KR101277560B1 - 글루카곤 안타고니스트 활성 및 ｇｌｐ-1 아고니스트 활성의 펩티드 유사체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 주로 글루코즈 의존 인슐린 분비촉진제로서 작용하는 식 (I)의 신규한 펩티드 유사체를 제공한다. 또한, 이 펩티드 유사체는 GLP-I 수용체 아고니스트 활성과 함께 글루카곤 수용체 안타고니스트 활성을 보이는 것으로 밝혀졌다.

Description

글루카곤 안타고니스트 활성 및 ＧＬＰ-1 아고니스트 활성의 펩티드 유사체 {Peptidomimetics with glucagon antagonistic and GLP-1 agonistic activities}

본 발명은 일반식 (I)의 신규한 화합물, 그의 토토머 형태, 그의 약제학적으로 허용가능한 염 및 그를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

A-Z₁-Z₂-Z₃-Z₄-Z₅-Z₆-Z₇-Z₈-Z₉-Z₁₀-Z₁₁-B (I)

또한, 본 발명은 일반식 (I)의 화합물, 그의 토토머 형태, 그의 약제학적으로 허용가능한 염 및 그를 포함하는 약제학적 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

당뇨병은 췌장 β-세포로부터의 인슐린 분비 부전, 인슐린 저항성(insulin resistance) 또는 둘 모두를 특징으로 한다 (Cavaghan, M.K., et al., J. Clin. Invest. 2000, 106, 329). 타입 2 당뇨병 환자의 대다수는 간 글루코즈 생산을 감소시키고(글루카곤 안타고니스트), 글루코즈 흡수 형태 GIT를 감소시키고, β-세포 기능을 자극시키는 약제(인슐린 분비촉진제) 또는 인슐린에 대한 환자의 조직 감수성을 증진시키는 약제(인슐린 민감제)로 치료될 수 있다. 타입 2 당뇨병을 치료하는데 현재 사용되는 약물은 α-글루코시다제 억제제, 인슐린 민감제, 인슐린 분비촉진제 및 K_ATP 채널 차단제 (Chehade, J. M., et al., Drugs, 2000, 60, 95)를 포함한다. 그러나, 타입 2 당뇨병 환자의 거의 절반이 시간이 흐름에 따라 이 약물들에 대한 그들의 반응성을 상실하여 인슐린 치료법을 필요로 한다. 인슐린 치료는 몇 가지 단점을 가지며, 주사가능하고, 저혈당증을 초래하고 체중 증가를 유발한다(Burge, M.R., Diabetes Obes. Metab., 1999, 1, 199).

현재 치료법에서의 문제들은 타입 2 당뇨병을 치료하기 위한 새로운 치료법을 필요로 한다. 이러한 점에 있어서, 췌장에서 글루코즈-의존 인슐린 분비를 촉진하는 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1) 아고니스트 및 글리코겐분해 (glycogenolysis) 및 글루코즈신생(gluconeogenesis)을 억제하는 것에 의해 간 글루코즈 생산을 억제하는 글루카곤 수용체 안타고니스트가 치료적 대안으로 발견되었다. 따라서, GLP-1 아고니스트 및 글루카곤 안타고니스트는 모두 순환하는 글루코즈 레벨을 감소시키고 타입 2 당뇨병의 치료 및 예방을 위한 유용한 치료제임이 발견되었다 (Perry, T.A., et al., Trends Pharmacol. ScL, 2003, 24, 377).

글루카곤 및 GLP-1은 구조적으로 관련된 펩티드 호르몬 패밀리 (분비 패밀리)의 일원이다. 글루카곤 및 GLP-1은, 조직 특이적 가공으로 주로 장에서는 GLP-1 생산을, 췌장에서는 글루카곤 생산을 가져오는 공통전구물질, 프리프로글루카곤(preproglucagon)으로부터 유래되기 때문에 이 두 호르몬은 펩티드의 고 상동성(highly homologous) 세트를 구성한다 (Jiang, G., et al., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., 2003, 284, E671-678). 이 두 펩티드의 수용체들은 동종(58% 동일성)이고 G-단백질 커플링된 수용체(G-protein coupled receptor: GPCR)의 클래스 B 패밀리에 속한다. 클래스-B GPCR은 분비 수용체 패밀리라고도 불리우며, 인간에서 15종의 펩티드-결합 수용체로 이루어진다. GPCR 수용체는 연결 루프(intervening loop) 및 C-말단 꼬리를 갖는 일곱 개의 막 관통 α 나선(seven membrane-spanning α-helices)의 막근접(juxtamembrane) 도메인(J-domain)에 연결된 100-160개 잔기의 세포 외 N-말단 도메인을 포함한다(Brubaker, P. L., et al., Receptors Channels, 2002, 8, 179). 클래스 B GPCR은 통상적으로 30-40개의 아미노산으로 구성된 중간 크기의 내생 펩티드 리간드에 의해 활성화된다(Hoare, S.R.J., Drug. Discovery Today, 2005, 10, 423; Gether, U., Endocrine Reviews, 2000, 21, 90).

글루카곤은 PC2에 의해 췌장 α-세포에 있는 프로글루카곤으로부터 가공된 29-아미노산 펩티드 호르몬이다. 글루카곤은 485개의 아미노산으로 이루어지는 일곱 개의 막관통 GPCR을 통해 작용한다. 글루카곤은 혈중 글루코즈(circulating glucose)가 낮은 농도일 때 혈류로 방출된다. 글루카곤의 주요 생리학적 역할은 간 글루코즈 배출을 자극하여 당혈증(glycemia)의 증가를 이끄는 것이다(Tan, K., et al., Diabetologia, 1985, 28, 435). 글루카곤은 인 비보에서 글루코즈 항상성을 유지시키는데 있어 인슐린에 대한 주요한 반대조절 기작을 제공한다. 글루카곤과 그의 수용체는 당뇨병 치료를 위한 잠재적 표적이다. 글루카곤 수용체에서 분비된 글루카곤의 작용을 차단하는 것에 의해 (글루카곤 안타고니스트) 또는 글루카곤 생산 그 자체를 억제(저해)하는 것에 의해 글루카곤 작용을 길항시키는 것은 당뇨병 및 대사 질환의 개입을 위한 새로운 수단을 제시한다 (Unson, C. G., et al., Peptides, 1989, 10, 1171; Parker, J. C, Diabetes, 2000, 49, 2079; Johnson, D. G., Science, 1982, 215, 1115; Ahn, J. M., JMC, 2001, 44(9), 1372-1379).

GLP-1 (7-36) 아미드는 프리프로글루카곤 유전자의 생성물로, 음식의 소화에 반응하여 장 L-세포로부터 분비된다. GLP-1의 생리학적인 작용은 상당한 흥미를 끈다. GLP-1은 글루코즈 의존 방식으로 췌장 β-세포로부터 인슐린 분비를 촉진시키는 것에 의해 복합적인 작용을 발휘한다(인슐린 촉진(insulinotropic) 작용). GLP-1은 α-세포로부터 글루카곤의 분비(생산)를 억제함으로써 순환하는 혈장 글루카곤 농도를 낮춘다 (Drucker D. J., Endocrinology, 2001, 142, 521-527). 또한 GLP-1은 β-세포 성장 자극, 식욕 억제, 지연된 위 배출 및 인슐린 감수성 자극과 같은 특성을 보인다 (Nauck, M. A., Horm. Metab. Res., 2004, 36, 852). 현재, 리라글루티드(Liraglutide)/NN2211 (Novo Nordisk; Phase-III; WO 1998 008871), BIM 51077 (Ipsen; Phase-II; WO 2000 034331), CJC-1131 (ConjuChem; Phase-II; WO 2000 069911) 및 ZP-10 (Zealand and Aventis; Phase-II; WO 2001 004156)과 같은 GLP-1 및 EX-4의 다양한 유사체가 임상 개발의 상이한 단계에 있다 (Nauck M. A., Regulatory Peptides, 2004, 115, 13). 최근 BYETTA^®(Exendin-4, AC 2933; US 5424286)가 US 시장에 출시 되었다(Amylin and Lilly). 그러나 모든 기존의 GLP-1 아고니스트들은 비경구적 투여 경로에 의해 전달되어 환자 비순응성이 기존 GLP-1 기반 치료법의 주요한 문제이다.

글루카곤 및 GLP-1 수용체의 효과기(effector) 시스템은 아데닐릴 시클라제 (AC) 효소이다. 글루카곤 또는 GLP-1 아고니스트와 글루카곤 또는 GLP-1 수용체와(GLP-1 R)의 상호작용은 각각 ATP를 cAMP로 변환하는 AC의 활성화를 유발한다. 세포 내 cAMP 레벨의 증가는 ADP/ATP의 비율을 증가시켜, (K_ATP 채널의 폐쇄로 인한)세포 탈분극을 개시시킨다. 또한, 세포 내 cAMP 레벨의 증가는 L-타입 Ca^{2 +} 채널을 개방하여 세포질(cystolic) Ca^{2 +} 농도를 증가시키는 단백질 키나아제(PK-A 및 PK-C)를 활성화한다. 세포 내 Ca^{2 +}의 증가는 췌장 β-세포에서 인슐린 및 α-세포에서 글루카곤 펩티드의 세포 외 유출(exocytosis)을 초래한다 (Fehmann, H.C., Endocr. Rev., 1995, 16, 390).

하기에 보여지는 GLP-1 및 글루카곤 서열 정렬은 1차 구조 관계를 나타낸다:

글루카곤: NH₂-¹HSQGTFTSD⁹YSKYLDSRRAQDFVQWLMNT²⁹-CONH₂

(서열번호 1)

GLP-1(7-36): NH₂-¹HAEGTFTSD⁹VSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR³⁰-CONH₂

(서열번호 2)

C-말단 아미드를 갖는 GLP-1 펩티드의 처음 N-말단 1-9개의 잔기:

NH₃ ⁽⁺⁾-¹HAE^(-)GTFTSD^{9 (-)}-CONH₂(서열번호 3):순 음전하(Net charge Negative)

C-말단 아미드를 갖는 글루카곤 펩티드의 처음 N-말단 1-9개의 잔기:

NH₃ ⁽⁺⁾-¹HSQGTFTSD^{9 (-)}-CONH₂ (서열번호 4):순 중성전하(Net charge Neutral)

Zubay, G., Biochemistry 2^nd ed., 1988, MacMillan Publishing, New York, p. 33에서 아미노산의 한 글자 약어를 확인할 수 있다.

천연 또는 합성 GLP-1 펩티드는 디펩티딜 펩티다제-IV (DPP-IV)와 같은 단백질 분해효소에 의해 비활성 대사물로 빠르게 대사되어 GLP-1의 약물로서의 사용을 제한한다 (Deacon, C. F., Regulatory Peptides, 2005, 128, 117). 유사하게, 다양한 구조의 여러 비펩티드 글루카곤 수용체 안타고니스트 또는 펩티드 글루카곤 수용체 안타고니스트가 최근 몇 년간에 걸쳐 보고되고 있지만,활발하게 개발되거나 임상 시험 하에 있는 것은 없다 (Kurukulasuriya, R., Expert Opinion Therapeutic Patents, 2005, 15, 1739; Lau, J., J. Med. Chem., 2007, 50, 113; Petersen, K. F. Diabetologia, 2001, 44, 2018; Cascieri, M. A., JBC, 1999, 274, 8694). 클래스 B GPCR에 대한 비펩티드 리간드(특히 아고니스트)를 식별하는 것이 약을 발견하는데 본질적인 장애인 것으로 사료된다. HTS는 명백히 약간의 히트(hit)(US 2005/6927214; WO 2000/042026; US 2007/0043093)를 가져왔지만 상응하는 수용체에 대한 이러한 히트를 스크리닝하는 것은, 특히 인 비보 조건 하에서(동물 모델), 위음성(false negative)인 경향이 있다(Murphy, K.G., PNAS, 2007, 104, 689).

글루카곤 및 GLP-1은 모두 전반적인 글루코즈 항상성에 있어 주요한 역할을 한다 (Drucker, D. J., J. Clin. Invest., 2007, 117, 24; Bollyky, J., J. Clin, Endocrinol. Metab., 2007, 92, 2879). 글루카곤은 글루코즈신생 및 글리코겐분해를 촉진하는 것에 의해 혈장 글루코즈 농도를 높이나, 반면 GLP-1은 글루코즈 의존 인슐린 분비에 의해 매개 되는 혈장 글루코즈 농도를 낮춘다 (Mojsov, S., et al., JBC, 1990, 265, 8001). 최근 수 년간 정상 혈중 글루코즈 농도를 유지하는데에 있어 글루카곤 펩티드 및 GLP-1의 중요성이 밝혀졌기 때문에, 글루카곤 수용체 안타고니스트 및 GLP-1 수용체 아고니스트로서 작용하는 하나의 리간드를 식별하는데 상당한 관심이 있어왔다 (Claus, T. H., J. Endocrinology, 2007, 192, 371; Pan C.Q., JBC, 2006, 281, 12506).

비록 강력한 비펩티드 GLP-1 아고니스트의 식별은 어려울 수 있지만 (Chen, D., PNAS, 2007, 104, 943; Knudsen, L. B., PNAS, 2007, 104, 937), 글루카곤 안타고니스트 및 GLP-1 수용체 아고니스트로서 작용하는 하이브리드 펩티드 유사체(peptidomimetic)의 디자인은 타입 2 당뇨병의 치료를 위한 새로운 접근을 제공할 수 있을 것이다(Claus, T.H., J. Endocrinology, 2007, 192, 371). 최근, 주로 글루카곤 펩티드의 N-말단 잔기(잔기 1-26)와 GLP-1 펩티드의 마지막 C-말단 4개의 잔기(VKGR)를 결합시키는 것에 의해 구축된, GLP-1 수용체 아고니스트 및 글루카곤 수용체 안타고니스트로 작용하는 일련의 키메라 펩티드들이 보고되고 있다 (Pan C.Q., et al., US 6864069 B2; Pan C.Q., JBC, 2006, 281, 12506).

