KR20050034580A - Ｇｌｐ-1 수용체 작용제 및 글루카곤 수용체 길항제둘다로서 작용하는 펩티드 및 그의 약리학적 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 GLP-1 수용체 작용제 및 글루카곤 수용체 길항제 둘다로서 작용하는 폴리펩티드를 제공한다. 그러한 폴리펩티드는 2형 당뇨병 또는 다른 대사 장애를 가진 개체를 치료하는데 유용하다.

Description

ＧＬＰ-1 수용체 작용제 및 글루카곤 수용체 길항제 둘다로서 작용하는 펩티드 및 그의 약리학적 사용 방법{PEPTIDES ACTING AS BOTH GLP-1 RECEPTOR AGONISTS AND GLUCAGON RECEPTOR ANTAGONISTS AND THEIR PHARMACOLOGICAL METHODS OF USE}
본 발명은 GLP-1 수용체의 작용제 및 글루카곤 수용체의 길항제 둘다로서 작용하는 새롭게 동정된 폴리펩티드 및 치료 목적을 위한 그러한 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 포도당 (glucose) 의존 방식으로 췌장 베타 세포로부터의 인슐린 방출을 자극하고 간으로부터의 글루카곤 매개된 포도당 분비를 감소시키는데 유용하므로, 당뇨병, 고혈당증, 공복 혈당 장애, 내당능 장애, 전-당뇨병 상태 및 비만과 같은 대사 장애를 겪고 있는 개체에 대한 치료 선택권을 제공하게 된다.
당뇨병은 특히 당뇨병 환자에서의 높은 혈당 수치에 의해 나타나는 인슐린 분비 장애에 의해 특징지워진다. 당뇨병은 근원적인 결함에 의해 다음 2가지 주요 군으로 분류된다: 췌장선 내에 인슐린 생성 베타 세포가 결핍된 환자에서 일어나는 1형 당뇨병 (또는 인슐린 의존형 당뇨병, IDDM) 및 베타 세포 인슐린 분비에 장애가 있고(있거나) 인슐린 작용이 변화된 환자에서 일어나는 2형 당뇨병 (또는 비-인슐린 의존형 당뇨병, NIDDM).
1형 당뇨병 환자는 현재 인슐린으로 치료되고 있으며, 2형 당뇨병 환자의 대부분은 베타 세포 기능을 자극하는 약제로 또는 인슐린에 대한 환자의 조직 감수성을 증강시키는 약제로 치료될 수 있다. 시간이 지남에 따라, 2형 당뇨병 환자의 거의 절반은 이들 약제에 대해 반응하지 않으며 그후에는 인슐린 요법을 받아야만 한다. 2형 당뇨병을 치료하는데 현재 사용되는 약물로는 알파-글루코시다제 억제제 (프레코스 (PRECOSE) (등록상표), 보글리보스 (VOGLIBOSE)TM, 및 미글리톨 (MIGLITOL) (등록상표)), 인슐린 감작제 (예를 들면, 아반디아 (Avandia)TM, 액토스 (Actos)TM 및 레줄린 (Rezulin)TM), 인슐린 분비촉진제 (술포닐우레아 ("SFUs") 및 ATP-의존성 K+ 채널에 의해 작용하는 다른 약제) 및 글루코파지 (GLUCOPHAGE)TM (메트포르민 HCl)를 포함한다.
알파-글루코시다제 억제제. 알파-글루코시다제 억제제는 소화관으로부터의 포도당 흡수를 지연시킴으로써 식후 포도당의 회유를 감소시킨다. 이들 약물은 안전하며 경증 내지 중등 정도의 당뇨병 환자를 치료한다. 그러나, 위장관 부작용이 문헌에 보고되어 있어 그들의 효능이 한정된다.
인슐린 감작제. 인슐린 감작제는 인슐린에 대한 신체의 반응을 증강시키는 약물이다. 아반디아TM (로지글리타존) 및 액토스TM와 같은 티오졸리딘디온은 퍼옥시좀 증식 활성화 수용체 (PPAR) 감마를 활성화하며 잘 설명되지 않은 일련의 유전자의 활성을 조절한다. 간 효과 (예를 들면, 약물 유도된 간독성 및 높은 간 효소 수치)는 아반디아TM 및 액토스TM를 사용하는 환자에서 중요한 문제인 것으로 보이지는 않는다. 그렇다 하더라도, 간 효소 시험이 요법의 첫해에는 2개월 마다 그리고 그후에는 정기적으로 권장된다. 아반디아TM 및 액토스TM 치료법은 체액 저류, 부종 및 체중 증가와 관련이 있다. 아반디아TM는 울혈성 심부전과 관련이 있으므로 인슐린과 함께 사용하는 것으로 처방되지 않는다. 이러한 종류에서 최초 약물인 레줄린TM (트로글리타존)은 높은 간 효소 수치 및 약물 유도된 간독성 때문에 사용 중지되었다.
인슐린 분비촉진제. 술포닐우레아 (SFUs) 및 비-술포닐우레아, 나테글리니드 및 페파글리니드는 ATP-의존성 칼슘 채널을 통해 포도당 비-의존적 인슐린 분비를 야기시키도록 작용한다. 이들 약물은 경증 내지 중등 정도의 공복 고혈당증을 갖는 2형 당뇨병에 대한 표준 요법이다. 인슐린 분비촉진제는 저혈당증, 체중 증가 및 높은 일차 및 이차 실패율을 유도할 가능성이 있는 한계가 있다. 초기 치료된 환자의 10 내지 20%는 상당한 치료 효과를 나타내지 못한다 (1차 실패). 2차 실패는 인슐린 분비촉진제로 치료한지 6개월 후에 치료 효과의 추가적인 20-30% 상실로 입증된다. 인슐린 치료는 요법의 5-7년 후의 인슐린 분비촉진제 반응자의 50%에서 필요하다 (Scheen et al., Diabetes Res. Clin. Pract. 6:533-543, 1989). 나테글리니드 및 페파글리니드는 하루에 3회 투여할 필요가 있는 단시간 작용형 약물이다. 그것은 공복시 포도당 조절을 위한 것이 아니고 식후 포도당 조절 만을 위해 사용된다.
글루코파지 (GLUCOPHAGE)TM는 간의 포도당 배출을 감소시키고 말초 포도당 흡수 및 이용을 증가시킴으로써 혈당을 낮추는 비구아니드이다. 약물은 경증 내지 중등 정도의 환자에서 혈당을 낮추는데 효과적이며 체중 증가의 부작용 또는 저혈당증을 유도할 가능성이 없다. 그러나, 글루코파지TM는 위장 장애 및 락트산증을 비롯한 많은 부작용을 나타낸다. 글루코파지TM는 70세 이상의 당뇨병 환자 및 신장 또는 간 기능이 손상된 대상에게는 금기시된다. 마지막으로, 글루코파지TM는 인슐린 분비촉진제와 동일한 1차 및 2차 실패율을 갖는다.
인슐린 치료는 식이요법 및 운동 후에 시행되며, 경구 투약은 혈당을 적당히 조절하는데 실패하였다. 이러한 치료법은 몇가지 단점을 갖고 있다: 그것은 주사가능하며, 저혈당증을 나타낼 수 있으며 체중 증가를 야기시킬 수 있다. 인슐린에 의한 저혈당증의 유도 가능성은 저혈당증이 조절될 수 있는 범위를 제한한다.
현행 치료법의 문제점은 2형 당뇨병을 치료할 새로운 요법을 필요로 하고 있다. 특히, 정상 (즉, 포도당 의존적) 인슐린 분비를 유지할 새로운 치료법이 필요하다. 췌장에서의 포도당 조절된 인슐린 분비를 촉진하는데 글루카곤형 펩티드-1 ("GLP-1")가 역할을 한다면, GLP-1 수용체 작용제는 그러한 질환을 치료하는데 유용할 수 있다. 또한, 글루카곤 수용체 길항제도 간의 글리코겐분해 및 포도당신생을 자극하여 혈당을 상승시키는데 글루카곤이 역할을 한다면 2형 당뇨병을 치료하는데 유용한 것으로 입증되어야 한다.
GLP-1 및 글루카곤은 구조적으로 관련된 펩티드 호르몬 군인 글루카곤/세크레틴 군의 일원이다. 이러한 군에 속하는 GLP-1 (7-36) 및 GLP-1 (7-37) (각각, 30 아미노산 및 31 아미노산) 및 글루카곤 (30 아미노산)은 펩티드의 높은 상동성 세트를 구성한다. 또한, 이러한 두 호르몬은 조직 특이적 처리 시에 주로 장에서의 GLP-1 생성 및 췌장에서의 글루카곤 생성을 유도하는 공통된 전구체인 프레프로글루카곤으로부터 유래된다. 이들 두 펩티드에 대한 수용체는 상동성 (58% 동일성)이며 G-단백질 결합된 수용체 과에 속한다.
GLP-1 및 글루카곤은 둘다 전체 포도당 항상성에 중요한 역할을 한다. GLP-1은 포도당 의존적 인슐린 분비에 의해 매개되는 혈당 농도를 낮추는 반면, 글루카곤은 혈당 농도를 증가시킨다. 정상 혈당 농도를 유지하는데 있어서의 GLP-1 및 글루카곤 둘다의 중요한 역할을 가정하고, GLP-1 수용체 작용제 및 글루카곤 수용체 길항제를 확인하는데 상당한 관심이 있어 왔다. 임상적 연구는 GLP-1을 주입하여 당뇨병 대상에서 인슐린 분비를 촉진시키고 혈당을 정상화할 수 있음을 입증하였다. 그러나, GLP-1은 신속하게 분해되고 체내에서 매우 짧은 반감기를 갖는다. 또한, GLP-1은 치료 용량에서 또는 그 부근에서 소화관 운동성 부작용을 야기시킨다. 그러므로, GLP-1 자체는 치료제로서 상당한 한계를 가지며 안정성이 개선된 펩티드의 변형된 버젼이 연구되고 있다. GLP-1 수용체의 비-펩티드 작용제는 지금까지 개시된 바가 없다.
당뇨병 래트에서 글루카곤 길항제로서 작용하고 고혈당증을 감소시키는 글루카곤의 펩티드 유사체가 동정되었다. 그러나, 펩티드 글루카곤 길항제는 임상전 개발 단계를 넘어서지 못하였다. 구조적으로 상이한 수많은 비-펩티드 글루카곤 수용체 길항제가 과학 및 특허 문헌에 보고되어 있다. 그러나, 글루카곤 수용체의 소분자 억제제를 동정하려는 시도는 생체내에서의 성공에 한계가 있었다. 임상 연구에서 효과적인 것으로 알려진 글루카곤 작용의 유일한 길항제는 BAY 27-9955로서 동정된 화합물이다. 글루카곤 길항작용에서 일어날 수 있는 부작용은 저혈당증이다.
GLP-1 수용체 작용제 또는 글루카곤 수용체 길항제 만을 투여한 경우에 일어날 수 있는 부작용 때문에, 병용 요법은 필요한 혈당 저하를 유지하면서 부작용을 감소시키는 이점을 가질 것이다. 그러나, 동시 투여는 두 펩티드에 대한 적절한 약동학 프로파일을 나타내는 단일 제제 및 전달 방법을 필요로 한다. 이는 그러한 치료제의 개발에 주요한 장애가 될 수 있다.
상기한 바에 근거하면 생체내에서 GLP-1 작용제 및 글루카곤 길항제 둘다로서 기능하는 단일의 치료 펩티드가 존재할 상당한 가능성이 있다.
발명의 요약
본 발명은 GLP-1 수용체의 작용제 및 글루카곤 수용체의 길항제 둘다로서 기능하며 GLP-1 수용체 작용제 및 글루카곤 수용체 길항제 둘다의 활성을 갖는 약제에 의해 개선될 수 있는 질환 및 상태의 치료에 효과적인 신규 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드는 감소된 내인성 인슐린 분비가 원인이 되는 것과 같은 대사 장애가 있는, 특히 2형 당뇨병 환자, 또는 내당능 장애, 인슐린 분비가 약간 변화된 전당뇨병 상태 또는 공복 혈당 장애, 또는 비만이 있는 환자에 대한 새로운 요법을 제공한다.
본 발명의 한면은 서열 번호: 6-32 및 서열 번호: 6-32에 나타낸 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 수준에서 GLP-1 수용체 작용제 및 글루카곤 수용체 길항제 둘다로서 기능하는 폴리펩티드의 단편, 유도체 및 변이체로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드 (총체적으로, "본 발명의 폴리펩티드")이다.
본 발명의 다른 실시태양은 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 재조합하여 발현하는데 필요한 부수적인 벡터 및 숙주 세포를 포함한다.
본 발명의 또다른 실시태양은 인간을 포함한 포유동물에서 당뇨병 및(또는) 본 발명의 폴리펩티드에 의해 영향받는 다른 질환 또는 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 그 방법은 본 발명의 임의의 폴리펩티드를 치료 유효량으로 포유동물에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드의 재조합 및 합성 제조 방법을 제공한다.
도 1은 GST-펩티드 융합 폴리뉴클레오티드 코딩 서열을 함유하는 전형적인 플라스미드의 제한 지도이다.
