KR101597006B1 - 산왕거미 유래 메이져 엠풀레이트 스피드로인 단백질을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 및 당뇨합병증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 - Google Patents
산왕거미 유래 메이져 엠풀레이트 스피드로인 단백질을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 및 당뇨합병증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 혈당강하 및 인슐린 분비 촉진 활성을 가진 산왕거미 유래 메이져 엠풀레이트 스피드로인 단백질, 이를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 및 당뇨합병증을 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 이를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 및 당뇨합병증 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다. 본 발명에 따른 산왕거미 유래 메이져 엠풀레이트 스피드로인 단백질은 혈당강하 및 인슐린 분비 촉진 활성을 통해 당뇨병 및 당뇨병과 관련된 합병증을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있는바, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 의약품, 식품과 같은 다양한 산업 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 혈당강하 및 인슐린 분비 촉진 활성을 가진 산왕거미 유래 메이져 엠풀레이트 스피드로인 단백질, 이를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 및 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 이를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 및 당뇨합병증의 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.
누에와 거미에서 생산되는 실크는 최근 독특한 물리적, 기계적 특성으로 인하여 산업적 및 의학적 목적으로 관심의 대상이 되는 매력적인 생체물질이다. 주로 의류용 고급소재로 이용되어 실크는 화학적 조성이 밝혀지면서 식품, 화장품, 의약품 등 기능성 소재로 개발이 활발히 진행이 되고 있다. 누에에서 생산되는 실크는 천연에서 얻을 수 있는 단백질이며, 섬유상 단백질인 피브로인과 이들을 부착시키는 고무상 단백질인 세리신으로 구성되어 있다. 누에고치의 가수분해물인 실크단백질 가수분해물은 분자량이 감소하고 전하가 변하며 펩타이드는 본래의 단백질과는 다른 물리화학적 특성을 가져 본래 단백질에 비해 용해성이 높아 식품에서 사용될 때 열변성이 적고 고농도 용액에서도 점도가 낮아 음식 등에 응용되고 있다 [Rupnow, Encyclopedia of Food Science and Technology vol 3: 2182 (1994)]. 이 외에도 누에실크 단백질 가수분해물은 기능성 식품, 화장품, 의약품 등에 응용하고자하는 연구가 보고되고 있다 [Takano et al., Sov. Phys. Crystallogr, 60: 358-362 (1991); Chen et al., J. Seric. Sci. Jpn, 65:131-133 (1996); Kim et al., Korean Patent 98712 (1996); Kim et al., J. Kor. Fiber Soc., 38: 131-133 (2001)].
누에 실크 피브로인 단백질은 18종의 아미노산으로 구성되어 있으며 주성분은 글리신, 알라닌과 세린으로 피브로인 전체 성분의 약 80% 이상을 차지하고 있는데[Zhou et al., Nucleic Acids Res., 28: 2413-2419 (2000)] 글리신, 알라닌 및 세린은 혈중 콜레스테롤 수치를 낮추어 주는 작용에 의한 항산화 효과, 면역 관련 작용, 알코올 흡수저해 효과 등이 알려져 있다.
거미 실크는 여러 가지 종류의 실크 단백질로 구성되는데 그 중 메이져 엠풀레이트 스피드로인 실크는 거미망의 주요 골격 합성에 사용되는 가장 높은 인장강도를 나타낸다고 알려져 있다. 거미 메이져 엠풀레이트 스피드로인 실크는 N-말단 및 C-말단의 비반복적인 부분과 짧은 펩타이드(GGX 또는 GA) 또는 여러 개의 알라닌(poly-A)으로 구성된 반복되는 특이한 구조로 주로 이루어져 있다 [Hayashi & Lewis Science 287: 1477-1479 (2000); Scheibel, Microbial Cell Factories 3: 14 (2004); Lee et al., J. Biosci., 32: 705-712 (2007); Lee et al., J. Aisa-Pacific Entomol., 15: 641-646 (2012)]. 누에와는 다른 생활 습성으로 거미 실크를 대량생산하지 못하는 단점이 있어서 재조합 거미실크 단백질을 생산하기 위하여 여러 가지 발현시스템을 이용하는 시도가 있어왔다. 지금까지 주로 박테리아, 포유동물 세포, 식물체 또는 곤충세포에서 재조합 거미실크 단백질을 생산하였다 [Arcidiacono et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 49: 31-38 (1998); Scheller et al., Nat. Biotechnol. 19: 573-577 (2001); Lazaris et al., Science 295: 472-476 (2002); Huemmerich et al., Curr. Biol. 14: 2070-2074 (2004); Lee et al., J. Biosci., 32: 705-712 (2007); 대한민국 특허출원 10-2011-0114413 (2011); Lee et al., J. Aisa-Pacific Entomol., 15: 641-646 (2012)]. 거미 메이져 엠풀레이트 스피드로인 실크의 짧은 펩타이드 및 여러 개의 알라닌으로 구성된 반복되는 특이한 구조로 인하여 주성분은 글리신과 알라닌으로 구성된다.
