CN1603346A - 蛋白质，含有其的产品及其在诊断、治疗和/或预防sars相关疾病中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种来自SARS－CoV病毒S蛋白的蛋白质或其保守性变体，编码所述蛋白的核苷酸序列，及含有所述序列的重组载体。本发明还涉及所述蛋白用于制备诊断、预防和/或治疗严重急性呼吸道综合征的产品的用途。本发明还涉及一种SARS相关冠状病毒感染的基因工程亚单位疫苗和DNA疫苗。

Description

蛋白质，含有其的产品及其 在诊断、治疗和/或预防SARS相关疾病中的用途

发明领域

本发明涉及来自SARS-CoV病毒S蛋白的蛋白质S242、S163和S297或其保守性变体，其能够形成多聚体，从而形成抗原性颗粒。本发明还涉及编码所述蛋白的核苷酸序列，及含有所述序列的重组载体。本发明进一步涉及所述蛋白用于制备诊断、预防和/或治疗严重急性呼吸道综合征的产品的用途。本发明还涉及一种SARS相关冠状病毒的基因工程亚单位疫苗，其中分别含有所述蛋白或其多聚体的活性成分，以及任选的佐剂和/或药学可接受的载体。本发明还涉及一种SARS相关冠状病毒的DNA疫苗，其中含有编码本发明所述蛋白或其片段的核苷酸序列，以及药学可接受的载体。

发明背景

严重急性呼吸道综合征(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)，又称传染性非典型性肺炎，是由一种新型冠状病毒(SARS，Coronavirus，SARS-CoV)引起的，通过飞沫、粪便和尿液等多种途径传播，以发热后出现快速进行性呼吸困难为特征性症状，传染性强、高病死率的急性疾病。潜伏期10天左右，病死率高达15％。病程一般为18～23天。

SARS流行的控制一方面依赖于可靠的诊断试剂以对病例进行及时诊断并监测其传播，另一方面也需要有效的疫苗和抗病毒药物以预防和治疗这一疾病。因此开发出预防SARS-CoV感染的疫苗十分必要。已知，疫苗可以成功预防动物的传统冠状病毒感染。但由于SARS-CoV的发现时间较短，因此，对该病毒的主要结构蛋白的结构特征、主要病毒中和表位、免疫优势表位等均缺乏直接了解，始终无法开展针对SARS-CoV感染的诊断、治疗和/或预防。

冠状病毒是一个大的RNA病毒家族，它的宿主非常广泛，包括哺乳动物和鸟类在内的很多脊椎动物都能被感染。已知冠状病毒直径100-120nm，呈有包膜的球形颗粒。病毒内部含单正链RNA，全长约30kb，是所有RNA病毒中最大的一种。病毒体成六角型状，组成病毒体衣壳的结构蛋白共有4-5种，包括S、M、E和N蛋白等，有些病毒还有HE蛋白。S蛋白形成病毒表面大的花瓣状突起，为分子量150-180kD的糖蛋白，该蛋白与病毒侵入细胞的过程密切相关，并可诱导中和抗体的产生。M蛋白确定病毒芽生的位置，启动病毒颗粒的组装等。N蛋白形成核蛋白，介导细胞免疫。E蛋白可形成病毒包膜，启动病毒颗粒的组装等。HE蛋白可凝集红细胞，形成病毒表面的小突起等。

SARS-CoV病毒形态上与其它冠状病毒相同，但同源性分析研究发现SARS-CoV与以往的3群冠状病毒不同，SARS-CoV看来缺乏HE基因，因此SARS-CoV被分为第4群冠状病毒，而各地获得的SARS-CoV基因序列相对保守。SARS-CoV包括5个主要的开放读码框架，分别编码S、M、N、E和复制酶蛋白；此外还包括数量不等的非保守开放读码框架。SARS-CoV病毒引起VERO和FRhk-4细胞病变效应，病毒复制被SARS康复人的血清所抑制。

S蛋白被认为是冠状病毒侵染过程中的关键蛋白，与病毒的组织嗜性、致病性密切相关，因此，也是SARS疫苗和SARS诊断试剂研制的重要靶蛋白，可能包含着重要的中和表位和免疫优势表位。SARS-CoV的S蛋白包括1255个氨基酸，其具体序列如SEQ ID NO：1所示。

发明内容

本发明人通过对SARS病毒的大量研究和实验，利用基因工程方法成功表达了SARS-CoV的S蛋白的不同片段，首次发现在所述SARS-CoV的S蛋白中存在能够形成多聚体的数个氨基酸片段，从而成功研制出用于诊断、预防和/或治疗SARS相关疾病的产品，特别是SARS相关冠状病毒的基因工程亚单位疫苗和DNA疫苗。

本发明的一个方面，涉及SARS-CoV的S蛋白的片段，所述蛋白质之氨基酸序列的N-端位于SEQ ID NO：1所示序列的870-920残基之间，C-端位于SEQ ID NO：1所示序列的1000-1240残基之间。此外，本发明还涉及所述蛋白的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸残基的替换、添加、缺失的保守性变体。优选的，所述蛋白的氨基酸序列之N-端位于第899位残基，C-端位于第1063位、第1140位或第1195位残基。

在本发明的一个实施方案中，所述蛋白具有如SEQ ID NO：2所述的序列，以下称为S163蛋白。在本发明又一实施方案中，所述蛋白具有如SEQ ID NO：3所述的序列，以下称为S242蛋白。在本发明又一实施方案中，所述蛋白具有SEQ ID NO：4所述的序列，以下称为S297蛋白。

