ES2525095T3

ES2525095T3 - Proteínas recombinantes de la seda de araña

Info

Publication number: ES2525095T3
Application number: ES05763003.0T
Authority: ES
Inventors: Thomas Scheibel; Daniel Huemmerich; Christian Ackerschott
Original assignee: AMSilk GmbH
Current assignee: AMSilk GmbH
Priority date: 2004-07-22
Filing date: 2005-07-21
Publication date: 2014-12-17
Anticipated expiration: 2025-07-21
Also published as: AU2005263622A1; JP2008506409A; US20110230911A1; CN102532295B; EP1773875A2; US8034897B1; RU2415938C2; WO2006008163A3; US20070214520A1; CN101018806B; CA2573780A1; DK1773875T3; KR20070059065A; CN101018806A; RU2007102846A; JP5128943B2; EP1773875B1; PL1773875T3; CN102532295A; US20100298877A1

Abstract

Una proteína recombinante de seda de araña que comprende una o más secuencias de proteínas de seda de araña repetitivas sintéticas, (a) en donde la secuencia repetitiva sintética comprende entre 5 a 50 unidades de repetición, y en donde una unidad de repetición consiste de la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 5 o variantes de esta, o (b) en donde la secuencia repetitiva sintética comprende entre 10 a 50 unidades de repetición, y en donde una unidad de repetición consiste de la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 3 o 10 variantes de esta y se combina con una unidad de repetición que consiste en la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 4 o variantes de esta, en donde las variantes en cada caso tienen una sustitución de aminoácido, deleciones de aminoácido y/o inserciones de aminoácido, en donde la sustitución de aminoácidos consiste en 1 sustitución de aminoácido, las deleciones de aminoácido consisten en entre 1 a 2 deleciones de aminoácido y/o las inserciones de aminoácido consisten en entre 1 a 2 inserciones de aminoácido.

Description

Proteínas recombinantes de la seda de araña

5 La presente invención se dirige a proteínas recombinantes de la seda de araña, ácidos nucleicos, que codifican para estas proteínas recombinantes de la seda de araña, así como también huéspedes adecuados para la expresión de los ácidos nucleicos. Además, la presente invención se dirige a un método de agregación de proteínas de seda de araña y el uso de las proteínas en el campo de la biotecnología y/o medicina y otros campos industriales, en particular en la fabricación de piezas de automóviles, en la construcción de aviones, en el procesamiento de textiles y cuero, así como en la fabricación y

10 procesamiento de papel, cosméticos, alimentos, dispositivos electrónicos, administración de fármacos y similares.

En esta solicitud se usan las siguientes abreviaturas:

NR, no repetitivo; Apr, gen de resistencia a ampicilina; IPTG, isopropilo-ß-D-tiogalactosido; GdmCl, cloruro de guanidinio;

15 GdmSCN, tiocianato de guanidinio; SDS, dodecilsulfato de sodio; PAGE, electroforesis en gel de poliacrilamina; Tris, tris(hidroximetil)aminometano; CD, dicroísmo circular; rep-proteínas, proteínas repetitivas; Da, Dalton; cps, cuentas por segundo; MRW, peso promedio por residuo; n.d., no determinado.

Las sedas de araña son polímeros de proteínas que muestran propiedades físicas extraordinarias (1). Entre los diferentes

20 tipos de sedas de araña, las draglines son las más intensamente estudiadas. Las sedas Dragline son utilizadas por las arañas que tejen orbe para construir el marco y los radios de las redes, como líneas de vida que se arrastran detrás de forma permanente. Para estos fines se requiere una alta resistencia a la tracción y elasticidad. La combinación de tales propiedades da como resultado una dureza que es mayor que la de la mayoría de otros materiales conocidos (1;2). Las sedas Dragline se componen generalmente de dos proteínas principales cuyas estructuras primarias comparten una

25 arquitectura común repetitiva (3;4).

Las variaciones de una sola unidad de repetición, que puede comprender hasta 60 aminoácidos, son iterados varias veces para representar la parte más grande de una secuencia de seda dragline. Estas unidades de repetición comprenden un conjunto limitado de motivos de aminoácidos diferentes. Un motivo que se encuentra en las unidades de repetición de la

30 seda dragline es un bloque típicamente de 6 -9 residuos de alanina. En los hilos de seda muchos motivos de poli-alanina forman pilas de láminas β cristalinas que conducen a resistencia a la tracción (5;6).

Los motivos ricos en glicina tales como GGX o GPGXX adoptan estructuras helicoidales flexibles que conectan las regiones cristalinas y proporcionan elasticidad al hilo (7).

35 Además, todas las proteínas de la seda dragline investigadas comprenden regiones en sus extremos carboxilo que no muestran ningún patrón de repetición obvio (regiones no repetitivas o NR). Hasta el momento ninguna función podría asignarse a estas regiones en el hilo final.

40 El ensamblaje de la seda in vivo es un proceso notable. Las proteínas de la seda de araña dragline se almacenan en concentraciones de hasta 50 % (p/v) (8) en la denominada glándula ampulácea mayor. Aunque se ha propuesto una "estructura helicoidal suelta dinámica" para las proteínas dentro de la glándula ampulácea mayor(8), datos más recientes sugieren una conformación aleatoria para las proteínas de la denominada Zona A, que representa la mayor parte de la glándula (9;10). La solución proteica altamente concentrada forma la base de seda (solución de hilatura), que muestra

45 propiedades de un cristal líquido (11-13).

El ensamblaje del hilo se inicia durante un paso de la base a través del conducto de hilatura acompañado de extracción de agua, sodio y cloruro (14;15). Al mismo tiempo las concentraciones de los iones más liotrópicos potasio y fosfato aumentan y el pH desciende de 6.9 a 6.3 (14-16). Finalmente el ensamblaje se desencadena por tensión mecánica, que es causada al

50 tirar el hilo hacia fuera del abdomen de la araña (17).

Para varios propósitos los hilos de seda natural no se pueden utilizar directamente, sino que tienen que ser disueltos y reagrupados en otras morfologías tales como películas, espumas, esferas, nanofibras, hidrogeles y similares.

55 La mayoría de las investigaciones relativas a películas fabricadas a partir de proteínas de la seda se han realizado con fibroína de seda, el componente proteico principal de la seda del gusano de la seda Bombyx mori. Las películas de fibroína de seda pueden moldearse a partir de soluciones acuosas o a partir de soluciones que contienen hexafluoroisopropanol (HFIP), ácido fórmico, y ácido trifluoroacético. En solución, las fibroínas de seda tienden a adoptar conformaciones helicoidales o aleatorias, dependiendo del solvente usado. Cuando se moldea en películas, las proteínas mantienen la

60 conformación del estado soluble o adoptan una conformación más rica en lámina β. En la mayoría de los casos el

procesamiento de las películas con metanol conduce a un aumento adicional del contenido de láminas β y de la cristalinidad. Además de fibroína de seda, se han empleado además otras proteínas de la seda para moldear películas. Vollrath y colaboradores investigaron películas fabricadas de proteínas extraídas de la glándula ampulácea mayor de la araña Nephila senegalensis. Las películas moldeadas contenían principalmente proteínas en una conformación aleatoria cuando se prepararon a partir de una solución acuosa. Sus estructuras cambiaron a lámina β tras la adición de cloruro de potasio. Adicionalmente, se han fabricado películas a partir de una proteína de seda sintética derivada de la proteína de seda dragline MaSpl de la araña Nephila clavipes mediante el uso de HFIP como solvente. En solución la proteína adoptó una estructura de α-hélice que cambia a una conformación más rica en lámina β cuando se moldea en una película.

Desafortunadamente, la generación de materiales de película funcionales de fibroína de seda natural está restringida por su secuencia de aminoácidos. La modificación química selectiva de la fibroína de seda sólo es posible en una extensión muy limitada debido a la baja abundancia (<1.5%) de cadenas laterales de aminoácidos químicamente reactivos que contienen grupos tiol, amino o carboxilo. Adicionalmente, la modificación genética dentro del huésped natural para alterar las proteínas de la seda y por lo tanto las propiedades de las películas es tedioso.

Aunque se han desentrañado algunos aspectos estructurales de las proteínas de la seda de araña, todavía se sabe poco sobre la contribución de las proteínas de seda individuales y sus elementos de estructura primaria para el proceso de ensamble. Los estudios comparativos de las dos principales proteínas de seda dragline de la araña de jardín Araneus diadematus, ADF-3 y ADF-4, revelaron que, aunque sus secuencia de aminoácidos son bastante similares (4), ellas muestran características de solubilidad y de ensamblaje notablemente diferentes: Mientras ADF-3 es soluble incluso a altas concentraciones (18), ADF-4 es virtualmente insoluble y se auto ensambla en estructuras filamentosas bajo condiciones especificas (resultados no publicados).

El interés científico y comercial inició la investigación de la fabricación a escala industrial de la seda de araña. La producción de seda de araña nativa es poco práctica debido al canibalismo de las arañas, y la producción artificial ha encontrado problemas para lograr tanto un rendimiento suficiente de proteínas como un ensamblaje del hilo con calidad. La expresión bacteriana arrojó niveles de proteína bajas, probablemente causados por un uso de codones diferentes en bacterias y en arañas. Los genes sintéticos con un uso de codones adaptado para el huésped de expresión llevaron a rendimientos más altos, pero las proteínas sintetizadas de los mismos mostraron características diferentes en comparación con las sedas de araña nativas. La expresión de los ADNc de seda dragline parciales en líneas celulares de mamífero sí rindió proteínas de la seda (por ejemplo ADF-3) que podría hilarse artificialmente en hilos 'de seda', aunque todavía de calidad inferior.

WO03060099 se refiere a métodos y dispositivos para la hilatura de proteínas de biofilamentos en fibras. Esta invención es particularmente útil para la hilatura proteínas de seda recombinantes a partir de soluciones acuosas y mejorar la resistencia de las fibras y la viabilidad de fabricación para hacer que la producción comercial y el uso de tales fibras sea practicable. En la misma, se describe la expresión de proteínas de seda de araña en células de mamífero, por ejemplo, células de la glándula mamaria de cabra transgénica.

La expresión de los genes de seda de araña auténticos en huéspedes bacterianos es -como se mencionó anteriormente ineficiente (24) ya que algunas secciones de genes contienen codones no eficazmente traducidos en las bacterias. Además, la manipulación de genes y la amplificación por PCR es difícil debido a la naturaleza repetitiva de las sedas. Para investigar las propiedades de las proteínas de seda de araña, las estrategias de clonación se emplean usando módulos de ADN sintético con un uso de codones adaptado al huésped de expresión correspondiente. Se obtuvieron genes sintéticos que codificaban para las proteínas que se asemejan a las regiones repetitivas de las sedas de araña (25-28). Sin embargo, ninguno de estos diseños de proteínas incluyó las regiones NR del carboxilo terminal que se encuentran en todas las sedas dragline.

Por lo tanto, es un objeto subyacente de la presente invención proporcionar proteínas de seda de araña recombinante que tengan características mejoradas, en particular, la capacidad de mejorada de expresarse con alto rendimiento y mejorar la resistencia y la flexibilidad, es decir, una mejor calidad. Además, es un objetivo de la presente invención proporcionar proteínas recombinantes de la seda de araña, que puedan expresarse convenientemente en sistemas de expresión ya conocidos. Es además un objetivo de la presente invención proporcionar un método mejorado para la agregación de las proteínas de seda de araña y un método para formar hilos fabricados de esas proteínas. Adicionalmente, es un objetivo de la presente invención proporcionar productos de papel, textil y de piel mejorados. Objetos adicionales son proporcionar nuevas proteínas y otros materiales basados en proteínas de seda de araña tales como esferas, nanofibrillas, hidrogeles, hilos, espumas, películas para usar en aplicaciones en biotecnología, medicina, farmacéutica y alimentarias, cosméticos, en dispositivos electrónicos y para otros fines comerciales.

Estos objetos se resuelven mediante la materia objeto de las reivindicaciones independientes. Las modalidades preferidas se exponen en las reivindicaciones dependientes.

El presente enfoque de ingeniería de proteínas, que proporciona proteínas recombinantes de seda de araña, que comprende o que consiste de secuencias de proteínas de seda de araña repetitivas sintéticas y/o regiones NR-auténticas (no repetitivas), revela que las proteínas muy parecidas a las proteínas de seda auténticas se pueden producir con altos rendimientos. En particular, el sistema de expresión bacteriana, así como el proceso de purificación simple y barato proporcionado en este documento, que se puede escalar fácilmente, proporciona la base para la producción a escala industrial rentable de proteínas del tipo de seda de araña.

Las proteínas de seda de araña principalmente han sido investigadas en cuanto a su contribución a las propiedades mecánicas del hilo de seda. Sin embargo, poco se sabe acerca de los mecanismos moleculares de ensamble de la seda. Como una primera etapa hacia la caracterización de este proceso, los inventores identificaron elementos de la estructura primaria de las proteínas principales de la seda dragline ADF-3 y ADF-4 de la araña de jardín (Araneus diadematus) que determinan la solubilidad de la proteína. Además, se investigó la influencia de las condiciones implicadas en la mediación de ensamblaje del hilo natural, en la agregación de proteínas. Se generaron genes que codifican para proteínas similares a la seda de araña mediante el uso de una estrategia de clonación de nuevo desarrollo, que se basa en una combinación de módulos de ADN sintéticos y secuencias génicas auténticas amplificadas por PCR. La comparación de las propiedades de la estructura secundaria, solubilidad y agregación de las proteínas sintetizadas reveló que los elementos estructurales primarios individuales tienen diversas influencias sobre las características de las proteínas. Las regiones repetitivas que representan la mayor parte de las proteínas de la seda dragline determinaron la solubilidad de las proteínas sintéticas, que difirieron mucho entre las construcciones derivadas de ADF-3 y ADF-4. Los factores, tales como la acidificación y el aumento de la concentración de fosfato, que promueven el ensamblaje de la seda in vivo, generalmente disminuyeron la solubilidad de las proteínas de la seda in vitro. De manera sorprendente este efecto fue pronunciado en las proteínas modificadas genéticamente que comprendían las regiones no repetitivas del carboxilo terminal de ADF-3 o ADF-4, lo que indica que estas regiones juegan un papel importante en la iniciación del ensamblaje de las proteínas de la seda de araña.

De acuerdo con un primer aspecto, la presente invención se dirige a una proteína recombinante de seda de araña que comprende una o más secuencias de proteínas de seda de araña repetitivas sintéticas.

(a): en donde la secuencia repetitiva sintética comprende entre 5 a 50 unidades de repetición, y en donde una unidad de repetición consiste de la secuencia de aminoácido de la sec. con núm. de ident.: 5 o variantes de esta, o

(b): en donde la secuencia repetitiva sintética comprende entre 10 a 50 unidades de repetición, y en donde una unidad de repetición consiste de la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 3 o variantes de esta y se combina con una unidad de repetición que consiste en la secuencia de aminoácido de la sec. con núm. de ident.: 4 o variantes de esta,

en donde las variantes en cada caso tienen un sustitución de aminoácido, deleciones de aminoácido y/o inserciones de aminoácido, en donde la sustitución de aminoácidos consiste en 1 sustitución de aminoácido, las deleciones de aminoácido consisten en entre 1 a 2 deleciones de aminoácido y/o las inserciones de aminoácido consisten en entre 1 a 2 inserciones de aminoácido.

El término "secuencia repetitiva sintética" como se usa en la presente se entiende como secuencia de proteína recombinante, que no puede encontrarse en la naturaleza, que sin embargo, se deriva de unidades de repetición, que son de origen natural en proteínas de seda de araña. Como se indicó anteriormente, las secuencias repetitivas comprenden una

o más unidades de repetición individuales, que comprenden hasta 60 aminoácidos. Las unidades de repetición de origen natural comprenden un conjunto limitado de motivos de aminoácido distintos. Las unidades de repetición confieren entre otros resistencia a la tracción y elasticidad al hilo, que pueden formarse más tarde a partir de la proteína de seda de araña.

Los diferentes tipos de unidades de repetición, que pueden formar la base para la secuencia repetitiva sintética de la invención, se explicarán en detalle más abajo.

El segundo componente de la proteína recombinante de seda de araña de la invención, que puede estar presente en adición a la secuencia repetitiva sintéticas o solo, comprende una o más secuencias de proteína no repetitivas autenticas. Estas secuencias no repetitivas desempeñan un papel funcional importante en el ensamble de hilos.

