JP2020097524A - 精製されたタンパク質を製造する方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】高い純度で精製されたタンパク質を簡便に製造できる方法を提供すること。【解決手段】目的タンパク質、夾雑物及び酸性化合物とこれらが溶解している水とを含有する酸性のタンパク質水溶液のpHを上昇させ、それによって夾雑物を含む沈殿物を析出させる工程と、析出した沈殿物と目的タンパク質を含む上清とを分離する工程と、を備える、精製されたタンパク質を製造する方法が開示される。【選択図】なし
Description
本発明は、精製されたタンパク質を製造する方法に関する。
従来、目的タンパク質を精製する各種の方法が知られている。例えば、タンパク質の一種であるクモ糸フィブロインの精製方法として、ヘキサフルオロ−2−プロパノール(HFIP)を用いる方法(非特許文献1)、有機酸を含む溶媒を用いる方法(特許文献1)、及び、ジメチルスルホキシド(DMSO)又はジメチルホルムアミド(DMF)を用いる方法(特許文献2)が検討されている。
Macromolecules, 31:6733 (1998)
有機酸を含む溶媒を用いる方法は、比較的安価な材料及び設備を用いて実施可能で、精製操作が簡便という利点を有している。しかし、この方法では十分に高い純度までタンパク質を精製することが困難であった。
そこで、本発明の一側面の目的は、高い純度で精製されたタンパク質を簡便に製造できる方法を提供することにある。
本発明の一側面は、目的タンパク質、夾雑物及び酸とこれらが溶解している水とを含有する酸性のタンパク質水溶液のpHを上昇させ、それによって夾雑物を含む沈殿物を析出させる工程と、析出した沈殿物と目的タンパク質を含む上清とを分離する工程と、を備える、精製されたタンパク質を製造する方法を提供する。
この方法によれば、高い純度で精製されたタンパク質を簡便に製造することができる。
本発明の一側面によれば、高い純度で精製されたタンパク質を簡便に製造することができる。
以下、本発明のいくつかの実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
精製されたタンパク質を製造する方法の一実施形態は、目的タンパク質及び夾雑物とこれらが溶解している水とを含有する酸性のタンパク質水溶液のpHを上昇させ、それによって夾雑物を含む沈殿物を析出させる工程と、析出した沈殿物と目的タンパク質を含む上清とを分離する工程と、を備える。
この方法によれば、精製すべき目的タンパク質と、目的タンパク質以外の夾雑物とを含む粗原料から、夾雑物の大部分を除去して、精製された目的タンパク質を回収することができる。
<目的タンパク質>
目的タンパク質の種類に制限はない。目的タンパク質は、遺伝子組換え技術により微生物等で製造されたものであってもよく、化学合成によって製造されたものであってもよい。あるいは、目的タンパク質は、天然原料から取得したタンパク質であってもよい。
目的タンパク質の種類に制限はない。目的タンパク質は、遺伝子組換え技術により微生物等で製造されたものであってもよく、化学合成によって製造されたものであってもよい。あるいは、目的タンパク質は、天然原料から取得したタンパク質であってもよい。
目的タンパク質は、特に、構造タンパク質であってもよい。構造タンパク質は、生体構造を構築する役割を有するタンパク質であり、酵素、ホルモン、抗体等の機能タンパク質とは異なる。構造タンパク質は、水溶液中でその立体構造を維持し易いため、水溶液のpHが変化したときに、凝集して沈殿物として析出し難いと考えられる。そのため、pHの上昇をともなう本実施形態の方法は、構造タンパク質の精製のために特に適用し易い。
構造タンパク質の例としては、フィブロイン、コラ−ゲン、レシリン、エラスチン及びケラチン等の天然型構造タンパク質を挙げることができる。構造タンパク質は、フィブロイン又はケラチンであってもよい。フィブロインの例としては、昆虫又はクモが産生するフィブロインが挙げられる。
昆虫が産生するフィブロインとしては、例えば、ボンビックス・モリ(Bombyx mori)、クワコ(Bombyx mandarina)、天蚕(Antheraea yamamai)、柞蚕(Anteraea pernyi)、楓蚕(Eriogyna pyretorum)、蓖蚕(Pilosamia Cynthia ricini)、樗蚕(Samia cynthia)、栗虫(Caligura japonica)、チュッサー蚕(Antheraea mylitta)、及びムガ蚕(Antheraea assama)等のカイコが産生する絹タンパク質(絹フィブロイン)、並びに、スズメバチ(Vespa simillima xanthoptera)の幼虫が吐出するホーネットシルクタンパク質が挙げられる。
絹フィブロインは、天然若しくは家蚕の繭、又は中古若しくは廃棄のシルク生地を原料とし、フィブロインを覆うセリシン、及びその他の脂肪分等を除去して精製したものである。絹フィブロインは、精製したフィブロインを凍結乾燥して得られた粉末でってもよい。
昆虫が産生するフィブロインのより具体的な例としては、カイコ・フィブロインL鎖(GenBankアクセッション番号M76430(塩基配列)、AAA27840.1(アミノ酸配列))が挙げられる。
クモは、最大7種類の絹糸腺を有しており、それらから互いに性質の異なるフィブロイン(クモ糸フィブロイン、又はスパイダーシルクタンパク質)を産生する。その例としては、大吐糸管しおり糸タンパク質、横糸タンパク質、及び小瓶状腺タンパク質が挙げられる。スパイダーシルクタンパク質は、その源泉の器官によって異なる形態を有しており、例えば、高い靭性を有する大瓶状スパイダータンパク質(major ampullate spider protein、MaSp)、高度な伸長力を有する小瓶状スパイダータンパク質(minor ampullate spider protein、MiSp)、並びに鞭状(flagelliform(Flag))、管状(tubuliform)、集合(aggregate)、ブドウ状(aciniform)又はナシ状(pyriform)のスパイダーシルクタンパク質がある。
クモ糸フィブロイン(又はスパイダーシルクタンパク質)を産生するクモとしては、例えば、オニグモ、ニワオニグモ、アカオニグモ、アオオニグモ及びマメオニグモ等のオニグモ属(Araneus属)に属するクモ、ヤマシロオニグモ、イエオニグモ、ドヨウオニグモ及びサツマノミダマシ等のヒメオニグモ属(Neoscona属)に属するクモ、コオニグモモドキ等のコオニグモモドキ属(Pronus属)に属するクモ、トリノフンダマシ及びオオトリノフンダマシ等のトリノフンダマシ属(Cyrtarachne属)に属するクモ、トゲグモ及びチブサトゲグモ等のトゲグモ属(Gasteracantha属)に属するクモ、マメイタイセキグモ及びムツトゲイセキグモ等のイセキグモ属(Ordgarius属)に属するクモ、コガネグモ、コガタコガネグモ及びナガコガネグモ等のコガネグモ属(Argiope属)に属するクモ、キジロオヒキグモ等のオヒキグモ属(Arachnura属)に属するクモ、ハツリグモ等のハツリグモ属(Acusilas属)に属するクモ、スズミグモ、キヌアミグモ及びハラビロスズミグモ等のスズミグモ属(Cytophora属)に属するクモ、ゲホウグモ等のゲホウグモ属(Poltys属)に属するクモ、ゴミグモ、ヨツデゴミグモ、マルゴミグモ及びカラスゴミグモ等のゴミグモ属(Cyclosa属)に属するクモ、及びヤマトカナエグモ等のカナエグモ属(Chorizopes属)に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質、並びにアシナガグモ科(Tetragnathidae科)に属するクモが挙げられる。