此处所用的术语“变体”是指多核苷酸或多肽，其分别不同于参考的多核苷酸或多肽，但保留了基本的特性，如基本的生物特性、结构特性、调节特性或生化特性。多核苷酸的一般变体之核苷酸序列不同于另一个，参考核苷酸。变体核苷酸序列的变化可改变或不改变多肽的氨基酸序列，其中所述的多肽由参考多核苷酸编码。核苷酸的变化可导致参考序列所编码的多肽中氨基酸的替换、添加、删除、融合和截短，对此将在下面讨论。多肽的一般变体之氨基酸序列不同于另一个，参考多肽。通常，差异是有限的，以使参考多肽之序列与变体总体上非常相似，并且在许多区域是相同的。变体和参考多肽氨基酸序列上的差异可以是一个或多个氨基酸以任一组合的替换、添加和删除。替换或插入的氨基酸残基可由遗传密码编码，也可不由遗传密码编码。多核苷酸或多肽的变体可以自然产生(如等位基因变体)，或者它可以是非自然产生的变体。多核苷酸和多肽之非自然产生的变体可通过诱变技术或直接合成而产生。

此外，本发明所要求保护的范围还涉及编码根据上述蛋白之多核苷酸序列。本领域技术人员知晓，由于遗传密码的简并性，因此，根据上述氨基酸序列可以推导出一种以上的相应的多核苷酸序列，这些序列均包含在本发明的范围之内。

此外，本领域技术人员知晓，在编码上述蛋白的氨基酸序列中，可以进行保守性的氨基酸替换、添加或缺失，得到本发明所述蛋白质的保守性变体，只要经修饰的氨基酸序列保持或基本上保持本发明蛋白的抗原性或免疫原性。这些蛋白质保守性变体以及编码这些蛋白质变体的相应的多核苷酸序列均包含在本发明的范围之内。

本发明的又一方面涉及所述蛋白形成的多聚体。本发明人出人意料的发现，所述的蛋白能够形成聚合范围从大约2到大约600聚体不等的多聚体，优选的，所述蛋白的多聚体的聚合范围为从3-100的多聚体，更特别的，是3-50的多聚体。

本发明所述蛋白形成的多聚体呈粒径15-50纳米，优选的，粒径为20-30纳米的蛋白质颗粒。

本发明还涉及编码所述蛋白的核苷酸序列，及含有所述核苷酸序列的重组载体。适于表达本发明所述蛋白的重组表达载体，包括但不限于原核表达载体，真核表达载体。

这些载体包括染色体的、非染色体的和合成的DNA序列，例如，SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、酵母质粒、衍生于质粒和噬菌体DNA结合的载体、病毒DNA、杆状病毒、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒及伪狂犬病毒。不过，只要能在宿主中复制和存活，其它载体也可以利用。

合适的DNA序列可以通过许多方法插到载体中。通常，DNA序列用本领域中已知的方法插入到合适的限制性内切酶位点上。这些方法相信处于本领域技术人员的知识范围内。

表达载体中的DNA序列被有效地与一个合适的表达控制序列(启动子)连在一起，从而指导mRNA的合成。下面提到的是这种启动子的代表：LTR或SV40启动子、大肠杆菌的Lac或trp启动子、λ噬菌体的PL启动子以及已知控制原核或真核细胞或其病毒中基因表达的其它启动子。表达载体也包含翻译起始所需要的核糖体结合位点和转录终止子。载体还可以具有增强表达的合适序列。

此外，表达载体优选包含能提供表型特征的一个或多个选择标记基因，以便于转化宿主细胞的筛选，例如真核细胞的培养可用二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，大肠杆菌则可用四环素或氨苄青霉素抗性。

本发明再一方面涉及通过基因工程方法生产所述蛋白的方法，包括用本发明所述的重组载体转化宿主细胞，在适于所述蛋白表达的条件下培养转化的宿主细胞，以及从培养物中分离纯化所述的蛋白。

在本发明的一个具体实施方案中，采用大肠杆菌表达。在本发明的又一个具体实施方案中，采用酵母细胞表达。在本发明的又一个采用杆状病毒的表达。

包含上述合适的DNA序列、合适的启动子或控制序列的载体可以用于转化合适的宿主，让宿主表达该蛋白。

下面列举的是合适宿主的代表：细菌细胞，诸如大肠杆菌、链霉菌、鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞，如果蝇S2和草地夜蛾Sf9；动物细胞，如CHO、COS(猴肾成纤维细胞系)或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物细胞等等。从这些讲授看，合适宿主的选择应该在本领域技术人员的知识范围内。

特别值得提及的是，本发明也包括含上面概括性描述的一个或多个序列的重组构建体。该构建体包括载体，如质粒或病毒载体，其中正向或反向插入了本发明的一个序列。在此实施方案的一个优选方面，该构建体还包含调节序列，例如启动子，它被有效地连接到该序列上。对于本领域技术人员来说，许多载体和启动子都是已知的，并可通过商业途径获得。下面列举几种载体。细菌的：pQE-70、pQE-60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pBluescript SK、pBSKS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、pTRC99a、pKK223-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)；真核的：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。不过，只要是能在宿主中复制和存活，其它质粒或载体也可应用。

启动子区域可以利用CAT(氯霉素转移酶)载体或其它具有选择标记的载体从想要的基因中选择出来。pKK232-8和pCM7是两个合适的载体。特称的细菌启动子包括LacI、LacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL和trp。真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、逆转录病毒的LTR和小鼠金属硫蛋白I。合适载体和启动子的选择应在本领域普通的技术水平之内。

在另一实施方案中，本发明涉及包含上述构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是高等真核细胞，比如哺乳类细胞，或者是低等真核细胞，比如酵母细胞，还可以是原核细胞，比如细菌细胞。将构建体导入宿主细胞的方法有：磷酸钙转染、DEAE-聚糖介导的转染、电穿孔或基因枪方法。

在合适的启动子控制下可以在哺乳类细胞、酵母、细菌或其它细胞中表达成熟蛋白。利用由本发明的DNA构建体衍生的RNA，也可以用无细胞翻译体系产生这种蛋白质。适合于原核和真核宿主的克隆和表达载体Sambrook等人已在《分子克隆实验指南》(第二版，冷泉港出版社，纽约，1989)中进行了描述。

在高等真核生物中，编码本发明多肽的DNA的转录可以通过在载体中插入一增强子序列而被提高。增强子是DNA的顺式作用因子，通常有大约10-300bp，作用于启动子，提高它的转录。例如，SV40的位于复制起点后侧100-270bp处的增强子，巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起点后侧的多形瘤增强子及腺病毒增强子。

