KR101494711B1 - 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 단백질의 반복적인 ｃ-말단 영역의 폴리펩티드 서열 및 이를 코딩하는 염기서열 - Google Patents

Abstract

본 발명은 산왕거미(Araneus ventricosus) 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 단백질(major ampullate spidroin protein, MaSp)의 반복적인 C-말단 영역을 갖는 폴리펩티드 및 이의 반복적인 C-말단 영역을 암호화하는 염기서열을 제공하고자 한다.
거미실크 단백질은 생물 고분자 물질, 콘택트렌즈관련 물질, 수술용 실, 바이오 소재, 조직 공학 등의 분야에 유용하게 사용될 수 있다.
특히 본 발명의 염기서열은 거미실크 단백질의 아미노산 구조적 특성을 이해하고 곤충세포에서 베큘로바이러스 발현 시스템을 이용한 재조합 거미실크를 발현함으로써 거미실크 단백질의 특성을 밝히는데 기여할 수 있다.

Description

산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 단백질의 반복적인 Ｃ-말단 영역의 폴리펩티드 서열 및 이를 코딩하는 염기서열{Polypeptide Sequences of the Repetitive C-terminus of the Major Ampullate Spidroin Protein from Araneus ventricosus and Gene Sequences Encoding thereof}

본 발명은 산왕거미(Araneus ventricosus) 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 단백질(major ampullate spidroin protein, MaSp)의 반복적인 C-말단 영역의 폴리펩티드 서열 및 이를 코딩하는 염기서열에 관한 것이다.

거미실크(spider silk)는 독특한 물리적, 기계적 특성으로 인하여 산업적 및 의학적 목적으로 관심의 대상이 되는 매력적인 생체물질(biomaterial)이다 [Scheibel, Microbial Cell Factories 3: 14 (2004)]. 바이오의약품, 섬유 기술, 화장품과 같은 보호 생산품 등 다양한 범위에서 거미실크의 적용이 가능하다. 예를 들면, 생물 고분자 물질, 콘택트렌즈관련 물질, 수술용 실, 바이오 소재, 조직 공학 등의 분야에 거미실크의 사용이 고려될 수 있다[Foo et al., Adv. Drug Deli. Rev. 54: 1131-1143 (2002); Scheibel, Microbial Cell Factories 3: 14 (2004)]. 이러한 거미실크는 실샘 특이적으로 합성되어 토사관을 통해 방출되는데, 거미 망(spider net)을 만드는데 있어 하기의 세 가지 형태의 실크를 합성하는 것으로 알려져 있다 [Gatesy et al., Science 291: 2603 (2001)]: (1) 거미 망의 주요 골격 합성을 위한 주된 실크, (2) 거미 망의 골격을 보조하는 실크와 (3) 먹이 포획을 위한 나선형 망 실크. 이들 거미실크 중에서 주요 골격 합성에 사용되는 메이저 엠풀레이트 스피드로인(MaSp)은 주요 거미실크로서 가장 높은 인장강도를 나타내고 먹이 포획을 위한 나선형 망 합성에 사용되는 플라겔리폼(flagelliform) 실크는 아주 높은 탄성력을 나타내는 것으로 알려져 있다. 거미실크는 N-말단 및 C-말단의 비반복적인 부분과 짧은 펩타이드(GGX 또는 GPGGX) 또는 여러 개의 알라닌(poly-A)으로 구성된 반복되는 구조로 주로 이루어져있다 [Hayashi & Lewis Science 287: 1477-1479 (2000); Scheibel, Microbial Cell Factories 3: 14 (2004); Lee et al., J. Biosci., 32: 705-712 (2007)].