クモ糸フィブロイン(又はスパイダーシルクタンパク質)を産生するアシナガグモ科のクモとしては、例えば、アシナガグモ、ヤサガタアシナガグモ、ハラビロアシダカグモ及びウロコアシナガグモ等のアシナガグモ属(Tetragnatha属)に属するクモ、オオシロカネグモ、チュウガタシロカネグモ及びコシロカネグモ等のシロカネグモ属(Leucauge属)に属するクモ、ジョロウグモ及びオオジョロウグモ等のジョロウグモ属(Nephila属)に属するクモ、キンヨウグモ等のアズミグモ属(Menosira属)に属するクモ、ヒメアシナガグモ等のヒメアシナガグモ属(Dyschiriognatha属)に属するクモ、クロゴケグモ、セアカゴケグモ、ハイイロゴケグモ及びジュウサンボシゴケグモ等のゴケグモ属(Latrodectus属)に属するクモ、及びユープロステノプス属(Euprosthenops属)に属するクモ等のアシナガグモ科(Tetragnathidae科)に属するクモが挙げられる。
スパイダーシルクタンパク質としては、例えば、MaSp(MaSp1及びMaSp2)、ADF(ADF3及びADF4)等の牽引糸タンパク質、MiSp(MiSp1及びMiSp2)等が挙げられる。
クモが産生するクモ糸フィブロインのより具体的な例としては、例えば、fibroin−3(adf−3)[Araneus diadematus由来](GenBankアクセッション番号AAC47010(アミノ酸配列)、U47855(塩基配列))、fibroin−4(adf−4)[Araneus diadematus由来](GenBankアクセッション番号AAC47011(アミノ酸配列)、U47856(塩基配列))、dragline silk protein spidroin 1[Nephila clavipes由来](GenBankアクセッション番号AAC04504(アミノ酸配列)、U37520(塩基配列))、major ampullate spidroin 1[Latrodectus hesperus由来](GenBankアクセッション番号ABR68856(アミノ酸配列)、EF595246(塩基配列))、dragline silk protein spidroin 2[Nephila clavata由来](GenBankアクセッション番号AAL32472(アミノ酸配列)、AF441245(塩基配列))、major ampullate spidroin 1[Euprosthenops australis由来](GenBankアクセッション番号CAJ00428(アミノ酸配列)、AJ973155(塩基配列))、及びmajor ampullate spidroin 2[Euprosthenops australis](GenBankアクセッション番号CAM32249.1(アミノ酸配列)、AM490169(塩基配列))、minor ampullate silk protein 1[Nephila clavipes](GenBankアクセッション番号AAC14589.1(アミノ酸配列))、minor ampullate silk protein 2[Nephila clavipes](GenBankアクセッション番号AAC14591.1(アミノ酸配列))、及び、minor ampullate spidroin−like protein[Nephilengys cruentata](GenBankアクセッション番号ABR37278.1(アミノ酸配列)が挙げられる。
天然由来のフィブロインのより具体的な例としては、更に、NCBI GenBankに配列情報が登録されているフィブロインを挙げることができる。例えば、NCBI GenBankに登録されている配列情報のうちDIVISIONとしてINVを含む配列の中から、DEFINITIONにspidroin、ampullate、fibroin、「silk及びpolypeptide」、又は「silk及びprotein」がキーワードとして記載されている配列、CDSから特定のproductの文字列、SOURCEからTISSUE TYPEに特定の文字列の記載された配列を抽出することにより確認することができる。
目的タンパク質は、以上例示した天然型タンパク質に由来するポリペプチド、すなわち人造ポリペプチドであってもよい。例えば、人造ポリペプチドたる組換えフィブロインは、いくつかの異種タンパク質生産系で産生されており、その製造方法として、トランスジェニック・ヤギ、トランスジェニック・カイコ、又は組換え植物若しくは哺乳類細胞が利用されている。
組換えフィブロインは、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列、又は天然由来のフィブロインのアミノ酸配列に1若しくは複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び/若しくは付加したものであってもよい。このように改変されたアミノ酸配列を設計し、それをコードする核酸を化学合成することにより、組換えフィブロインを得ることもできる。
クモ糸フィブロインの一種である大吐糸管しおり糸タンパク質の組換えポリペプチドは、例えば、式1:[(A)nモチーフ−REP]mで表されるドメイン配列を含むタンパク質(式1中、(A)nモチーフは4〜20アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、(A)nモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が70%以上である。REPは10〜200アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。mは5〜300の整数を示す。複数存在する(A)nモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するREPは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。)であることができる。大吐糸管しおり糸タンパク質の組換えポリペプチドの具体例としては、配列番号1で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。
横糸タンパク質に由来するタンパク質としては、例えば、式2:[REP2]oで表されるドメイン配列を含むタンパク質(式2中、REP2はGly−Pro−Gly−Gly−Xから構成されるアミノ酸配列を示し、Xはアラニン(Ala)、セリン(Ser)、チロシン(Tyr)及びバリン(Val)からなる群から選ばれる一つのアミノ酸を示す。oは8〜300の整数を示す。)を挙げることができる。横糸タンパク質に由来するタンパク質の具体例としては、配列番号2で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号2で示されるアミノ酸配列は、NCBIデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分的な配列(NCBIアクセッション番号:AAF36090、GI:7106224)のリピート部分及びモチーフに該当するN末端から1220残基目から1659残基目までのアミノ酸配列(PR1配列と記す。)と、NCBIデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分配列(NCBIアクセッション番号:AAC38847、GI:2833649)のC末端から816残基目から907残基目までのC末端アミノ酸配列を結合し、結合した配列のN末端に配列番号7で示されるアミノ酸配列(タグ配列及びヒンジ配列)が付加されたものである。
