CN1564828A - 作为glp-1受体激动剂和胰高血糖素拮抗剂的肽及其在药学上的使用方法 - Google Patents
作为glp-1受体激动剂和胰高血糖素拮抗剂的肽及其在药学上的使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1564828A CN1564828A CNA02819716XA CN02819716A CN1564828A CN 1564828 A CN1564828 A CN 1564828A CN A02819716X A CNA02819716X A CN A02819716XA CN 02819716 A CN02819716 A CN 02819716A CN 1564828 A CN1564828 A CN 1564828A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polypeptide
- ala
- peptide
- seq
- arg
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 264
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 184
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 57
- 229940122904 Glucagon receptor antagonist Drugs 0.000 title description 19
- 229940089838 Glucagon-like peptide 1 receptor agonist Drugs 0.000 title 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 title 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 179
- 108010086246 Glucagon-Like Peptide-1 Receptor Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims abstract description 13
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 claims description 69
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 claims description 69
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 claims description 67
- 102000007446 Glucagon-Like Peptide-1 Receptor Human genes 0.000 claims description 29
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 26
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 23
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 17
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 17
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 17
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 8
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 5
- 201000009104 prediabetes syndrome Diseases 0.000 claims description 4
- 206010018429 Glucose tolerance impaired Diseases 0.000 claims description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 3
- 208000001280 Prediabetic State Diseases 0.000 claims description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 claims 1
- 208000002705 Glucose Intolerance Diseases 0.000 claims 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 claims 1
- 108010063919 Glucagon Receptors Proteins 0.000 abstract description 13
- 102100040890 Glucagon receptor Human genes 0.000 abstract description 13
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 abstract description 4
- 102100032882 Glucagon-like peptide 1 receptor Human genes 0.000 abstract 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 abstract 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 91
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 79
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 78
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 78
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 71
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 71
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 70
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 69
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 68
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 68
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 description 67
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 40
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 40
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 39
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 38
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 38
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 36
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 35
- 102100040918 Pro-glucagon Human genes 0.000 description 34
- DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N Glucagon-like peptide 1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N 0.000 description 33
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 101710198884 GATA-type zinc finger protein 1 Proteins 0.000 description 31
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 28
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 28
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 28
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 27
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 27
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 25
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 25
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 25
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 23
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 23
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 23
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 21
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 17
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 16
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 15
- 230000008859 change Effects 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 15
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 14
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 14
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 13
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 13
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 13
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 12
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 12
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 11
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 11
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 11
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 11
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 9
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 9
- 230000002218 hypoglycaemic effect Effects 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 9
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 8
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 8
- 238000007446 glucose tolerance test Methods 0.000 description 8
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 8
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 8
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 8
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 8
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 101800004295 Glucagon-like peptide 1(7-36) Proteins 0.000 description 7
- 208000013016 Hypoglycemia Diseases 0.000 description 7
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 7
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 7
- 229940122199 Insulin secretagogue Drugs 0.000 description 6
- YASAKCUCGLMORW-UHFFFAOYSA-N Rosiglitazone Chemical compound C=1C=CC=NC=1N(C)CCOC(C=C1)=CC=C1CC1SC(=O)NC1=O YASAKCUCGLMORW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 229940062310 avandia Drugs 0.000 description 6
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 6
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 230000008676 import Effects 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 6
- OETHQSJEHLVLGH-UHFFFAOYSA-N metformin hydrochloride Chemical compound Cl.CN(C)C(=N)N=C(N)N OETHQSJEHLVLGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N oxalonitrile Chemical compound N#CC#N JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 6
- SUFUKZSWUHZXAV-BTJKTKAUSA-N rosiglitazone maleate Chemical compound [H+].[H+].[O-]C(=O)\C=C/C([O-])=O.C=1C=CC=NC=1N(C)CCOC(C=C1)=CC=C1CC1SC(=O)NC1=O SUFUKZSWUHZXAV-BTJKTKAUSA-N 0.000 description 6
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 6
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 6
- NGJOFQZEYQGZMB-KTKZVXAJSA-N (4S)-5-[[2-[[(2S,3R)-1-[[(2S)-1-[[(2S,3R)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[2-[[(2S)-5-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S,3S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[2-[[(1S)-4-carbamimidamido-1-carboxybutyl]amino]-2-oxoethyl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-4-carboxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1,5-dioxopentan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]amino]-4-carboxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-3-carboxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]amino]-4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]propanoyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 NGJOFQZEYQGZMB-KTKZVXAJSA-N 0.000 description 5
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 206010056997 Impaired fasting glucose Diseases 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 5
- 125000005313 fatty acid group Chemical group 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 229940095884 glucophage Drugs 0.000 description 5
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- XZWYZXLIPXDOLR-UHFFFAOYSA-N metformin hydrochloride Natural products CN(C)C(=N)NC(N)=N XZWYZXLIPXDOLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 4
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 4
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 4
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 229940122355 Insulin sensitizer Drugs 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 239000002269 analeptic agent Substances 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 4
- -1 polyoxyethylene Polymers 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 229910052727 yttrium Inorganic materials 0.000 description 4
- 229940077274 Alpha glucosidase inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 3
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 239000003888 alpha glucosidase inhibitor Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 3
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- OELFLUMRDSZNSF-BRWVUGGUSA-N nateglinide Chemical compound C1C[C@@H](C(C)C)CC[C@@H]1C(=O)N[C@@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 OELFLUMRDSZNSF-BRWVUGGUSA-N 0.000 description 3
- 229960000698 nateglinide Drugs 0.000 description 3
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 3
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 3
- 229960004586 rosiglitazone Drugs 0.000 description 3
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 3
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 3
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 description 2
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 description 2
- 208000002267 Anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis Diseases 0.000 description 2
- 108010001478 Bacitracin Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 2
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 2
- 101800004266 Glucagon-like peptide 1(7-37) Proteins 0.000 description 2
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091016366 Histone-lysine N-methyltransferase EHMT1 Proteins 0.000 description 2
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 2
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 2
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- 102100037505 Secretin Human genes 0.000 description 2
- 108010086019 Secretin Proteins 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006035 Tryptophane Substances 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 229940062328 actos Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 229960003071 bacitracin Drugs 0.000 description 2
- 229930184125 bacitracin Natural products 0.000 description 2
- CLKOFPXJLQSYAH-ABRJDSQDSA-N bacitracin A Chemical compound C1SC([C@@H](N)[C@@H](C)CC)=N[C@@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]1C(=O)N[C@H](CCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2N=CNC=2)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCCCC1 CLKOFPXJLQSYAH-ABRJDSQDSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- 238000002742 combinatorial mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 2
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 2
- 210000002767 hepatic artery Anatomy 0.000 description 2
- 231100000304 hepatotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000007056 liver toxicity Effects 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HYAFETHFCAUJAY-UHFFFAOYSA-N pioglitazone Chemical compound N1=CC(CC)=CC=C1CCOC(C=C1)=CC=C1CC1C(=O)NC(=O)S1 HYAFETHFCAUJAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003240 portal vein Anatomy 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 2