이러한 거미실크의 여러 가지 특성에도 불구하고 거미의 영역차지 및 동족을 잡아먹는 습성으로 인하여 사육이 불가능하여 거미실크를 대량생산하지 못하는 단점이 있다. 재조합 거미실크 또는 유사 실크를 생산하기 위하여 여러 가지 발현시스템을 이용하는 시도가 있어왔다. 지금까지 주로 박테리아 [Arcidiacono et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 49: 31-38 (1998)], 포유동물 세포 [Lazaris et al., Science 295: 472-476 (2002)], 식물체 [Scheller et al., Nat. Biotechnol. 19: 573-577 (2001)] 또는 곤충세포 [Huemmerich et al., Curr. Biol. 14: 2070-2074 (2004)]를 사용하여 재조합 거미실크를 생산하였는데, 이때 사용된 거미실크 유전자는 3´-말단 cDNA를 사용하였다. 거미실크 단백질의 다양한 반복 서열로 인하여 전체 염기서열을 밝히는데 어려움이 있었으나, 최근에야 몇몇 종의 거미실크 전체 염기서열이 밝혀졌다.

지금까지 몇몇 종의 거미 중에서 대표적으로 Nephila clavipes와 Araneus diadematus에서 많은 연구가 실시되어 거미 메이저 엠풀레이트 스피드로인(MaSp) 유전자 3´-말단 염기서열이 밝혀졌다 [Xu & Lewis Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 7120-7124 (1990); Hinman & Lewis J. Bio. chem. 267: 19320-19324 (1992); Beckwitt & Arcidiacono J. Bio. chem. 269: 6661-6663 (1994); Guerette et al., Science 272: 112-115 (1996); Hayashi & Lewis J. Mol. Biol. 275: 773-784 (1998)]. 최근 두 종의 거미에서 거미실크의 전체 염기서열이 밝혀졌는데, Argiope bruennichi 종에서 알집(egg case)을 만드는데 사용되는 두 가지의 거미실크 단백질을 코딩하는 전체 염기서열이 밝혀졌다 [Zhao et al., Biochemistry 45: 3348-3356 (2006)]. 알집을 만드는데 사용되는 거미실크는 메이저 엠풀레이트 스피드로인(MaSp) 보다 낮은 인장강도와 강성을 가진 단점이 있다. 그리고 Latrodectus hesperus 종에서 처음으로 두 가지의 메이저 엠풀레이트 스피드로인(MaSp) 단백질을 코딩하는 전체 염기서열이 보고되었다 [Ayoub et al., PLoS One 6: e514 (2007)].

그러나 우리나라를 포함한 동아시아 지역에서 발견되는 대표적 거미인 산왕거미에서는 주요 거미 실크 단백질인 메이저 엠풀레이트 스피드로인(MaSp)을 코딩하는 염기서열 및 아미노산 서열의 구조에 관해서는 아직 밝혀지지 않은 실정이다.

이에 본 발명자들은 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 단백질을 코딩하는 cDNA 유전자의 3´-말단 염기서열 및 폴리펩티드 서열을 밝히고 구조적 특성을 밝힘으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명은 산왕거미의 메이저 엠풀레이트 스피드로인 단백질의 반복적인 C-말단을 암호화하는 핵산 분자를 제공하는데 목적이 있다.

또한 본 발명은 상기 핵산 분자에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 제공하는데 목적이 있다.

또한 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공하는데 그 목적이 있다.

또한 본 발명은 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 폴리펩티드로부터 구축된 곤충베큘로바이러스로부터 발현시킨 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 재조합 단백질을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 서열목록 제1서열을 필수 아미노산 서열로 하는 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 서열목록 제1서열의 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 폴리펩티드를 코딩하는 반복적인 C-말단 영역을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.

본원 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다.

(i) 본 발명의 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 단백질을 코딩하는 cDNA 유전자의 3´-말단 염기서열은 새로운 바이오의약품 및 섬유 기술 등의 개발에 유용하다.

(ii) 본 발명의 핵산 분자는 여러 가지 발현시스템을 이용하여 재조합 단백질을 발현하고 생산물을 이용할 수 있다.

(iii) 본 발명의 핵산 분자를 이용하면 새로운 바이오생체물질의 개발 등 산업, 의학적으로 다양하게 이용 가능하다.