コラーゲンの組換えポリペプチドとして、例えば、式3:[REP3]pで表されるドメイン配列を含むタンパク質(式3中、pは5〜300の整数を示す。REP3は、Gly一X一Yから構成されるアミノ酸配列を示し、X及びYはGly以外の任意のアミノ酸残基を示す。複数存在するREP3は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。)を挙げることができる。コラーゲンの組換えポリペプチドの具体例としては、配列番号3で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号3で示されるアミノ酸配列は、NCBIデータベースから入手したヒトのコラーゲンタイプ4の部分的な配列(NCBIのGenbankのアクセッション番号:CAA56335.1、GI:3702452)のリピート部分及びモチーフに該当する301残基目から540残基目までのアミノ酸配列のN末端に配列番号7で示されるアミノ酸配列(タグ配列及びヒンジ配列)が付加されたものである。
レシリンの組換えポリペプチドとして、例えば、式4:[REP4]qで表されるドメイン配列を含むタンパク質(式3中、qは4〜300の整数を示す。REP4はSer一J一J一Tyr一Gly一U−Proから構成されるアミノ酸配列を示す。Jは任意のアミノ酸残基を示し、特にAsp、Ser及びThrからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。Uは任意のアミノ酸残基を示し、特にPro、Ala、Thr及びSerからなる群から選ばれるアミノ酸残基であってもよい。複数存在するREP3は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。)を挙げることができる。レシリンの組換えポリペプチドの具体例としては、配列番号4で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号4で示されるアミノ酸配列は、レシリン(NCBIのGenbankのアクセッション番号NP 611157、Gl:24654243)のアミノ酸配列において、87残基目のThrをSerに置換し、かつ95残基目のAsnをAspに置換した配列の19残基目から321残基目までのアミノ酸配列のN末端に配列番号7で示されるアミノ酸配列(タグ配列及びヒンジ配列)が付加されたものである。
エラスチンの組換えポリペプチドとして、例えば、NCBIのGenbankのアクセッション番号AAC98395(ヒト)、I47076(ヒツジ)、NP786966(ウシ)等のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。エラスチンの組換えポリペプチドの具体例としては、配列番号5で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号5で示されるアミノ酸配列は、NCBIのGenbankのアクセッション番号AAC98395のアミノ酸配列の121残基目から390残基目までのアミノ酸配列のN末端に配列番号7で示されるアミノ酸配列(タグ配列及びヒンジ配列)が付加されたものである。
ケラチンの組換えポリペプチドとして、例えば、カプラ・ヒルクス(Capra hircus)のタイプIケラチン等を挙げることができる。ケラチンの組換えポリペプチドの具体例としては、配列番号6で示されるアミノ酸配列(NCBIのGenbankのアクセッション番号ACY30466のアミノ酸配列)を含むタンパク質を挙げることができる。
目的タンパク質としての組換えポリペプチドは、以上例示した組換えポリペプチドのアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドであってもよい。
組換えポリペプチドは、N末端及びC末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、組換えフィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
タグ配列として、例えば、他の分子との特異的親和性(結合性、アフィニティ)を利用したアフィニティタグを挙げることができる。アフィニティタグの具体例として、ヒスチジンタグ(Hisタグ)を挙げることができる。Hisタグは、ヒスチジン残基が4から10個程度並んだ短いペプチドで、ニッケル等の金属イオンと特異的に結合する性質があるため、金属キレートクロマトグラフィー(chelating metal chromatography)による組換えフィブロインの単離に利用することができる。タグ配列の具体例として、例えば、配列番号7で示されるアミノ酸配列(Hisタグを含むアミノ酸配列)が挙げられる。
グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質(MBP)等のタグ配列を利用することもできる。
抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用することもできる。抗原性を示すペプチド(エピトープ)をタグ配列として付加することにより、当該エピトープに対する抗体を結合させることができる。エピトープタグとして、HA(インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列)タグ、mycタグ、FLAGタグ等を挙げることができる。エピトープタグを利用することにより、高い特異性で容易に組換えフィブロインを精製することができる。
特定のプロテアーゼで切り離すことが可能なタグ配列も使用することができる。このタグ配列を介して吸着したタンパク質をプロテアーゼ処理することにより、タグ配列を切り離した組換えフィブロインを回収することもできる。
<タンパク質水溶液>
一実施形態に係るタンパク質水溶液は、目的タンパク質及び夾雑物とこれらが溶解している水とを含有する酸性の水溶液である。タンパク質水溶液は、目的タンパク質を産生した培養物等に由来する不溶物を含んでいてもよいし、不溶物を含む粗原料から遠心分離等によって回収した上清から調製されたものであってもよい。
一実施形態に係るタンパク質水溶液は、目的タンパク質及び夾雑物とこれらが溶解している水とを含有する酸性の水溶液である。タンパク質水溶液は、目的タンパク質を産生した培養物等に由来する不溶物を含んでいてもよいし、不溶物を含む粗原料から遠心分離等によって回収した上清から調製されたものであってもよい。
タンパク質水溶液は、例えば、目的タンパク質及び夾雑物を含む粗原料と酸性化合物を含む酸水溶液とを混合し、得られた混合物中で酸水溶液に目的タンパク質を溶解させて、作製される。
酸性化合物は、水に溶解して酸性の水溶液を形成する化合物である。この酸性化合物及びこれを含む酸水溶液は、粗原料に含まれる目的タンパク質を溶解可能なものであれば、その種類が特に限定されるものではなく、原料に含まれるタンパク質種類に応じて、適宜に決定される。例えば、タンパク質がクモ糸フィブロインである場合には、酸水溶液が含む酸性化合物は、カルボン酸等の有機酸であってもよい。カルボン酸は、例えば酢酸、ギ酸、及びプロピオン酸からなる群より選ばれる少なくとも1種であってもよい。クモ糸フィブロインは、酸性化合物としてカルボン酸を含む酸水溶液に対して高い溶解度を有する傾向があるため、カルボン酸を用いることにより、高濃度のタンパク質水溶液が得られ易い。