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 229960002101 secretin Drugs 0.000 description 2
- OWMZNFCDEHGFEP-NFBCVYDUSA-N secretin human Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(N)=O)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 OWMZNFCDEHGFEP-NFBCVYDUSA-N 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- WVAKABMNNSMCDK-UHFFFAOYSA-N sulfacarbamide Chemical compound NC(=O)NS(=O)(=O)C1=CC=C(N)C=C1 WVAKABMNNSMCDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229950010053 sulfacarbamide Drugs 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- XUFXOAAUWZOOIT-SXARVLRPSA-N (2R,3R,4R,5S,6R)-5-[[(2R,3R,4R,5S,6R)-5-[[(2R,3R,4S,5S,6R)-3,4-dihydroxy-6-methyl-5-[[(1S,4R,5S,6S)-4,5,6-trihydroxy-3-(hydroxymethyl)-1-cyclohex-2-enyl]amino]-2-oxanyl]oxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-2-oxanyl]oxy]-6-(hydroxymethyl)oxane-2,3,4-triol Chemical compound O([C@H]1O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O)[C@H]1O)N[C@@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)C(CO)=C1)O)C)[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O XUFXOAAUWZOOIT-SXARVLRPSA-N 0.000 description 1
- NWXMGUDVXFXRIG-WESIUVDSSA-N (4s,4as,5as,6s,12ar)-4-(dimethylamino)-1,6,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]4(O)C(=O)C3=C(O)C2=C1O NWXMGUDVXFXRIG-WESIUVDSSA-N 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- WIHIUTUAHOZVLE-UHFFFAOYSA-N 1,3-diethoxypropan-2-ol Chemical compound CCOCC(O)COCC WIHIUTUAHOZVLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VDTWKXAPIQBOMO-UHFFFAOYSA-N 1-[2-(4-fluorophenyl)-4,6-di(propan-2-yl)-3-propylphenyl]ethanol Chemical compound CCCC1=C(C(C)C)C=C(C(C)C)C(C(C)O)=C1C1=CC=C(F)C=C1 VDTWKXAPIQBOMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KKAJSJJFBSOMGS-UHFFFAOYSA-N 3,6-diamino-10-methylacridinium chloride Chemical compound [Cl-].C1=C(N)C=C2[N+](C)=C(C=C(N)C=C3)C3=CC2=C1 KKAJSJJFBSOMGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 230000005730 ADP ribosylation Effects 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101100230376 Acetivibrio thermocellus (strain ATCC 27405 / DSM 1237 / JCM 9322 / NBRC 103400 / NCIMB 10682 / NRRL B-4536 / VPI 7372) celI gene Proteins 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102100022900 Actin, cytoplasmic 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000713826 Avian leukosis virus Species 0.000 description 1
- XNCOSPRUTUOJCJ-UHFFFAOYSA-N Biguanide Chemical compound NC(N)=NC(N)=N XNCOSPRUTUOJCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010005042 Bladder fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 101150029409 CFTR gene Proteins 0.000 description 1
- 101100337060 Caenorhabditis elegans glp-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000345998 Calamus manan Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108091062157 Cis-regulatory element Proteins 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 206010011831 Cytomegalovirus infection Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108050009160 DNA polymerase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000006419 Glucagon-Like Peptide Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010083749 Glucagon-Like Peptide Receptors Proteins 0.000 description 1
- 101800000224 Glucagon-like peptide 1 Proteins 0.000 description 1
- 102400000325 Glucagon-like peptide 1(7-36) Human genes 0.000 description 1
- 102400000324 Glucagon-like peptide 1(7-37) Human genes 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 208000000857 Hepatic Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010019663 Hepatic failure Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 1
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000581650 Ivesia Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010052014 Liberase Proteins 0.000 description 1
- IBAQFPQHRJAVAV-ULAWRXDQSA-N Miglitol Chemical compound OCCN1C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1CO IBAQFPQHRJAVAV-ULAWRXDQSA-N 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- XUYPXLNMDZIRQH-LURJTMIESA-N N-acetyl-L-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(C)=O XUYPXLNMDZIRQH-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 241000256259 Noctuidae Species 0.000 description 1
- 241001597008 Nomeidae Species 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102000003728 Peroxisome Proliferator-Activated Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000029 Peroxisome Proliferator-Activated Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 102000004257 Potassium Channel Human genes 0.000 description 1
- 241001415846 Procellariidae Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241001655322 Streptomycetales Species 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150006914 TRP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108700007696 Tetrahydrofolate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 description 1
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 description 1
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 1
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 1
- FZNCGRZWXLXZSZ-CIQUZCHMSA-N Voglibose Chemical compound OCC(CO)N[C@H]1C[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O FZNCGRZWXLXZSZ-CIQUZCHMSA-N 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 1
- 235000021028 berry Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 description 1
- 201000000053 blastoma Diseases 0.000 description 1
- 210000003995 blood forming stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000000424 bronchial epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000011284 combination treatment Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000011461 current therapy Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000017858 demethylation Effects 0.000 description 1
- 238000010520 demethylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 230000005059 dormancy Effects 0.000 description 1
- 201000006549 dyspepsia Diseases 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 201000008184 embryoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003725 endotheliocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 230000022244 formylation Effects 0.000 description 1
- 238000006170 formylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 239000003877 glucagon like peptide 1 receptor agonist Substances 0.000 description 1
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 208000009429 hemophilia B Diseases 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001841 imino group Chemical group [H]N=* 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000011221 initial treatment Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- ICIWUVCWSCSTAQ-UHFFFAOYSA-M iodate Chemical compound [O-]I(=O)=O ICIWUVCWSCSTAQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 230000006122 isoprenylation Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 208000006443 lactic acidosis Diseases 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- GRVDJDISBSALJP-UHFFFAOYSA-N methyloxidanyl Chemical group [O]C GRVDJDISBSALJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 229960001110 miglitol Drugs 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000007659 motor function Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000007498 myristoylation Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229940067626 phosphatidylinositols Drugs 0.000 description 1
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920005990 polystyrene resin Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000000291 postprandial effect Effects 0.000 description 1
- 108020001213 potassium channel Proteins 0.000 description 1
- 229940095885 precose Drugs 0.000 description 1
- GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N preproglucagon 78-108 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 229940079889 pyrrolidonecarboxylic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 1
- 229910052761 rare earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012950 rattan cane Nutrition 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 231100000489 sensitizer Toxicity 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- AWUCVROLDVIAJX-GSVOUGTGSA-N sn-glycerol 3-phosphate Chemical compound OC[C@@H](O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- TXBNDGDMWKVRQW-UHFFFAOYSA-M sodium;2-[[1,3-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)propan-2-yl]azaniumyl]acetate;dodecyl sulfate Chemical compound [Na+].OCC(CO)(CO)NCC(O)=O.CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O TXBNDGDMWKVRQW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- GOLXNESZZPUPJE-UHFFFAOYSA-N spiromesifen Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1C(C(O1)=O)=C(OC(=O)CC(C)(C)C)C11CCCC1 GOLXNESZZPUPJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N sulfonylurea Chemical class OC(=N)N=S(=O)=O YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005987 sulfurization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 150000001467 thiazolidinediones Chemical class 0.000 description 1
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N tri(propan-2-yl)silicon Chemical compound CC(C)[Si](C(C)C)C(C)C ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 1
- GXPHKUHSUJUWKP-UHFFFAOYSA-N troglitazone Chemical compound C1CC=2C(C)=C(O)C(C)=C(C)C=2OC1(C)COC(C=C1)=CC=C1CC1SC(=O)NC1=O GXPHKUHSUJUWKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001641 troglitazone Drugs 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 208000035408 type 1 diabetes mellitus 1 Diseases 0.000 description 1
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 1
- 210000002620 vena cava superior Anatomy 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 229960001729 voglibose Drugs 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/605—Glucagons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Abstract
本发明提供的多肽既可以作为GLP-1受体激动剂,也可作为胰高血糖素拮抗剂。这种多肽可用于治疗2型糖尿病或其他代谢紊乱。
Description
发明领域
本发明涉及一种新近鉴定的多肽及这种多肽在治疗上的应用,它可作为GLP-1受体激动剂,也可作为胰高血糖素拮抗剂。更具体地说,本发明的多肽可用来刺激胰岛素以葡萄糖依赖方式从β胰细胞中释放,同时减少胰高血糖素介导的葡萄糖从肝中的分泌,因此给患有糖尿病、高血糖病、空腹血糖异常、葡萄糖耐受性异常、前驱糖尿病和肥胖症等代谢紊乱的患者提供了一种治疗选择。
背景技术
糖尿病的特征是胰岛素分泌异常,患者体内的其它表现是血糖浓度的升高。根据原在性缺陷可以将糖尿病分成两类:1型糖尿病(胰岛素依赖型糖尿病,IDDM),当患者体内胰腺缺乏产生胰岛素的β细胞时,便会出现1型糖尿病,而2型糖尿病(非胰岛素依赖型糖尿病,NIDDM)则是在患者β细胞胰岛素分泌异常和/或胰岛素作用发生改变时出现。
1型糖尿病目前用胰岛素治疗,而大多数2型糖尿病则用能刺激β细胞作用或增强患者组织对胰岛素敏感性的药剂来治疗。长时间治疗后,几乎有一半2型糖尿病供试者对这些药剂失去应答。因此,必须用胰岛素治疗。目前用来治疗2型糖尿病的药物包括α-葡萄糖苷酶抑制剂(PRECOSE、VOGLIBOSETM和MIGLITOL)、胰岛素致敏剂(例如AvandiaTM、ActosTM和RezulinTM)、胰岛素促泌剂(磺胺尿素类(“SFUs”)和别的作用于K+通道的药剂)和GLUCOPHAGETM(盐酸梅氟明)。
α-葡萄糖苷酶抑制剂。α-葡萄糖苷酶抑制剂通过延迟消化道对葡萄糖的吸收来减少餐后葡萄糖的释放。这些药物是安全的,能治疗轻度到中度的糖尿病患者。然而,已有文献报导了它们的胃肠道副作用,而这种副作用限制了这些药物的有效性。
胰岛素致敏剂。胰岛素致敏剂是一些能增强机体对胰岛素应答的药物。噻唑烷二酮类化合物如梵帝雅(Avandia)TM(罗格列酮)和爱妥糖(Actos)TM能激活过氧化物酶体增殖物活化的受体(PPAR)-γ,并调节一系列未阐明的基因的活性。在应用了梵帝雅TM(罗格列酮)和爱妥糖TM的患者中,肝脏效应(药物诱导肝毒性和肝中酶水平升高)看起来并不是显著的问题。即便如此,还是推荐在治疗的第一年每2个月作一次肝酶检测,以后定期检测。梵帝雅TM(罗格列酮)和爱妥糖TM治疗伴随水滞留、水肿和体重增加。研究表明梵帝雅TM并不能和胰岛素一起使用,因为它会引发心脏衰竭。第一个胰岛素致敏剂药物,爱妥糖TM(屈吉他宗)从市场上撤出,是因为它能引起肝中酶水平升高,并诱导肝毒性。
胰岛素促泌剂。磺胺脲素类(SFUs)和非磺胺脲素类药物:那格列奈(Nateglinide)和Pepaglinide通过ATP-依赖的的钾通道作用,引起不依赖葡萄糖的胰岛素的分泌。这些药物用于伴随轻至中度空腹血糖异常的2型糖尿病的基本治疗。胰岛素促泌剂有局限性,它有可能诱导低血糖、体重增加以及高的原发性和继发性失败率。10%~20%的最初治疗的病人不能显示出显著的治疗效果(原发性失败)。用胰岛素促泌剂治疗六个月后,治疗效果又要损失20~30%,可以通过这点来证明继发性失败。通过5~7年治疗后,胰岛素治疗是50%的胰岛素促泌剂应答者所必需的(Scheen等,Diabetes Res.Clin.Pract.6:533-543,1989)。那格列奈和Pepaglinide是短效药物,因此必须一天服用三次。它们只是用来控制餐后血糖,并不用来控制空腹血糖。
GLUCOPHAGETM是一种缩二胍,它通过减少肝中葡萄糖的输出,增加外周葡萄糖的吸收和利用来降低血糖。这种药物能有效地降低轻度和中度糖尿病患者的血糖浓度,而且不会带来体重增加可能诱导低血糖的副作用。然而,GLUCOPHAGETM有许多别的副作用,包括肠胃消化不良和乳酸酸中毒。70岁以上的糖尿病患者和肾功能不全或肝功能不全的患者禁止服用GLUCOPHAGETM。最后,GLUCOPHAGETM和胰岛素促泌剂具有一样的原发性和继发性失败率。
在饮食、锻炼和口服给药不足以控制血糖后,开始胰岛素治疗。这种治疗有一些缺点:它需要注射,能导致低血糖,而且它还能引起体重增加。胰岛素诱导低血糖的可能性限制了低血糖被控制的程度。
当前疗法中出现的新问题使得新的治疗2型糖尿病疗法成为可能。保持正常胰岛素分泌(即葡萄糖依赖的)的疗法尤其必需。假如胰高血糖素样肽-1(“GLP-1”)能促进胰腺中葡萄糖调节的胰岛素分泌,GLP-1受体激动剂在治疗这种疾病中就可能有价值。此外,假设胰高血糖素能通过刺激肝糖分解和葡萄糖新生作用提高血糖水平,就能证明胰高血糖素受体拮抗剂在治疗2型糖尿病中有价值。