도 1은 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 단백질의 반복적인 C-말단 영역을 암호화하는 cDNA 유전자의 서열과 이 염기서열에 의하여 코딩되는 폴리펩티드 서열이다.
도 2는 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 단백질의 C-말단 아미노산 서열과 기존에 보고된 거미 메이저 엠풀레이트 스피드로인 단백질의 C-말단 아미노산 서열을 비교한 것이다.
도 3은 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 단백질의 C-말단 아미노산 서열과 기존에 보고된 거미 유래 실크의 아미노산 서열 비교를 통한 계통도 분석을 나타낸 것이다.
도 4는 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 단백질의 C-말단 아미노산 서열의 구조적 특성을 나타낸 것이다. 반복되는 짧은 아미노산 서열 (GGX)과 여러 개의 알라닌 서열 (A_n)을 각각 다른 색으로 표기 하였다.
도 5는 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 단백질의 C-말단 아미노산 서열의 소수성을 나타낸 그림이다.
도 6은 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 단백질의 C-말단 아미노산 서열에서 빈번하게 나타나는 아미노산 서열을 백분율로 나타낸 그림이다.
도 7은 재조합 베큘로바이러스를 이용하여 재조합 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 단백질을 곤충세포에서 발현시켜 웨스턴 블랏을 실시한 사진이다.
도 8은 재조합 베큘로바이러스를 감염시킨 곤충세포로부터 재조합 산왕거미 유래 이져 엠풀레이트 스피드로인 단백질을 분리하여 전기영동한 사진이다.

본 발명은 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 폴리펩티드 및 이의 폴리펩티드를 코딩하는 반복적인 C-말단을 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 서열목록 제1서열을 필수 아미노산 서열로 하는 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 폴리펩티드이다.

본 명세서에서의 핵산 분자는 예컨대, RNA, DNA 또는 cDNA가 될 수 있으며, 핵산의 시퀀스는 암호화 부위 서열 또는 비암호화 부위 서열(예컨대, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 또는 miRNA)이 될 수 있다.

본 명세서에서 용어 “필수 아미노산 서열로 포함”은 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 기능과 관련하여 언급된 서열을 최소 서열로 포함하며 다른 서열을 추가적으로 포함할 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 펩티드 기능을 위하여 서열목록 제1서열로 구성된(consisting of) 펩티드 또는 서열목록 제1서열의 아미노산 서열에 추가적으로 다른 아미노산 서열이 결합된(N-말단, C-말단 또는 두 양말단에) 펩티드는 본 발명의 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 펩타이드에 속하는 것이다.

또한 본 발명은 상기 서열목록 제1서열의 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 폴리펩티드를 코딩하는 반복적인 C-말단 영역을 포함하는 핵산 분자이다.

산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 단백질의 반복적인 C-말단을 암호화하는 유전자는 본 발명자들에 의하여 처음 분리된 것으로 아직까지 그 특징이 구체적으로 보고되고 있지 않다. 본 발명자들은 2006년 9월 24일 산왕거미 유래 3´-말단 플라겔리폼(flagelliform) 실크 단백질을 코딩하는 cDNA 유전자의 3´-말단 염기서열을 유전자은행(GenBank No. EF025541)에 등록하였으며, 2007년 Journal of Biosciences에 논문을 연구내용을 발표한 바 있다. 그러나 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 단백질을 코딩하는 cDNA 유전자의 염기서열은 산왕거미 유래 플라겔리폼 실크 단백질을 코딩하는 cDNA 유전자의 염기서열과 차이가 있음을 확인하였다.

상기 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 유전자는 NCBI GenBank database에 승인번호 JN857964 (cDNA)로 2011년 10월 17일에 등록되었다.