酸水溶液又はタンパク質水溶液は、目的タンパク質が溶解可能な範囲で、水と相溶性のあるその他の溶媒を含んでいてもよい。その他の溶媒としては、例えば、メチルスルホキシド(DMSO)、N−メチル−2−ピロリドン(NMP)、1,3−ジメチル−2−イミダゾリジノン(DMI)、ジメチルアセトアミド(DMA)、ヘキサメチルリン酸トリアミド(HMPA)、アセトン、トリクロロ酢酸、アセトニトリル、炭酸ブチレン、炭酸プロピレン、炭酸エチレン、ブチロラクトン、テトラヒドロフラン、及びアルコール(メタノール、エタノール、プロパノールなど)が挙げられる。
酸水溶液の酸性化合物の濃度も何等限定されるものではなく、原料に含まれる目的たんぱく質の種類、及び酸の種類等に応じて適宜に決定される。例えば、タンパク質水溶液(特に、クモ糸フィブロイン水溶液)を作製するためにカルボン酸(特に、モノカルボン酸)が用いられる場合、カルボン酸水溶液の濃度は、カルボン酸水溶液の体積を基準として、5.0mol/L以上15.0mol/L以下であってもよい。カルボン酸水溶液の濃度が5.0mol/L未満である、又は15.0mol/Lを超えると、カルボン酸水溶液への目的タンパク質の溶解量が小さくなって、精製効率が相対的に低下する可能性がある。同様の観点から、カルボン酸水溶液の濃度は5.2mol/Lを超えて15mol/L未満、5.2mol/Lを超えて13.1mol/L以下、又は8.7以上12.2mol/L以下であってもよい。
タンパク質水溶液を作製する際、酸水溶液、又は酸水溶液と粗原料との混合物に対して、無機塩を添加してもよい。この無機塩は、タンパク質水溶液におけるタンパク質の溶解度(酸水溶液に対するタンパク質の溶解量)を向上させ得る。すなわち、無機塩を、タンパク質の溶解促進剤として利用することができる。
溶解促進剤として用いられ得る無機塩としては、例えば、アルカリ金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属硝酸塩、及びチオシアン酸塩が挙げられる。より具体的には、無機塩は、例えば、リン酸アルミニウム、炭酸リチウム、炭酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、フッ化アルミニウム、酢酸第二鉄、酢酸アルミニウム、水酸化亜鉛、水酸化マグネシウム、水酸化第一鉄、水酸化マンガン、水酸化クロム、水酸化第二鉄、水酸化アルミニウム、塩化ニッケル、塩化コバルト、塩化亜鉛、塩化第一鉄、塩化マンガン、塩化クロム、塩化第二鉄、塩化アルミニウム、硝酸リチウム、硝酸ストロンチウム、硝酸ニッケル、硝酸カルシウム、硝酸コバルト、硝酸亜鉛、硝酸マグネシウム、硝酸第一鉄、硝酸マンガン、硝酸クロム、硝酸第二鉄、硝酸アルミニウム、臭化リチウム、臭化バリウム、臭化ストロンチウム、臭化ニッケル、臭化カルシウム、臭化コバルト、臭化亜鉛、臭化マグネシウム、臭化第一鉄、臭化マンガン、臭化クロム、臭化第二鉄、臭化アルミニウム、塩素酸バリウム、塩素酸ストロンチウム、塩素酸ニッケル、塩素酸カルシウム、塩素酸コバルト、塩素酸亜鉛、塩素酸マグネシウム、塩素酸第一鉄、塩素酸マンガン、塩素酸クロム、塩素酸第二鉄、塩素酸アルミニウム、ヨウ化ルビジウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化銅、ヨウ化リチウム、ヨウ化バリウム、ヨウ化ストロンチウム、ヨウ化ニッケル、ヨウ化カルシウム、ヨウ化コバルト、ヨウ化亜鉛、ヨウ化マグネシウム、ヨウ化第一鉄、ヨウ化マンガン、ヨウ化クロム、ヨウ化第二鉄、ヨウ化アルミニウム、過塩素酸ナトリウム、過塩素酸鉛、過塩素酸銅、過塩素酸リチウム、過塩素酸バリウム、過塩素酸ストロンチウム、過塩素酸ニッケル、過塩素酸カルシウム、過塩素酸コバルト、過塩素酸亜鉛、過塩素酸マグネシウム、過塩素酸第一鉄、過塩素酸マンガン、過塩素酸クロム、過塩素酸第二鉄、過塩素酸アルミニウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸鉛、チオシアン酸銅、チオシアン酸リチウム、チオシアン酸バリウム、チオシアン酸ストロンチウム、チオシアン酸ニッケル、チオシアン酸カルシウム、チオシアン酸コバルト、チオシアン酸亜鉛、チオシアン酸マグネシウム、チオシアン酸第一鉄、チオシアン酸マンガン、チオシアン酸クロム、チオシアン酸第二鉄、チオシアン酸アルミニウム、シアン酸アンモニウム、シアン酸セシウム、シアン酸ルビジウム、シアン酸カリウム、シアン酸ナトリウム、シアン酸鉛、シアン酸銅、シアン酸リチウム、シアン酸バリウム、シアン酸ストロンチウム、シアン酸ニッケル、シアン酸カルシウム、シアン酸コバルト、シアン酸亜鉛、シアン酸マグネシウム、シアン酸第一鉄、シアン酸マンガン、シアン酸クロム、シアン酸第二鉄、及びシアン酸アルミニウムからなる群より選ばれる少なくとも1種であってもよい。
酸水溶液、又は酸水溶液と粗原料との混合物への無機塩の添加量は、特に限定されるものではなく、無機塩の種類、目的タンパク質の量等に応じて適宜に決定される。
粗原料及び酸水溶液を含有する混合物を加温しながら、目的タンパク質及び夾雑物を酸水溶液に溶解させて、酸性のタンパク質水溶液を作製してもよい。これによって、原料中のタンパク質の酸水溶液への溶解量が向上し、より効率的に目的タンパク質が原料中から精製され得る。酸水溶液を加温した後、加温された酸水溶液を粗原料と混合してもよいし、酸水溶液と粗原料を混合してから、混合物を加温してもよい。または、酸水溶液を、粗原料と混合する前から混合後に亘って継続的に加温してもよい。
加温のための温度制御の方法は、何等限定されない。例えば、所定の温度に到達した後に、その温度に一定に維持してもよいし、予め定めた温度範囲の間での変動が許容される状態で温度制御してもよい。酸水溶液又は混合物の加温は、原料中のタンパク質が酸水溶液中に均一に溶解するまで行ってもよい。酸性のタンパク質水溶液を調製した後、最終的に得られる精製されたタンパク質水溶液を、紡糸、フィルム形成その他の成形のためのドープ液として用いる場合、精製から成形まで、タンパク質水溶液を加温し続けてもよい。この場合、温度は一定の同じ温度に保たれてもよいし、タンパク質が酸水溶液に均一に溶解した後、より低い温度又は高い温度で水溶液を保温してもよい。
酸水溶液又はこれを含む混合物を加温する温度の範囲は、特に限定されるものではないが、加温による効果をより確実に得ると共に、最終的に得られるタンパク質の品質低下を防ぐために、室温(25℃)より高く、且つタンパク質の変性温度又は酸水溶液の沸点より低いことが好ましい。タンパク質の変性温度が酸水溶液の沸点を超える場合には、作業性や取扱い性の面からして、酸水溶液又はこれを含む混合物を加温する温度は、酸水溶液の沸点よりも低いことが望ましい。酸水溶液又はこれを含む混合物を加温する温度は、具体的には30〜80℃であってもよい。酸水溶液又はこれを含む混合物を加温する温度の下限は、約30℃、約36℃、約38℃、約40℃、約45℃、約50℃、約55℃、又は約60℃であってもよい。酸水溶液又はこれを含む混合物を加温する温度の上限は、例えば、約45℃、約50℃、約55℃、約60℃、約65℃、約70℃、約75℃、又は約80℃であってもよい。これら下限及び上限は任意に組み合わされる。本明細書において、「約」を付した温度の数値は、その数値の90%から110%までの範囲の数値を意味する。例えば、約40℃とは、36℃〜44℃をいう。同様に、約60℃とは、54℃〜66℃をいう。ここでの温度は、常圧での温度である。ここで常圧とは、純水の沸点が約95℃〜105℃である気圧をいう。酸水溶液又はこれを含む混合物を加温する方法は、特に限定されず、通常の方法が何れも採用可能である。
<pH上昇操作>