그러나, 이러한 거미 메이져 엠풀레이트 피브로인 실크 단백질이 가진 구조적 특성에도 불구하고 아직까지 거미 실크 단백질을 이용한 기능성 식품 또는 의약 보조용으로 적용에 대한 연구가 보고가 없는 실정이다.
이에 본 발명자들은, 산왕거미 유래 메이져 엠풀레이트 스피드로인 단백질을 베큘로바이러스를 사용하여 곤충 세포주에서 발현시켜 재조합 메이져 엠풀레이트 스피드로인 단백질을 분리정제[한국공개특허 제10-2013-0049409호]하였으며, 상기 단백질의 기능성 식품 또는 의약품으로의 용도를 알아보기 위하여 실험동물 쥐에 섭식시킨 결과, 혈당상승 억제로 인한 혈당개선 및 인슐린 분비량 증가를 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 혈당강하 및 인슐린 분비 촉진 활성이 우수하여 당뇨병 및 당뇨합병증의 예방 또는 치료에 효과적인 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 혈당강하 및 인슐린 분비 촉진 활성이 우수하여 당뇨병 및 당뇨합병증의 예방 또는 개선에 효과적인 건강기능식품을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드; 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 포함된 발현 벡터를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 및 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 당뇨합병증은 당뇨성 망막병증, 당뇨성 녹내장, 당뇨성 백내장, 당뇨성 신증 및 당뇨성 신경병증으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 혈당강하 및 인슐린 분비 촉진 활성을 통해 당뇨병 및 당뇨합병증 치료 효과를 가질 수 있다.
본 발명은 또한, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 및 당뇨합병증의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 상기 식품은 음료류, 육류, 초코렛, WE식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 식품은 혈당강하 및 인슐린 분비 촉진 활성을 통해 당뇨병 및 당뇨합병증 개선 효과를 가질 수 있다.
본 발명에 따른 산왕거미 유래 메이져 엠풀레이트 스피드로인 단백질은 혈당강하 및 인슐린 분비 촉진 활성을 통해 당뇨병 및 당뇨병과 관련된 합병증을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있는바, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 의약품, 식품과 같은 다양한 산업 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a는 본 발명에서 사용한 산왕거미 유래 메이져 엠풀레이트 스피드로인 단백질의 반복 영역의 아미노산 조성을 그래프화한 것이다.
도 1b는 산왕거미 유래 메이져 엠풀레이트 스피드로인 유전자의 반복 구조만을 발현시킨 재조합 단백질 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 당뇨대조군과 산왕거미 유래 메이져 엠풀레이트 스피드로인 재조합 단백질 0.5 mg 또는 1 mg을 섭취시킨 실험군의 혈당변화를 나타낸 것이다.
도 3은 당뇨대조군과 산왕거미 유래 메이져 엠풀레이트 스피드로인 재조합 단백질 0.5 mg 또는 1 mg을 섭취시킨 실험군의 혈청내 인슐린량을 나타낸 것이다.
도 1b는 산왕거미 유래 메이져 엠풀레이트 스피드로인 유전자의 반복 구조만을 발현시킨 재조합 단백질 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 당뇨대조군과 산왕거미 유래 메이져 엠풀레이트 스피드로인 재조합 단백질 0.5 mg 또는 1 mg을 섭취시킨 실험군의 혈당변화를 나타낸 것이다.
도 3은 당뇨대조군과 산왕거미 유래 메이져 엠풀레이트 스피드로인 재조합 단백질 0.5 mg 또는 1 mg을 섭취시킨 실험군의 혈청내 인슐린량을 나타낸 것이다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 가지며, 혈당강하 및 인슐린 분비 촉진 활성을 갖는 폴리펩티드를 제공함에 그 특징이 있다.
본 발명의 상기 폴리펩티드는 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 단백질로서, 본 발명자들은 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 단백질을 코딩하는 유전자 cDNA 염기서열을 분석하였으며(한국공개특허 10-2013-0049409호 참조), 이를 NCBI GENE BANK database에 등재하였다(JN857964).