GLP-1和胰高血糖素是结构相关的肽类激素家族,即胰高血糖素/肠促胰激素家族中的成员。在这个家族中,GLP-1(7-36)和GLP-1(7-37)(分别是30个和31个氨基酸)和胰高血糖素(30个氨基酸)构成了一类高度同源的肽。此外,这两类激素衍生自同一前体前胰高血糖素,通过组织特异性加工,前胰高血糖素在肠内主要生成GLP-1,而在胰腺中主要生成胰高血糖素。这两类肽的受体有同源性(58%的相同性),属于G蛋白偶连受体家族。
GLP-1和胰高血糖素在维持全身葡萄糖平衡中起着主要的作用。依赖葡萄糖的胰岛素分泌能调节血浆中葡萄糖的浓度,GLP-1能降低这种血糖的浓度,而胰高血糖素却能升高血糖浓度。假如GLP-1和胰高血糖素确实在维持体内血糖浓度中发挥重要作用,那么鉴定GLP-1受体激动剂和胰高血糖素受体拮抗剂就会引起很大的兴趣。临床研究已经证明灌输GLP-1能促进糖尿病患者胰岛素分泌,使血糖浓度保持正常。然而,GLP-1在体内半寿期很短,能快速降解。此外,GLP-1在达到或接近治疗剂量时,会产生消化道运动机能副作用。因此,GLP-1本身作为治疗药剂有显著的局限性。因此,正在对其进行修饰,希望获得具有更高稳定性的肽。GLP-1受体的非肽类激动剂迄今为止未见有报道。
在患有糖尿病的大鼠中鉴定出了胰高血糖素的肽类似物,它可作为胰高血糖素的拮抗剂,减轻高血糖。然而,肽类胰高血糖素的拮抗剂还没超出临床前开发的范畴。在科学文献和专利文案中介绍了许多结构各异的非肽类胰高血糖素受体拮抗剂。然而,在体鉴定胰高血糖素受体的小分子抑制剂取得的成功有限。在临床研究中唯一已知的有活性的胰高血糖素拮抗剂是一种称作BAY27-9955的化合物。胰高血糖素拮抗剂可能的副作用是导致低血糖。
因为在GLP-1受体激动剂和胰高血糖素受体拮抗剂单独给药时,可能会伴随副作用,用组合疗法具有优势,既能保持所需的低血糖,又能减少副作用。然而同时给药时,要求单一的制剂和转移方法来获得两种肽的合适药物动力学图谱。这可能是开发这种疗法的主要障碍。
根据前面所述,单一的、在体内既可作GLP-1激动剂又可作为胰高血糖素拮抗剂的治疗用肽可能是存在的。
发明概述
本发明提供了一种新的多肽,它既能作GLP-1受体激动剂,也可作胰高血糖素受体拮抗剂,对可被具有GLP-1受体激动剂和胰高血糖素受体拮抗剂活性的药剂改善的疾病和状况有效。本发明的多肽为一些病人提供了一种新的疗法,如患代谢紊乱、葡萄糖耐受性异常、肥胖症的患者,代谢紊乱是由内源胰岛素分泌下降所引发的疾病,尤其是2型糖尿病,而葡萄糖耐受性异常是一种前驱糖尿病状态,在这种状态中,胰岛素分泌或空腹血糖异常有轻微变化。
本发明的一个方面是选自下列一组多肽:SEQ ID NOS:6-32,以及具GLP-1受体激动剂和胰高血糖素受体拮抗剂功能的多肽片段、衍生物和变体,它们的水平和SEQ ID NOS:6-32所示的多肽基本相同(统一叫“本发明的多肽”)。
本发明的别的实施方案包括编码本发明多肽的多核苷酸以及重组表达多肽所必需的载体和宿主细胞。
本发明的另一方面提供了治疗受本发明中多肽影响的哺乳动物,包括人糖尿病和/或其他疾病和状况的方法。这些方法包括对哺乳动物施用治疗有效剂量的本发明中任一多肽。
本发明也提供制备本发明中多肽的重组方法和合成方法。
附图简述
图1是一种典型的质粒限制性图谱,质粒中含有GST-肽融合多核苷酸编码序列。
优选实施方案详述
本发明提供了一种具GLP-1受体激动剂和胰高血糖素受体拮抗剂功能的新型多肽,及其片段、衍生物和类似物。本发明的多肽在体内既能作GLP-1受体激动剂,也能作胰高血糖素的受体拮抗剂,用于预防和/或治疗如糖尿病、低血糖、糖耐量减低、空腹血糖异常和肥胖症等疾病和状况。
GLP-1和胰高血糖素是结构相关的肽类激素家族,既胰高血糖素/肠促胰激素家族中的成员。下列的堆叠排序显示的是一级结构关系:
胰高血糖素 | HSQGTFTSDYSKYLEGQAAKEFIAWLVKGR(SEQID NO:1) |
GLP-1(7-36) | HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH2(SEQ ID NO:2) |
GLP-1(7-37) | HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG(SEQ ID NO:3) |
氨基酸的单字母缩写可以在Zubay,Biochemistry第二版,MacMillan出版社,纽约,第33页中找到。这些多肽在保持全身葡萄糖平衡中起着一定的作用。GLP-1能降低血糖浓度,而胰高血糖素则升高血糖浓度。
假如GLP-1能促进胰腺中葡萄糖调节的胰岛素分泌,GLP-1受体激动剂就可能在治疗代谢紊乱和别的疾病中有潜在的价值。而且,假设胰高血糖素通过刺激肝糖分解和葡萄糖新生作用提高血糖水平,胰高血糖素受体就能证明在治疗疾病中有价值。
本发明提供了一种新的多肽,它既能用作GLP-1受体激动剂,也能用作胰高血糖素受体拮抗剂。不局限于理论,我们相信本发明的多肽在体内能够刺激胰岛素以葡萄糖依赖方式从β胰细胞中释放,同时减少胰高血糖素介导的葡萄糖分泌。
GLP-1受体激动剂和胰高血糖素受体拮抗剂多肽
本发明提供的多肽既能用作GLP-1受体激动剂,也能用作胰高血糖素受体拮抗剂。在一个或多个体外或体内测定GLP-1受体活化的实验中,这种多肽的GLP-1受体激动剂成分能激活GLP-1受体。
在一个或多个体外或体内测定胰高血糖素受体活性抑制的实验中,本发明的多肽表现出胰高血糖素受体拮抗剂的活性。这种试验的例子包括,但不仅限于检测对胰高血糖素介导之胞内cAMP上升的抑制作用的体外实验,检测胰高血糖素介导的葡萄糖从培养的肝细胞中释放的体外实验,或如下面具体实施例所介绍的胰高血糖素刺激葡萄糖产生的体内实验。
本发明优选的多肽选自(1)SEQ ID NOS:6-32和(2)以及具GLP-1受体激动剂和胰高血糖素受体拮抗剂功能的多肽片段、衍生物和变体,它们的功能水平和SEQ ID NOS:6-32所示的多肽基本相同。
本发明的多肽可以是天然的多肽,重组的多肽或合成的多肽。
片段,衍生物,变体和类似物
肽片段、衍生物、变体和类似物基本保持和SEQ ID NOS:6-32所示的多肽同样的生物功能或活性。“基本同样的生物功能或活性”是指全长多肽活性的约30%~100%(即30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%)或更多。
衍生物
衍生物包括经化学修饰的、具有附加结构和/或功能的本发明多肽。例如,可以在多肽中加入聚乙二醇(PEG)或脂肪酸来改善它的半寿期。也可构建具有靶向特异性或其他附加活性的融合多肽,这在下面会更详细地加以介绍。
衍生物既可通过天然加工如转录后加工或化学修饰技术进行修饰,这两类技术都是本领域众所周知的技术。可以在多肽的任何部位进行修饰,包括多肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基端。在一个给定的多肽中,同一类型的修饰在一些位点出现的程度可以相同或不同。此外,一个变体可以包含一个或多个不同类型的修饰。例如,多肽由于泛素化而变成分支状,它们可以是带或不带分支的环状。
别的化学修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素基因的共价连接、核苷酸和核苷酸衍生物的共价连接、脂或脂类衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇、交联、环化、形成二硫键、去甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、形成GPI锚、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒化、硫化、转运RNA介导的向蛋白上添加氨基酸如精氨酰化和泛素化。(参考例如T.E.Creighton,蛋白质:结构和分子特征,第二版,W.H.Freeman and Company,New York(1993);蛋白质的翻译后共价修饰,B.C.Johnson,ed.,Academic Press,New York,pgs.1-12(1983);Seifter et al.,Meth.Enzymol 182:626-46(1990);Rattan etal.,Ann.N.Y.Acad.Sci.663:48-62,1992)。
衍生物也包括和其他多肽,例如人血清白蛋白相融合的成熟多肽,以改进其药物动力学特性。可以用本领域技术人员熟知的任何技术融合两种多肽。例如,编码人血清白蛋白的DNA和编码本发明多肽的DNA序列可以克隆到本领域技术人员熟知的任何哺乳动物表达载体中。本发明多肽位于其他多肽的N末端是优选的,因为一个自由的N-端组氨酸是GLP-1受体活性所必需的(Kawa,EndocrinologyApr;124(49):1768-73,1989)。然后通过将载体转化合适的宿主细胞,如HKB细胞或CHO细胞,表达融合蛋白,从而产生重组的融合蛋白。
优选的衍生物包括连接了一个PEG基团或脂肪酸基团的本发明多肽(SEQ ID NOS:6-32)。举例来说,PEG基团可以是分子量大于22kDa的PEG,分子量介于25kDa~100kDa(如25、30、35、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100kDa)是优选的,而分子量介于35kDa~45kDa(如35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45kDa)是更优选的。PEG化的多肽例子是那些含有一个连接到SEQID NOS:19或SEQ ID NOS:25的31位半胱氨酸残基的PEG的多肽。参看SEQ ID NO:27和表2。此外,也可在SEQ ID NO:25的31位上连接一个43kDa的PEG基团。参看SEQ ID NO:27和表2。可以用本领域众所周知的方法将PEG基团加到本发明多肽的半胱氨酸残基上,参考实施例19。
其他优选的衍生物含有一个连接到多肽上的脂肪酸基团。举例来说,脂肪酸基团可以是C12和C20之间的脂肪酸,优选的是C14到C18之间的脂肪酸,而最优选的是C16脂肪酸。这种多肽的例子是SEQ IDNOS:28-32,它包含一个连接在多肽的亮氨酸残基上的C16脂肪酸基团,参考表2。可以通过本发明众所周知的方法,如脂肪酸酰化将脂肪酸基团加到本发明多肽的亮氨酸残基上(Knudsen et al.,J.Med.Chem.43:1664-1669,2000)。
变体是对SEQ ID NOS:6-32中氨基酸序列作了一个或多个氨基酸序列变化的本发明中的多肽。变体也包括通过修饰的肽键相互连接的氨基酸,即肽等配物(isosteres),也包括除了20个天然存在的氨基酸以外的其他氨基酸。
优选的变体优选在非基本氨基酸残基处有一个或多个保守氨基酸取代(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代)。“非基本”氨基酸残基是蛋白质中野生型序列改变,但又不改变蛋白质生物功能的残基。而“基本”的氨基酸是蛋白质生物功能所必需的。保守氨基酸取代是用具有相似侧链的氨基酸取代蛋白上的氨基酸。具有相似侧链的氨基酸家族本领域已有定义。这些家族包括具碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸,谷氨酸),不带电荷的极性氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β分支侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。对保守的氨基酸或位于蛋白质保守结构域的氨基酸不能进行非保守的取代。
SEQ ID NO:34所示的多肽共有序列的保守氨基酸取代优选地发生在第11、12、16、17或18位。第11位优选的是R、S、A、K、G或T,而更优选的是R、A、G或S。第12位优选的是K、N、R、H、A、S或Q,而更优选的是K、A、S或N。第16位优选的是K、R、V、I、L、M、F、W、Y、A、S、T、N、Q、G或H,而更优选的是K、V、I、F、A、S或N。第1 7位优选的是D、E、H、K、R、F、I、L、M、Y、V、W、A、S、T、N、Q或G,而更优选的是R、A、L、M、V、S、H、E或Q。第18位优选的是K、R、F、I、L、Y、V、M、A、G或H,而更优选的是K、R、F、I、L、Y或A。在11、12、16、17和18位上的组合取代,包括在这些位点上的任意1、2、3或4个上的取代都是可考虑的。
变体也包括由于突变所致的氨基酸序列不同的多肽。通过筛选重组文库可以鉴定既可以作GLP-1受体激动剂,也可作为胰高血糖素拮抗剂的变体。举例来说,通过本领域众所周知的方法进行筛选,发现在一个或多个位点(即在第1、2、3、4、5、6、7、8、9或10位)发生取代的多肽突变体是GLP-1受体激动剂和胰高血糖素拮抗剂,下面的实施例中将作详细介绍。
类似物
类似物包括多肽前体(propolypeptide),其中多肽前体包含本发明多肽的氨基酸序列。可以通过天然的体内加工过程或本领域众所周知的技术,如酶切或化学剪切从多肽前体中间切掉多余的氨基酸,生成本发明的活性多肽。
片段
和本发明的多肽,包括具GLP-1受体激动剂和胰高血糖素拮抗剂活性的全长衍生物、变体或类似物相比,片段较短。
多核苷酸
任何编码本发明多肽的多核苷酸都可用来表达多肽。多核苷酸可以只包含多肽的编码序列,也可包含额外的编码和/或非编码区。
通过本领域众所周知的方法可以整体或部分合成编码本发明多肽的多核苷酸(例如参考Caruthers等,Nucl.Acids Res.Symp.Ser.215-23,1980;Horn等,Nucl.Acids Res.Symp.Ser.225-32,1980)。然后可以将编码多肽的多核苷酸克隆到表达载体中表达多肽,或克隆到克隆载体中扩增多核苷酸。
产生一些含有非天然存在之密码子的、编码多肽的核苷酸是有利的,这一点本领域的技术人员都很清楚。例如,选择某个原核或真核宿主的偏爱密码子可以增加多肽表达的效率,或产生具有所需特性,如半寿期比天然存在序列长的RNA转录物。
出于多种原因,通过本领域众所周知的方法将本发明公开的多核苷酸序列加以改造来改变编码多肽的序列。这些原因包括,但不仅限于修饰多肽或mRNA产物的克隆、加工和/或表达的变异。通过对DNA片段进行随机分段和PCR重组以及合成的寡核苷酸来改造核苷酸序列。例如,利用定点诱变插入新的限制位点、改变糖基化类型、改变密码子偏爱性、产生剪接变体、导入突变等等。
载体
本发明还包括含有一个或多个编码本发明多肽的核苷酸序列的克隆载体和表达载体。核苷酸序列可以正向或反向插入。可以通过不同的方法将DNA插入载体。总之,通过本领域众所周知的方法可以将DNA序列插入合适的限制性酶切位点,这在Sambrook等,分子克隆:实验手册(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL),第二版(冷泉港,N.Y.,1989)中作有详细介绍。这些技术和其他方法属于本领域技术人员的能力范围。
克隆载体的例子包括但不仅限于pBR322、pUC18、pUC19、pSport和pCRII。
在这个实施方案的优选方面,表达载体进一步包括调节序列,如可操纵地连接在编码序列上的启动子。大量合适的表达载体和启动子都是本领域技术人员众所周知的,并可通过商业途径获得。举例来说有下面的表达载体。细菌表达载体包括但不限于pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen公司)、pBS、phagescript、psiX174,pBluescript SK、pBsKS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene公司)、pTRC99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、PRIT5(Pharmacia公司)。真核表达载体包括但不仅限于pWLneo、pSV2cat、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene公司)、pSVK3、pBPV、pMSG、PSVL(Pharmacia公司)。然而,只要克隆和表达载体在所需的宿主中能复制和存活,就都能使用。利用CAT(氯霉素转移酶)表达载体或其他带选择标记的载体可以从所需的基因中选择启动子区。pKK232-8和pCM7是两个合适的载体。具体命名的细菌启动子包括laci、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL和trp启动子。真核启动子包括CMV即早启动子、胸腺嘧啶核苷激酶启动子、SV40早期和晚期启动子、逆转录病毒的LTRs和金属硫蛋白-I启动子。合适的载体和启动子的选择是本领域普通技术人员所具有的能力。
表达载体也包括一个起始翻译的核糖体结合位点、一个转录终止位点和扩增表达的合适序列。表达载体可以包括一个能提供表型特征、用于选择转化的宿主细胞的基因,如用于真核细胞的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性基因,或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性基因。
文库
在一个实施方案中,变体文库通过核酸水平上的组合突变产生,由嵌合基因文库编码。举例来说,通过酶将合成的寡核苷酸混合物连接到基因序列中,构建成一个变体文库,一套简并的变体氨基酸序列以单个多肽的形式表达,或者以包含这套序列的更大融合蛋白的形式表达(例如用于噬菌体展示)。
可通过许多方法,利用简并寡核苷酸序列来产生变体文库。简并基因序列的化学合成可以在自动的DNA合成仪上进行,然后把合成的基因连入合适的载体中。使用一套简并基因可以在一个混合物中提供一套编码所需的类似物序列的所有序列。合成简并寡核苷酸的方法在本领域众所周知(例如参考Narang,Tetrahedron 39:3(1983);Itakura等,Annu.Rev.Biochem.53:323(1984);Itakura等.,Science 198:1056(1984);Ike等.,Nucleic Acid Res.11:477,1983)。
筛选通过点突变或截短构建的重组文库的基因产物和cDNA文库中具有选择特性的基因产物的几个技术在本领域众所周知。这些技术可用来快速筛选通过对本发明的多肽进行组合突变而构建的基因文库。应用最广的,用于大型基因文库筛选的高通量分析技术,典型地包括把基因文库克隆进可复制的表达载体,用产生的载体文库转化合适的宿主细胞,然后在所需活性的检测便于编码基因的载体分离的条件下表达重组基因,其中的基因产物得以检测。递推集团诱变(REM)是一种能增强文库中功能性突变体频率的技术,可以和筛选技术联用来鉴定所需变体。
宿主细胞
本发明还提供含有上述载体的宿主细胞。宿主细胞可以是高等真核细胞,如哺乳动物细胞,或低等真核细胞,如酵母细胞。此外,宿主细胞可以是原核细胞,如细菌细胞。
宿主细胞可以通过本发明的载体进行遗传工程化(转导、转化或转染)。载体可以是各种形式,如质粒、病毒粒颗粒或噬菌体。工程化的宿主细胞可以在适于活化启动子或选择转化子的常规营养培养基中培养。合适培养条件,如温度和pH的选择,是本领域普通技术人员众所周知的。
举例来说,代表性的合适宿主包括,但不限于细菌细胞,如大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、链霉菌;真菌细胞,如酵母;昆虫细胞,如果蝇S2细胞,夜蛾Sf9细胞;哺乳动物细胞如CHO、COS或黑色素瘤细胞。合适宿主的选择属于本领域技术人员的能力范围。
把构建好的载体导入宿主细胞可以通过许多方法实现,如磷酸钙转染、二乙氨基葡聚糖介导的转染、电穿孔法(Davis等.,BASICMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,1986)。可用常规的方式使用宿主细胞中的构建体来产生由重组序列编码的基因产物。
蛋白的表达
在合适启动子的控制下,可以在哺乳动物细胞、酵母、细菌或其他细胞中表达成熟的蛋白。也可以利用衍生于本发明DNA构建体的RNA,采用无细胞翻译系统来产生这种蛋白。用于原核和真核宿主的合适克隆载体和表达载体在上文和Sambrook等,分子克隆:实验指南,第二版,(冷泉港,N.Y.,1989)中作有介绍。
通过在表达载体中插入增强子,可以增强真核生物中编码本发明多肽的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件,大小通常是10bp~300bp,作用在启动子上增强它的转录。举例来说,增强子包括位于复制起点的SV40增强子(100bp~270bp)、巨细胞病毒早期启动子增强子以及腺病毒增强子。总之,重组表达载体包括复制起点、选择标记和启动子,选择标记如大肠杆菌的氨苄青霉素抗性基因和酿酒酵母TRP1基因,而启动子则来源于一个指导下游结构基因高表达的基因。这样的启动子来源于编码糖酵解酶如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、α因子、酸性磷酸酶或热激蛋白的操纵子。异源结构序列和翻译、起始或终止序列同时协调地组装在一起,优选的是能指导翻译的蛋白分泌到周质空间或胞外培养基中的前导序列。异源序列也可以编码融合蛋白,它包括N-末端鉴定肽,该肽能产生一些所需的特征,如增加稳定性或简化所表达重组蛋白的纯化。
转化到合适的宿主株,并生长到合适的细胞密度后,用合适的手段将启动子去阻遏(如温度改变或化学诱导),细胞再培养一段时期。典型地通过离心收集细胞,通过一些物理或化学方法将其破碎。将粗提取物保存以进一步纯化。在表达中应用的微生物细胞可以通过任何常规的方法破碎,包括超声波处理、机械破碎或使用细胞破碎试剂。
可以用不同的哺乳动物细胞培养系统来表达重组蛋白。举例来说,哺乳动物表达系统包括Gluzman,Cell 23:175(1981)介绍的猴肾成纤维细胞COS-7细胞系,以及其他能表达相容载体的细胞系,如C1 27、3T3、CHO、HeLa和HBK细胞系。
蛋白的纯化
本发明的多肽可以用本领域众所周知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化,包括硫酸胺或乙醇沉淀、酸抽提、阳离子或阴离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用色谱法、亲和层析、羟磷灰石层析以及凝集素层析。最后的纯化可以采用高压液相层析(HPLC)。
本发明的多肽可以用下面具体实施例中介绍的常规方法分离。纯化的多肽至少有70%的纯度。换句话说,分离的多肽中基本上没有细胞物质,含有少于30%的非多肽物质(干重)。优选的,制备的多肽纯度是85%~99%(即85%、87%、89%、91%、93%、95%、96%、97%、98%和99%)。制备的多肽纯度可以用本领域众所周知的方法来检测,如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、质谱和液相层析。
翻译后修饰
根据重组生产方法中使用的宿主,本发明的多肽可以用哺乳动物或其他真核的碳水化合物糖基化,也可以不糖基化。本发明的多肽还包括起始甲硫氨酸残基。
化学合成
此外,本发明的多肽可以通过化学合成的方法来合成其氨基酸序列,如用固相合成进行直接合成肽(参看,Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85,2149-2154,1963;Roberge等,Science 269,202-204,1995)。可以手工或自动化合成多肽。例如,可以用应用生物系统431A肽合成仪(Perkin Elmer)自动化合成多肽。此外,可以单独合成多肽的片段,然后通过化学方法组合成全长分子。
可以用制备性的高效液相色谱基本上纯化新合成的多肽(例如,参看Creighton,蛋白质:结构和分子原理,WH Freeman and Co.,NewYork,N.Y.,1983)。可以通过氨基酸分析或通过Edman降解法来证实本发明合成的多肽的组成(参看Creighton,同上)。另外,在直接合成和/或联合使用化学方法或其他蛋白的序列形成变体多肽或融合多肽的过程中,可以改变多肽氨基酸序列的任何一部分。
药学上的应用
本发明的多肽可以用来治疗2型糖尿病(非胰岛素依赖的糖尿病)和/或预防具有葡萄糖耐受性异常、空腹血糖异常、低血糖和/或肥胖的供试者发展成2型糖尿病。
药用组合物
本发明的多肽可以和一种合适的药用载体联合使用,形成一种可肠胃给药的组合物。这种组合物包括治疗有效量的多肽和药用上可接受的载体或赋形剂。药用上可接受的载体包括,但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇以及它们的组合物。制剂应该和给药模式相匹配。
药学上的组合物可以用常规的方法给药,如口服、体表接种、静脉注射、腹膜内注射、肌肉注射、皮下注射或皮内给药。药用组合物以对特定指征进行治疗和/或预防的有效量给药。合适的剂量是每天至少约3.5ng/kg到约100μg/kg体重的活性多肽(即并不包括PEG或脂肪酸基团的重量)。在大部分情况下,考虑给药方式、症状等的话,剂量是每天约0.1μg/kg体重到约35μg/kg体重。这个数量并没考虑到体内通过生物方法获得的肽,在这种情况下,或多或少可用来保持所需的有效剂量。剂量的确定是本领域普通技术人员所熟知的,它只需要常规的筛选。
本发明的多肽也可以和别的用于治疗糖尿病的药物联合使用。合适的药剂包括胰岛素、胰岛素致敏剂和盐酸二甲双胍。
试剂盒
本发明也提供药用的包装或试剂盒,里面含有装满一种或若干种本发明药用组合物成分的容器。一个由政府机构开具的用来调节药物或生物产品的制造、使用或销售的通知,以及政府机构批准的文书和包装或试剂盒装在一起。
基因治疗
本发明的多肽也能在体内表达,这种方法通常叫“基因治疗”。因此,举例来说,通常可以用编码多肽的多核苷酸(DNA或RNA)对离体的细胞进行工程化,然后把这工程化的细胞提供给需要用多肽治疗的病人。这种方法是本领域众所周知的。例如,细胞可以利用含有编码本发明多肽的RNA的逆转录病毒颗粒,通过本领域众所周知的技术加以工程化。
在一个优选的实施方案中,含有本发明多肽的DNA用于糖尿病之类代谢紊乱的基因治疗。根据这个实施方案,在诊断的同时或诊断后立即将含有编码本发明多肽的DNA的基因治疗提供给需要治疗的病人。
利用基因治疗进行的多肽的局部转移可以给目的区域,如胰腺提供治疗药剂。例如,用胰腺特异的启动子构建一种β细胞胰腺肿瘤小鼠模型。
体外基因疗法和体内基因疗法都可以考虑使用。一些把潜在的治疗药剂转入确定的细胞群落的方法是已知的。参见Mulligan,Science260:926-31,1993.这些方法包括:
1)直接的基因转移。参见Wolff等,“向小鼠肌肉中的体内直接基因转移”,Science 247:1465-68,1990;
2)脂质体介导的DNA转移。参见Caplen等,“脂质体介导的CFTR基因向膀胱纤维化患者的Nasal上皮细胞中的转移”,Nature Med.3:39-46,1995;Crystal,“基因作为一种药物”,Nature Med 1:15-17,1995;Gao and Huang,“用作有效转染哺乳动物细胞的一种新的阳离子脂质体药剂”,Biochem.Biophys.Res.Comm.179:280-85,1991;
3)逆转录病毒介导的DNA转移。参见Kay等,“血友病B的体内基因转移:在因子IX缺陷的狗中持续的部分纠正”,Science 262:117-19,1993;Anderson,“人类基因治疗”,Science 256:808-13,1992.
