる。抗原性を示すペプチド（エピトープ）をタグ配列として付加することにより、当該エピトープに対する抗体を結合させることができる。エピトープタグの例として、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列）タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等を挙げることができる。エピトープタグを利用することにより、高い特異性で容易に組換えフィブロインを精製することができる。
　特定のプロテアーゼで切り離すことが可能なタグ配列も使用することができる。このタグ配列を介して吸着したタンパク質をプロテアーゼ処理することにより、タグ配列を切り離した組換えフィブロインを回収することもできる。
＜タンパク質水溶液＞
　一実施形態に係るタンパク質水溶液は、目的タンパク質及び夾雑物とこれらが溶解している水とを含有する酸性の水溶液である。タンパク質水溶液は、目的タンパク質を産生した培養物等に由来する不溶物を含んでいてもよいし、不溶物を含む粗原料から遠心分離等によって回収した上清から調製されたものであってもよい。
　タンパク質水溶液は、例えば、目的タンパク質及び夾雑物を含む粗原料と酸性化合物を含む酸水溶液とを混合し、得られた混合物中で酸水溶液に目的タンパク質を溶解させて、作製される。
　酸性化合物は、水に溶解して酸性の水溶液を形成する化合物である。この酸性化合物及びこれを含む酸水溶液は、粗原料に含まれる目的タンパク質を溶解可能なものであれば、その種類が特に限定されるものではなく、原料に含まれるタンパク質の種類に応じて、適宜に決定される。例えば、タンパク質がクモ糸フィブロインである場合には、酸水溶液が含む酸性化合物は、カルボン酸等の有機酸であってもよい。カルボン酸は、例えば酢酸、ギ酸、及びプロピオン酸からなる群より選ばれる少なくとも１種であってもよい。クモ糸フィブロインは、酸性化合物としてカルボン酸を含む酸水溶液に対して高い溶解度を有する傾向があるため、カルボン酸を用いることにより、高濃度のタンパク質水溶液が得られ易い。
　酸水溶液又はタンパク質水溶液は、目的タンパク質が溶解可能な範囲で、水と相溶性のあるその他の溶媒を含んでいてもよい。その他の溶媒としては、例えば、メチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン（ＤＭＩ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ヘキサメチルリン酸トリアミド（ＨＭＰＡ）、アセトン、トリクロロ酢酸、アセトニトリル、炭酸ブチレン、炭酸プロピレン、炭酸エチレン、ブチロラクトン、テトラヒドロフラン、及びアルコール（メタノール、エタノール、プロパノールなど）が挙げられる。
　酸水溶液の酸性化合物の濃度も何等限定されるものではなく、原料に含まれる目的たんぱく質の種類、及び酸の種類等に応じて適宜に決定される。例えば、タンパク質水溶液（特に、クモ糸フィブロイン水溶液）を作製するためにカルボン酸（特に、モノカルボン酸）が用いられる場合、カルボン酸水溶液の濃度は、カルボン酸水溶液の体積を基準として、５．０ｍｏｌ／Ｌ以上１５．０ｍｏｌ／Ｌ以下であってもよい。カルボン酸水溶液の濃度が５．０ｍｏｌ／Ｌ未満である、又は１５．０ｍｏｌ／Ｌを超えると、カルボン酸水溶液への目的タンパク質の溶解量が小さくなって、精製効率が相対的に低下する可能性がある。同様の観点から、カルボン酸水溶液の濃度は５．２ｍｏｌ／Ｌを超えて１５ｍｏｌ／Ｌ未満、５．２ｍｏｌ／Ｌを超えて１３．１ｍｏｌ／Ｌ以下、又は８．７以上１２．２ｍｏｌ／Ｌ以下であってもよい。
　タンパク質水溶液を作製する際、酸水溶液、又は酸水溶液と粗原料との混合物に対して、無機塩を添加してもよい。この無機塩は、タンパク質水溶液におけるタンパク質の溶解度（酸水溶液に対するタンパク質の溶解量）を向上させ得る。すなわち、無機塩を、タンパク質の溶解促進剤として利用することができる。