Se observa que en la presente invención, también se contemplan las proteínas recombinantes de seda de araña, que sólo comprenden secuencias repetitivas sintéticas. Aunque las proteínas recombinantes de la invención que muestran los dos componentes, es decir secuencias repetitivas sintéticas así como secuencias no repetitivas auténticas, tienen una variedad más amplia de utilidad y pueden producirse en mayores cantidades (ver el capítulo de Ejemplos más abajo), las proteínas recombinantes de la seda de araña que sólo tienen secuencias repetitivas sintéticas incluidas puede utilizarse para algunas aplicaciones específicas.

Estas aplicaciones son -entre otras -piezas de automóviles y aviones, revestimientos de superficies, así como sistemas de cierre de heridas y vendajes de heridas. O en otras palabras, las aplicaciones, en las que no se requieren estructuras de hilos de proteínas de seda de araña.

El término "auténtico" como se usa en la presente significa que las secuencias de ácidos nucleicos subyacentes se aíslan de su medio ambiente natural sin realizar enmiendas sustanciales en la secuencia en sí. La única modificación, que se acepta que se produzca, es donde la secuencia de ácido nucleico no repetitiva auténtica es modificada con el fin de adaptar dicha secuencia a la expresión en un huésped sin cambiar la secuencia de aminoácidos codificada. Las secuencias preferidas son NR3 (sec. con núm. de ident.: 10; derivada de ADF-3) y NR4 (sec. con núm. de ident.: 11; derivada de ADF-4). En las dos secuencias, para una traducción eficiente, el codón AGA (Arg), que se traduce rara vez en E. coli, se mutó a CGT (Arg) usando mutagénesis por PCR.

Secuencias no repetitivas auténticas preferidas de proteínas flageliformes son la secuencia de aminoácidos y la secuencia de ácido nucleico de FlagN-NR (sec. con núms. de ident.: 31 y 32) y FlagC-NR (sec. con núms. de ident.: 33 y 34).

De acuerdo con una modalidad preferida, las proteínas recombinantes de la seda de araña de la invención generalmente se derivan de proteínas dragline de araña a partir de glándula ampulácea mayor de la araña y/o a partir de proteínas derivadas de la glándula flageliforme.

De acuerdo con otra modalidad preferida, las secuencias no repetitivas auténticas se derivan de la región no repetitiva amino terminal (proteínas flageliformes) y/o la región no repetitiva carboxilo terminal (proteínas flageliformes y dragline) de una proteína de seda de araña de origen natural. Los ejemplos preferidos de estas proteínas se indicarán más abajo.

Generalmente se prefiere seleccionar las secuencias dragline y/o flageliformes a partir de proteínas dragline y/o flageliformes de arañas con telas en espiral (Araneidae y Araneoides).

Con mayor preferencia las proteínas dragline y/o proteínas flageliformes se derivan de una o más de las siguientes arañas: Arachnura higginsi, Araneus circulissparsus, Araneus diadematus, Argiope picta, araña de jardín de bandas (Argiope trifasciata), Araña de tela en oro de batik (Nephila antipodiana), araña telarañosa de Beccari (Cyrtophora beccarii), araña "caca de pájaro (Celaenia excavata), araña tejedoras espinosas blanca y negra (Gasteracantha kuhlii), araña de jardín negra y amarilla (Argiope aurantia), araña de bolas (Ordgarius furcatus), araña de bolas -araña magnificente (Ordgarius magnificus), araña marrón (Neoscona nautica), araña de patas marrón (Neoscona rufofemorata), araña de cabeza negra (Zygiella calyptrata), araña común de jardín (Parawixia dehaani), tejedora de orbe común (Neoscona oxancensis), tejedora de orbe cangrejo espinoso (Gasteracantha cancriformis (elipsoides)), araña espinosa curvada (Gasteracantha arcuata), Cyrtophora moluccensis, Cyrtophora parnasia, Dolophones conifera, Dolophones turrigera, araña espinosa de Doria (Gasteracantha doriae), Araña tejedora espinosa asiática (Gasteracantha mammosa), Araña telarañosa de dos colas (Cyrtophora exanthematica), Aculeperia ceropegia, Eriophora pustulosa, Flat Anepsion (Anepsion depressium), Araña tejedora cuadriespinosa (Gasteracantha quadrispinosa), Araña del tejedor del orbe del jardín (Eriophora transmarina), Araña tejedora de orbe gigante (Araneus bicentenarius), Arañas de seda dorada (Nephila maculata), araña espinosa de Hasselt (Gasteracantha hasseltii), Tegenaria atrica, Heurodes turrita, Araña cyclosa de las islas (Cyclosa insulana), araña joya (Astracantha minax), tejedor del orbe pálido (Araneus mitificus), araña de jardín de Laglaise (Eriovixia laglaisei), Araña cyclosa bífida (Cyclosa bifida), araña Malabar (Nephilengys malabarensis), araña cruz de San Andrés multi-coloreada (Argiope versicolor), Araña de tronco de árbol ornamental (Herennia ornatissima), araña cruz de San Andrés ovalada (Argiope aemula), araña tejedora roja (Cyrtophora unicolor), araña tejedora rusa (Cyrtophora hirta), araña cruz de San Andrés (Argiope keyserlingi), Scarlet Acusilas (Acusilas coccineus), Argiope plateada (Argiope argentata), araña tejedora con espalda espinosa (Gasteracantha cancriformis), tejedora de orbe manchada (Neoscona domiciliorum), cruz de San Andrés (Argiope aetheria), Araña Cruz de San Andrés (Argiope Keyserlingi), araña tocón de árbol (Poltys illepidus), araña triangular (Arkys clavatus), araña triangular (Arkys lancearius), araña doble espinada (Poecilopachys australasia), especies Nephila, por ejemplo Nephila clavipes, Nephila senegalensis, Nephila madagascariensis y muchas más (para otras especies de araña, ver más abajo). Las más preferidas, las proteínas de dragline se derivan de Araneus diadematus y las proteínas flageliformes se derivan de Nephila clavipes.

En el contexto de esta invención, debería ser evidente que una proteína recombinante de seda de araña no sólo puede comprender secuencias de proteína de una especie, sino que también puede contener secuencias derivadas de diferentes especies de arañas. Como un ejemplo, la una o más secuencias de proteínas de seda de araña repetitivas sintéticas pudieran derivarse de una especies, la una o más secuencias de proteína de seda de araña repetitivas no auténticas de otra. Como un ejemplo adicional, también es posible diseñar una proteína de seda de araña recombinante, que contiene más de un tipo de una secuencia repetitiva, en la que los diferentes tipos se derivan de diferentes especies.

De acuerdo con una modalidad preferida, la proteína dragline es ADF-3, ADF-4, MaSp I, MaSp II de tipo silvestre y la proteína flageliforme es FLAG. El término ADF-3/-4 se usa en el contexto de proteínas MaSp producidas por Araneus diadematus (fibroína de Araneus diadematus -3/-4). Ambas proteínas, ADF-3 y -4 pertenecen a la clase de proteínas MaSp II (espidroina II ampulácea mayor).

La fibra de seda tiene regiones cristalinas de lámina β intercaladas con segmentos amorfos elásticos similares a los polímeros cristalinos líquidos. Estos dos segmentos están representados por dos clases diferentes de proteínas, MaSp I (espidroina I ampulácea mayor) y MaSp II (espidroina II ampulácea mayor) codificada por genes diferentes.

Otras proteínas de seda de araña, que se pueden utilizar en esta invención (es decir, solo o en combinación con otras proteínas) y sus números de acceso de base de datos son:

espidroina 2 [Araneus bicentenarius]gi|2911272

proteína-1 de seda dragline de la glándula ampulácea mayor[Araneus ventricosus] gi|27228957

proteína-2 de seda dragline de la glándula ampulácea mayor[Araneus ventricosus]gi|27228959 ampullate

espidroina I [Nephila madagascariensis]gi|13562006

espidroina 1 de ampulácea mayor[Nephila senegalensis]gi|13562010

espidroina 1 de ampulácea mayor[Latrodectus geometricus]gi|13561998

espidroina 1 de ampulácea mayor[Argiope trifasciata]gi|13561984

espidroina 1 de ampulácea mayor[Argiope aurantia]gi|13561976

espidroina 2 de la proteína de la seda dragline [Nephila clavata]gi|16974791

espidroina 2 de ampulácea mayor[Nephila senegalensis]gi|13562012

espidroina 2 de ampulácea mayor[Nephila madagascariensis]gi|13562008

espidroina 2 de ampulácea mayor[Latrodectus geometricus]gi|13562002

Sin embargo, también las secuencias flageliformes y ya conocidas publicadas pueden usarse en la presente, en particular, la siguiente:

Cds parciales de proteínas de seda flageliformes [Nephila clavipes]gi|2833646

Cds parciales de proteínas de seda flageliformes [Nephila clavipes]gi|2833648

La secuencia consenso que contiene polialanina se deriva de ADF-3 y tiene la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.: 3 (módulo A) o una variante de esta como se definió anteriormente. El módulo A contiene una polialanina que tiene 6 residuos de alanina. Una secuencia consenso que contiene polialanina adicionalmente preferida, derivada de ADF-4, es el módulo C (sec. con núm. de ident.: 5), que contiene 8 residuos de alanina.

En la proteína recombinante de seda de araña de la invención, la secuencia repetitiva sintética se deriva de ADF-3 y comprende una o más repeticiones de secuencia de aminoácido de la sec. con núm. de ident.: 4 (módulo Q) o una variante de esta como se definió anteriormente.

Cabe destacar que los módulos específicos para la secuencia repetitiva sintética de la invención pueden combinarse además entre sí, por ejemplo, módulos (unidades de repetición) que combinan A y Q, Q y C etc. también están abarcados por la presente invención. El número de los módulos que se introducirá en la proteína de seda de araña está en el intervalo de 5-50 módulos, con mayor preferencia 10-40 y con la máxima preferencia entre 15-35 módulos.

La secuencia repetitiva sintética preferentemente comprende una o más de (AQ) como unidades de repetición. Con la máxima preferencia, la secuencia repetitiva sintética es (AQ)12, o (AQ)24.

Siempre que la secuencia repetitiva sintética se deriva de ADF-4, esta puede comprender preferentemente una o más repeticiones de la secuencia de aminoácido de sec. con núm. de ident.: 5 (módulo C) o una variante de esta, como se mencionó anteriormente, en donde la secuencia repetitiva sintética total es C16 o C32.

Las modalidades preferidas para las proteínas recombinantes de la seda de araña completas de la invención son (AQ)12NR3, (AQ)24NR3, C16NR4 y C32NR4 es decir proteínas que comprenden o consisten en dichas secuencias.

Se señala que la configuración anterior de la secuencia repetitiva sintética (con el uso del sistema A, Q y C) se aplica además a todas las demás unidades de repetición descritas anteriormente, por ejemplo todas las secuencias que contienen polialanina puede tomarse por A y/o C y todas las secuencias ricas en glicina pueden usarse como Q.

Además, también es posible combinar aquellas secuencias derivadas de ADF-3 y ADF-4 y Flag en una secuencia recombinante.

Como se explicó anteriormente, las secuencias de aminoácidos descritas en la presente no se restringen a las secuencias exactas proporcionadas en las sec. con núms. de ident. Las secuencias de aminoácidos indicadas en la presente también comprenden variantes. Por lo tanto, las secuencias de aminoácidos de las proteínas de la presente invención abarcan además todas las proteínas de seda de araña repetitivas sintéticas que comprenden las variantes de las unidades de repetición que consisten en la secuencia de aminoácido de sec. con núm. de ident.: 3, 4, o 5 en donde las variantes en cada caso tienen una sustitución de aminoácido, deleciones de aminoácido y/o inserciones de aminoácido, en donde la sustitución de aminoácidos consiste de 1 sustitución de aminoácido, las deleciones de aminoácido consisten en entre 1 a 2 deleciones de aminoácido y/o las inserciones de aminoácido consisten en entre 1 a 2 inserciones de aminoácido.

Las "sustituciones" de aminoácidos son el resultado de la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas similares, es decir, sustituciones de aminoácidos conservadoras. Las sustituciones de aminoácidos pueden realizarse sobre la base de similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad, y/o la naturaleza anfipática de los residuos en cuestión. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobo) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano, y metionina; los aminoácidos polares neutros incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, y glutamina; los aminoácidos positivamente cargados (básicos) incluyen arginina, lisina, e histidina; y los aminoácidos negativamente cargados (acídicos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico.

"Inserciones" o "eliminaciones" están típicamente en el intervalo de aproximadamente 1 a 2 aminoácidos.

La variación permitida puede determinarse experimentalmente al producir inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos de manera sistemática en una proteína mediante el uso de técnicas de ADN recombinante y pruebas de actividad para las variantes recombinantes resultantes. Esto no requiere más que experimentos de rutina para el experto en la técnica.

La presente invención, de acuerdo con un segundo aspecto, se dirige a una secuencia de ácido nucleico, que codifica una proteína recombinante de seda de araña como se describió anteriormente.

El término "secuencia de ácido nucleico" se refiere a un heteropolímero de nucleótidos o la secuencia de esos nucleótidos. Los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" se usan indistintamente en la presente descripción para referirse a un heteropolímero de nucleótidos.

La rigurosidad de la hibridación, como se usa en la presente, se refiere a las condiciones bajo las cuales los dúplex de polinucleótidos son estables. Como es conocido por los expertos en la técnica, la estabilidad del dúplex es una función de la concentración de iones de sodio y la temperatura (véase, por ejemplo, Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2o. Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)). Los niveles de rigurosidad usados para hibridar se pueden variar fácilmente por los expertos en la técnica.

Como se usa en la presente, la frase "condiciones moderadamente rigurosas" se refiere a condiciones que permiten que el ADN se una a un ácido nucleico complementario que tiene aproximadamente 60% de identidad, preferentemente aproximadamente 75% de identidad, con mayor preferencia aproximadamente 85% de identidad al ADN; y se prefiere especialmente más de aproximadamente 90% de identidad a dicho ADN. Preferentemente, las condiciones moderadamente rigurosas son condiciones equivalentes a la hibridación en 50% de formamida, 5 x solución de Denhart, 5 x SSPE, 0.2% SDS a 42°C, seguido por lavado en 0.2 x SSPE, 0.2% SDS, a 65°C.

De acuerdo con un tercer aspecto, se proporciona un vector que comprende los ácidos nucleicos anteriormente mencionados. Preferentemente, se proporciona un vector de expresión, que comprende dichos ácidos nucleicos. Este vector de expresión comprende preferentemente una o más secuencias reguladoras. El término "vector de expresión" se refiere generalmente a un plásmido o fago o virus o vector, para expresar un polipéptido/proteína de una secuencia de ADN (ARN). Un vector de expresión puede comprender una unidad transcripcional que comprende un ensamblaje de (1) un elemento genético o elementos que tienen un papel regulador en la expresión génica, por ejemplo, los promotores o potenciadores,

(2) una secuencia estructural o de codificación, que se transcribe en el ARNm y se traduce en proteína, y (3) las secuencias de iniciación y terminación de la traducción y transcripción adecuadas. Las unidades estructurales destinadas para su uso en sistemas de expresión de levadura o eucariotas preferentemente incluyen una secuencia líder que permite la secreción extracelular de la proteína traducida por una célula huésped. Alternativamente, donde la proteína recombinante se expresa

sin una secuencia líder o de transporte, esta puede incluir un residuo de metionina amino-terminal. Este residuo puede ser escindido posteriormente de la proteína recombinante expresada para proporcionar un producto final.

De acuerdo con una modalidad preferida, el vector es un plásmido o un vector viral, que preferentemente es un sistema de

5 baculovirus o un sistema de vector de virus vaccinia. En esta invención pueden usarse además otros sistemas de vectores virales. De un caso a otro, puede necesitarse una modificación del vector. Ejemplos de otros vectores virales son los adenovirus y todos los virus de ARN de cadena negativa, por ejemplo, la rabia, el sarampión, el RSV, etc.

De acuerdo con una modalidad preferida, el vector es el vector de clonación pAZL como se define en la Figura 6 o en la sec.

10 con núm. de ident.: 55, o una variante de este como se definió anteriormente. Este vector muestra las siguientes propiedades y ventajas:

1. alta amplificación (más alta que otros vectores de clonación)

2. permite una construcción controlada y sin problemas de genes sintéticos (no se conoce otro vector que proporcione 15 esta capacidad).

Un cuarto aspecto de la invención comprende un huésped, que se ha transformado con el vector como se definió anteriormente.

20 El huésped puede ser una célula procariota. En este caso se prefieren, E. coli o Bacillus subtilis.

Además, el huésped puede ser una célula eucariota, preferentemente una célula de mamífero, célula vegetal, célula de levadura o una célula de insecto.