또한, 본 발명자들은 산왕거미 유래 메이져 엠풀레이트 스피드로인의 반복구조의 특성을 알아보기 위하여 MacVector (ver. 6.5, Oxford Molecular Ltd., Oxford, UK) 프로그램을 사용하여 분석하였며, 그 결과 산왕거미 유래 메이져 엠풀레이트 스피드로인은 240개의 아미노산으로 구성되며 알라닌, 류신, 글리신, 세린, 타이로신, 글루타민 및 아르기닌으로 구성되며, 특히 글리신과 알라닌이 각각 45% 및 32%로 전체 아미노산 중에 77%를 차지하고 있는 것을 확인하였다(도 1a 참조). 본 발명에서는 상기 240개의 아미노산으로 구성되는 산왕거미 유래 메이져 엠풀레이트 스피드로인 단백질의 폴리펩티드 서열을 서열번호 1로 표시하였으며, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 서열번호 2로 표시하였다.
한편, 본 발명자들은 상기의 산왕거미 유래 메이져 엠풀레이트 스피드로인 단백질을 곤충세포주에서 발현시켰으며(한국공개특허 10-2013-0049409호 참조), MagneHisTM protein purification system (Promega 사, 미국)을 이용하여 분리·정제하여 하기 실험의 시료로 사용하였다.
즉, 본 발명자들은 산왕거미 유래 메이져 엠풀레이트 스피드로인 단백질의 활성을 검증하기 위하여, 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 재조합 벡터에 삽입한 후 이를 곤충세포주에 도입하여 재조합 단백질을 생산한 다음, 이렇게 생산된 재조합 단백질을 이용 혈당개선 효과를 실험하였다. 그 결과, 상기 재조합 단백질이 혈당상승을 억제함과 동시에, 인슐린 분비 촉진 효과를 갖는 것을 확인할 수 있었다(도 2 및 도 3 참조).
본 발명에서 혈당강하 및 인슐린 분비 촉진 활성을 갖는 단백질(폴리펩티드)은 야생형뿐만 아니라 90% 이상의 아미노산 상동성을 가지고 상기 활성을 가지는 기능적 상동체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "상동성"이란 야생형(wild type) 단백질의 아미노산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 혈당강하 및 인슐린 분비 촉진 활성을 갖는 단백질(폴리펩티드)은 서열번호 1의 서열로 정의되는 야생형 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.
본 기술 분야의 당업자라면 이러한 인위적인 변형에 의해 90% 이상의 상동성이 유지되고 본 발명에서 단백질 활성을 보유하는 한 균등한 폴리펩티드임을 쉽게 이해할 것이다.
본 발명의 단백질(폴리펩티드)은 혈당강하 및 인슐린 분비 촉진 활성을 보유하는 한 이들의 아미노산 서열 변이체를 포함할 수 있다. 여기서 변이체란 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질(폴리펩티드)을 의미한다.
이러한 변이체는 야생형과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 기능적 상동체 또는 물리 화학적 성질을 증가 또는 감소시키는 변형을 가지는 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게는 폴리펩티드의 물리 화학적 성질이 변형된 변이체이다. 예를 들어, 온도, 수분, pH, 전해질, 환원당, 가압, 건조, 동결, 계면장력, 광선, 동결과 해동의 반복, 고농도 조건 등의 물리적 요인과 산, 알카리, 중성염, 유기용매, 금속이온, 산화환원제, 프로티아제 등의 화학적 요인의 외부 환경에 대한 구조적 안정성이 증대된 변이체이다. 또한 아미노산 서열상의 변이로 혈당강하 및 인슐린 분비 촉진 활성이 증대된 변이체일 수 있다.
본 발명의 혈당강하 및 인슐린 분비 촉진 활성을 갖는 단백질(폴리펩티드)은 산왕거미(Araneus ventricosus) 유래의 메이져 엠풀레이트 스피드로인 단백질을 직접 분리하거나, 화학적으로 합성하거나, 유전자 재조합 기술을 이용하여 얻을 수도 있다.
먼저, 본 발명의 혈당강하 및 인슐린 분비 촉진 활성을 갖는 단백질(폴리펩티드)은 산왕거미(Araneus ventricosus)로부터 직접 분리하여 제조할 수 있다. 세포에 함유된 메이져 엠풀레이트 스피드로인 단백질의 분리 및 정제는 많은 공지 방법에 의해 실시할 수 있다.
또한 본 발명의 단백질(폴리펩티드)은 화학적으로 합성할 수 있다. 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당 분야에 널리 공지된 폴리펩티드 합성법을 이용하여 얻을 수 있다. 폴리펩티드는 통상의 단계적인 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법을 이용하여 제조할 수 있다. 특히, 바람직한 폴리펩티드의 제조방법은 고체상 합성방법(solid phase syntheses)을 이용하는 것이다. 본 발명의 신규한 폴리펩티드는 보호된 아미노산간의 응축반응(condensation reaction)에 의하여 통상의 고체상 방법으로, C-말단으로부터 시작하여 그 서열에 따라 순차적으로 진행하면서 합성할 수 있다. 응축 반응 후 보호기 및 C-말단 아미노산이 연결된 담체를 산분해(acid decomposition) 또는 아미놀리시스(aminolysis)와 같은 공지의 방법에 의해 제거할 수 있다. 상기 언급된 폴리펩티드 합성법은 관련 서적에 상세히 기술되어 있다.