通常，重组表达载体包含复制起点和用于转化宿主细胞的选择标记，例如大肠杆菌的氨苄青霉素抗性基因和啤酒酵母TRP1基因，还包含从高效表达基因而来的启动子，从而介导下游结构序列的转录。这些启动子可以从编码糖酵解酶的操纵子中得来，诸如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、α因子、酸性磷酸酶或热休克蛋白。异源的结构序列以适当的方位与翻译起始和终止序列以及其它优选的序列装配在一起。

细菌适用的有效表达载体这样来构建：将编码目的蛋白的结构DNA序列随同适当的翻译起始和终止信号被插入到带有一个功能启动子的可操纵的阅读框中。载体应包含一个或多个表型选择标记和复制起点，复制起点保证了载体在宿主中能保留下来，更理想的是能使载体得到扩增。适于转化的原核宿主有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌以及假单孢菌属、链霉菌属和葡萄球菌属的各种细菌，其它的宿主也可以被选择。

作为一个代表性的但非限定性的例子，细菌适用的有效表达载体包括一个选择标记和细菌的复制起点，它衍生于从商业途径获得的、具有众所周知的克隆载体pBR322(ATCC37017)的遗传元件的质粒。这些商业化的载体包括诸如pKK223-3(Pharmacia)和pGEM1(Promega)等。pBR322的“骨架”部分与合适的启动子和被表达的结构序列组合在一起。

在转化合适的宿主菌株和宿主菌株生长到恰当的细胞密度之后，用适当的方法(例如温度转变或化学药品诱导)诱导所选择的启动子，并将细胞再培养一段时间。

通常用离心的方法收获细胞，用物理或化学的方法破碎细胞，将粗提物保留以进一步纯化。用于表达蛋白的微生物细胞可以用任何便捷的方法破碎，包括冻融循环、超声波、机械破碎，或者使用细胞溶解剂，这些方法都是本领域的技术人员熟知的。

各种哺乳动物细胞的培养系统也能用于表达重组蛋白。哺乳类表达系统的例子有Gluzman(Cell 23：175，1981)所描述猴肾成纤维细胞的COS-7细胞系，及其它的能表达相容载体的细胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。哺乳类表达载体包括复制起点、适当的启动子、增强子及任何必需的核糖体结合位点、多腺苷化位点、拼接供体和受体位点、转录终止序列和5’侧翼非转录序列。衍生于SV40拼接序列的DNA序列和多腺苷化位点可用于提供所需要的非转录遗传元件。

多肽可以从重组细胞培养物中回收和纯化出来，回收和纯化的方法有硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和植物凝集素层析。形成成熟蛋白的完整构象需要蛋白质的再折叠步骤。高效液相层析(HPLC)应用于最后的纯化步骤。

本发明的多肽可以是纯化的天然产物，也可以是化学合成的产物，还可以从原核或真核宿主(例如，培养的细菌、酵母、高等植物、昆虫或哺乳动物细胞)经重组技术产生。根据重组生产方法中所用的宿主不同，本发明中的多肽可能被糖基化或不被糖基化。该多肽也可能具有起始的甲硫氨酸残基。

本发明还涉及所述蛋白用于制备诊断、预防和/或治疗严重急性呼吸道综合征的产品的用途，包括但不限于制备用于临床诊断的试剂盒，用于预防的疫苗和治疗剂。

本发明还涉及含有所述蛋白质和至少一种另外的氨基酸片段的融合蛋白。所述另外的氨基酸片段是指能够和本发明所述蛋白一起，用于引发针对SARS相关病毒的免疫反应的氨基酸片段，或者能够促进本发明所述蛋白质形成多聚体的氨基酸片段。

在本发明的一个具体实施方案中，所述融合蛋白含有本发明所述的蛋白质以及至少一种能够增强本发明所述蛋白的抗原性的另外一种蛋白质。

本发明的又一方面还涉及一种SARS相关冠状病毒基因工程亚单位疫苗，其中含有选自本发明所述蛋白或其多聚体作为活性成分，以及任选的佐剂和/或药学可接受的载体。

在本发明所述基因工程亚单位疫苗中，所述蛋白多聚体包括选自至少一种如下形式的多聚体：二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体或十聚体，还可以包括更高形式的多聚体。

本领域技术人员根据所述疫苗的给药途径和接种方案，知晓如何选择所述亚单位疫苗中本发明所述蛋白质或其多聚体作为活性成分的含量。优选的，本发明所述亚单位疫苗中含有5-50微克的本发明所述蛋白质或其多聚体，更优选的，本发明所述亚单位疫苗含有15-30微克的本发明所述蛋白质或其多聚体。

适于本发明所述基因工程亚单位疫苗的佐剂优选为氢氧化铝。事实上，本领域技术人员知晓如何根据所述疫苗的活性成分选择不影响其生物活性的佐剂。

本发明又一方面还包括含有编码所述核苷酸序列或其片段的SARS相关冠状病毒的DNA疫苗。

附图说明

图1显示表达质粒pTO-T7-242的构建示意图。

图2显示重组表达的S163和S242蛋白的SDS-PAGE分析结果。

图3显示复性后重组表达的S242蛋白的SDS-PAGE分析结果。

图4β-巯基乙醇及煮沸对S242蛋白的影响。

图5复性后S242蛋白的HPLC-G5000分析结果。

图6复性后S242蛋白的动态光散射分析结果。

图7重组表达的SARS相关冠状病毒S蛋白多肽片段的dot-blotting分析结果。

图8复性后S242蛋白的Western Blotting和对应的SDS-PAGE分析结果。

图9复性后S163蛋白的Western Blotting和对应的SDS-PAGE分析结果。

实施例1  S242蛋白、S163蛋白和S297蛋白表达质粒的构建

根据SARS-CoV Urbani株基因组序列(Genbank收录号：AY278741.1)序列号第21492到25259位碱基合成基因(由上海生工生物工程公司合成)，获得携带SARS-CoV S基因全编码区的质粒pcDNA3.1 SARS-S。