目的タンパク質及び夾雑物を含む酸性のタンパク質水溶液のpHを上昇さることによって、タンパク質水溶液中の目的タンパク質以外の溶解成分(夾雑物)を含む沈殿物を析出させる。析出した沈殿物と目的タンパク質を含む上清とを分離することによって、精製された目的タンパク質を含むタンパク質水溶液を得ることができる。
目的タンパク質及び夾雑物を含む酸性のタンパク質水溶液のpHを上昇さることによって、タンパク質水溶液中の目的タンパク質以外の溶解成分(夾雑物)を含む沈殿物を析出させる。析出した沈殿物と目的タンパク質を含む上清とを分離することによって、精製された目的タンパク質を含むタンパク質水溶液を得ることができる。
タンパク質水溶液のpHを上昇させる方法は、特に限定されない。例えば、タンパク質水溶液に塩基性化合物、水、pH緩衝剤、又はその他のpH調整剤を加える方法によって、pHを上昇させることができる。必要に応じて、タンパク質水溶液のpHを上昇させる前に、タンパク質水溶液中の沈殿物(不溶性残渣)を除去してもよい。その際には、遠心分離等の通常の方法が適宜に採用される。
酸性のタンパク質水溶液のpHを上昇させる幅は、タンパク質水溶液から目的タンパク質以外の夾雑物が析出するように、調整される。タンパク質水溶液のpHの上昇幅は、2.8未満、2.6以下、又は2.3以下であってもよい。上昇後のpHの上限値は、例えば、タンパク質水溶液を調製するために用いられた酸水溶液の種類等によっても適宜に決定される。例えば、タンパク質水溶液のpHを、4.8未満、4.6以下、又は4.3以下まで上昇させてもよい。これらのpHの範囲は、酸水溶液がカルボン酸水溶液である場合に、特に適用され易い。
pHを上昇させるためにタンパク質水溶液に添加され得る塩基性化合物の種類は、特に限定されない。塩基性化合物は、例えば、NaOH、K2HPO4、及びNa2HPO4からなる群より選ばれる少なくとも1種であってもよい。これらの塩基性化合物を用いることによって、目的タンパク質が、より一層高い精製純度で得られ易い傾向がある。
塩基性化合物をタンパク質水溶液に添加してタンパク質水溶液のpHを上昇させる場合、その添加量は、目的タンパク質の析出を出来るだけ抑制しながら、その他の夾雑物が析出するような範囲に調整される。例えば、塩基性化合物のタンパク質水溶液への添加量は、タンパク質水溶液における酸の濃度に応じて決定することができる。具体的には、添加される塩基性化合物の塩基当量C1と酸の酸当量C2との比:C1/C2が、0.55未満であってもよい。この比C1/C2が0.55以上であると、目的タンパク質が徐々に析出し易くなる可能性がある。同様の観点から、比C1/C2は、0.5以下、又は0.45以下であってもよい。比C1/C2が過度に小さいと、夾雑物の析出量が小さくなり、その結果、最終的な目的タンパク質の純度が低下する可能性がある。そのため、比C1/C2は、0.04以上であってもよい。
<目的タンパク質を含む上清の分離>
沈殿物の析出の後、沈殿物と目的タンパク質を含む上清とが分離される。分離の方法は、特に限定されるものではなく、例えば、遠心分離又は濾過等の通常の方法によって、沈殿物と分離した上清を回収することができる。得られた上清から目的タンパク質を析出させ、固形の目的タンパク質を回収してもよい。回収された上清を、例えば繊維やフィルム、ゲル、スポンジ等の各種の成形体を成形するためのドープ液等として、そのまま利用することも可能である。本明細書において、「上清」の用語は、沈殿物以外の清澄部分を意味する用語として用いられ、遠心分離等によって形成される清澄液だけでなく、濾過によって回収される濾液も含む。上清が微量の沈殿物を含むこともあり得る。
沈殿物の析出の後、沈殿物と目的タンパク質を含む上清とが分離される。分離の方法は、特に限定されるものではなく、例えば、遠心分離又は濾過等の通常の方法によって、沈殿物と分離した上清を回収することができる。得られた上清から目的タンパク質を析出させ、固形の目的タンパク質を回収してもよい。回収された上清を、例えば繊維やフィルム、ゲル、スポンジ等の各種の成形体を成形するためのドープ液等として、そのまま利用することも可能である。本明細書において、「上清」の用語は、沈殿物以外の清澄部分を意味する用語として用いられ、遠心分離等によって形成される清澄液だけでなく、濾過によって回収される濾液も含む。上清が微量の沈殿物を含むこともあり得る。
<目的タンパク質の製造>
目的タンパク質及び夾雑物は、遺伝子組み換え技術によって目的タンパク質を産生した宿主細胞を含む培養物から取り出されたものであってもよい。言い換えると、一実施形態に係るタンパク質を製造する方法は、培養物中で宿主細胞に目的タンパク質を産生させる工程と、培養物から目的タンパク質及び夾雑物を含む粗原料を得る工程と、粗原料と酸水溶液とを混合して、酸性のタンパク質水溶液を得る工程とを含んでいてもよい。この場合、目的タンパク質は、例えば、当該タンパク質をコードする核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された1又は複数の調節配列とを有する発現ベクターで形質転換された宿主細胞により、当該核酸を発現させることにより生産することができる。
目的タンパク質及び夾雑物は、遺伝子組み換え技術によって目的タンパク質を産生した宿主細胞を含む培養物から取り出されたものであってもよい。言い換えると、一実施形態に係るタンパク質を製造する方法は、培養物中で宿主細胞に目的タンパク質を産生させる工程と、培養物から目的タンパク質及び夾雑物を含む粗原料を得る工程と、粗原料と酸水溶液とを混合して、酸性のタンパク質水溶液を得る工程とを含んでいてもよい。この場合、目的タンパク質は、例えば、当該タンパク質をコードする核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された1又は複数の調節配列とを有する発現ベクターで形質転換された宿主細胞により、当該核酸を発現させることにより生産することができる。
タンパク質をコードする遺伝子の製造方法は特に制限されない。例えば、天然の構造タンパク質をコードする遺伝子を利用して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などで増幅しクローニングする方法、又は、化学的な合成によって、遺伝子を製造することができる。遺伝子の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、NCBIのウェブデータベースなどより入手した構造タンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、AKTA oligopilot plus 10/100(GEヘルスケア・ジャパン株式会社)などで自動合成したオリゴヌクレオチドをPCRなどで連結する方法によって遺伝子を化学的に合成することができる。この際に、タンパク質の精製や確認を容易にするため、上記のアミノ酸配列のN末端に開始コドン及びHis10タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を合成してもよい。
調節配列は、宿主における組換えタンパク質の発現を制御する配列(例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等)であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。プロモーターとして、宿主細胞中で機能し、目的とするタンパク質を発現誘導可能な誘導性プロモーターを用いてもよい。誘導性プロモーターは、誘導物質(発現誘導剤)の存在、リプレッサー分子の非存在、又は温度、浸透圧若しくはpH値の上昇若しくは低下等の物理的要因により、転写を制御できるプロモーターである。