또한 본 발명의 단백질(폴리펩티드)은 유전자 재조합 기술을 이용하여 얻을 수도 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우, 본 발명의 신규한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(핵산)를 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 벡터를 숙주세포로 형질전환(도입)하여 본 발명의 신규한 폴리펩티드가 발현되도록 숙주세포를 배양한 뒤, 숙주세포로부터 상기 단백질을 회수하는 과정으로 수득할 수 있다. 단백질은 선택된 숙주 세포에서 발현시킨 후, 분리 및 정제를 위해 통상적인 생화학 분리 기술, 예를 들어 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 원심분리, 초음파파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 등을 이용할 수 있으며, 통상적으로 순도가 높은 단백질(폴리펩티드)을 분리하기 위하여 이들을 조합하여 이용한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 혈당강하 및 인슐린 분비 촉진 활성을 갖는 단백질(폴리펩티드)을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명의 상기 핵산 분자는 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 가질 수 있으며, 이와 90% 이상의 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 이들과 기능적으로 동일한 작용을 수행하는 이의 작용성 등가물을 포함하는데, 상기 작용성 등가물은 인위적인 변형에 의해 뉴클레오타이드의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution), 삽입(insertion) 또는 이들의 조합(combination)에 의해 변형된 변이체(variants) 또는 동일한 작용을 수행하는 상기 핵산 분자의 작용성 단편(fragments)을 포함할 수 있다.
본 기술분야의 당업자라면 이러한 인위적인 변형에 의해 70% 이상 상동성이 유지되는 염기서열이 본 발명에서 목적하는 유전자 발현을 위한 혈당강하 및 인슐린 분비 촉진 활성을 보유하는 한, 본 발명의 핵산 분자와 균등물로서 본 발명의 권리 범위에 속함을 쉽게 이해할 수 있을 것이다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 혈당강하 및 인슐린 분비 촉진 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 이를 발현하는 벡터에 의해 제공되어 단백질로 발현될 수 있다.
본 발명에서 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미하는 것으로, 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.
본 발명에서 "작동가능하게 연결된 (operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
본 발명의 벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트, 분비시그널 등을 포함할 수 있으며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다.
본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주 중에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당 업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 예컨대 비바이러스성 벡터 또는 바이러스성벡터를 사용할 수 있다.
상기 비바이러스성 벡터로는 플라스미드가 대표적이다. 플라스미드 발현 벡터는 사람에게 사용할 수 있는 FDA의 승인된 유전자 전달방법으로 사람 세포에 직접적으로 플라스미드 DNA를 전달하는 방법으로, 플라스미드 DNA는 바이러스 벡터와는 달리 균질하게 정제될 수 있는 장점이 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 플라스미드 발현 벡터로는 당업계에 공지된 포유동물 발현 플라스미드를 사용할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 pRK5(유럽특허 제307,247호), pSV16B(국제특허공개 제91/08291호) 및 pVL1392(PharMingen) 등이 대표적이다.
또한 본 발명의 발현벡터로 바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 바이러스 벡터는 예를 들어, 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 아데노바이러스-연관 바이러스, 허피스바이러스(herpes virus) 및 아비폭스바이러스(avipoxvirus) 등이 포함된다. 바이러스 벡터는 다음의 기준을 충족해야 한다: (1) 목적하는 세포에 감염할 수 있어야 하며 이에 따라 적합한 숙주 범위를 갖는 바이러스 벡터가 선택되어야 하고, (2) 전달된 유전자가 적절한 기간 동안 세포에서 보존되고 발현될 수 있어야 하며, (3) 벡터가 숙주에 안전해야 한다.
상기 레트로바이러스 벡터는 바이러스 유전자가 모두 제거되었거나 또는 변경되어 비-바이러스 단백질이 바이러스 벡터에 의해 감염된 세포 내에서 만들어지도록 제작된 것이다. 유전자 요법을 위한 레트로바이러스 벡터의 주요 장점은 다량의 유전자를 복제세포 내에 전달하고, 세포 DNA 내로 전달된 유전자를 정확하게 통
합하며, 유전자 형질 감염 후 연속적인 감염이 유발되지 않는 것이다. FDA에서 인증 받은 레트로바이러스 벡터는 PA317 암포트로픽 레트로바이러스 패키지 세포를 이용하여 제조한 것이다(Miller, A.D. and Buttimore, C., Molec. Cell Biol., 6:2895-2902, 1986).