　溶解促進剤として用いられ得る無機塩としては、例えば、アルカリ金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属硝酸塩、及びチオシアン酸塩が挙げられる。より具体的には、無機塩は、例えば、リン酸アルミニウム、炭酸リチウム、炭酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、フッ化アルミニウム、酢酸第二鉄、酢酸アルミニウム、水酸化亜鉛、水酸化マグネシウム、水酸化第一鉄、水酸化マンガン、水酸化クロム、水酸化第二鉄、水酸化アルミニウム、塩化ニッケル、塩化コバルト、塩化亜鉛、塩化第一鉄、塩化マンガン、塩化クロム、塩化第二鉄、塩化アルミニウム、硝酸リチウム、硝酸ストロンチウム、硝酸ニッケル、硝酸カルシウム、硝酸コバルト、硝酸亜鉛、硝酸マグネシウム、硝酸第一鉄、硝酸マンガン、硝酸クロム、硝酸第二鉄、硝酸アルミニウム、臭化リチウム、臭化バリウム、臭化ストロンチウム、臭化ニッケル、臭化カルシウム、臭化コバルト、臭化亜鉛、臭化マグネシウム、臭化第一鉄、臭化マンガン、臭化クロム、臭化第二鉄、臭化アルミニウム、塩素酸バリウム、塩素酸ストロンチウム、塩素酸ニッケル、塩素酸カルシウム、塩素酸コバルト、塩素酸亜鉛、塩素酸マグネシウム、塩素酸第一鉄、塩素酸マンガン、塩素酸クロム、塩素酸第二鉄、塩素酸アルミニウム、ヨウ化ルビジウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化銅、ヨウ化リチウム、ヨウ化バリウム、ヨウ化ストロンチウム、ヨウ化ニッケル、ヨウ化カルシウム、ヨウ化コバルト、ヨウ化亜鉛、ヨウ化マグネシウム、ヨウ化第一鉄、ヨウ化マンガン、ヨウ化クロム、ヨウ化第二鉄、ヨウ化アルミニウム、過塩素酸ナトリウム、過塩素酸鉛、過塩素酸銅、過塩素酸リチウム、過塩素酸バリウム、過塩素酸ストロンチウム、過塩素酸ニッケル、過塩素酸カルシウム、過塩素酸コバルト、過塩素酸亜鉛、過塩素酸マグネシウム、過塩素酸第一鉄、過塩素酸マンガン、過塩素酸クロム、過塩素酸第二鉄、過塩素酸アルミニウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸鉛、チオシアン酸銅、チオシアン酸リチウム、チオシアン酸バリウム、チオシアン酸ストロンチウム、チオシアン酸ニッケル、チオシアン酸カルシウム、チオシアン酸コバルト、チオシアン酸亜鉛、チオシアン酸マグネシウム、チオシアン酸第一鉄、チオシアン酸マンガン、チオシアン酸クロム、チオシアン酸第二鉄、チオシアン酸アルミニウム、シアン酸アンモニウム、シアン酸セシウム、シアン酸ルビジウム、シアン酸カリウム、シアン酸ナトリウム、シアン酸鉛、シアン酸銅、シアン酸リチウム、シアン酸バリウム、シアン酸ストロンチウム、シアン酸ニッケル、シアン酸カルシウム、シアン酸コバルト、シアン酸亜鉛、シアン酸マグネシウム、シアン酸第一鉄、シアン酸マンガン、シアン酸クロム、シアン酸第二鉄、及びシアン酸アルミニウムからなる群より選ばれる少なくとも１種であってもよい。
　酸水溶液、又は酸水溶液と粗原料との混合物への無機塩の添加量は、特に限定されるものではなく、無機塩の種類、目的タンパク質の量等に応じて適宜に決定される。
　粗原料及び酸水溶液を含有する混合物を加温しながら、目的タンパク質及び夾雑物を酸水溶液に溶解させて、酸性のタンパク質水溶液を作製してもよい。これによって、原料中のタンパク質の酸水溶液への溶解量が向上し、より効率的に目的タンパク質が原料中から精製され得る。酸水溶液を加温した後、加温された酸水溶液を粗原料と混合してもよいし、酸水溶液と粗原料を混合してから、混合物を加温してもよい。または、酸水溶液を、粗原料と混合する前から混合後に亘って継続的に加温してもよい。
　加温のための温度制御の方法は、何等限定されない。例えば、所定の温度に到達した後に、その温度に一定に維持してもよいし、予め定めた温度範囲の間での変動が許容される状態で温度制御してもよい。酸水溶液又は混合物の加温は、原料中のタンパク質が酸水溶液中に均一に溶解するまで行ってもよい。酸性のタンパク質水溶液を調製した後、最終的に得られる精製されたタンパク質水溶液を、紡糸、フィルム形成その他の成形のためのドープ液として用いる場合、精製から成形まで、タンパク質水溶液を加温し続けてもよい。この場合、温度は一定の同じ温度に保たれてもよいし、タンパク質が酸水溶液に均一に溶解した後、より低い温度又は高い温度で水溶液を保温してもよい。
　酸水溶液又はこれを含む混合物を加温する温度の範囲は、特に限定されるものではないが、加温による効果をより確実に得ると共に、最終的に得られるタンパク質の品質低下を防ぐために、室温（２５℃）より高く、且つタンパク質の変性温度又は酸水溶液の沸点より低くてもよい。タンパク質の変性温度が酸水溶液の沸点を超える場合には、作業性や取扱い性の面からして、酸水溶液又はこれを含む混合物を加温する温度は、酸水溶液の沸点よりも低いことが望ましい。酸水溶液又はこれを含む混合物を加温する温度は、具体的には３０～８０℃であってもよい。酸水溶液又はこれを含む混合物を加温する温度の下限は、約３０℃、約３６℃、約３８℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、又は約６０℃であってもよい。