以pcDNA3.1 SARS-S质粒为模板，利用正向引物FS899(5’-GGATCC CAT ATG TAT GAG AAC CAA AAA CAA ATC-3’(SEQ IDNO：9)，携带BamH I、NdeI位点)，以及反向引物RS1140(5’-GAATTC TTA TGG CGC TGT GGT GAA-3’(SEQ ID NO：10)，其5’端引入EcoR I位点)，按以下方法依次进行PCR反应：94℃7min；94℃60sec，57℃60sec，72℃30sec，共20个循环；72℃10min。电泳，以胶回收试剂盒(上海华舜公司)回收扩增的特异DNA片段：S242。PCR产物再与pMD 18-T载体(TAKARA公司)连接。用BamH I和EcoR I切下S242片段，连到同样酶切处理的pTO-T7上。鉴定正确的克隆即为pTO-T7-242(图1)，携带S蛋白的aa899-1140片段编码基因，编码本发明所述S242蛋白。

类似的，分别以引物FS899和RS1061(GAA TTC TTA TGG CGCTGT GGT GAA(SEQ ID NO：11))或RS1195(GAA TTC CTA AGGCCA TTT AAT ATA TTG CT(SEQ ID NO：12))从pSARS-S质粒中扩增S基因的aa899-1061片段(S163)或aa899-1095片段(S297)，并插入表达载体pTO-T7中，获得表达载体pTO-T7-163和pTO-T7-297。实施例2 S-242蛋白的原核表达、纯化、复性及其表征

取带有S-242蛋白编码基因的如实施例1所制备的表达载体之大肠杆菌甘油保藏菌株，转接至一定量的LB培养基(NaCl 10g/L；酵母膏5g/L；蛋白胨10g/L)中中，活化至OD600达0.5左右。然后按1∶1000体积比转接至大瓶培养(500ml/瓶)。培养到OD600约为1.0时诱导表达，诱导表达的条件为：37℃，0.4mM IPTG，诱导5小时。

离心收集菌体，超声破碎(量大时使用高压均质机破碎细胞)，所得包涵体经洗涤纯化后，分别用2mol尿素，4mol尿素，8mol尿素进行溶解。为了去除尽量多的杂蛋白，采用Triton X-100溶液洗涤3次。由图2可知，目的蛋白主要存在于包涵体，超声裂解上清中几乎无目的蛋白。大部分包涵体(80％)可溶于8mol尿素中，最终的纯度可达85％以上，(图2)。

先将8M尿素的样品透析到4M尿素/CPB(10.3mMNa₂HPO₄；4.85mM柠檬酸)(pH5.0)中，然后用羧甲基纤维素(CM)阳离子交换层析的方法纯化。离子交换层析是利用离子交换剂为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的洗脱层析法。

用DNAstar软件(DNAstar公司)的Protean程序分析S-242蛋白的等电点为6.7，在pH值为5.0时可使用阳离子交换层析纯化此蛋白。层析柱为：TSK-GEL CM-5PW，7.5mm×7.5mm，柱体积为3.3mL；缓冲液为为4M尿素/CPB(pH5.0)；线性洗脱：0-1mol/L NaCl/CPB，洗脱体积约为20倍柱体积。纯化后样品再透析到2M尿素/TB(pH8.5)中，最后透析到TB(20mM Tris，用HCl调pH到8.5)中，最后透析到TB(pH8.5)中。

复性后S-242蛋白的SDS-PAGE分析

复性后S-242蛋白的SDS-PAGE分析显示，在无β-巯基乙醇的条件下所述蛋白可形成明显的多聚体，在有β-巯基乙醇并煮沸的条件下所述蛋白只观察到单体(参见图3、4)。

复性后S-242蛋白的HPLC-G5000分析

复性后S-242蛋白的HPLC-G5000分析使用大分子凝胶过滤分析柱：  TSK-GEL G5000PWxl，在BECKMAN Coulter 126/128 HPLC系统中使用流动相20mM TB(pH8.5)，流速为0.5ml/min，蛋白主峰的保留时间为14.28min。根据G5000柱的分离范围，发现主峰相对分子量约为10,000KD，因为单体分子量约为27KD，提示它应为多聚体，结果见图5。

复性后S-242蛋白的动态光散射分析

复性后S-242蛋白的动态光散射分析，将样品经1,2000rpm离心10分钟后取上清在动态光散射仪(Protein Solutions Dynapro)中分析，发现在溶液20mM TB(pH8.5)中，此蛋白能形成均一度较高，水化半径约20nm的颗粒，结果见图6。

实施例3  S-163蛋白的表达、纯化、复性和表征

取带有S-163蛋白编码基因的如实施例1所制备的表达载体之大肠杆菌甘油保藏菌株，转接至一定量的LB培养基中，活化至OD600达0.5左右。然后按1∶1000体积比转接至大瓶培养(500ml/瓶)。培养到OD600约为1.0时诱导表达，诱导表达的条件为：37℃，0.4mM IPTG，诱导5小时。

离心收集菌体，超声破碎(量大时使用高压均质机破碎细胞)，所得包涵体经洗涤纯化后，分别用2mol尿素，4mol尿素，8mol尿素进行溶解。为了去除尽量多的杂蛋白，采用Triton X-100溶液洗涤3次。由图2可知，目的蛋白主要存在于包涵体，超声裂解上清中几乎无目的蛋白。大部分包涵体(80％)可溶于8mol尿素中，最终的纯度可达85％以上，参见图2。

先将8M尿素的样品透析到4M尿素/CPB(pH5.0)中，然后用CM阳离子交换层析的方法纯化。离子交换层析是利用离子交换剂为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的洗脱层析法。

用DNAstar软件(DNAstar公司)的Protean程序分析，S-163蛋白的等电点为8.85，在pH值为5.0时可使用阳离子交换层析纯化此蛋白。层析柱为：TSK-GEL CM-5PW，7.5mm×7.5mm，柱体积为3.3mL；缓冲液为为4M尿素/CPB(pH5.0)；线性洗脱：0-1mol/L NaCl/CPB，洗脱体积约为20倍柱体积。纯化后样品再透析到2M尿素/TB(pH8.5)中，最后透析到TB(pH8.5)中。

复性后S-163蛋白的SDS-PAGE分析

复性后S-163蛋白的SDS-PAGE分析发现，在无β-巯基乙醇的条件下，S163蛋白可形成明显的多聚体，在有β-巯基乙醇并煮沸的条件下，所述蛋白只观察到单体.