4)DNA病毒介导的DNA转移。这样的DNA病毒包括腺病毒(优选Ad-2或Ad-5为基础的载体)、疱疹病毒(优选单纯疱疹病毒为基础的载体)和细小病毒(优选“缺陷”或没自主复制能力的细小病毒为基础的载体,更优选的是腺伴随病毒为基础的载体,最优选的是AAV-2为基础的载体)。
基因治疗载体系统
转化目的基因的特定载体系统的选择取决于多种因素。一个重要的因素是目的细胞群落的天然属性。尽管逆转录病毒载体已经被广泛的研究,并在许多基因治疗中得以使用,但这些载体一般并不适合感染不分裂的细胞。此外,逆转录病毒有潜在的致癌性。然而,最近在慢病毒载体领域的进展可能会解决这些局限性。
本领域技术人员都会意识到,根据实施方案,可以采用含有本发明多肽的适合基因治疗的任何载体。构建这种载体的技术是已知的。参见Anderson,Nature 392 25-30,1998;Verma和Somia,Nature 389239-242,1998。利用已知的技术可以把载体导入靶位点。
合适的基因治疗载体包括一个或若干个启动子。可以采用的合适启动子包括,但不限于病毒启动子(如逆转录病毒LTR、SV40启动子、腺病毒主要晚期启动子、呼吸道合胞病毒启动子、B19细小病毒启动子和Miller等,Biotechniques 7(9):980-990,1989中介绍的人巨细胞病毒(CMV)启动子)、胞内启动子(如组氨酸启动子、pol III启动子和β-肌动蛋白启动子,以及诱导型启动子(如MMT启动子、金属硫蛋白启动子和热激蛋白启动子)。选择合适的启动子是本领域技术人员熟知的。
逆转录病毒
上文提及的产生逆转录病毒质粒载体的逆转录病毒,包括但不限于莫洛尼鼠类白血病毒、脾脏坏死病毒、逆转录病毒如劳斯肉瘤病毒、禽类白血病病毒、人类免疫缺陷病毒、乳瘤病毒。在一个实施方案中,逆转录病毒质粒载体衍生自莫洛尼鼠类白血病毒。
逆转录病毒质粒载体被用来转导包装细胞系,形成生产细胞系。可以被转染的包装细胞系包括,但不限于PE501、PA317、Ψ-2、Ψ、AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ΨCRE、ΨCRIP、GP+E-86、GP+envAm12以及如Miller,“人类基因治疗“,1:5-14,1990中介绍的细胞系。载体可以通过本领域任何已知的手段转导细胞系。这样的手段包括,但不限于电穿孔、使用脂质体以及CaPO4沉淀。在另一个选择方案中,逆转录病毒质粒载体可以包裹进脂质体,或和脂类偶连,然后施用于宿主。生产细胞系产生感染性的逆转录病毒载体颗粒,颗粒中包含编码本发明多肽的核酸序列。这种逆转录病毒载体颗粒可以用来在体外或体内转导真核细胞。真核细胞将会表达编码本发明多肽的核酸序列。能被转导的真核细胞包括,但不限于胚胎干细胞、胚胎瘤细胞、造血干细胞、肝细胞、成纤维细胞、成肌细胞、角质细胞、内皮细胞和支气管上皮细胞。
腺病毒和腺伴随病毒
腺病毒的优点是,有范围很广的宿主,能感染休眠或末端分化细胞,如神经元或肝细胞,而且不致癌。腺病毒不会整合到宿主基因组中。它们位于染色体外,减少了插入诱变的风险。Ali等,1994,373页。
腺伴随病毒表示出和以腺病毒为基础的载体相似的优点。然而,AAVs能位点特异地整合到人19号染色体(Ali等,1994,377页)。
转核(transkaryotic)疗法
和基因治疗不同的方法是转核疗法,其中在体外处理患者的细胞,重新导入患者体内后,诱导显性染色体基因产生目的蛋白。转核疗法补充个体活化所必需的正常基因成分。把能激活新生基因的启动子或其他外源调节序列在离体状态下导入患者染色体DNA中,培养并挑选活性的、能产生蛋白的细胞,然后重新把激活的细胞导入患者,认为这些细胞在体内会充分确立。然后“激活的基因”在很长的时间内,也许是患者的一生都制造目的蛋白。美国专利Nos.5641670和5733761详细公开了这个概念。
为了让本发明被更好地理解,提出了下列实施例。这些实施例只是证明,而不是以任何方式限制本发明的范围。所有的专利、专利出版物,以及在本公开内容中引用的参考文献一并引入作为本发明的参考。
实施例
实施例1
多肽合成方法学
可以遵照下面的一般方法合成本发明的多肽。多肽合成可以利用Rapp-Polymere PEG-polystyrene树脂在连续的流体状态下,通过FMOC/t-Butyl(Peptide Synthesis Protocols(1994),Volume 35 byMichael W.Pennington & Ben M.Dunn)策略进行。在合成完成时,肽从树脂上切下,并用TFA/DTT/H2O/Triisopropyl silane(88/5/5/2)去保护。利用冰冷的二乙醚把肽从剪切混合物中沉淀出来。用冷的乙醚将沉淀洗三遍,然后溶解在5%的乙酸中,最后冷干。在WatersALLIANCE系统(Waters Corporation,Milford,MA)上,利用含3%TFA的水/乙氰为梯度,其中乙氰为0%至100%,用YMC-packODS-AQ柱(YMC,Inc.,Wilmington,NC)进行反向层析,并通过在VOYAGER DETM MALDI质谱仪(model 5-2386-00,PerseptiveBiosystems,Framingham,MA)上进行MALDI质谱分析来证实肽的相同性。基质缓冲液(含有3%TFA的50/50H2O/乙氰)肽样品以1/1比例加入到基质缓冲液中。不符合纯度>95%标准的那些肽在WatersDelta Prep 4000 HPLC系统(Waters Corporation,Milford,MA)上进行反相层析加以纯化。
实施例2
肽的克隆
为了建立一种表达本发明多肽及其突变体的强有力方法,将编码多肽的核苷酸克隆到GST的C末端,中间用一个单因子Xa识别位点序列将单体肽和GST分开。通过DNA序列中含限制性酶切位点紧邻将要克隆的多核苷酸的5端,将在紧靠待克隆多核苷酸的DNA序列的5’端含有BamHI或EcoRI限制性酶切位点的两个重叠单链DNA片段(70mers~90mers)相杂交,然后利用DNA聚合酶1的大片段(Life Techmologies,Inc.,Gaithersburg,MD)合成DNA的对应链,从而合成编码和要获得肽的DNA序列相融合的Xa因子识别位点的基因。
每个多核苷酸DNA序列的选择都是根据每条肽的氨基酸序列推导出来。在有些情况下,编码肽的多核苷酸可以通过对已用上述方法制备的多核苷酸进行PCR诱变来制备。用BamH I和EcoR I消化双链产物,然后连接已用BamH I和EcoR I消化的pGEX-6P-1。
举例来说,当编码鉴定为SEQIDNO:7多肽的DNA序列克隆进pGEX-6P-1时,下列的多肽和谷胱甘肽-S-转移酶(GST):IEGRHSQGTFTSDYAKYLDARRAKEFIAWLVKGRG(SEQ ID NO:33)以融合的形式表达,其中,前4个氨基酸IEGR是Xa因子识别位点,而剩余的31个氨基酸是鉴定为SEQIDNO:7的氨基酸序列。
编码SEQIDNO:7中多肽的核酸序列的前六个核苷酸和最后六个核苷酸代表是用来克隆进pGEX6P-1(图1)中的限制性酶切位点(BamH I和EcoRI)。在EcoRI位点(GAATTC)前的“TAATGA”序列编码的是两个终止密码子。其他DNA序列编码SEQ ID NO:7融合序列中的Xa因子多肽。
实施例3
肽重组表达和纯化
将含有GST-肽融合形式的质粒转化BL21(DE3)细胞,在37℃培养至OD600达0.6-1.0,然后用1mM IPTG在37℃诱导2小时。2升细胞在7,700g离心15分钟,-20℃保存。细胞沉淀重悬在80mLB-PER细菌蛋白抽提试剂和1x完全蛋白酶抑制剂中,直到细胞悬液完全匀浆。在室温下,轻轻摇晃匀浆混合物10分钟。分别加入终浓度分别为200μg/mL和10μg/mL的溶酶体和DNase I,进一步溶解蛋白并减少粘性。混合物再培养5分钟。细胞残渣用27,000g,20分钟离心下来。上清液和2mL洗过的Glutathione Sepharose 4B树脂(Pharmacia)混合,在摇床上4℃过夜。用1,500g,15分钟将树脂离心下来,装入空的Poly-Prep层析柱,用30mLPBS冲洗,接下来用10mL的Xa因子缓冲液(1mM CaCl2、100mM NaCl和50mM Tris-HCl,pH8.0)冲洗。肽从柱子上用60单位的Xa因子剪切下来,Xa因子溶解在1mL的Xa因子缓冲液中,4℃过夜。洗脱液然后上C18 HPLC(BeckmanSystem Gold),使用2mL的环、流速1mL/min,程序如下:5分钟的缓冲液A(0.1%TFA/H2O),30分钟的梯度至100%的缓冲液B(0.1%TFA/ACN),10分钟的BufferA,10分钟梯度,以及10分钟的缓冲液A。收集洗脱峰,通过10%~20%Tricine-SDS凝胶电泳筛选。根据从氨基酸序列推测的质量,用质谱证实每个肽的相同性。典型的产量是每升大肠杆菌有大约50μg的游离肽。重组肽和合成肽具有同样的活性。
下面的表2包含一些根据上述的方案制造的多肽(实施例1),或在下面介绍的重组多肽。
表2
胰高血糖素 | HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT(SEQ ID NO:1) |
GLP- | HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH2(SEQ |
1(7-36) | ID NO:2) |
GLP-1(7-37) | HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG(SEQ IDNO:3) |
G1 | HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLVKGR-NH2(SEQID NO:4) |
G5 | HSQGTFTSDYSKYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH2(SEQID NO:5) |
G27 | HSQGTFTSDYAKYLDARRAKEFIAWLVKGR-NH2(SEQID NO:6) |
G51 | HSQGTFTSDYAKYLDARRAKEFIAWLVKGRG(SEQ IDNO:7) |
G55 | HSQGTFTSDYARYLDARRAKEFIAWLVKGR-NH2(SEQID NO:8) |
G56 | HSQGTFTSDYAAYLDARRAKEFIAWLVKGR-NH2(SEQID NO:9) |
G57 | HSQGTFTSDYAKYLDAARAKEFIAWLVKGR-NH2(SEQID NO:10) |
G58 | HSQGTFTSDYAKYLDAKKAKEFIAWLVKGRG(SEQ IDNO:11) |
G59 | HSQGTFTSDYARYLDAKKAKEFIAWLVKGRG(SEQ IDNO:12) |
G60 | HSQGTFTSDYAKYLDAAKAKEFIAWLVKGRG(SEQ IDNO:13) |
G61 | HSQGTFTSDYARYLDAAKAKEFIAWLVKGRG(SEQ IDNO:14) |
G71 | HSQGTFTSDYAKYLDARRACEFIAWLVKGRG(SEQ IDNO:15) |
G74 | HSQGTFTSDYAKYLDARRAKEFIAWLVCGRG(SEQ ID |
NO:16) | |
G75 | HSQGTFTSDYAKYLDARRAKEFIAWLVKCRG(SEQ IDNO:17) |
G76 | HSQGTFTSDYAKYLDARRAKEFIAWLVKGCG(SEQ IDNO:18) |
G77 | HSQGTFTSDYAKYLDARRAKEFIAWLVKGRC(SEQ IDNO:19) |
G277 | HSQGTFTSDYAKYLDARRAKEFIAWLVKGRC(22kD)(SEQ ID NO:20) |
G82 | HSQGTFTSDYARYLDARRAKEFIAWLVRGRG(SEQ IDNO:21) |
G83 | HSQGTFTSDYARYLDARRAREFIKWLVRGRG(SEQ IDNO:22) |
G84 | HSQGTFTSDYARYLDARRAREFIAWLVKGRG(SEQ IDNO:23) |
G85 | HSQGTFTSDYARYLDARRAREFIAWLVRGRGK(SEQ IDNO:24) |
G185 | HSQGTFTSDYARYLDARRAREFIKWLVRGRC(SEQ IDNO:25) |
G2185 | HSQGTFTSDYARYLDARRAREFIKWLVRGRC(22kD)(SEQ ID NO:26) |
G4185 | HSQGTFTSDYARYLDARRAREFIKWLVRGRC(43kD)(SEQ ID NO:27) |
G87 | HSQGTFTSDYAKYLDARRAK(FA)EFIAWLVKGR-NH2(SEQ ID NO:28) |
G88 | HSQGTFTSDYAKYLDARRAKEFIAWLVKGRK(FA)(SEQID NO:29) |
G90 | HSQGTFTSDYARYLDARRAREFIK(FA)WLVRGRG(SEQ |
ID NO:30) | |
G182 | HSQGTFTSDYARYLDARRAREFIKWLVRGRGK(FA)(SEQ ID NO:31) |
G183 | HSQGTFTSDYARYLDARRAK(FA)EFIKWLVRGRG(SEQID NO:32) |
(FA):连接在亮氨酸残基上的C16棕榈酸
(22kD):连接在半胱氨酸残基上的22kD PEG
(43kD):连接在半胱氨酸残基上的43kD PEG
实施例4
RINm5F细胞膜的制备