글루카곤 및 GLP-1 서열에서 개개의 아미노산이 하는 역할을 결정하는 구조-활성 관계 (SAR) 연구가 문헌으로 보고되어 왔다 (Runge, S., JBC, 2003, 278, 28005; Mann, R., Biochem. Soc. Trans., 2007, 35, 713). 글루카곤 및 GLP-1은 수용액에서 정해진 구조를 갖지 않지만, 마이셀의 존재 시 또는 막 유사 환경(membrane mimetic environment)에서는 유연한 N- 및 C- 말단 영역과 함께, 중간-부분에서 α-나선형 구조를 갖는다 (Thornton, K., Biochemistry, 1994, 33, 3532; Neidigh, J. W., Biochemistry, 2001, 40, 13188). 이는 그들 각각의 수용체에 펩티드 리간드의 결합을 위해서는 나선형 구조가 필요하다는 것을 암시한다. 두 펩티드의 N-말단 영역에 있는 아미노산의 돌연변이 또는 결실은 수용체 안타고니스트 또는 비활성 화합물의 결과를 가져오고, 이는 글루카곤 및 GLP-1 펩티드에 의한 수용체 활성을 위해서는 N-말단이 중요함을 시사한다 (Hjorth, S.A., JBC, 1994, 269, 30121; Green, B. D., J. MoI. Endocrinology, 2003, 31, 529). 인 비보에서, GLP-1은, N-말단 위치의 전종단(penultimate)에 프롤린 또는 알라닌 잔기를 포함하는 펩티드를 절단하는 역할을 하는 프로테아제인, 디펩티딜-펩티다제 IV (DPP IV)에 의해 빠르게 분해되어 그 결과 비활성 대사체가 된다. GLP-1 펩티드의 두 번째 위치에 있는 Ala를 D-Ala, Aib 또는 Hfl (헥사플루오로루신)로 치환하는 것과 같은 DPP-IV 감수성 위치의 치환은 혈장 안정성을 크게 향상시킨다 (Deacon, C. F., Diabetes, 1998, 47, 764; Meng, H., J. Med. Chem., 2008, 51, 7303-7307).

본 조사에서, 본 발명자들은 글루카곤 펩티드의 N-말단 서열(처음 1-9개 잔기, 서열번호 4)와 두 개의 비천연(unnatural) 아미노산의 디펩티드와의 커플링은 다양한 정도의 선택성으로, 글루카곤 안타고니스트 및 GLP-1 아고니스트 활성을 모두 갖는 새로운 클래스의 펩티드 유사체의 식별을 가져온다는 것을 발견했다. DPP-IV 효소에 대한 작용 기간 및 안정성을 증진시키기 위해 본 발명자들은 선택적으로 하이브리드 펩티드 유사체를 Z₂ 위치에서 D-Ala, Aib, α-메틸 프롤린 (α-Me-Pro), 1-아미노-시클로펜탄카복실산(APP) 및 1-아미노-시클로프로판 카복실산(ACP)과 같은 비천연 아미노산으로 위치-특이적으로 변형시키고, 짧은 펩티드 유사체의 식별에 성공하였다. 몇몇의 펩티드 유사체는 글루카곤 안타고니스트 및 GLP-1 아고니스트 활성을 모두 유지하는 동시에, 심지어 경구 투여 경로에 의해서도 효능을 나타냈다.

선행 기술 및 디자인 전략

Xaa1-Xaa9은 GLP-1 펩티드의 처음 1-9개 잔기(HAEGTFTSD; 서열번호 3)를 나타내는 것인 일반식 Xaa1-Xaa11의 일련의 N-말단 변형 GLP-1 조절자가, Xaa2는 Ala를 나타내거나 선택적으로 Aib로 치환되고, Xaa3은 글루카곤 펩티드의 N-말단 서열(HSQGTFTSD, 서열번호 4)에서 보존되어 있는 Gln (Q)은 아닌, 글루탐산 및 아스파르트산과 같은 카복실산 곁사슬을 갖는 아미노산을 나타내는 것인 몇몇의 유사체와 함께 보고되어왔다. Xaa6은 Phe를 나타내거나 선택적으로 -α-Me-2F-Phe-로 치환되고, Xaa9는 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴 등과 같은 카복실산 또는 아미드 곁사슬을 갖는 아미노산을 나타내고, Xaa10은 치환되거나 치환되지 않은 비페닐 알라닌 (Bip)유도체를 나타내고, 및 Xaa11은 치환되거나 치환되지 않은 비페닐 알라닌(Bip) 유도체 또는 치환되거나 치환되지 않은 2-아미노-5-페닐-펜탄산 (APPA) 유도체를 나타낸다 (WO 2003/033671 A2; US 2004/0127423 A1; WO 2004/094461 A2; US 2006/0004222 A1; WO 2006/014287 A1; WO 2006/127948 A2; WO 2007/082264 A2; US 2007/0021346 A1; US2007/0099835; US 2007/0238669A1; WO 2007/140284 A2; US 2006/7145040B2; US 2007/7238671 B2; US 2007/7238670 B2; US 2007/0287670 A1; US 2008/0045461 A1).

이전에, 주로 글루코즈 의존 인슐린 분비를 보이는, 결합 구성요소로서 2개의 비천연 아미노산(치환되거나 치환되지 않은 비페닐 알라닌 (Bip) 유도체)의 디펩티드와 공유결합에 의해 연결되고, 활성화 구성 요소로서 글루카곤 펩티드의 N-말단 서열(처음 1-9 잔기, 서열번호 4)로 주로 이루어지는 일련의 신규한 11개의 아미노산 펩티드 유사체가 보고되었다. 또한, 이 펩티드 유사체들은 GLP-1 수용체 아고니스트 활성과 함께 글루카곤 수용체 안타고니스트 활성도 나타냈다 (WO 2008/ 062457 A2).

본 발명에서, 식 (I)의 신규한 펩티드 유사체(이하 펩티드 유사체로 지칭됨)가 보고된다. 본 발명에서, 비페닐 알라닌 (Bip) 기반 디펩티드 결합 구성요소 대신, 본 발명자들은 치환되거나 치환되지 않은 Bip(OMe)-APPA 기반 디펩티드 유도체를 결합 구성요소로 사용하였다. 놀랍게도, GLP-1 펩티드의 N-말단 서열의 처음 9개 잔기(HAEGTFTSD; 서열번호 3) 대신 본 발명자들이 이 디펩티드를 글루카곤 펩티드의 N-말단 서열의 처음 9개 잔기(¹HSQGTFTSD⁹; 서열번호: 4)에 부착하였을 때, 이 펩티드 유사체(NH₃ ⁺-HSQGTFTSD-Bip(OMe)-(APPA)-CONH₂; 서열번호 5)가 GLP-1 수용체 아고니스트 활성과 함께, 주로 글루카곤 수용체 안타고니스트 활성을 보임을 발견하였다 (도 1).

식 (I)의 신규 펩티드 유사체는 주로 글루카곤 수용체 안타고니스트로 작용하며 GLP-1R 아고니스트 효과도 나타낸다. 본 발명에서 보고된 상이한 펩티드 유사체는 글루카곤 및 GLP-1 수용체에 대한 상이한 레벨의 친화도/선택성과 함께, 상당한 글루코즈 의존 인슐린 분비(인 비트로)를 나타내고 혈중 글루코즈 레벨을 감소시켰다(인 비보). 또한, 보고된 이전의 펩티드 유사체와 비교하여(예를 들면, WO 2008/062457 A2에서와 같은 유사체) 치환되거나 치환되지 않은 Bip(OMe)-APPA 기반 디펩티드 유도체를 결합 구성요소로 하는 이 펩티드 유사체들은 단백질분해 절단에 대해, 특히 DPP-IV, 위 및 장 효소에 대한 증가된 안정성을 나타냈다. 그러므로, 몇몇의 펩티드 유사체는 증진된 경구 생체이용률과 함께 GIT 효소 및 위의 산성 pH에 대해 안정적인 것으로 확인되어, 타입 1 및 타입 2 당뇨병, 대사성 질환 및 관련 질환의 치료/ 완화/ 예방을 위한 적절한 후보가 된다.

발명의 요약

본 발명은 글루카곤 수용체의 안타고니스트 및 GLP-1 수용체의 아고니스트로 기능하는, 두 수용체에 대해 상이한 정도의 친화도/선택성을 갖고, 당뇨병의 치료 및 혈중 글루코즈 레벨을 감소시키는데 유용한 일군의 신규한 펩티드 유사체를 기술한다. 이 펩티드 유사체는 하기에 주어진 일반식 (I)에 의해 정의된다. 본 발명의 펩티드 유사체는 인슐린 및 글루카곤 작용의 조절에 의해 인간 또는 동물체의 치료에 있어 유용하다. 신규하고 대사적으로 안정적인 결합 구성요소의 결합(incorporation)으로 인해, 본 발명의 펩티드 유사체는 증진된 경구 생체이용률을 보이고 따라서 타입 1 및 타입 2 당뇨병 및 관련 대사 질환의 치료/ 완화/조절 또는 예방을 위해 적절한 것으로 드러났다.

바람직한 구체예

본 발명의 바람직한 구체예는 당뇨병의 치료/ 완화/조절에 적절한, 일반식 (I)의 신규한 펩티드 유사체, 그의 토토머 형태, 그의 합성에 관련되는 신규한 중간체, 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 그의 약제학적으로 허용가능한 용매화합물 및 상기 유사체 또는 그의 혼합물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

다른 바람직한 구체예에서 일반식 (I)의 신규한 펩티드 유사체, 그의 토토머형태, 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 약제학적으로 허용가능한 용매화합물 및 그들을 포함하는 약제학적 조성물의 제조를 위한 방법이 제공된다.

또 다른 바람직한 구체예에서, 일반식(I)의 펩티드 유사체, 그의 토토머 형태, 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화합물 및 그들의 혼합물을 포함하고, 약제학적으로 허용가능한 담체, 용매, 희석제, 부형제 및 그의 제조에 보통 사용되는 다른 매질(media)를 갖는 약제학적 조성물이 제공된다.

또 다른 바람직한 구체예에서, 식(I)의 펩티드 유사체 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 조성물의 치료적으로 유효한 무독성 양(effective, non-toxic amount)을 치료를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 것에 의한, 항당뇨병제로서의 본 발명의 신규한 펩티드 유사체의 용도가 제공된다.

사용된 약어

하기의 약어가 실시예 및 본 명세서에서 사용된다:

Aib = α-아미노이소부티르산 (α-Aminoisobutyric acid),

ACN = 아세토니트릴 (Acetonitrile),

APPA = 2-아미노-5-페닐펜탄산 (2-Amino-5-phenylpentanoic acid),

ACPP = 2-아미노-5-(3-클로로페닐)펜탄산 (2-Amino-5-(3-chlorophenyl)penta noic acid),

ADMP= 2-아미노-5-(3,5-디메틸페닐)펜탄산 (2-Amino-5-(3,5-dimethylphenyl) pentanoic acid),

AMCB= 2-아미노-5-(4-클로로-2-메틸페닐)펜탄산 (2-Amino-5-(4-chloro-2-me thylphenyl)pentanoic acid),

2F-APPA= 2-아미노-5-(2-플루오로페닐)펜탄산 (2-Amino-5-(2-flurophenyl)pe ntanoic acid),

2,4-diF-APPA= 2-아미노-5-(2,4-디플루오로페닐)펜탄산 (2-Amino-5-(2,4-diflurophenyl)pentanoic acid),

2CF₃-APPA= 2-아미노-5-(2-(트리플루오로메틸)페닐)펜탄산) (2-Amino-5-(2-(trifluoromethyl)phenyl)pentanoic acid),

2CF₃,4F-APPA= 2-아미노-5-(4-플루오로-2-(트리플루오로메틸)페닐)펜탄산 (2 -Amino-5-(4-fluro-2-(trifluoromethyl)phenyl)pentanoic acid),

2F, 4CF₃-APPA= 2-아미노-5-(2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐)펜탄산 (2-Amino-5-(2-fluoro-4-(trifluoromethyl)phenyl)pentanoic acid),

2Cl-APPA= 2-아미노-5-(2-클로로페닐)펜탄산 (2-Amino-5-(2-chlorophenyl)pe ntanoic acid),

2Cl, 4OMe-APPA= 2-아미노-5-(2-클로로-4-메톡시페닐)펜탄산 (2-Amino-5-(2-chloro-4-methoxyphenyl)pentanoic acid),