实施例4  S-242蛋白的抗原/抗体结合活性检测

用点杂交方法检测如实施例3所述方法获得的S242蛋白的抗原活性。将1uL蛋白直接点样于硝酸纤维素(NC)膜上，风干。用10mL溶于TN(10mM Tris●Cl  pH8.0；150mM NaCl)的5％脱脂奶室温封闭2小时。按1∶500体积比稀释加入SARS患者恢复期血清，室温反应1小时。用TNT(TN+0.05％Tween 20)洗膜三次，每次间隔10min。加入1∶10000体积比稀释的碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗人二抗，室温反应1小时。用TNT洗膜三次，每次间隔10min。显色。结果见图7。抗原活性检测发现，在由包含于SARS-CoV S蛋白编码基因的诸多亚片段所编码的蛋白质中，S-242具一定的抗原活性。

用蛋白印迹法检测S242蛋白的抗原/抗体结合活性

用蛋白印迹方法检测S242蛋白的抗原/抗体结合活性，包括：将所述蛋白进行SDS-PAGE电泳，再将经分离的蛋白从凝胶上电转移到硝酸纤维素(NC)膜。用10mL溶于TN的5％脱脂奶室温封闭2 hr。按1∶500体积比稀释加入SARS患者恢复期血清室温反应1小时。用TNT洗膜三次，每次间隔10min。加入1∶10000体积比稀释的AP标记的羊抗人二抗，室温反应1hr。用TNT洗膜三次，每次间隔10min。显色。

结果发现，S-242蛋白的多聚体位置可见反应条带，而单体位置未见，显示S-242蛋白多聚体的抗原/抗体结合活性明显好于S242的单体。

实施例5  S-163蛋白的抗原/抗体结合活性检测

用点杂交检测蛋白活性

将1uL蛋白直接点到NC膜上，风干。用10mL溶于TN的5％脱脂奶室温封闭2hr。按1∶500体积比稀释加入SARS患者恢复期血清室温反应1hr。用TNT洗膜三次，每次间隔10min。加入1∶10000体积比稀释的AP标记的羊抗人二抗，室温反应1hr。用TNT洗膜三次，每次间隔10min。显色。

结果显示，发现在由包含于SARS-CoV S蛋白编码基因的诸多亚片段所编码的蛋白质中，S-163蛋白具一定的抗原/抗体结合活性。结果参见图8。

蛋白质印迹检测S163蛋白的抗原/抗体结合活性

蛋白质印迹检测S163蛋白的抗原/抗体结合活性，包括：将所述蛋白进行SDS-PAGE电泳；再将所展开的蛋白从凝胶上电转移到NC膜。用10mL溶于TN的5％脱脂奶室温封闭2hr。按1∶500稀释加入Sars患者恢复期血清室温反应1hr。用TNT洗膜三次，每次间隔10min。加入1∶10000稀释的AP标记的羊抗人二抗，室温反应1hr。用TNT洗膜三次，每次间隔10min。显色。结果参见图9。发现S-163蛋白多聚体位置可见反应条带，而单体位置未见，表明S-163蛋白多聚体的抗原/抗体结合活性好于单体。

序列表

<110>厦门大学

养生堂有限公司

<120>蛋白质，含有其的产品及其在诊断、治疗和/或预防SARS相关疾病中的用途

<130>IDC030093

<160>12

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1255

<212>PRT

<213>Coronavirus

<220>

<221>1

<222>(577)..(577)

<223>any one of amino acids

<220>

<221>misc feature

<222>(577)..(577)

<223>any one of amino acids

<400>1

Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu

1               5                   10                  15

Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln

            20                  25                  30

His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg

        35                  40                  45

Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser

    50                  55                  60

Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Gly Asn Pro Val

65                  70                  75                  80

Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn

                85                  90                  95

Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln

            100                 105                 110

Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys

        115                 120                 125

Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met

    130                 135                 140

Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr

145                 150                 155                 160

Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser

                165                 170                 175

Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly

            180                 185                 190

Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp

        195                 200                 205

Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu

    210                  215                220

Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro

225                 230                 235                 240

Ala Gln Asp Ile Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr

                245                 250                 255

Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile

            260                 265                 270

Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys

        275                 280                 285

Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn

    290                 295                 300

Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr

305                 310                 315                 320

Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser

                325                 330                 335

Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr

            340                 345                 350

Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly

        355                 360                 365

Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala

    370                 375                 380

Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly

385                 390                 395                 400

Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe

                405                410                  415

Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser

            420                 425                 430

Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu

        435                 440                 445

Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly

    450                 455                 460

Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp

465                 470                 475                 480

Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val

                485                 490                 495

Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly

            500                 505                 510

Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn

        515                 520                 525

Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg

    530                 535                 540

Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp

545                 550                 555                 560

Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys

                565                 570                 575

Xaa Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser Ser

            580                 585                 590

Glu Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Asp Val Ser Thr

        595                 600                 605

Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Ala Trp Arg Ile Tyr Ser Thr

    610                 615                 620

Gly Asn Ash Val Phe Gln Thr Gln Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu

625                 630                 635                 640

His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile

                645                 650                 655

Cys Ala Ser Tyr His Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln Lys

            660                 665                 670

Ser Ile Val Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Asp Ser Ser Ile Ala