25 La célula de mamífero preferentemente es una célula CHO, COS, HeLa, 293T, HEH o BHK.

Se prefiere usar además una célula de levadura como una célula hospedera, que preferentemente es Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Candida albicans o Hansenula polymorpha.

30 Como células de insectos, las células de insectos Lepidópteros pueden usarse preferentemente, con mayor preferencia células de Spodoptera frugiperda y de Trichoplusia ni. Con la máxima preferencia, la célula de insecto es una célula Sf9, Sf21 o high-5.

Una ventaja del sistema de expresión en células de insecto, por ejemplo con respecto a los sistemas bacterianos, reside en

35 el hecho de que las proteínas producidas están glicosiladas, por lo tanto son un blanco para la degradación por microorganismos. Esta característica puede ser de importancia, por ejemplo, en el campo de la medicina, siempre que las proteínas de la seda estén destinadas a un uso in vivo, en que se desea la degradación biológica. Esta característica puede encontrar aplicación particularmente en materiales de sutura y cierre de heridas y en sistemas de cobertura.

40 Cuando el huésped es una célula vegetal, la célula vegetal se deriva preferentemente del tabaco, papa, maíz y tomate.

De acuerdo con un quinto aspecto, se proporciona un método de agregación de proteínas de la seda de araña, que comprende las siguientes etapas:

45 a) preparar una solución de proteínas que contiene proteínas de seda de araña no orientadas como se define en la presente descripción; b) exponer la solución preparada en a) a un inductor de de agregación; y c) recuperar las proteínas de seda de araña precipitadas.

50 Preferentemente, las proteínas de seda de araña usadas en la etapa a) se producen por transformación de un huésped adecuado como se definió anteriormente con un vector o un ácido nucleico descrito en la presente, y que expresa el gen de la seda de araña bajo condiciones adecuadas.

El inductor de agregación se selecciona preferentemente de acidificación, preferentemente a un pH de aproximadamente 1,

55 fosfato de potasio y tensión mecánica, preferentemente al rotar la solución de proteína y aplicar fuerzas de cizalla. La etapa desencadenante resultó ser esencial para realizar el método de esta invención.

Sorprendentemente los inventores mostraron que en particular los factores desencadenantes mencionados anteriormente mejoraron la agregación de proteínas de la seda de araña, que es un resultado muy deseado particularmente desde el punto 60 de vista industrial. En este sentido se hace referencia al capítulo de "Resultados" más abajo, donde se explica la influencia

de estos factores desencadenantes sobre las proteínas recombinantes de la seda de araña de la invención: la influencia de cada factor desencadenante puede variar entre las diferentes proteínas recombinantes de la seda de araña de esta invención, sin embargo, puede verse como un concepto general que esos factores desencadenantes in vitro muestran una influencia inesperadamente alta sobre todas las proteínas recombinantes, que comprenden los componentes de la presente invención, es decir las regiones repetitivas y/o no repetitivas. Adicionalmente, de los resultados proporcionados en la presente puede derivarse que no solo un factor desencadenante, sino además combinaciones de ellos pueden conducir a la mejor manera de agregar las proteínas de la seda de araña de la invención.

Sin embargo, cabe señalar que este método no se limita a las proteínas de la seda de araña de la presente invención, sino que además puede aplicarse a todas las demás proteínas de la seda de araña disponibles, tanto si se producen de manera natural como sintética.

El método comprende además preferentemente la etapa de hilatura de dichas proteínas preparadas en la etapa a) o recuperadas en c) en filamentos, nanofibras e hilos mediante un método adecuado.

Para este propósito, pueden usarse métodos de hilatura, que se conocen per se en la técnica. Por ejemplo, una solución base de proteína de la seda de araña se extrude a través de una tobera de hilatura para formar un biofilamento. El biofilamento resultante puede alargarse o estirarse. Siempre que existan arreglos de moléculas tanto cristalinos como amorfos en los biofilamentos, el alargamiento o estiramiento aplicarán un esfuerzo de cizalla suficiente para orientar las moléculas y hacerlas más paralelas a las paredes del filamento y aumentar la resistencia a la tracción y la dureza del biofilamento.

La solución base puede contener las proteínas de la seda recombinantes de la invención y/o proteínas de la seda auténticas de una o más especies de arañas, o proteínas de la seda de diferentes géneros que producen seda, por ejemplo, una mezcla de proteínas de la seda de arañas y B. mori. En las modalidades más preferidas, las proteínas de la seda son sedas dragline y/o flageliformes de N. clavipes o A. diadematus, particularmente las proteínas MaSpl, MaSpII, ADF-3, ADF-4 y Flag. En modalidades alternativas, la solución base contiene una mezcla de proteínas de la seda y uno o más polímeros sintéticos o proteínas de biofilamentos naturales o sintéticos.

Preferentemente, la solución base es al menos 1%, 5%, 10%, 15% en peso/volumen (p/v) de proteína de la seda. Con mayor preferencia, la solución base es tanto como 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, o 50% p/v de proteína de la seda. En modalidades preferidas, la solución base contiene proteína de la seda de araña sustancialmente pura. En modalidades preferidas, la base tiene un pH de aproximadamente 6.9.

Por "solución base" se entiende cualquier mezcla líquida que contiene proteína de la seda y es susceptible de extrusión para la formación de un biofilamento o moldeado de una película. Las soluciones base también pueden contener, además de los monómeros de proteínas, agregados de orden superior que incluyen, por ejemplo, dímeros, trímeros, y tetrámeros. Normalmente, las soluciones base son soluciones acuosas de pH 4.0-12.0 y que tienen menos de 40% de compuestos orgánicos o agentes caotrópicos (p/v). Preferentemente, las soluciones base no contienen solventes orgánicos o agentes caotrópicos, pero pueden incluir aditivos para mejorar la conservación, la estabilidad, o la facilidad de trabajo con la solución.

Por "filamento" se entiende una fibra de longitud indefinida, que está en el intervalo de longitud microscópica y de nanoescala a longitudes de una milla o mayores. La seda es un filamento natural, mientras que el nailon y el poliéster como ejemplo son filamentos sintéticos.

Más información respecto a cómo hilar las fibras de proteína de seda de araña puede encontrarse en WO03060099 (Karatzas y otros), publicado el 24 de julio de 2003, que se incorpora en la presente como referencia.

Además, las proteínas de seda de araña de la presente invención puede proporcionarse como películas o similares, por ejemplo, como un producto de proteína de seda de araña, para el que no se requiere una etapa de hilatura.

Para una descripción más detallada del proceso de fabricar películas se hace referencia al capítulo de Ejemplos.

Adicionalmente, el método de la presente invención puede incluir preferentemente en la etapa a) y/o c) un método de purificación, que comprende exponer las proteínas de la seda de araña expresadas a una desnaturalización por calor a 6090, preferentemente 70-80 °C seguido de la adición de sulfato de amonio de 600-1400 mM, preferentemente 800-1200 mM.

Como ya se ha explicado anteriormente, las proteínas/hilos tal como se define en la presente pueden usarse en el campo de

la biotecnología y/o la medicina, preferentemente para la fabricación de sistemas de cobertura o cierre de heridas, materiales de sutura para su uso en neurocirugía o cirugía oftálmica.

Además, las proteínas/hilos pueden usarse preferentemente para la fabricación de materiales de reemplazo, preferentemente materiales artificiales de cartílago o tendón.

Adicionalmente, los hilos/fibras de la invención pueden usarse en la fabricación de dispositivos médicos tales como tiras adhesivas médicas, injertos de piel, ligamentos de reemplazo, y malla quirúrgica; y en una amplia variedad de productos industriales y comerciales, tales como tejido para ropa, revestimiento de chaleco antibalas, tejido de recipientes, correas de bolsas o carteras, cable, cuerda, material de unión adhesiva, material de unión no adhesiva, material de precinto, cubiertas y partes de automóviles, material de construcción de aviones, material de impermeabilización, material de partición flexible, equipos deportivos; y, de hecho, en casi cualquier uso de fibra o tejido para el que se desean las características de alta resistencia a la tracción y elasticidad. La presente invención contempla además la adaptabilidad y el uso del producto de fibra estable en otras formas, tales como un revestimiento por rociado en seco, partículas similares a perlas, o su uso en una mezcla con otras composiciones.

Se señala explícitamente que las aplicaciones más preferidas de las proteínas de la seda de araña de la presente invención están en la fabricación y procesamiento de tejido para ropa (textiles) y cuero, cubiertas y partes de automóviles, materiales de construcción de aviones así como en la fabricación y procesamiento de papel.

Las proteínas recombinantes de la seda de araña de la presente invención pueden añadirse a productos con celulosa y queratina y colágeno y por lo tanto, la presente invención está dirigida además a un papel o producto de de cuidado de la piel y cuidado del cabello, que comprende celulosa y/o queratina y/o colágeno y las proteínas de la seda de araña de la presente invención. Los papeles y productos de cuidado de la piel y cuidado del cabello, en los que se incorporan las proteínas de la presente invención muestran características mejoradas, particularmente resistencia a la tracción o resistencia al desgarro mejores.

Además, las proteínas recombinantes de la seda de araña de la invención pueden usarse como un revestimiento para productos textiles y de cuero, lo que confiere de esta manera estabilidad y durabilidad al producto recubierto. Las proteínas de la seda en particular muestran aplicabilidad para el revestimiento de productos de cuero, ya que en este caso, el curtido y sus efectos negativos para el medio ambiente pueden evitarse o al menos reducirse.

A menos que se defina de cualquier otra forma, todos los términos técnicos y científicos que se usan en la presente descripción tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente el experto en la técnica a la cual pertenece la invención. Todas las publicaciones, solicitudes de patentes, patentes y otras referencias mencionadas en la presente descripción se incorporan como referencia en su totalidad. En caso de conflicto, la presente descripción, incluyendo las definiciones, controlará. Además, los materiales, métodos, y ejemplos son ilustrativos solamente y no pretenden ser limitantes.

La invención se ilustra ahora adicionalmente mediante los ejemplos y los dibujos adjuntos, que muestran lo siguiente:

Figura 1 Estrategia de clonación para construir genes sintéticos de la seda de araña. (A) El casete de clonación comprende los sitios de restricción requeridos para la multimerización de módulos (BsgI y BseRI) y para la escisión de los genes ensamblados (NcoI, BamHI, HindIII). Durante la construcción génica la región espaciadora se reemplazó por módulos y multímeros de módulos. (B) La conexión, de manera dirigida al sitio, de dos módulos se llevó a cabo al ligar dos fragmentos plasmídicos apropiados. El gen de resistencia a la ampicilina del vector (Apr) se reconstituyó. (C) Los nucleótidos necesarios para unir dos módulos se confinaron dentro del primer codón de cada módulo. (D) Los multímeros de módulos se conectaron como módulos individuales lo que resultó en un ensamblaje controlado de los genes sintéticos. (E) Las secuencias de aminoácidos de los módulos de seda diseñados se derivaron a partir de las proteínas de la seda dragline ADF-3 y ADF-4.

Figura 2 Análisis de proteínas de la seda de araña. (A) Las etiquetas T7 de las proteínas recombinantes de la seda se detectaron después de una transferencia de tipo Western con un anticuerpo anti-etiqueta T7. (B) Las proteínas se sometieron a SDS-PAGE seguido de tinción con plata. Debido a una tinción débil de (AQ)12 y (QAQ)8 el contraste de la imagen se aumentó electrónicamente. (C) Se muestran espectros de emisión de fluorescencia de C16NR4 purificada con longitudes de onda de excitación de 280 nm (línea recta) o 295 nm (línea de puntos), respectivamente.

Figura 3 Estructura secundaria y transiciones de temperatura de proteínas de la seda de araña. (A) Los espectros de CD de proteínas rep (líneas rectas), proteínas repNR (líneas de puntos) y proteínas NR (guiones largos) se registraron a 20°C. (B) Las elipticidades del peso promedio por residuo (MRW) de las proteínas solubles de la seda de araña se

midieron a 220 nm al calentar las proteínas sintéticas de la seda a 90°C (línea recta), seguido de enfriamiento a 20°C (línea de puntos).

Figura 4 Agregación de proteínas sintéticas de la seda de araña. La agregación de las proteínas se determinó después

5 de una incubación durante 1 hora en tampón (control), en presencia de 300 mM de NaCl, o 300 mM de KCl, a pH 1 o en presencia de 300 mM de fosfato de potasio. Las barras para las proteínas derivadas de ADF-3: gris claro; de ADF-4: gris oscuro.

Figura 5 Estrategia de clonación para la construcción de genes sintéticos de la seda de araña flageliforme (ver Figura 1).

10 Los módulos individuales se conectaron como homo-multímeros (a), así como hetero-multímeros (b). (c) muestra las secuencias de aminoácidos de los módulos diseñados de la seda flageliforme derivados de una proteína de seda flageliforme (Flag) a partir de Nephila clavipes.

La Figura 6 muestra un mapa de restricción del vector pAZL.

15 Figura 7: Formas de ensamblaje de proteínas de la seda de araña. (A) Esferas formadas por C16 visualizadas mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). (B) Nanofibrillas formadas por C16NR4 visualizadas mediante microscopía de fuerza atómica (información de altura). (C, D) Microfibrilla formada por (AQ)24NR3 investigada mediante SEM (C). Para el corte de la fibrilla y la posterior visualización de la sección transversal se usó un haz de iones Ga+ enfocado (D). (E)

20 Espuma generada a partir de una solución de (AQ)24NR3. (F) Espuma generada a partir de una solución de C16NR4. (G) Gel reticulado formado por nanofibrillas de C16NR4.

Figura 8: Espectros de CD de las proteínas sintéticas de la seda (AQ)24NR3 y C16 disueltas en 6 M de tiocianato de guanidina seguido por diálisis contra 5 mM de fosfato de potasio pH 8.0 (línea recta) o disueltas en HFIP (línea de

25 puntos).

Figura 9: Moldeado de película de C16 a partir de una solución de C16 al 2% p/v en HFIP.

Figura 10: Espectros de CD de películas de proteínas producidas a partir de (AQ)24NR3 y C16. Las películas se

30 moldearon a partir de una solución de proteínas en HFIP directamente sobre un vidrio de cuarzo plano y se analizaron por espectroscopía de CD (línea de puntos). La película se procesó posteriormente con 1 M de fosfato de potasio y se volvió a analizar. Debido a imprecisiones en la definición del espesor de las películas, la □ΘMRW no pudo determinarse.

Figura 11: Modificación de películas de C16 moldeadas a partir de una solución de HFIP y procesadas con fosfato de

35 potasio. (A) El acoplamiento eficiente de la fluoresceína (color amarillo) sólo ocurrió cuando los grupos carboxilo de C16 se activaron (+) con el uso de EDC. En contraste sólo se unió poca fluoresceína a las películas sin activación con EDC (). (B) La actividad de la β-galactosidasa acoplada se monitoreó mediante el uso de X-Gal como sustrato. La aparición de un precipitado azul indicó la actividad de la enzima sólo en películas que se habían activado con EDC (+), mientras que las películas no activadas sólo mostraron actividad enzimática residual (-).

Figura 12: Imagen de AFM de nanofibras de C16.

Figura 13: Hidrogeles preparados de nanofibras de C16

45 Figura 14: El comportamiento de tensión/deformación de los hidrogeles reticulados y no reticulados a una concentración de 10 mg/ml.

Figura 15: Dependencia de la frecuencia del módulo de almacenamiento (G') y el módulo de pérdida (G") tanto para las redes de fibras reticuladas como no reticuladas a una concentración de 20 mg/ml.

50 Figura 16: Dependencia de la concentración del módulo de almacenamiento a una frecuencia de 0.5 Hz tanto para los hidrogeles reticulados como no reticulados. Ambas redes tienen módulos de almacenamiento que son proporcionales al cuadrado de la concentración [c]2.

55 EJEMPLOS

Procedimientos experimentales

Materiales. Productos químicos se obtuvieron de Merck KGaA (Darmstadt, Alemania) si no se indica lo contrario. La 60 manipulación y modificación del ADN se realizó como se describió previamente (19). Las enzimas de restricción se 11

obtuvieron de New England Biolabs (Beverly, MA, USA) y la ligasa de Promega Biosciences Inc. (San Luis Obispo, CA, USA). La purificación del ADN se realizó usando kits de Qiagen (Hilden, Alemania). Los oligonucleótidos sintéticos se obtuvieron de MWG Biotech AG (Ebersberg, Alemania). Todas las etapas de clonación se realizaron en la cepa de E. coli DH10B de Novagen (Madison, WI, USA).