Bip = 비페닐알라닌 (Biphenylalanine),

Bip(OMe)= 2'-에틸-4'-메톡시-비페닐알라닌 (2'-ethyl-4'-methoxy-biphenyla lanine),

α-Me-Bip(OMe)= α-메틸화 Bip(OMe) (α-methylated Bip(OMe)),

N(Me)-Bip(OMe)= N-메틸화 Bip(OMe) (N-methylated Bip(OMe)),

Bn = 벤질 (Benzyl),

Boc = 터트-부톡시카보닐 (tert-Butoxycarbonyl),

Bu^t = O-터트-부틸기 (O-tert-butyl group),

cAMP= 아데노신 3',5'-시클릭 모노포스페이트 (Adenosine 3',5'-cyclic mono phosphate),

DCM = 디클로로메탄 (Dichloromethane),

DMF = N,N-디메틸포름아미드 (N,N-Dimethylformamide),

DIPCDI= 디-이소프로필카보디이미드 (Di-isopropylcarbodiimide),

DIPEA= 디이소프로필에틸아민 (Diisopropylethylamine),

Et = 에틸 (Ethyl),

Et₂O = 디에틸 에테르 (Diethyl ether),

Fmoc = 플루오레닐메톡시카보닐 (Fluorenylmethoxycarbonyl),

g = 그램 (Gram)(s),

GLP-1R = 글루카곤 유사 펩티드-1 수용체 (Glucagon Like Peptide- 1 Recept or),

Glucagon R= 글루카곤 수용체 (Glucagon receptor),

h = 시간 (Hour) (s),

Hfl = 5,5,5,5',5',5'-2S-헥사플루오로루신 (5,5,5,5',5',5'-2S-hexafluorol eucine),

HOBt = 히드록시벤조트리아졸 (Hydroxybenzotriazole),

HOAt= 7-아자-히드록시벤조트리아졸 (7-Aza-hydroxybenzotriazole),

HBTU = 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸 아미늄 헥사플루오로포스페이트 (2-(lH-benzotriazole-l-yl)-l,l,3,3-tetramethyl aminium hexafluorop hosphate),

HPLC = 고성능 액체 크로마토그래피 (High Performance Liquid Chromatogra phy),

i.p.= 복막 내 (intraperitonial),

L = 리터 (Liter),

LC/MS = 액체크로마토그래피/질량 분석 (Liquid Chromatography / Mass Spectrometry),

Me = 메틸 (Methyl),

Min = 분 (minute) (s),

mL = 밀리리터 (milliliter),

㎕ = 마이크로리터 (microliter),

mg = 밀리그램 (milligram) (s),

mmol = 밀리몰 (millimole) (s),

MS= 질량 분석 (Mass Spectrometry),

PyBOP = 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노-포스포니움 헥사플루오로포스페이트 (Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorop hosphate),

SPPS = 고체 상 펩티드 합성 (Solid Phase Peptide Synthesis),

sc = 피하 (subcutaneous),

TMS = 트리메틸실릴 (Trimethylsilyl),

TIPS = 트리이소프로필실란 (Triisopropylsilane),

TFA = 트리플루오로아세트산 (Trifluoroacetic acid),

TBTU= 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸아미니움 테트라플루오로보레이트 (2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium tetrafluoro borate),

Trt= 트리틸기 (Trityl group),

발명의 상세한 설명

본 발명에 따른, 구조 식 (I)을 갖는 합성 펩티드 유사체는 글루코즈 의존 인슐린 분비를 보인다. 또한, 이러한 펩티드 유사체들은 GLP-1 수용체 아고니스트 활성과 함께 글루카곤 수용체 안타고니스트 활성을 보이는 것으로 밝혀졌다. 이러한 이중 작용 펩티드 유사체는 단백질 분해 절단, 특히 DPP-IV (디펩티딜 펩티다제-IV) 효소에 대해 증가된 안정성을 나타낸다. 대부분의 펩티드 유사체들이 쥐 혈장에서 24 시간까지 (인 비트로) 안정한 것으로 밝혀졌고 펩신과 같은 GIP 효소 및 산성 위 pH 에 대해, 및 간 미세소체에 대해서도 (인 비트로) 증가된 안정성을 나타냈다. 증가된 대사 안정성으로 인하여, 이러한 펩티드 유사체의 일부는 당뇨병 및 관련 대사 질환의 치료 또는 예방을 위해 경구 투여에 의해 전달될 수도 있다.

A- Z ₁ - Z ₂ - Z ₃ - Z ₄ - Z ₅ - Z ₆ - Z ₇ - Z ₈ - Z ₉ - Z ₁₀ - Z ₁₁ -B

(I)

상기 A는, R₁이 수소, 또는 선택적으로 치환된 직쇄형 또는 분지형 (C₁-C₁₀) 알킬 사슬을 나타내고; R₃은 직쇄형 또는 분지형 (C₁-C₁₀) 알킬, (C₃-C₆) 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 아릴알킬 기로부터 선택되는 것인, -NH-R₁, R₃-CO-, R₃-O-CO- 또는 R₃-SO₂-기를 나타내고;

바람직한 구체예에서, 상기 아릴 기는 페닐, 디페닐, 나프틸, 인다닐, 플루오레닐 또는 비페닐 기로부터 선택되고; 헤테로아릴 기는 피리딜, 티에닐, 퓨릴, 이미다졸릴, 벤조퓨라닐 기로부터 선택되고;

B는, R₂가 H, 상기 정의된 것과 같은, 선택적으로 치환된, 직쇄형 또는 분지형 (C₁-C₁₀) 알킬기, 아릴 또는 아랄킬기(aralkyl group)로부터 선택된 기를 나타내는 것인 -COOR₂, -CONHR₂ 또는 CH₂OR₂을 나타내고;

Z₁ 내지 Z₁₁은 다른 언급이 없는 한, 아미드 결합으로 서로 연결된 천연(natural) 또는 비천연(unnatural) 아미노산을 나타낸다.

Z₁은 L-히스티딘 (H), D-히스티딘 (dH) 또는 우로칸산 (UA)를 나타내고;

Z₂는 L-세린 (S), D-세린 (dS), L-알라닌 (A), D-알라닌 (dA), α-메틸 프롤린 (α-Me-Pro), α-아미노-이소부티르 산 (Aib), 1-아미노 시클로프로판 카복실산 (ACP), 1-아미노-시클로펜탄카복실산 (APP)으로 이루어진 군으로부터 선택된 천연또는 비천연적으로 생성된 아미노산을 나타내고;

Z₃은 L-글루타민 (Gln; Q), D-글루타민 (dQ) 또는 식II의 화합물 (CNB 또는 Hfl)을 나타낸다.

Z₄는 글리신 (G) 또는 비천연 아미노산 1-아미노 시클로프로판 카복실산 (ACP) 또는 1-아미노-시클로펜탄카복실산 (APP)을 나타내고;

Z₅는 히드록실 곁사슬을 포함하는 천연 또는 비천연적으로 생성된 아미노산을 나타내고; 바람직한 Z₅는 L-트레오닌 (T), D-트레오닌 (dT), L-알로-트레오닌 (allo-Thr; allo-T), D-알로-트레오닌 (d-allo-Thr; d-allo-T)이고;

Z₆는 두 개의 곁사슬을 갖는 이치환 알파 탄소를 갖는 천연 또는 비천연적으로 생성된 아미노산을 나타내고, 상기 각 곁사슬은 독립적으로, 하나 이상의 알킬기 또는 하나 이상의 할로기로부터 선택될 수 있는 치환기로 선택적으로 치환된 알킬 또는 아릴 또는 아랄킬기일 수 있다. 바람직한 Z₆은 페닐알라닌 (Phe; F), 알파-메틸-페닐알라닌 (-α-Me-Phe-), 알파-메틸-2-플루오로페닐알라닌 (-α-Me-2F-Phe-) 또는 알파-메틸-2,6-디플루오로페닐알라닌 (-α-Me-2,6-F-Phe-) 또는 2-플루오로페닐알라닌 (-2F-Phe-)을 나타낸다.

Z₇ 및 Z₈은 독립적으로 히드록실 곁사슬를 포함하는 천연 또는 비천연적으로 생성된 아미노산을 나타내고, 바람직한 Z₇ 및 Z₈은 상기 정의된 것과 같은 트레오닌, 세린, 1-아미노 시클로프로판 카복실산(ACP)으로부터 독립적으로 선택되고;

Z₉는 산성 기를 포함하는 아미노산 곁사슬을 갖는 천연 또는 비천연적으로 생성된 아미노산을 독립적으로 나타낸다. 바람직한 Z₉는 L-아스파르트산 (D), D-아스파르트 산 (dD) 또는 상기 정의된 식 II의 화합물로부터 선택된다.

Z₁₀은 치환되거나 치환되지 않은 2'-에틸-4'-메톡시-비페닐알라닌 (Bip(OMe)) 및 그의 유도체로부터 선택된 식 III (a-c)의 L 또는 D 비천연 아미노산을 나타낸다.

Z₁₁은 치환되거나 치환되지 않은 2-아미노-5-페닐-펜탄산(APPA) 및 그 유도체로부터 선택된 식 IV(a-l)의 L 또는 D 비천연 아미노산을 나타낸다.

다른 구체예에서, Z₉와 Z₁₀ 또는 Z₁₀와 Z₁₁ 또는 Z₉-Z₁₁ 사이의 아미드 결합은 D-(NMe)-(Bip(OMe)); (Bip(OMe))-(NMe)-APPA; D-(NMe)-(Bip(OMe))-(NMe)-APPA와 같이 약어 '(NMe)'로 표시되는, N-메틸화될 수 있고; D-(C=S)-(Bip(OMe)); Bip(OMe)-(C=S)-(APPA); D-(C=S)-(Bip(OMe))-(C=S)-(APPA)와 같이 약어 'C=S'로 표시되는 티오아미드 결합일 수 있고; 또는 D-(CH₂)-(Bip(OMe)); Bip(OMe)-(CH₂)-(APPA); D-(CH₂)-(Bip(OMe))-(CH₂)-(APPA)와 같이 Z₉와 Z₁₀ 또는 Z₁₀와 Z₁₁ 또는 Z₉-Z₁₁ 사이의 티오아미드 결합은 '-CH₂-'기로 환원될 수 있다(데스옥소펩티드: desoxopeptide).

정의:

용어 '천연 아미노산 (natural amino acid)'은 자연에 존재하는 모든 20개의 아미노산을 나타낸다.

용어 '비천연 아미노산 (unnatural amino acid)' 또는 '비자연적 아미노산 (non-natural amino acid)'은 L-Ala를 D-Ala로 대체하는 것 등과 같이 L-아미노산을 상응하는 D-아미노산으로 대체하거나 하기에 의한 L 또는 D 아미노산, 아미노 알킬산의 적절한 변형을 나타낸다:

-α-메틸 Ala (Aib)로 Ala의 치환, Phe의 알파-메틸-페닐알라닌 (-α-Me-Phe-), 알파-메틸-2-플루오로페닐알라닌(-α-Me-2F-Phe-) 또는 알파-메틸-2,6-디플루오로페닐알라닌 (-α-Me-2,6-F-Phe-)으로의 치환(replacement)과 같은 α-알킬화;

-할로겐, (C₁-C₃)알킬, 아릴기에 의한 방향성 아미노산 곁사슬의 치환(substitution), 더 구체적으로 Phe의 알파-메틸-2-플루오로페닐알라닌 (-α-Me-2F-Phe-) 또는 알파-메틸-2,6-디플루오로페닐알라닌 (-α-Me-2,6-F-Phe-)로의 치환(replacement)과 같은 아미노산 곁사슬에의 치환(substitution);

-(NMe)-Bip(OMe) 또는 (NMe)-APPA와 같이 약어 '(NMe)'로 나타내는 아미노산의 N-메틸화;

-약어 'C=S'로 나타내는, 티오아미드 결합으로 아미드 결합의 치환(replacement), 화학적으로 디펩티드의 아미드에서 티오아미드로의 변형은 로젠시약 (Lawssen's reagent)을 사용하여 용액 상 또는 고체 지지체 상에서 보호된 디펩티드의 처리에 의해 성취될 수 있다. 또한, 디펩티드간 티오아미드 결합은 니켈 보라이드 환원을 사용하여 '-CH₂-'기(데스옥소펩티드)로 변환될 수 있다(Jr.Guziec, F.S., Tetrahedron Letters, 1990, 31(1), 23-26).

본 명세서에서 사용된 다양한 기(group), 라디칼 및 치환체는 하기의 단락에 기술된다.

본 명세서에서 홀로 또는 다른 라디칼과 결합하여 사용된 용어 "알킬(alkyl)"은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, 세크(sec)-부틸, 터트-부틸, 아밀, t-아밀, n-펜틸, n-헥실, 이소-헥실, 헵틸, 옥틸, 데실 등과 같은 1 내지 10개의 탄소를 포함하는 직쇄형 또는 분지형 라디칼을 나타낸다.

본 명세서에서 홀로 또는 다른 라디칼과 결합하여 쓰인 용어 "시클로알킬(cycloalkyl)"은 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸 등과 같은 3 내지 7개의 탄소를 포함하는 라디칼을 나타낸다.

본 명세서에 홀로 또는 다른 라디칼과 결합하여 쓰인 용어 "아릴(aryl)" 또는 "방향조(aromatic)"은 페닐, 나프틸, 테트라히드로나프틸, 인단, 비페닐등과 같은 각 고리가 펜던트 방식으로 서로 부착되거나 융합될 수 있는 1개, 2개 또는 3개의 고리를 포함하는 방향족 시스템을 나타낸다.

용어 '아릴알킬(arylalkyl)'은 벤질, 페닐에틸, 나프틸메틸 등과 같이 아릴에 부착된 상기 정의된 것과 같은 알킬기를 나타낸다. 용어 "아릴옥시(aryloxy)"는 치환될 수도 있는, 페녹시, 나프틸옥시 등과 같이 알콕시기에 부착된 상기 정의된 것과 같은 아릴 라디칼을 나타낸다.

용어 "아랄콕시(aralkoxy)"는 치환될 수도 있는, 벤질옥시, 페네틸옥시, 나프틸메틸옥시, 페닐프로필옥시 등과 같이 상기 정의된 것과 같은 아릴알킬 모이어티를 나타낸다.