비-레트로바이러스 벡터로는 상기에서 언급한 바와 같은 아데노바이러스가 있다. 아데노바이러스의 주요 장점은 다량의 DNA 단편(36kb 게놈)을 운반하고, 매우 높은 역가로 비-복제세포를 감염시킬 수 있는 능력이 있다는 것이다. 또한, 허피스 바이러스도 사람 유전자 요법을 위해 유용하게 사용될 수 있다(Wolfe, J.H., et al., Nature Genetics,1:379-384, 1992). 이외에도, 공지된 적절한 바이러스 벡터를 사용할 수 있다.
세포 내로 유전자 전달을 위해 사용할 수 있는 다른 바이러스 벡터로는 뮤린 백혈병 바이러스(MLV), JC, SV40, 폴리오마, 엡스타인-바르 바이러스 파필로마 바이러스, 백시니아, 폴리오바이러스, 헤르페스 바이러스, 신드비스 바이러스, 렌티 바이러스, 기타 사람 및 동물 바이러스가 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 발현벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 세포에 도입할 수 있다. 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electropora tion), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 세포 내로 도입할 수 있다(Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988).
또한, 본 발명의 벡터는 선별 마커(selection market)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉, 목적 유전자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나, 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다. 본 발명의 형질전환체는 벡터를 프로모터가 작용할 수 있는 양태로 숙주세포 내에 도입시키는 것에 의해 구축될 수 있다.
본 발명에서 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 형질전환은 핵산 분자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 포함될 수 있으나 이들로 제한되는 것은 아니다.
발현벡터로 형질전환되는 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다. 본 발명에서 이용될 수 있는 숙주세포로는 곤충세포주, 효모, 진균, 세균 또는 조류가 가능하며, 예를 들면, 곤충세포주(Sf21) 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명자들은 이전에 출원된 한국공개특허 제10-2013-0049409호에서 산왕거미 유래 메이져 엠풀레이트 스피드로인 단백질을 베큘로바이러스를 사용하여 곤충 세포주에서 발현시켜 재조합 메이져 엠풀레이트 스피드로인 단백질을 분리정제하는 방법을 자세히 기술하였다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드; 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 포함된 발현 벡터를 유효성분으로 함유하는 당뇨병 및 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 야생형뿐만 아니라 90% 이상의 아미노산 상동성을 가지고 동일한 활성을 가지는 기능적 상동체를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 자연에서 분리되거나 인위적으로 합성 또는 변형된 것일 수 있는데, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 염기서열은 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실 또는 삽입에 의해 변형될 수 있으며, 이러한 변형에 의해 발현된 단백질은 이의 생물학적 작용성에 유의한 변화를 포함하지 않아야 한다. 상기한 변형은 이종의 상동성 유전자로의 변형을 포함한다.
따라서 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하되, 이에 한정되지 않고 상기의 핵산서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열로 표시되는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 본 발명의 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드는 이를 발현하는 벡터에 작동가능하게 연결된 재조합 발현벡터의 형태로 제공될 수 있다. 상기 발현벡터로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 당업계에 공지된 플라스미드, 파지, 코스미드, 바이러스벡터 또는 기타 매개체를 의미한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.
본 발명의 조성물은 당뇨병뿐만 아니라 당뇨합병증에도 적용될 수 있는데, 이러한 당뇨합병증의 종류로는 당뇨성 망막병증, 당뇨성 녹내장, 당뇨성 백내장, 당뇨성 신증 및 당뇨성 신경병증 등에 적용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
또한, 본 발명은 당뇨병 및 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 의약의 제조를 위한 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드; 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 포함된 발현 벡터를 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 상기한 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 당뇨병 및 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 의약의 제조를 위한 용도로 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 포유동물에게 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드; 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 포함된 발현 벡터를 투여하는 것을 포함하는 당뇨병 및 당뇨합병증의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
여기에서 사용된 용어 "치료상 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약제학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.1㎎/kg~100㎎/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 치료방법에서 본 발명의 유효성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
본 발명은 또한 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 및 당뇨합병증의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
이러한 식품 조성물은 유효성분인 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.
또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 및 당뇨합병증의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 건강기능식품은 당뇨병 및 당뇨합병증의의 예방 또는 개선을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
본 발명에서 “건강기능식품”이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 “식품 첨가물 공전”에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.
예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.
캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분(서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드)을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 백운풀 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분(서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드)과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.
과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분(서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드)과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
산왕거미
유래 메이저
엠풀레이트
스피드로인
단백질을 코딩하는 유전자(
cDNA
) 염기서열 분석
본 발명자들은 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 단백질을 코딩하는 유전자 cDNA 염기서열을 분석하였으며(한국공개특허 10-2013-0049409호 참조), 이를 NCBI GENE BANK database에 등재하였다(JN857964).