酸水溶液又はこれを含む混合物を加温する温度の上限は、例えば、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、又は約８０℃であってもよい。これら下限及び上限は任意に組み合わされる。本明細書において、「約」を付した温度の数値は、その数値の９０％から１１０％までの範囲の数値を意味する。例えば、約４０℃とは、３６℃～４４℃をいう。同様に、約６０℃とは、５４℃～６６℃をいう。ここでの温度は、常圧での温度である。ここで常圧とは、純水の沸点が約９５℃～１０５℃である気圧をいう。酸水溶液又はこれを含む混合物を加温する方法は、特に限定されず、通常の方法が何れも採用可能である。
＜ｐＨ上昇操作＞
　目的タンパク質及び夾雑物を含む酸性のタンパク質水溶液のｐＨを上昇さることによって、タンパク質水溶液中の目的タンパク質以外の溶解成分（夾雑物）を含む沈殿物を析出させる。析出した沈殿物と目的タンパク質を含む上清とを分離することによって、精製された目的タンパク質を含むタンパク質水溶液を得ることができる。
　タンパク質水溶液のｐＨを上昇させる方法は、特に限定されない。例えば、タンパク質水溶液に塩基性化合物、水、ｐＨ緩衝剤、又はその他のｐＨ調整剤を加える方法によって、ｐＨを上昇させることができる。必要に応じて、タンパク質水溶液のｐＨを上昇させる前に、タンパク質水溶液中の沈殿物（不溶性残渣）を除去してもよい。その際には、遠心分離等の通常の方法が適宜に採用される。
　酸性のタンパク質水溶液のｐＨを上昇させる幅は、タンパク質水溶液から目的タンパク質以外の夾雑物が析出するように、調整される。タンパク質水溶液のｐＨの上昇幅は、２．８未満、２．６以下、又は２．３以下であってもよい。上昇後のｐＨの上限値は、例えば、タンパク質水溶液を調製するために用いられた酸水溶液の種類等によっても適宜に決定される。例えば、タンパク質水溶液のｐＨを、４．８未満、４．６以下、又は４．３以下まで上昇させてもよい。これらのｐＨの範囲は、酸水溶液がカルボン酸水溶液である場合に、特に適用され易い。
　ｐＨを上昇させるためにタンパク質水溶液に添加され得る塩基性化合物の種類は、特に限定されない。塩基性化合物は、例えば、ＮａＯＨ、Ｋ２ＨＰＯ４、及びＮａ２ＨＰＯ４からなる群より選ばれる少なくとも１種であってもよい。これらの塩基性化合物を用いることによって、目的タンパク質が、より一層高い精製純度で得られ易い傾向がある。
　塩基性化合物をタンパク質水溶液に添加してタンパク質水溶液のｐＨを上昇させる場合、その添加量は、目的タンパク質の析出を出来るだけ抑制しながら、その他の夾雑物が析出するような範囲に調整される。例えば、塩基性化合物のタンパク質水溶液への添加量は、タンパク質水溶液における酸の濃度に応じて決定することができる。具体的には、添加される塩基性化合物の塩基当量Ｃ１と酸の酸当量Ｃ２との比：Ｃ１／Ｃ２が、０．５５未満であってもよい。この比Ｃ１／Ｃ２が０．５５以上であると、目的タンパク質が徐々に析出し易くなる可能性がある。同様の観点から、比Ｃ１／Ｃ２は、０．５以下、又は０．４５以下であってもよい。比Ｃ１／Ｃ２が過度に小さいと、夾雑物の析出量が小さくなり、その結果、最終的な目的タンパク質の純度が低下する可能性がある。そのため、比Ｃ１／Ｃ２は、０．０４以上であってもよい。
＜目的タンパク質を含む上清の分離＞
　沈殿物の析出の後、沈殿物と目的タンパク質を含む上清とが分離される。分離の方法は、特に限定されるものではなく、例えば、遠心分離又は濾過等の通常の方法によって、沈殿物と分離した上清を回収することができる。得られた上清から目的タンパク質を析出させ、固形の目的タンパク質を回収してもよい。回収された上清を、例えば繊維やフィルム、ゲル、スポンジ等の各種の成形体を成形するためのドープ液等として、そのまま利用することも可能である。本明細書において、「上清」の用語は、沈殿物以外の清澄部分を意味する用語として用いられ、遠心分離等によって形成される清澄液だけでなく、濾過によって回収される濾液も含む。上清が微量の沈殿物を含むこともあり得る。
＜目的タンパク質の製造＞
　目的タンパク質及び夾雑物は、遺伝子組み換え技術によって目的タンパク質を産生した宿主細胞を含む培養物から取り出されたものであってもよい。言い換えると、一実施形態に係るタンパク質を製造する方法は、培養物中で宿主細胞に目的タンパク質を産生させる工程と、培養物から目的タンパク質及び夾雑物を含む粗原料を得る工程と、粗原料と酸水溶液とを混合して、酸性のタンパク質水溶液を得る工程とを含んでいてもよい。この場合、目的タンパク質は、例えば、当該タンパク質をコードする核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する発現ベクターで形質転換された宿主細胞により、当該核酸を発現させることにより生産することができる。