본 발명은 GLP-1 수용체의 작용제 및 글루카곤 수용체의 길항제 둘다로서 기능하는 신규 폴리펩티드, 및 그의 단편, 유도체, 변이체 및 유사체를 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드는 당뇨병, 고혈당증, 내당능 장애, 공복 혈당 장애 및 비만과 같은 질환 또는 상태의 예방 및(또는) 치료에서 GLP-1 수용체 작용제 및 글루카곤 수용체 길항제 둘다로서의 생체내 기능을 갖는다.
GLP-1 및 글루카곤은 구조적으로 관련된 펩티드 호르몬 군인 글루카곤/세크레틴 군의 일원이다. 아래의 적중 배열은 일차 구조적 관계를 나타낸다:
글루카곤 HSQGTFTSDYSKYLEGQAAKEFIAWLVKGR (서열 번호: 1)
GLP-1 (7-36) HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH2 (서열 번호: 2)
GLP-1 (7-37) HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG (서열 번호: 3)
아미노산에 대한 단문자 약어는 문헌 (Zubay, Biochemistry 2d ed., 1988, MacMillan Publishing, New York, p. 33)에 기재되어 있다. 이들 폴리펩티드는 전체 당 항상성에서 역할을 하며: GLP-1은 혈당 농도를 낮추는 반면, 글루카곤은 혈당 농도를 증가시킨다.
GLP-1이 췌장에서의 포도당 조절된 인슐린 분비를 촉진시키는데 역할을 한다면, GLP-1 수용체 작용제는 대사 장애 및 기타 질환의 치료에 유용할 수 있다. 또한, 글루카곤이 간의 글리코겐분해 및 포도당신생을 자극하여 혈당을 상승시키는데 역할을 한다면 글루카곤 수용체 길항제도 질환을 치료하는데 유용한 것으로 입증되어야 한다. 그러나, 이러한 사실 만으로는 상당한 부작용을 유도하지 않고 생체내에서 당의 감소를 보장하지는 못한다.
본 발명은 GLP-1 수용체 작용제 및 글루카곤 수용체 길항제인 신규 폴리펩티드를 제공한다. 이론에 구속되는 것은 아니지만, 본 발명자는 본 발명의 폴리펩티드가 포도당 의존 방식으로 췌장 베타 세포로부터의 인슐린 방출을 자극하면서 동시에 간으로부터의 글루카곤 매개된 포도당 분비를 감소시킬 수 있다고 생각한다.
GLP-1 수용체 작용제 및 글루카곤 수용체 길항제 폴리펩티드
본 발명의 폴리펩티드는 GLP-1 수용체 작용제 및 글루카곤 수용체 길항제 둘다로서 기능한다. 그러한 폴리펩티드의 GLP-1 수용체 작용제 성분은 GLP-1 수용체 활성화를 위한 하나 이상의 시험관내 또는 생체내 분석에서 GLP-1 수용체를 활성화한다. 그러한 분석의 예로는 하기 특정 실시예에 기재된 바와 같은 RINm5F 세포에서의 cAMP 유도에 대한 시험관내 분석, 췌장 β-세포로부터의 인슐린 분비의 유도에 대한 시험관내 분석, 혈당치의 감소에 대한 생체내 분석, 및 혈장 인슐린 수치의 상승에 대한 생체내 분석이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 폴리펩티드는 또한 글루카곤 수용체 활성화의 억제에 대한 하나 이상의 시험관내 또는 생체내 분석에서 글루카곤 수용체 길항제 활성을 나타낸다. 그러한 분석의 예로는 하기 특정 실시예에 기재된 바와 같은 세포성 cAMP의 글루카곤 매개된 증가의 억제를 측정하기 위한 시험관내 분석, 예를 들면 배양된 간세포로부터의 글루카곤 매개된 포도당 방출의 억제를 측정하기 위한 시험관내 분석, 또는 글루카곤 자극된 포도당 생성에 대한 생체내 분석이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 폴리펩티드는 (1) 서열 번호: 6-32 및 (2) 서열 번호: 6-32에 나타낸 임의의 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 수준에서 GLP-1 수용체 작용제 및 글루카곤 수용체 길항제 둘다로서 기능하는 그의 단편, 유도체, 변이체 및 유사체로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 폴리펩티드는 천연 폴리펩티드, 재조합 폴리펩티드 또는 합성 폴리펩티드일 수 있다.
단편, 유도체, 변이체 및 유사체
단편, 유도체, 변이체 및 유사체 폴리펩티드는 예를 들면, 서열 번호: 6-32에 나타낸 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 유지한다. "실질적으로 동일한 생물학적 기능 또는 활성"은 비교되는 완전 길이 폴리펩티드의 동일한 생물학적 활성의 약 30% 내지 100% (즉, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100%) 또는 그 이상이다.
유도체
유도체는 추가의 구조 및(또는) 기능을 제공하도록 화학적으로 변형된 본 발명의 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 지방산은 폴리펩티드에 첨가되어 그의 반감기를 개선시킬 수 있다. 표적화 특이성 또는 추가의 활성을 부여하는 융합 폴리펩티드는 또한 아래에 더욱 상세히 기재된 바와 같이 작제될 수 있다.
유도체는 번역후 가공과 같은 자연 방법에 의해, 또는 화학적 변형 기술에 의해 변형될 수 있으며, 두 기술은 모두 당업계에 공지되어 있다. 변형은 펩티드 골격, 아미노산 측쇄, 및 아미노 또는 카르복실 말단을 포함한 폴리펩티드 내의 어느 곳에서든 일어날 수 있다. 동일한 유형의 변형이 제공된 폴리펩티드 내의 몇개의 부위에서 동일한 또는 다양한 정도로 존재할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 변이체는 하나 이상의 다른 유형의 변형을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는, 예를 들면 유비퀴틴화의 결과로서 분지될 수 있고, 그것은 분지된 또는 분지되지 않은 환형일 수 있다.
다른 화학적 변형으로는 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유결합 부착, 헴 (heme) 잔기의 공유결합 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유결합 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유결합 부착, 포스포티딜이노시톨의 공유결합 부착, 가교결합, 환화, 이황화 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교결합의 형성, 시스테인의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 제제, 감마-카르복실화, 글리코실화, GPI 앵커 (anchor) 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, PEG화 (pegylation), 단백질분해 처리, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 아르기닐화와 같은 단백질로의 운반-RNA 매개된 아미노산 첨가 및 유비퀴틴화가 있다 (예를 들면, T. E. Creighton, PROTEINS, STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd ed., W. H. Freeman and Company, New York (1993); POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, ed., Academic Press, New York, pgs. 1-12 (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol 182:626-46 (1990); Rattan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:48-62, 1992 참조).
유도체는 또한 다른 폴리펩티드, 예를 들면 인간 혈청 알부민과 융합된 성숙 폴리펩티드를 포함하여 그의 약동학적 프로파일을 개선시킨다. 두 폴리펩티드의 융합은 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들면, 인간 혈청 알부민을 코딩하는 DNA 및 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열은 당업자에게 공지된 포유동물 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 자유 N-말단 히스티딘이 GLP-1 수용체 활성에 필요한 것으로 생각되므로 본 발명의 폴리펩티드 N-말단을 다른 폴리펩티드에 위치시키는 것이 바람직하다 (Kawa, Endocrinology Apr; 124 (49):1768-73, 1989). 결과 재조합 융합 단백질은 그후에 HKB 또는 CHO와 같은 적합한 세포주를 벡터로 형질전환시키고 융합 단백질을 발현시킴으로써 발현될 수 있다.
바람직한 유도체로는 PEG 잔기 또는 지방산 잔기가 부착된 본 발명의 폴리펩티드 (서열 번호: 6-32)가 있다. PEG 잔기는 예를 들면 22 kDa를 넘는 분자량, 바람직하게는 25 kDa 내지 100 kDa (예를 들면, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 kDa)의 분자량, 더욱 바람직하게는 35 kDa 내지 45 kDa (예를 들면, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 또는 45 kDa)의 분자량을 갖는 PEG일 수 있다. 그러한 PEG화 폴리펩티드의 예는 서열 번호: 19 또는 25의 위치 31에서 시스테인 잔기에 부착된 22 kDa PEG 잔기를 함유하는 것이다. 서열 번호: 20 및 26 및 표 2를 참조하면 된다. 다르게는, 43 kDa PEG 잔기는 서열 번호: 25의 위치 31에서 시스테인 잔기에 부착될 수 있다. 서열 번호: 27 및 표 2를 참조하면 된다. PEG 잔기는 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어 실시예 19에 기재된 방법에 의해 본 발명의 폴리펩티드의 시스테인 잔기에 첨가될 수 있다.
기타 바람직한 유도체는 폴리펩티드에 부착된 지방산 잔기를 갖는다. 지방산은 예를 들면 C12 내지 C20의 지방산, 바람직하게는 C14 내지 C18 의 지방산, 가장 바람직하게는 C16 지방산일 수 있다. 그러한 폴리펩티드의 예는 펩티드 내의 리신 잔기에 부착된 C16 (팔미테이트) 지방산 잔기를 함유하는 서열 번호: 28-32이다 (표 2 참조). 지방산 잔기는 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어 지방산 아실화에 의해 본 발명의 폴리펩티드의 리신 잔기에 첨가될 수 있다 (Knudsen et al., J. Med. Chem. 43:1664-1669, 2000).
변이체
변이체는 서열 번호: 6-32에 나타낸 아미노산 서열에 대해 하나 이상의 아미노산 서열이 변화된 본 발명의 폴리펩티드이다. 변이체는 또한 변형된 펩티드 결합, 즉 펩티드 이소스테레스 (isosteres)에 의해 서로에게 연결된 아미노산을 가질 수 있으며, 20개의 천연 아미노산 이외의 아미노산을 함유할 수 있다.
바람직하게는, 변이체는 바람직하게는 비필수적 아미노산 잔기에 하나 이상의 보존성 아미노산 치환 (즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 치환)을 포함한다. "비필수적" 아미노산 잔기는 그의 생물학적 활성을 변화시키지 않고 단백질의 야생형 서열로부터 변화될 수 있는 잔기이며, "필수적" 아미노산 잔기는 생물학적 활성에 필요한 것이다. 보존성 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 군은 업계에 정의되어 있다. 이들 군은 기본 측쇄를 가진 아미노산 (예를 들면, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 가진 아미노산 (예를 들면, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄를 가진 아미노산 (예를 들면, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 가진 아미노산 (예를 들면, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타 분지된 측쇄를 가진 아미노산 (예를 들면, 트레오닌, 발린, 이소루신) 및 방향족 측쇄를 가진 아미노산 (예를 들면, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 비보존성 치환은 보존된 아미노산 잔기에 대해서 또는 보존된 단백질 도메인 내에 있는 아미노산 잔기에 대해서는 이루어지지 않을 것이다.
보존성 아미노산 치환은 바람직하게는 서열 번호: 34에 나타낸 일치 폴리펩티드의 위치 11, 12, 16, 17 또는 18에서 이루어진다. 위치 11은 바람직하게는 R, S, A, K, G 또는 T이고, 더욱 바람직하게는 R, A, G 또는 S이다. 위치 12는 바람직하게는 K, N, R, H, A, S 또는 Q이고, 더욱 바람직하게는 K, A, S 또는 N이다. 위치 16은 바람직하게는 K, R, V, I, L, M, F, W, Y, A, S, T, N, Q, G 또는 H이고, 더욱 바람직하게는 K, V, I, F, A, S 또는 N이다. 위치 17은 바람직하게는 D, E, H, K, R, F, I, L, M, Y, V, W, A, S, T, N, Q 또는 G이고, 더욱 바람직하게는 R, A, L, M, V, S, H, E 또는 Q이다. 위치 18은 바람직하게는 K, R, F, I, L, Y, V, M, A, G 또는 H이고, 더욱 바람직하게는 K, R, F, I, L, Y 또는 A이다. 위치 11, 12, 16, 17 및 18 중 임의의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 위치에서 치환되지 않은 것을 포함한, 상기 위치에서의 치환의 모든 가능한 조합이 예상된다.
변이체는 또한 돌연변이유발로 인해 아미노산 서열이 다른 폴리펩티드를 포함한다. GLP-1 수용체 작용제 및 글루카곤 수용체 길항제 둘다로서 기능하는 변이체는 돌연변이체의 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 동정될 수 있으며, 예를 들면 1 이상의 위치 (즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 위치)에서 보존성 치환이 있는 폴리펩티드의 돌연변이체는 당업계에 공지되고 하기 특정 실시예에 기재된 방법을 이용하여 GLP-1 수용체 작용제 활성 및 글루카곤 수용체 길항제 활성에 대해 스크리닝될 수 있다.
유사체
유사체는 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 프로폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 활성 폴리펩티드는 자연, 생체내 과정에 의해 또는 당업계에 공지된 절차에 의해, 예를 들어 효소적 또는 화학적 절단에 의해 프로폴리펩티드 분자 내의 추가의 아미노산으로부터 절단될 수 있다.
단편
단편은 GLP-1 수용체 작용제 및 글루카곤 수용체 길항제 활성을 갖는, 완전 길이 유도체, 변이체 또는 유사체를 포함한, 본 발명의 완전 길이 폴리펩티드 보다 작다.