본 명세서에서 홀로 또는 다른 라디칼과 결합하여 사용된 용어 "헤테로아릴(heteroaryl)" 또는 "헤테로방향족(heteroaromatic)"은 O, N 또는 S로부터 선택된 하나 이상의 헤테로 원자를 포함하고, 각 고리가 펜던트 방식으로 서로 부착되거나 융합될 수 있는 1개, 2개 또는 3개의 고리를 포함하는 방향족 시스템을 나타낸다.

본 명세서에 홀로 또는 다른 라디칼과 결합하여 쓰인 용어 "헤테로아랄킬(heteroaralkyl)"은 1 내지 6개 탄소를 포함하는 직쇄형 또는 분지형 포화 탄소 사슬에 부착된, 상기 정의된 것과 같은, 헤테로아릴기를 나타낸다. 용어 "헤테로아릴옥시(heteroaryloxy)", "헤테로아랄콕시(heteroaralkoxy)", "헤테로시클옥시(heterocycloxy)"는 각각 산소 원자에 부착된, 상기 정의된 것과 같은, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬 기를 나타낸다.

본 명세서에 홀로 또는 다른 라디칼과 결합되어 사용된 용어 "아실(acyl)"은 포밀, 아세틸, 프로파노일, 부타노일, 이소-부타노일, 펜타노일, 헥사노일, 헵타노일, 벤조일 등과 같은, 치환될 수도 있는 1 내지 8개의 탄소를 포함하는 라디칼을 나타낸다.

본 명세서에 홀로 또는 다른 라디칼과 결합되어 사용된 용어 "카복실산(carboxylic acid)"은 -COOH 기를 나타내고, 에스테르 및 아미드와 같은 카복실산 유도체를 포함한다. 본 명세서에 홀로 또는 다른 라디칼과 결합하여 사용된 용어 "에스테르"는 -COO-기를 나타내고, 메톡시카보닐, 에톡시카보닐 등과 같은, 에스테르 모이어티가 알콕시카보닐인 치환될 수도 있는 카복실산 유도체를 포함한다.

다른 언급이 없으면, 홀로 또는 다른 기의 일부로서 본 명세서에 적용되는 용어 '아미노산'은 'α' 탄소로 지칭되는 동일한 탄소에 연결된 아미노기 및 카복실기를 제한 없이 포함한다.

'α' 탄소에서 절대 'S' 배열(configuration)은 보통 'L' 또는 천연 배열로서 지칭된다. 'α' 탄소에서 'R' 배열은 보통 'D' 아미노산으로서 지칭된다. 수소 또는 메틸과 같이 두 'α-치환체'가 동일한 경우에, 아미노산은 Gly 또는 Aib이고 이는 키랄(chiral)이 아니다. 소문자 'd'는 D-아미노산의 키랄성을 나타낸다. 본 명세서에서, 아미노산이 기술될 때마다 다른 언급이 없다면 그것은 L과 D 형태 모두를 포함한다. 따라서, 본 발명에서 표 2는 각 아미노산이 'L' 또는 'D'가 될 수 있는 제조된 펩티드 유사체의 목록을 제공한다.

용어 '수용체 안타고니스트(receptor antagonist)'는 경쟁적 또는 비 경쟁적 결합에 의해, 수용체의 활성화 및 시클릭 AMP와 같은 2차적 메신저의 생성을 억제하는 화합물을 지칭한다.

용어 '글루카곤 수용체 안타고니스트(glucagon receptor antagonist)'는 글루카곤 수용체의 활성화를 억제하는 화합물을 지칭한다.

용어 'GLP-1 수용체 조절자 또는 아고니스트(GLP-1 receptor modulator or agonist)'는 GLP-1 수용체에서 cAMP 생성 및 인슐린 방출과 같은, 하류(down stream) 신호전달 이벤트를 조절하는 그의 능력을 변화시키도록 작용하는 화합물을 지칭한다. 수용체 조절자의 예로 아고니스트, 부분적인 아고니스트, 반대 아고니스트(inverse agonist) 및 알로스테릭 강화제(potentiator)를 포함한다.

본 발명에 따라서, 본 명세서에 기술된 분리된 합성 펩티드 유사체는 주로 글루카곤 수용체 안타고니스트로서 작용한다. 또한 이러한 펩티드 유사체들은 GLP-1 수용체 아고니스트로서도 작용한다는 것이 밝혀졌다. 이러한 합성 펩티드 유사체는 1-100 nM 농도의 범위에서 인간 글루카곤 또는 GLP-1 수용체(H Glucagon R 또는 HGLP-1R)로 트랙스팩션(transfection)된 CHO 세포에서 GLP-1 수용체 아고니스트 활성 뿐만 아니라 바람직한 인 비트로 글루카곤 수용체 안타고니스트 특성을 나타냈다. 글루카곤 안타고니스트 활성은 글루카곤 펩티드의 존재 하에, 시험 펩티드 유사체에 의해 억제된 cAMP 생산량의 측정에 의해 평가되는 반면에, H GLP-1R 아고니스트 활성은 방출된 cAMP 양의 측정에 의해 평가된다. 신규한 펩티드 유사체는 1-100 nM 농도의 범위에서 인간 글루카곤 수용체로 트랜스팩션된 CHO 세포에서 바람직한 인 비트로 글루카곤 수용체 안타고니스트 활성을 보였다. 제조된 시험 펩티드 유사체중 일부는 고혈당 C57 생쥐, ob/ob 및 db/db 생쥐와 같은 상이한 당뇨병 동물 모델에서 인 비보로 시험되었을 때, 글루카곤 의존 인슐린 방출을 보이고 및 저혈당을 유발하지 않고 공복 고혈당증의 감소시켜, 타입 2 당뇨병의 치료 및 예방을 위한 이상적인 치료제 후보가 된다. 이러한 펩티드 유사체의 신규한 클래스는 경구 또는 비경구적 투여 경로에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 식 (I)의 펩티드 유사체, 상기 펩티드 유사체를 홀로 또는 조합하여 사용하는 약제학적 조성물 및 상기 펩티드 유사체를 사용하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 홀로 또는 배합된, 식 (I)의 펩티드 유사체의 치료적 유효량를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

또한, 포유 동물, 예를 들면 인간, 치료를 필요로 하는 환자에게 식 (I)의 펩티드 유사체 또는 그의 조합의 치료적 유효량을 투여하는, 망막병증, 신경병증, 신장병증 및 지연된 상처 치유를 포함하는 당뇨병의 합병증 및 인슐린 저항성(글루코즈 항상성 장애: impaired glucose homeostasis), 고혈당증, 고인슐린혈증, 지방산 또는 글리세롤의 증가된 혈중 수준, 고트리글리세리드혈증(hypertriglyceridemia)을 포함하는 고지질혈증, X 증후군, 죽상동맥경화증, 및 고혈압과 같은 관련 질병을 포함하는 당뇨병, 특히 타입 2 당뇨병의 진행 또는 발병을 치료 또는 지연시키는 방법을 제공한다.

유용성:

바람직한 구체예에서, 본 발명은 글루카곤 수용체 및 GLP-1 수용체에 대해 상이한 정도의 친화도/ 선택성을 갖고 글루카곤 수용체의 안타고니스트 및 GLP-1 수용체의 아고니스트로서 작용하고, 당뇨병의 치료 및 혈중 글루코즈 레벨을 감소시키는데 유용한 펩티드 유사체를 만드는 방법을 제공한다.

본 발명의 구체예에서 기술되는 합성 펩티드 유사체는 nM 농도로 인간 글루카곤 또는 HGLP-1R로 트랜스팩션된 CHO 세포에서 바람직한 인 비트로 글루카곤 안타고니스트 및 GLP-1 아고니스트 활성을 보이고, 인 비보에서 고혈당 C57 생쥐 및 db/ db 생쥐와 같은 상이한 당뇨병 동물 모델에서 시험되었을 때, 일부 펩티드 유사체들은 글루코즈 의존 인슐린 방출을 보이고 및 저혈당을 유발하지 않고 공복 고혈당을 감소시켰다.

본 발명의 신규한 펩티드 유사체는 다양한 단백질 분해효소에 대해 증가된 안정성을 보였고 이러한 증가된 안정성 및 짧은 사슬 길이로 인하여 상기 펩티드 유사체들은 다른 침습(invensive) 및 비-침습(non-invensive) 투여 경로와 함께 경구 투여 경로에 의해서도 전달될 수 있다.

본 발명의 신규한 펩티드 유사체는 잘 알려진 적절한 부형제와 배합하여 적절한 약제학적으로 허용가능한 조성물로 제제화될 수 있다.

통상적인 기술을 사용하여 약제학적 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 조성물은 활성 성분, 즉 홀로 또는 배합된 본 발명에 따른 식 (I)의 펩티드 유사체,의 유효량을 포함하는 단위 투여 형태(unit dosage form)이다.

약제학적 조성물 및 그의 단위 투여 형태에서 활성 성분, 즉 본 발명에 따른 식 (I)의 펩티드 유사체의 양은 다양하거나 특정 적용 방법, 특정 펩티드 유사체의 효능 및 바람직한 농도에 따라 광범위하게 조절될 수 있다. 보통, 활성 성분의 양은 조성물의 0.5 중량 % 내지 90 중량%의 범위일 것이다.

따라서, 본 발명의 펩티드 유사체는 당뇨병(바람직하게는 타입 II, 내당능 장애(impaired glucose tolerance), 인슐린 저항성, 및 신장병증, 망막병증, 신경병증 및 백내장과 같은 당뇨병 합병증), 고혈당, 고인슐린혈증, 고콜레스테롤증, 유리 지방산 또는 글리세롤의 증가된 혈중 수준, 고지질혈증, 고트리글리세리드혈증, 상처치유, 조직 허혈, 죽상동맥경화증, 고혈압, 장 질환(괴사성 장염, 미세융모 봉입증 (microvillus inclusion disease) 또는 만성소화장애증(celic disease))의 진행 또는 발병을 치료하거나 지연시키는 것을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 상태 및 장애의 치료를 위해 포유 동물, 바람직하게는 인간에게 투여될 수 있다. 본 발명의 펩티드 유사체는 고밀도 지질 단백질 (HDL)의 혈중 레벨을 증가시키는 데에도 사용될 수 있다.

또한, Johannsson G., J., Clin. Endocrinol. Metab., 1997, 82, 727에 상술된 'X 증후군' 또는 대사 증후군으로 통칭되는 상태, 질환을 본 발명의 펩티드 유사체를 적용하여 치료할 수 있다. 본 발명의 펩티드 유사체는, 화합물을 순차적으로 투여하는 것에 의해 또는 적절한 DPP-IV 억제제와 함께 본 발명의 펩티드 유사체들 포함하는 제제로서, 상기 일부 질병 상태를 치료하기 위해 선택적으로 적절한 DPP-IV 억제제와 선택적으로 배합되어 사용될 수 있다.

전술된 본 발명의 펩티드 유사체로부터 역효과는 관찰되지 않았다. 본 발명의 화합물은 사용된 실험 동물에서 우수한 글루코즈 혈청-낮춤(glucose serum-lowering) 활성을 보였다. 이 펩티드 유사체들은 NIDDM, 대사 장애와 같은 고인슐린혈증, 고혈당에 의해 유발된 질병의 시험/ 예방에, 이러한 질병들은 서로 연결되어 있기 때문에 사용되었다.

도 1은 인 비트로에서 서열번호 5의 인간 글루카곤 수용체 안타고니스트 활성 및 GLP-1 수용체 아고니스트 활성을 도시한다.
도 2는 펩티드 유사체의 Fmoc 기반-고체 상 펩티드 합성 (SPPS)에 사용된 직각으로(orthogonally) 보호된 아미노산의 예를 도시한다.
도 3은 H GLP-1 R 분석에서, 엑세딘(도 A) 및 서열번호 38 (도 B)의 인 비트로 DRC 및 EC_5O 측정을 도시한다.
도 4는 서열번호 38의 복막 내 (i.p) 투여 후, C57 생쥐에서에서 인 비보 글루코즈 감소를 도시한다.
도 5는 서열번호 38의 경구(p.o) 투여 후, C57 생쥐에서 인 비보 글루코즈 감소를 도시한다.
도 6은 서열번호 38의 경구 (p.o) 투여 후에, db/db 생쥐에서 인 비보 글루코즈 감소를 도시한다.
도 7은 C57BL/6J 생쥐 (인 비보)에서 운반체 / 시험 펩티드 유사체 (서열번호 10, 20 및 25)의 단일 경구 투여 후 혈청 인슐린 레벨을 도시한다.

펩티드 유사체의 제조:

펩티드 합성 분야에서 당업자에게 잘 알려진 몇몇의 합성 경로가 본 발명의 펩티드 유사체의 제조에 사용될 수 있다. 모든 기호가 앞서 정의된 대로인, 식 (I)의 펩티드 유사체는 펩티드 합성 분야의 당업자에게 잘 알려진 통상적인 기술과 함께 하기 기술된 방법 또는 당업자에 의해 인정되는 그들의 변형을 사용하여 합성될 수 있다. 언급된 방법은 하기 기술된 방법에 제한되지는 않으나 하기 기술된 방법을 포함한다.

본 명세서에 기술된 펩티드 유사체는 G. Barany and R. B. Merrifield, "The peptides: Analysis, synthesis, Biology"; Volume 2- "Special methods in peptide synthesis, Part A", pp. 3- 284, E. Gross and J. Meienhofer, Eds., Academic Press, New York, 1980; 및 J. M. Stewart and J. D. Young, "Solid-phase peptide synthesis" 2nd Ed., Pierce chemical Co., Rockfordjl, 1984에 기술된 것과 같이 일반적으로 알려진 다양한 고체-상 기술의 적절한 변형을 사용한 화학 합성에 의해 생산될 수 있다.