　タンパク質をコードする遺伝子の製造方法は特に制限されない。例えば、天然の構造タンパク質をコードする遺伝子を利用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅しクローニングする方法、又は、化学的な合成によって、遺伝子を製造することができる。遺伝子の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどより入手した構造タンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ　１０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結する方法によって遺伝子を化学的に合成することができる。この際に、タンパク質の精製や確認を容易にするため、上記のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を合成してもよい。
　調節配列は、宿主における組換えタンパク質の発現を制御する配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等）であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。プロモーターとして、宿主細胞中で機能し、目的とするタンパク質を発現誘導可能な誘導性プロモーターを用いてもよい。誘導性プロモーターは、誘導物質（発現誘導剤）の存在、リプレッサー分子の非存在、又は温度、浸透圧若しくはｐＨ値の上昇若しくは低下等の物理的要因により、転写を制御できるプロモーターである。
　発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主の染色体中への組込みが可能で、目的とするタンパク質をコードする核酸を転写できる位置にプロモーターを含有していてもよい。
　宿主として、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも用いることができる。
　原核生物の例として、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する細菌を挙げることができる。
　タンパク質をコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２（ベーリンガーマンハイム社製）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＣｏｌｄ、ｐＵＢ１１０、ｐＮＣＯ２（特開２００２－２３８５６９号公報）等を挙げることができる。
　真核生物の宿主としては、例えば、酵母及び糸状真菌（カビ等）を挙げることができる。
　酵母としては、例えば、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属等に属する酵母を挙げることができる。糸状真菌としては、例えば、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属等に属する糸状真菌を挙げることができる。
　ベクターとしては、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）等を挙げることができる。
　宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，６９，２１１０　（１９７２）〕、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、コンピテント法を挙げることができる。
　発現ベクターで形質転換された宿主による核酸の発現方法としては、直接発現のほか、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
　タンパク質は、例えば、発現ベクターで形質転換された宿主を培養培地中で培養し、培養培地中に当該タンパク質を生成蓄積させ、該培養培地から採取することにより製造することができる。宿主を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。