본 발명은 상기 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터(vector)"는 외부의 유전 물질을 다른 세포로 옮기는데 사용되는 전달 수단인 DNA 분자이다. 대표적으로 플라스미드 벡터, 박테리오파아지 벡터, 코스미드 벡터, 인공 염색체를 이용한 벡터(예컨대, YAC, BAC) 등이 존재한다. 벡터를 이용하여 원하는 유전 물질을 대량 발현하는데 있으므로 벡터로서의 기능을 하기 위해 필요한 공통 요소가 존재하는데, 복제 원점(Replication Origin), 여러 제한효소 자리(Multicloning site), 선택표지(selective marker)가 반드시 존재하여야 한다. 벡터 그 자체는 DNA 염기 서열로 이식할 유전자(transgene)과 벡터 백본(backbone)을 포함한다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 본 발명의 핵산 분자가 원핵 세포 유래이고, 배양의 편의성 등을 고려하여, 원핵 세포를 숙주로 하는 것이 바람직하다. 본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET, pEGFP, pCR 등), 파지 (예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

한편, 본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명이 바람직한 구현예에 따르면, 상기 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 폴리펩티드는 곤충베큘로바이러스로부터 발현시킨다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 폴리펩티드로부터 구축된 곤충베큘로바이러스로부터 발현시킨 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 재조합 단백질을 제공한다.

본 발명에서의 용어 ‘재조합 단백질’이란 두 개 혹은 그 이상의 DNA를 유전자 재조합 기술로 이어 붙여 만든 recombinant DNA에서 만들어지는 단백질이다.

상기 recombinant DNA기술을 통해 과거 자연 상태부터 미량으로 밖에 얻을 수 없던 의료용 단백질 또는 산업용 효소 등을 박테리아(예컨대 E. coli)와 동물세포 등을 이용하여 합성할 수 있다. 박테리아(예컨대 E. coli)를 비롯한 효모(Yeast)와 동물 세포(Mammalian cell)의 발효 및 배양, 의약품 원료 수준의 정제 과정을 통하여 합성 가능하다. 재조합 단백질로 합성된 예로, hGH (Human Growth hormone), INS (Insulin), Interleukine 등이 있다.

본 발명은 하기의 실시 예에 의하여 보다 구체적으로 이해될 수 있다. 그러나 하기의 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 보호를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1: cDNA 염기서열 분석 및 데이터 분석