본 발명의 펩티드 유사체를 제조하는 바람직한 전략은, 아미노산 곁사슬의 일시적인 보호를 위해 t-부틸옥시 카보닐 (Boc), 터트-부틸 (Bu^t), 트리틸 (Trt)기 (도 2)와 같은 산에 불안정한(acid labile) 보호기와 배합되어 Fmoc (9-플루오레닐-메틸-메틸옥시카보닐) 기가 α-아미노기의 일시적인 보호로 사용되는 Fmoc-기반 SPPS 접근의 사용에 기반한다(예를 들면, E. Atherton and R.C. Sheppard, "The Fluorenylmethoxycarbonyl amino protecting group", in "The peptides: Analysis, synthesis, Biology"; Volume 9 - "Special methods in peptide synthesis, Part C", pp. 1- 38, S. Undenfriend and J. Meienhofer, Eds., Academic Press, San Diego, 1987를 참조한다).

펩티드 유사체는 펩티트의 C-말단부터 시작하여, 불용성의 폴리머 지지체 (수지)상에서 단계적으로(stepwise) 합성될 수 있다. 일 구체예에서, 아미드, 에스테르 또는 에테르 연결의 형성을 통해 수지에 펩티드의 C-말단 아미노산을 추가하는 것에 의해 합성이 시작된다. 이는 각각 C-말단 아미드, 카복실산 또는 알코올로서, 생성된 펩티드의 최종적인 방출을 가능하게 한다.

Fmoc-기반 SPPS에서, 합성에 사용되는 C-말단 아미노산 및 모든 다른 아미노산은, 수지로부터 펩티드의 조기(premature) 절단 또는 보통 산에 불안정한 보호기로 보호되는 곁사슬 보호기의 탈보호화 없이, 20% 피페리딘 용액과 같은 적절한 염기를 사용하여 합성 동안 α-아미노 보호기가 선택적으로 제거되도록, 그의 α-아미노기 및 (만약 존재한다면) 곁사슬 작용기(functionality)가 상이하게 보호될 것(직각 보호: orthogonal protection)이 요구된다.

아미노산의 커플링은, 활성 에스테르(active ester)로서 카복실기의 활성화 및 그와 수지에 부착된 N-말단 아미노산의 차단되지 않은 α-아미노 기와의 반응에 의해 수행된다. 각 커플링 및 탈보호 후마다, 펩티딜-수지를 DMF, DCM 및 디에틸 에테르와 같은 과량의 용매로 씻어낸다. α-아미노 기 탈보호화 및 커플링의 연속반응(sequence)을 원하는 펩티드 서열이 형성될 때까지 반복한다(반응 개요 1). 그 후, 부 반응(side reaction)을 제한하기 위해 보통 적절한 제거제(scavenger)의 존재하에, 적절한 절단 혼합물을 사용하여 동시적인 곁사슬 작용기의 탈보호와 함께 펩티드를 수지로부터 절단한다. 생성된 펩티드를 최종적으로 역상 HPLC에 의해 정제한다.

최종 펩티드의 전구물질로서 요구되는 펩티딜-수지의 합성은 상업적으로 입수 가능한 교차-결합(cross-linked) 폴리스티렌 폴리머 수지를 이용한다 (Novabiochem, San Diego, CA). C-말단 아미노산이 이미 부착되었거나 부착되지 않은 Fmoc-PAL-PEG-PS 수지, 4-(2',4'-디메톡시페닐-Fmoc-아미노메틸)-페녹시아세틸-p-메틸 벤즈히드릴아민 수지 (Fmoc-Rink 아미드 MBHA 수지), 2-클로로-트리틸-클로라이드 수지 또는 p-벤질옥시벤질 알코올 수지 (HMP 수지)가 본 발명에 사용하기에 바람직하다. 만약 C-말단 아미노산이 부착되지 않았다면, 그의 부착은 DIPCDI와 그의 반응으로 형성된 Fmoc-보호된 아미노산의 HOBt 활성 에스테르에 의해 성취될 수 있다. 2-클로로-트리틸 수지의 경우, DIPEA를 사용하여 첫 번째 Fmoc-보호된 아미노산의 커플링이 성취되었다. 다음 아미노산의 조립을 위해, 펩티딜 수지의 N-말단 보호가 10-20% 피페리딘 용액을 사용하여 선택적으로 탈보호시켰다. 각 커플링 및 탈보호화 후마다, 과량의 아미노산 및 커플링 시약을 DMF, DCM 및 에테르로 씻어 제거하였다. 각각 DIPCDI/ HOBt 또는 DIPCDI/HOAT로부터 생산된 HOBt 또는 HOAT 활성 에스테르를 사용하여 후속하는 아미노산의 커플링을 성취할 수 있다. 일부 어려운 커플링의 경우, 특히 소수성이거나 부피가 큰(bulky) 곁사슬 보호를 갖는 아미노산의 커플링에서, 완전한 커플링은 HBTU, PyBOP 또는 TBTU와 같은 높은 효율의 커플링제와 DIPEA과 같은 첨가제의 조합을 사용하여 성취될 수 있다.

본 명세서에 기술된 펩티드 유사체의 합성은 Fmoc/t-부틸 보호 전략을 사용하여, CS-Bio 또는 AAPPTEC 펩티드 합성기와 같은 회분식(batchwise) 또는 연속 플로우(flow) 펩티드 합성 기기를 사용하여 수행할 수 있다. 상이한 위치에 존재하는 비천연, 비-상업적 아미노산들을 당 업계에 알려진 하나 이상의 방법을 사용하여 펩티드 사슬로 통합시켰다. 한 시도에서, 적절한 문헌에 기재된 방법을 사용하여 용액에서 Foc-보호된 비천연 아미노산을 제조하였다. 예를 들면, Fmoc-Aib-OH, Fmoc-(α-Me-2F-Phe)-OH, Fmoc-(α-Me-2,6-F-Phe)-OH와 같은 Fmoc-보호된 α-메틸화된 아미노산을 변형된 문헌 방법(modified literature method)을 사용하여 제조하였다 (Boesten, W.H.J., et al., Org. Lett., 2001, 3(8), 1121; Kapadia, S. R., et al., JOC, 2001, 66, 1903-1905). 식 IV(a-l)에 나열된, N-Fmoc-2-아미노-5-페닐-펜탄산 (Fmoc-APPA) 및 그의 유도체의 합성을 변형된 문헌 방법을 사용하여 수행하였다 (Betshrugge, J. V., Tetrahedron, 1998, 54, 1753-1762; WO 2003/087036). Fmoc-Bip(OMe)-OH (2'-에틸-4'-메톡시-비페닐알라닌;2-아미노-3-(2'-에틸-4'-메톡시-비페닐-4-일)-프로피온산)을 문헌 방법에 의해 제조하였고 (Kotha, S., et al., Tetrahedron 2002, 58, 9633; US 2006 / 0004222 Al), Fmoc-5,5,5,5',5',5'-2S-헥사플루오로루신 (Fmoc-(Hfl)-OH)을 보고된 방법에 의해 제조하였다 (Chiu, H. P., Cheng, R. P., Org. Lett., 2007, 9(26), 5517-5520). 그 후, 유도체 결과물을 펩티드의 단계적(step-wise) 합성에 사용하였다. 대안적으로, 요구되는 비천연 아미노산을 합성 유기 화학 방법을 사용하여 직접 수지상에서 제조하고 직선 펩티드 사슬을 형성하였다.

반응 개요 1: Fmoc -기반 SPPS 의 일반적인 개요.

각각의 펩티드 유사체를 위한 펩티드-수지 전구체는 문헌에 기술된 임의의 표준 절단 방법의 적절한 변형을 사용하여 절단하고 탈보호할 수 있다 (King, D. S., et al., Int. J. Peptide Protein Res., 1990, 36, 255). 본 발명에서 사용되는 바람직한 방법은 물 및 제거제로서 TIPS의 존재하에서, TFA 절단 혼합물의 사용이다. 통상적으로, 펩티딜-수지를 TFA / 물 /TIPS (94:3:3; V: V: V; 10 ml / 펩티딜 수지 100 mg )에서 1.5-2시간 동안, 실온에서 인큐베이션시켰다. 그 후, 잘려진 수지는 여과에 의해 제거하고(filter off), TFA 용액을 농축시키거나 감소된 압력하에서 건조시켰다. 조 펩티드(crude peptide) 결과물을 침전시키거나 또는 Et₂O로 세척하거나 제조용 HPLC(preparative HPLC)에 의한 정제를 위해 DMF 또는 50% 아세트산 수용액에 바로 재용해시켰다.

원하는 순도의 펩티드 유사체를 제조용 HPLC를 사용한 정제에 의해 얻을 수 있었다. 조 펩티드 용액을 세미-프렙 컬럼(Luna lOμ; C₁₈; 100 A⁰), 용적( dimension) 250 X 50 mm에 주입하고 220 nm에서 PDA 검출기에 의해 유출액(effluent)을 모니터링 하면서, 15-50 ml/분의 유속을 사용하여, 0.1 % TFA로 완충된 물 중 0.1% TFA로 완충된 ACN의 선형 구배(gradient)로 용리시켰다. 정제된 펩티드 유사체의 구조는 전자스프레이 질량 분석(Electrospray Mass Spectroscopy) (ES-MS)에 의해 확인할 수 있었다.

제조된 모든 펩티드가 Prep-HPLC 정제 후에, 반대 이온으로서 TFA와 함께, 트리플루오로-아세테이트 염으로서 분리되었다. 그러나, 일부 펩티드는 적절한 이온 교환 수지 베드(bed), 바람직하게는 음이온-교환 수지 Dowex SBR P(Cl) 또는 동등한(equivalent) 염기성 음이온-교환 수지를 통해 통과시키는 것에 의해 탈염을 수행하였다. 일부 경우에 있어서, 적절한 이온-교환 수지를 통과시키는 것에 의해 TFA 반대 이온이 아세테이트 이온으로 대체되고 희석된 아세트산 용액에 용리되었다. 펩티드의 히드로클로라이드 염의 제조를 위해, 제조의 마지막 단계에서, 선택된 펩티드들을 아세테이트염과 함께 4M의 HCl로 처리하였다. 생성된 용액을 막 필터(0.2 ㎛)를 통해 여과시키고 그 후 감압하에 동결 건조하여(lyophilize) 백색 내지 회백색(off-white)의 HCl 염을 얻었다. 당업자의 범위 내에서 잘 알려진 비슷한 기술 및/또는 적절한 변형에 따라, 본 발명의 펩티드 유사체의 다른 적절한 약제학적으로 허용가능한 염을 제조하였다.

SPPS 접근을 사용한, 펩티드 유사체 제조의 일반적인 방법:

수지상에서의 펩티드 유사체의 조립:

충분한 양(50-100 mg)의 Fmoc-PAL-PEG-PS 수지 또는 Fmoc-Rink 아미드 MBHA 수지, 로딩(loading): 0.5-0.6 mmol/g을 DMF(10-20 ml /수지 100 mg)에서 2-10 분 동안 팽창시켰다. 그 후, 10-30분 동안 DMF (10-30 ml / 수지 100 mg) 중의 10-20% 피페리딘으로 수지를 인큐베이션하여 수지상 Fmoc-기를 제거하였다. 탈보호된 수지를 여과시키고 과량의 DMF, DCM 및 에테르(50 ml X 4)로 세척하였다. 세척된 수지를 새로 증류한 DMF(1 ml / 수지 100 mg) 중에서 질소 대기하에서, 5분 동안 인큐베이션 시켰다. DMF 중의 HOBt (1-3 eq.) 및 DIPCDI (1-2 eq.)로 미리-활성화된 첫 번째 Fmoc-보호된 아미노산(1-3 eq.)의 0.5M 용액을 수지에 첨가하고, 그 후 질소 대기하에서, 1-3 시간 동안 수지를 진탕시켰다. 정성적 닌히드린 시험을 사용하여 커플링 완료를 모니터하였다. 첫 번째 아미노산의 커플링 후, 수지를 DMF, DCM 및 디에틸에터 (50 ml X 4)로 세척하였다. 다음 아미노산의 커플링을 위해, 우선, 수지와 커플링된 첫 번째 아미노산이 Fmoc-보호를 20% 피페리딘 용액을 사용하여 탈보호하고, 그 후 적절한 커플링 시약을 사용하여 상기 기술된 바와 같이 Fmoc-보호된 두 번째 아미노산과 커플링시켰다. 상기 전반적인 반응 개요 1에 따라서, 탈보호, 세척, 커플링 및 세척의 반복된 사이클을 원하는 펩티드 사슬이 수지상에 조립될 때까지 수행하였다.

최종적으로, 상기 제조된 Fmoc-보호된 펩티딜-수지를 상기 기술된 바와 같이 20% 피페리딘 처리에 의해 탈보호하고 DMF, DCM 및 디에틸 에테르 (50 ml X 4)로 펩티딜-수지를 세척하였다. 원하는 펩티드를 포함하는 수지를 질소 압력하에서 10-15분 동안 건조시키고 절단/ 탈보호 시켰다.

펩티드 서열번호 37 ( H ₂ N -H- Aib - QGT -(α- Me -2F- Phe )- TSD - Bip ( OMe )-( APPA )-CONH ₂ )의 자동화된 고체 상 합성의 대표적인 실시예 .