　宿主が大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、宿主の培養培地として、宿主が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有し、宿主の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
　炭素源としては、宿主が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類を用いることができる。
　窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。
　無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。
　大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物の培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は、例えば、１５～４０℃である。培養時間は、通常１６時間～７日間である。培養中の培養培地のｐＨは３．０～９．０に保持してもよい。培養培地のｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。
　培養中、必要に応じて、アンピシリン及びテトラサイクリン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
　目的タンパク質を産生した培養物から取り出した粗原料を用いて、上述の酸性のタンパク質水溶液を作製することができる。例えば、目的タンパク質が細胞内に産生した場合、培養終了後、遠心分離等によって回収された粗原料としての宿主細胞と、酸水溶液とを混合して、タンパク質水溶液を得ることができる。タンパク質が細胞内で不溶体を形成している場合、これを蛋白質変性剤で可溶化してもよい。目的タンパク質が細胞外に分泌された場合、粗原料としての培養上清と酸水溶液とを混合して、タンパク質水溶液を得ることができる。
　以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
１．クモ糸フィブロインをコードする遺伝子の合成、及びクモ糸フィブロインの発現
　ネフィラ・クラビペス（Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ）由来のクモ糸フィブロイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する改変クモ糸フィブロイン（以下、「ＰＲＴ４１０」ともいう。）を設計した。
　配列番号１で示されるアミノ酸配列は、ネフィラ・クラビペス由来のクモ糸フィブロインのアミノ酸配列に対して、生産性の向上を目的としてアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を施したアミノ酸配列と、そのＮ末端に付加された配列番号６で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）とを有する。
　設計したＰＲＴ４１０をコードする核酸を合成した。当該核酸には、５’末端にＮｄｅＩサイト及び終止コドン下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した。当該核酸をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。その後、同核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した後、タンパク質発現ベクターｐＥＴ－２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。
　得られたｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターによって、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。当該形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。当該培養液を、アンピシリンを含む１００ｍＬのシード培養用培地（表１）にＯＤ６００が０．００５となるように添加した。培養液温度を３０℃に保ち、ＯＤ６００が５になるまで約１５時間、フラスコ培養を行って、シード培養液を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　当該シード培養液を５００ｍｌの生産培地（表２）を添加したジャーファーメンターにＯＤ６００が０．