폴리뉴클레오티드
본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열을 이용하여 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드에 대한 코딩 서열 만으로 이루어지거나 추가의 코딩 및(또는) 비코딩 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 당업계에 공지된 화학적 방법을 이용하여 전체적으로 또는 부분적으로 합성될 수 있다 (예를 들면, Caruthers et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-23, 1980; Horn et al., Nucl. Acids Res. Sump. Ser. 225-32, 1980 참조). 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 다음에 폴리펩티드를 발현하기 위해 발현 벡터 내에 또는 폴리뉴클레오티드를 전달하기 위해 클로닝 벡터내에 클로닝될 수 있다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 비천연 코돈을 갖고 있는 폴리펩티드 코딩 뉴클레오티드 서열을 생산하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들면, 원핵 또는 진핵생물 숙주에 의해 선호되는 코돈은 폴리펩티드 발현 속도를 증가시키거나 목적하는 성질, 예를 들면 천연 서열로부터 생성된 전사물 보다 더 긴 반감기를 가진 RNA 전사물을 생산하도록 선택될 수 있다.
본원에 개시된 뉴클레오티드 서열은 제한되는 것은 아니지만, 폴리펩티드 또는 mRNA 산물의 클로닝, 처리 및(또는) 발현을 변형시키는 변화를 포함하여 다양한 이유를 위해 폴리펩티드 코딩 서열을 변화시키는 것으로 당업계에 일반적으로 공지된 방법을 이용하여 유전공학 처리될 수 있다. 유전자 단편 및 합성 올리고뉴클레오티드의 무작위 단편화 및 PCR 재조합에 의한 DNA 셔플링 (shuffling)을 이용하여 뉴클레오티드 서열을 유전공학 처리할 수 있다. 예를 들면, 특정 부위 돌연변이유발은 새로운 제한 부위를 삽입하고, 글리코실화 패턴을 변화시키고, 코돈 선호도를 변화시키고, 스플라이스 변이체를 생산하고, 돌연변이를 도입하는데 이용될 수 있다.
벡터
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 클로닝 및 발현 벡터를 포함한다. 뉴클레오티드 서열은 순방향 또는 역방향으로 삽입될 수 있다. DNA 서열은 각종 절차에 의해 벡터에 삽입될 수 있다. 일반적으로, DNA 서열은 당업계에 공지되고 문헌 (Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2d ed., (Cold Spring Harbor, N. Y., 1989))에 기재된 절차에 의해 적절한 제한 엔도뉴클레아제 부위로 삽입된다. 그러한 절차 및 기타 절차는 당업자의 범위내에 드는 것으로 간주된다.
클로닝 벡터의 예로는 pBR322, pUC18, pUCl9, pSport 및 pCRII가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이 실시태양의 바람직한 면에서, 발현 벡터는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열, 예를 들면 프로모터를 더 포함한다. 적합한 많은 발현 벡터 및 프로모터가 당업자에게 공지되고 시판되고 있다. 다음의 발현 벡터가 예로서 제공된다. 세균 발현 벡터로는 pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBS, 파지스크립트 (phagescript), psiX174, pBluescript SK, pBsKS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene); pTRC99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, PRIT5 (Pharmacia)가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 진핵생물 발현 벡터로는 pWLneo, pSV2cat, pOG44, pXTl, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, PSVL (Pharmacia)이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 그러나, 원하는 숙주에서 복제가능하고 생존가능하기만 하면 임의의 다른 클로닝 또는 발현 벡터가 사용될 수 있다. 프로모터 영역은 CAT (클로람페니콜 전이효소) 발현 벡터 또는 선택가능한 마커를 가진 다른 벡터를 사용하여 임의의 원하는 유전자로부터 선택될 수 있다. 적절한 2개의 벡터는 pKK232-8 및 pCM7이다. 특별히 지정된 세균성 프로모터로는 laci, lacZ, T3, T7, gpt, 람다 PR, PL 및 trp가 있다. 진핵생물 프로모터로는 CMV 극초기, HSV 티미딘 키나제, 초기 및 후기 SV40, 레트로바이러스로부터의 LTRs 및 마우스 메탈로티오네인-I가 있다. 적절한 벡터 및 프로모터의 선택은 당업자의 기술 범위내에 든다.
발현 벡터는 또한 번역 개시를 위한 리보좀 결합 부위, 전사 종결자 및 발현을 증폭시키기 위한 적절한 서열을 함유할 수 있다. 발현 벡터는 진핵생물 세포 배양을 위한 디히드로폴레이트 환원효소 또는 네오마이신 내성, 또는 이. 콜리에서의 배양을 위한 테트라사이클린 또는 암피실린 내성과 같은, 형질전환된 숙주 세포의 선택을 위한 표현형 특성을 제공하는 유전자를 함유할 수 있다.
라이브러리
한 실시태양에서, 변이체의 라이브러리는 핵산 수준의 조합 돌연변이유발에 의해 형성되며 변화된 유전자 라이브러리에 의해 코딩된다. 변이체의 라이브러리는 예를 들면 가능한 변이체 아미노산 서열의 변성 세트가 개개의 폴리펩티드로서, 또는 다르게는 그 안에 서열 세트를 함유하는 더 큰 융합 단백질 세트 (예를 들면, 파지 디스플레이의 경우)로서 발현가능하도록 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 유전자 서열에 효소적으로 연결시킴으로써 생산될 수 있다.
변성 올리고뉴클레오티드 서열로부터 가능한 변이체의 라이브러리를 생산하는데 사용될 수 있는 각종 방법이 있다. 변성 유전자 서열의 화학적 합성은 자동 DNA 합성기에서 수행될 수 있으며, 그후에 합성 유전자는 적절한 발현 벡터에 연결된다. 변성 유전자 세트를 사용함으로써 필요한 유사체 서열 세트를 코딩하는 모든 서열을 한 혼합물에 갖게 된다. 변성 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들면, Narang, Tetrahedron 39:3 (1983); Itakura et al., Annu. Rev. Biochem. 53:323 (1984); Itakura et al., Science 198:1056 (1984); Ike et al., Nucleic Acid Res. 11:477, 1983 참조).
점 돌연변이 또는 절단 (truncation)에 의해 제조된 조합 라이브러리의 유전자 산물을 스크리닝하기 위한 또한 선택된 특성을 갖는 유전자 산물에 대한 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 몇가지 기술이 당업계에 공지되어 있다. 그러한 기술은 본 발명의 폴리펩티드의 조합 돌연변이유발에 의해 생성된 유전자 라이브러리의 신속한 스크리닝에 적합하다. 큰 유전자 라이브러리를 스크리닝하기 위한 대량 처리 분석을 할 수 있는 가장 통용되는 기술은 일반적으로 유전자 라이브러리를 복제가능한 발현 벡터로 클로닝하고, 적당한 세포를 벡터의 결과 라이브러리로 형질전환시키고, 필요한 활성의 검출이 산물이 검출된 유전자를 코딩하는 벡터의 분리를 용이하게 하는 조건 하에서 조합 유전자를 발현하는 것을 포함한다. 라이브러리 내의 기능적 돌연변이체의 빈도수를 증가시키는 기술인 반복 앙상블 돌연변이유발 (REM)을 스크리닝 분석과 함께 이용하여 필요한 변이체를 동정할 수 있다.
숙주 세포
본 발명은 또한 상기 벡터를 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 포유동물 세포와 같은 고등 진핵생물 세포, 또는 효모 세포와 같은 하등 진핵생물 세포일 수 있다. 다르게는, 숙주 세포는 세균 세포와 같은 원핵생물 세포일 수 있다.
숙주 세포는 본 발명의 클로닝 또는 발현 벡터로 유전공학 처리 (형질도입, 형질전환 또는 트랜스펙션)될 수 있다. 벡터는 예를 들면 플라스미드, 바이러스 입자 또는 파아지의 형태일 수 있다. 유전공학 처리된 숙주 세포는 프로모터를 활성화하거나 형질전환체를 선별하기에 적합한 것으로 변형된 통상의 영양 배지에서 배양될 수 있다. 적절한 배양 조건, 예를 들면 온도 및 pH의 선택은 당업자의 기술에 속한다.
적절한 숙주의 대표적인 예로서 세균 세포, 예를 들면 이. 콜리, 살모넬라 티피무륨 (Salmonella typhimurium), 스트렙토마이세스 (Streptomyces); 진균 세포, 예를 들면 효모; 곤충 세포, 예를 들면 드로소필라 (Drosphila) S2 및 스포돕테라 (Spodoptera) Sf9; 포유동물 세포, 예를 들면 CHO, COS 또는 보웨스 (Bowes) 흑색종을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적절한 숙주의 선택은 본원의 교시로부터 당업자의 기술 영역 내에 드는 것으로 간주된다.
작제물의 숙주 세포로의 도입은 예를 들면 인산 칼슘 트랜스펙션, DEAE-덱스트란 매개된 트랜스펙션, 또는 전기천공법에 의해 실시될 수 있다 (Davis et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986). 숙주 세포 내의 작제물은 재조합 서열에 의해 코딩되는 유전자 산물을 생산하기 위해 통상의 방법으로 사용될 수 있다.
단백질 발현
성숙형 단백질은 적절한 프로모터의 제어 하에 포유동물 세포, 효모, 세균 또는 기타 세포에서 발현될 수 있다. 본 발명의 DNA 작제물로부터 유래된 RNA를 사용하여 그러한 단백질을 생산하는데 무-세포 번역 시스템이 이용될 수도 있다. 원핵 및 진핵생물 숙주와 함께 사용하기 위한 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 상기되어 있으며 또한 문헌 (Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2d ed., (Cold Spring Harbor, N. Y., 1989))에 기술된 바 있다.
고등 진핵생물에 의한 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사는 인핸서 서열을 발현 벡터에 삽입함으로써 증가될 수 있다. 인핸서는 그의 전사를 증가시키도록 프로모터에 작용하는, 일반적으로 약 10 내지 300 bp의 DNA의 시스-작용 요소이다. 그의 예로는 복제 기점의 후기쪽 상의 SV 인핸서 (bp 100 내지 270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 후기쪽 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서가 있다. 일반적으로, 재조합 발현 벡터는 복제 기점 및 숙주 세포의 형질전환을 가능하게 하는 선택 마커, 예를 들면 이. 콜리의 암피실린 내성 유전자 및 에스. 세레비지애 (S. cerevisiae) TRP1 유전자, 및 하류 구조 서열의 전사를 지시하도록 고도로 발현된 유전자로부터 유래된 프로모터를 포함할 것이다. 그러한 프로모터로는 특히 3-포스포글리세레이트 키나제 (PGK), α 인자, 산 포스파타제 또는 열 쇼크 단백질과 같은 해당 효소를 코딩하는 오페론으로부터 유래될 수 있다. 이종성 구조 서열은 번역, 개시 및 종결 서열, 및 바람직하게는 번역된 단백질의 세포질주위 공간 또는 세포외 영역 내로의 분비를 지시할 수 있는 리더 서열과 적절한 상으로 조립된다. 임의로, 이종성 서열은 목적하는 특징, 예를 들면 발현된 재조합 산물의 안정화 또는 간편화된 정제를 부여하는 N-말단 동정 펩티드를 포함한 융합 단백질을 코딩할 수 있다.
적합한 숙주 균주의 형질전환 및 숙주 균주의 적절한 세포 밀도로의 성장 후에, 선택된 프로모터는 적절한 수단 (예를 들면, 온도 이동 또는 화학적 유도)에 의해 억제해제되고, 세포는 추가 기간 동안 배양된다. 세포는 전형적으로 원심분리에 의해 수거되고 물리적 또는 화학적 수단에 의해 파괴된다. 결과 조 추출물은 추가의 정제 동안 유지된다. 단백질 발현에 이용되는 미생물 세포는 동결-해동 순환, 소니피케이션, 기계적 파괴 또는 세포 용해제의 사용을 비롯한 임의의 편리한 방법에 의해 파괴될 수 있다.
재조합 단백질을 발현하는데 각종 포유동물 세포 배양 시스템이 또한 이용될 수 있다. 포유동물 발현 시스템의 예로는 문헌 (Gluzman, Cell 23:175 (1981))에 기재된 원숭이 신장 섬유아세포의 COS-7 주, 및 적합한 벡터를 발현할 수 있는 기타 세포주, 예를 들면 C127, 3T3, CHO, HeLa 및 HBK 세포주가 있다.
단백질 정제
본 발명의 폴리펩티드는 재조합 세포 배양물로부터 당업계에 공지된 방법, 예를 들면 황산 암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 및 렉틴 크로마토그래피에 의해 회수되고 정제될 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)는 최종 정제 단계로서 이용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 아래의 특정 실시예에 기재된 바와 같이 편리하게 단리될 수 있다. 정제된 폴리펩티드는 약 70% 이상 순수하며, 즉 단리된 폴리펩티드는 세포성 물질을 실질적으로 함유하지 않으며 약 30% (건조 중량 기준) 미만의 비-폴리펩티드 물질을 갖고 있다. 바람직하게는, 제제는 85% 내지 99% (즉, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 96, 97, 98 및 99%) 순수하다. 제제의 순도는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 질량 분광분석법 및 액체 크로마토그래피와 같은 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 평가될 수 있다.