<
실시예
2>
산왕거미
유래 메이저
엠풀레이트
스피드로인
재조합 단백질의 아미노산 조성 및 발현
산왕거미 유래 메이져 엠풀레이트 스피드로인의 반복구조의 특성을 알아보기 위하여 MacVector (ver. 6.5, Oxford Molecular Ltd., Oxford, UK) 프로그램을 사용하여 분석하였다.
상기의 MacVector 프로그램에 의해 분석한 결과를 도 1A에 나타내었다.
도 1a에 나타낸 바와 같이, 산왕거미 유래 메이져 엠풀레이트 스피드로인은 240개의 아미노산으로 구성되며 알라닌, 류신, 글리신, 세린, 타이로신, 글루타민 및 아르기닌으로 구성되며, 특히 글리신과 알라닌이 각각 45% 및 32%로 전체 아미노산 중에 77%를 차지하고 있었다 (도 1a). 본 발명에서는 상기 240개의 아미노산으로 구성되는 산왕거미 유래 메이져 엠풀레이트 스피드로인 단백질의 폴리펩티드 서열을 서열번호 1로 표시하였으며, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 서열번호 2로 표시하였다.
상기의 산왕거미 유래 메이져 엠풀레이트 스피드로인 재조합 단백질을 곤충세포주에서 발현시켰다 (한국공개특허 10-2013-0049409호 참조). 산왕거미 유래 메이져 엠풀레이트 스피드로인 재조합 단백질, AvMaSp-R은 MagneHisTM protein purification system (Promega 사, 미국)을 이용하여 분리하였다. 분리된 산왕거미 유래 메이져 엠풀레이트 스피드로인 재조합 단백질 전기영동사진은 도 1b에 나타내었다.
도 1b에 나타난 바와 같이, 다량의 글리신과 알라닌을 함유한 산왕거미 유래 메이져 엠풀레이트 스피드로인 재조합 단백질은 전기영동 상에서 22 kDa의 분자량을 나타내는 염색 결과를 확인할 수 있었다.
본 발명의 상기 분리된 산왕거미 유래 메이져 엠풀레이트 스피드로인 재조합 단백질은 하기 실험에서 시료로 사용하였다.
<
실시예
3>
산왕거미
유래
메이져
엠풀레이트
스피드로인
재조합 단백질의 혈당상승 억제 효과 검증
산왕거미 유래 메이져 엠풀레이트 스피드로인 단백질의 당뇨관련 기능성 효과를 검정하기 위하여 제2형 당뇨병 모델쥐 BKS.Cg-m+/+Lepdb를 샘타코에서 구입하여 실험에 사용하였다. 실험동물은 4주령의 수컷을 각각 케이스에 각각 넣고 23±3℃의 온도와 50±5%의 습도에서 12시간 간격으로 light-dark cycle을 주면서 사육하였다. 식이는 고형사료 ((주)샘타코)와 증류수를 자유 섭취시켰다. 실험실 환경에 2주간 적응시키고 실험 전 12시간 절식시켜 대조군은 30% 글루코오스 용액 (0.1 g glucose/100 g body wt.), 실험군은 0.5 mg의 메이져 엠풀레이트 스피드로인 재조합 단백질과 30% 글루코오스 혼합용액 또는 1 mg의 메이져 엠풀레이트 스피드로인 재조합 단백질과 30% 글루코오스 혼합용액을 1회 구강투여하고 30, 60, 120, 180, 240, 300분에 꼬리 정맥으로부터 혈당변화를 관찰하였다.
그 결과 도 2에서 나타낸 바와 같이, 초기 혈당의 경우 당뇨대조군은 240 mg/dL, 메이져 엠풀레이트 스피드로인 재조합 단백질 0.5 mg과 30% 글루코오스를 또는 메이져 엠풀레이트 스피드로인 재조합 단백질 1 mg과 30% 글루코오스를 동시에 섭취시킨 실험군은 각각 261.5 mg/dL, 256 mg/dL로 고혈당을 나타내었다. 당뇨대조군 및 실험군은 당부하 후 30분에 405 mg/dL,, 395 mg/dL,, 392 mg/dL를 나타내며 혈당이 높아졌으며 대조군과 실험군과의 유의적 차이는 나타나지 않았다. 당부하 후 60분째 메이져 엠풀레이트 스피드로인 재조합 단백질 0.5 mg과 30% 글루코오스를 그리고 메이져 엠풀레이트 스피드로인 재조합 단백질 1 mg과 30% 글루코오스를 동시에 섭취시킨 실험군에서 379 mg/dL 및 374 mg/dL로 혈당이 낮아지기 시작하였다. 당뇨대조군은 180분째부터 혈당이 약간씩 떨어지기 시작하여 300분째는 370 mg/dL 혈당을 나타내며 여전히 높은 혈당을 유지하였으나, 실험군에서는 300분째 271 mg/dL, 243 mg/dL로 당뇨대조군에 비해 혈당이 아주 많이 낮아졌으며 메이져 엠풀레이트 스피드로인 재조합 단백질 0.5 mg을 섭취시킨 실험군은 300분째 초기 혈당 수준과 비슷한 수준으로 회복되었으며 메이져 엠풀레이트 스피드로인 재조합 단백질 1 mg을 섭취시킨 실험군은 초기 혈당보다 더 낮아지는 효과를 나타내었다.