０５となるように添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ　１２０ｇ／１Ｌ）を１ｍｌ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持しながら、２０時間培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、目的のクモ糸フィブロインを発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。回収した菌体を乾燥して、クモ糸フィブロインを発現する大腸菌の乾燥菌体を所定量得た。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）法によって分析し、ＩＰＴＧ添加に依存した目的とするクモ糸フィブロインサイズのバンドの出現により、目的とするクモ糸フィブロインの発現を確認した。
２．タンパク質の精製試験
＜試験例１＞
　上記のようにして得られた、クモ糸フィブロインを発現している大腸菌の乾燥菌体を５つのエッペンドルチューブに５０ｍｇずつ投入し、それら５つのエッペンドルチューブ内に８．７Ｍ（５０質量％）の酢酸水溶液を１ｍＬずつ加えた。次いで、エッペンドルチューブを、ヒートブロックシェイカーで６０℃に加温しながら３０分間撹拌した。その後、各エッペンドルチューブ内のサンプルの遠心分離を１１，０００×ｇ、２０℃、１０分間の条件で実施し、上清（酸性のタンパク質水溶液）と沈殿物とを回収した。さらに、５つのエッペンドルチューブのうちの４つから、上清を１００μＬずつ、新たな４つのエッペンドルフチューブにそれぞれ分注した。この時点の上清（酸性のタンパク質水溶液）のｐＨは２．０３であった。上清（酸性のタンパク質水溶液）が入った３つのエッペンドルフチューブそれぞれに、濃度０．５Ｍ、１Ｍ又は２ＭのＮａＯＨ水溶液を１００μＬ加えて混合し、上清（酸性のタンパク質水溶液）のｐＨを上昇させた。残りの１つのエッペンドルチューブに、逆浸透膜で精製された水（ＲＯ水）を１００μＬ加えて混合し、上清（酸性のタンパク質水溶液）のｐＨを上昇させた。その後、１１，０００×ｇ、２０℃、１０分間の条件で各エッペンドルチューブ内のサンプルの遠心分離を実施し、上清及び沈殿物を回収した。表３は、ＮａＯＨ水溶液又はＲＯ水の添加によりｐＨを調整した後の各サンプルのｐＨと、調整前からのｐＨの上昇幅を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　各サンプルから回収した上清及び沈殿物を、それぞれ、常法に従って、２－メルカプトエタノールを含むサンプルバッファーと混合して煮沸還元した。その後、各上清のサンプルバッファーに対してそのままＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により電気泳動を行った。また、各沈殿物のサンプルに対して更に遠心分離を行って上清を分離した後、残った沈殿物についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により電気泳動を行った。電気泳動後のゲルはｏｒｉｏｌｅ染色して、蛍光により各サンプルの泳動パターンを電気泳動図として写真に記録した。ＮａＯＨ水溶液又はＲＯ水を加えていない１つのエッペンドルチューブ内からも上清及び沈殿物を回収し、それら上清と沈殿物に対して上記と同様にして電気泳動を行い、それらの泳動パターンを電気泳動図として写真を記録した。
　図１は、上清のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析結果を示す写真であり、図２は、沈殿物のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析結果を示す写真である。図１及び図２において、レーン１は０．５Ｍ　ＮａＯＨ、レーン２は１Ｍ　ＮａＯＨ、レーン３は２Ｍ　ＮａＯＨ、レーン４はＲＯ水によってタンパク質水溶液のｐＨを上昇させたサンプルであり、レーン５はＮａＯＨ水溶液又はＲＯ水をタンパク質水溶液に加えていないサンプルであり、レーン６は別途準備した精製クモ糸フィブロイン（ＳＳＰ）である。ＸＬ　Ｌａｄｄｅｒは市販の分子量マーカー（株式会社アプロサイエンス製）を示す（図２～９も同様）。
　図１及び図２から明らかなように、クモ糸フィブロインを発現している大腸菌の乾燥菌体に酢酸水溶液を加えて得たタンパク質水溶液のｐＨを、ＮａＯＨ水溶液又はＲＯ水の添加により上昇させて得たサンプルは、タンパク質水溶液のｐＨを上昇させなかったサンプルと比較して、高い純度で精製されたクモ糸フィブロインを含んでいた。