번역후 변형
재조합 생산 절차에 이용된 숙주에 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 포유동물 또는 다른 진핵생물 탄수화물로 당화될 수 있거나 비-당화될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 초기 메티오닌 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
화학적 합성
또 다르게는, 본 발명의 폴리펩티드는 그의 아미노산 서열을 합성하는 화학적 방법을 이용하여, 예를 들면 고상 기술을 이용한 직접 펩티드 합성에 의해 생산될 수 있다 (예를 들면, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154, 1963; Roberge et al, Science 269, 202-204, 1995 참조). 폴리펩티드 합성은 수동 기술을 이용하여 또는 자동화에 의해 수행될 수 있다. 자동화 합성은, 예를 들면 어플라이드 바이오시스템스 431A 펩티드 합성기 (Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer; Perkin Elmer 제품)를 사용하여 이루어질 수 있다. 임의로, 폴리펩티드의 단편은 완전 길이 분자를 생산하는 화학적 방법을 이용하여 별도로 합성되고 조합될 수 있다.
새롭게 합성된 폴리펩티드는 고성능 분취 액체 크로마토그래피에 의해 실질적으로 정제될 수 있다 (예를 들면, Creighton, Proteins: Structures And Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York, N.Y., 1983 참조). 본 발명의 합성 폴리펩티드의 조성은 아미노산 분석에 의해 또는 예를 들어, 에드만 분해법 (Creighton, 상기 참조)에 의한 서열화에 의해 확인될 수 있다. 추가로, 폴리펩티드의 아미노산 서열의 임의의 부분은 직접 합성 중에 변화될 수 있고(있거나) 화학적 방법을 이용하여 다른 단백질로부터의 서열과 조합되어 변이 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드를 생산할 수 있다.
제약학적 응용
본 발명의 폴리펩티드는 2형 당뇨병 (비-인슐린 의존형 당뇨병)을 치료하는데 및(또는) 내당능 장애, 공복 혈당 장애, 고혈당증 및(또는) 비만을 갖고 있는 대상이 2형 당뇨병으로 발전하는 것을 예방하는데 이용될 수 있다.
제약 조성물
본 발명의 폴리펩티드는 적합한 제약학적 담체와 배합되어 비경구 투여용 제약 조성물을 형성할 수 있다. 그러한 조성물은 치료 유효량의 폴리펩티드 및 제약학상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 제약학상 허용되는 담체로는 염수, 완충 염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 및 그의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 제제는 투여 방식에 적합해야 한다.
제약 조성물은 편리한 방식으로, 예를 들면 경구, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 비강내 또는 피내 경로로 투여될 수 있다. 제약 조성물은 특정 징후를 치료 및(또는) 예방하는데 효과적인 양으로 투여된다. 적합한 용량은 1일에 약 3.5 ng 이상의 활성 폴리펩티드 (즉, PEG 또는 지방산 잔기의 중량은 포함하지 않음)/㎏ 체중 내지 약 100 ㎍/㎏ 체중의 범위이다. 대부분의 경우에, 용량은 투여 경로, 증상 등을 고려하여, 1일에 약 0.1 ㎍/㎏ 체중 내지 약 35 ㎍/㎏ 체중 (즉, 0.1, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30 및 35 ㎍/㎏ 체중)이다. 이 수치는 생체내에서의 펩티드의 생체이용성을 고려하지 않으며, 이 경우에는 원하는 유효량을 얻는데 대략적인 것이 사용될 수 있다. 용량의 결정은 당업자의 기술 범위에 속하며 통상적인 스크리닝 만을 필요로 한다.
본 발명의 폴리펩티드는 또한 당뇨병, 공복 혈당 장애, 내당능 장애, 고혈당증 및 비만의 치료에 유용한 다른 약제와 함께 이용될 수 있다. 적합한 제제는 인슐린 분비촉진제, 인슐린 감작제 및 메트포르민 HCl을 포함한다.
키트
본 발명은 또한 본 발명의 제약 조성물의 1종 이상의 성분으로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 제약학적 팩 또는 키트를 제공한다. 제약 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정되고 그 기관에 의한 승인을 반영하는 형태의 통지문이 팩 또는 키트와 함께 포함될 수 있다.
유전자 요법
본 발명의 폴리펩티드는 또한 생체내에서 발현될 수 있으며, 이는 종종 "유전자 요법"으로 불리운다. 따라서, 예를 들면 세포는 생체외에서 폴리펩티드에 대해 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (DNA 또는 RNA)로 유전공학 처리될 수 있으며 그후에 유전공학 처리된 세포는 폴리펩티드로 치료될 환자에게 제공된다. 그러한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 세포는 본 발명의 폴리펩티드에 대해 코딩하는 RNA를 함유하는 레트로바이러스 입자를 사용하여 당업계에 공지된 절차에 의해 유전공학 처리될 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 당뇨병과 같은 질환에 대한 유전자 요법에 사용된다. 이 실시태양에 따라서, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 의한 유전자 요법은 진단과 동시에 또는 진단 직후에 환자에게 제공된다.
유전자 요법을 이용한 폴리펩티드의 국소 전달은 치료제를 표적 영역, 즉 췌장에 제공할 수 있다. 예를 들어 췌장 특이적 프로모터가 베타-세포 췌장 종양 마우스 모델을 형성하는데 이용되었다 (Hanahan, Nature 315 (6015): 115-22, 1985).
시험관내 및 생체내 유전자 요법의 방법론 둘다가 고려된다. 정의된 세포 집단에 치료가능한 유전자를 전달하는 몇가지 방법이 공지되어 있다 (예를 들면, Mulligan, Science 260:926-31, 1993 참조). 이러한 방법으로는 다음과 같은 것이 있다:
1) 직접 유전자 전달 (예를 들면, Wolff et al., "Direct Gene transfer Into Mouse Muscle In Vivo," Science 247:1465-68, 1990 참조);
2) 리포좀-매개된 DNA 전달 (예를 들면, Caplen et al., "Liposome- mediated CFTR Gene Transfer To The Nasal Epithelium Of Patients With Cystic Fibrosis," Nature Med. 3: 39-46, 1995; Crystal, "The Gene As A Drug," Nature Med. 1:15-17, 1995; Gao and Huang, "A Novel Cationic Liposome Reagent For Efficient Transfection Of Mammalian Cells," Biochem. Biophys. Res. Comm. 179:280-85, 1991 참조);
3) 레트로바이러스 매개된 DNA 전달 (예를 들면, Kay et al., "In Vivo Gene Therapy Of Hemophilia B: Sustained Partial Correction In Factor IX-Deficient Dogs," Science 262:117-19, 1993; Anderson, "Human Gene Therapy," Science 256:808-13, 1992 참조).
4) DNA 바이러스 매개된 DNA 전달. 그러한 DNA 바이러스로는 아데노바이러스 (바람직하게는, Ad-2 또는 Ad-5계 벡터), 헤르페스 바이러스 (바람직하게는, 단순 포진 바이러스계 벡터), 및 파르보바이러스 (바람직하게는, "결핍성" 또는 비-자율 파르보바이러스계 벡터, 더욱 바람직하게는 아데노 관련 바이러스계 벡터, 가장 바람직하게는 AAV-2계 벡터)가 있다 (예를 들면, Ali et al., "The Use Of DNA Viruses As Vectors For Gene Therapy," Gene Therapy 1:367-84, 1994; 미국 특허 제4,797,368호 및 미국 특허 제5,139,941호 참조).
유전자 요법 벡터 시스템
당해 유전자를 전달하기 위한 특정 벡터 시스템의 선택은 각종 인자에 좌우될 것이다. 한가지 중요한 인자는 표적 세포 집단의 성질이다. 레트로바이러스 벡터가 광범위하게 연구되고 많은 유전자 요법 분야에 이용되어 왔지만, 이 벡터는 일반적으로 비-분화 세포를 감염시키는 데에는 부적합하다. 또한, 레트로바이러스는 종양 형성 가능성이 있다. 그러나, 렌티바이러스 벡터 분야에서의 최근의 발전은 이들 한계의 일부를 극복할 수 있다 (Naldini et al., Science 272:263-7, 1996 참조).
당업자는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 임의의 적합한 유전자 요법 벡터가 이 실시태양에 따라서 이용될 수 있음을 이해할 것이다. 그러한 벡터를 작제하는 기술은 공지되어 있다 (예를 들면, Anderson, Nature 392 25-30, 1998; Verma and Somia, Nature 389 239-242, 1998 참조). 표적 부위로의 벡터의 도입은 공지된 기술을 이용하여 이루어질 수 있다.
적합한 유전자 요법 벡터는 하나 이상의 프로모터를 포함한다. 사용될 수 있는 적합한 프로모터로는 바이러스 프로모터 (예를 들면, 레트로바이러스 LTR, SV40 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, RS (respiratory syncytial) 바이러스 프로모터, B19 파르보바이러스 프로모터 및 인간 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 (Miller et al., Biotechniques 7(9):980-990, 1989), 세포성 프로모터 (예를 들면, 히스톤, pol III 및 β-액틴 프로모터) 및 유도성 프로모터 (예를 들면, MMT 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터 및 열 충격 프로모터)가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적합한 프로모터의 선택은 본원에 함유된 교시로부터 당업자에게 명백할 것이다.
레트로바이러스
상기 레트로바이러스 플라스미드 벡터가 유래될 수 있는 레트로바이러스로는 몰로니 쥐 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스, 레트로바이러스, 예를 들면 라우스 육종 (Rous Sarcoma) 바이러스, 하비 육종 (Harvey Sarcoma) 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 긴팔원숭이 유인원 백혈병 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 골수증식성 육종 바이러스, 및 유선 종양 바이러스가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 한 실시태양에서, 레트로바이러스 플라스미드 벡터는 몰로니 래트 백혈병 바이러스로부터 유래된다.
레트로바이러스 플라스미드 벡터는 프로듀서 세포주를 형성하기 위해 패키징 세포주를 형질도입하는데 사용된다. 트랜스펙션될 수 있는 패키징 세포의 예로는 PE501, PA317, Ψ-2, Ψ-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, ΨCRE, ΨCRIP, GP+E-86, GP+envAml2 및 DAN 세포주가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다 (Miller, Human Gene Therapy, 1:5-14, 1990). 벡터는 당업계에 공지된 임의의 수단을 통하여 패키징 세포를 형질도입할 수 있다. 그러한 수단으로는 전기천공법, 리포좀의 사용 및 CaPO4 침전이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 한가지 대안에서, 레트로바이러스 플라스미드 벡터는 리포좀 내로 봉입되거나, 지질에 결합되고, 그후에 숙주에 투여된다. 프로듀서 세포주는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열(들)을 포함하는 감염성 레트로바이러스 벡터 입자를 생성한다. 그러한 레트로바이러스 벡터 입자는 그후에 시험관내에서 또는 생체내에서 진핵생물 세포를 형질도입하는데 사용될 수 있다. 형질도입된 진핵생물 세포는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열(들)을 발현할 것이다. 형질도입될 수 있는 진핵생물 세포로는 배아 줄기 세포, 배아 암종 세포 및 조혈모세포, 간세포, 섬유아세포, 근세포, 케라틴세포, 내피세포 및 기관지 상피 세포가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스
아데노바이러스는 광범위한 숙주 범위를 가지며, 휴지 또는 완전 분화 세포, 예를 들면 뉴론 또는 간세포를 감염시킬 수 있고, 본질적으로 비-종양원성으로 보이는 잇점을 갖고 있다 (예를 들면, Ali et al., 1994, at page 367). 아데노바이러스는 숙주 게놈으로 통합되는 것으로 보이지 않는다. 그들은 염색체외로 존재하므로, 삽입성 돌연변이유발의 위험이 크게 줄어든다 (Ali et al., 1994, at page 373).
아데노-관련 바이러스는 아데노바이러스계 벡터와 유사한 잇점을 나타낸다. 그러나, AAVs는 인간 염색체 19에 대해 부위 특이적 통합을 나타낸다 (Ali et al., 1994, at page 377).
핵형전환 요법 (transkaryotic therapy)
다른 유전자 요법은 환자의 세포를 휴면 염색체 유전자를 유도하도록 생체외 처리하여 환자에게 재도입한 후에 당해 단백질을 생산하는 "핵형전환 요법"이다. 핵형전환 요법은 개체가 활성화에 필요한 정상 유전자 보체를 갖고 있음을 가정한다. 핵형전환 요법은 발생기 유전자를 활성화할 수 있는 프로모터 또는 다른 외인성 조절 서열을 생체외에서 환자의 세포 염색체 DNA 내로 도입하고, 배양하고활성 단백질 생성 세포를 선별하고 그후에 확실하게 이루어지도록 활성화된 세포를 환자에게 재도입하는 것을 포함한다. "유전자 활성화된" 세포는 아마도 환자의 생명이 유지되는 한 상당한 시간 동안 당해 단백질을 제조한다. 미국 특허 제5,641,670호 및 5,733,761호는 이러한 개념을 상세히 개시하고 있다.
본 발명을 더욱 잘 이해하기 위해, 다음 실시예를 기재하였다. 이 실시예는 예시 만을 목적으로 하는 것이며 어떠한 식으로든 본 발명의 영역을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 이러한 설명에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 참조 문헌은 본원에 전체적으로 참고로 포함된다.