결론적으로, 당뇨대조군은 글루코오스 섭취 후 300분째 초기 혈당에 비해 혈당이 54% 증가된 고혈당을 나타낸 반면, 메이져 엠풀레이트 스피드로인 재조합 단백질 0.5 mg을 섭취시킨 실험군은 혈당이 회복되며 300분째 초기 혈당에 비해 혈당이 3% 정도만 높은 것으로 나타나 공복혈당과 유사하였으며 메이져 엠풀레이트 스피드로인 재조합 단백질 1 mg을 섭취시킨 실험군은 혈당이 빠른 속도로 낮아지며 초기 혈당보다 오히려 약 5%가 낮아지는 결과를 나타내었다.
<
실시예
4>
산왕거미
유래
메이져
엠풀레이트
스피드로인
재조합 단백질의 인슐린 분비 촉진 효과 검증
당뇨병은 인슐린 분비와 밀접한 관련이 있다. 본 실험에서는 메이져 엠풀레이트 스피드로인 재조합 단백질에 의해 혈당이 개선되는 효과를 증명하기 위하여 당뇨대조군 및 메이져 엠풀레이트 스피드로인 재조합 단백질을 섭취시킨 실험군의 혈청으로부터 혈청내 인슐린 농도 변화를 1, 3, 5 시간째 꼬리 정맥으로부터 채혈하여 Ultra Sensitive Mouse Insulin ELISA Kit (Crystal Chem INC.)를 사용하여 측정하였다.
그 결과 도 3에서 나타낸 바와 같이, 초기 인슐린 농도는 당뇨대조군의 경우 4.6 ng/ml, 메이져 엠풀레이트 스피드로인 재조합 단백질 0.5 mg과 30% 글루코오스 또는 메이져 엠풀레이트 스피드로인 재조합 단백질 1 mg과 30% 글루코오스를 동시에 섭취한 실험군에서 각각 4.5 ng/ml 및 4.4 ng/ml로 나타났으며, 당부하 후 당뇨대조군은 1시간째 5.9 ng/ml로 혈청 내 인슐린 양이 증가하였다가 3시간째 5.2 ng/ml 그리고 5시간째 5.1 ng/ml로 조금씩 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 한편, 메이져 엠풀레이트 스피드로인 재조합 단백질 0.5 mg을 글루코오스와 같이 섭취시킨 실험군은 인슐린 양이 1시간째 6.9 ng/ml, 3시간째에 7.1 ng/ml로 증가하였다가 5시간째 5.1 ng/ml로 낮아졌으며 메이져 엠풀레이트 스피드로인 재조합 단백질 1 mg을 글루코오스와 같이 섭취시킨 실험군은 혈청 내 혈당이 1시간째 7.1 ng/ml, 3시간째 7.6 ng/ml로 높아졌다가 5시간째 5.4 ng/ml로 낮아지는 것을 확인할 수 있었다.
결론적으로, 당뇨대조군과 메이져 엠풀레이트 스피드로인 재조합 단백질을 섭취시킨 실험군의 혈당 내 인슐린 분비량은 글루코오스 섭취 후 초기 인슐린양 보다 모두 높아졌으나 메이져 엠풀레이트 스피드로인 재조합 단백질 0.5 mg 또는 1 mg 섭취군에서 당뇨대조군에 비해 약 1시간째 각각 17% 및 20% 더 많은 인슐린이 분비되는 것으로 나타났으며, 특히 3시간째에는 약 37% 및 46%가 더 많이 분비되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 인슐린의 분비량이 증가로 인한 혈당 상승 억제 효과로 나타났다.