Construcción del vector de clonación pAZL. Un casete de clonación con extremos coherentes complementarios a los generados por BglII y HindIII se creó mediante hibridación de dos oligonucleótidos sintéticos CCl (GATCGAGGAGGATCCATGGGACGAATTCACGGCTAATGAAAGCTTACTGCAC) (sec. con núm. de ident.: 18) y CC2 (AGCTGTGCAGTAAGCTTTCATTAGCCGTGAATTCGTC CCATGGATCCTCCTC) (sec. con núm. de ident.: 19). La hibridación se llevó a cabo disminuyendo la temperatura de una solución de oligonucleótidos de 50 pmol/µl (cada una) de 95°C a 20°C con un incremento de 0.1°C/s. Las cadenas dobles no apareadas se desnaturalizaron a 70°C seguido de otro descenso de la temperatura a 20°C. Después de repetir el ciclo a 20°C-70°C-20°C diez veces, se realizaron diez ciclos adicionales con una temperatura de desnaturalización de 65°C. El casete de clonación resultante se ligó con un vector pFastBacl (Invitrogen, Carlsbad, California, Estados Unidos) digerido con BglII y HindIII. Ambas secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción se destruyeron tras esta etapa de clonación. El nuevo vector de clonación resultante se denominó pAZL.

Clonación de módulos de seda y regiones NR en el vector pAZL. Tres módulos de aminoácidos derivados de las proteínas de la seda dragline ADF-3 y ADF-4 (Fig.1E) se volvieron a traducir a una secuencia de ADN considerando el uso de codones bacterianos. Los oligonucleótidos de ADN complementarios correspondientes A1 (TCCGTACGGCCCAGGTGCTAGCGCCGCAGCGGCAGCGGCTGGT GGCTACGGTCCGGGCTCTGGCCAGCAGGG) (sec. con núm. de ident.: 20) y A2 (CTGCTGGCCAGAGCCCGGACCGTAGCCACCAGCCGCTGCCGCTGCGGCGCTAGCAC CTGGGCCGTACGGACC) (sec. con núm. de ident.: 21), Q1 (TCCGGGCCAGCAGGGCCCGGGTCAAC AGGGTCCTGGCCAGCAAGGTCCGGGCCAGCAGGG) (sec. con núm. de ident.: 22) y Q2 (CTGCT GGCCCGGACCTTGCTGGCCAGGACCCTGTTGACCCGGGCCCTGCTGGCCCGGACC) (sec. con núm. de ident.: 23), C1 (TTCTAGCGCGGCTGCAGCCGCGGCAGCTGCGTCCGGCCCGGG TGGCTACGGTCCGGAAAACCAGGGTCCATCTGGCCCGGGTGGCTACGGTCCTGGCG GTCCGGG) (sec. con núm. de ident.: 24) y C2 (CGGACCGCCAGGACCGTAGCCACCCGGGCCAG ATGGACCCTGGTTTTCCGGACCGTAGCCACCCGGGCCGGACGCAGCTGCCGCGGCTG CAGCCGCGCTAGAACC) (sec. con núm. de ident.: 25) se sintetizaron e hibridaron como se describió anteriormente y se ligaron al vector pAZL digerido con BsgI y BseRI. Las regiones NR de los genes de seda de araña adf-3 (gi|1263286) y adf-4 (gi|1263288) (obtenidos de Prof.

Gosline, Vancouver, Canadá) se amplificaron por PCR usando los siguientes (GAAAAACCATGGGTGCGGCTTCTGCAGCTGTATCTG) (sec. con núm. de ident.: (GAAAAGAAGCTTTCATTAGCCAGCAAGGGCTTGAGCTACAGATTG) (sec. con núm. de (GAAAAACCATGGGAGCATATGGCCCATCTCCTTC) (sec. con núm. de ident.: (GAAAAGAAGCTTTCATTAGCCTGAAAGAGCTTGGCTAATCATTTG) (sec. con núm. de ident.: 29).: iniciadores: 26), ident.: 27), 28) y NR3f NR3r NR4f NR4r

Para las secuencias Flag, pueden usarse los siguientes iniciadores y casetes:

Iniciador de PCR:

FLAG-N-chr-sentido: (sec. con núm. de ident.: 43) 5'-GAAAAACCATGGGCGAAAGCAGCGGAGGCGAT -3' FLAG-N-chr-anti: (sec. con núm. de ident.: 44) 5'-GAAAAGAAGCTTTCATTAGCCTGGGCTGTATGGTCC -3'

FLAG-C-chr-sentido: (sec. con núm. de ident.: 45)

5'-GAAAAACCATGGGTGCTTATTATCCTAGCTCGC -3' FLAG-C-chr-anti: (sec. con núm. de ident.: 46) 5'-GAAAAGAAGCTTTCATTAGCCATAAGCGAACATTCTTCCTAC -3'

Oligos para secuencias repetitivas a partir de las que se generaron casetes:

Módulo Y-(GPGGX)-ds: (sec. con núm. de ident.: 47)

Módulo sp-(espaciador)-ds: (sec. con núm. de ident.: 49)

Módulo K (GPGGAGGPY)-ds: (sec. con núm. de ident.: 51)

Los productos de PCR y el vector pAZL se ligaron después de la digestión con NcoI y HindIII. La clonación de los módulos sintéticos así como los productos de PCR resultó en la sustitución del espaciador del casete de clonación, lo que preservó la

35 disposición de sus elementos. Para una traducción más eficaz, el codón AGA (Arg), que rara vez se traduce en E. coli, se mutó a CGT (Arg) en NR3 y NR4 con el uso de mutagénesis por PCR (19).

Construcción de genes sintéticos de la seda de araña. La conexión de dos fragmentos génicos por ejemplo módulos individuales, multímeros de módulos o regiones NR representó la etapa básica de la estrategia de clonación. Para este

40 propósito el vector pAZL, que contiene el fragmento génico 5' terminal designado se digirió con BsaI y BsgI, mientras que el vector que comprende el fragmento génico 3' terminal se digirió con BseRI y BsaI, respectivamente (Fig. 1B). La ligación de los fragmentos plasmídicos apropiados produjo la conexión de los dos fragmentos génicos y condujo a la reconstitución del gen de resistencia a la ampicilina (Apr) del vector pAZL que facilitó la identificación de las construcciones correctas.

45 Para la construcción de los genes, los módulos individuales se conectaron primero para producir unidades de repetición (Fig.1D + Fig.5). Estos se multimerizaron gradualmente y opcionalmente se unieron con regiones NR. Finalmente, las construcciones de los genes sintéticos así como las regiones NR se escindieron del vector pAZL con BamHI y HindIII y se ligaron con el vector de expresión bacteriano pET21a (Novagen) igualmente digerido, lo que proporciona una secuencia codificante para una etiqueta T7 (MASMTGGQQMGR) (sec. con núm. de ident.: 30) (20). La fidelidad de todas las

50 construcciones se confirmó por secuenciación de ADN.

Expresión génica. Todos los genes de la seda se expresaron en la cepa de E. coli BLR [DE3] (Novagen). Las células se cultivaron a 37°C en medio LB a una OD600 = 0.5. Antes de la inducción con 1 mM de IPTG (Isopropil-ß-D-tiogalactosido), las células se cambiaron a 30°C en el caso de (AQ)12, (AQ)12NR3, (QAQ)8, y (QAQ)8NR3 y a 25°C en el caso de C16,

55 C16NR4, NR3 y NR4 respectivamente. Alternativamente las células se cultivaron en un fermentador a una OD600 = 40-50 con el uso de medios complejos (21) y la técnica de alimentación por lotes (22). De nuevo, antes de la inducción con 1 mM de IPTG las células se cambiaron a 25°C o 30°C, respectivamente. Las células que expresan (AQ)12, (AQ)12NR3, (QAQ)8, (QAQ)8NR3, C16 y C16NR4 se cosecharon después de 3-4 horas de la inducción mientras que las células que expresan NR3 y NR4 se cosecharon después de 16 horas.

Purificación de proteínas. Las células se resuspendieron con 5 ml/g de amortiguador que contenía 20 mM de N-(2hidroxietil)piperazina-N'-(ácido 2-etanosulfónico) (HEPES) pH 7.5, 100 mM de NaCl, 0.2 mg/ml de lisozima (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos) y se incubaron a 4°C durante 30 min. Las células se lisaron por sonicación mediante el uso de un ultrasonicador HD/UW2200/KE76 (Bandelin, Berlín, Alemania) y el ADN genómico se digirió al incubar los lisados celulares con 0.1 mg/ml de DNasa I (Roche, Mannheim, Alemania) y 3 mM de MgCl2 a 4°C durante 60 minutos. Los fragmentos celulares insolubles se sedimentaron a 50,000×g y 4°C durante 30 min. Las proteínas solubles de E. coli de los lisados que contenían (AQ)12, (AQ)12NR3, (QAQ)8, (QAQ)8NR3, C16 y C16NR4 se precipitaron mediante desnaturalización por calor a 80°C durante 20 min, mientras que los lisados que contenían NR3 y NR4 se calentaron a 70°C durante el mismo período de tiempo. Las proteínas precipitadas se eliminaron mediante sedimentación a 50,000×g durante 30 min. Las proteínas de la seda, que permanecieron solubles durante la desnaturalización por calor, se precipitaron con sulfato de amonio al 20% (800 mM) ((AQ)12. (AQ)12NR3, (QAQ)8, (QAQ)8NR3, C16 y C16NR4) o sulfato de amonio al 30% (1200 mM) (NR3 y NR4) a temperatura ambiente y se cosecharon mediante centrifugación a 10,000×g durante 10 min. Los sedimentos de (AQ)12, (AQ)12NR3, (QAQ)8, (QAQ)8NR3, NR3 y NR4 se enjuagaron con una solución que contenía la misma concentración de sulfato de amonio tal como se usó para la precipitación y se disolvieron en 6 M de cloruro de guanidinio (GdmCl). En contraste C16 y C16NR4 se lavaron con 8 M de urea y se disolvieron en 6 M de tiocianato de guanidinio (GdmSCN). Todas las proteínas se dializaron contra 10 mM de NH4HCO3. Los precipitados formados durante la diálisis se eliminaron por sedimentación a 50,000xg durante 30 min y las restantes proteínas solubles de la seda se liofilizaron. Antes del análisis la proteína liofilizada se disolvió en 6 M de GdmSCN seguido por diálisis frente a tampones adecuados. Los agregados se eliminaron por sedimentación a 125,000 ×g durante 30 min. Las concentraciones de proteínas se determinaron por fotometría en una cubeta de 1 cm de longitud de la trayectoria a 276 nm con el uso de coeficientes de extinción calculados (Tabla 1) (23). La identidad de las proteínas se confirmó por electroforesis en gel de dodecilsulfato sódico -poliacrilamida (SDS-PAGE; geles de Tris-glicina 10% para proteínas > 20 kDa y geles de Tris-Tricina 10 -20% (Invitrogen) para proteínas < 20 kDa), seguido de transferencia sobre membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore, Billerica, MA, Estados Unidos) y la detección mediante el uso de un anticuerpo monoclonal anti-T7 de ratón (Novagen, 1:10,000) como primario y un conjugado de peroxidasa y anti-1gG de ratón (Sigma-Aldrich, 1:5,000) como anticuerpo secundario. La actividad peroxidasa se visualizó con el uso del kit de detección de membrana de Western ECLplus de Amersham Biosciences (Piscataway, NJ, Estados Unidos).

Fluorescencia. Los espectros de fluorescencia se registraron en un Espectrofluorómetro FluoroMax (Jobin Yvon Inc, Edison, NJ, Estados Unidos). Los espectros se tomaron mediante el uso de una concentración de proteínas de 100 µg/ml en 10 mM de Tris (hidroximetil) aminometano (Tris) / HCl (pH 8.0) a temperatura ambiente. El tiempo de integración fue de 1 s, el tamaño del paso fue de 0.5 nm y los anchos de banda fueron de 5 nm (excitación) y 5 nm (emisión), respectivamente.

Análisis de la estructura secundaria. Los espectros de dicroísmo circular (CD) de UV lejano se obtuvieron mediante el uso de un espectropolarímetro Jasco 715 equipado con una unidad de control de temperatura (Jasco International Co. Ltd., Tokio, Japón). Todos los espectros se tomaron a una concentración de proteínas de 150 µg/ml en 5 mM de Tris/HCl (pH 8.0) en una cubeta de cuarzo de 0.1 cm de longitud de la trayectoria a 20°C. La velocidad de barrido fue de 20 nm/min, el tamaño del paso fue de 0.2 nm, el tiempo de integración se estableció en 1 s y el ancho de banda fue de 1 nm. Se promediaron cuatro barridos y se corrigieron con amortiguador. Las transiciones térmicas se analizaron con un incremento de calentamiento / enfriamiento de 1°C/min a 220 nm.

Ensayo de solubilidad. Para determinar la concentración máxima de proteínas solubles, una solución de 1 mg/ml (= 0.1% (p/v)) en 10 mM de Tris/HCl pH 8.0 se concentró por ultrafiltración mediante el uso de una membrana de poliéter sulfona con un corte para un peso molecular de 10,000 Da (Vivascience AG, Hannover, Alemania). Se tomaron muestras de la solución en distintos intervalos hasta que la proteína empezó a precipitar. Las muestras se diluyeron en 10 mM de Tris pH 8.0 para determinar la concentración de proteína por fotometría.

Ensayo de agregación. Todas las muestras se ajustaron a 1 mg/ml en 10 mM de Tris/HCl pH 8.0. Para probar los efectos iónicos sobre la agregación de proteínas de la seda, se añadieron sales hasta concentraciones finales de 300 mM. El efecto de la acidificación se investigó al añadir HCl hasta una concentración final de 100 mM (pH = 1). Todas las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Los precipitados de proteínas se eliminaron de todas las muestras por sedimentación a 125,000×g durante 25 min y la cantidad de proteína soluble restante se determinó fotométricamente. Dado que la suma de la proteína soluble y agregada tuvo que ser igual a la cantidad inicial de proteína soluble, el porcentaje de proteína agregada podría calcularse al restar la cantidad de proteína soluble de la cantidad de proteína usada inicialmente.

RESULTADOS

Una estrategia de cierre para diseñar proteínas similares a las de seda. La expresión de genes auténticos de la seda de araña en huéspedes bacterianos es ineficiente (24) ya que algunas secciones génicas contienen codones que no se

traducen de manera eficiente en bacterias. Además, la manipulación génica y la amplificación por PCR es difícil debido a la naturaleza repetitiva de las sedas. Para investigar las propiedades de las proteínas de la seda de araña, se han empleado estrategias de clonación mediante el uso de módulos de ADN sintético con un uso de codones adaptado al huésped de expresión correspondiente. Se obtuvieron los genes sintéticos que codifican para proteínas semejantes a las regiones repetitivas de las sedas de araña (25-28). Es importante destacar que ninguno de estos diseños de proteínas incluyó las regiones NR del carboxilo terminal que se encuentran en todas las sedas dragline.

Los inventores desarrollaron una estrategia de clonación sin problemas (29) que permite la combinación controlada de diferentes módulos de ADN sintético, así como fragmentos de genes auténticos. Se diseñó el vector de clonación pAZL que comprende un casete de clonación con un espaciador que actúa como marcador de posición para los genes sintéticos, y sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción BseRI y BsgI (Fig.1A). Dado que los sitios de reconocimiento y escisión de estas enzimas están a 8 (BseRI) o 12 (BsgI) nucleótidos aparte, el inicio de la traducción y los codones de parada, así como sitios de restricción adicionales requeridos para la escisión de los genes ensamblados podrían colocarse cerca del espaciador.

En una primera etapa de clonación la región espaciadora de pAZL se remplazó por un módulo de ADN sintetizado (para el diseño del módulo ver más abajo). Posteriormente pudieron unirse dos módulos de manera dirigida al sitio (ver materiales y métodos y Fig.1B). Las extensiones complementarias 3' de una sola cadena GG (sentido) y CC (antisentido) generadas mediante escisión con BsgI y BseRI se usaron para conectar dos módulos (Fig.1C). Así la secuencia de ADN requerida para unir dos módulos se confinó a un codón de glicina (GGX). La glicina es abundante de manera natural en proteínas de la seda de araña (∼ 30%), por lo tanto los módulos pudieron diseñarse sin la necesidad de buscar sitios de reconocimiento para endonucleasas de restricción que, después de la traducción, hagan coincidir las secuencias auténticas de aminoácidos. Dado que la disposición de los elementos del casete de clonación se mantuvo sin cambios tras la clonación y la multimerización, pudo construirse una variedad de combinaciones de módulos (Fig.1D).