실시예 1
펩티드 합성 방법
하기 일반 절차에 따라 본 발명의 폴리펩티드 일부를 합성하였다. 펩티드 합성은 래프 (Rapp)-폴리머 PEG-폴리스티렌 수지 (Rapp-Polymere, Tubingen, Germany)를 사용하여 연속 유동 조건하에 FMOC/t-부틸 방식 (Peptide Synthesis Protocols (1994), Volume 35 by Michael W. Pennington & Ben M. Dunn 참조)에 의해 행하였다. 합성이 종결되면, 펩티드를 수지로부터 분리시키고 TFA/DTT/H20/트리이소프로필 실란 (88/5/5/2)을 사용하여 탈보호시켰다. 펩티드를 냉각 디에틸 에테르를 사용하여 분리 혼합물로부터 침전시켰다. 침전물을 냉각 에테르로 3회 세척한 다음 5 % 아세트산에 용해시킨 후 동결건조시켰다. 펩티드 정체는 0 % to 100 % 아세토니트릴 구배로서 3 % TFA를 함유한 물/아세토니트릴을 사용하여 워터스 알리앙스 (Waters ALLIANCE) (등록상표) 시스템 (Waters Corporation, Milford, MA) 상에서 YMC-Pack ODS-AQ 컬럼 (YMC, Inc., Wilmington, NC)을 사용하는 역상 크로마토그래피법, 및 VOYAGER DETM MALDI 질량 분광계 (모델 5-2386-00, PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) 상에서 MALDI 질량 분광분석법으로 확인하였다. 매트릭스 완충액 (3% TFA를 함유한 50/50 dH20/아세토니트릴) 펩티드 샘플을 매트릭스 완충액 1/1에 첨가하였다. 95% 초과 순도 기준에 맞지 않는 펩티드는 워터스 델타 분취 (Waters Delta Prep) 4000 HPLC 시스템 (Waters Corporation; Milford, MA) 상에서 역상 크로마토그래피로 정제하였다.
실시예 2
펩티드 클로닝
본 발명의 폴리펩티드 및 이의 돌연변이체를 발현시키기 위한 확고한 방법을 설정하기 위해, 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 모노머 펩티드 및 GST를 분리시키는 단일 팩터 (Factor) Xa 인식 부위를 갖는 GST에 C-말단 클로닝시켰다. 생성될 펩티드의 DNA 서열에 융합되는 팩터 Xa 인식 부위를 코딩하는 유전자는, 클로닝될 폴리뉴클레오티드의 DNA 서열에 5'에 바로 접한 BamHI 또는 EcoRI 제한 효소 부위를 갖는 2개의 겹쳐진 단일 가닥 DNA 단편 (70 내지 90 mers)을 혼성화시킨 다음, DNA 폴리머라제 I (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD)의 거대 단편을 통해 반대편 가닥을 DNA 합성시킴으로써 합성하였다.
폴리뉴클레오티드 각각에 대해 선택된 DNA 서열은 각 펩티드의 설정된 아미노산 서열의 역 번역을 기준으로 하였다. 일부의 경우, 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기한 방법에 의해 미리 제조된 폴리뉴클레오티드의 PCR 돌연변이유발에 의해 생성되었다 [Picard et al., Nucleic Acids Res 22: 2587-91, 1994; Sambrook et al., (1989) MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) 참조]. 그 다음, 이중 가닥 생성물을 BamHI 및 EcoRI로 분해하고, 역시 BamHI 및 EcoRI에 의해 절단된 pGEX-6P-l (Amersham Pharmacia Biotech)에 연결하였다.
예를 들면, 서열 번호: 7로서 확인된 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 pGEX-6P-l로 클로닝시킬때, 폴리펩티드 서열 IEGRHSQGTFTSDYAKYLDARRAKEFIAWLVKGRG (서열 번호: 33) (여기서, 첫번째 4개의 아미노산, IEGR은 팩터 Xa 인식 부위이며 나머지 31개의 아미노산은 서열 번호: 7로서 확인된 아미노산 서열이다)은 글루타티온 S-전이효소 (GST)와의 융합물로서 발현되었다.
서열 번호: 7로서 확인된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 첫번째 및 마지막 6개의 뉴클레오티드는 pGEX6P-l 플라스미드로 클로닝시키는데 사용된 제한 효소 부위 (BamHI and EcoRI)를 나타낸다 (제1도). EcoRI 부위 ("GAATTC")에 바로 앞서 있는 "TAATGA" 서열은 2개의 정지 코돈을 코딩시킨다. 나머지 DNA 서열은 서열 번호: 7 융합 서열로서 확인된 팩터 Xa-폴리펩티드를 코딩한다.
실시예 3
펩티드 재조합 발현 및 정제
플라스미드를 갖는 GST-펩티드 융합물로 형질전환시킨 BL21 (DE3) 세포 (Stratagene)를 37 ℃에서 OD600이 0.6 내지 1.0에 도달할 때까지 성장시키고 37 ℃에서 2 시간 동안 1 mM IPTG (Life Technologies)에 의해 유도시켰다. 2 리터의 세포를 7,700 x g에서 15분 동안 스피닝 (spinning)시키고 -20 ℃에서 보관시켰다. 세포 펠릿을 80 ㎖의 B-PER 세균 단백질 추출 시약 (Cat No. 78248, Pierce) 및 lx 완전 프로테아제 억제제 (Roche) 중에서 세포 현탁액이 균질화될 때 까지 재현탁시켰다. 균질 혼합물을 실온에서 10 분 동안 온화하게 진탕시켰다. 리소좀 및 데옥시리보뉴클레아제 (Dnase) I을 각각 단백질을 추가로 용해시키고 점도를 낮추기 위해 최종 농도 200 ㎍/㎖ 및 10 ㎍/㎖까지 첨가하였다. 혼합물을 5 분간 더 인큐베이션시켰다. 27,000 x g에서 20 분 동안 스피닝시켜 세포 잔해를 제거하였다. 상등액을 사전 세척시킨 글루타티온 세파로스 4B 수지 (Pharmacia) 2 mL와 함께 4 ℃에서 밤새 교반기상에서 혼합시켰다. 수지를 1,500 x g에서 15분 동안 스피닝시키고, 빈 Poly-Prep 크로마토그래피 컬럼 (Bio-Rad)에 채우고 PBS 30 mL에 이어서 팩터 Xa 완충액 (1 mM CaCl2, 100 mM NaCl 및 50 mM 트리스-HCl, pH 8.0) 10 mL로 세척하였다. 펩티드를 4 ℃에서 밤새 팩터 Xa 완충액 1 mL 중 팩터 Xa (Pharmacia) 60 단위로 컬럼으로부터 분리시켰다. 그 다음, 이 용리액을 하기 프로그램에 따라서 루프 2 mL 및 유속 1 mL/분을 사용하여 C18 HPLC (Beckman System Gold) 처리시켰다: 완충액 A (0.1% TFA/H20) 5 분, 100% 완충액 B (0.1% TFA/ACN) 까지의 구배 30분, 완충액 A 10분, 구배 10분, 및 완충액 A 10분. 피이크 분획 (각각 0.5 mL)을 모으고 10-20 % 트리신-SDS 겔 전기영동법에 의해 스크리닝시켰다. 각 펩티드 정체는 아미노산 서열로부터 추산된 질량을 사용한 질량 분광분석법에 의해 확인하였다. 일반적인 수율은 대략 이. 콜리 배양물 리터 당 유리 펩티드 50 ㎍이었다. 재조합 펩티드는 그의 합성 변형물과 동일한 활성을 갖는 것으로 입증되었다.
하기 표 2는 상기 실시예 1에 기술된 펩티드 합성 실험 계획에 따르거나 또는 상술된 바와 같이 재조합에 의해 제조된 일부 선택된 폴리펩티드를 포함하고 있다.
글루카곤 HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT (서열 번호: 1)
GLP-1(7-36) HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH2 (서열 번호: 2)
GLP-1(7-37) HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG (서열 번호: 3)
G1 HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLVKGR-NH2 (서열 번호: 4)
G5 HSQGTFTSDYSKYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH2 (서열 번호: 5)
G27 HSQGTFTSDYAKYLDARRAKEFIAWLVKGR-NH2 (서열 번호: 6)
G51 HSQGTFTSDYAKYLDARRAKEFIAWLVKGRG (서열 번호: 7)
G55 HSQGTFTSDYARYLDARRAKEFIAWLVKGR-NH2 (서열 번호: 8)
G56 HSQGTFTSDYAAYLDARRAKEFIAWLVKGR-NH2 (서열 번호: 9)
G57 HSQGTFTSDYAKYLDAARAKEFIAWLVKGR-NH2 (서열 번호: 10)
G58 HSQGTFTSDYAKYLDAKKAKEFIAWLVKGRG (서열 번호: 11)
G59 HSQGTFTSDYARYLDAKKAKEFIAWLVKGRG (서열 번호: 12)
G60 HSQGTFTSDYAKYLDAAKAKEFIAWLVKGRG (서열 번호: 13)
G61 HSQGTFTSDYARYLDAAKAKEFIAWLVKGRG (서열 번호: 14)
G71 HSQGTFTSDYAKYLDARRACEFIAWLVKGRG (서열 번호: 15)
G74 HSQGTFTSDYAKYLDARRAKEFIAWLVCGRG (서열 번호: 16)
G75 HSQGTFTSDYAKYLDARRAKEFIAWLVKCRG (서열 번호: 17)
G76 HSQGTFTSDYAKYLDARRAKEFIAWLVKGCG (서열 번호: 18)
G77 HSQGTFTSDYAKYLDARRAKEFIAWLVKGRC (서열 번호: 19)
G277 HSQGTFTSDYAKYLDARRAKEFIAWLVKGRC (22kD) (서열 번호: 20)
G82 HSQGTFTSDYARYLDARRAKEFIAWLVRGRG (서열 번호: 21)
G83 HSQGTFTSDYARYLDARRAREFIKWLVRGRG (서열 번호: 22)
G84 HSQGTFTSDYARYLDARRAREFIAWLVKGRG (서열 번호: 23)
G85 HSQGTFTSDYARYLDARRAREFIAWLVRGRGK (서열 번호: 24)
G185 HSQGTFTSDYARYLDARRAREFIKWLVRGRC (서열 번호: 25)
G2185 HSQGTFTSDYARYLDARRAREFIKWLVRGRC (22kD) (서열 번호: 26)
G4185 HSQGTFTSDYARYLDARRAREFIKWLVRGRC (43kD) (서열 번호: 27)
G87 HSQGTFTSDYAKYLDARRAK(FA)EFIAWLVKGR-NH2 (서열 번호: 28)
G88 HSQGTFTSDYAKYLDARRAKEFIAWLVKGRK(FA) (서열 번호: 29)
G90 HSQGTFTSDYARYLDARRAREFIK(FA)WLVRGRG (서열 번호: 30)
G182 HSQGTFTSDYARYLDARRAREFIKWLVRGRGK(FA) (서열 번호: 31)
G183 HSQGTFTSDYARYLDARRAK(FA)EFIKWLVRGRG (서열 번호: 32)
(FA): 리신 잔기에 결합된 C16 팔미테이트 (22kD): 시스테인 잔기에 결합된 22kD PEG (43kD): 시스테인 잔기에 결합된 43kD PEG
실시예 4
RINmSF 세포막의 제조
RINm5F 세포 플라스크를 PBS로 세척하고, 프로테아제 억제제 (HES)를 함유하는 20 mM Hepes - 1 mM EDTA - 250 mM 수크로스 완충액 중에서 긁어내고 다운스 (dounce) 균질화기 중에서 균질화시킨 다음 23 게이지 니들을 통해 재현탁을 반복시켰다. 파괴되지 않은 세포 및 핵을 500 x g에서 5 분 동안 원심분리시켜 제거하였다. 펠릿을 23 게이지 니들을 사용한 HES 완충액 중에 재현탁시키고 원심 분리를 반복하였다. 2회 스피닝에 의해 얻어진 상등액을 합하고 40,000 x g에서 20 분 동안 원심분리시켰다. 생성된 원형질 막 펠릿을 23 게이지 니들에 이어 25 게이지 니들을 사용하여 HES 완충액 중에서 재현탁시켰다. 막을 사용할 때 까지 -80 ℃에서 보관시켰다.
실시예 5
래트의 간으로부터 원형질 막의 제조
래트를 희생시키고 간을 빙냉 TES 완충액 (프로테아제 억제제를 함유하는 20 mM 트리스, pH 7.5, 1 mM EDTA, 255 mM 수크로스) 중으로 떼어 내었다. 촉촉한 상태의 간의 중량을 측정하고 조직을 빙냉 TES 완충액 5 용적 중에 잘게 썰고 폴리트론을 사용하여 슬러리를 제조하였다. 모든 완충액 및 스핀을 4 ℃에서 유지시켰다. 소형 다운스 균질화기를 3회 동작시켜 슬러리를 추가로 균질화시켰다. 균질물을 수겹의 투박한 무명천에 통과시키고 25,000 x g에서 10분 동안 스피닝시켰다. 펠릿을 TES 완충액 22.1 ㎖ 중에서 소형 다운스 균질화기 10회 동작에 의해 균질화시켰다. TES 중 2.4 M 수크로스 27.9 ㎖를 첨가하고 잘 혼합시켰다. 균질물을 수개의 튜브에 분배시키고 각 튜브상에 TES 완충액 7 ㎖를 더 첨가하였다. 튜브를 120,000 x g에서 60 분 동안 스피닝시켰다. 원형질 막을 스피닝시키는 동안 형성된 계면에서 분리시키고, TES 중에 희석시키고 200,000 x g에서 15분 동안 스피닝시켜 농축시켰다. 생성된 펠릿을 TES 완충액 9.8 ㎖ 중에서 다시 균질화하고, 2.4M 수크로스 10.3 ㎖와 합하고, TES 7 ㎖를 더 첨가하고 180,000 x g에서 30 분 동안 원심분리시켰다. 원형질 막을 계면에서 분리시키고, TES 완충액으로 희석시키고 200,000 x g에서 15분 동안 원심분리시켜 모았다. 최종 펠릿을 TES 중에서 재현탁시켰다. 원형질 막을 사용할 때 까지 -80℃에서 보관시켰다.