상기와 같은 실험 결과를 통해, 당뇨 실험쥐를 이용하여 글리신과 알라닌이 많이 함유된 메이져 엠풀레이트 스피드로인 재조합 단백질의 혈당 상승 억제와 인슐린 분비 촉진으로 혈당개선 효과를 확인하였으며, 따라서 이를 혈당 개선제 또는 항당뇨제의 소재로 유용하게 사용할 수 있다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
MaSp: 산왕거미 유래 메이져 엠풀레이트 스피드로인 재조합 단백질
<110> Dong-A University Research Foundation For Industry-Academy Cooperation
<120> Pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes
and diabetic complications comprising Major ampullate spidroin
protein from Araneus ventricosus
<130> PN1311-375
<160> 2
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 240
<212> PRT
<213> Major ampullate spidroin polypeptide from Araneus ventricosus
<400> 1
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly
1 5 10 15
Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Ala
20 25 30
Gly Gln Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gly
35 40 45
Ala Gly Arg Gly Gly Leu Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Tyr Gly
50 55 60
Ala Gly Leu Gly Gly Gln Gly Gly Ala Gly Gln Ala Ala Ala Ala Ala
65 70 75 80
Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Arg Gln Gly Gly Leu Gly Ala Gly
85 90 95
Gly Ala Gly Gln Gly Tyr Gly Ala Gly Leu Gly Gly Gln Gly Gly Ala
100 105 110
Gly Gln Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gln Gly
115 120 125
Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Gln Gly
130 135 140
Gly Tyr Gly Ala Gly Gln Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
145 150 155 160
Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly
165 170 175
Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Arg Gln Gly Gly Ala Gly Ala Ala
180 185 190
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly
195 200 205
Leu Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr
210 215 220
Gly Gly Gln Gly Ala Ala Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala
225 230 235 240
<210> 2
<211> 720
<212> DNA
<213> Major ampullate spidroin polynucleotide from Araneus ventricosus
<400> 2
gccgccgcag ccgcagcagc agctggtgga caaggaggtc aaggtggata tggaggatta 60
ggttcccaag gagctggaca aggaggatat ggagcaggac aaggtgccgc ggcagctgca 120
gcagcagccg ggggtgcagg aggcgcagga cgaggaggct taggtgctgg aggtgcagga 180
caaggatatg gagctggatt aggtggacaa ggaggagcag gacaagcagc agctgcagca 240
gcagccggag gagcaggagg cgcacgacaa ggaggcttag gcgctggtgg tgcaggacaa 300
ggatatggag ctggattagg tggacaagga ggggcaggac aaggaggtgc cgcggcagcc 360
gcagcagcag ctggtggaca aggaggtcaa ggtggatatg gaggattagg ttcccaagga 420
gctggacaag gaggatatgg agcaggacaa ggtggtgccg ctgcagccgc agcagcagct 480
ggaggacaag gaggtcaagg tggatatggt ggattaggtt cccaaggagc tggacaaggt 540
ggatatggag gtagacaagg tggtgcagga gccgcagcag ctgcagcagc agccggaggt 600
gcaggaggcg caggacaagg aggattaggt gctggtggtg ccggacaagg aggatatgga 660
ggtggtgcat atggtggaca aggtgcagca tcatctgctg ctgcagcctc tgccgcagcg 720
720
Claims (7)
- 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드; 또는
상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 포함된 발현벡터를 유효성분으로 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물. - 삭제
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 조성물은 혈당강하 및 인슐린 분비 촉진 활성을 통해 당뇨병 치료 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물. - 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 당뇨병의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
- 제5항에 있어서,
상기 식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 당뇨병의 예방 또는 개선용 건강기능식품. - 제5항 또는 제6항에 있어서,
상기 식품은 혈당강하 및 인슐린 분비 촉진 활성을 통해 당뇨병 개선 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
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|---|---|---|---|
| KR1020130136689A KR101597006B1 (ko) | 2013-11-12 | 2013-11-12 | 산왕거미 유래 메이져 엠풀레이트 스피드로인 단백질을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 및 당뇨합병증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP4098127A4 (en) * | 2020-01-31 | 2024-03-13 | Spiber Inc. | MEAT SUBSTITUTE COMPOSITION |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050010035A1 (en) | 2001-08-29 | 2005-01-13 | Lewis Randolph V | Spider silk protein encoding nucleic acids, polypeptides, antibodies and methods of use thereof |
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|---|---|---|---|---|
| KR101494711B1 (ko) | 2011-11-04 | 2015-02-26 | 동아대학교 산학협력단 | 산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 단백질의 반복적인 ｃ-말단 영역의 폴리펩티드 서열 및 이를 코딩하는 염기서열 |
| KR101304017B1 (ko) | 2011-12-27 | 2013-09-04 | 영남대학교 산학협력단 | 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물 |
-
2013
- 2013-11-12 KR KR1020130136689A patent/KR101597006B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
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| EP4098127A4 (en) * | 2020-01-31 | 2024-03-13 | Spiber Inc. | MEAT SUBSTITUTE COMPOSITION |
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| KR20150054346A (ko) | 2015-05-20 |
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