        675                 680                 685

Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Ser Ile Ser Ile

    690                 695                 700

Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys Thr Ser Val Asp Cys

705                 710                 715                 720

Asn Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ala Ash Leu Leu Leu

                725                 730                 735

Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser Gly Ile

            740                 745                 750

Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala Gln Val Lys

        755                 760                 765

Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly Gly Phe Asn Phe

    770                 775                 780

Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr Lys Arg Ser Phe Ile

785                 790                 795                 800

Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Met

                805                 810                 815

Lys Gln Tyr Gly Glu Cys Leu Gly Asp Ile Asn Ala Arg Asp Leu Ile

            820                 825                 830

Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr

        835                 840                 845

Asp Asp Met Ile Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Leu Val Ser Gly Thr Ala

    850                 855                 860

Thr Ala Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe

865                 870                 875                 880

Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn

                885                 890                 895

Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala

            900                 905                 910

Ile Ser Gln Ile Gln Glu Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala Leu Gly

        915                 920                 925

Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu

    930                 935                 940

Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn

945                 950                 955                 960

Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp

                965                 970                 975

Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln

            980                 985                 990

Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala

        995                 1000                1005

Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp

    1010                1015                1020

Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ala Ala

    1025                1030                1035

Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ser Gln

    1040                1045                1050

Glu Arg Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Glu Gly Lys

    1055                1060                1065

Ala Tyr Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Phe Asn Gly Thr Ser

    1070                1075                1080

Trp Phe Ile Thr Gln Arg Asn Phe Phe Ser Pro Gln Ile Ile Thr

    1085                1090                1095

Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly

    1100                1105                1110

Ile Ile Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp

    1115                1120                1125

Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser

    1130                1135                1140

Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val

    1145                1150                1155

Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys

    1160                1165                1170

Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr

    1175                1180                1185

Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Val Trp Leu Gly Phe Ile

    1190                1195                1200

Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Leu Leu Cys Cys

    1205                1210                1215

Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Ala Cys Ser Cys Gly

    1220                1225                1230

Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys

    1235                1240                1245

Gly Val Lys Leu His Tyr Thr

    1250                1255

<210>2

<211>163

<212>PRT

<213>SARS-CoV

<400>2

Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala Ile Ser

1               5                   10                  15

Gln Ile Gln Glu Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala Leu Gly Lys Leu

            20                  25                  30

Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys

        35                  40                  45

Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile

    50                  55                  60

Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu

65                  70                  75                  80

Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu

                85                  90                  95

Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys

            100                 105                 110

Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly

        115                 120                 125

Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ala Ala Pro His Gly Val

    130                 135                 140

Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ser Gln Glu Arg Asn Phe Thr

145                 150                 155                 160

Thr Ala Pro

<210>3

<211>242

<212>PRT

<213>SARS-CoV

<400>3

Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala Ile Ser

1               5                   10                  15

Gln Ile Gln Glu Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala Leu Gly Lys Leu

            20                  25                  30

Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys

        35                  40                  45

Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile

    50                  55                  60

Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu

65                  70                  75                  80

Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu

                85                  90                  95

Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys

            100                 105                 110

Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly

        115                 120                 125

Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ala Ala Pro His Gly Val

    130                 135                 140

Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ser Gln Glu Arg Asn Phe Thr

145                 150                 155                 160

Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Glu Gly Lys Ala Tyr Phe Pro Arg Glu

                165                 170                 175

Gly Val Phe Val Phe Asn Gly Thr Ser Trp Phe Ile Thr Gln Arg Asn

            180                 185                 190

Phe Phe Ser Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly

        195                 200                 205

Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Ile Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro

    210                 215                 220

Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe

225                 230                 235                 240

Lys Asn

<210>4

<211>297

<212>PRT

<213>SARS-CoV

<400>4

Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala Ile Ser

1               5                   10                  15

Gln Ile Gln Glu Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala Leu Gly Lys Leu

            20                  25                  30

Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys

        35                  40                  45

Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile

    50                  55                  60

Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu

65                  70                  75                  80

Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu

                85                  90                  95

Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys

            100                 105                 110

Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly

        115                 120                 125

Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ala Ala Pro His Gly Val

    130                 135                 140

Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ser Gln Glu Arg Asn Phe Thr

145                 150                 155                 160

Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Glu Gly Lys Ala Tyr Phe Pro Arg Glu

                165                 170                 175

Gly Val Phe Val Phe Asn Gly Thr Ser Trp Phe Ile Thr Gln Arg Asn

            180                 185                 190

Phe Phe Ser Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly

        195                 200                 205

Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Ile Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro

    210                 215                 220

Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe

225                 230                 235                 240

Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile

                245                 250                 255

Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu

            260                 265                 270

Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly

        275                 280                 285

Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro

    290                 295

<210>5

<211>3768

<212>DNA

<213>SARS-CoV

<400>5

atgtttattt tcttattatt tcttactctc actagtggta gtgaccttga ccggtgcacc     60

acttttgatg atgttcaagc tcctaattac actcaacata cttcatctat gaggggggtt    120

tactatcctg atgaaatttt tagatcagac actctttatt taactcagga tttatttctt    180

ccattttatt ctaatgttac agggtttcat actattaatc atacgtttgg caaccctgtc    240

atacctttta aggatggtat ttattttgct gccacagaga aatcaaatgt tgtccgtggt    300

tgggtttttg gttctaccat gaacaacaag tcacagtcgg tgattattat taacaattct    360

actaatgttg ttatacgagc atgtaacttt gaattgtgtg acaacccttt ctttgctgtt    420

tctaaaccca tgggtacaca gacacatact atgatattcg ataatgcatt taattgcact    480

ttcgagtaca tatctgatgc cttttcgctt gatgtttcag aaaagtcagg taattttaaa    540

cacttacgag agtttgtgtt taaaaataaa gatgggtttc tctatgttta taagggctat    600

caacctatag atgtagttcg tgatctacct tctggtttta acactttgaa acctattttt    660

aagttgcctc ttggtattaa cattacaaat tttagagcca ttcttacagc cttttcacct    720

gctcaagaca tttggggcac gtcagctgca gcctattttg ttggctattt aaagccaact    780

acatttatgc tcaagtatga tgaaaatggt acaatcacag atgctgttga ttgttctcaa    840

aatccacttg ctgaactcaa atgctctgtt aagagctttg agattgacaa aggaatttac    900

cagacctcta atttcagggt tgttccctca ggagatgttg tgagattccc taatattaca    960

aacttgtgtc cttttggaga ggtttttaat gctactaaat tcccttctgt ctatgcatgg   1020

gagagaaaaa aaatttctaa ttgtgttgct gattactctg tgctctacaa ctcaacattt   1080

ttttcaacct ttaagtgcta tggcgtttct gccactaagt tgaatgatct ttgcttctcc   1140

aatgtctatg cagattcttt tgtagtcaag ggagatgatg taagacaaat agcgccagga   1200

caaactggtg ttattgctga ttataattat aaattgccag atgatttcat gggttgtgtc   1260

cttgcttgga atactaggaa cattgatgct acttcaactg gtaattataa ttataaatat   1320

aggtatctta gacatggcaa gcttaggccc tttgagagag acatatctaa tgtgcctttc   1380

tcccctgatg gcaaaccttg caccccacct gctcttaatt gttattggcc attaaatgat   1440

tatggttttt acaccactac tggcattggc taccaacctt acagagttgt agtactttct   1500

tttgaacttt taaatgcacc ggccacggtt tgtggaccaa aattatccac tgaccttatt   1560

aagaaccagt gtgtcaattt taattttaat ggactcactg gtactggtgt gttaactcct   1620

tcttcaaaga gatttcaacc atttcaacaa tttggccgtg atgtttctga tttcactgat   1680

tccgttcgag atcctaaaac atctgaaata ttagacattt caccttgckc ttttgggggt   1740

gtaagtgtaa ttacacctgg aacaaatgct tcatctgaag ttgctgttct atatcaagat   1800

gttaactgca ctgatgtttc tacagcaatt catgcagatc aactcacacc agcttggcgc   1860

atatattcta ctggaaacaa tgtattccag actcaagcag gctgtcttat aggagctgag   1920

catgtcgaca cttcttatga gtgcgacatt cctattggag ctggcatttg tgctagttac   1980

catacagttt ctttattacg tagtactagc caaaaatcta ttgtggctta tactatgtct   2040

ttaggtgctg atagttcaat tgcttactct aataacacca ttgctatacc tactaacttt   2100

tcaattagca ttactacaga agtaatgcct gtttctatgg ctaaaacctc cgtagattgt   2160

aatatgtaca tctgcggaga ttctactgaa tgtgctaatt tgcttctcca atatggtagc   2220

ttttgcacac aactaaatcg tgcactctca ggtattgctg ctgaacagga tcgcaacaca   2280

cgtgaagtgt tcgctcaagt caaacaaatg tacaaaaccc caactttgaa atattttggt   2340

ggttttaatt tttcacaaat attacctgac cctctaaagc caactaagag gtcttttatt   2400

gaggacttgc tctttaataa ggtgacactc gctgatgctg gcttcatgaa gcaatatggc   2460

gaatgcctag gtgatattaa tgctagagat ctcatttgtg cgcagaagtt caatggactt   2520

acagtgttgc cacctctgct cactgatgat atgattgctg cctacactgc tgctctagtt   2580

agtggtactg ccactgctgg atggacattt ggtgctggcg ctgctcttca aatacctttt   2640

gctatgcaaa tggcatatag gttcaatggc attggagtta cccaaaatgt tctctatgag   2700

aaccaaaaac aaatcgccaa ccaatttaac aaggcgatta gtcaaattca agaatcactt   2760

acaacaacat caactgcatt gggcaagctg caagacgttg ttaaccagaa tgctcaagca   2820

ttaaacacac ttgttaaaca acttagctct aattttggtg caatttcaag tgtgctaaat   2880

gatatccttt cgcgacttga taaagtcgag gcggaggtac aaattgacag gttaattaca   2940

ggcagacttc aaagccttca aacctatgta acacaacaac taatcagggc tgctgaaatc   3000

agggcttctg ctaatcttgc tgctactaaa atgtctgagt gtgttcttgg acaatcaaaa   3060

agagttgact tttgtggaaa gggctaccac cttatgtcct tcccacaagc agccccgcat   3120

ggtgttgtct tcctacatgt cacgtatgtg ccatcccagg agaggaactt caccacagcg   3180

ccagcaattt gtcatgaagg caaagcatac ttccctcgtg aaggtgtttt tgtgtttaat   3240

ggcacttctt ggtttattac acagaggaac ttcttttctc cacaaataat tactacagac   3300

aatacatttg tctcaggaaa ttgtgatgtc gttattggca tcattaacaa cacagtttat   3360