Diseño, síntesis y purificación de las sedas sintéticas de araña. Los inventores eligieron las proteínas de seda dragline ADF3 y ADF-4 (3) de la araña de jardín Araneus diadematus como moldes para las construcciones sintéticas. La estructura primaria parcialmente identificada de ADF-3 en gran parte consiste de unidades de repetición, todas las cuales comprenden una secuencia consenso que incluye un motivo de poli-alanina. La longitud de las unidades de repetición individuales se determina al variar los números del motivo GPGQQ. Para imitar la secuencia repetitiva de ADF-3 se diseñaron dos módulos. Un módulo, denominado A, se derivó de la secuencia consenso que contiene poli-alanina (Fig.1E). Un segundo módulo denominado Q contenía cuatro repeticiones del motivo GPGQQ. Para estudiar unidades de repetición de diferente longitud, uno o dos módulos Q se combinaron con un módulo A para obtener (AQ) o (QAQ). Estas unidades de repetición se multimerizaron para generar genes sintéticos que codifican para proteínas repetitivas (proteínas rep) (AQ)12 y (QAQ)8.

La parte repetitiva de ADF-4 se compone generalmente de una sola unidad de repetición conservada que solamente presenta pequeñas variaciones. Los inventores combinaron estas variaciones y diseñaron un módulo consenso denominado C (Fig.1E), que los inventores multimerizaron para obtener la proteína rep C16. Se eligió que el número de repeticiones de los módulos en todos los genes sintéticos codificara para proteínas de masa molecular similar (∼50 kDa).

Tanto ADF-3 como ADF-4 presentan regiones NR homólogas en sus extremos carboxilo, que comprenden 124 y 109 aminoácidos respectivamente. Las secuencias génicas que codifican para estas regiones se amplificaron mediante PCR, y los codones problemáticos para la expresión bacteriana se cambiaron a codones más adecuados mediante mutagénesis dirigida a un sitio (ver materiales y métodos). Por lo tanto, todos los genes sintéticos usados pudieron combinarse con las regiones NR auténticas apropiadas lo que produce genes que codifican para las proteínas repNR (AQ)12NR3, (QAQ)8NR3 y C16NR4. Adicionalmente NR3 y NR4 podrían expresarse solas.

Después de la síntesis bacteriana las proteínas de la seda se purificaron mediante una etapa de calor seguida de una precipitación con sulfato de amonio. La identidad de las proteínas se confirmó por inmunotransferencia, mediante el uso de anticuerpos dirigidos contra las secuencias peptídicas de etiquetas T7, unidas al extremo amino terminal de todas las proteínas de la seda (Fig.2A). Aunque todas las proteínas rep y todas las proteínas repNR tenían pesos moleculares similares (Tabla 1) éstas mostraron diferentes velocidades de migración cuando se sometieron a SDS-PAGE. Este efecto podría ser causado por una unión aberrante del dodecilsulfato a las proteínas debido a la composición de aminoácidos diferentes, lo que conduce a una variación de las cargas netas de las proteínas. Además de proteínas de longitud completa, la inmunotransferencia reveló trazas de proteínas con menor peso molecular dentro de las preparaciones de proteínas repNR. La unión del anticuerpo anti-etiqueta T7 a estas proteínas las identificó como proteínas de la seda que carecen de parte de su extremo carboxilo-terminal. Al analizar cada proteína purificada mediante SDS-PAGE y tinción con plata, no se detectaron otras proteínas en todas las preparaciones de proteínas (Fig.2B). Adicionalmente la pureza de las proteínas se determinó al medir la emisión de fluorescencia. La luz incidente de longitud de onda de 280 nm conduce a la excitación y la emisión de fluorescencia de tirosinas y triptófanos mientras que la luz de 295 nm excita exclusivamente a este último. Dado

que ninguna de las proteínas de la seda de araña diseñadas comprendía triptófanos, la emisión de fluorescencia tras la excitación con 295 nm habría sido un indicativo de proteínas de E. coli contaminantes, que en promedio contienen 1.5% de triptófano (30). Las mediciones de fluorescencia de todas las preparaciones de proteínas de la seda revelaron espectros de emisión similares al espectro de la tirosina, que se produce de manera abundante en las proteínas de la seda. En contraste, no se detectó ninguna fluorescencia de triptófano, lo que indica una alta pureza de las preparaciones de proteínas (los datos se muestran de manera ilustrativa para C16NR4 en la Fig. 2B).

La producción bacteriana de proteínas de seda sintéticas en matraces Erlenmeyer produjo cantidades de proteínas similares para todas las construcciones. Los rendimientos de las preparaciones individuales están en el intervalo de 10 a 30 mg de proteína purificada por litro de medio de cultivo. La fermentación de las células se empleó para investigar la posibilidad de escalar la síntesis de proteínas. Los rendimientos de (QAQ)8NR3 y C16NR4 por lo tanto pudieran aumentar a 140 y 360 mg/l, respectivamente.

Las proteínas RepNR consisten de una región repetitiva poco estructurada y un dominio no repetitivo altamente estructurado. La estructura secundaria se investigó mediante espectroscopía de CD. Las proteínas rep revelaron espectros típicos de proteínas no estructuradas de manera intrínseca. En contraste las proteínas NR revelaron espectros indicativos de un alto contenido de estructura secundaria. Estas regiones parecen representar dominios proteicos plegados de manera independiente. Los espectros de las proteínas repNR corresponden a grandes rasgos a una combinación de los espectros rep y NR ponderados de acuerdo con su participación en las proteínas repNR. Aunque no puede excluirse un cambio estructural menor dentro de las regiones rep o los dominios NR tras la unión mutua es probable que las proteínas repNR estén compuestas de una región que muestra mayormente una estructura aleatoria y un dominio proteico plegado en el carboxilo terminal. Sorprendentemente los espectros de las proteínas repNR fueron similares a los espectros de CD obtenidos a partir de la base de seda de la ampulácea mayor extraída directamente de arañas (Nephila clavipes) (9).

Las proteínas de la seda se vuelven a plegar después de la desnaturalización térmica y química. Al investigar los cambios estructurales mediante espectroscopía de CD tras un calentamiento, no se observaron transiciones de temperatura de cooperación para las proteínas rep entre 20°C y 90°C, un efecto que también se ha observado para otras proteínas desplegadas intrínsecamente (31; 32) (Fig.3). Dado que las proteínas repNR estaban al menos parcialmente estructuradas, el desplegamiento térmico de la región estructurada debe ser detectable a temperaturas elevadas. En consecuencia, se observaron transiciones térmicas de cooperación. Los puntos medios de las transiciones de temperatura fueron 67°C ((QAQ)8NR3), 66°C ((AQ)12NR3) y 72°C (C16NR4), respectivamente (Fig.3B y Tabla 1). Además, todas las transiciones térmicas fueron completamente reversibles. La reversibilidad de los cambios estructurales tras el calentamiento explicó la alta recuperación de proteínas de la seda solubles después de la etapa de calor empleada durante la purificación de proteínas. El Tris se usó para amortiguar todas las soluciones investigadas por espectroscopía de CD, debido a las buenas propiedades espectrales y la poca capacidad de promover la agregación de proteínas de la seda. Debido a la fuerte dependencia de la temperatura de las soluciones amortiguadas con Tris, se esperaba que el pH de las muestras cambiara de pH 8 a pH 6 tras el calentamiento de 20°C a 90°C (19). Sin embargo, las transiciones de temperatura de las proteínas de la seda en amortiguador fosfato a pH 8, que muestran un valor de pK independiente de la temperatura, revelaron iguales temperaturas de punto medio (datos no mostrados) a pesar de que no fueron totalmente reversibles probablemente debido a la agregación de proteínas (ver más abajo). Esto indicó que las transiciones térmicas de las proteínas de la seda no se influenciaron por cambios de pH inducidos térmicamente en soluciones amortiguadas con Tris.

El efecto de la desnaturalización y la renaturalización químicas sobre la estructura secundaria se investigó mediante la medición del dicroísmo circular de las proteínas repNR en amortiguador Tris, después de la diálisis contra 6 M de GuaHCl y la renaturalización mediante diálisis frente al amortiguador Tris. Los espectros idénticos de las proteínas iniciales y las que volvieron a plegarse indicaron que la desnaturalización química es reversible (datos no mostrados).

La solubilidad de las proteínas de la seda se determina por sus secuencias repetitivas. Con el objetivo de obtener altas concentraciones de proteína en la base, las proteínas de la seda tienen que ser altamente solubles. Probamos las concentraciones máximas en que las proteínas rep y repNR se mantuvieron solubles para identificar los elementos de la estructura primaria que determinan la solubilidad. Todas las proteínas que comprenden los módulos A y Q pudieron concentrarse por ultrafiltración a más de 30% p/v sin formar agregados visibles, independientemente de la presencia del dominio NR. En contraste, las proteínas que contienen el módulo C sólo pudieron concentrarse hasta 8% p/v (C16) y 9% p/v (C16NR4), respectivamente (Tabla 1). Ambas proteínas formaron un sólido similar a un gel tras un aumento de la concentración (datos no mostrados). Por lo tanto, la solubilidad de las proteínas de la seda se determinó únicamente por sus secuencias repetitivas y no fue influenciada por el dominio NR.

El potasio no promueve agregación de las proteínas de seda sintéticas, independientemente de su estructura primaria. El pH, los iones, tales como potasio y fosfato, y la tensión mecánica están involucrados en el ensamblaje de la seda natural. Aquí hemos querido investigar cómo estos factores promueven el ensamblaje de las proteínas de seda sintéticas. Ya que

éramos incapaces de imitar el proceso de ensamblaje auténtico, que requiere una pre-orientación de las proteínas involucradas como se encuentra en la base líquida cristalina (33), realizamos un ensayo de agregación a partir de soluciones de proteínas que no presentan un orden de orientación. Ninguna de las proteínas probadas rep, repNR y NR mostraron una agregación significativa (< 5%) cuando se incubaron en amortiguador, lo que indica que todas las proteínas eran intrínsecamente solubles bajo las condiciones de prueba (Fig.4). Para investigar si la adición de iones causaba agregación por el aumento de la fuerza iónica, las proteínas se incubaron con cloruro de sodio. Sin embargo no se observó agregación. En contraste con el sodio, previamente se ha reportado que el potasio promueve específicamente la agregación de la seda (34). Sin embargo, el cloruro de potasio tampoco mostró influencia sobre la solubilidad de las proteínas de seda sintéticas (Fig.4).

La acidificación y la adición de fosfato inician la agregación de las proteínas rep en dependencia de su estructura primaria.

La función exacta de la acidificación durante el ensamblaje de la seda de araña aún no se ha determinado. Sin embargo parece probable que los grupos cargados negativamente (por ejemplo los grupos fosforilo) están protonados lo que reduce así la carga neta y la repulsión de las proteínas de la seda de araña. Dado que las proteínas de seda sintéticas no contenían grupos químicos que mostraran un valor de pKA dentro del intervalo de cambio de pH observado durante el proceso de hilatura, los inventores se propusieron imitar este efecto al protonar todos los grupos carboxilos de las cadenas terminal y lateral. (QAQ)8 y (AQ)12, que presentan sólo el grupo carboxilo terminal, no mostraron agregación (<5%) y mostraron una débil (18%) agregación a pH 1. Curiosamente la protonación de los 16 residuos de glutamato de C16 también causó solamente una agregación débil (8%) (Fig.4). El fosfato que se ha descrito que se añade a la base durante el proceso de hilatura no causó agregación de (QAQ)8 y precipitación débil de C16 (12%). En contraste, (AQ)12 mostró un aumento de la tendencia a agregarse (47%) después del tratamiento con fosfato de potasio. Se obtuvieron resultados similares con el uso de fosfato de sodio, lo que indica que el efecto es causado específicamente por los iones fosfato (datos no mostrados).

Los dominios NR amplifican la respuesta a los factores que promueven la agregación. Para investigar la influencia de los dominios NR, se probó la agregación de las proteínas repNR, así como las proteínas NR a un pH bajo y tras el tratamiento con fosfato. La acidificación de (QAQ)8NR3 y (AQ)12NR3, así como NR3 causó una débil agregación (10%, 15% y 13%), que estuvo en el intervalo mostrado por las correspondientes proteínas rep. Curiosamente, aunque el dominio NR4 no precipitó a pH 1 (0%), C16NR4 mostró una fuerte agregación a pH 1 (70%). Por lo tanto la combinación de C16 repetitiva y el dominio NR4, que no se agregó significativamente tras la acidificación, condujo a una proteína altamente sensible a este factor promotor de la agregación. Se obtuvieron resultados similares para la adición de fosfato. Aunque ni NR3 ni NR4 mostraron agregación en presencia de fosfato (1% y 0%), la adición de los dominios NR a las regiones repetitivas provocó un aumento de la agregación de las proteínas repNR en comparación con las proteínas rep ((QAQ)8NR3: 57%, (AQ)12NR3: 81%, C16NR4: 80%).

Con el uso de una estrategia de clonación que permite el ensamblaje controlado y sin problemas de los módulos de ADN, se construyeron genes sintéticos que codifican para proteínas similares a la seda de araña. El diseño de proteínas produjo diferentes combinaciones de unidades de repetición y regiones NR de origen natural, para probar de manera sistemática las propiedades de tales elementos individuales de la estructura primaria. El análisis estructural por espectroscopía de CD reveló que las regiones repetitivas en su mayoría no tienen estructura en su estado soluble, lo que muestra propiedades comunes a otras proteínas desplegadas intrínsecamente (31; 32). El mismo estado conformacional se ha propuesto para la mayor parte del contenido de la ampulácea mayor (10) que está dominado por secuencias de proteínas repetitivas. En contraste se encontraron regiones NR para representar independientemente dominios de la proteína plegable que adoptan su conformación después de la desnaturalización por calor así como el tratamiento con agentes caotrópicos. Debido a su pequeño tamaño relativo en comparación con las regiones repetitivas la influencia sobre las propiedades estructurales globales fue pequeña en las proteínas repNR.

En sedas de araña naturales que muestran regiones repetitivas de varios cientos de kDa, puede esperarse que la contribución estructural de las regiones NR sea incluso más pequeña, lo que explica la falta de evidencia para su presencia en las investigaciones del contenido de ampulácea mayor. Debido a la reversibilidad de la desnaturalización térmica y química de las proteínas repNR y la similitud de datos de CD presentados en este trabajo y obtenidos a partir de la solución de seda natural, se puede suponer que, incluso después del tratamiento con calor y reactivos caotrópicos durante la purificación y preparación de la muestra todos los componentes de seda de araña investigados en soluciones acuosas estaban en un estado de conformación comparable al de las proteínas de seda naturales dentro de la solución.

De acuerdo con Uversky y otros el desplegamiento intrínseco de las proteínas puede predecirse en base a su carga neta y a la hidropaticidad promedio. La carga neta de una proteína se usa para calcular una hidropaticidad "límite". Si la hidropaticidad promedio de la proteína está por debajo del valor "límite", se prevé que la proteína esté intrínsecamente desplegada (35;36). De acuerdo con los resultados presentados se prevé que las secuencias repetitivas (QAQ)8 y (AQ)12 estén intrínsecamente desplegadas (Tabla 1). El desplegamiento intrínseco de una proteína significa que las interacciones de los residuos de aminoácidos con el solvente que los rodea son más favorables que con los aminoácidos de la misma o

de otras cadenas polipeptídicas. En consecuencia, (QAQ)8 y (AQ)12 son solubles incluso a altas concentraciones. En contraste, C16 muestra una hidropaticidad ligeramente por encima del valor límite. Aunque se revelan propiedades de las proteínas desplegadas intrínsecamente, las interacciones entre las cadenas polipeptídicas son cada vez más favorables a altas concentraciones lo que conduce a la agregación de la proteína y resulta en una menor solubilidad en comparación con (QAQ)8 y (AQ)12 (Tabla 1).

Como las secuencias repetitivas constituyen la fracción más grande de proteínas de seda de araña, probablemente determinan muchas de las propiedades de las proteínas. En consecuencia, las solubilidades de las proteínas repNR no difieren significativamente de las proteínas rep. La solubilidad y hidropaticidad calculada de (QAQ)8 y (AQ)12 se correlacionan bien con los valores de la ADF-3 auténtica (Tabla 1). C16y ADF-4 muestran menor solubilidad, aunque C16 no comparte la insolubilidad intrínseca alta de ADF-4. Esta diferencia puede explicarse por la mayor hidropaticidad y carga neta inferior de ADF-4 comparada con C16.