산왕거미(Araneus ventricosus) 몸 전체로부터 상용화된 SV Total RNA Isolation System 키트(Promega 사, 미국)를 이용하여 전 RNA(total RNA)를 추출하였다. 추출된 전 RNA로부터 상용화된 PolyATtractmRNA Isolation System(Promega 사, 미국)을 이용하여 Promega 사가 제시한 방법을 따라 추출한 poly(A)+mRNA를 상용화된 키트인 Marathon cDNA Anplication 키트(Clontech 사, 미국)을 사용하여 cDNA를 합성하였다. 기존에 보고된 거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 단백질의 폴리 알라닌(poly-alanine) 영역에서 유전자 특이적인 프라이머를 제작하였다. 이때 단백질 발현을 위하여 임의의 개시코돈을 포함한 앞쪽 프라이머 (F-primer) 5'-ATGGCCGCNGCAGCYGCAGCAGCAGCYGG-3'와 키트에 포함된 adapter primer(AP1-primer)를 이용하여 PCR을 수행하여 3‘-말단 유전자를 합성하였다. 합성된 cDNA를 pGemT 플라스미드 벡터(Promega 사, 미국)에 클로닝하고 무작위로 선별한 클론들의 염기서열을 분석하였다. DNA 추출은 상용화 키트인 Wizard mini-preparation 키트(Promega 사, 미국)를 사용하였고 염기서열은 자동화 DNA 서열분석기(Applied Biosystems 사, 미국)로 서열을 분석하였다. 그 염기서열들은 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)의 BLAST 프로그램에 의해 비교하였다. 이때 분석된 DNA들 중, 기존에 보고된 거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 유전자(MaSp)와 높은 상동성을 보이는 cDNA 클론을 확보하고 반복적인 3´-말단 뉴클레오티드 서열만을 클로닝하기 위하여 유전자 특이적인 뒤쪽 프라이머를 제작하였다. 종결부위와 히스티딘 영역을 합성한 뒤쪽 프라이머 (R-primer) 5’-TTAATGATGATGATGATGATGAGCACTAGGAGATGAAAGGCGAGA-3'와 앞쪽 프라이머를 사용하였다. 이때 합성된 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인(AvMaSp)을 코딩하는 cDNA의 3´-말단 뉴클레오티드 서열은 744 bp로써 248개의 아미노산으로 번역이 가능하였다 (도 1). 기존에 보고된 거미 메이저 엠풀레이트 스피드로인의 아미노산 서열과 비교하기 위하여 MacVector 프로그램(Version 6.5, Oxford Molecular Ltd., Oxford, 영국)을 사용한 결과, 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 단백질은 다른 거미 유래의 메이저 엠풀레이트 스피드로인 단백질과 높은 상동성을 나타내며 Argiope trifasciata의 메이저 엠풀레이트 스피드로인 1과 76%의 가장 높은 상동성을 나타내었다 (도 2). PAUP 프로그램(Version 4.0, Phylogenetic Analysis Using Parsimony, Swofford 2000)을 사용하여 기존에 보고된 거미실크와의 계통도 분석을 실시하였다. 그 결과, 2개의 그룹으로 나누어 졌는데, 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인은 다른 거미에서 알려진 메이저 엠풀레이트 스피드로인과 같은 그룹을 형성하여 유사한 단백질이라는 것을 가늠할 수 있었다 (도 3). 이때 사용된 거미실크 유전자 정보는 다음과 같다: Araneus ventricosus major ampullate spidroin (본 연구), Argiope trifasciata major ampullate spidroin 1 (GenBank No. AF350266), A. diadematus fibroin-2 (GenBank No. U47854), Nephila clavipes major ampullate spidroin 1 (GenBank No. 654291), Nephilengys cruentata major ampullate spidroin-like (GenBank No. EF638446), Gasteracantha cancriformis major ampullate spidroin 2 (GenBank No. AF350272), A. trifasciata major ampullate spidroin 2 (GenBank No. AF350267), Deinopis spinosa major ampullate spidroin 2 (GenBank No. DQ399328), Latrodectus hesperus major ampullate spidroin 2 (GenBank No. EF595245), A. ventricosus flagelliform (GenBank No. EF025541), A. trifasciata flagelliform (GenBank No. AF350264), N. clavipes flagelliform (GenBank No. AH009146), N. madagascariensis flagelliform (GenBank No. AF218624) 및 N. cruentata flagelliform (GenBank No. EF638444).

산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 cDNA 유전자의 염기서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 기존에 보고된 메이저 엠풀레이트 스피드로인과 비교하였을 때, 반복적인 구조를 나타내는 240개의 아미노산 서열과 비반복적인 구조를 나타내는 8개의 아미노산 서열로 이루어져 있다 (도 4). 짧은 아미노산 서열 GGX와 알라닌 서열 (A_n)이 반복적으로 나타난다는 것을 알 수 있다. 이러한 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 단백질의 반복적인 구조는 다른 거미에서 알려진 메이저 엠풀레이트 스피드로인 1 및 2에서 나타나는 특징으로 GGX와 poly-A가 많은 부분을 차지한다고 알려져 있다 [Hinman & Lewis J. Biol. Chem. 267: 19320-19324 (1992)]. 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 단백질의 반복적인 아미노산이 소수성을 나타낸다는 것을 Kyte 및 Doolittle의 방법(Kyte 및 Doolittle 1982)에 의해 확인하였다 (도 5). 그리고 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 단백질의 반복적인 아미노산 서열에서 빈번이 나타나는 아미노산 서열의 함량을 백분율로 나타낸 결과, 전체 아미노산 서열의 43.9 %가 글라이신(glycine)이 그리고 알라닌(alanine)이 33.9 %로 구성되어 있는 것으로 나타났다 (도 6).