＜試験例２＞
　ＮａＯＨ水溶液の代わりに、濃度０．５Ｍ、１Ｍ、２Ｍ若しくは５ＭのＫ２ＨＰＯ４水溶液、又は、濃度０．５ＭのＮａ２ＨＰＯ４水溶液を用いて酸性のタンパク質水溶液（上清）のｐＨを上昇させたこと以外は試験例１と同様にして、クモ糸フィブロインの精製試験を行った。表４は、Ｋ２ＨＰＯ４水溶液又はＮａ２ＰＯ４水溶液の添加によりｐＨを上昇させた後の各タンパク質水溶液のｐＨと、調整前からのｐＨの上昇幅を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　試験例１と同様に、各サンプルから回収した上清及び沈殿物を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により分析した。図３は、Ｋ２ＨＰＯ４水溶液を用いたサンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析結果を示す写真であり、図４は、Ｎａ２ＨＰＯ４水溶液を用いたサンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析結果を示す写真である。図３において、レーン１は０．５ＭのＫ２ＨＰＯ４水溶液、レーン２は１Ｍ　Ｋ２ＨＰＯ４水溶液、レーン３は２Ｍ　Ｋ２ＨＰＯ４水溶液、レーン４は５ＭのＫ２ＨＰＯ４水溶液によってタンパク質水溶液のｐＨを上昇させたサンプルの上清であり、レーン５は０．５ＭのＫ２ＨＰＯ４水溶液、レーン６は１Ｍ　Ｋ２ＨＰＯ４水溶液、レーン７は２Ｍ　Ｋ２ＨＰＯ４水溶液、レーン８は５ＭのＫ２ＨＰＯ４水溶液によってタンパク質水溶液のｐＨを上昇させたサンプルの沈殿物であり、レーン９は別途準備した精製クモ糸フィブロイン（ＳＳＰ）である。図４において、レーン１は０．５ＭのＮａ２ＨＰＯ４水溶液によってタンパク質水溶液のｐＨを上昇させたサンプルの上清であり、レーン２は０．５ＭのＮａ２ＨＰＯ４水溶液によってタンパク質水溶液のｐＨを上昇させたサンプルの沈殿物であり、レーン３は別途準備した精製クモ糸フィブロイン（ＳＳＰ）である。
　図３及び図４から明らかなように、クモ糸フィブロインを発現している大腸菌の乾燥菌体に酢酸水溶液を加えて得たタンパク質水溶液のｐＨを、Ｋ２ＨＰＯ４水溶液又はＮａ２ＨＰＯ４水溶液の添加により上昇させて得たサンプルの上清は、タンパク質水溶液のｐＨを上昇させなかったサンプルの上清（図１及び図２参照）と比較して、高い純度で精製されたクモ糸フィブロインを含んでいた。Ｋ２ＨＰＯ４水溶液の添加によりタンパク質水溶液のｐＨを５．２としたサンプル（レーン４）は、Ｋ２ＨＰＯ４水溶液の添加によりタンパク質水溶液のｐＨを３．４、３．８、又は４．４としたサンプル（レーン１～３）と比較して、沈殿物に含まれるクモ糸フィブロインの量が多くなって精製量が少なくなる傾向が認められる。
＜試験例３＞
　ｐＨ値とクモ糸フィブロインの精製量との関係をより詳細に確認するために、酢酸水溶液及びＮａＯＨ水溶液の濃度を変えながら、試験例１と同様にしてクモ糸ポリペプチドの精製試験を行い、得られたサンプルの沈殿物をＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により分析した。表５は、酢酸濃度及びＮａＯＨ水溶液濃度の組み合わせと、ｐＨ調整後の各サンプルのタンパク質水溶液のｐＨを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　図５は５Ｍ（３０質量％）の酢酸水溶液及びＮａＯＨ水溶液を用いて得られたサンプルの沈殿物のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析結果を示す写真である。図６は８．７Ｍ（５０質量％）の酢酸水溶液及びＮａＯＨ水溶液を用いて得られたサンプルの沈殿物のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析結果を示す写真である。図７は１２．２Ｍ（７０質量％）の酢酸水溶液及びＮａＯＨ水溶液を用いて得られたサンプルの沈殿物のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析結果を示す写真である。
　表３及び図５～７の結果から、ＮａＯＨ水溶液の添加によってｐＨを上昇させた後のタンパク質水溶液のｐＨが４．８以上になると、沈殿物に含まれるクモ糸フィブロインの量が多くなって、精製量が少なくなる傾向があることが認められる。
＜試験例４：温度の影響＞