실시예 6
래트 간세포의 제조
베리 (Berry)와 프렌드 (Friend)의 변형 실험절차에 따라서 간세포를 분리시켰다 (J. Cell. Biol. 43: 506, 1969). 사육한 수컷 위스타 (Wistar) 종 래트를 나트륨 펜토바비탈 (55 ㎎/㎏)로 복강내 투여하여 마취시켰다. 래트를 간 관류 장치 (37 ℃) 트레이 상에 등을 댄 상태로 위치시키고 사지를 실험용 테이프로 결박시켰다. 복부면을 70 % 알콜로 소독하고, 가위를 사용하여 복강을 개복시켜 간, 문정맥, 간동맥 및 후부 대정맥을 노출시켰다. 3종류 맥관 주변에 결찰사를 대충위치시켰다. 캐뉼라를 문정맥으로 삽입시키고 결찰사를 사용하여 묶었다. 간동맥 및 간 하단의 후부 대정맥을 결찰사를 사용하여 묶었다. 관류 펌프를 작동시키고 하향 대동맥을 즉시 분리시켜 완충액이 새나가도록 하고 쥐를 방혈시켰다. 흉강을 신속하게 절개하여 심장을 노출시켰다. 캐눌러를 심장을 통해 상부 대정맥에 삽입시키고 결찰사로 묶어 완충액이 간을 통해 순환하는 것을 멈추게 하였다. 간을 5 내지 10 % 양 RBC를 함유하는 크렙스-헨슬레이트 (Krebs-Henseleit) 완충액을 사용하여 14 ㎖/분의 유속에서 95 % 02/ 5 % C02를 지속적으로 실험실내 유동시키면서 관류시켰다. 이를 비순환계 중에서 5 분 동안 관류시킨 다음 재순환계 (콜라게나제 30 ㎎ 사용)에서 추가 30 분 동안 관류시켰다. 그 다음 간을 꺼내어 플라스틱 비이커내에서 가위로 잘게 저미고 나일론 체를 통과시켜 여과시켰다. 간세포를 완충액으로 세척하고 원심분리 (690 rpm, 실온, 90초)시키는 것을 연속적으로 행하여 잔해로부터 분리시켰다. 세포 등분량을 완충액으로 희석시키고 0.4% 트리판 블루 (Trypan Blue)로 염색하여 계수하였다. 나머지 세포를 각 분석에 적합한 밀도까지 완충액을 사용하여 희석시켰다.
실시예 7
래트 소도 (islet) 분리에 대한 프로토콜
공여 소도 (donor islet) 공급원으로서 스프라그 다울리 (Sprague Dawley) 종 래트 (275-320 g)을 사용하였다. 요약하면, 췌장을 냉각 재구성된 리버라제 (Liberase) RI (Boehringer Manheim) 10 ㎖로 채우고, 수거하고 효소 용액 추가 5 ㎖를 사용하여 수조 중에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 조직 현탁액을 냉각 10% FBS/행크스 (Hanks) 완충액 (Gibco)으로 2회 세척하고, 25% 피콜 (ficoll; Sigma) 8 ㎖에 재현탁시킨 다음 23%, 20% 및 11% 피콜 각각 5 ㎖로 층형성시켰다. 20 % 층 중 소도를 취하여 냉각 10 % FBS/행크스 완충액으로 2회 세척하고 10 % FBS/RPMI 1640 매질 (Sigma) 중에서 재현탁시켰다.
실시예 8
RINm5F 세포 원형질 막 내의 GLP-1 수용체에 대한 펩티드의 경쟁적 결합
RINm5F 막 내의 GLP-1 수용체에 대한 본 발명의 폴리펩티드, 및 폴리펩티드 단편, 변이체 및 유사체의 경쟁적 결합에 대한 IC50 값은 약 0.01 nM 내지 약 20 nM이다 (즉, 0.01, 0.1, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 nM). 전형적으로 본 발명의 폴리펩티드 유도체에 대한 IC50 값은 약 0.01 nM 내지 약 500 nM 이다 (즉, 0.01, 0.1, 1, 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 또는 500 nM).
RINm5F 세포 원형질 막에 대한 본 발명의 일부 폴리펩티드의 경쟁적 결합은 다음과 같이 측정하였다: 96 웰 GF/C 여과 플레이트 (Millipore, Bedford, MA)를 1시간 이상 동안 0.3% PEI로 차단하고 20 mM 트리스, 2 mM EDTA, pH 7.5, 1 ㎎/㎖ BSA 및 1 ㎎/㎖ 바시트라신을 포함하는 결합 완충액으로 2회 세척하였다. 결합 완충액에 희석된 RINm5F 세포 원형질 막 5 ㎍을 0.05 μCi 125I 표지된 GLP-1 및 1x10-12 내지 1x10-5 M 농도 범위의 펩티드와 함께 각 웰에 가하였다. 실온에서 60분 인큐베이션시킨 후에, 플레이트를 1 ㎎/㎖ BSA를 함유하는 빙냉 PBS로 3회 세척하였다. 플레이트를 건조시키고, 신틸런트 (scintillant)를 각 웰에 첨가하고, 월락 마이크로베타 (Wallac Microbeta) 계수기를 사용하여 웰 당 cpm을 측정하였다.
각 펩티드 농도에서 막에 결합된 125I 계수의 수치를 플롯팅하고 프리즘 (Prizm) 소프트웨어를 사용하여 비선형 회귀법으로 분석하여 IC50을 결정하였다. 표 2에 기재된 폴리펩티드가 RINm5F 세포로부터 분리된 원형질 막에 존재하는 GLP-1 수용체에 1.4 nM 및 248 nM의 IC50 값 (최소 3회 시험하여 결정함)으로 결합되었다. IC50은 표지된 GLP-1 (7-36) (서열 번호: 2)의 최대 결합이 50% 감소되는 폴리펩티드의 농도이다.
실시예 9
래트 간 원형질 막 내의 글루카곤 수용체에 대한 펩티드의 경쟁적 결합
래트 간 막 내의 글루카곤 수용체에 대한 본 발명의 폴리펩티드, 및 폴리펩티드 단편, 변이체 및 유사체의 경쟁적 결합에 대한 IC50 값은 약 0.1 nM 내지 약 1000 nM이다 (즉, 0.1, 1, 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 또는 1000 nM).
래트 간 원형질 막에 대한 본 발명의 일부 폴리펩티드의 경쟁적 결합은 다음과 같이 측정하였다: 96 웰 GF/C 여과 플레이트 (Millipore, Bedford, MA)를 1시간 이상 동안 0.1% PEI로 차단하고 20 mM 트리스, 2 mM EDTA, pH 7.5, 1 ㎎/㎖ BSA 및 1 ㎎/㎖ 바시트라신을 포함하는 결합 완충액으로 2회 세척하였다. 결합 완충액에 희석된 래트 간 원형질 막 3 ㎍을 0.05 μCi 125I 표지된 글루카곤 및 1x10-12 내지 1x10-5 M 농도 범위의 펩티드와 함께 각 웰에 가하였다. 실온에서 60분 인큐베이션시킨 후에, 플레이트를 1 ㎎/㎖ BSA를 함유하는 빙냉 PBS로 3회 세척하였다. 플레이트를 건조시키고, 신틸런트를 각 웰에 첨가하고, 월락 마이크로베타 계수기를 사용하여 웰 당 cpm을 측정하였다.
각 펩티드 농도에서 막에 결합된 125I 계수의 수치를 플롯팅하고 프리즘 소프트웨어를 사용하여 비선형 회귀법으로 분석하여 IC50을 결정하였다. 표 2에 기재된 폴리펩티드가 래트 간으로부터 분리된 원형질 막에 존재하는 글루카곤 수용체에 11.7 nM 및 726 nM의 IC50 값 (최소 3회 시험하여 결정함)으로 결합되었다. IC50은 표지된 글루카곤의 최대 결합이 50% 감소되는 폴리펩티드의 농도이다.
실시예 10
환형 AMP 섬광 근접 분석법 (SPA)을 이용한 GLP-1 수용체를 통한 펩티드 시그날링의 측정
본 발명의 폴리펩티드, 및 폴리펩티드 단편, 변이체 및 유사체의 경우, cAMP 섬광 근접 분석법에서의 GLP-1 수용체의 "활성화"는 4% 내지 약 1000% (즉, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000%)의 상대 효능으로 천연 GLP-1 (7-36) (서열 번호: 2)에 의해 유도된 최대 활성의 약 80% 내지 약 200% (즉, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195 또는 200%)인 최대 활성을 유도하는 것이다. 본 발명의 폴리펩티드 유도체의 경우, cAMP 섬광 근접 분석법에서의 GLP-1 수용체의 "활성화"는 0.5% 내지 약 1000% (즉, 0.5, 1, 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000%)의 상대 효능으로 천연 GLP-1 (7-36) (서열 번호: 2)에 의해 유도된 최대 활성의 약 80% 내지 약 200% (즉, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195 또는 200%)인 최대 활성을 유도하는 것이다. "상대 효능"은 천연 GLP-1 (7-36) (서열 번호: 2)의 EC50을 본 발명의 폴리펩티드의 EC50으로 나누고 100을 곱한 것이다. "EC50"은 최대 활성의 50%가 얻어지는 폴리펩티드의 농도이다.
cAMP 섬광 근접 분석법을 이용한 본 발명의 일부 폴리펩티드에 대한 GLP-1 수용체의 펩티드 시그날링은 다음과 같이 측정하였다: RINm5F 세포를 96 웰 플레이트 (Costar)에 1.5x105 세포/웰의 농도로 플레이팅하고 RPMI 1640, 5% FBS, 항생제/항진균제 (Gibco BRL)에서 37 ℃로 24시간 동안 성장시켰다. 배지를 제거하고 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 세포를 1% BSA 및 100 μM IBMX를 함유하는 Hepes-PBS에서 1x10-12 내지 1x10-5 M 농도 범위의 펩티드와 함께 인큐베이션시켰다. 지방산과 접합된 펩티드를 분석하기 위하여, BSA를 인큐베이션 완충액에서 생략하였다. 인큐베이션 완충액을 제거하고, 세포를 cAMP 섬광 근접 분석법 (SPA) 직접 스크리닝 분석 시스템 (Amersham Pharmacia Biotech Inc; Piscataway, NJ)과 함께 제공된 용해 시약에 용해시켰다. 이 키트와 함께 제공된 다음 지시 사항에 따라 용해질에 존재하는 cAMP의 양 (pmol)을 측정하였다.
각 펩티드 농도에서 생성된 cAMP의 양 (pmol)을 플롯팅하고 프리즘 소프트웨어를 사용하여 비선형 회귀법으로 분석하여 각 펩티드에 대한 EC50을 결정하였다. 표 2에 기재된 폴리펩티드에 대한 GLP-1 수용체 활성화에 대한 평균 상대 효능 값은 0.6% 내지 76.1%였다. 유도된 최대 활성의 범위는 천연 펩티드 GLP-1 (7-36) (서열 번호: 2)의 83% 내지 132%였다 (최소 3회 시험하여 결정함). 표 4 참조.
실시예 11
환형 AMP 섬광 근접 분석법 (SPA)을 이용한 글루카곤 수용체를 통한 펩티드 시그날링의 측정
본 발명의 폴리펩티드, 및 폴리펩티드 단편, 변이체 및 유사체의 경우, cAMP 섬광 근접 분석법에서의 글루카곤 수용체의 "활성화"는 약 0.001 내지 약 5% (즉, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 2, 3, 4 또는 5%)의 상대 효능으로 천연 글루카곤 (서열 번호: 1)에 의해 유도된 최대 활성의 약 0% 내지 약 75% (즉, 0, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 또는 75%)인 최대 활성을 유도하는 것이다. 본 발명의 폴리펩티드 유도체의 경우, cAMP 섬광 근접 분석법에서의 글루카곤 수용체의 "활성화"는 약 0.001 내지 약 1% (즉, 0.001, 0.01, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1%)의 상대 효능으로 천연 글루카곤 (서열 번호: 1)에 의해 유도된 최대 활성의 약 0% 내지 약 40% (즉, 0, 1, 10, 20, 30 또는 40%)인 최대 활성을 유도하는 것이다. "상대 효능"은 천연 글루카곤 (서열 번호: 1)의 EC50을 본 발명의 폴리펩티드의 EC50으로 나누고 100을 곱한 것이다. "EC50"은 최대 활성의 50%가 얻어지는 폴리펩티드의 농도이다.
cAMP 섬광 근접 분석법을 이용한 본 발명의 일부 폴리펩티드에 대한 글루카곤 수용체의 펩티드 시그날링은 다음과 같이 측정하였다: 새로 분리된 래트 간세포를 1% BSA 및 100 μM IBMX를 함유하는 Hepes-중탄산염-PBS에서 7.5x104 또는 2x105 세포/웰의 농도로 96 웰 플레이트에 플레이팅하였다. 5% CO2/95% O2 환경에서 37 ℃에서 10분 동안 평형화한 후에, 1x10-12 내지 1x10-5 M 농도 범위의 펩티드를 추가로 15분 동안 첨가하였다. 플레이트를 간단히 원심분리시키고, 인큐베이션 완충액을 제거하고, 세포를 cAMP 섬광 근접 분석법 (SPA) 직접 스크리닝 분석 시스템 (Amersham Pharmacia Biotech Inc; Piscataway, NJ)과 함께 제공된 용해 시약에 용해시켰다.