用PBS冲洗烧瓶中的RINM5F细胞,刮在含有蛋白酶抑制剂(HES)的20mM Hepes-1mM EDTA-250mM蔗糖缓冲液中,用细胞均质器匀浆,然后用23号针头重复重悬。500g离心5分钟去除没破碎的细胞和细胞核。用23号的针头将沉淀重悬在HES缓冲液中,重复离心。将两次离心得到的上清液混合,然后在40,000xg离心20分钟。得到的质膜沉淀用23号针头,然后用25号针头重悬在HES缓冲液中。细胞膜在使用前储存在-80℃。
实施例5
大鼠肝质膜的制备
将大鼠杀死,将肝脏移到冰冻的TES缓冲液中(含蛋白酶抑制剂的20mM Tris,pH 7.5,1mM EDTA,255mM蔗糖)。确定肝脏湿重,将组织切碎,放入5倍体积冰冷的TES缓冲液中,并用高速电动研磨机制备匀浆。所有的缓冲液及离心产物保存在4℃。用手控的细胞均质器捣三次将稀浆进一步匀浆化。把匀浆液通过几层粗棉布,在25,000xg离心10分钟。沉淀在22.1mL TES中用手控的细胞均质器捣10次加以匀浆。加入27.9mL的2.4M蔗糖并混合。然后把匀浆液分装在若干试管中,而每个试管加入7mL的TES缓冲液。将试管在120,000xg离心60分钟。从旋转过程中形成的界面中取细胞膜,在TES中稀释,在200,000xg,离心15分钟将其浓缩。产生的沉淀再次用9.8mL的TES缓冲液和10.3mL 2.4M的蔗糖匀浆化,加入7mLTES,在18,000xg,离心30分钟。从界面上取质膜,用TES稀释,通过200,000xg,离心15分钟来收集。最终的沉淀重悬在TES中。质膜储存在-80℃备用。
实施例6
大鼠肝细胞的制备
根据Berry和Friend的方法加以改进(J. Cell.Biol.43:506,1969),分离肝细胞。一个喂食的雄性Wistar大鼠用戊巴比妥钠(55mg/kg,i.p.)麻醉。把大鼠背向下放置在肝灌流装置(37℃)的盘子中,四肢用实验带系紧。用70%乙醇清洗心室表面,然后用剪子打开腹腔,暴露肝脏、门静脉、肝动脉以及后腔静脉。在这三个血管周围松弛地放置绷带。插管插入门静脉,并用绷带系紧。肝脏下面的肝动脉和后腔静脉用绷带打结。打开灌流泵,立即切断下行主动脉,使得缓冲液选出来,给大鼠放血。迅速打开胸腔,暴露心脏。插管通过心脏插入上腔静脉,然后用绷带切断,完成环绕肝的缓冲液环路。用含有5%~10%绵羊RBC的Krebs-Henseleit缓冲液,在流速为14mL/min的恒定95%O2/5%CO2流作用下灌流肝脏。首先灌流非环流系统5分钟,然后再灌流环流系统30分钟(用30mg胶原酶)。然后取下肝脏,在塑料口杯中用剪刀将其切碎,用尼龙网过滤。通过一系列缓冲液冲洗和离心(690rpm,室温,90sec)将肝细胞从残渣中分离出来。各份细胞用缓冲液稀释,用0.4%锥虫蓝染色和计数。剩余的细胞用缓冲液稀释到每次试验的合适密度。
实施例7
大鼠胰岛分离方案
用Sprague Dawley大鼠(275g~320g)作为胰岛供应来源。简而言之,用10mL冷重构的Liberase RI(Boehringer Manheim)填充胰腺,收获,然后和另外5mL酶溶液在水浴中共培养30分钟。用冷的10%FBS/Hanks缓冲液将组织悬浮液(Gibco)冲洗两遍,重悬在8mL25%的Ficoll(Sigma)中,然后用23%、20%和11%的Ficoll各5mL分层。离心后,将20%这一层的胰岛取出来,用冷的10%FBS/Hank缓冲液冲洗两遍,然后重悬在10%FBS/RPMI 1640培养基中(Sigma)。
实施例8
肽对RINm5F质膜上的GLP-1受体的竞争性结合
本发明的多肽和多肽片段、变体和类似物对RINm5F膜竞争性结合的IC50值典型是约0.01nM至约20nM(即0.01、0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20nM)本发明多肽衍生物的IC50值典型是至少0.01nM至约500nM(即0.01、0.1、1、10、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500nM)。
本发明一些多肽对RINm5F细胞质膜的竞争性结合可以用如下方式检测。96孔的GF/C过滤平板(Millipore,Bedford,MA)用0.3%PEI阻断至少1小时,然后用结合缓冲液冲洗两遍,结合缓冲液包括20mMTris,2mM EDTA,pH7.5,1mg/ml BSA和1mg/ml杆菌肽。各孔加入用结合缓冲液稀释的5μg RINm5F细胞质膜、0.05μCi 125I标记的GLP-1和浓度范围在1×10-12~1×10-5的肽。在室温下培养60分钟,然后平板用含1mg/mL BSA的冰冷PBS冲洗3遍。把平板弄干,在各孔中加入闪烁体,然后用Wallac Microbeta计数器测定cpm/孔。
绘制各浓度肽中结合到膜上的125I数,用Prizm软件进行非线性回归分析,测定IC50。表2中公开的多肽和从RINm5F细胞上分离的质膜上的GLP-1受体结合,IC50在1.4nM~248nM之间(根据三次试验的最少值确定)。IC50是使标记的GLP-1(7~36)(SEQ ID NO:2)的最大结合值减少了50%的多肽浓度。
实施例9
肽对大鼠肝细胞质膜上胰高血糖素受体的竞争性结合
本发明的多肽和多肽片段、变体和类似物对大鼠肝细胞质膜上胰高血糖素受体的竞争性结合的IC50值典型约0.01nM至约1000nM(即0.1、1、10、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000nM)。
本发明一些多肽对大鼠肝细胞质膜上胰高血糖素受体的竞争性结合可以用如下方式检测。96孔的GF/C过滤平板(Millipore,Bedford,MA)用0.1%PEI阻断至少1小时,然后用结合缓冲液冲洗两遍,结合缓冲液包括20mM Tris、2mM EDTA,pH7.5、1mg/ml BSA和1mg/ml杆菌肽。各孔加入用结合缓冲液稀释的5μg RINm5F细胞质膜、0.05μCi 125I标记的GLP-1和浓度范围在1×10-12~1×10-5的肽。在室温下培养60分钟,然后平板用含1mg/mL BSA的冰冷PBS冲洗3遍。把平板弄干,在各孔中加入闪烁体,然后用Wallac Microbeta计数器测定cpm/孔。
绘制每种浓度的肽中的结合到膜上的125I数,用Prizm软件进行非线性回归分析,测定IC50。表2中公开的多肽和从大鼠肝细胞上分离的质膜上的胰高血糖素受体结合,IC50在11.7nM~726nM之间(根据三次试验的最少值确定)。IC50是使标记的GLP-1(7-36)(SEQ IDNO:2)的最大结合值减少了50%的多肽浓度。
实施例10
利用cAMP亲近闪烁检测(SPA),通过GLP-1受体检测肽信号
对于本发明的多肽及多肽片段、变体和类似物,在cAMP亲近闪烁检测中GLP-1受体的“激活”是最大活性的诱导,这种最大活性是天然GLP-1(7-36)(SEQ ID NO:2)诱导的活性的约80%至约200%(即85%、90%、95%、100%、105%、110%、115%、120%、125%、130%、135%、140%、145%、150%、155%、160%、165%、170%、175%、180%、185%、190%、195%或200%),相对活性至少约4%至约1000%(即4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%或1000%)。对于本发明的多肽衍生物,在cAMP亲近闪烁检测中GLP-1受体的“激活”是最大活性的诱导,这种最大活性是天然GLP-1(7-36)(SEQ ID NO:2)诱导的活性的约80%至约200%(即85%、90%、95%、100%、105%、110%、115%、120%、125%、130%、135%、140%、145%、150%、155%、160%、165%、170%、175%、180%、185%、190%、195%或200%),相对活性至少约0.5%至约1000%(即0.5%、1%、10%、50%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%或1000%)。“相对活性”是指天然GLP-1(7-36)(SEQ IDNO:2)的EC50除以本发明多肽的EC50,再乘以100。“EC50”是达到最大活性50%的多肽浓度。
在cAMP亲近闪烁检测中,检测本发明一些多肽的GLP-1受体的肽信号可以用如下方法检测。以1.5×105细胞/孔的浓度将RINm5F细胞铺96孔平板,并在RPMI 1640、5%FBS、抗生素/抗真菌剂(GibcoBRL)中37℃培养24小时。弃去培养基,用PBS将细胞冲洗两遍。细胞在含1%BSA和100μM IBMX的Hepes-PBS中,37℃培养15分钟,肽浓度是1×10-12M-1×10-5M。在肽和脂肪酸交联的实验中,培养缓冲液中可以不含BSA。弃去培养缓冲液,用裂解试剂裂解细胞,裂解试剂是和cAMP亲近闪烁检测直接筛选系统(AmershamPharmacia Biotech Inc,Piscataway,NJ)一起提供的。根据试剂盒中的说明书可以测定裂解物中的cAMP的量。
绘制每种浓度的肽中产生的cAMP量,用Prizm软件进行非线性回归分析,以确定EC50。对于表2公开的多肽中GLP-1受体激活的平均相对活性是0.6%~76.1%。诱导的最大活性是天然肽GLP-1(7-36)(SEQ ID NO:2)的83%~132%(根据三次试验的最小值测定)。参看表4。
实施例11
利用cAMP亲近闪烁检测(SPA),通过胰高血糖素受体检测肽信号
对于本发明的多肽及多肽片段、变体和类似物,在cAMP亲近闪烁检测中胰高血糖素受体的“激活”是最大活性的诱导,这种最大活性是由具的天然胰高血糖素(SEQ ID NO:1)诱导的活性的约0%至约75%(即0%、10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%),相对活性至少约0.001%至约5%(即0.001%、0.01%、0.1%、1%、2%、3%、4%或5%)。对于本发明的多肽衍生物,在cAMP亲近闪烁检测中胰高血糖素受体的“激活”是最大活性的诱导,这种最大活性是天然胰高血糖素(SEQ ID NO:1)诱导的活性的约0%至约40%(即0%、1%、10%、20%、30%或40%),相对活性至少约0.001%至约1%(即0.001%、0.01%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%或1%)。“相对活性”是指天然胰高血糖素(SEQ ID NO:1)的EC50除以本发明多肽的EC50,再乘以100。“EC50”是能够达到最大活性的50%的多肽的浓度。
在cAMP亲近闪烁检测中,检测本发明一些多肽的胰高血糖素受体的肽信号可以用如下方法检测。将在含1%BSA和100μM IBMX的Hepes-碳酸氢盐-PBS中的新分离的大鼠肝细胞铺96孔平板,浓度为7.5×105细胞/孔或2×105细胞/孔。在5%CO2/95%O2,37℃平衡10分钟,加入浓度是1×10-12M~1×10-5M的肽再平衡15分钟。将平板稍离心一下,弃去培养缓冲液,用裂解试剂裂解细胞,裂解试剂是和cAMP亲近闪烁检测直接筛选系统(Amersham Pharmacia Biotech Inc,Piscataway,NJ)一起提供的。
根据试剂盒中的说明书可以测定裂解物中的cAMP的量。绘制各浓度的肽产生的cAMP量,用Prizm软件进行非线性回归分析,以确定EC50。本发明多肽中胰高血糖素受体激活的平均相对活性(在50%应答时,胰高血糖素和多肽浓度的比值×100,根据三次试验的最小值确定)小于5%。诱导的最大活性是天然肽胰高血糖素的28.3%~71.3%(根据三次试验的最小值确定)。
杂合肽抑制胰高血糖素的能力可以用如下方法检测。在5%CO2/95%O2,37℃平衡10分钟,然后在细胞中加入10μM肽,紧接着再加入次最高浓度的胰高血糖素,再平衡15分钟。细胞裂解和cAMP的检测如上文所述进行。
在减掉每个数据点中未刺激肝细胞中产生的cAMP量后,抑制百分比用如下方法计算。抑制百分比是在次最高浓度胰高血糖素和10μM肽存在情况下产生的cAMP减去单独用次最高浓度胰高血糖素产生的cAMP,得到的数除以单独用次最高浓度胰高血糖素产生的cAMP量,再乘以100所得到的值。表2中公开的多肽的胰高血糖素活性的平均抑制百分比是11.3%~59%(根据三次试验的最小值确定)。参考表4。
实施例12
从大鼠肝细胞释放的葡萄糖的检测
和大鼠肝细胞中葡萄糖释放的检测一样,对胰高血糖素介导的葡萄糖产量的抑制率典型说至少约20%至约100%(即20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%)。
可以用如下方法检测本发明的一些多肽对胰高血糖素介导的葡萄糖产量的抑制。把肝细胞加入平底96孔板中(2×105/100μl/孔),在培养箱中,在95%O2/5%CO2气流中37℃恒速摇晃预培养10分钟。在肝细胞中加入胰高血糖素和肽或者只加入胰高血糖素后,再培养30分钟。然后用15%的高氯酸裂解细胞,并在2600rpm,4℃下将平板离心15min。上清液用1M Tris-HCl(pH8.0)∶2.5N KOH(45∶55)中和,再次离心。根据己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Methods ofEnzymatic Analysis,H.U.Bermeyer,Ed.,Academic Press)和平板读数器上的A340读数(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)分析得到的上清液中的葡萄糖。
减去每个数据点中未刺激肝细胞中产生的葡萄糖后,计算葡萄糖的产量和抑制百分率。抑制百分率是在1nM胰高血糖素单独存在时产生的葡萄糖减去1nM胰高血糖素和100nM肽存在时产生的葡萄糖,除以1nM胰高血糖素单独存在时产生的葡萄糖,得到的结果再乘以100。具如SEQ ID NO:6所是氨基酸序列的多肽可以将胰高血糖素介导的葡萄糖分泌抑制47%,这从三个实验中已确定。参看表2。