직선 펩티드 사슬인, H₂N-H-Aib-QGT-(α-Me-2F-Phe)-TSD-Bip(OMe)-(APPA)-PAL-PEG-PS를 Fmoc 고체 상 펩티드 합성 (SPPS) 접근 (반응 개요 2)를 사용하여 자동화된 CS-Bio 536 PepSynthesiser^TM상에 형성하였다. Fmoc 아미노산과 2-(lH-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움테트라플루오로보레이트 (TBTU)를 바이알(vial)에 같이 채워 넣고 합성기의 아미노산 모듈에 위치시켰다. 디이소프로필에틸아민(DIPEA; 0.9 M) 및 DMF의 저장(stock) 용액을 건조한 질소 대기하에서, 시약병에 보관하였다. 수지, Fmoc-PAL-PEG-PS (0.38 mmol/g; 1g)를 진공에서(1 시간) P₂O₅로 건조시키고 새로 증류한 DMF (5mL)에서 팽창시켰다. 팽창된 수지를 유리 컬럼에 슬러리(slurry) 충진하고 합성기에 배치시켰다. 모든 합성 사이클은 5 mL 분^-1의 유속에서 수행되었다, 표 1. 수지를 새로 증류한 DMF로 10분간 세척하였다. Fmoc 기의 탈보호는 DMF 중의 20% 페퍼리딘으로 10분 동안 수행하였고, 탈보호는 304nm에서 컬럼 유출액(effluent)의 UV 검출에 의해 모니터링하였다.

반응 개요 2: 서열번호 37의 SPPS

과량의 피페리딘을 각 사이클당 15분씩, 3 회의 보조 세척 사이클 및 증류한 DMF 세척 사이클에 의해 제거하였다. 아미노기를 Fmoc-아미노산 (4 당량)으로 처리하고, DIPEA (8 당량)의 존재 하에 TBTU (3.9 당량)로 미리 활성화하고 120분 동안 리사이클링 시켰다. 과량의 아미노산 및 가용성 부산물을 각 사이클당 10분씩, 4회의 보조 세척 사이클 및 증류된 DMF 세척 사이클에 의해 컬럼 및 루프(loop)로부터 제거하였다. 또한, 직선 펩티드의 완전한 형성을 위해 합성 사이클(탈보호, 세척, 아실화 및 세척)을 반복하였다. 마지막 탈보호 사이클을 15분간 DMF 중의 20% 피페리딘으로 수행하여 말단 Fmoc 기를 제거하고, 그 후 세척 사이클(10 X 4 분)을 수행하였다. 완성된 펩티드-수지를 소결(sintered) 유리 필터를 통해 여과시켜 DMF, DCM, 메탄올, DMF 및 디에틸에테르(각 100mL)로 연속적으로 3회 세척하였다. 펩티드-수지를 진공에서 P₂O₅ (2 시간)로 건조시키고 -20℃에서 저장하였다. 닌히드린 수지 시험을 수지 결합 펩티드의 N-말단 자유 아미노기를 확인하기 위해 수행하였다. 용액 및 수지 비드가 청자색을 띠는 것은 수지 결함 펩티드 상의 자유 아미노기의 존재를 나타내고 양성 시험으로 간주되었다.

표 1. 고체 상 펩티드 합성을 위한 자동화된 사이클

수지 결합 펩티드의 순도를 평가하기 위해 작은-스케일 절단을 수행하였다. 건조된 펩티드-수지 (약(ca) 10-mg)를 TFA, 물, 트리이소프로필실란 (95: 2.5: 2.5 v/v)의 혼합물로 90분 동안 가끔씩 천천히 저어주면서 실온에서 처리하였다. 수지를 여과시키고 순수한 TFA (1mL)로 완전히 세척하고 전체 여과액을 감압하에 증발시켰다. 잔여 TFA를 디에틸 에테르 (2mL)로 세 번 공비증류(azeotrope) 시켰다. 얻은 잔류물을 증류수 (2mL)에 현탁시키고 수성층을 디에틸 에테르 (3 mL)로 세 번 추출하였다. 수성층을 분리하고 동결 건조하여 조 펩티드 H₂N-H-Aib-QGT-(α-Me-2F-Phe)-TSD-Bip(OMe)-(APPA)-CONH₂를 얻었다. 동결 건조된 펩티드 H₂N-H-Aib-QGT-(α-Me-2F-Phe)-TSD-Bip(OMe)-(APPA)- CONH₂를 0.1% TFA 수용액 (약 1mg /1 mL)에 용해시키고 분석 RP-HPLC에 의해 그의 순도를 분석하고 전자스프레이 이온화 질량 분석 (ESI-MS)에 의해 특성을 규명하였다. 순도 퍼센트: 90 % (조 펩티드). ESI-MS; H₂N-H-Aib-QGT-(α-Me-2F-Phe)-TSD-Bip(OMe)-(APPA)-CONH₂의 계산값: 1465 (M⁺), 1487 (M+Na⁺) 및 1503 (M+K⁺); 측정값 (m/z): 1465 (M⁺), 1487 (M+Na⁺) 및 1503 (M+K⁺).

상기 프로토콜 및 당업자의 범위 내에 있는 적절한 그의 변형을 사용하고, Fmoc-SPPS 접근을 사용하여 본 발명에서 디자인된 펩티드 유사체를 제조하였다. 또한, 하기의 프로토콜을 사용하여 수지 결합 펩티드 유사체를 절단하고 탈보호, 정제 및 특징지었다.

절단 및 탈보호 :

원하는 펩티드 유사체를 하기와 같이 TFA 절단 혼합물로 처리하여 그들 각각의 펩티딜-수지로부터 절단하고 탈보호하였다. TFA / 물 / 트리이소프로필실란 (95: 2.5: 2.5) (10 ml / 펩티딜-수지 100 mg)의 용액을 펩티딜-수지에 첨가하고 혼합물을 때때로 저어주면서 실온에 두었다. 수지를 여과시키고 절단 혼합물로 세척하고 모아진 여과액을 건조해질 때까지 증발시켰다. 얻은 잔류물을 10 ml의 물에 용해시키고 수성층을 에테르(각 20ml)로 세 번 추출하고 마지막으로 수성층을 동결 건조시켰다. 동결 건조 후 얻은 조 펩티드를 다음과 같이 제조용 HPLC에 의해 정제하였다:

조 펩티드 유사체의 제조용 HPLC 정제:

제조용 HPLC를 Shimadzu LC-8A 액체 크로마토그래프 상에서 수행하였다. DMF 또는 물 중에 용해된 조 펩티드 용액을 세미-프렙 컬럼(Luna lOμ; C₁₈; 100 A⁰), 용적 250 X 50 mm에 주입하고, 220nm 에서 PDA 검출기에 의해 유출액을 모니터링하면서, 15-50 ml/분의 유속을 사용하여, 0.1% TFA로 완충된 물 중 0.1% TFA로 완충된 ACN의 선형구배로 용리시켰다. 0.1% TFA로 완충된 20% 내지 70%의 물-ACN 혼합물의 전형적인 구배를 50분의 시간에 걸쳐 분당 1% 구배 변화로 사용하였다. 용리된 원하는 생성물을 단일 10-20 ml 분획으로 모아 각각의 HPLC 분획의 동결 건조에 의해 무정형의 백색 분말로서 순수한 펩티드 유사체를 얻었다.

정제된 펩티드 유사체의 HPLC 분석

상기 기술된 제조용 HPLC에 의한 정제 후에, 각 펩티드들을 Shimadzu LC-1OAD 분석 HPLC 시스템 상에서 분석 RP-HPLC에 의해 분석하였다. 펩티드 유사체의 분석 HPLC 분석을 위해, 0.1% TFA 및 ACN 완충액의 선형 구배로 Luna 5μ; C₁₈; 100 A⁰, 용적 250 X 4.6 mm 컬럼을 사용하였고, 크로마토그램의 획득은 PDA 검출기를 사용하여 220 nm에서 수행하였다.

질량 분석에 의한 특성 규명

각 펩티드는 플로우 주입 또는 LC/MS 모드로 전자스프레이 이온화 질량 분석 (ESI-MS)에 의해 특성을 규명하였다. 모든 분석에서 양성 및 음성 이온 전자스프레이 모드로 3단계 4중극자형 질량 분석기 (Triple quadrupole mass spectrometer) (API-3000 (MDS-SCIES, Canada)를 사용하였다. 단위 해상도(unit resolution)에서 작동시켜 4중극(quadrupole)의 질량 범위에 걸쳐 완전한 스캔 데이터를 얻었다. 모든 경우에 있어서, 실험적으로 측정된 분자량은 계산된 단일동위원소 분자량의 0.5 달톤(Dalton) 내에 있었다. 질량 크로마토그램의 정량은 Analyst 1.4.1 소프트웨어를 사용하여 행해졌다.

다른 일반적으로 알려진 기술 및 적절한 그의 변형과 함께 본 명세서에 기술된 합성 방법을 이용하여, 하기의 신규한 펩티드 유사체들을 제조하였다. 이 리스트는 본 발명에 따라 제조될 수 있고, 이러한 펩티드 유사체의 명백한 변형을 적어도 포함하는 것으로 기대되는 펩티드 유사체의 다양한 군을 나타낸다. 그러나, 이 개시는 어떤 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 표 2 (i-v)에서, 본 발명의 신규한 펩티드 유사체가 그의 상응하는 서열번호와 같이 나열된다.

표 2 (i): 제조된 펩티드 유사체 리스트

표 2( ii ): 제조된 펩티드 유사체 리스트

표 2 ( iii ): 제조된 펩티드 유사체 리스트

표 2 ( iv ): 제조된 펩티드 유사체 리스트

표 2 (v): 제조된 펩티드 유사체 리스트

신규 펩티드 유사체의 인 비트로 및 인 비보 연구:

상기 기술된 것과 같이 제조된 펩티드 유사체로

a) 인 비트로 글루코즈-의존 인슐린 분비(RIN5F 세포 분석 스크리닝 프로토콜);

b) 인 비트로 인간 GLP-1R 아고니스트 활성 (시클릭 AMP 측정);

c)인 비트로 인간 글루카곤 안타고니스트 활성 (시클릭 AMP 측정);

d) DPP IV 효소, 인간 혈장, 가장(simulated) 위액, 장액 및 간 미세소체에 대한 펩티드 유사체의 안정성; 및

e) C57BL/6J 생쥐에서 (인 비보) 시험 화합물(펩티드 유사체)의 인 비보 효능의 증명;을 하기에 기술된, 다양한 인 비트로 및 인 비보 분석을 사용하여 시험하였다.

인 비트로 연구:

인 비트로 글루코즈 -의존 인슐린 분비 ( RIN5F 세포 분석 스크리닝 프로토콜)

RIN5F (쥐 인슐린종 (Rat Insulinoma)) 세포를 37℃, 가습 인큐베이터(5 % CO₂)에서, 소듐 피루베이트 (1 mM) HEPES 및 글루코즈 (4.5 g/L)으로 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양시켰다. 트립신 처리 후, RIN5F 세포를 웰당 0.2 X 10⁶개 세포의 농도로 12 웰 플레이트에 심었다. 세포를 80 % 콘플루엔스(confluence)까지 밤새 배양하고 다음과 같이 인슐린 분비 실험을 수행하였다 (Montrose-Rafizadeh C, et al., Mol. Cell. Endo. 1997, 130, 109.; Wang, X., et al., Endocrinology 2001 , 5, 1820).

세포를 PBS 용액으로 한 번 세척하고 NaCl (115 mmol/L), KCl (4.7 mmol/L), CaCl₂ (1.28 mmol/L), MgSO₄.7H₂O (1.2 mmol/L), KH₂PO₄ (1.2 mmol/L), NaHCO₃ (10 mmol/ L), 및 글루코즈 (1.1 mM) 와 B.S.A (0.5 %)를 포함하는 pH 7.4의 HEPES (25 mmol/L)를 포함하는 신선한 Krebs-Ringer Balanced Buffer에서 40분간 인큐베이션 시켰다. 40분 후 버퍼를 교환하고 세포를 30분 동안 글루코즈 부하(load)의 존재 (16.7 mM) 및 부존재 (0 mM)하 모두에서, 상이한 농도의 시험 펩티드 유사체와 인큐베이션(37℃) 시켰다. 상층액을 모아 ultra sensitive Rat insulin ELISA kit (Crystal Chem, IL)에 의해 인슐린 양을 측정하였다. 제조자의 프로토콜(Sigma Aldrich, MO)에 따라 Bicinchoninic Acid kit를 사용하여 상층액 속의 단백질을 측정하였다. 웰 간 세포 밀도의 차이를 표준화하기 위해 피코-그램(Pico-gram) (pg)으로 얻은 전체 인슐린을 전체 단백질 (㎍)으로 나누었다. 대표적인 펩티드 유사체의 인 비트로 글루코즈 의존 인슐린 분비 활성이 표 3에 나열된다.

표 3. 대표적인 펩티드 유사체의 인 비트로 글루코즈 의존 인슐린 분비 활성

* 다양한 농도의 펩티드 유사체에 의한(?) 인 비트로 글루코즈 의존 (16.7-mM 글루코즈 부하) 인슐린 분비를 쥐 인슐린종 (RIN5F) 세포를 사용하여 측정하였다. 웰간 세포 밀도의 차이를 표준화하기 위해 전체 인슐린 내용물 (pg)을 전체 단백질 (㎍)로 나누었다. n=3, 값들은 평균±.S.D를 나타낸다. 0-mM 글루코즈 농도에서 기본 인슐린 분비(basal insulin secretion)를 모든 시험 화합물에서 관찰하였다.

인 비트로 인간 GLP -1R 아고니스트 활성 ( 시클릭 AMP 측정).