gatcctctgc aacctgagct tgactcattc aaagaagagc tggacaagta cttcaaaaat   3420

catacatcac cagatgttga tcttggcgac atttcaggca ttaacgcttc tgtcgtcaac   3480

attcaaaaag aaattgaccg cctcaatgag gtcgctaaaa atttaaatga atcactcatt   3540

gaccttcaag aattgggaaa atatgagcaa tatattaaat ggccttggta tgtttggctc   3600

ggcttcattg ctggactaat tgccatcgtc atggttacaa tcttgctttg ttgcatgact   3660

agttgttgca gttgcctcaa gggtgcatgc tcttgtggtt cttgctgcaa gtttgatgag   3720

gatgactctg agccagttct caagggtgtc aaattacatt acacataa                3768

<210>6

<211>489

<212>DNA

<213>SARS-CoV

<400>6

tatgagaacc aaaaacaaat cgccaaccaa tttaacaagg cgattagtca aattcaagaa     60

tcacttacaa caacatcaac tgcattgggc aagctgcaag acgttgttaa ccagaatgct    120

caagcattaa acacacttgt taaacaactt agctctaatt ttggtgcaat ttcaagtgtg    180

ctaaatgata tcctttcgcg acttgataaa gtcgaggcgg aggtacaaat tgacaggtta    240

attacaggca gacttcaaag ccttcaaacc tatgtaacac aacaactaat cagggctgct    300

gaaatcaggg cttctgctaa tcttgctgct actaaaatgt ctgagtgtgt tcttggacaa    360

tcaaaaagag ttgacttttg tggaaagggc taccacctta tgtccttccc acaagcagcc    420

ccgcatggtg ttgtcttcct acatgtcacg tatgtgccat cccaggagag gaacttcacc    480

acagcgcca                                                            489

<210>7

<211>726

<212>DNA

<213>SARS-CoV

<400>7

tatgagaacc aaaaacaaat cgccaaccaa tttaacaagg cgattagtca aattcaagaa     60

tcacttacaa caacatcaac tgcattgggc aagctgcaag acgttgttaa ccagaatgct    120

caagcattaa acacacttgt taaacaactt agctctaatt ttggtgcaat ttcaagtgtg    180

ctaaatgata tcctttcgcg acttgataaa gtcgaggcgg aggtacaaat tgacaggtta    240

attacaggca gacttcaaag ccttcaaacc tatgtaacac aacaactaat cagggctgct    300

gaaatcaggg cttctgctaa tcttgctgct actaaaatgt ctgagtgtgt tcttggacaa    360

tcaaaaagag ttgacttttg tggaaagggc taccacctta tgtccttccc acaagcagcc    420

ccgcatggtg ttgtcttcct acatgtcacg tatgtgccat cccaggagag gaacttcacc    480

acagcgccag caatttgtca tgaaggcaaa gcatacttcc ctcgtgaagg tgtttttgtg    540

tttaatggca cttcttggtt tattacacag aggaacttct tttctccaca aataattact    600

acagacaata catttgtctc aggaaattgt gatgtcgtta ttggcatcat taacaacaca    660

gtttatgatc ctctgcaacc tgagcttgac tcattcaaag aagagctgga caagtacttc    720

aaaaat                                                               726

<210>8

<211>891

<212>DNA

<213>SARS-CoV

<400>8

tatgagaacc aaaaacaaat cgccaaccaa tttaacaagg cgattagtca aattcaagaa     60

tcacttacaa caacatcaac tgcattgggc aagctgcaag acgttgttaa ccagaatgct    120

caagcattaa acacacttgt taaacaactt agctctaatt ttggtgcaat ttcaagtgtg    180

ctaaatgata tcctttcgcg acttgataaa gtcgaggcgg aggtacaaat tgacaggtta    240

attacaggca gacttcaaag ccttcaaacc tatgtaacac aacaactaat cagggctgct    300

gaaatcaggg cttctgctaa tcttgctgct actaaaatgt ctgagtgtgt tcttggacaa    360

tcaaaaagag ttgacttttg tggaaagggc taccacctta tgtccttccc acaagcagcc    420

ccgcatggtg ttgtcttcct acatgtcacg tatgtgccat cccaggagag gaacttcacc    480

acagcgccag caatttgtca tgaaggcaaa gcatacttcc ctcgtgaagg tgtttttgtg    540

tttaatggca cttcttggtt tattacacag aggaacttct tttctccaca aataattact    600

acagacaata catttgtctc aggaaattgt gatgtcgtta ttggcatcat taacaacaca    660

gtttatgatc ctctgcaacc tgagcttgac tcattcaaag aagagctgga caagtacttc    720

aaaaatcata catcaccaga tgttgatctt ggcgacattt caggcattaa cgcttctgtc    780

gtcaacattc aaaaagaaat tgaccgcctc aatgaggtcg ctaaaaattt aaatgaatca    840

ctcattgacc ttcaagaatt gggaaaatat gagcaatata ttaaatggcc t             891

<210>9

<211>33

<212>DNA

<213>artifical

<400>9

ggatcccata tgtatgagaa ccaaaaacaa atc                                 33

<210>10

<211>24

<212>DNA

<213>artifical

<400>10

gaattcttat ggcgctgtgg tgaa                                           24

<210>11

<211>24

<212>DNA

<213>artifical

<400>11

gaattcttat ggcgctgtgg tgaa                                           24

<210>12

<211>29

<212>DNA

<213>artifical

<400>12

gaattcctaa ggccatttaa tatattgct                                      29

Claims (10)

1.一种蛋白，其氨基酸序列的N-端位于SEQ ID NO：1所示序列的870-920残基之间，C-端位于SEQ ID NO：1所示序列的1000-1240残基之间，或所述蛋白的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸残基的替换、添加、缺失的保守性变体。

2.权利要求1所述的蛋白，其为具有SEQ ID NO：2(899-1063)，SEQ ID NO：3(899-1140)或SEQ ID NO：4(899-1195)所示的序列的S163蛋白、S242蛋白和S297蛋白或其保守性变体。

3.权利要求1所述蛋白，其为2-400的多聚体形式，优选的为3-150的多聚体的形式，或呈选自至少一种下述多聚体的形式：二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体或十聚体。

4.权利要求1所述蛋白，其为粒径15-50纳米的颗粒，优选的所述粒径为20-30纳米。

5.编码权利要求1所述蛋白的核苷酸序列，优选的为SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，或SEQ ID NO：8所示的序列或其简并性变体。

6.一种制备权利要求1所述蛋白的方法，包括用权利要求5所述的重组载体转化宿主细胞，在适于所述蛋白表达的条件下培养转化的宿主细胞，以及从培养物中分离纯化所述的蛋白。

7.权利要求1所述蛋白用于制备诊断、预防和/或治疗严重急性呼吸道综合征的药物的用途。

8.一种融合蛋白，其含有权利要求1所述蛋白。

9.一种严重急性呼吸道综合征基因工程亚单位疫苗，其中含有选自权利要求1所述蛋白或其n聚体，和权利要求8的融合蛋白的活性成分，其中n为2-400的整数，以及任选的佐剂和/或药学可接受的载体。

10.一种严重急性呼吸道综合征的DNA疫苗，其中含有编码权利要求1所述蛋白或其片段的核苷酸序列，以及药学可接受的载体。

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