En contraste con las regiones repetitivas, los dominios NR representan sólo una fracción de las proteínas de seda de araña. Ambos dominios NR revelaron una estructura rica en α-hélices. Debido a la gran similitud entre los dominios NR de ADF-3 y ADF-4 (81% de similitud y 67% de identidad) puede suponerse que ambos podrían cumplir funciones relacionadas. Se obtuvo más información sobre la función de los dominios NR cuando se investigó la agregación de las proteínas de la seda tras el tratamiento con factores conocidos para inducir el ensamblaje de las proteínas de la seda in vivo. Se esperaba que la reducción de las cargas negativas por protonación de los grupos carboxilo de las proteínas de la seda afectara principalmente a las proteínas que comprenden el módulo C. En consecuencia, las proteínas compuestas por los módulos A y Q, que no contienen aspartatos o glutamatos, no mostraron más que una agregación débil. C16, incluso después de la neutralización de sus 16 cargas negativas se mantuvo mayormente soluble. De manera sorprendente la combinación del dominio NR4, que no mostró ninguna respuesta a la acidificación por sí mismo, y la débil agregación de C16 resultó en una proteína altamente sensible a la protonación. Por lo tanto se requiere una reducción de la carga de la región repetitiva y la presencia del dominio NR para la agregación eficiente. Se obtuvieron resultados similares cuando se añadió fosfato a las soluciones de proteínas. El fosfato, al igual que otros iones liotrópicos se sabe que aumenta la tensión superficial del agua, y promueve las interacciones hidrofóbicas (37). En el caso de proteínas de seda de araña es probable que la adición de fosfato inicie las interacciones entre los motivos poli-alanina hidrófobos, causando la agregación de las proteínas. En consecuencia la agregación de (AQ)12 fue mayor que (QAQ)8 que contiene un tercio menos de motivos poli-alanina que (AQ)12. C16 que muestra el número más largo y alto de motivos poli-alanina sin embargo no mostró la agregación más fuerte tras el tratamiento con fosfato. Una posible explicación de este resultado inesperado puede ser la repulsión de las cadenas laterales de glutamato cargadas negativamente e iones fosfato que conducen a su exclusión del solvente circundante y un debilitamiento de su efecto liotrópico. A pesar de que los dominios NR no respondieron a la adición de fosfato, su adición a las proteínas rep aumentó fuertemente la sensibilidad de fosfato. Aunque los datos presentados no son suficientes para llegar a una conclusión definitiva, parece probable que los dominios NR funcionan como potenciadores inespecíficos de la sensibilidad a la agregación de los factores de promoción. Para la agregación eficiente su presencia es tan importante como la capacidad de las regiones repetitivas de responder a estos factores.

El mecanismo de esta mejora podría implicar cambios en el estado oligomérico de las proteínas de la seda. Se ha encontrado que los dominios NR forman dímeros disulfuro puenteado (38). Además, la oligomerización podría conducir a un aumento de las concentraciones locales de las secuencias de polipéptidos requeridos para iniciar la agregación que es asistida por las condiciones del solvente que favorezcan la formación de interacciones intermoleculares.

El presente enfoque de ingeniería de proteína, que combina secuencias repetitivas sintéticas con regiones NR auténticas, revela que las proteínas muy parecidas a las proteínas de seda auténticas se pueden producir con altos rendimientos. El sistema de expresión bacteriana, así como el proceso de purificación simple y barato, que se puede escalar fácilmente, proporciona la base para la producción a escala industrial rentable de proteínas del tipo de seda de araña. Con base en los estudios actuales, los mecanismos moleculares del ensamble de la seda de araña pueden ser investigados aún más, lo que proporcionará los conocimientos necesarios para la hilatura artificial de hilos de seda a partir de las proteínas recombinantes y para la obtención de nuevos materiales para aplicaciones biotecnológicas y médicas.

Ensamblaje de proteínas derivadas de la seda de araña

Los siguientes experimentos se realizaron para demostrar que las proteínas derivadas de las secuencias de la seda de araña ADF-3 (sec. con núm. de ident:. 1) o ADF-4 (sec. con núm de ident:. 2) pueden ensamblarse en distintas formas morfológicas. Las proteínas (AQ)24NR3 y C16NR4 se construyeron, produjeron y prepararon en soluciones acuosas como se describe en Biochemistry 2004 Vol.43 págs. 13604-11362. Si no se menciona lo contrario las soluciones de proteína contenían 10 mM Tris-(hidroximetilo)-aminometano (Tris) pH 8.0.

1. Esferas

Esferas de proteínas que presentan diámetros en el intervalo entre 0.5 y 2 µm (Fig.7a) se generaron al añadir 0.8 M de sulfato amonio a una solución de C16 al 0.2% (p/v).

5 2. Nanofibrillas

Las nanofibrillas que mostraron diámetros entre 0.7 y 4 nm (Fig. 7b) se formaron por incubación de una solución de C16NR4 1% (p/v) a temperatura ambiente por 2 semanas.

10 3. Microfibrillas

Para la formación de microfibrillas 5 -10 µl de una solución (AQ)24NR3 25% (p/v) se inyectaron lentamente en 0.5 M fosfato de potasio pH 8.0, formando una gota estable de solución de proteína. Después de la incubación durante 1 min la gota de proteína se retiró de la solución usando pinzas. Después de un tiempo de incubación adicional de 1 min en el aire, una

15 fibrilla de proteína podría extraerse de la gota de proteína a una velocidad de aproximadamente 2 cm/s usando un segundo conjunto de pinzas. Las fibrillas mostraron una sección transversal redonda con un diámetro de 4 µm (Fig 7c,d).

4. Espumas

20 Se generaron espumas de proteína (Fig. 7e,f) a partir de las soluciones que contienen 2.5 mM peroxodisulfato de amonio (APS), 100 µM tris(2,2'-bipiridil)diclororutenio(II) (Rubpy) y 10% µ(p/v) (AQ)24NR3 o 2% (p/v) C16NR4. Las soluciones de proteína se espumaron con aire. Para estabilizar, las proteínas de estructura de espuma resultante se reticularon por exposición a la luz visible de una lámpara de tungsteno por 1 min (Protocolo: PNAS 1999 Vol.96 págs. 6020-6024). Las espumas se secaron subsecuentemente a 95°C.

5. Geles

Las nanofibrillas de C16NR4 a una concentración de 1% (p/v) mostraron un aspecto de gel que fácilmente podría ser interrumpido por agitación o cizallamiento. Para mejorar las propiedades mecánicas del gel se permitió que el APS y el

30 Rubpy entraran en el gel por difusión para producir concentraciones finales de 10 mM de APS y 100µM de Rubpy. Después de la reticulación inducida por la luz (ver la sección 4) pudieron obtenerse geles dimensionalmente estables (Fig. 7g).

6. Películas

35 6.1 Estado soluble de las proteínas de seda de araña

Con el fin de formar las películas los inventores usaron las dos proteínas de seda sintéticas, (AQ)24NR3 y C16, que se derivan de las proteínas de seda dragline ADF-3 y ADF-4 de la araña de jardín Araneus diadematus(ver además anteriormente para más explicaciones). Estas dos proteínas diferentes se eligieron en base a observaciones anteriores 40 donde ADF-3 y ADF-4 así como sus derivados muestran un comportamiento marcadamente diferente con respecto a la solubilidad y al ensamblaje. Las soluciones acuosas de ambas proteínas pudieron prepararse mediante la disolución de proteínas liofilizadas en 6 M de tiocianato de guanidinio y la posterior eliminación de la sal por diálisis frente a un amortiguador con bajo contenido de sal tal como 5 mM de fosfato de potasio pH 8.0. Las proteínas liofilizadas también pudieron disolverse directamente en HFIP. La medición del dicroísmo circular (CD) de las soluciones de proteínas reveló

45 una influencia diferente de los dos solventes sobre la estructura secundaria. En solución acuosa ambas proteínas mostraron un espectro de CD con un único mínimo a una longitud de onda por debajo de 200 nm que es indicativo de una proteína principalmente aleatoria (Fig.8). En contraste, los espectros de ambas proteínas en HFIP mostraron un mínimo a 201 -202 nm y un mínimo adicional ((AQ)24NR3) u hombro (C16) a 220 nm que es indicativo de un mayor contenido α-helicoidal (Fig.8).

6.2 Formación de la película

Las películas se formaron sobre una superficie de poliestireno (o sobre el cristal de cuarzo para mediciones de CD) a partir de soluciones HFIP que contienen 2% p/v de proteínas. Después de la evaporación del solvente, (AQ)24NR3 y C16 formaron 55 películas transparentes que podrían ser fácilmente desprendidas de la superficie (Fig.9 y datos no mostrados). Suponiendo la evaporación completa del solvente y que la densidad de la película de proteína es idéntica al valor reportado de 1.3 g/cm3 para la seda de araña dragline, se calculó que el espesor de las películas estaba en el intervalo de 0.5 a 1.5 µm. Las películas moldeadas (recién preparadas) fabricadas de cualquier proteína se disolvieron tras el contacto con agua. Dado que la insolubilidad en agua es un requisito previo para la mayoría de las aplicaciones de películas de proteínas, los 60 inventores buscaron un método de procesamiento con el objetivo de producir películas insolubles. Se conoce que el fosfato

de potasio induce agregación y formación de estructuras químicamente estables de las proteínas de seda empleadas. En consecuencia, el procesamiento (incubación) de las películas moldeadas con 1 M de fosfato de potasio resultó en la conversión de las películas en un estado insoluble en agua.

6.3 Estructura secundaria

Para investigar las propiedades estructurales de las películas de proteína, su estructura secundaria se investigó por espectroscopia CD. Las películas moldeadas revelaron un espectro con dos mínimos a 208 nm y 220 nm, indicativo de un alto contenido α-helicoidal (Fig. 10). Después de procesar con 1 M de fosfato de potasio, las películas revelaron un espectro con un solo mínimo a 218 nm que es típico para una estructura rica en lámina β. Por lo tanto, la transición de la solubilidad en agua a la insolubilidad en agua fue paralela a una conversión de la estructura secundaria de la proteína de la α-hélice a la lámina β.

6.4 Estabilidad química

Para probar la estabilidad química, las películas se expusieron a 8 M urea, 6 M de clorhidrato guanidinio y 6 M de tiocianato de guanidinio (Tabla 2). Las películas moldeadas de las dos proteínas así como también las películas procesadas de (AQ)24NR3 fueron solubles en estos desnaturalizantes. En contraste, las películas procesadas de C16sólo podían ser disueltas en tiocianato de guanidinio. Esta estabilidad química notable de las películas de C16 es idéntica a aquella de ADF-4 producida de forma recombinante y agrupada y de la seda dragline natural. Estudios anteriores correlacionaron las propiedades de ensamble y las estabilidades de las estructuras ensambladas directamente con las secuencias de aminoácidos de las proteínas de seda. Por lo tanto, se puede concluir, que las propiedades de las películas de seda de araña pueden ser modificadas directamente por alteración de la estructura primaria de la proteína de la seda a través de la manipulación del gen de seda correspondiente.

6.5 Modificación de la película

Muchas aplicaciones de las películas de proteínas requieren la presencia de funcionalidades específicas en la superficie de la película. A fin de demostrar, que nuestras películas de proteínas de seda de araña pueden ser modificadas con moléculas orgánicas pequeñas, así como macromoléculas biológicas como las proteínas, la fluoresceína del cromóforo y la enzima βgalactosidasa se acoplaron químicamente a las películas de C16 procesadas. El acoplamiento se alcanzó mediante la activación de los grupos carboxilo expuestos a la superficie de C16 usando 1-etil-3-(3-dimetilaminopropilo)carbodiimida (EDC) (para más detalles de las reacciones ver material complementario que se indica a continuación). Las películas se incubaron con etilendiamina lo que conduce a la formación de una amida. El grupo amino libre restante de etilendiamina se acopló posteriormente al fluoresceinisotiocianato resultando en el enlace covalente eficaz de la fluoresceína (Fig.11A) a través de la formación de un derivado de tiourea estable. De manera similar, la incubación de β-galactosidasa con películas de C16 activadas con EDC condujo a la formación de enlaces amida entre los grupos carboxilo de C16 y aminas primarias (por ejemplo de residuos de lisina) de la β-galactosidasa que estaban accesibles en la superficie de la enzima. Después de lavados repetidos de tales películas modificadas, la actividad β-galactosidasa pudo detectarse mediante el uso de 5-bromo4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido (X-Gal) como sustrato (Fig.11B).

6.6 Conclusión

Aquí, se pudo demostrar que las películas de proteína se pueden obtener de proteínas de seda de araña sintéticas. Las películas, que inicialmente eran solubles en agua, pueden ser procesadas con fosfato de potasio que conduce a insolubilidad en agua, que es un requisito importante para muchas aplicaciones. La comparación de las estabilidades químicas de las películas realizadas a partir de dos proteínas de seda de araña sintéticas diferentes sugiere que las propiedades de las películas se basan en la estructura primaria de las proteínas. Por lo tanto, será posible generar proteínas de seda que forman películas que exhiben propiedades específicas. Dado que diferentes moléculas funcionales pueden unirse covalentemente a la superficie de la película, una gran variedad de aplicaciones técnicas o médicas puede abordarse en el futuro.

6.7 Materiales y resultados complementarios

Preparación de las soluciones de proteína

Se llevó a cabo la producción y purificación de proteínas como se describió previamente. Para obtener soluciones acuosas de (AQ)24NR3 y C16, proteína liofilizada se disolvió en 6 M de tiocianato de guanidinio a una concentración de 10 mg/ml y subsecuentemente se dializó contra 5 mM de fosfato de potasio pH 8.0. Los agregados se eliminaron por sedimentación a 15,000×g por 10 min. Las concentraciones de proteína se determinaron por fotometría en una cubeta de 1 cm de longitud de

la trayectoria a 276 nm mediante el uso de coeficientes de extinción calculados de 73950 M-1 cm -1 para (AQ)24NR3 y 46400

M-1

cm -1 para C16. Alternativamente, las proteínas de seda liofilizadas se disolvieron directamente en hexafluoroisopropanol (HFIP).

5 Análisis de la estructura secundaria

Los espectros de dicroísmo circular (CD) de UV lejano se obtuvieron mediante el uso de un espectropolarímetro Jasco 715 (Jasco International Co. Ltd., Tokio, Japón). Los espectros de las proteínas solubles se tomaron a una concentración de proteína de 200 µg/ml en 5 mM de fosfato de potasio (pH 8.0) o HFIP en una cubeta de cuarzo de 0.1 cm de longitud de la

10 trayectoria a 20°C. Para medir las películas, 100 µl de una solución de 2 mg/ml de proteína en HFIP se extendieron sobre un cristal de cuarzo plano de 4 cm2 y se secaron al aire antes de la medición de CD. La velocidad de barrido fue de 20 nm/min, el tamaño del paso fue de 0.2 nm, el tiempo de integración se estableció para 1 s y el ancho de banda fue de 1 nm. Se promediaron cuatro barridos.

15 Modificación de la película

1. Acoplamiento de fluoresceína a superficies de películas de C16

Las películas se prepararon al extender 15 µl por pocillo de 20 mg/ml de C16 en HFIP sobre la parte inferior de una placa de

20 24 pocillos. Después de la evaporación del HFIP, las películas se incubaron durante 5 minutos con 1 M de fosfato de potasio. Después de enjuagar con agua, los grupos carboxilo se activaron mediante incubación durante 15 min con 100 mM de ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico (MES) pH 5.0, 100 mM de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y 20 mM de N-hidroxisulfo-succinimida (NHS). Posteriormente se añadió etilendiamina para producir una concentración final de 500 mM. Después de 2 h de incubación las películas se enjuagaron exhaustivamente con agua. Finalmente, las películas se

25 incubaron durante 1 h con 1 mg/ml de fluoresceinisotiocianato en 100 mM de carbonato de sodio pH 9.0, seguido de un enjuague con agua y secado al aire.

2. Acoplamiento de β-galactosidasa a las superficies de películas de C16

30 Las películas se prepararon y activaron como se describió anteriormente. Después de 15 min de incubación con EDC / NHS, las películas se enjuagaron con agua y posteriormente se incubaron durante 2 h con una solución que contenía 100 µg/ml de β-galactosidasa, 4 mM de KH2PO4, 16 mM de Na2HPO4, 115 mM de NaCl (PBS). Después de un enjuague exhaustivo con PBS, se probó la actividad enzimática en la superficie de la película.

35 Ensayo de β-galactosidasa

Las películas acopladas con β-galactosidasa se incubaron durante 16 h a temperatura ambiente con una solución que contenía 100 mM de fosfato de sodio pH 7.0, 10 mM de cloruro de potasio, 1 mM de sulfato de magnesio, 50 mM de βmercaptoetanol y 2 mg/ml de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido (X-Gal).