안정적으로 트랜스팩션된 CHO/ 인간 GLPlR 세포에서, cAMP 세포-기반 분석을 사용하여 신규 펩티드 유사체를 인간 GLP-1 수용체 (HGLP-1R) 아고니스트 활성(인 비트로)에 대해 선별하였다. CHO-Kl 세포(CRL 9618)를 American Type Culture Collection (Rockville, MD)으로부터 얻었다. CHO 세포는 L-글루타민 (2mM), HEPES (25 mM), NaHCO₃ (1.1 g/L)를 포함하고, NewBorn Calf Serum (NBCS; 10%), 페니실린 (50 U/ml (v/v)) 및 스트렙토마이신 (50 ㎍/ml (v/v))으로 보충된 Ham's F12 배지에서 길러졌다. 세포들을 매 3일 마다 1:8로 분리시켰다.

인간 GLP -1 수용체를 발현하는 안정적인 CHO 세포주( cell line )의 생산

인간 GLP-1 수용체를 코딩하는 cDNA를 표준적인 프로토콜에 따라 RT-PCR에 의해 분리하였다. 완전한 길이의 cDNA를 pcDNA3.1(+)에서 클로닝 하였다. GLP-1 수용체를 발현하는 CHO 세포주의 생산을 위해, 표준적인 프로토콜에 따라 CaPO₄를 사용하여 CHO세포를 10㎍의 발현 플라스미드 pcDNA/hGLP-1R로 트랜스팩션시켰다 (Wheeler, M.B., et al., Endocrinology 1993, 133, 57.). 수용체를 발현하는 클론들을 G418 (800 ㎍/ml active, Sigma) 선별에 의해 생성하였다. 그 후, 안정한 클론들을 500 ㎍/ml로 유지시켰다(G418). 선별된 클론은 cAMP 분석을 위해 9 내지 25 계대에서 사용하였다.

cAMP 생성의 측정

인간 GLP-1R로 안정적으로 트랜스팩션된 CHO 세포를 Ham's F12 + 10% NBCS + 500 ㎍/ml G418에서 70-75%의 콘플루엔시(confluency)가 될 때까지 유지시켰다. 세포를 2 ml 의 TPVG (0.25% 트립신, 0.53 mM EDTA, 1.38-mM 글루코즈)를 사용하여 트립신 처리하였다.

10% NBCS를 포함하는 Ham's F 12 배지를 사용하여 트립신을 비활성화시키고 세포를 2 ml의 완전(complete) 배지에 현탁시켰다. 그 후, 2 X 10⁵개의 세포/웰로 12 웰 플레이트에 접종하고 플레이트를 16-18 시간 동안, 37℃에서 가습된 대기하에서 인큐베이션하였다 (Fehmann, H.C., et al., Peptides 1994, 15, 453). 세포들이 90-95% 콘플루엔시를 보인, 그 다음날 분석을 수행했다. 12 웰 플레이트로부터 배지를 흡인하여 제거하고 세포를 Ham's F12 (플레인)를 사용하여 한 번 세척하였다. 세포를 37℃에서 30분 동안 500 ㎕의 Ham's F12 + 1% BSA+ 0.125 mM RO-20과 인큐베이션 시켰다. 인큐베이션 후, 배지를 흡인하여 제거하고, 물 (MilliQ)중에 용해되어 있던 5㎕의 시험 화합물(펩티드 유사체)과 새로운 배지 (플레인 Ham's F12 + 1% BSA+ 0.25 mM RO-20)를 첨가하였다. 세포를 시험 화합물과 함께 30분 동안 가습된 대기 하, 37℃에서 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 배지를 제거하고 세포를 플레인 Ham's F12로 한 번 세척하였다. 그 후, 500 ㎕의 얼음처럼 차가운 0.1 N HCl을 각 웰에 첨가하고 30분 동안 200 rpm에서 진탕하여 세포를 용해시켰다. 그 후, 세포를 스크랩(scrap)하여, 용해물을 마이크로 원심분리기 튜브에 모아 12000 rpm으로 10분 동안 원심 분리하여 찌꺼기를 제거하였다. 그 후 각 마이크로-원심분리기 튜브로부터 300㎕의 상층액을 유리 튜브에 넣어 N₂ 하에서 cAMP 평가를 위해 30분 동안 건조시켰다. Cyclic AMP immunoassay kit (R&D systems, Minneapolis. MN)를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 샘플로부터 전체 cAMP를 측정하였다. 남은 상층액을 마이크로 BCA (Sigma)를 사용하여 단백질 농도를 측정하는데 사용하였다. 데이터를 대조군의 퍼센트 (운반체: 물)로서 계산하였고 평균±SD로 표현했다. 대표적인 펩티드 유사체의 인 비트로 인간 GLP-1 수용체 아고니스트 활성이 표 4에 나열된다.

인 비트로 인간 GLP-1 수용체 아고니스트 활성에 기초하여 신규한 펩티드 유사체에 대해 EC₅₀ 값을 측정하였고 엑센딘(Exendin)(EC₅₀= 0.56 nM) 및 서열번호 38: H-Aib-QGT-(α-Me-2F-Phe)-TSD-Bip(OMe)-(ADMP) (EC₅₀= 0.34 nM)에 대한 비교 투여-반응 커브 (DRC)가 대표적인 예로서 도 3에 보여진다.

인 비트로 인간 글루카곤 안타고니스트 활성 (시험 펩티드 유사체에 의한, 시클릭 AMP 생산량 억제 측정).

안정적으로 트랜스팩션된 CHO/인간 글루카곤 R 세포에서, cAMP 세포-기반 분석을 사용하여 인간 글루카곤 수용체 (H-글루카곤-R) 안타고니스트 활성 (인 비트로)에 대해 신규한 펩티드 유사체를 선별하였다. CHO-K1 세포 (CRL 9618)를 American Type Culture Collection (Rockville, MD)로부터 얻었다. CHO 세포를 L-글루타민 (2mM), HEPES (25 mM), NaHCO₃ (1.1 g/L)를 포함하고, newborn Calf Serum (NBCS; 10%), 페니실린 (50 U /ml (v/v)) 및 스트렙토마이신 (50 ㎍/ml (v/v))으로 보충된 Ham's F12 배지에서 길렀다. 세포들을 3일 마다 1:8로 나누었다.

인간 글루카곤 수용체를 발현하는 안정한 CHO 세포주의 생산

인간 글루카곤 수용체를 코딩하는 cDNA를 표준적인 프로토콜에 따라 RT-PCR에 의해 분리하였다. 완전한 길이의 cDNA를 pcDNA3.1(Invitrogen)에서 클로닝시켰다. 글루카곤 수용체를 발현하는 CHO 세포주의 생산을 위해, 표준적인 프로토콜에 따라 CaPO₄를 사용하여 10㎍의 발현 플라스미드 pcDNA/ H-글루카곤-R로 CHO 세포를 트랜스팩션시켰다. G418 (800 ㎍/ml active, Sigma) 선별에 의해 수용체를 발현하는 클론이 생성되었다. 안정적인 클론들을 그 후 500 ㎍/ml (G418)에서 유지시켰다. 선별된 클론들을 cAMP 분석을 위해 9내지 25계대(passage)에서 사용하였다.

글루카곤 펩티드와 함께 시험 펩티드 유사체의 첨가 후 억제된 cAMP 생산량의 측정에 의한 글루카곤 안타고니스트 활성의 측정.

인간 글루카곤 R로 안정적으로 트랜스팩션된 CHO 세포를 Ham's F12 + 10% NBCS + 500 ㎍/ml G418에서 70-75%의 콘플루엔시가 될 때까지 유지시켰다. 2 ml의 TPVG (0.25% 트립신, 0.53 mM EDTA, 1.38-mM 글루코즈)를 사용하여 세포를 트립신처리하였다. 10% NBCS를 포함하는 Ham's F12 배지를 사용하여 트립신을 불활성화시키고 세포를 2ml의 완전(complete) 배지에 현탁시켰다. 그 후, 2 X 10⁵ 개의 세포/웰로 12 웰 플레이트에 접종하고 플레이트를 가습된 대기, 37℃에서 16-18시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포들이 90-95% 콘플루엔시를 보인 그 다음날 분석을 수행했다. 12 웰 플레이트로부터 배지를 흡인하여 제거하고 세포를 Ham's F12 (plain)을 사용하여 한 번 세척하였다. 세포를 37℃에서 30분 동안 500 ㎕의 Ham's F12 + 1% BSA+ 0.125 mM RO-20과 인큐베이션 시켰다. 인큐베이션 후, 배지를 흡인하여 제거하고 물 (MilliQ)중에 용해되어 있던 5㎕의 시험 화합물 (펩티드 유사체)과 새로운 배지 (플레인 Ham's F12 + 1% BSA+ 0.25 mM RO-20)를 첨가하고, 뒤이어 (아고니스트로서) 글루카곤 펩티드를 첨가하였다. 세포를 시험 화합물 및 글루카곤 펩티드와 함께 30분 동안 가습된 대기하, 37℃에서 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 배지를 제거하고 세포를 플레인 Ham's F12로 한 번 세척하였다. 그 후, 500 ㎕의 얼음처럼 차가운 0.1 N HCl을 각 웰에 첨가하고 30분 동안 200 rpm에서 진탕하여 세포를 용해시켰다. 그 후, 세포를 스크랩(scrap)하여, 용해물을 마이크로 원심분리기 튜브에 모아 12000 rpm으로 10분 동안 원심 분리하여 찌꺼기를 제거하였다. 그 후 각 마이크로-원심분리기 튜브로부터 300㎕의 상층액을 유리 튜브에 넣어 N₂ 하에서 cAMP 평가를 위해 30분 동안 건조시켰다. Cyclic AMP immunoassay kit (R&D systems, Minneapolis. MN)를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 샘플로부터 전체 cAMP를 측정하였다. 남은 상층액을 마이크로 BCA (Sigma)를 사용하여 단백질 농도를 측정하는데 사용하였다. 데이터를 대조군의 퍼센트 (운반체: 물)로서 계산하였고 평균+SD로 표현했다. 대표적인 펩티드 유사체의 인 비트로 인간 글루카곤 수용체 안타고니스트 활성이 표 5에 나열된다.

DPP IV 효소, 인간 혈장, 가장 위액, 장액 및 간 미세소체에 대한 펩티드 유사체의 안정성.

상이한 펩티드 유사체들(최종 농도 2 ㎛)을 0, 2, 4, 6, 12 및 24 시간 동안 DPP IV (1 : 25 mU) 또는 혼주 인간 혈장(pooled human plasma) (7.5 ㎕) 또는 가장 위액 (pH 1.5; HCl, NaCl 및 펩신 조성물) 또는 가장 장액 (pH 7.5) 또는 인간 간 미세소체와 인큐베이션시켰다(37 ℃; 50 mM 트리에탄올아민- HCl 버퍼; pH 7.8). DPP IV 효소/ 인간 혈장/ 가장 위액/ 가장 장액/ 인간 간 미세소체의 농도는 2-4 시간 안에 약 50%의 엑세딘의 분해를 제공하도록 미리 행해진 실험에서 선택되어, 24 시간에 걸쳐 시간-의존 분해를 볼 수 있도록 하였다. 반응을 TFA/H₂O (15 mL, 10% (v/v))의 첨가에 의해 종료시켰다. 그 후, 반응 생성물을 Vydac C₁₈ 분석 컬럼 (4.6 x 250-mm)에 적용하고 주요 분해 조각을 손상되지 않은(intact) 펩티드 유사체로부터 분리하였다. 컬럼을 TFA/H₂O로, 1 mL/분의 유속으로 평형화시켰다. 70% 아세토니트릴/H₂O 중의 0.1% (v/v) TFA를 사용하여 용리 용매 중의 아세토니트릴이 농도를 10분에 걸쳐 0%에서 28%까지 증가시키고, 30분에 걸쳐 28%에서 42%까지 증가시켰다. UV 검출기를 사용하여 206nm에서 흡광도를 모니터링하고 ESI-MS 분석에 앞서 피크(peak)를 안내서에 따라(manually) 모았다. 시험 펩티드 유사체 및 그의 대사체에 대한 커브 아래의 면적(area under the curve)을 측정하고 24 시간에 걸쳐 각 시점에 분해 비율을 계산하였다. DPP IV 효소, 인간 혈장, 가장 위액, 장액 및 간 미세소체 (인 비트로)에 대한 선택된 펩티드 유사체의 안정성 연구 결과가 표 6에 나열된다.

(a): DPP-IV 효소와 함께 인큐베이션 되었을 때, 24시간 내의 펩티드 유사체의 분해% 및 괄호 안의 값은 시간(h)으로 표현된 반감기(t_{1 /2})를 나타낸다.

(b): 인간 혈장과 함께 인큐베이션 되었을 때, 24시간 내의 펩티드 유사체의 분해% 및 괄호 안의 값은 시간(h)으로 표현된 반감기(t_{1 /2})를 나타낸다.

(c): 가장 위액과 함께 인큐베이션 되었을 때, 24시간 내의 펩티드 유사체의 분해% 및 괄호 안의 값은 시간(h)으로 표현된 반감기(t_{1 /2})를 나타낸다.

(d): 가장 장액 함께 인큐베이션 되었을 때, 24시간 내의 펩티드 유사체의 분해% 및 괄호 안의 값은 시간(h)으로 표현된 반감기(t_{1 /2})를 나타낸다.

(e): 간 미세소체와 함께 인큐베이션 되었을 때, 24시간 내의 펩티드 유사체의 분해% 및 괄호 안의 값은 시간(h)으로 표현된 반감기(t_{1 /2})를 나타낸다.