이 키트와 함께 제공된 다음 지시 사항에 따라 용해질에 존재하는 cAMP의 양 (pmol)을 측정하였다. 각 펩티드 농도에서 생성된 cAMP의 양 (pmol)을 플롯팅하고 프리즘 소프트웨어를 사용하여 비선형 회귀법으로 분석하여 각 펩티드에 대한 EC50을 결정하였다. 본 발명의 폴리펩티드에 대한 글루카곤 수용체 활성화에 대한 평균 상대 효능 값 (50% 반응 (EC50)에서의 글루카곤 농도 대 폴리펩티드 농도의 비 x 100, 최소 3회 시험하여 결정함)은 <5%였다. 유도된 최대 활성의 범위는 천연 펩티드 글루카곤의 28.3% 내지 71.3%였다 (최소 3회 시험하여 결정함).
글루카곤 활성을 억제하는 혼성 펩티드의 능력은 다음과 같이 측정하였다: 5% CO2/95% O2 환경에서 37 ℃에서 10분 동안 평형화한 후에, 10 μM 펩티드를 세포에 첨가하고, 바로 이어서 최대하 농도의 글루카곤을 15분 동안 첨가하였다. 세포를 용해하고 상기한 바와 같이 cAMP를 측정하였다.
비자극된 간세포에서 생성된 cAMP의 양을 각 데이타 점에서 뺀 후에, 억제율을 다음과 같이 계산하였다: 억제율은 최대하 글루카곤 만의 존재하에 생성된 cAMP의 양 - 최대하 글루카곤 및 10 μM 펩티드 존재하에 생성된 cAMP의 양을 최대하 글루카곤 만의 존재하에 생성된 cAMP의 양으로 나누고 100을 곱한 것이다. 표 2에 기재된 폴리펩티드에 의한 글루카곤 활성의 평균 억제율은 11.3% 내지 59%였다 (최소 3회 시험하여 결정함). 표 4 참조.
실시예 12
래트 간세포로부터의 포도당 방출의 측정
래트 간세포로부터의 포도당 방출에 의해 측정된 글루카곤 매개된 포도당 생성의 억제율은 일반적으로 약 20% 내지 약 100%이다 (즉, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100%).
본 발명의 일부 폴리펩티드에 의한 글루카곤 매개된 포도당 생성의 억제는 다음과 같이 측정하였다: 래트 간세포를 편평 바닥 96 웰 플레이트에 첨가하고 (2x105/100 ㎕/웰) 95% O2/5% CO2 흐름 하에 일정하게 진탕시키며 37 ℃ 인큐베이터에서 10분 동안 예비 인큐베이션하였다. 간세포를 펩티드 존재 또는 부재하에 글루카곤을 첨가한 후에 추가로 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 15% 과염소산으로 용해하고 플레이트를 4 ℃에서 2600 rpm으로 15분 동안 스피닝시켰다. 상등액을 1M Tris-HCl (pH 8.0): 2.5 N KOH (45:55)로 중화시키고 다시 스피닝시켰다. 결과 상등액을 헥소키나제 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제로 포도당에 대해 분석하고 (Methods of Enzymatic Analysis, H.U. Bermeyer, Ed., Academic Press), fMAX 플레이트 리더 상에서 A340을 읽었다 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
비자극된 간세포에서 생성된 포도당의 양을 각 데이타 점에서 뺀 후에 포도당 배출을 계산하고 억제율을 계산하였다. 억제율은 1 nM 글루카곤 만의 존재하에 생성된 포도당의 양 - 1 nM 글루카곤 및 100 nM 펩티드 존재하에 생성된 포도당의 양을 1 nM 글루카곤 만의 존재하에 생성된 포도당의 양으로 나누고 100을 곱한 것이다. 서열 번호: 6에 나타낸 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드는 글루카곤 매개된 포도당 생성을 47% 억제하였다 (최소 3회 시험하여 결정함). 표 2 참조.
실시예 13
관류시킨 래트 소도에 의한 인슐린 분비의 측정
이 분석에서 관류시킨 래트 소도에 의한 인슐린 분비의 증가는 1.5배 이상의 증가이다. 본 발명의 폴리펩티드의 GLP-1 수용체 작용제 성분은 관류시킨 소도로부터의 인슐린 분비를 1.5배 내지 약 10배까지 증가시킨다 (즉, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0 또는 10배).
본 발명의 일부 펩티드에 의해 매개된 관류시킨 래트 소도의 인슐린 분비는 다음과 같이 측정하였다: 이들 폴리펩티드에 의해 자극된 인슐린 방출의 2가지 모드의 반응은 소도 관류에 의해 시험하였다. 50 소도를 주변관류 챔버에 두고 37 ℃에서 3 mM 포도당을 함유하는 HEPES-KRB로 주변관류하였다. 60분 후에, 소도를 펩티드 (50 nM) 존재 또는 부재하에 8 mM 포도당을 함유하는 완충액에 노출시키고 추가로 30분 동안 관류하였다. 주변관류 통과된 분획을 인슐린 측정을 위해 1 또는 5분 간격으로 모았다. 인슐린을 ELISA 키트 (Alpco Diagnostics, Windham, NH)를 사용하여 측정하였다. 50 nM의 농도에서, 서열 번호: 6에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 관류시킨 소도로부터의 인슐린 분비를 약 2배 증가시켰으며, 이는 50 nM GLP-1에 의해 얻어진 것과 동등한 것이다.
실시예 14
분산시킨 래트 소도 세포로부터의 인슐린 분비
이 분석에서 분산시킨 래트 소도 세포로부터의 인슐린 분비의 증가는 1.5배 이상의 증가이다. 본 발명의 폴리펩티드의 GLP-1 수용체 작용제 성분은 분산시킨 소도 세포로부터의 인슐린 분비를 1.5배 내지 약 10배까지 증가시킨다 (즉, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0 또는 10배).
본 발명의 다수의 펩티드에 의해 매개된 분산시킨 래트 소도 세포의 인슐린 분비는 다음과 같이 측정하였다: 랑게르한스 소도를 콜라게나제를 사용한 분해 과정을 거쳐 SD 래트 (200-250 g)로부터 분리하였다. 분산시킨 소도 세포를 트립신 처리하여 제조하고, 96 V-바닥 플레이트에 접종하고 펠릿화하였다. 세포를 배지에서 밤새 배양하였다. 배지를 흡인하고 세포를 3 mM 포도당을 함유하는 크렙스-링거-HEPES 완충액과 함께 37 ℃에서 30분 동안 예비 인큐베이션하였다. 예비 인큐베이션 완충액을 제거하고, 세포를 펩티드 존재 및 부재하에 적절한 농도 (예를 들면, 8 mM)의 포도당을 함유하는 크렙스-링거-HEPES 완충액으로 37 ℃에서 적절한 시간 동안 자극하였다. 일부 연구에서는, 적절한 농도의 GLP-1을 또한 포함시켰다. 상등액의 일부를 제거하고 그의 인슐린 함량을 SPA에 의해 측정하였다. 결과는 대조군에 대한 배수 (FOC)로서 표시하였다. 50 nM의 농도에서, 서열 번호: 27에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 분산시킨 소도 세포로부터의 인슐린 분비를 약 3배 증가시켰다. 표 2 참조.
실시예 15
사육한 위스타 래트에서의 글루카곤 자극된 포도당 생성의 측정
이 분석에서 글루카곤 자극된 포도당 생성의 억제는 20% 이상의 억제이다. 본 발명의 폴리펩티드의 글루카곤 수용체 길항제 성분은 사육한 위스타 래트에서 글루카곤 자극된 포도당 생성에 의해 측정된 바와 같이 글루카곤 매개된 혈당 상승을 20% 내지 약 100% 억제한다 (즉, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100%).
본 발명의 일부 폴리펩티드에 의한, 사육한 위스타 래트에서의 글루카곤 자극된 포도당 생성은 다음과 같이 측정하였다: 숫컷 위스타 래트를 이소플루란 가스로 간단하게 마취시키고, 혈당측정기로 꼬리 채혈하여 혈당을 측정하고, 비히클 (0.9% 염수 + 1% 인간 알부민), 0.29 nmol/㎏의 글루카곤, 1 nmol/㎏의 본 발명의 폴리펩티드 또는 글루카곤 + 본 발명의 폴리펩티드를 꼬리 정맥내로 주사하였다. 마취제를 제거하고 의식이 있는 래트를 10, 20 및 30분 후에 다시 꼬리 채혈하였다.
기저 포도당 농도 (dAUC)를 뺀 후의 포도당 곡선 아래의 면적을 분석하여 포도당 억제를 확인하였다. 억제율은 0.3 nmol/㎏ 글루카곤 만에 의해 생성된 포도당의 양 - 1 nmol/㎏의 혼성 펩티드 존재하에 0.3 nmol/㎏의 글루카곤에 의해 생성된 포도당의 양을 0.3 nmol/㎏ 글루카곤 만에 의해 생성된 포도당의 양으로 나누고 100을 곱한 것이다.
글루카곤 만으로 혈당 수치를 상승시킨 반면, 본 발명의 폴리펩티드 만으로는 혈당 수치에 영향을 주지 않았다. 서열 번호: 6에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 글루카곤 매개된 혈당 상승을 63% 억제하였다. 표 2 참조.
실시예 16
사육한 Balb/C 마우스에서의 글루카곤 자극된 포도당 생성의 측정
이 분석에서 포도당 생성의 억제는 20% 이상의 억제이다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드의 글루카곤 수용체 길항제 성분은 사육한 Balb/C 마우스에서의 글루카곤 자극된 포도당 생성에 의해 측정된 바와 같이 마우스에서의 글루카곤 매개된 혈당 상승을 약 20% 내지 약 100% 억제한다 (즉, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100%).
본 발명의 일부 폴리펩티드에 의한, 사육한 Balb/C 마우스에서의 글루카곤 매개된 포도당 생성은 다음과 같이 측정하였다: 사육한 숫컷 Balb/C 마우스에 글루카곤 챌린지 17시간 전에 비히클 (0.9% 염수 + 1% 인간 알부민) 또는 100 ㎍/㎏의 유도체화된 폴리펩티드를 피하 주사하였다. 다음날, 마우스를 10 ㎍/㎏의 글루카곤 또는 비히클을 꼬리 정맥에 정맥내 주사하기 전에 2시간 동안 절식시켰다. 글루카곤 주사하기 직전에 혈당측정기로 마우스를 꼬리 채혈하여 혈당을 측정하고 15분 후에 다시 측정하였다.
15분에 동안의 포도당의 변화를 각 마우스에 대해 계산하였다. 그후에, 비히클 처리군에서의 포도당의 평균 변화를 처리군의 각 마우스에 대한 포도당의 변화에서 빼서 글루카곤에 의한 포도당의 변화를 알게 되었다. 억제율은 10 ㎍/㎏의 글루카곤 만에 의해 생성된 포도당의 양 - 100 ㎍/㎏ 혼성 펩티드 존재하에 10 ㎍/㎏의 글루카곤에 의해 생성된 포도당의 양을 10 ㎍/㎏의 글루카곤 만에 의해 생성된 포도당의 양으로 나누고 100을 곱한 것이다. 표 3 참조.
포도당 (㎎/dl)
군 0분 15분 델타(15-0) -비히클 델타 10 ㎍/㎏글루카곤의 % 억제율 %
비히클 92 108 16
10 ㎍/㎏ 글루카곤 95 195 100 84 100
10 ㎍/㎏ 글루카곤 + 100 ㎍ 폴리펩티드 (서열 번호: 27) 75 150 75 59 69 31
실시예 17
절식시킨 위스타 래트에서의 생체내 내당능 시험 (IVGTT) 동안의 혈장 인슐린 수치 증가의 측정
이 분석에서 혈장 인슐린 수치의 증가는 약 2배 이상의 증가이다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드의 GLP-1 수용체 작용제 성분은 절식시킨 위스타 래트에서의 생체내 내당능 시험 중의 혈장 인슐린 수치 증가에 의해 측정된 바와 같이 래트에서의 인슐린 분비를 약 2배 내지 약 5배, 더욱 바람직하게는 약 2배 내지 약 10배, 더욱 더 바람직하게는 약 2배 내지 약 20배 증가시킨다 (즉, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20배).