7. Hidrogeles adicionales

La parte repetitiva de ADF-4 se compone generalmente de una sola unidad de repetición conservada que solamente presenta pequeñas variaciones. Los inventores combinaron estas variaciones y diseñaron un módulo consenso denominado

45 C (GSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPSGPGGYGPGGP) (sec. con núm. de ident.: 5), que se multimerizó para obtener la proteína rep C16, lo que resultará en una proteína de una masa molecular de 48 kDa.

El gen para C16 de la seda se expresó en la cepa de E. coli BLR [DE3] (Novagen). Las células se cultivaron a 37 ° C en medio LB a una OD600 = 0.5. Antes de la inducción con 1 mM de IPTG (isopropil-ß-D-tiogalactósido), las células se

50 cambiaron a 25°C. Las células se cosecharon después de 3-4 horas de inducción.

La proteína C16 se purificó como se describe en Huemmerich y otros (40). Los sedimentos de C16 se lavaron con 8 M de urea y se disolvieron en 6 M de tiocianato de guanidina (GdmSCN) antes de la diálisis frente a 10 mM de NH4HCO3. Los precipitados formados durante la diálisis se eliminaron por sedimentación a 50,000×g durante 30 min y las restantes

55 proteínas solubles de la seda se liofilizaron. Antes del análisis la proteína liofilizada se disolvió en 6 M de GdmSCN seguido por diálisis frente a 10mM de Tris / HCl. Los agregados se eliminaron por sedimentación a 125,000 ×g durante 30 min. Las concentraciones de proteínas se determinaron por fotometría en una cubeta de 1 cm de longitud de la trayectoria a 276 nm con el uso del coeficiente de extinción calculado (40).

60 C16 se auto-ensambla en nanofibras a concentraciones entre 5 y 30 mg/ml después de la adición de 10% p/v de metanol

(Fig. 12). Sorprendentemente, a las concentraciones usadas las nanofibras conducen a la formación de una red de fibras que representa los hidrogeles. Los hidrogeles de C16 pudieron interrumpirse fácilmente por agitación o cizallamiento. Para mejorar las propiedades mecánicas del gel se permitió que el peroxodisulfato de amonio (APS), y el tris (2,2'-bipiridil) diclororutenio (II) (Rubpy) entraran en el gel por difusión para producir concentraciones finales de 10 mM de APS y 100µM de Rubpy. Para obtener geles dimensionalmente estables las proteínas se reticularon por exposición a luz visible de una lámpara de tungsteno durante 1 min (IV) (Fig. 13).

Se realizaron mediciones reológicas dinámicas de los hidrogeles reticulados y no reticulados mediante el uso de un Physica MCR 301 con una geometría de placa-placa de 25 mm. El espacio entre la placa superior y el plato de la muestra se estableció al mover primero la placa superior aproximadamente 2 mm por encima de la superficie de la muestra. La placa superior se bajó muy lentamente (5 µm/s), mientras se monitoreó la fuerza normal y se detuvo en una fuerza normal límite de 0.1 N.

Después de encontrar tamaños de espacio adecuados para las muestras, las muestras se desviaron a 0.5 Hz y una deformación de 1% hasta que la fuerza normal se equilibró a un valor constante. Las mediciones reológicas dinámicas se realizaron a temperatura ambiente al aplicar una tensión constante a la muestra. Las medidas reológicas se llevaron a cabo en muestras con concentraciones de proteínas en el intervalo de 5 a 30 mg/ml.

Las imágenes de AFM de los hidrogeles secos indican que las nanofibras son de aproximadamente 3 nm de diámetro y parecen ser semiflexibles, con una longitud de persistencia en el mismo orden de magnitud que su longitud (Figura 12). Muchas de las nanofibras parecen tener además una estructura ramificada. De las imágenes de AFM no pudo determinarse si las estructuras en forma ramificada son ramas físicas en cada fibra polimérica o si son el resultado de la agrupación de nanofibras.

Similar a las redes de polímeros más concentrados, el hidrogel de la proteína recombinante de la seda de araña C16 demuestra un comportamiento viscoelástico. Cuando se aplica una tensión a las redes viscoelásticas de C16 de la seda la deformación cambia lentamente con el tiempo y es proporcional a la tensión aplicada. La Figura 14 muestra el comportamiento tensión/deformación de los hidrogeles reticulados y no reticulados a una concentración de 10 mg/ml. El hidrogel no reticulado de C16 de la seda tiene un módulo de cizalla inicial de 38 Pa. Sin embargo, a medida que aumenta la tensión el hidrogel no reticulado muestra una mayor respuesta de deformación a la tensión, y después de una deformación de 20% la respuesta es relativamente lineal. Con el aumento de la tensión la red continúa deformándose hasta que se alcanza una deformación de 90%, donde el hidrogel no reticulado se rompe y fluye. A diferencia de las redes de fibras no reticuladas, las redes reticuladas muestran una respuesta viscoelástica lineal en todas las deformaciones, tiene un módulo de cizalla mucho más alto de 820 Pa, y se rompe a una menor deformación de 30%.

Las medidas viscoelásticas dinámicas de las redes de fibras no reticuladas a una concentración polimérica de 20 mg/ml revelan que el módulo de almacenamiento (G') y el módulo de pérdida (G") son muy dependientes de la frecuencia de oscilación (ω), tanto en el intervalo de ω alto como en el de ω bajo (Figura 15). La red demuestra un comportamiento viscoso a bajas frecuencias y un comportamiento elástico a frecuencias moderadas con un cruce a 0.49 Hz. El comportamiento observado del hidrogel es similar al esperado para una red de polímeros enredados y no es similar a lo que se esperaría de una solución cristalina líquida o fluido viscoso.

El hidrogel no reticulado de C16 de la seda muestra además un comportamiento viscoelástico dinámico que es muy diferente al que se observa en los hidrogeles reticulados químicamente (Figura 15). A diferencia del comportamiento de la red de fibras no reticuladas, el módulo de almacenamiento de la red de fibras reticuladas es casi constante a todas las frecuencias, excepto a las frecuencias más altas probadas. El hidrogel reticulado de C16 de la seda demuestra además un módulo de almacenamiento mayor y de pérdida menor que el que se observa en la red no-reticulada.

Como era de esperar, el módulo de almacenamiento del hidrogel reticulado es mayor que el de la red no reticulada para todas las concentraciones probadas (Figura 16). Sin embargo, inesperadamente los módulos de almacenamiento tanto de las redes reticuladas como no reticuladas aumenta con la concentración [c] y tienen una dependencia de [c]2. En el caso de las redes reticuladas de biopolímeros semiflexibles lineales, donde la longitud de persistencia es mayor que el tamaño de malla, se espera que el módulo de almacenamiento de la red de polímeros tenga una dependencia de [c], que es cercana a la del hidrogel reticulado de C16 de la seda. En el caso de las redes de biopolímeros semiflexibles lineales que se enredan pero no se reticulan, se espera que el módulo de almacenamiento tenga una dependencia mucho más baja de la concentración de [c]. Tal dependencia ha demostrado ser válida para otros biopolímeros tales como F-actina, pero no describe la dependencia del hidrogel no reticulado de la seda.

Esta discrepancia podría explicarse si las estructuras con formas ramificadas observadas en las imágenes de AFM son ramas físicas reales en la red polimérica. Se espera que el módulo de almacenamiento de una red de polímeros

semiflexibles ramificados muestre una dependencia de la concentración entre lo que se esperaría para la red de polímeros reticulados y no reticulados.

Las imágenes de AFM y los datos de reología son consistentes con el modelo de una red de polímeros semiflexibles 5 ramificados. Sin embargo, el comportamiento a escala del módulo de almacenamiento de los hidrogeles no puede explicarse en el marco de los modelos más ampliamente aceptados para redes de polímeros semiflexibles lineales.

TABLA

10 Tabla 1

Propiedades seleccionadas de las construcciones sintéticas de la seda y las proteínas auténticas de la seda de araña ADF-3 y ADF-4.

50 a La masa molecular de las proteínas modificadas genéticamente incluye la etiqueta T7. b Los coeficientes de extinción se calcularon de acuerdo con Gill y Hippel (23). c Los residuos de aminoácidos cargados solo se refieren a las secuencias génicas de la seda; Las etiquetas T7 comprenden una arginina adicionald La hidropaticidad se calculó como se describe previamente (39). La hidrofobicidad aumenta con los valores de

55 hidropaticidad.

e La hidropaticidad se normalizó a un intervalo entre 0 y 1. La hidropaticidad “límite” se calculó de acuerdo con Uversky y otros (35;36). Si los valores de la hidropaticidad normalizada están por debajo del valor “límite” se prevé que las proteínas están desplegadas intrínsecamente. Los valores de ADF-3 y ADF-4 se refieren a sus secuencias repetitivas solamente.f Las temperaturas del punto medio se determinaron mediante espectroscopía de CD.

5 g Los valores para ADF-3 y ADF-4 se tomaron de (18) y de resultados no publicados.

Tabla 2 Solubilidad de películas de proteína en desnaturalizantes. Las películas se consideraron como insolubles (-), en caso que una inmersión completa en el agente respectivo y agitación repetida durante un período de cinco minutos no resultó en un cambio de la apariencia óptica. En contraste, la solubilidad (+) se caracterizó por la desintegración completa de

10 la película bajo las mismas condiciones.

REFERENCIAS

1.: Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S., y Savage, K. N. (1999) The mechanical design of spider silks: from fibroin 30 sequence to mechanical function, J. Exp. Biol. 202 Pt 23, 3295-3303.

2.: Vollrath, F. y Knight, D. P. (2001) Liquid crystalline spinning of spider silk, Nature 410, 541-548.

3.: Guerette, P. A., Ginzinger, D. G., Weber, B. H., y Gosline, J. M. (1996) Silk properties determined by gland-specific expression of a spider fibroin gene family, Science 272, 112-115.

4.: Gatesy, J., Hayashi, C., Motriuk, D., Woods, J., y Lewis, R. (2001) Extreme diversity, conservation, and convergence of 35 spider silk fibroin sequences, Science 291, 2603-2605.

5.: Simmons, A. H., Ray, E., y Jelinski, L. W. (1994) Solid-State 13C NMR of Nephila clavipes Dragline Silk Establishes Structure and Identity of Crystalline Regions, Macromolecules 27, 5235-5237.

6.: Parkhe, A. D., Seeley, S. K., Gardner, K., Thompson, L., y Lewis, R. V. (1997) Structural studies of spider silk proteins in the fiber, J. Mol. Recognit. 10, 1-6.

40 7. van Beek, J. D., Hess, S., Vollrath, F., y Meier, B. H. (2002) The molecular structure of spider dragline silk: folding and orientation of the protein backbone, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 99, 10266-10271.

8. Hijirida, D. H., Do, K. G., Michal, C., Wong, S., Zax, D., y Jelinski, L. W. (1996) 13C NMR of Nephila clavipes major ampullate silk gland, Biophys. J. 71, 3442-3447.

9. Kenney, J. M., Knight, D., Wise, M. J., y Vollrath, F. (2002) Amyloidogenic nature of spider silk, Eur. J. Biochem. 269, 45 4159-4163.

10.: Hronska, M., van Beek, J. D., Williamson, P. T., Vollrath, F., y Meier, B. H. (2004) NMR characterization of native liquid spider dragline silk from Nephila edulis, Biomacromolecules. 5, 834-839.

11.: Kerkam, K., Viney, C., Kaplan, D., y Lombardi, S. (1991) Liquid crystallinity of natural silk secretions, Nature 349, 596

598.

50 12. Knight, D. P. y Vollrath, F. (1999) Liquid crystals and flow elongation in a spider's silk production line, Proc. R. Soc. Lond. 519-523.

13. Willcox, J., Gido, S., Muller, W., y Kaplan, D. (1996) Evidence of a Cholesteric Liquid Crystalline Phase in Natural Silk Spinning Processes, Macromolecules 29, 5106-5110.

14. Knight, D. P. y Vollrath, F. (2001) Changes in element composition along the spinning duct in a Nephila spider, 55 Naturwissenschaften 88, 179-182.

15.: Vollrath, F., Knight, D., y Hu, X. W. (1998) Silk production in a spider involves acid bath treatment, Proc. R. Soc. Lond B Biol. Sci. 265, 817-820.

16.: Tillinghast, E. K., Chase, S. F., y Townley, M. A. (1984) Water extraction by the major ampullate duct during silk formation in the spider, Argiope aurantia Lucas, J. Insect Physiol. 30, 591-596.

: agua 8 M urea 6 M clorhidrato de guanidinio 6 M tiocianato de guanidinio

(AQ)24NR3: + + + +

as-cast

(AQ)24NR3: - + + +

procesado

C16: + + + +

as-cast

C16: - - - +

procesado

17.: Knight, D. P., Knight, M. M., y Vollrath, F. (2000) Beta transition and stress-induced phase separation in the spinning of spider dragline silk, Int. J. Biol. Macromol. 27, 205-210.

18.: Lazaris, A., Arcidiacono, S., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W., y Karatzas, C.

N. (2002) Spider silk fibers spun from soluble recombinant silk produced in mammalian cells, Science 295, 472-476.

19.: Sambrook, J. y Russell, D. (2001) Molecular Cloning.

20.: Kroll, D. J., Abdel-Malek Abdel-Hafiz, H., Marcell, T., Simpson, S., Chen, C. Y., Gutierrez-Hartmann, A., Lustbader, J. W., y Hoeffler, J. P. (1993) A multifunctional prokaryotic protein expression system: overproduction, affinity purification, and selective detection, DNA Cell Biol. 12, 441-453.

21.: Reiling, H. E., Laurila, H., y Fiechter, A. (1985) Mass-Culture of Escherichia-Coli -Medium Development for Low and High-Density Cultivation of Escherichia Coli-B/R in Minimal and Complex Media, Journal of Biotechnology 2, 191-206.

22.: Yee, L. y Blanch, H. W. (1992) Recombinant protein expression in high cell density fed-batch cultures of Escherichia coli, Biotechnology (N. Y.) 10, 1550-1556.

23.: Gill, S. C. y von Hippel, P. H. (1989) Calculation of Protein Extinction Coefficients from Amino-Acid Sequence Data, Analytical Biochemistry 182, 319-326.

24.: Arcidiacono, S., Mello, C., Kaplan, D., Cheley, S., y Bayley, H. (1998) Purification and characterization of recombinant spider silk expressed in Escherichia coli, Appl. Microbiol. Biotechnol. 49, 31-38.

25.: Prince, J. T., McGrath, K. P., DiGirolamo, C. M., y Kaplan, D. L. (1995) Construction, cloning, and expression of synthetic genes encoding spider dragline silk, Biochemistry 34, 10879-10885.

26.: Fahnestock, S. R. e Irwin, S. L. (1997) Synthetic spider dragline silk proteins and their production in Escherichia coli, Appl. Microbiol. Biotechnol. 47, 23-32.

27.: Lewis, R. V., Hinman, M., Kothakota, S., y Fournier, M. J. (1996) Expression and purification of a spider silk protein: a new strategy for producing repetitive proteins, Protein Expr. Purif. 7, 400-406.

28.: Scheller, J., Guhrs, K. H., Grosse, F., y Conrad, U. (2001) Production of spider silk proteins in tobacco and potato, Nat. Biotechnol. 19, 573-577.

29.: Padgett, K. A. y Sorge, J. A. (1996) Creating seamless junctions independent of restriction sites in PCR cloning, Gene 168, 31-35.

30.: Blattner, F. R., Plunkett, G., III, Bloch, C. A., Perna, N. T., Burland, V., Riley, M., Collado-Vides, J., Glasner, J. D., Rode,

C. K., Mayhew, G. F., Gregor, J., Davis, N. W., Kirkpatrick, H. A., Goeden, M. A., Rose, D. J., Mau, B., y Shao, Y. (1997) The complete genome sequence of Escherichia coli K-12, Science 277, 1453-1474.

31.: Kim, T. D., Ryu, H. J., Cho, H. I., Yang, C. H., y Kim, J. (2000) Thermal behavior of proteins: heat-resistant proteins and their heat-induced secondary structural changes, Biochemistry 39, 14839-14846.

32.: Uversky, V. N., Lee, H. J., Li, J., Fink, A. L., y Lee, S. J. (2001) Stabilization of partially folded conformation during alphasynuclein oligomerization in both purified and cytosolic preparations, J. Biol. Chem. 276, 43495-43498.

33.: Knight, D. P. y Vollrath, F. (2002) Biological liquid crystal elastomers, Philos. Trans. R. Soc. Lond B Biol. Sci. 357, 155

163.

34.: Chen, X., Knight, D. P., y Vollrath, F. (2002) Rheological characterization of nephila spidroin solution, Biomacromolecules. 3, 644-648.

35.: Uversky, V. N., Gillespie, J. R., y Fink, A. L. (2000) Why are "natively unfolded" proteins unstructured under physiologic conditions?, Proteins 41, 415-427.