실시예2 : 재조합 산왕거미 메이저 엠풀레이트 스피드로인 단백질( AvMaSp )의 발현

산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 단백질을 발현시키기 위하여 Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcNPV)와 곤충세포 (Sf21)을 이용한 베큘로바이러스 시스템 [Je et al., Biotechnol. Lett. 23: 575-582 (2001)]을 이용하여 발현시켰다. 플라스미드 pGemT-MaSp로부터 제한효소 BamHI 및 XhoI으로 처리하여 AvMaSp 유전자를 분리하여 같은 제한효소를 처리한 전이벡터 pBacPAK8 (Clontech 사, 미국)에 클로닝 하였다. 이때 AvMaSp는 다각체 프로모터하에 조절되도록 두어 전이벡터 pBacPAK8-AvMaSp를 제작하였다. 500 ng의 전이벡터 DNA와 100 ng의 AcNPV 바이러스 DNA [Je et al., Biotechnol. Lett. 23: 575-582 (2001)]를 1.0 1.5 × 10⁶개의 Sf9 곤충세포에 트랜스펙숀 리에이젼트 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)를 사용하여 5시간 동안 동시에 트랜스펙숀 시켰다. 트랜스펙숀 시킨 곤충세포는 27℃에서 5일 동안 배양하였다. 이렇게 제작된 재조합 베큘로바이러스를 AcNPV-AvMaSp라 명하고 O’Reilly의 방법에 따라 바이러스를 순화하고 농도를 측정하였다.

실시예 3: 단백질 전기영동 분석 및 웨스턴 블랏 분석

직경 35 mm의 곤충세포 배양 용기에 1 × 10⁶개의 곤충세포 Sf9을 준비하고 감염시키지 않은 대조구와 야생형 바이러스 또는 재조합 베큘로바이러스를 감염시켰다. 감염시킨 후, 27℃에서 3일간 배양하고 곤충세포를 수거하여 PBS 용액을 사용하여 세척한 후, 단백질 sample buffer(10% 2-mercaptoethanol, 4% SDS, 10% sucrose, 0.004% bromophenol blue, 0.12 M Tris-HCl, pH 6.8)와 혼합하고 100℃에서 5분 동안 처리하였다. 전체 곤충세포 단백질은 14% SDS-PAGE를 실시하고 0.1% Coomassie Brilliant Blue R-250에 염색하였다. 단백질 전기영동 후, 단백질을 nitrocellulose 막에 전이시켜, 막을 1% skim milk와 blocking을 시켰다. His-tag 항체를 1:10,000의 농도로 1% skim milk에 희석하여 막과 1시간 동안 반응시키고 막을 TBST [10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 0.05% (v/v) Tween-20] 용액에 세척하였다. 다시 막을 2차 항체 [anti-mouse IgG-horseradish peroxidase (HRP) conjugate]와 혼합하여 반응시켰다. 반응 후, TBST 용액을 이용하여 막을 세척하고 ECL detection reagents를 사용하여 발색시키고 필름에 노출시켰다. 그 결과, 재조합 베큘로바이러스 AcNPV-AvMaSp를 감염시킨 곤충세포에서 약 21-kDa의 재조합 AvMaSp 단백질로 발현되었음을 확인할 수 있었다 (도 7). 이러한 결과는 곤충세포에서 베큘로바이러스를 이용한 거미 실크 단백질을 코딩하는 3´-말단의 염기서열의 발현이 성공한 것처럼 곤충세포를 이용하여 거미 실크 단백질의 생산 가능성을 확인할 수 있었다 [Lee et al., J. Biosci., 32: 705-712 (2007)].