实施例13
通过灌流大鼠胰岛检测胰岛素分泌
在这个实验中,通过灌流胰岛,可以将胰岛素的分泌至少增加1.5倍。本发明多肽的GLP-1受体激动剂成分能使灌流胰岛中胰岛分泌增加至少1.5至约10倍(即1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0或10倍)。
本发明一些多肽介导的灌流大鼠胰岛中胰岛素的分泌可以用如下方法检测。由这些多肽刺激的胰岛素分泌的双相反应可以通过胰岛灌流来检测。在灌流室放入50个胰岛,用含3mM葡萄糖的HEPES-KRB在37℃灌流。60分钟后,将胰岛暴露在加或不加肽(50nM)的含8mM葡萄糖的缓冲液中,再灌流30分钟。为了确定胰岛素产量,每隔1或5分钟分部收集灌流产物。用ELISA试剂盒(Alpco Diagnostics,Windham,NH)检测胰岛素。具SEQ ID NO:6氨基酸序列的多肽在50nM时,能使灌流胰岛中胰岛素的分泌增加2倍,这和用50nM GLP-1增加的倍数相当。
实施例14
分散的大鼠胰岛细胞中的胰岛素分泌
在这个试验中,分散的大鼠胰岛细胞中胰岛素分泌增加至少1.5倍。本发明多肽的GLP-1受体激动剂成分能使分散的胰岛中胰岛分泌增加至少1.5至约10倍(即1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0或10倍)。
本发明各多肽介导的分散的大鼠胰岛中胰岛素的分泌可以用如下方法检测。利用胶原酶通过消化从SD大鼠(200g~250g)中分离出兰氏小岛。用胰蛋白酶处理可制备分散的胰岛细胞,接种在96V底的平板上,并使之沉淀。细胞在培养基上中培养过夜。弃去培养基,细胞用含3mM葡萄糖的Krebs-Ringer-HEPES缓冲液在37℃预培养30分钟。去掉预培养缓冲液,用含合适浓度葡萄糖(例如8mM)的Krebs-Ringer-HEPES缓冲液和肽或不加肽在37℃刺激细胞一段时间。在一些研究中,也包括合适浓度的GLP-1。去掉一部分上清,用SPA检测胰岛素含量。结果表示成对照的倍数。在浓度为50nM时,具SEQ ID NO:27所示氨基酸的多肽能使分散胰岛中胰岛素的分泌增加约3倍。参考表2。
实施例15
检测喂食的Wistar大鼠中胰高血糖素刺激的葡萄糖产量
在这个实验中,胰高血糖素刺激的葡萄糖产量至少被抑制了20%。本发明多肽的胰高血糖素受体拮抗剂成分能抑制胰高血糖素介导的血糖浓度的升高,喂食的Wistar大鼠中胰高血糖素刺激的葡萄糖产量被抑制至少20%至约100%(即20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%)。
可以用如下方法检测喂食的Wistar大鼠中胰高血糖素刺激的葡萄糖产量。用异氟烷气简单地将雄性Wistar大鼠麻醉,用葡萄糖计检测尾巴血中的血糖。然后把媒介物(0.9%盐水+1%人白蛋白)、0.29nmol/kg胰高血糖素、1nmol/kg本发明的多肽或胰高血糖素+本发明的多肽注射入小鼠尾巴静脉。然后去掉麻醉,在10分钟、20分钟、30分钟后从尾巴放血。
在葡萄糖曲线中,减去基本葡萄糖水平(dAUG)后,通过分析面积来确定葡萄糖被抑制的程度。百分抑制可以这么定义:单由0.3nmol/kg胰高血糖素产生的葡萄糖量减去0.3nmol/kg胰高血糖素和1nmol/kg杂合肽存在时产生的葡萄糖,除以单由0.3nmol/kg胰高血糖素产生的葡萄糖量,再乘以100。
仅仅胰高血糖素就能增加血糖水平,而仅仅本发明的多肽却对血糖水平没效果。具SEQ ID NO:6氨基酸序列的本发明多肽能抑制血糖中胰高血糖素介导的葡萄糖升高63%。参看表2。
实施例16
检测喂食的Balb/c大鼠中胰高血糖素刺激的葡萄糖产量
在这个实验中,葡萄糖的产量被抑制了至少约20%。优选的,本发明多肽的胰高血糖素受体拮抗剂成分能抑制小鼠中胰高血糖素介导的血糖浓度的升高,喂食的Balb/c大鼠中胰高血糖素刺激的葡萄糖产量被抑制至少约20%至约100%(即20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%)。
可以用如下方法检测喂食的Balb/c大鼠中胰高血糖素刺激的葡萄糖产量。把媒介物(0.9%盐水+1%人白蛋白)或100μg/kg衍生的多肽在胰高血糖素刺激前17小时通过皮下注射入喂食的雄性Balb/c大鼠中。第二天,大鼠尾静脉注射100μg/kg胰高血糖素或媒介物之前,禁食两个小时。在注射胰高血糖素之前,用葡萄糖计检测尾巴血中的血糖,15分钟后再重复一次。
计算每只小鼠每隔15分钟葡萄糖的变化。然后从接受各处理的每只小鼠的葡萄糖变化中减去用媒介物处理的群体中葡萄糖的平均变化,就获得了由胰高血糖素所引发的葡萄糖的变化。百分抑制定义是:单由10μg/kg胰高血糖素所产生的葡萄糖减去由10μg/kg胰高血糖素和100μg/kg杂合肽存在时产生的葡萄糖量,除以单由100μg/kg胰高血糖素所产生的葡萄糖,再乘以100。参看表3。
表3
葡萄糖(mg/dl) | ||||||
组别 | 0分钟 | 15分钟 | Delta(15-0) | -媒介物delta | 10μg/kg胰高血糖素的百分数 | 抑制率% |
媒介物 | 92 | 108 | 16 | |||
10μg/kg胰高血糖素 | 95 | 195 | 100 | 84 | 100 | |
10μg/kg胰高血糖素+100μg多肽(SEQ IDNO:27) | 75 | 150 | 75 | 59 | 69 | 31 |
实施例17
在禁食的Wistar大鼠的体内葡萄糖耐量试验中,血浆胰岛素水平增加的检测
在这个实验中,血浆中胰岛素水平增加至少约2倍。优选的,本发明多肽的胰高血糖素受体拮抗剂成分能增加大鼠中胰岛素分泌,在禁食的Wistar大鼠的在体葡萄糖耐量试验中,血浆胰岛素水平增加约2至约5倍,更优选的是约2至约10倍,尤为优选的是约2至约20倍(即2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20倍)。
在禁食的Wistar大鼠的在体葡萄糖耐量试验中,血浆胰岛素水平增加可以用本发明的多肽按如下方法检测。雄性Wistar大鼠禁食过夜,然后用异氟烷气麻醉。通过尾静脉注射入0.4g/kg的葡萄糖和媒介物(0.9%生理盐水+1%白蛋白),或加上1nmol/kg GLP-1(阳性对照),或加上1nmol/kg本发明的多肽。大鼠眼部放血一分钟,然后利用ELISA试剂盒(Alpco Diagnostics(Windham,NH))检测血浆中的胰岛素。在1nmol/kg的浓度时,具SEQ ID NO:6氨基酸的多肽能促进胰岛素分泌3-4倍,这和1nmol/kg GLP-1获得的效果一样。参看表2。
实施例18
在腹腔内葡萄糖耐量试验(IPGTT)中,本发明肽对大鼠或小鼠的效果
在这个试验中,检测到血糖水平下降了至少约10%。优选的,本发明多肽的胰高血糖素受体拮抗剂成分能降低大鼠或小鼠血糖水平,在大鼠或小鼠的腹腔内葡萄糖耐量试验中,下降了约10%至约60%,更优选的是约10%至约80%,尤为优选的是约10%至约100%(即10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%)。
在大鼠或小鼠的腹腔内葡萄糖耐量试验中,血糖水平可以用本发明的多肽按如下方法检测。本发明多肽皮下给药后,检测它们在大鼠或小鼠中的活性。禁食过夜的大鼠或小鼠中皮下注射入对照或肽(100μg/kg)。在给肽前或给衍生的肽后3~17小时检测基本的血糖水平,而且2g/kg的葡萄糖通过腹腔给药的方式注射入大鼠或小鼠。在15、30和60分钟后检测大鼠血糖水平,在30或60分钟后检测小鼠血糖水平。
根据IPGTT试验,本发明的多肽相对媒介物而言,能显著地降低血糖水平,在葡萄糖AUC中达到13-54%。这证明肽降低葡萄糖的活性延长,体内半寿期延长。GLP-1在体内有非常短的半寿期(<10分钟)。在本发明肽给药后3小时,它能降低血糖水平的能力清楚的表明肽正好在这个时间点出现在循环中,因此,相对GLP-1而言具有更长的半寿期。
实施例19
肽聚乙二醇化
可以用本领域技术人员众所周知的方法进行聚乙二醇化。然而,在这个例子中,聚乙二醇化是用如下方式完成的,在肽中导入一个唯一的半胱氨酸突变,然后通过肽中巯基和甲氧基-PEG-马来酰亚胺试剂(Inhale/Shearwater)的马来酰亚胺基之间的一个稳定的硫醚键对半胱氨酸进行聚乙二醇化。优选的是在肽的C末端导入一个唯一的半胱氨酸残基,从而减少由聚乙二醇化导致的活性下降。
具体来说,2倍摩尔分子数的mPEG-mal(分子量22kD和43kD)加入1mg的肽(例如,SEQ ID NO:25,它在肽的C末端具有突变的半胱氨酸残基),并溶解在pH6.0的反应缓冲液(0.1M NaPO4/0.1M NaCl/0.1M EDTA)中。在室温下反应0.5小时后,用2倍摩尔分子数的DTT或无半胱氨酸的mPEG-mal终止反应。将肽-PEG-mal反应混合物上离子交换层析柱,以除去残余的PEG试剂,紧接着上凝胶过滤层析柱,以除去残余的自由肽。用SDS-PAGE和MALDI-TOF质谱测定聚乙二醇化位点的纯度、质量和数目。用于聚乙二醇化的PEG越小(线性的22kDa的PEG),降低肽活性的可能性更小,而PEG越大,则降低肽活性的可能性就越大。然而,更大的PEG将会进一步增加血浆半寿期,以至于一个星期注射一次都有可能(Harris,等.,PEG化:改进药代动力学的一个新方法,Clin.Pharmacokinet 40:539-551,2001)。
实施例20
GLP-1受体激动剂和胰高血糖素受体拮抗剂多肽的相对能力
表4所列的结合到多肽上的GLP-1(IC50值)可以用实施例8所述的方法进行测定。相对能力值和百分GLP-1活性可以用实施例10所述的方法计算。大鼠或小鼠用100μg/kg肽给药,在给药后3个小时,葡萄糖水平的降低可以用实施例18所述的腹腔内葡萄糖耐量试验来测定。参看表4。
表4所列的结合到肽上的肝细胞膜(IC50)可以用实施例9所示的方法进行测定。胰高血糖素刺激的cAMP增加的抑制百分率可以用实施例11所述的方法进行测定。大鼠或小鼠用100μg/kg肽给药,在给药后17个小时,葡萄糖水平用实施例15和16及表4所报道的方法进行测定。本发明的多肽在体内可以作为GLP-1受体激动剂或胰高血糖素受体拮抗剂。
表4
GLP1 | 胰高血糖素 | |||||||
肽 | RINIC50(nM) | 相对能力(%) | %GLP1max | 体内IpGTTAUC的降低(%)a | 肝IC50(nM) | %抑制胰高血糖素刺激的cAMP增加 | %胰高血糖素降低刺激的血糖增加b | |
胰高血糖素 | 1.8 | |||||||
GLP-1 | 0.4 | 100 | 100 | |||||
G1 | 6 | 6.9 | 112.1 | 6.6 | ||||
G5 | 0.5 | 69.9 | 109.4 | 243.1 | ||||
G27 | 2.2 | 13.4 | 98.1 | 69.3 | 31 | |||
G51 | 8.2 | 58.1 | 91.2 | 154.1 | 35.2 | |||
G55 | 9.8 | 18.6 | 115.9 | 139.2 | 32.1 | |||
G56 | 6.6 | 37.2 | 114.8 | 125.3 | 28.6 | |||
G57 | 14.7 | 18.3 | 132.4 | 177.5 | 18.4 | |||
G58 | 6.9 | 76.1 | 99.0 | 163.5 | 32.6 | |||
G59 | 2.1 | 22.7 | 101.7 | 97.5 | 41.1 | |||
G60 | 13.8 | 22.3 | 95.7 | 682 | 21.8 | |||
G61 | 10.6 | 12.1 | 96.0 | 232 | 45.2 | |||
G71 | 5.8 | 4.3 | 93.3 | 25.6 | 11.3 | |||
G74 | 4.4 | 8.4 | 88.7 | 21.7 | 23.7 | |||
G75 | 7.7 | 6.6 | 86.1 | 54.0 | 17.1 | |||
G76 | 10.2 | 7.7 | 85 | 59.1 | 23.0 | |||
G77 | 8.9 | 9.5 | 92.1 | 61.1 | 18.6 |
G277 | ND | 1.8 | 93.7 | 46 | 65.5 | |||
G82 | 8.1 | 29.9 | 97.1 | 33.6 | 30.2 | |||
G83 | 3.2 | 29.9 | 89.4 | 28.6 | 24.7 | |||
G84 | 1.4 | 61.8 | 113.9 | 11.7 | 25.2 | |||
G85 | 1.5 | 64.5 | 95.8 | 16.1 | 27.9 | |||
G185 | 4.5 | 13.0 | 103.9 | 48 | 32 | |||
G2185 | 56.1 | 6.2 | 112.7 | 44 | 347 | |||
G4185 | 248 | 0.7 | 98.3 | 36 | 547 | 31 | ||
G87 | 98.6 | 6.1 | 100.4 | 13 | 620 | 59 | ||
G88 | 109.0 | 2.3 | 118.3 | 16 | 350 | |||
G90 | 25.4 | 0.8 | 83.5 | 13 | 726 | |||
G182 | 12.6 | 1.4 | 104.4 | 14 | 220 | |||
G183 | 158.7 | 0.6 | 90.5 | 27 | 663 |
a=100μg/kg肽给药后3小时的小鼠ipGTT实验
b=100μg/kg肽给药后17小时的小鼠胰高血糖素挑战实验
ND=未测定
序列表
<110>Bayer药物公司
Pan,Clark
Whelan,James
Clairmont,Kevin B.