発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主の染色体中への組込みが可能で、目的とするタンパク質をコードする核酸を転写できる位置にプロモーターを含有していてもよい。
宿主として、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも用いることができる。
原核生物の例として、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する細菌を挙げることができる。
タンパク質をコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、pBTrp2(ベーリンガーマンハイム社製)、pGEX(Pharmacia社製)、pUC18、pBluescriptII、pSupex、pET22b、pCold、pUB110、pNCO2(特開2002−238569号公報)等を挙げることができる。
真核生物の宿主としては、例えば、酵母及び糸状真菌(カビ等)を挙げることができる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属等に属する酵母を挙げることができる。糸状真菌としては、例えば、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ(Trichoderma)属等に属する糸状真菌を挙げることができる。
ベクターとしては、例えば、YEP13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)等を挙げることができる。
宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へDNAを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA,69,2110 (1972)〕、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、コンピテント法を挙げることができる。
発現ベクターで形質転換された宿主による核酸の発現方法としては、直接発現のほか、モレキュラー・クローニング第2版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
タンパク質は、例えば、発現ベクターで形質転換された宿主を培養培地中で培養し、培養培地中に当該タンパク質を生成蓄積させ、該培養培地から採取することにより製造することができる。宿主を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。
宿主が大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、宿主の培養培地として、宿主が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有し、宿主の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、宿主が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類を用いることができる。
窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。
無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。
大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物の培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は、例えば、15〜40℃である。培養時間は、通常16時間〜7日間である。培養中の培養培地のpHは3.0〜9.0に保持することが好ましい。培養培地のpHの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。
培養中、必要に応じて、アンピシリン及びテトラサイクリン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
目的タンパク質を産生した培養物から取り出した粗原料を用いて、上述の酸性のタンパク質水溶液を作製することができる。例えば、目的タンパク質が細胞内に産生した場合、培養終了後、遠心分離等によって回収された粗原料としての宿主細胞と、酸水溶液とを混合して、タンパク質水溶液を得ることができる。タンパク質が細胞内で不溶体を形成している場合、これを蛋白質変性剤で可溶化してもよい。目的タンパク質が細胞外に分泌された場合、粗原料としての培養上清と酸水溶液とを混合して、タンパク質水溶液を得ることができる。
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
1.クモ糸フィブロインをコードする遺伝子の合成、及クモ糸フィブロインの発現
ネフィラ・クラビペス(Nephila clavipes)由来のクモ糸フィブロイン(GenBankアクセッション番号:P46804.1、GI:1174415)の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、配列番号1で示されるアミノ酸配列を有する改変クモ糸フィブロイン(以下、「PRT410」ともいう。)を設計した。
ネフィラ・クラビペス(Nephila clavipes)由来のクモ糸フィブロイン(GenBankアクセッション番号:P46804.1、GI:1174415)の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、配列番号1で示されるアミノ酸配列を有する改変クモ糸フィブロイン(以下、「PRT410」ともいう。)を設計した。
配列番号1で示されるアミノ酸配列は、ネフィラ・クラビペス由来のクモ糸フィブロインのアミノ酸配列に対して、生産性の向上を目的としてアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を施したアミノ酸配列と、そのN末端に付加された配列番号7で示されるアミノ酸配列(タグ配列及びヒンジ配列)とを有する。
設計したPRT410をコードする核酸を合成した。当該核酸には、5’末端にNdeIサイト及び終止コドン下流にEcoRIサイトを付加した。当該核酸をクローニングベクター(pUC118)にクローニングした。その後、同核酸をNdeI及びEcoRIで制限酵素処理して切り出した後、タンパク質発現ベクターpET−22b(+)に組換えて発現ベクターを得た。
得られたpET22b(+)発現ベクターによって、大腸菌BLR(DE3)を形質転換した。当該形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む2mLのLB培地で15時間培養した。当該培養液を、アンピシリンを含む100mLのシード培養用培地(表1)にOD600が0.005となるように添加した。培養液温度を30℃に保ち、OD600が5になるまで約15時間、フラスコ培養を行って、シード培養液を得た。
当該シード培養液を500mlの生産培地(表2)を添加したジャーファーメンターにOD600が0.05となるように添加した。培養液温度を37℃に保ち、pH6.9で一定に制御して培養した。培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。
