CN101983208A - 胰高血糖素受体拮抗剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及胰高血糖素受体多肽拮抗剂，其抑制激素胰高血糖素与其受体的结合。更具体地，本发明涉及抑制胰高血糖素与其受体结合的高亲和力胰高血糖素受体抗体或其Fab片段，以及它们用于治疗或预防哺乳动物物种中II型糖尿病(NIDDM)以及相关疾病的用途。
Description
技术领域
本发明涉及胰高血糖素受体多肽拮抗剂，其抑制激素胰高血糖素与其受体的结合。更具体地，本发明涉及抑制胰高血糖素与其受体结合的高亲和力胰高血糖素受体抗体或其Fab片段，以及它们用于治疗或预防哺乳动物物种中II型糖尿病(NIDDM)以及相关疾病的用途。
背景技术
胰高血糖素是由胰腺α-细胞应答于低血糖水平而产生的29个氨基酸的肽激素。胰高血糖素与肝细胞表面上的膜相连的胰高血糖素受体结合，其引发G蛋白信号转导级联，活化细胞内环AMP并导致通过重头合成(葡萄糖异生)和糖原分解(糖原分解)释放葡萄糖。
Unson等人公开了针对对应于大鼠受体的两个细胞外部分的合成肽产生的多克隆抗体。在所公开的测定中，发现针对126-137和206-219氨基酸残基产生的多克隆抗体在大鼠肝膜中阻断胰高血糖素与受体的结合(Unson等人，PNAS，第93卷，第310-315页，1996年1月)。
Buggy等人公开了据说在体外测定中与胰高血糖素竞争受体的激素结合位点的单克隆抗体的制备。(Buggy等人，Horm.Metab.Res.28(1996)215-219)。在所公开的测定中，命名为CIV395.7A的抗体识别人和大鼠胰高血糖素受体，但不识别小鼠受体。为了开发用于人体治疗的抗体，通常需要进行在有效的大鼠和/或小鼠动物模型中临床前疗效和安全性研究。因此，提供能够结合大鼠、小鼠和人形式的胰高血糖素受体的临床前治疗性抗体候选非常有利于治疗性抗体的药物开发，并且是非常想要的。
Wright等人公开了称为hGR-2F6的单克隆抗体以及其Fab片段的氨基酸序列。已在小鼠中产生了针对人胰高血糖素受体的此抗体，并在公开的测定中描述为对此受体的竞争性拮抗剂(Wright等人，Acta Cryst.(2000)D56，573-580)。本申请人发现hGR-2F6仅以低亲合性结合胰高血糖素受体的大鼠和小鼠形式，在糖尿病大鼠体内模型中发现高剂量的hGR-2F6也不具有治疗效力。具体地，在大鼠模型中此抗体不能以任何统计显著性降低血清葡萄糖(blood serum glucose，未公开)。
本申请人认识到需要提供以高亲和力结合胰高血糖素受体并由此抑制胰高血糖素与其结合的治疗性单克隆抗体，从而提供对糖尿病的有效治疗，优选对II型糖尿病和相关疾病的有效治疗。此外，为了允许抗体的临床前药物开发，显然希望提供可结合人、大鼠和小鼠形式胰高血糖素受体的单克隆抗体，从而允许要进行的必须的临床前安全性和疗效研究。
发明内容
本发明涉及新型单克隆抗体或其Fab片段，其能够以高亲和力特异性结合人、大鼠和小鼠来源的天然胰高血糖素受体。此外，本发明人提供了不但结合多种来源胰高血糖素受体的单克隆抗体或其Fab片段，而且第一次提供了在降低血清葡萄糖方面显示体内效力的结合胰高血糖素受体的单克隆抗体。
在第一方面中，本发明涉及Fab片段或包含该Fab片段的人源化单克隆抗体，其中该Fab片段能够结合人、大鼠和小鼠胰高血糖素受体，并以低于50nM的Ki抑制胰高血糖素与各个受体的结合。
在另一个出人意料的发现中，本发明人第一次提供了能够特异性结合胰高血糖素受体的抗体或其Fab片段，其能够显著增加体内GLP-1血清浓度。本领域中已知提高的GLP-1血清水平增强β-细胞功能，降低胰高血糖素分泌并延迟胃排空，被认为高度有利于II型糖尿病和相关病症的治疗。