<120>作为GLP-1受体激动剂和胰高血糖素拮抗剂的肽及其在药学上的使用方法
<130>MSB-7288-PCT
<140>PCT/US02/31693
<141>2002-10-04
<150>US 60/327,730
<151>2001-10-05
<160>34
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>29
<212>PRT
<213>人
<400>1
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210>2
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>2
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
20 25 30
<210>3
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>3
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
20 25 30
<210>4
<211>30
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(30)..(30)
<223>酰胺化
<400>4
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Val Lys Gly Arg
20 25 30
<210>5
<211>30
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(30)..(30)
<223>酰胺化
<400>5
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
20 25 30
<210>6
<211>30
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(30)..(30)
<223>酰胺化
<400>6
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Leu Asp Ala
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
20 25 30
<210>7
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>7
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Leu Asp Ala
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
20 25 30
<210>8
<211>30
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(30)..(30)
<223>酰胺化
<400>8
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Arg Tyr Leu Asp Ala
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
20 25 30
<210>9
<211>30
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(30)..(30)
<223>酰胺化
<400>9
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Ala Tyr Leu Asp Ala
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
20 25 30
<210>10
<211>30
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(30)..(30)
<223>酰胺化
<400>10
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Leu Asp Ala
1 5 10 15
Ala Arg Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
20 25 30
<210>11
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>11
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Leu Asp Ala
1 5 10 15
Lys Lys Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
20 25 30
<210>12
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>12
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Arg Tyr Leu Asp Ala
1 5 10 15
Lys Lys Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
20 25 30
<210>13
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>13
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Leu Asp Ala
1 5 10 15
Ala Lys Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
20 25 30
<210>14
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>14
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Arg Tyr Leu Asp Ala
1 5 10 15
Ala Lys Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
20 25 30
<210>15
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>15
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Leu Asp Ala
1 5 10 15
Arg Arg Ala Cys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
20 25 30
<210>16
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>16
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Leu Asp Ala
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Cys Gly Arg Gly
20 25 30
<210>17
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>17
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Leu Asp Ala
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Cys Arg Gly
20 25 30
<210>18
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>18
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Leu Asp Ala
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Cys Gly
20 25 30
<210>19
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>19
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Leu Asp Ala
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Cys
20 25 30
<210>20
<211>31
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(31)..(31)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(31)..(31)
<223>聚乙二醇化
<400>20
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Leu Asp Ala
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Cys
20 25 30
<210>21
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>21
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Arg Tyr Leu Asp Ala
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
20 25 30
<210>22
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>22
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Arg Tyr Leu Asp Ala
1 5 10 15
Arg Arg Ala Arg Glu Phe Ile Lys Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
20 25 30
<210>23
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>23
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Arg Tyr Leu Asp Ala
1 5 10 15
Arg Arg Ala Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
20 25 30
<210>24
<211>32
<212>PRT
<213>人
<400>24
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Arg Tyr Leu Asp Ala
1 5 10 15
Arg Arg Ala Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly Lys
20 25 30
<210>25
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>25
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Arg Tyr Leu Asp Ala
1 5 10 15
Arg Arg Ala Arg Glu Phe Ile Lys Trp Leu Val Arg Gly Arg Cys
20 25 30
<210>26
<211>31
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(31)..(31)
<223>聚乙二醇化
<400>26
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Arg Tyr Leu Asp Ala
1 5 10 15
Arg Arg Ala Arg Glu Phe Ile Lys Trp Leu Val Arg Gly Arg Cys
20 25 30
<210>27
<211>31
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(31)..(31)
<223>聚乙二醇化
<400>27
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Arg Tyr Leu Asp Ala
1 5 10 15
Arg Arg Ala Arg Glu Phe Ile Lys Trp Leu Val Arg Gly Arg Cys
20 25 30
<210>28
<211>30
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(30)..(30)
<223>酰胺化
<400>28
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Leu Asp Ala
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
20 25 30
<210>29
<211>31
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>脂类
<222>(31)..(31)
<223>棕榈酸化
<400>29
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Leu Asp Ala
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Lys
20 25 30
<210>30
<211>31
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>脂类
<222>(24)..(24)
<223>棕榈酸化
<400>30
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Arg Tyr Leu Asp Ala
1 5 10 15
Arg Arg Ala Arg Glu Phe Ile Lys Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
20 25 30
<210>31
<211>32
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>脂类
<222>(32)..(32)
<223>棕榈酸化
<400>31
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Arg Tyr Leu Asp Ala
1 5 10 15
Arg Arg Ala Arg Glu Phe Ile Lys Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly Lys
20 25 30
<210>32
<211>31
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>脂类
<222>(24)..(24)
<223>棕榈酸化
<400>32
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Arg Tyr Leu Asp Ala
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Glu Phe Ile Lys Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
20 25 30
<210>33
<211>35
<212>PRT
<213>人
<400>33
Ile Glu Gly Arg His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Lys
1 5 10 15
Tyr Leu Asp Ala Arg Arg Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys
20 25 30
Gly Arg Gly
35
<210>34
<211>31
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(12)
<223>X11=R,G,S,A,K,或T
X12=K,N,R,A,S,H,或Q
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(18)
<223>X16=A,F,S,W,T,H,K,R,V,I,L,M,N,Q,G,或Y
X17=R,A,L,M,V,Q,K,F,I,W,N,D,E,H,S,T,G,或Y
X18=K,R,F,I,L,Y,V,M,A,G,或H
<400>34
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Xaa Xaa Tyr Leu Asp Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
20 25 30
Claims (17)
1.一种多肽,其选自SEQ ID NOs:6-32,及其功能相当的片段、衍生物和变体。
2.编码权利要求1所述多肽的多核苷酸,或其简并变体。
3.含有权利要求2所述多核苷酸的载体。
4.含有权利要求3所述载体的宿主细胞。
5.一种制备多肽的方法,其包括:
a)在适合表达所述多肽的条件下培养权利要求4所述的宿主细胞;和
b)从宿主细胞培养物中回收多肽。
6.一种药用组合物,其含有权利要求1所述的多肽和药学上可接受的载体。
7.一种基因治疗组合物,其含有权利要求2所述的多核苷酸和治疗有效性基因治疗载体。
8.根据权利要求1所述的多肽,其中所述多肽由SEQ ID NO:25所示。
9.根据权利要求1所述的多肽,其中所述多肽由SEQ ID NO:26所示。
10.根据权利要求1所述的多肽,其中所述多肽由SEQ ID NO:27所示。
11.一种纯化抗体,其与权利要求1所述的多肽特异性结合。
12.一种治疗哺乳动物代谢紊乱的方法,其包括给哺乳动物施用治疗有效量的肽,所述肽是GLP-1受体激动剂和胰高血糖素拮抗剂。
13.根据权利要求12所述的方法,其中肽选自SEQ ID NOs:6-32,及其功能相当的片段、衍生物和变体。
14.根据权利要求13所述的方法,其中肽选自SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27。
15.根据权利要求12所述的方法,其中所述代谢紊乱是2型糖尿病。
16.根据权利要求12所述的方法,其中所述治疗有效量为约0.1μg/kg~约1mg/kg。
17.根据权利要求12所述的方法,其中所述代谢紊乱是葡萄糖耐量异常的前驱糖尿病状态。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US32773001P | 2001-10-05 | 2001-10-05 | |
US60/327,730 | 2001-10-05 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1564828A true CN1564828A (zh) | 2005-01-12 |
CN1326876C CN1326876C (zh) | 2007-07-18 |
Family
ID=23277790
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNB02819716XA Expired - Fee Related CN1326876C (zh) | 2001-10-05 | 2002-10-04 | 作为glp-1受体激动剂和胰高血糖素拮抗剂的肽及其在药学上的使用方法 |
Country Status (28)
Country | Link |
---|---|
US (6) | US7399745B2 (zh) |
EP (1) | EP1436330A4 (zh) |
JP (1) | JP2005508639A (zh) |
KR (1) | KR20050034580A (zh) |
CN (1) | CN1326876C (zh) |
AR (1) | AR036711A1 (zh) |
BR (1) | BR0213132A (zh) |
CA (1) | CA2462462A1 (zh) |
CO (1) | CO5570710A2 (zh) |
DO (1) | DOP2002000475A (zh) |
EC (2) | ECSP024346A (zh) |
HK (1) | HK1073117A1 (zh) |
HN (1) | HN2002000282A (zh) |
HR (1) | HRP20040327A2 (zh) |
HU (1) | HUP0401797A2 (zh) |
IL (1) | IL160706A0 (zh) |
MA (1) | MA26228A1 (zh) |
MX (1) | MXPA04002140A (zh) |
MY (1) | MY138267A (zh) |
NO (1) | NO20041792L (zh) |
NZ (1) | NZ532685A (zh) |
PE (1) | PE20030850A1 (zh) |
PL (1) | PL368760A1 (zh) |
RU (1) | RU2334761C2 (zh) |
SG (2) | SG158736A1 (zh) |
UY (1) | UY27469A1 (zh) |
WO (1) | WO2003040309A2 (zh) |
ZA (1) | ZA200403322B (zh) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101983208A (zh) * | 2008-03-27 | 2011-03-02 | 伊莱利利公司 | 胰高血糖素受体拮抗剂 |
CN102123723A (zh) * | 2008-06-17 | 2011-07-13 | 印第安纳大学研究及科技有限公司 | 胰高血糖素/glp-1受体共激动剂 |
CN103477224A (zh) * | 2011-03-04 | 2013-12-25 | 贝克顿·迪金森公司 | 含有溶血磷脂酶抑制剂的血液收集装置 |
CN113461785A (zh) * | 2021-04-13 | 2021-10-01 | 湖南中晟全肽生化有限公司 | Glp-1受体激动剂及其应用 |
CN114401981A (zh) * | 2019-06-18 | 2022-04-26 | 北京费森尤斯卡比医药有限公司 | 胰高血糖素制造方法 |
Families Citing this family (56)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006501820A (ja) * | 2002-09-06 | 2006-01-19 | バイエル・フアーマシユーチカルズ・コーポレーシヨン | 修飾glp−1受容体アゴニストおよびそれらの薬理学的使用法 |
CA2518336A1 (en) | 2003-03-19 | 2004-11-04 | Eli Lilly And Company | Polyethelene glycol link glp-1 compounds |
US20050124550A1 (en) * | 2003-06-18 | 2005-06-09 | Peri Krishna G. | Compounds that modulate the glucagon response and uses thereof |
MXPA06006745A (es) | 2003-12-18 | 2006-08-18 | Novo Nordisk As | Compuestos glp-1 novedosos. |
TW200643033A (en) * | 2005-03-08 | 2006-12-16 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Conjugate of water-soluble modified hyaluronic acid and glp-1 analogue |
JP5755398B2 (ja) | 2005-03-18 | 2015-07-29 | ノヴォ ノルディスク アー/エス | 伸長されたglp−1化合物 |
TWI362392B (en) | 2005-03-18 | 2012-04-21 | Novo Nordisk As | Acylated glp-1 compounds |
WO2007056362A2 (en) * | 2005-11-07 | 2007-05-18 | Indiana University Research And Technology Corporation | Glucagon analogs exhibiting physiological solubility and stability |
TWI430806B (zh) | 2006-09-13 | 2014-03-21 | Smithkline Beecham Corp | 用於投與長效降血糖藥劑之方法 |
MX2009006564A (es) * | 2007-01-05 | 2009-06-26 | Univ Indiana Res & Tech Corp | Analogos de glucagon que muestran solubilidad potenciada en amortiguadores a ph fisiologico. |
KR20090119876A (ko) * | 2007-02-15 | 2009-11-20 | 인디애나 유니버시티 리서치 앤드 테크놀로지 코퍼레이션 | 글루카곤/glp-1 수용체 공동-항진물질 |
WO2008098693A2 (en) * | 2007-02-16 | 2008-08-21 | Bayer Healthcare Ag | Convergent synthesis of glp-1 |
US8981047B2 (en) | 2007-10-30 | 2015-03-17 | Indiana University Research And Technology Corporation | Glucagon antagonists |