36.: Uversky, V. N. (2002) Natively unfolded proteins: a point where biology waits for physics, Protein Sci. 11, 739-756.

37.: Arakawa, T. y Timasheff, S. N. (1985) Theory of protein solubility, Methods Enzymol. 114, 49-77.

38.: Sponner, A., Unger, E., Grosse, F., y Weisshart, K. (2004) Conserved C-termini of Spidroins are secreted by the ampulácea mayorglands and retained in the silk thread, Biomacromolecules. 5, 840-845.

39.: Kyte, J. y Doolittle, R. F. (1982) A simple method for displaying the hydropathic character of a protein, J. Mol. Biol. 157, 105-132.

40.: Huemmerich, D., Helsen, C.W., Oschmann, J., Rudolph, R. y Scheibel, T. (2004) Primary structure elements of dragline silks and their contribution to protein solubility and assembly, Biochemistry 43, 13604-13612.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Technische Universität München

<120> Proteínas recombinantes de la seda de araña

<130> P19310

<140>

<141>

<150> US 60/590,196

<151> 2004-07-22

<160> 55

<170> PatentIn versión 3.1

<210> 1

<211> 653

<212> PRT

<213> Araneus diadematus 5 <400> 1

<210> 2

<211> 671

<212> PRT 25 <213> Araneus diadematus

<400> 2

<210> 3

<211> 24

<212> PRT 20 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Módulo A (ADF-3)

<400> 3

<210> 4 35 <211> 20

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Módulo Q (ADF-3) 40 <400> 4

50

<210> 5

<211> 35

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

55: <220>

<223> Módulo C (ADF-4)

<400> 5

60

<210> 6

<211> 942

<212> PRT

<213> Nephila clavipes 20 <400> 6

<210> 7

<211> 907 25 <212> PRT

<213> Nephila clavipes

<400> 7

<210> 8

<211> 636

<212> PRT

<213> Araneus diadematus 15 <400> 8

<210> 9

<211> 410

<212> PRT

<213> Araneus diadematus

<400> 9

<210> 10

<211> 140

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> NR3 (ADF-3)

<400> 10

50

55: <210> 11 <211> 125 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> NR4 (ADF-4) <400> 11

60

30

<210> 12

<211> 1959

<212> ADN

35: <213> Araneus diadematus

<400> 12

40

45

50

55

60

<210> 13

<211> 2013 5 <212> ADN

<213> Araneus diadematus

<400> 13

<210> 14

<211> 420

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> NR3 (ADF-3)

<400> 14

<210> 15

<211> 375

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 30 <220>

<223> NR4 (ADF-4)

<400> 15

<210> 16

<211> 2828

<212> ADN 55 <213> Nephila clavipes

<400> 16

<210> 17

<211> 2724

<212> ADN 35 <213> Nephila clavipes

<400> 17

<210> 18 10 <211> 52

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 15 <223> oligonucleótido sintético.

<400> 18 gatcgaggag gatccatggg acgaattcac ggctaatgaa agcttactgc ac 52

20 <210> 19

<211> 52

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

25 <220>

<223> oligonucleótido sintético.

<400> 19 agctgtgcag taagctttca ttagccgtga attcgtccca tggatcctcc tc 52

<210> 20

<211> 72

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> oligonucleótido sintético.

<211>: 72 45 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> oligonucleótido sintético.

<400> 21

<210> 22

<211>: 60 55 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> oligonucleótido sintético.

<400> 22 5 tccgggccag cagggcccgg gtcaacaggg tcctggccag caaggtccgg gccagcaggg 60

<210> 23

<211> 60

<212> ADN 10 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> oligonucleótido sintético.

15 <400> 23 ctgctggccc ggaccttgct ggccaggacc ctgttgaccc gggccctgct ggcccggacc 60

<210> 24

<211> 105 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> oligonucleótido sintético.

<400> 24

<210> 25 30 <211> 105

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 35 <223> oligonucleótido sintético.

<400> 25

40: <210> 26 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial

45: <220> <223> Iniciador

50 55: <400> 26 gaaaaaccat gggtgcggct tctgcagctg tatctg 36 <210> 27 <211> 45 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Iniciador

56

<400> 27 gaaaagaagc tttcattagc cagcaagggc ttgagctaca gattg 45

5: <210> 28 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10: <220> <223> Iniciador

<400> 28 gaaaaaccat gggagcatat ggcccatctc cttc 34

15: <210> 29 <211> 45 <212> ADN <213> Secuencia artificial

20: <220> <223> Iniciador

25 30: <400> 29 gaaaagaagc tttcattagc ctgaaagagc ttggctaatc atttg 45 <210> 30 <211> 12 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> etiqueta T7

40: <210> 31 <211> 216 <212> PRT <213> Secuencia artificial

45: <220> <223> FlagN-NR <400> 31

50

55

15

<210> 32

<211> 648

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

20

<220>

<223> FlagN-NR

<400> 32

50

55: <210> 33 <211> 93 <212> PRT <213> Secuencia artificial

60: <220> <223> FlagC-NR <400> 33

30 <210> 34

<211> 279

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

35 <220>

<223> FlagC-NR

<400> 34

50

55: <210> 35 <211> 27 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Módulo K <400> 35

60

<210> 36 10 <211> 81

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 15 <223> Módulo K

<400> 36

20 <210> 37

<211> 28

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

25 <220>

<223> Módulo sp

<400> 37

<210> 38

<211> 84 40 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Módulo sp

<400> 38

<210> 39

<211> 18

<212> PRT 50 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Módulo X

<400> 39

<210> 40

<211> 54

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 15 <223> Módulo X

<400> 40 ggtggcgctg gtggcgccgg tggcgcaggt ggctctggcg gtgcgggcgg ttcc 54

<210> 41

<211> 30

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

25 <220>

<223> Módulo Y

<400> 41

35

<210> 42 <211> 90 <212> ADN <213> Secuencia artificial

45: <220> <223> Módulo Y <400> 42

<210> 43

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

55 <220>

<223> Iniciador de PCR

<400> 43 gaaaaaccat gggcgaaagc agcggaggcg at 32

<210> 44

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Iniciador de PCR

<400> 44 gaaaagaagc tttcattagc ctgggctgta tggtcc 36

<210> 45

<211> 33

<212> ADN 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Iniciador de PCR

<400> 45 gaaaaaccat gggtgcttat tatcctagct cgc 33

<210> 46

<211> 42 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Iniciador de PCR

<400> 46 gaaaagaagc tttcattagc cataagcgaa cattcttcct ac 42

<210> 47 35 <211> 90

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> oligonucleótido sintético.

<400> 47

45 <210> 48

<211> 90

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> oligonucleótido sintético.

<400> 48

55 <210> 49

<211> 84

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> oligonucleótido sintético.

<400> 49

<210> 50

<211> 84

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

15 <220>

<223> oligonucleótido sintético.

<400> 50

<210> 51

<211> 81 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> oligonucleótido sintético.

<400> 51

<210> 52 35 <211> 81

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> oligonucleótido sintético.

<400> 52

45 <210> 53

<211> 54

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> oligonucleótido sintético.

<400> 53

tggcgctggt ggcgccggtg gcgcaggtgg ctctggcggt gcgggcggtt ccgg 54

<210> 54

<211> 54

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> oligonucleótido sintético.

<400> 54 ggaaccgccc gcaccgccag agccacctgc gccaccggcg ccaccagcgc cacc 54

<210> 55

<211> 3238

<212> ADN 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Vector de clonación pAZL

<400> 55

Claims

Reivindicaciones

1. Una proteína recombinante de seda de araña que comprende una o más secuencias de proteínas de seda de araña repetitivas sintéticas,

(a)

en donde la secuencia repetitiva sintética comprende entre 5 a 50 unidades de repetición, y en donde una unidad de repetición consiste de la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 5 o variantes de esta, o

(b)

en donde la secuencia repetitiva sintética comprende entre 10 a 50 unidades de repetición, y en donde una unidad de repetición consiste de la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 3 o variantes de esta y se combina con una unidad de repetición que consiste en la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 4 o variantes de esta,

en donde las variantes en cada caso tienen una sustitución de aminoácido, deleciones de aminoácido y/o inserciones de aminoácido, en donde la sustitución de aminoácidos consiste en 1 sustitución de aminoácido, las 15 deleciones de aminoácido consisten en entre 1 a 2 deleciones de aminoácido y/o las inserciones de aminoácido consisten en entre 1 a 2 inserciones de aminoácido.
2. La proteína recombinante de seda de araña de la reivindicación 1, en donde la proteína recombinante de seda de araña comprende adicionalmente una o más secuencias de proteína de seda de araña repetitivas no auténticas, y en donde

(i) la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia no repetitiva auténtica es la sec. con núm. de ident.: 14 o una variante de esta, que codifica la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.: 10 con una sustitución de aminoácido, deleciones de aminoácidos y/o inserciones de aminoácidos, en donde la

25 sustitución de aminoácidos consiste en 1 sustitución de aminoácido, las deleciones de aminoácidos consisten en entre 1 a 2 deleciones de aminoácidos y/o las inserciones de aminoácidos consisten en entre 1 a 2 inserciones de aminoácidos,

(ii) la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia no repetitiva auténtica es la sec. con núm. de ident.: 15 o una variante de esta, que codifica la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.: 11 con una sustitución de aminoácido, deleciones de aminoácidos y/o inserciones de aminoácidos, en donde la sustitución de aminoácidos consiste en 1 sustitución de aminoácido, las deleciones de aminoácidos consisten en entre 1 a 2 deleciones de aminoácidos y/o las inserciones de aminoácidos consisten en entre 1 a 2 inserciones de aminoácidos,

(iii) la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia no repetitiva auténtica es la sec. con núm. de

35 ident.: 32 o una variante de esta, que codifica la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.: 31 con una sustitución de aminoácido, deleciones de aminoácidos y/o inserciones de aminoácidos, en donde la sustitución de aminoácidos consiste en 1 sustitución de aminoácido, las deleciones de aminoácidos consisten en entre 1 a 2 deleciones de aminoácidos y/o las inserciones de aminoácidos consisten en entre 1 a 2 inserciones de aminoácidos, o

(iv) la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia no repetitiva auténtica es la sec. con núm. de ident.: 34 o una variante de esta, que codifica la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.: 33 con una sustitución de aminoácido, deleciones de aminoácidos y/o inserciones de aminoácidos, en donde la sustitución de aminoácidos consiste en 1 sustitución de aminoácido, las deleciones de aminoácidos consisten en entre 1 a 2 deleciones de aminoácidos y/o las inserciones de aminoácidos consisten en entre 1 a 2

45 inserciones de aminoácidos.
3.

La proteína recombinante de seda de araña de una o más de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la secuencia repetitiva sintética es (AQ)12 o (AQ)24, y en donde A representa la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 3 y Q representa la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 4.
4.

La proteína recombinante de seda de araña de una o más de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la secuencia repetitiva sintética es C16 o C32, y en donde C representa la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 5.

55 5. La proteína recombinante de seda de araña de una o más de las reivindicaciones 1 a 4, en donde las proteínas recombinantes de la seda de araña completas comprenden la fórmula (AQ)12NR3, (AQ)24NR3, C16NR4, C32NR4, (AQ)12, (AQ)24, C16 o C32, y en donde A representa la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 3, Q representa la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 4, C representa la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 5, NR3 representa la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 10 y NR4 representa la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 11.
6.

Una secuencia de ácido nucleico, que codifica una proteína recombinante de seda de araña de una o más de las reivindicaciones 1 a 5.
7.

Un vector, que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 6.
8.

El vector de la reivindicación 7, que es un vector de clonación que tiene una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la sec. con núm. de ident.: 55.
9.

El vector de la reivindicación 7, que comprende además una o más secuencias reguladoras, en donde el vector es un vector de expresión..
10.

El vector de las reivindicaciones 7 a 9, que es un plásmido o un vector viral.
11. El vector de la reivindicación 10, en donde el vector es un sistema de baculovirus o un sistema de vector del virus 15 vaccinia.
12.

Un huésped no humano, que ha sido transformado con el vector de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11.
13.

El huésped de la reivindicación 12, que es una célula procariota preferentemente E. coli o Bacillus subtilis.
14.

El huésped de la reivindicación 12, que es una célula eucariota, preferentemente una célula de mamífero, célula vegetal, célula de levadura o una célula de insecto.
15.

El huésped de la reivindicación 14, en donde la célula de mamífero es una célula CHO, COS, HeLa, 293T, HEH o

25 BHK, o en donde la célula de levadura se selecciona de Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Candida albicans, y Hansenula polymorpha.
16.

El huésped de la reivindicación 14, en donde la célula de insecto es seleccionada de células de insecto Lepidoptera, preferentemente de Spodoptera frugiperda y de Trichoplusia ni, preferentemente es una célula Sf9, Sf21 o high-5.
17.

El huésped de la reivindicación 14, en donde la célula vegetal se deriva de tabaco, papa, maíz, chícharo y tomate.
18.

Un método de agregación de proteínas de seda de araña, que comprende las siguientes etapas:

a) preparar una solución de proteína que contiene proteínas de seda de araña no orientadas como se define en una o más de las reivindicaciones 1 a 5; b) exponer la solución preparada en a) a un inductor de de agregación; y c) recuperar las proteínas de seda de araña precipitadas.
19. El método de la reivindicación 18, en donde las proteínas de seda de araña usadas en la etapa a) se producen por transformación de un huésped adecuado de una o más de las reivindicaciones 12 a 17 con un vector de la reivindicación 7 a 11 o un ácido nucleico de la reivindicación 6, y expresar la proteína de seda de araña bajo condiciones adecuadas.
20.

El método de las reivindicaciones 18 o 19, en donde el inductor de de agregación es seleccionado de acidificación, preferentemente a un pH de aproximadamente 1, fosfato de potasio y tensión mecánica, preferentemente al rotar la solución de proteína y aplicar fuerzas de cizalla y/o que comprende además la etapa de hilar dichas proteínas proporcionadas en la etapa a) o recuperadas en la etapa c) en filamentos, nanofibras e hilos por un método adecuado o formar una película.
21.

Uso de las proteínas/hilos tal como se define en una o más de las reivindicaciones precedentes en el campo de la biotecnología o la medicina para la fabricación de sistemas de cierre o de cobertura de la herida, preferentemente para la fabricación de materiales de sutura, que están destinados con mayor preferencia para usar en neurocirugía

55 o cirugía oftálmica.
22.

Uso de las proteínas/hilos tal como se define en una o más de las reivindicaciones precedentes para la fabricación de materiales de materiales de reemplazo, preferentemente materiales de cartílago o tendón artificiales.
23.

Uso de las proteínas/hilos tal como se define en una o más de las reivindicaciones 1 a 5 en la fabricación de piezas de automóviles y aviones.
24.

Sistemas de cierre o de cobertura de heridas, materiales de sutura, materiales de reemplazo, preferentemente

5 cartílago artificial, materiales de tendón, partes o piezas de automóviles usados en la construcción de aviones, que comprenden una proteína de una o más de las reivindicaciones 1 a 5 o que se obtienen por un método de una o más de las reivindicaciones 18-20.
25.

Un producto de papel, o un producto de textil o cuero, que comprende una proteína recombinante de seda de araña de una o más de las reivindicaciones 1 a 5.
26.

El producto de textil o cuero de la reivindicación 25, en donde la proteína recombinante de seda de araña está presente como un recubrimiento.

15 27. Un gel o una espuma que comprende o que consiste en una proteína de una o más de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el gel comprende o consiste preferentemente en proteínas basadas en (AQ)12NR3, (AQ)24NR3, C16NR4, C32NR4, (AQ)12, (AQ)24, C16 o C32.
28.

Recubrimiento para los implantes y endoprótesis que comprenden o que consisten en una proteína de una o más de las reivindicaciones 1 a 5.
29.

Una esfera, hilo o fibra, que comprende una proteína/hilo de una o más de las reivindicaciones 1 a 5 y una fibra adicional, la fibra no es de origen de araña y preferentemente es una fibra derivada de planta o una fibra sintética.

25 30. Una película que comprende o que consiste en una proteína de una o más de las reivindicaciones 1 a 5 o que se basa en (AQ)12NR3, (AQ)24NR3, C16NR4, C32NR4, (AQ)12, (AQ)24, C16 o C32 y que comprende o consiste en preferentemente proteínas basadas en (AQ)24NR3 o C16.
31. La película de la reivindicación 30, en donde la superficie de la película se modifica por las moléculas orgánicas pequeñas o macromoléculas biológicas, por ejemplo proteínas, fluoresceína o β-galactosidasa.