在第二方面中，本发明涉及包含有效量的本发明Fab片段或人源化单克隆抗体，以及可药用赋形剂的药物组合物。
在第三方面中，本发明提供了治疗I型或II型糖尿病以及人体中实现重量减轻的方法，其中该方法包括向有此需要的患者施用有效量的本发明Fab片段或人源化单克隆抗体。
本发明的第四个方面包括用作药物的本发明Fab片段或人源化单克隆抗体。
本发明的第五方面涉及本发明Fab片段或人源化单克隆抗体在制备用于治疗或预防I型或II型糖尿病，或在人体中实现重量减轻的药物中的用途。
发明详述
本发明涉及Fab片段或包含该Fab片段的人源化单克隆抗体，其中该Fab片段能够结合人、大鼠和小鼠胰高血糖素受体，并以低于50nM的Ki抑制胰高血糖素与各个受体的结合。
本发明还提供了除了针对人、大鼠和小鼠来源的胰高血糖素受体之外还能够以高亲和力结合食蟹猴(cynomologous monkey)胰高血糖素受体的单克隆抗体。优选地，该Fab片段或包含该Fab片段人源化单克隆抗体因此还以低于50nM的Ki抑制胰高血糖素与食蟹猴胰高血糖素受体结合。优选地，Fab片段或包含该Fab片段的人源化单克隆抗体具有低于30nM的对每种提及(named)的胰高血糖素受体的Ki，更优选低于20nM，更优选10nM。更优选地，该Fab片段具有低于20nM的对大鼠、小鼠和食蟹猴受体的体外Ki，以及低于5nM的对人受体的体外Ki。更优选地，该Fab片段的Ki，尤其针对人胰高血糖素受体的，为0.1nM至15nM，最优选1至10nM。
本发明的Fab片段或包含该Fab片段人源化单克隆抗体优选具有至少100nM的对人和大鼠胰高血糖素受体的功能性结合亲和力(Kb)。更优选的Fab片段或包含该Fab片段的人源化单克隆抗体具有至少50nM的，更优选至少10nM的对这些受体的功能性结合亲和力。在最优秀的实施方案中，该Fab片段或包含该Fab片段的人源化单克隆抗体具有1至10nM的对人和大鼠胰高血糖素受体的功能性结合亲和力。
在一个特别出人意料的发现中，本申请人注意到体内接触具有本发明该结合性能的该Fab片段或包含该Fab片段的人源化单克隆抗体之后，血清GLP-1以很快的速率增加，血清血糖(serum blood glucose)以很快的速率降低。为了使这一有利效果最大化，优选该Fab片段或包含该Fab片段的人源化单克隆抗体不显著结合GLP受体，即Ki大于5000nM。
序列说明：
SEQ ID NO 1至22表示表1的轻链和重链CDR：
SEQ ID NO 23至30表示本文所述的优选人构架区域：
SEQ ID NO 31和32是人GluR的氨基酸和cDNA序列：
SEQ ID NO 33和34是大鼠GluR的氨基酸和cDNA序列：
SEQ ID NO 35和36是小鼠GluR的氨基酸和cDNA序列：
SEQ ID NO 37和38是食蟹猴(cyno)GluR的氨基酸和cDNA序列：
SEQ ID NO 39和40是实施例1(Ab1)的可变区氨基酸序列
SEQ ID NO 41和42是实施例2(Ab2)的可变区氨基酸序列
SEQ ID NO 43和44是实施例3(Ab3)的可变区氨基酸序列
SEQ ID NO 45和46是实施例4(Ab4)的可变区氨基酸序列
SEQ ID NO 45和47是实施例5(Ab5)的可变区氨基酸序列
SEQ ID NO 45和48是实施例6(Ab6)的可变区氨基酸序列
SEQ ID NO 45和49是实施例7(Ab7)的可变区氨基酸序列
SEQ ID NO：50表示优选的K轻链IgG4恒定区。
SEQ ID NO：51表示优选的重链CH1恒定结构域。
SEQ ID NO：52表示优选的经修饰人IgG4Fc区。
SEQ ID NO 53至55表示优选的轻链CDR。
SEQ ID NO 56至68表示优选的重链CDR。
SEQ ID NO 59和60是实施例1(Ab1)的轻链和重链蛋白质序列。