실시예4 : 재조합 AvMaSp 단백질의 정제

재조합 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 단백질을 분리하기 위하여 재조합 베큘로바이러스 AcNPV-AvMaSp를 Sf21 곤충세포주에 감염시키고 3일 뒤, 곤충세포를 모아 lysis buffer를 처리하고 15,000 ×g의 속도로 원심분리를 실시하여 단백질을 추출하였다. MagneHis Protein Purification System(Promega 사, 미국)을 사용하여 재조합 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 단백질만 분리하여 14 % SDS-PAGE를 실시한 결과, 약 21 kDa의 재조합 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 단백질을 확인할 수 있었다 (도 8). 이러한 결과는 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 단백질의 반복적인 아미노산 구조적 특성을 이해하고 베큘로바이러스 발현 시스템을 이용한 곤충세포에서 재조합 거미실크를 발현함으로써 거미실크 단백질의 특성을 밝혔다.

<110> Dong-A University Research Foundation for Industry-Academy Cooperation <120> Polypeptide Sequences of the Repetitive C-terminus of the Major Ampullate Spidroin Protein from Araneus ventricosus and Gene Sequences Encoding thereof <130> PC110834 <140> 10-2011-0114413 <141> 2011-11-04 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 248 <212> PRT <213> Araneus ventricosus <400> 1 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly 1 5 10 15 Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Ala 20 25 30 Gly Gln Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gly 35 40 45 Ala Gly Ala Gly Gly Leu Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Tyr Gly 50 55 60 Ala Gly Leu Gly Gly Gln Gly Gly Ala Gly Gln Ala Ala Ala Ala Ala 65 70 75 80 Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Arg Gln Gly Gly Tyr Gly Ala Gly 85 90 95 Gly Ala Gly Gln Gly Tyr Gly Ala Gly Tyr Gly Gly Gln Gly Gly Ala 100 105 110 Gly Gln Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gln Gly 115 120 125 Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Tyr Gly Ser Gln Gly Ala Gly Ala Gly 130 135 140 Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 145 150 155 160 Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Tyr Gly Ser Gln Gly 165 170 175 Ala Gly Ala Gly Gly Tyr Gly Gly Arg Gln Gly Gly Ala Gly Ala Ala 180 185 190 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly 195 200 205 Tyr Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr 210 215 220 Gly Gly Gln Gly Ala Ala Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala 225 230 235 240 Ser Arg Leu Ser Ser Pro Ser Ala 245 <210> 2 <211> 744 <212> DNA <213> Araneus ventricosus <400> 2 gccgccgcag ccgcagcagc agctggtgga caaggaggtc aaggtggata tggaggatta 60 ggttcccaag gagctggaca aggaggatat ggagcaggac aaggtgccgc ggcagctgca 120 gcagcagccg ggggtgcagg aggcgcagga cgaggaggct taggtgctgg aggtgcagga 180 caaggatatg gagctggatt aggtggacaa ggaggagcag gacaagcagc agctgcagca 240 gcagccggag gagcaggagg cgcacgacaa ggaggcttag gcgctggtgg tgcaggacaa 300 ggatatggag ctggattagg tggacaagga ggggcaggac aaggaggtgc cgcggcagcc 360 gcagcagcag ctggtggaca aggaggtcaa ggtggatatg gaggattagg ttcccaagga 420 gctggacaag gaggatatgg agcaggacaa ggtggtgccg ctgcagccgc agcagcagct 480 ggaggacaag gaggtcaagg tggatatggt ggattaggtt cccaaggagc tggacaaggt 540 ggatatggag gtagacaagg tggtgcagga gccgcagcag ctgcagcagc agccggaggt 600 gcaggaggcg caggacaagg aggattaggt gctggtggtg ccggacaagg aggatatgga 660 ggtggtgcat atggtggaca aggtgcagca tcatctgctg ctgcagcctc tgccgcagcg 720 tctcgccttt catctcctag tgct 744

Claims (6)

1. 서열목록 제1서열로 구성되는 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 단백질의 반복적인 C-말단 영역의 폴리펩티드.
   
2. 청구항 1의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자.
   
3. 청구항 2에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
   
4. 청구항 2에 있어서, 상기 핵산 분자는 cDNA인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
   
5. 청구항 2 내지 4 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
   
6. 삭제

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