　クモ糸フィブロインを発現している大腸菌の乾燥菌体を複数のエッペンドルチューブに５０ｍｇずつ投入し、そこに８．７Ｍ（５０質量％）の酢酸水溶液を１ｍＬ加えた。次いで、エッペンドルチューブを、ヒートブロックシェイカーで３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、又は８０℃に加温しながら３０分間撹拌した。その他は試験例１と同様に精製試験を行い、得られた各サンプルから回収した上清及び沈殿物を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により分析した。
　図８は、タンパク質水溶液から得た上清及び沈殿物のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析の結果を示す写真である。図８から、タンパク質水溶液を調製する際の酢酸水溶液の温度が高くなると、精製純度が高くなる傾向が認められた。
＜試験例５：酢酸水溶液の濃度の影響＞
　濃度が２．６ｍｏｌ／Ｌ（１５質量％）、５．２ｍｏｌ／Ｌ（３０質量％）、８．７ｍｏｌ／Ｌ（５０質量％）、１２．２ｍｏｌ／Ｌ（７０質量％）又は１５ｍｏｌ／Ｌ（８７質量％）の酢酸水溶液を用いて、試験例１と同様にしてクモ糸フィブロインの精製試験を行った。得られたサンプルから回収した上清と沈殿物を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。
　図９は、タンパク質水溶液から得た上清及び沈殿物のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析の結果を示す写真である。図９から、酢酸濃度が５．２ｍｏｌ／Ｌ（３０質量％）を超えて１５ｍｏｌ／Ｌ（８５質量％）未満になると、精製純度が特に高くなる傾向が認められる。

Claims (13)

  1. 　目的タンパク質、夾雑物及び酸性化合物とこれらが溶解している水とを含有する酸性のタンパク質水溶液のｐＨを上昇させ、それによって前記夾雑物を含む沈殿物を析出させる工程と、
    　析出した前記沈殿物と前記目的タンパク質を含む上清とを分離する工程と、
    を備える、精製されたタンパク質を製造する方法。
  2. 　前記タンパク質が構造タンパク質である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記構造タンパク質がフィブロイン又はケラチンである、請求項２に記載の方法。
  4. 　前記構造タンパク質がクモ糸フィブロインである、請求項２に記載の方法。
  5. 　前記酸性のタンパク質水溶液のｐＨを２．８未満の上昇幅で上昇させ、それによって前記夾雑物を含む前記沈殿物を析出させる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　塩基性化合物の添加によって前記酸性のタンパク質水溶液のｐＨを上昇させ、それによって前記夾雑物を含む前記沈殿物を析出させる、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　前記酸性のタンパク質水溶液に含まれる前記酸性化合物の酸当量に対する、添加される前記塩基性化合物の塩基当量の比が０．５５未満である、請求項６に記載の方法。
  8. 　前記酸性化合物がカルボン酸を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　前記カルボン酸が酢酸である、請求項８に記載の方法。
  10. 　前記酸性のタンパク質水溶液における前記カルボン酸の濃度が、前記酸性のタンパク質水溶液の体積を基準として、５．２ｍｏｌ／Ｌを超えて１５ｍｏｌ／Ｌ未満である、請求項８又は９に記載の方法。
  11. 　前記目的タンパク質及び前記夾雑物を含む粗原料と前記酸性化合物を含む酸水溶液とを含有する混合物中で前記目的タンパク質及び前記夾雑物を前記酸水溶液に溶解させて、前記酸性のタンパク質水溶液を得る工程を更に備える、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 　前記混合物を加温しながら、前記目的タンパク質及び前記夾雑物を前記酸水溶液に溶解させて、前記酸性のタンパク質水溶液を得る、請求項１１に記載の方法。
  13. 　前記目的タンパク質及び前記夾雑物が、前記目的タンパク質を産生した宿主細胞を含む培養物から取り出されたものである、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
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