SEQ ID NO 61和62是实施例2(Ab2)的轻链和重链蛋白质序列。
SEQ ID NO 63和64是实施例3(Ab3)的轻链和重链蛋白质序列。
SEQ ID NO 65和66是实施例4(Ab4)的轻链和重链蛋白质序列。
SEQ ID NO 65和67是实施例5(Ab5)的轻链和重链蛋白质序列。
SEQ ID NO 65和68是实施例6(Ab6)的轻链和重链蛋白质序列。
SEQ ID NO 65和69是实施例7(Ab7)的轻链和重链蛋白质序列。
SEQ ID NO 70和71是实施例1(Ab1)的轻链和重链DNA序列。
SEQ ID NO 72和73是实施例2(Ab2)的轻链和重链DNA序列。
SEQ ID NO 74和75是实施例3(Ab3)的轻链和重链DNA序列。
SEQ ID NO 76和77是实施例4(Ab4)的轻链和重链DNA序列。
SEQ ID NO 76和78是实施例5(Ab5)的轻链和重链DNA序列。
SEQ ID NO 76和79是实施例6(Ab6)的轻链和重链DNA序列。
SEQ ID NO 76和80是实施例7(Ab7)的轻链和重链DNA序列。
定义：
在本文中也称为“GluR”的“胰高血糖素受体”属于G蛋白偶联受体2类家族，其由长氨基端细胞外结构域、7个跨膜部分和细胞内C端结构域组成。胰高血糖素受体在肝细胞表面上显著表达，在那里它们结合胰高血糖素并将由此提供的信号转导进细胞内。本领域中已经分离并公开了编码大鼠和人来源的胰高血糖素受体的DNA序列(EP0658200B1)。也分离并测序了小鼠和食蟹猴同源物(Burcelin等人，Gene 164(1995)305-310)；McNally等人，Peptides 25(2004)1171-1178)。
本文中所使用的有关本发明抗体或其Fab片段活性的术语“抑制”表示显著拮抗胰高血糖素受体生物学活性的能力。此能力由本文所述的[125I]胰高血糖素结合测定所计算的Ki值反应。
本文所用的针对本发明单克隆抗体的术语“人源化”表示具有至少人构架和恒定区(CL、CH结构域(例如CH1、CH2、CH3)和铰链)以及来源于胰高血糖素受体结合抗体的CDR的抗体。人构架包含对应于人种系序列以及具有体细胞突变的序列的构架。人构架和恒定区可以完全是人的，或者可与天然序列相差一个或多个氨基酸取代、末端和中间添加和缺失，等等。CDR可来源于一个或多个在任何抗体构架的背景中结合本申请中胰高血糖素特异性受体的CDR。例如，本发明的人源化抗体的CDR可来源于在小鼠抗体构架背景中结合胰高血糖素受体的CDR，然后经改造结合在人构架背景中结合胰高血糖素受体。
术语“单克隆抗体”表示来源于单拷贝或克隆的抗体，包括例如任何真核、原核或噬菌体克隆，并且不表示其产生的方法。优选地，本发明单克隆抗体以纯的或基本上纯的群体存在。
本文所用的针对本发明抗体的术语“体内效力”表示抗体在人或动物模型中赋予积极生物学效应的能力。优选地，体内效力表示，与对照应答相比，响应于本发明的抗体而对于显示血糖升高的动物使葡萄糖正常化的作用。患糖尿病的Zucker糖尿病肥胖大鼠(ZDF)模型(Horm Metab Res.2005年2月；37(2)：79-83)可适用于评估体内效力，其中体内效力优选表示动物暴露于≤30mg/kg剂量的本发明人源化抗体后100％血糖正常化。更优选地，体内效力表示动物暴露于≤15mg/kg剂量的抗体后100％血糖正常化，优选≤10mg/kg剂量的抗体后100％血糖正常化，更优选0.1至5mg/kg剂量的抗体后100％血糖正常化。在最优选的实施方案中，体内效力用来表示在糖尿病ZDF大鼠模型中动物暴露于1至3mg/kg剂量的本发明人源化抗体后100％血糖正常化。