본 발명의 일부 폴리펩티드에 의한, 절식시킨 위스타 래트에서의 생체내 내당능 시험 중의 혈장 인슐린 수치는 다음과 같이 측정하였다: 숫컷 위스타 래트를 밤새 절식시키고, 이소플루란 가스로 마취시켰다. 래트에게 0.4 g/㎏의 포도당 + 비히클 (0.9% 염수 + 1% 알부민) 또는 1 nmol/㎏의 GLP-1 (양성 대조군) 또는 1 nmol/㎏의 본 발명의 폴리펩티드를 꼬리 정맥내 주사하였다. 래트를 1분 후에 눈에서 채혈하여 혈장을 ELISA 키트 (Alpco Diagnostics, Windham, NH)를 사용하여 인슐린 분석하였다. 1 nmol/㎏의 농도에서, 서열 번호: 6에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 인슐린 분비를 3-4배 촉진시켰으며, 이는 1 nmol/㎏ GLP-1에 의해 얻어진 것과 동등한 것이다. 표 2 참조.
실시예 18
래트 또는 마우스에서의 복강내 내당능 시험 (IPGTT)에 대한 본 발명의 펩티드의 효과
이 분석에 의해 측정된 바와 같은 혈당 수치 감소는 약 10% 이상의 감소이다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드의 GLP-1 수용체 작용제 성분은 래트 또는 마우스에서의 복강내 내당능 시험에 의해 측정된 바와 같이 래트 또는 마우스에서의 혈당 수치를 약 10% 내지 약 60%, 더욱 바람직하게는 약 10% 내지 약 80%, 더욱 더 바람직하게는 약 10% 내지 약 100% 감소시킨다 (즉, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100%).
본 발명의 일부 폴리펩티드에 의한, 래트 또는 마우스에서의 복강내 내당능 시험 동안의 혈당 수치는 다음과 같이 측정하였다: 피하 투여된 본 발명의 폴리펩티드의 생체내 활성을 래트 또는 마우스에서 시험하였다. 밤새 절식시킨 래트 또는 마우스에게 대조 시약 또는 펩티드 (100 ㎍/㎏)를 피하 주사하였다. 펩티드 투여 전 또는 유도체화된 펩티드의 투여 3시간 또는 17시간 후에 기저 혈당을 측정하고, 래트 또는 마우스에게 2 g/㎏의 포도당을 복강내 투여하였다. 혈당을 래트에서 15, 30 및 60분 후에 또는 마우스에서 30 및 60분 후에 다시 측정하였다.
본 발명의 펩티드는 IPGTT 이후에 비히클에 비해 혈당 수치를 상당히, 포도당 AUC를 13%-54% 감소시켰다. 이는 펩티드가 포도당을 저하시키는 활성을 가지며 생체내에서 장기간의 반감기를 가짐을 입증하는 것이다. GLP-1은 생체내에서 매우 짧은 반감기 (< 10분)를 갖는다. 펩티드 투여한 지 3시간 이후에 혈당을 낮추는 본 발명의 펩티드의 능력은 펩티드가 이 시점에서 순환되며 따라서 GLP-1에 비해 장기간의 반감기를 가짐을 명확히 나타내는 것이다.
실시예 19
펩티드 PEG화
PEG화는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 그러나, 이 경우에 PEG화는 독특한 시스테인 돌연변이를 펩티드에 도입하고, 이어서 펩티드의 술프히드릴과 메톡시-PEG-말레이미드 시약 (Inhale/Shearwater)의 말레이미드기 사이의 안정한 티오에테르 결합을 통해 시스테인을 PEG화함으로써 행하였다. 펩티드의 C-말단에 독특한 시스테인을 도입하여 PEG화에 의한 가능한 활성의 감소를 최소화하는 것이 바람직하다.
상세하게는, 2배 몰 과량의 mPEG-mal (MW 22kD 및 43 kD) 시약을 1 ㎎의 펩티드 (예를 들면, 펩티드의 C-말단에서 시스테인 돌연변이를 가진 서열 번호:25)에 첨가하고 pH 6에서 반응 완충액 (0.1M Na 포스페이트/0.1M NaCl/0.1M EDTA)에 용해시켰다. 실온에서 0.5시간 후에, 반응을 2배 몰 과량의 DTT 또는 자유 시스테인을 mPEG-mal에 첨가하여 중지시켰다. 펩티드-PEG-mal 반응 혼합물을 양이온 교환 컬럼에 넣어 잔류 PEG 시약을 제거하고, 이어서 겔 여과 컬럼에 넣어 잔류 자유 펩티드를 제거하였다. PEG화 부위의 순도, 질량 및 수를 SDS-PAGE 및 MALDI-TOF 질량 분광분석법에 의해 측정하였다. 더 작은 PEG (예를 들면, 선형 22 kD PEG)에 의한 PEG화는 펩티드의 활성을 덜 감소시키는 반면, 더 큰 PEG (예를 들면, 분지된 43 kD PEG)에 의한 PEG화는 활성을 더 많이 감소시킬 것이다. 그러나, 더 큰 PEG는 매주 1회의 주사가 가능할 수 있도록 혈장 반감기를 증가시킬 것이다 (Harris, et al., PEGylation: A Novel Process for Modifying Pharmacokinetics, Clin. Pharmacokinet 40:539-551, 2001).
실시예 20
GLP-1 수용체 작용제 및 글루카곤 수용체 길항제 폴리펩티드의 상대 효능
표 4에 기재된 폴리펩티드에 대한 GLP-1 결합 (IC50 값)을 실시예 8에서와 같이 측정하였다. 상대 효능 값 및 GLP-1 활성 %는 실시예 10에 기재된 바와 같이 계산하였다. 래트 또는 마우스에게 100 ㎍/㎏의 펩티드를 투여하고 투여후 3시간에 포도당 수치의 감소를 실시예 18에 기재된 바와 같이 복강내 내당능 시험 (IPGTT)에 의해 측정하였다. 표 4 참조.
표 4에 기재된 폴리펩티드에 대한 간 막 결합 (IC50 값)을 실시예 9에서와 같이 측정하였다. 글루카곤 자극된 cAMP 증가의 억제율은 실시예 11에 기재된 바와 같이 측정하였다. 래트 또는 마우스에게 100 ㎍/㎏의 펩티드를 투여하고 투여후 17시간에 포도당 수치를 실시예 15 및 16의 방법에 의해 측정하고 표 4에 나타내었다. 본 발명의 폴리펩티드는 생체내에서 GLP-1 수용체 작용제 및 글루카곤 수용체 길항제로서 기능한다.
GLP1 글루카곤
펩티드 RINIC50(nM) 상대효능(%) % GPL1최대 IpGTT AUC생체내감소율(%)a 간IC50(nM) 글루카곤자극된cAMP 증가 억제율% 글루카곤자극된 혈당생체내 감소율(%)b
글루카곤 1.8
GLP-1 0.4 100 100
G1 6 6.9 112.1 6.6
G5 0.5 69.9 109.4 243.1
G27 2.2 13.4 98.1 69.3 31
G51 8.2 58.1 91.2 154.1 35.2
G55 9.8 18.6 115.9 139.2 32.1
G56 6.6 37.2 114.8 125.3 28.6
G57 14.7 18.3 132.4 177.5 18.4
G58 6.9 76.1 99.0 163.5 32.6
G59 2.1 22.7 101.7 97.5 41.1
G60 13.8 22.3 95.7 682 21.8
G61 10.6 12.1 96.0 232 45.2
G71 5.8 4.3 93.3 25.6 11.3
G74 4.4 8.4 88.7 21.7 23.7
G75 7.7 6.6 86.1 54.0 17.1
G76 10.2 7.7 85 59.1 23.0
G77 8.9 9.5 92.1 61.1 18.6
G277 ND 1.8 93.7 46 65.5
G82 8.1 29.9 97.1 33.6 30.2
G83 3.2 29.9 89.4 28.6 24.7
G84 1.4 61.8 113.9 11.7 25.2
G85 1.5 64.5 95.8 16.1 27.9
G185 4.5 13.0 103.9 48 32
G2185 56.1 6.2 112.7 44 347
G4185 248 0.7 98.3 36 547 31
G87 98.6 6.1 100.4 13 620 59
G88 109.0 2.3 118.3 16 350
G90 25.4 0.8 83.5 13 726
G182 12.6 1.4 104.4 14 220
G183 158.7 0.6 90.5 27 663
a = 100 ㎍/㎏ 펩티드 투여 3 시간 후 마우스에서의 ipGTT b = 100 ㎍/㎏ 펩티드 투여 17 시간 후 마우스에서의 글루카곤 챌린지 ND = 측정되지 않음
<110> Bayer Pharmaceuticals Corporation Pan, Clark Whelan, James Clairmont, Kevin B. <120> Peptides Acting as Both GLP-1 Receptor Agonists and Glucagon Receptor Antagonists and Their Pharmacological Methods of Use <130> MSB-7288-PCT <140> PCT/US02/31693 <141> 2002-10-04 <150> US 60/327,730 <151> 2001-10-05 <160> 34 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr 20 25 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 3 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 4 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 5 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 5 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 6 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 6 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Arg Arg Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 7 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Arg Arg Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 8 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 8 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Arg Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Arg Arg Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 9 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 9 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Ala Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Arg Arg Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 10 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 10 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Ala Arg Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 11 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Lys Lys Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 12 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Arg Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Lys Lys Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 13 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Ala Lys Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 14 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Arg Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Ala Lys Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 15 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Arg Arg Ala Cys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 16 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Arg Arg Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Cys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 17 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Arg Arg Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Cys Arg Gly 20 25 30 <210> 18 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Arg Arg Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Cys Gly 20 25 30 <210> 19 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Arg Arg Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Cys 20 25 30 <210> 20 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> PEGylation <400> 20 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Arg Arg Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Cys 20 25 30 <210> 21 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Arg Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Arg Arg Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 22 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Arg Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Arg Arg Ala Arg Glu Phe Ile Lys Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 23 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Arg Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Arg Arg Ala Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 24 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Arg Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Arg Arg Ala Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly Lys 20 25 30 <210> 25 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Arg Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Arg Arg Ala Arg Glu Phe Ile Lys Trp Leu Val Arg Gly Arg Cys 20 25 30 <210> 26 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> PEGylation <400> 26 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Arg Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Arg Arg Ala Arg Glu Phe Ile Lys Trp Leu Val Arg Gly Arg Cys 20 25 30 <210> 27 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> PEGylation <400> 27 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Arg Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Arg Arg Ala Arg Glu Phe Ile Lys Trp Leu Val Arg Gly Arg Cys 20 25 30 <210> 28 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 28 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Arg Arg Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 29 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> LIPID <222> (31)..(31) <223> PALMITATE <400> 29 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Arg Arg Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Lys 20 25 30 <210> 30 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> LIPID <222> (24)..(24) <223> PALMITATE <400> 30 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Arg Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Arg Arg Ala Arg Glu Phe Ile Lys Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 31 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> LIPID <222> (32)..(32) <223> PALMITATE <400> 31 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Arg Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Arg Arg Ala Arg Glu Phe Ile Lys Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly Lys 20 25 30 <210> 32 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> LIPID <222> (24)..(24) <223> PALMITATE <400> 32 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Arg Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Arg Arg Ala Lys Glu Phe Ile Lys Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 33 <211> 35 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Ile Glu Gly Arg His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Lys 1 5 10 15 Tyr Leu Asp Ala Arg Arg Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys 20 25 30 Gly Arg Gly 35 <210> 34 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(12) <223> X11 = R, G, S, A, K, or T X12 = K, N, R, A, S, H, or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(18) <223> X16 = A, F, S, W, T, H, K, R, V, I, L, M, N, Q, G, or Y X17 = R, A, L, M, V, Q, K, F, I, W, N, D, E, H, S, T,G, or Y X18 = K, R, F, I,L, Y, V,M, A, G, or H <400> 34 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Xaa Xaa Tyr Leu Asp Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30

Claims (17)

  1. 서열 번호 6 내지 32, 및 그의 기능적으로 동등한 단편, 유도체 및 변이체로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드.
  2. 제1항의 폴리펩티드 서열, 또는 그의 변성 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  3. 제2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  4. 제3항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  5. a) 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에서 제4항의 숙주 세포를 배양하고;
    b) 숙주 세포 배양물로부터 폴리펩티드를 회수하는
    것을 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법.
  6. 제1항의 폴리펩티드와 제약학상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  7. 제2항의 폴리뉴클레오티드와 치료학적으로 유효한 유전자 요법 벡터를 포함하는 유전자 요법 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열 번호: 25로 표시되는 폴리펩티드.
  9. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열 번호: 26으로 표시되는 폴리펩티드.
  10. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열 번호: 27로 표시되는 폴리펩티드.
  11. 제1항의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 정제된 항체.
  12. GLP-1 수용체 작용제 및 글루카곤 수용체 길항제인 펩티드를 치료 유효량으로 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 대사 장애를 치료하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 펩티드가 서열 번호: 6 내지 32, 및 그의 기능적으로 동등한 단편, 유도체 및 변이체로 이루어진 군에서 선택된 방법.
  14. 제13항에 있어서, 펩티드가 서열 번호: 25, 서열 번호: 26 및 서열 번호: 27로 이루어진 군에서 선택된 방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 대사 장애가 2형 당뇨병인 방법.
  16. 제12항에 있어서, 상기 치료 유효량이 약 0.1 ㎍/㎏ 내지 약 1 ㎎/㎏인 방법.
  17. 제12항에 있어서, 상기 대사 장애가 내당능 장애의 전-당뇨병 상태인 방법.
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