인 비보 효능 연구:

비 경구 (i.p.) 및 경구 투여에 의한 C57BL /6J 또는 db / db 생쥐에서 시험 화합물(펩티드 유사체)의 인 비보 효능( 항고혈당 / 항당뇨병 활성)의 증명.

동물

자체적으로(in-house) 사육된 길러진, 8-12 주령의, 수컷 C57BL/6J 또는 db/db 생쥐로 급성 단일 투여(acute single dose) 120 분 시간-코스 실험을 수행하였다. 일주일 동안 사육장 조건(25±4 ℃, 60-65 % 상대 습도, 12: 12h 명:암 사이클, 7.30 am에 광기 개시)에 길들이기 위해 동물들을 우리 당 6 마리의 그룹으로 수용하였다. 모든 동물 실험은 'Zydus Research Center animal ethical committee'에 의한 승인 후 국제적으로 유효한 가이드라인에 따라 수행하였다.

방법

일부 시험 화합물(펩티드 유사체)과 엑센딘-4의 인 비보 글루코즈 저하 특성을 C57BL/6J (가벼운 고혈당) 또는 db/db 동물 모델에서 하기 기술된 것과 같이 평가하였다. 연구 이틀 전에, 동물들을 무작위로 골라 그들의 섭식 글루코즈 레벨(fed glucose level)에 기초하여 5개의 그룹(n=6)으로 나눴다. 실험 당일날, 모든 우리에서 먹이를 철수하고, 물은 자유로이 먹도록 하고 밤새 절식시켰다. 운반체 (생리 식염수)/ 시험 / 표준 화합물을 복막내 (i.p.) 또는 경구적으로 체중에 기초하여 투여하였다. 0분 바로 후, 각 동물로부터 혈액 채취, 및 30, 60 및 120 또는 240분까지에 후속적인 혈액 채취를 안와 후방(retro-orbital) 경로를 통해, 약한 에테르 마취 하에서 행하였다 (Chen, D., et al., Diabetes Obesity Metabolism, 2005, 7, 307. Kim, J. G. et al., Diabetes, 2003, 52, 751).

혈액 샘플을 원심분리하고 분리된 혈청을 대상으로 바로 글루코즈를 측정하였다. 인슐린 측정을 위한 혈청을 -70℃에서 인슐린 측정에 사용할 때까지 보관하였다. 글루코즈 측정은 DPEC-GOD/POD 방법(Ranbaxy Fine Chemicals Limited, Diagnostic division, India)으로 Spectramax-190을 사용하여 96-마이크로웰 플레이트 판독기(Molecular devices Corporation, Sunnyvale, California)에서 수행하였다. 중복된 샘플의 평균 값을 Microsoft excel을 사용하여 계산하고 0분 기준선 수정 선 그래프(0 min base line corrected line graph), 커브 밑의 면적 (0-120 분 AUC) 및 커브 밑의 기준 선 수정 면적 (0 분 BCAUC)을 작성하기 위해 Graph Pad Prism 소프트웨어 (Ver 4.0)를 사용하였다. 그래프로부터 얻은 AUC 및 BCAUC를 일 방향 ANOVA를 위해 분석하고, 그 후 Graph Pad prism 소프트웨어를 사용하여 Dunnett's post test를 분석하였다. 또한, 쥐/생쥐 인슐린 ELISA 키트(Linco research, Missouri USA)를 사용하여 인슐린 측정을 수행하였다. 선별된 펩티드 유사체에 의한 0, 30, 60 및 120 분에서의 혈액 글루코즈 레벨의 변화를 표 7 (복막 내 경로를 통한 투여) 및 표 8(경구 경로를 통한 투여)에 각각 나타내었다.

서열번호 38 (H-Aib-QGT-(α-Me-2F-Phe)-TSD-Bip(OMe)-(ADMP))를, C57 생쥐에서 상이한 투여량의 (2 /5 /8 /10 /15 nM /Kg) 복막 내 경로를 통한 투여 (도 4), 100 / 200 / 500 / 1000/ 2000 nM/ Kg의 투여량으로 경구 경로를 통한 투여 (도 5), 또는 db/db에서 1000 및 2000 nM / kg 투여량으로 경구 경로를 통한 투여 (도 6)로 급성 처리한 후의 기준선 수정 혈청 글루코즈 레벨의 일부가 대표적인 도면으로 보여진다. 도 7은 C57BL/6J 생쥐에서 0.5 / 1 / 2 ㎛/ Kg의 투여량으로 운반체 / 시험 화합물 (서열번호 10 (H-(α-Me-Pro)-QGTFTSD-Bip(OMe)-(ADMP)), 20 (H-Aib-QGTFTSD-Bip(OMe)-(AMCB)) 및 25 (H-(APP)-QGTFTSD-Bip(OMe)-(APPA))의 급성 경구투여 후 혈청 인슐린 레벨의 변화를 나타낸다(인 비보).

펩티드 유사체의 인 비트로 및 인 비보 결과의 요약( overview ):

상기 기술된 것처럼, 본 발명에서 제조된 모든 펩티드 유사체들을 인 비트로 및 인 비보에서 평가하였고 선별된 펩티드 유사체들의 데이터를 상기 부분에서 대표적인 펩티드 유사체의 예로서 나타내었다. RIN 5F (쥐 인슐린종) 세포 기반 분석에서, 모든 펩티드 유사체들은 1-10 nM 농도의 범위에서 글루코즈-의존 인슐린 분비만을 보였고(표 3), 따라서 이러한 클래스의 펩티드 유사체는 술포닐우레아와 같은 인슐린 분비촉진제의 다른 클래스에서 보통 발견되는 고혈당 에피소드가 없을 것이다. 인간 글루카곤 수용체 분석에서, 펩티드 유사체의 인 비트로 안타고니스트 활성을 글루카곤 펩티드와 같이 인큐베이션 시켰을 때 시험 펩티드 유사체에 의한 cAMP 생산량의 억제를 측정하여 평가하였다. 표 5에 나타난 것처럼, 전반적으로, 모든 펩티드 유사체가 1nM 내지 1000nM 범위의 상당한 글루카곤 수용체 안타고니스트 활성을 보였다. HGLP-1R 분석에서, 신규 펩티드 유사체는 1-100 nM 농도 범위에서, 농도 의존 cAMP 생산(인 비트로 GLP-1 아고니스트 활성)을 나타냈다 (표 4). 이러한 펩티드 유사체의 이중 특성 (글루카곤 수용체의 안타고니스트 및 GLP-1 수용체의 아고니스트)은 그들이 타입 2 당뇨병 및 관련 대사 장애의 안전하고 효과적인 치료를 위한 이상적인 후보가 되게 한다.

DPP-IV 효소, 인간 혈장, 가장 위액 및 장액 및 간 미세소체에 대한 선별된 펩티드 유사체의 안정성 연구 결과는 대부분의 펩티드 유사체가 24 시간까지 인큐베이션 시킨 경우, DPP-IV 효소에 대해 안정하다는 것을 나타낸다. 비슷하게, 인간 혈장, 가장 위액 및 장액에서 대부분의 펩티드 유사체가 24시간 인큐베이션시킨 경우 안정한 것으로 밝혀졌다. 펩티드 유사체의 간 미세소체와의 인큐베이션은 상당한 안정성을 보였고, 24 시간 동안 단지 26-35% 분해가 관찰되어서, 이는 일부 펩티드 유사체가 경구 경로 투여에 의해 전달될 수 있다는 것을 의미한다.

비경구적 및 경구적 투여에 의한 펩티드 유사체의 인 비보 항 고혈당/ 항 당뇨병 활성이 급성-단일-투여(acute-single-dose) 120/ 240-분 시간 코스 실험을 이용하여, C57 또는 db/db 생쥐에서 측정되었다. 표 7에서 볼 수 있는 것처럼, 경구적으로 0.5-2 ㎛/kg의 범위로 투여했을 때 일부 선별된 펩티드 유사체들(도 8)이 활성인 반면에, 5-50 nM 범위의 투여량을 복막 내로 투여하면 대부분의 펩티드 유사체들이 활성을 나타낸다. 따라서 신규 펩티드 유사체가 글루카곤 안타고니스트 및 GLP-1 아고니스트 활성을 보이고 경구적으로 생체이용가능한 것은 그들을 타입 2 당뇨병 및 관련 대사 장애의 안전하고 효과적인 치료법의 이상적인 후보로 만든다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (20)

1. 하기 식 (I)의 서열을 가지며,
   A-Z₁-Z₂-Z₃-Z₄-Z₅-Z₆-Z₇-Z₈-Z₉-Z₁₀-Z₁₁-B
   (I)
   식 중,
   A는, R₁이 수소 또는 직쇄형 또는 분지형 (C₁-C₁₀) 알킬 사슬을 나타내고, R₃은 직쇄형 또는 분지형 (C₁-C₁₀) 알킬 기로부터 선택되는 것인, -NH-R₁, R₃-CO-, R₃-O-CO- 또는 R₃-SO₂- 기를 나타내고; B는, R₂가 H를 나타내는 것인 -COOR₂, -CONHR₂ 또는 CH₂OR₂를 나타내고; Z₁ 내지 Z₁₁은 아미드 결합에 의해 서로 연결된 천연 또는 비천연 아미노산을 나타내고, 상기 Z₁은 L-히스티딘 (H), D-히스티딘 (dH) 또는 우로칸산 (UA)을 나타내고;
   

   

   
   Z₂는 L-세린 (S), D-세린 (dS), L-알라닌 (A), D-알라닌 (dA), α-메틸 프롤린 (α-Me-Pro), α-아미노-이소부티르산 (Aib), 1-아미노 시클로프로판 카복실산 (ACP), 1-아미노-시클로펜탄 카복실산 (APP)으로 이루어진 군으로부터 선택된 천연 또는 비천연적으로 생성된 아미노산을 나타내고;
   

   

   
   Z₃는 L-글루타민 (Gln; Q), D-글루타민 (dQ) 또는 하기 식 II의 화합물 (CNB 또는 Hfl)을 나타내고;
   

   

   
   Z₄는 글리신 (G) 또는 비천연 아미노산 1-아미노 시클로프로판 카복실산 (ACP) 또는 1-아미노-시클로펜탄카복실산 (APP)을 나타내고;
   Z₅는 L-트레오닌 (T), D-트레오닌 (dT), L-알로-트레오닌 (allo-Thr; allo-T) 또는 D-알로-트레오닌 (d-allo-Thr; d-allo-T)이고;
   Z₆은 Phe (F), 알파-메틸-페닐알라닌 (-α-Me-Phe-), 알파-메틸-2-플루오로페닐알라닌 (-α-Me-2F-Phe-) 또는 알파-메틸-2,6-디플루오로페닐알라닌 (-α-Me-2,6-F-Phe-) 또는 2-플루오로페닐알라닌 (-2F-Phe-)이고;
   Z₇은 트레오닌 또는 알로-트레오닌을 나타내고 Z₈은 세린을 나타내며;
   Z₉는 L-아스파르트산 (D) 또는 D-아스파르트산 (dD)을 나타내고;
   Z₁₀는 하기 식 III (a-c)의 L 또는 D 비천연 아미노산을 나타내고;
   

   

   
   Z₁₁는 하기 식 IV (a-l)의 L 또는 D 비천연 아미노산을 나타내는 것인,
   

   

   
   분리된 펩티드 유사체(peptidomimetic), 그의 토토머 형태 또는 용매화물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 제1항에 있어서, 상기 Z₉ 와 Z₁₀ 또는 Z₁₀ 과 Z₁₁ 또는 Z₉-Z₁₁ 사이의 아미드 결합은 추가로, '(NMe)'로 표시되는, N-메틸화된 것인 식(I)의 화합물.
7. 제1항에 있어서, 상기 Z₉ 와 Z₁₀ 또는 Z₁₀ 와 Z₁₁ 또는 Z₉-Z₁₁ 사이의 아미드 결합은 추가로, 티오아미드 결합인 것인 식(I)의 화합물.
8. 제7항에 있어서, 상기 Z₉ 와 Z₁₀ 또는 Z₁₀ 와 Z₁₁ 또는 Z₉-Z₁₁ 사이의 추가적인 티오아미드 결합은 '-CH₂-' 결합으로 환원된 것인 식 (I)의 화합물.
9. 삭제
10. 하기로부터 선택된 식(I)의 화합물:
    

    

    
    

    

    
    

    

    
    

    

    
    

    

    
    

    

    
    

    

    
    

    

    .
11. 타입 2 당뇨병, 고지질혈증, 고콜레스테롤혈증, 고혈당증, 고인슐린혈증, 유리 지방산 또는 글리세롤의 증가된 혈중 수준, 고트리글리세리드혈증, 상처 치유, 내당능 장애, 렙틴 저항성 (leptin resistance), 인슐린 저항성, 신경병증, 망막병증 또는 백내장으로부터 선택되는 질병을 치료 또는 예방하기 위한 제1항, 제6항 내지 제8항 및 제10항 중 어느 한 항의 식 (I)의 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
12. 제1항, 제6항 내지 제8항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식 (I)의 화합물은 글루카곤 수용체의 안타고니스트로서 작용하는 것인 화합물.
13. 제1항, 제6항 내지 제8항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식 (I)의 화합물은 GLP-1 수용체의 아고니스트로서 더 작용하는 것인 화합물.
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 제11항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 글루카곤 수용체의 안타고니스트로서 작용하는 것인 약제학적 조성물.
20. 제11항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 GLP-1 수용체의 아고니스트로서 더 작용하는 것인 약제학적 조성물.

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