术语“葡萄糖正常化”表示ZDF大鼠模型中血浆葡萄糖值低于120mg/dL，优选110至120mg/dL的范围内。可根据Etgen等人，(Metabolism 2000；49(5)：684-688)测定血浆葡萄糖，或者根据D’Orazio等人(Clin.Chem.Lab.Med.2006；44(12)：1486-1490)由全血葡萄糖浓度转化计算得出。
本文使用的“Fab片段”表示在可变区内的抗体分子的部分，其含有轻链和重链CDR以及除了CL和CH1结构域之外的构架序列的氨基酸残基。
重链的3个CDR在本文中称为“CDRH1、CDRH2和CDRH3”，轻链的3个CDR称为“CDRL1、CDRL2和CDRL3”。每个结构域的氨基酸分配(assignment)根据公知规定(Kabat等人，Ann.NY Acad.Sci.190：382-93(1971)；Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242(1991))。抗原结合结构域或者抗原结合结构域的CDR可来源于其他非人物种，包括但不限于兔、小鼠、大鼠或仓鼠(hamster)。
本发明人鉴定了可联合用于制备抗体Fab片段的重链和轻链CDR序列，其表现出特别高的小鼠、大鼠、食蟹猴和人来源的胰高血糖素受体亲和力。FAb片段优选包含；
(i)轻链CDRL1：S X S S S V S Y X1 H SEQ ID NO：53
(ii)轻链CDRL2：T T S X2 L A H SEQ ID NO：54
(iii)轻链CDRL3：X3 X4 R S T X5 P P T SEQ ID NO：55
(iv)重链CDRH1：G D D I T S G Y X6 X7 SEQ ID NO：56
(v)重链CDRH2：Y I S Y S G S T X8Y X9P S L K S SEQ ID NO：57
(vi)重链CDRH3：P P X10 Y Y G F G P Y A X11 D Y SEQ ID NO：58
其中：
X＝Y或A X6＝W或H
X1＝M或I X7＝N、D或E
X2＝N或Y X8＝Y、Q、S或V
X3＝Q或L X9＝N、S或I
X4＝Q或W X10＝G或A
X5＝L或I X11＝M或L
最优选地，X为Y或A；X1为I；X2为Y；X3为Q或L；X4为Q或W；X5为L或I；X6为W或H；X7为D或E；X8为Y、Q、S或V；X9为S；X10为G或A；X11为L。更优选地，X为A；X1为I；X2为Y；X3为Q；X4为Q；X5为L；X6为H；X7为D或E；X8为Y、Q或S；X9为S；X10为G或A；X11为L。
优选地，本发明的Fab片段或包含该Fab片段的人源化单克隆抗体包含下列CDR序列：
CDRL1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
S A S S S V S Y I H
CDRL2 1 2 3 4 5 6 7
T T S Y L A H
CDRL3 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Q Q R S T L P P T
CDRH1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
G D D I T S G Y H D
CDRH2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Y I S Y S G S T Y Y S P S L K S
CDRH3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
P P G Y Y G F G P Y A L D Y
其中该Fab片段具有一个、两个或三个选自下列的氨基酸取代：
CDRL1：A2Y、I9M；
CDRL2：Y4N；