生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液(グルコース455g/1L、Yeast Extract 120g/1L)を1ml/分の速度で添加した。培養液温度を37℃に保ち、pH6.9で一定に制御して培養した。培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の20%に維持しながら、20時間培養を行った。その後、1Mのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド(IPTG)を培養液に対して終濃度1mMになるよう添加し、目的のクモ糸フィブロインを発現誘導させた。IPTG添加後20時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。回収した菌体を乾燥して、クモ糸フィブロインを発現する大腸菌の乾燥菌体を所定量得た。IPTG添加前とIPTG添加後の培養液から調製した菌体を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)法によって分析し、IPTG添加に依存した目的とするクモ糸フィブロインサイズのバンドの出現により、目的とするクモ糸フィブロインの発現を確認した。
2.タンパク質の精製試験
<試験例1>
上記のようにして得られた、クモ糸フィブロインを発現している大腸菌の乾燥菌体を5つのエッペンドルチューブに50mgずつ投入し、それら5つのエッペンドルチューブ内に8.7M(50質量%)の酢酸水溶液を1mLずつ加えた。次いで、エッペンドルチューブを、ヒートブロックシェイカーで60℃に加温しながら30分間撹拌した。その後、各エッペンドルチューブ内のサンプルの遠心分離を11,000×g、20℃、10分間の条件で実施し、上清(酸性のタンパク質水溶液)と沈殿物とを回収した。さらに、5つエッペンドルチューブのうちの4つから、上清を100μLずつ、新たな4つのエッペンドルフチューブにそれぞれ分注した。この時点の上清(酸性のタンパク質水溶液)のpHは2.03であった。上清(酸性のタンパク質水溶液)が入った3つのエッペンドルフチューブそれぞれに、濃度0.5M、1M又は2MのNaOH水溶液を100μL加えて混合し、上清(酸性のタンパク質水溶液)のpHを上昇させた。残りの1つのエッペンドルチューブに、逆浸透膜で精製された水(RO水)を100μL加えて混合し、上清(酸性のタンパク質水溶液)のpHを上昇させた。その後、11,000×g、20℃、10分間の条件で各エッペンドルチューブ内のサンプルの遠心分離を実施し、上清及び沈殿物を回収した。表3は、NaOH水溶液又はRO水の添加によりpHを調整した後の各サンプルのpHと、調整前からのpHの上昇幅を示す。
<試験例1>
上記のようにして得られた、クモ糸フィブロインを発現している大腸菌の乾燥菌体を5つのエッペンドルチューブに50mgずつ投入し、それら5つのエッペンドルチューブ内に8.7M(50質量%)の酢酸水溶液を1mLずつ加えた。次いで、エッペンドルチューブを、ヒートブロックシェイカーで60℃に加温しながら30分間撹拌した。その後、各エッペンドルチューブ内のサンプルの遠心分離を11,000×g、20℃、10分間の条件で実施し、上清(酸性のタンパク質水溶液)と沈殿物とを回収した。さらに、5つエッペンドルチューブのうちの4つから、上清を100μLずつ、新たな4つのエッペンドルフチューブにそれぞれ分注した。この時点の上清(酸性のタンパク質水溶液)のpHは2.03であった。上清(酸性のタンパク質水溶液)が入った3つのエッペンドルフチューブそれぞれに、濃度0.5M、1M又は2MのNaOH水溶液を100μL加えて混合し、上清(酸性のタンパク質水溶液)のpHを上昇させた。残りの1つのエッペンドルチューブに、逆浸透膜で精製された水(RO水)を100μL加えて混合し、上清(酸性のタンパク質水溶液)のpHを上昇させた。その後、11,000×g、20℃、10分間の条件で各エッペンドルチューブ内のサンプルの遠心分離を実施し、上清及び沈殿物を回収した。表3は、NaOH水溶液又はRO水の添加によりpHを調整した後の各サンプルのpHと、調整前からのpHの上昇幅を示す。
各サンプルから回収した上清及び沈殿物を、それぞれ、常法に従って、2−メルカプトエタノールを含むサンプルバッファーと混合して煮沸還元した。その後、各上清のサンプルバッファーに対してそのままSDS−PAGE法により電気泳動を行った。また、各沈殿物のサンプルに対して更に遠心分離を行って上清を分離した後、残った沈殿物についてのSDS−PAGE法により電気泳動を行った。電気泳動後のゲルはoriole染色して、蛍光により各サンプルの泳動パターンを電気泳動図として写真に記録した。NaOH水溶液又はRO水を加えていない1つのエッペンドルチューブ内からも上清及び沈殿物を回収し、それら上清と沈殿物に対して上記と同様にして電気泳動を行い、それらの泳動パターンを電気泳動図として写真を記録した。
図1は、上清のSDS−PAGEによる分析結果を示す写真であり、図2は、沈殿物のSDS−PAGEによる分析結果を示す写真である。図1及び図2において、レーン1は0.5M NaOH、レーン2は1M NaOH、レーン3は2M NaOH、レーン4はRO水によってタンパク質水溶液のpHを上昇させたサンプルであり、レーン5はNaOH水溶液又はRO水をタンパク質水溶液に加えていないサンプルであり、レーン6は別途準備した精製クモ糸フィブロイン(SSP)である。XL Ladderは市販の分子量マーカー(株式会社アプロサイエンス製)を示す(図2〜9も同様)。
図1及び図2から明らかなように、クモ糸フィブロインを発現している大腸菌の乾燥菌体に酢酸水溶液を加えて得たタンパク質水溶液のpHを、NaOH水溶液又はRO水のk添加により上昇させて得たサンプルは、タンパク質水溶液のpHを上昇させなかったサンプルと比較して、高い純度で精製されたクモ糸フィブロインを含んでいた。
<試験例2>
NaOH水溶液の代わりに、濃度0.5M、1M、2M若しくは5MのK2HPO4水溶液、又は、濃度0.5MのNa2HPO4水溶液を用いて酸性のタンパク質水溶液(上清)のpHを上昇させたこと以外は試験例1と同様にして、クモ糸フィブロインの精製試験を行った。表4は、K2HPO4水溶液又はNa2PO4水溶液の添加によりpHを上昇させた後の各タンパク質水溶液のpHと、調整前からのpHの上昇幅を示す。
NaOH水溶液の代わりに、濃度0.5M、1M、2M若しくは5MのK2HPO4水溶液、又は、濃度0.5MのNa2HPO4水溶液を用いて酸性のタンパク質水溶液(上清)のpHを上昇させたこと以外は試験例1と同様にして、クモ糸フィブロインの精製試験を行った。表4は、K2HPO4水溶液又はNa2PO4水溶液の添加によりpHを上昇させた後の各タンパク質水溶液のpHと、調整前からのpHの上昇幅を示す。
試験例1と同様に、各サンプルから回収した上清及び沈殿物を、SDS−PAGE法により分析した。図3は、K2HPO4水溶液を用いたサンプルのSDS−PAGEによる分析結果を示す写真であり、図4は、Na2HPO4水溶液を用いたサンプルのSDS−PAGEによる分析結果を示す写真である。図3において、レーン1は0.5MのK2HPO4水溶液、レーン2は1M K2HPO4水溶液、レーン3は2M K2HPO4水溶液、レーン4は5MのK2HPO4水溶液によってタンパク質水溶液のpHを上昇させたサンプルの上清であり、レーン5は0.5MのK2HPO4水溶液、レーン6は1M K2HPO4水溶液、レーン7は2M K2HPO4水溶液、レーン8は5MのK2HPO4水溶液によってタンパク質水溶液のpHを上昇させたサンプルの沈殿物であり、レーン9は別途準備した精製クモ糸フィブロイン(SSP)である。図4において、レーン1は0.5MのNa2HPO4水溶液によってタンパク質水溶液のpHを上昇させたサンプルの上清であり、レーン2は0.5MのNa2HPO4水溶液によってタンパク質水溶液のpHを上昇させたサンプルの沈殿物であり、レーン3は別途準備した精製クモ糸フィブロイン(SSP)である。