ES2558155T3 (es) * | 2007-10-30 | 2016-02-02 | Indiana University Research And Technology Corporation | Compuestos que muestran actividad antagonista de glucacón y agonista de GLP-1 |
KR101277560B1 (ko) * | 2007-12-11 | 2013-06-25 | 카딜라 핼쓰캐어 리미티드 | 글루카곤 안타고니스트 활성 및 glp-1 아고니스트 활성의 펩티드 유사체 |
CN101983066B (zh) * | 2008-01-30 | 2016-06-29 | 印第安那大学科技研究公司 | 基于酯的胰岛素前药 |
SG192405A1 (en) * | 2008-06-17 | 2013-08-30 | Univ Indiana Res & Tech Corp | Gip-based mixed agonists for treatment of metabolic disorders and obesity |
WO2009155257A1 (en) * | 2008-06-17 | 2009-12-23 | Indiana University Research And Technology Corporation | Glucagon analogs exhibiting enhanced solubility and stability physiological ph buffers |
CN102112157B (zh) | 2008-08-06 | 2013-05-29 | 诺沃-诺迪斯克保健股份有限公司 | 具有延长的体内效能的缀合蛋白 |
PL2373681T3 (pl) | 2008-12-10 | 2017-07-31 | Glaxosmithkline Llc | Kompozycje farmaceutyczne albiglutydu |
JP2012512903A (ja) | 2008-12-19 | 2012-06-07 | インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーション | アミド系グルカゴンスーパーファミリーペプチドプロドラッグ |
TWI504405B (zh) | 2009-01-22 | 2015-10-21 | Novo Nordisk Healthcare Ag | 穩定的生長激素化合物 |
SG176858A1 (en) | 2009-06-16 | 2012-02-28 | Univ Indiana Res & Tech Corp | Gip receptor-active glucagon compounds |
WO2011015649A1 (en) | 2009-08-06 | 2011-02-10 | Novo Nordisk Health Care Ag | Growth hormones with prolonged in-vivo efficacy |
GB0917072D0 (en) | 2009-09-29 | 2009-11-11 | Univ Ulster | Peptide analogues of glucagon for diabetes therapy |
US8703701B2 (en) | 2009-12-18 | 2014-04-22 | Indiana University Research And Technology Corporation | Glucagon/GLP-1 receptor co-agonists |
EP2359843A1 (en) | 2010-01-21 | 2011-08-24 | Sanofi | Pharmaceutical composition for treating a metabolic syndrome |
AU2011208620B2 (en) | 2010-01-22 | 2015-04-16 | Novo Nordisk Health Care Ag | Stable growth hormone compounds |
BR112012018116B1 (pt) | 2010-01-22 | 2022-06-21 | Novo Nordisk Health Care Ag | Conjugados de hormônio do crescimento com eficácia in vivo prolongada |
EP2528618A4 (en) | 2010-01-27 | 2015-05-27 | Univ Indiana Res & Tech Corp | GLUCAGON ANTAGONISTE AND GIP AGONISTS CONJUGATES AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF METABOLISM DISEASES AND ADIPOSITAS |
US8691763B2 (en) | 2010-05-04 | 2014-04-08 | Glaxosmithkline Llc | Methods for treating or preventing cardiovascular disorders and providing cardiovascular protection |
EP2569000B1 (en) | 2010-05-13 | 2017-09-27 | Indiana University Research and Technology Corporation | Glucagon superfamily peptides exhibiting nuclear hormone receptor activity |
CA2797089A1 (en) | 2010-05-13 | 2011-11-17 | Indiana University Research And Technology Corporation | Glucagon superfamily peptides exhibiting g protein-coupled receptor activity |
MX2012014576A (es) | 2010-06-24 | 2013-02-21 | Univ Indiana Res & Tech Corp | Profarmacos de peptido de la superfamilia de glucagon basado en amida. |
MA34885B1 (fr) | 2010-12-22 | 2014-02-01 | Indiana Unversity Res And Technology Corp | Analogues du glucagon presentant una ctivite de recepteur de gip |
BR112013032717A2 (pt) | 2011-06-22 | 2017-01-24 | Univ Indiana Res & Tech Corp | coagonistas do receptor de glucagon/glp-1 |
US9156902B2 (en) | 2011-06-22 | 2015-10-13 | Indiana University Research And Technology Corporation | Glucagon/GLP-1 receptor co-agonists |
EP2548570A1 (en) | 2011-07-19 | 2013-01-23 | Sanofi | Pharmaceutical composition for treating a metabolic syndrome |
CA2847246A1 (en) | 2011-11-17 | 2013-05-23 | Indiana University Research And Technology Corporation | Glucagon superfamily peptides exhibiting glucocorticoid receptor activity |
CA2877358A1 (en) | 2012-06-21 | 2013-12-27 | Indiana University Research And Technology Corporation | Glucagon analogs exhibiting gip receptor activity |
WO2014158900A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-02 | Indiana University Research And Technology Corporation | Insulin-incretin conjugates |
WO2014166836A1 (en) | 2013-04-05 | 2014-10-16 | Novo Nordisk A/S | Growth hormone compound formulation |
EP3098235A4 (en) | 2014-01-20 | 2017-10-18 | Hanmi Pharm. Co., Ltd. | Long-acting insulin and use thereof |
US10189884B2 (en) | 2014-04-28 | 2019-01-29 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Thioamide-modified peptides and uses thereof |
WO2015183984A2 (en) * | 2014-05-28 | 2015-12-03 | Stealth Peptides International, Inc. | Therapeutic compositions including tocopherol and uses thereof |
AR100639A1 (es) | 2014-05-29 | 2016-10-19 | Hanmi Pharm Ind Co Ltd | Composición para tratar diabetes que comprende conjugados de análogos de insulina de acción prolongada y conjugados de péptidos insulinotrópicos de acción prolongada |
TWI684458B (zh) * | 2014-05-30 | 2020-02-11 | 南韓商韓美藥品股份有限公司 | 包含胰島素及glp-1/昇糖素雙重促效劑之治療糖尿病之組成物 |
AU2015294371B2 (en) | 2014-07-21 | 2018-02-01 | The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Ang-(1-7) derivative oligopeptides and methods for using and producing the same |
US10183055B2 (en) | 2014-07-21 | 2019-01-22 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Ang-(1-7) derivative oligopeptides for the treatment of pain and other indications |
CN108271356A (zh) | 2014-09-24 | 2018-07-10 | 印第安纳大学研究及科技有限公司 | 肠降血糖素-胰岛素缀合物 |
UY36870A (es) | 2015-08-28 | 2017-03-31 | Hanmi Pharm Ind Co Ltd | Análogos de insulina novedosos |
US11396534B2 (en) | 2016-09-23 | 2022-07-26 | Hanmi Pharm. Co., Ltd. | Insulin analogs with reduced affinity to insulin receptor and use thereof |
EP3604328A4 (en) | 2017-03-23 | 2021-01-06 | Hanmi Pharm. Co., Ltd. | REDUCED INSULIN ANALOGUE COMPLEX FOR INSULIN RECEPTOR AND ITS USE |
US20220056077A1 (en) | 2018-12-04 | 2022-02-24 | Københavns Universitet | Dual agonist glp-1 and neurotensin fusion peptide |
US11934931B2 (en) * | 2018-12-17 | 2024-03-19 | Shape Security, Inc. | Decision tree training using a database system |
CN115322794A (zh) | 2020-01-11 | 2022-11-11 | 北京质肽生物医药科技有限公司 | Glp-1和fgf21的融合蛋白的缀合物 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP3262329B2 (ja) * | 1990-01-24 | 2002-03-04 | アイ. バックレイ,ダグラス | 糖尿病治療に有用なglp―1アナログ |
ATE135372T1 (de) * | 1991-01-17 | 1996-03-15 | Zymogenetics Inc | Verfahren zum nachweis von glucagon-antagonisten |
US5846747A (en) * | 1992-03-25 | 1998-12-08 | Novo Nordisk A/S | Method for detecting glucagon-like peptide-1 antagonists and agonists |
US5480867A (en) * | 1993-12-29 | 1996-01-02 | The Rockefeller University | Glucagon analogs with serine replacements |
US5782802A (en) * | 1996-03-22 | 1998-07-21 | Vitajet Corporation | Multiple use needle-less hypodermic injection device for individual users |
US6232310B1 (en) * | 1999-03-12 | 2001-05-15 | Novo Nordisk A/S | Fused 1,4-thiazine-2-carbonitrile derivatives, their preparation and use |
US7041646B2 (en) * | 2001-10-05 | 2006-05-09 | Bayer Pharmaceuticals Corporation | Methods of treating type 2 diabetes with peptides acting as both GLP-1 receptor agonists and glucagon receptor antagonists |
-
2002
- 2002-10-01 AR ARP020103706A patent/AR036711A1/es unknown
- 2002-10-03 MY MYPI20023695A patent/MY138267A/en unknown
- 2002-10-03 PE PE2002000981A patent/PE20030850A1/es not_active Application Discontinuation
- 2002-10-03 DO DO2002000475A patent/DOP2002000475A/es unknown
- 2002-10-03 UY UY27469A patent/UY27469A1/es not_active Application Discontinuation
- 2002-10-04 MX MXPA04002140A patent/MXPA04002140A/es not_active Application Discontinuation
- 2002-10-04 SG SG200602178-6A patent/SG158736A1/en unknown
- 2002-10-04 KR KR1020047004830A patent/KR20050034580A/ko not_active Application Discontinuation
- 2002-10-04 EP EP02776122A patent/EP1436330A4/en not_active Withdrawn
- 2002-10-04 JP JP2003542556A patent/JP2005508639A/ja active Pending
- 2002-10-04 SG SG200602184-4A patent/SG149693A1/en unknown
- 2002-10-04 HN HN2002000282A patent/HN2002000282A/es unknown
- 2002-10-04 PL PL02368760A patent/PL368760A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2002-10-04 IL IL16070602A patent/IL160706A0/xx unknown
- 2002-10-04 RU RU2004114243/13A patent/RU2334761C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-10-04 WO PCT/US2002/031693 patent/WO2003040309A2/en active Application Filing
- 2002-10-04 HU HU0401797A patent/HUP0401797A2/hu unknown
- 2002-10-04 BR BR0213132-3A patent/BR0213132A/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-10-04 CA CA002462462A patent/CA2462462A1/en not_active Abandoned
- 2002-10-04 NZ NZ532685A patent/NZ532685A/en unknown
- 2002-10-04 CN CNB02819716XA patent/CN1326876C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-11-20 EC EC2002004346A patent/ECSP024346A/es unknown
-
2004
- 2004-04-06 HR HR20040327A patent/HRP20040327A2/xx not_active Application Discontinuation
- 2004-04-07 CO CO04033093A patent/CO5570710A2/es not_active Application Discontinuation
- 2004-04-23 MA MA27651A patent/MA26228A1/fr unknown
- 2004-05-03 NO NO20041792A patent/NO20041792L/no not_active Application Discontinuation
- 2004-05-03 ZA ZA200403322A patent/ZA200403322B/en unknown
- 2004-05-05 EC EC2004005094A patent/ECSP045094A/es unknown
- 2004-11-29 US US10/999,622 patent/US7399745B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-07-06 HK HK05105701A patent/HK1073117A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2005-08-26 US US11/213,083 patent/US20060003418A1/en not_active Abandoned
- 2005-08-26 US US11/213,023 patent/US7488715B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-08-26 US US11/212,439 patent/US7488714B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-08-26 US US11/213,026 patent/US7488716B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-08-26 US US11/213,087 patent/US7494978B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101983208A (zh) * | 2008-03-27 | 2011-03-02 | 伊莱利利公司 | 胰高血糖素受体拮抗剂 |
CN102123723A (zh) * | 2008-06-17 | 2011-07-13 | 印第安纳大学研究及科技有限公司 | 胰高血糖素/glp-1受体共激动剂 |
CN102123723B (zh) * | 2008-06-17 | 2016-05-25 | 印第安纳大学研究及科技有限公司 | 胰高血糖素/glp-1受体共激动剂 |
CN103477224A (zh) * | 2011-03-04 | 2013-12-25 | 贝克顿·迪金森公司 | 含有溶血磷脂酶抑制剂的血液收集装置 |
CN103477224B (zh) * | 2011-03-04 | 2015-12-23 | 贝克顿·迪金森公司 | 含有溶血磷脂酶抑制剂的血液收集装置 |
US9459187B2 (en) | 2011-03-04 | 2016-10-04 | Becton, Dickinson And Company | Blood collection device containing lysophospholipase inhibitor |
CN114401981A (zh) * | 2019-06-18 | 2022-04-26 | 北京费森尤斯卡比医药有限公司 | 胰高血糖素制造方法 |
CN113461785A (zh) * | 2021-04-13 | 2021-10-01 | 湖南中晟全肽生化有限公司 | Glp-1受体激动剂及其应用 |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN1564828A (zh) | 作为glp-1受体激动剂和胰高血糖素拮抗剂的肽及其在药学上的使用方法 | |
CN1191273C (zh) | 长效促胰岛肽 | |
CN1305897C (zh) | 新肽化合物和其制备方法及含有它们的药物组合物 | |
CN1483041A (zh) | Glp-1融合蛋白 | |
CN1044820A (zh) | 胰岛素类似物 | |
CN1703424A (zh) | Glp-1衍生物及其经粘膜吸收的制剂 | |
CN1070500C (zh) | 甲状旁腺激素类似物和甲状旁腺激素相关肽:合成和治疗骨质疏松症的用途 | |
CN1516739A (zh) | 利用hmg片段作为抗炎症试剂 | |
CN1635898A (zh) | 超级活性的猪生长激素释放激素类似物 | |
CN101068832A (zh) | 包含唯bh3域蛋白中bh3结构域的融合蛋白 | |
CN1933848A (zh) | 用于治疗性干预的y2选择性受体激动剂 | |
CN1161468C (zh) | Mpl配体类似物 | |
CN101062954A (zh) | 具有抗血管生成作用的融合蛋白及其编码基因与应用 | |
CN1256347C (zh) | 激肽原第五结构域-肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的融合蛋白及其制法和用途 | |
CN1705492A (zh) | 用于诱发抗过敏原保护性免疫应答的重组核酸 | |
CN1283793C (zh) | 具有骨骼肌刺激活性和免疫调节作用的趋化素样因子超家族 | |
CN1257187C (zh) | 钙网蛋白-肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的融合蛋白及其制法和用途 | |
CN1839155A (zh) | 胰高血糖素样肽的纯化 | |
CN1057096C (zh) | 蛋白质pl40多肽及编码该多肽的DNA | |
CN1220702C (zh) | 促胰岛素分泌肽及其用途 | |
CN1274717C (zh) | 一种新型免疫抑制融合蛋白、其编码核酸及其用途 | |
CN1262562C (zh) | 来源于sart-1的hla-a2限制性肿瘤抗原肽 | |
CN1603346A (zh) | 蛋白质,含有其的产品及其在诊断、治疗和/或预防sars相关疾病中的用途 | |
CN1100957A (zh) | 重组产品 | |
CN1954882A (zh) | 长效人重组可溶性肿瘤坏死因子α受体在制备防治肝衰竭药物中的用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1073117 Country of ref document: HK |
|
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
C17 | Cessation of patent right | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20070718 Termination date: 20101004 |