図3及び図4から明らかなように、クモ糸フィブロインを発現している大腸菌の乾燥菌体に酢酸水溶液を加えて得たタンパク質水溶液のpHを、K2HPO4水溶液又はNa2HPO4水溶液の添加により上昇させて得たサンプルの上清は、タンパク質水溶液のpHを上昇させなかったサンプルの上清(図1及び図2参照)と比較して、高い純度で精製されたクモ糸フィブロインを含んでいた。K2HPO4水溶液の添加によりタンパク質水溶液のpHを5.2としたサンプル(レーン4)は、K2HPO4水溶液の添加によりタンパク質水溶液のpHを3.4、3.8、又は4.4としたサンプル(レーン1〜3)と比較して、沈殿物に含まれるクモ糸フィブロインの量が多くなって精製量が少なくなる傾向が認められる。
<試験例3>
pH値とクモ糸フィブロインの精製量との関係をより詳細に確認するために、酢酸水溶液及びNaOH水溶液の濃度を変えながら、試験例1と同様にしてクモ糸ポリペプチドの精製試験を行い、得られたサンプルの沈殿物をSDS−PAGE法により分析した。表5は、酢酸濃度及びNaOH水溶液濃度の組み合わせと、pH調整後の各サンプルのタンパク質水溶液のpHを示す。
pH値とクモ糸フィブロインの精製量との関係をより詳細に確認するために、酢酸水溶液及びNaOH水溶液の濃度を変えながら、試験例1と同様にしてクモ糸ポリペプチドの精製試験を行い、得られたサンプルの沈殿物をSDS−PAGE法により分析した。表5は、酢酸濃度及びNaOH水溶液濃度の組み合わせと、pH調整後の各サンプルのタンパク質水溶液のpHを示す。
図5は5M(30質量%)の酢酸水溶液及びNaOH水溶液を用いて得られたサンプルの沈殿物のSDS−PAGEによる分析結果を示す写真である。図6は8.7M(50質量%)の酢酸水溶液及びNaOH水溶液を用いて得られたサンプルの沈殿物のSDS−PAGEによる分析結果を示す写真である。図7は12.2M(70質量%)の酢酸水溶液及びNaOH水溶液を用いて得られたサンプルの沈殿物のSDS−PAGEによる分析結果を示す写真である。
表3及び図5〜7の結果から、NaOH水溶液の添加によってpHを上昇させた後のタンパク質水溶液のpHが4.8以上になると、沈殿物に含まれるクモ糸フィブロインの量が多くなって、精製量が少なくなる傾向があることが認められる。
<試験例4:温度の影響>
クモ糸フィブロインを発現している大腸菌の乾燥菌体を複数のエッペンドルチューブに50mgずつ投入し、そこに8.7M(50質量%)の酢酸水溶液を1mL加えた。次いで、エッペンドルチューブを、ヒートブロックシェイカーで30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、又は80℃に加温しながら30分間撹拌した。その他は試験例1と同様に精製試験を行い、得られた各サンプルから回収した上清及び沈殿物を、SDS−PAGE法により分析した。
クモ糸フィブロインを発現している大腸菌の乾燥菌体を複数のエッペンドルチューブに50mgずつ投入し、そこに8.7M(50質量%)の酢酸水溶液を1mL加えた。次いで、エッペンドルチューブを、ヒートブロックシェイカーで30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、又は80℃に加温しながら30分間撹拌した。その他は試験例1と同様に精製試験を行い、得られた各サンプルから回収した上清及び沈殿物を、SDS−PAGE法により分析した。
図8は、タンパク質水溶液から得た上清及び沈殿物のSDS−PAGEによる分析の結果を示す写真である。図8から、タンパク質水溶液を調製する際の酢酸水溶液の温度が高くなると、精製純度が高くなる傾向が認められた。
<試験例5:酢酸水溶液の濃度の影響>
濃度が2.6mol/L(15質量%)、5.2mol/L(30質量%)、8.7mol/L(50質量%)、12.2mol/L(70質量%)又は15mol/L(87質量%)の酢酸水溶液を用いて、試験例1と同様にしてクモ糸フィブロインの精製試験を行った。得られたサンプルから回収した上清と沈殿物を、SDS−PAGEによって分析した。
濃度が2.6mol/L(15質量%)、5.2mol/L(30質量%)、8.7mol/L(50質量%)、12.2mol/L(70質量%)又は15mol/L(87質量%)の酢酸水溶液を用いて、試験例1と同様にしてクモ糸フィブロインの精製試験を行った。得られたサンプルから回収した上清と沈殿物を、SDS−PAGEによって分析した。
図9は、タンパク質水溶液から得た上清及び沈殿物のSDS−PAGEによる分析の結果を示す写真である。図9から、酢酸濃度が5.2mol/L(30質量%)を超えて15mol/L(85質量%)未満になると、精製純度が特に高くなる傾向が認められる。
Claims (13)
- 目的タンパク質、夾雑物及び酸性化合物とこれらが溶解している水とを含有する酸性のタンパク質水溶液のpHを上昇させ、それによって前記夾雑物を含む沈殿物を析出させる工程と、
析出した前記沈殿物と前記目的タンパク質を含む上清とを分離する工程と、
を備える、精製されたタンパク質を製造する方法。 - 前記タンパク質が構造タンパク質である、請求項1に記載の方法。
- 前記構造タンパク質がフィブロイン又はケラチンである、請求項2に記載の方法。
- 前記構造タンパク質がクモ糸フィブロインである、請求項2に記載の方法。
- 前記酸性のタンパク質水溶液のpHを2.8未満の上昇幅で上昇させ、それによって前記夾雑物を含む前記沈殿物を析出させる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 塩基性化合物の添加によって前記酸性のタンパク質水溶液のpHを上昇させ、それによって前記夾雑物を含む前記沈殿物を析出させる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酸性のタンパク質水溶液に含まれる前記酸性化合物の酸当量に対する、添加される前記塩基性化合物の塩基当量の比が0.55未満である、請求項6に記載の方法。
- 前記酸性化合物がカルボン酸を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記カルボン酸が酢酸である、請求項8に記載の方法。
- 前記酸性のタンパク質水溶液における前記カルボン酸の濃度が、前記酸性のタンパク質水溶液の体積を基準として、5.2mol/Lを超えて15mol/L未満である、請求項8又は9に記載の方法。
- 前記目的タンパク質及び前記夾雑物を含む粗原料と前記酸性化合物を含む酸水溶液とを含有する混合物中で前記目的タンパク質及び前記夾雑物を前記酸水溶液に溶解させて、前記酸性のタンパク質水溶液を得る工程を更に備える、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記混合物を加温しながら、前記目的タンパク質及び前記夾雑物を前記酸水溶液に溶解させて、前記酸性のタンパク質水溶液を得る、請求項11に記載の方法。
- 前記目的タンパク質及び前記夾雑物が、前記目的タンパク質を産生した宿主細胞を含む培養物から取り出されたものである、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
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