CDRL3：Q1L、Q2W、L6I；
CDRH1：H9W、D10E、D10N；
CDRH2：Y9Q、Y9S、Y9V、S11N、S11I；
CDRH3：G3A、L12M。
更优选地，该Fab片段包含一个、两个或三个氨基酸取代，其选自：CDRH1：D10E；CDRH2：Y9Q、Y9S；CDRH3：G3A。
本发明的Fab片段或包含该Fab片段的人源化单克隆抗体优选包含选自下列的CDR：
(i)具有SEQ ID NO 2的CDRL1；SEQ ID NO：4的CDRL2；SEQ IDNO：7的CDRL3的轻链；和具有SEQ ID NO：11的CDRH1；SEQ ID NO：15的CDRH2；SEQ ID NO：21的CDRH3的重链；
(ii)具有SEQ ID NO 1的CDRL1；SEQ ID NO：4的CDRL2；SEQ IDNO：6的CDRL3的轻链；和具有SEQ ID NO：10的CDRH1；SEQ ID NO：16的CDRH2；SEQ ID NO：20的CDRH3的重链；
(iii)具有SEQ ID NO：3的CDRL1；SEQ ID NO：5的CDRL2；SEQID NO：8的CDRL3的轻链；和具有SEQ ID NO：11的CDRH1；SEQ IDNO：15的CDRH2；SEQ ID NO：21的CDRH3的重链；
(iv)具有SEQ ID NO 3的CDRL1；SEQ ID NO：5的CDRL2；SEQ IDNO：6的CDRL3的轻链；和具有SEQ ID NO：12的CDRH1；SEQ ID NO：15的CDRH2；SEQ ID NO：21的CDRH3的重链；
(v)具有SEQ ID NO 3的CDRL1；SEQ ID NO：5的CDRL2；SEQ IDNO：6的CDRL3的轻链；和具有SEQ ID NO：12的CDRH1；SEQ ID NO：17的CDRH2；SEQ ID NO：21的CDRH3的重链；
(vi)具有SEQ ID NO 3的CDRL1；SEQ ID NO：5的CDRL2；SEQ IDNO：6的CDRL3的轻链；和具有SEQ ID NO：12的CDRH1；SEQ ID NO：15的CDRH2；SEQ ID NO：22的CDRH3的重链；以及
(vii)具有SEQ ID NO 3的CDRL1；SEQ ID NO：5的CDRL2；SEQ IDNO：6的CDRL3的轻链；和具有SEQ ID NO：13的CDRH1；SEQ ID NO：18的CDRH2；SEQ ID NO：22的CDRH3的重链。
尤其希望，本发明的抗体在低血浆浓度下显示体内效力。在ZDF大鼠模型中，应在30mg/kg剂量下，优选低于15mg/kg，更优选低于5mg/kg，再优选0.1至5mg/kg范围内，观察到体内效力。最优选地，本发明抗体以约1至3mg/kg的剂量在ZDF大鼠模型中实现100％葡萄糖正常化。已经发现，尤其优选的本发明抗体能够在3mg/kg的低剂量下在ZDF大鼠模型体内显示100％葡萄糖正常化。因此本发明优选包含Fab片段或含有该Fab片段的人源化单克隆抗体，其中该Fab片段包含：
(i)具有SEQ ID NO 3的CDRL1；SEQ ID NO：5的CDRL2；SEQ IDNO：6的CDRL3的轻链；和具有SEQ ID NO：12的CDRH1；SEQ ID NO：15的CDRH2；SEQ ID NO：21的CDRH3的重链；
(ii)具有SEQ ID NO 3的CDRL1；SEQ ID NO：5的CDRL2；SEQ IDNO：6的CDRL3的轻链；和具有SEQ ID NO：12的CDRH1；SEQ ID NO：17的CDRH2；SEQ ID NO：21的CDRH3的重链；
(iii)具有SEQ ID NO：3的CDRL1；SEQ ID NO：5的CDRL2；SEQID NO：6的CDRL3的轻链；和具有SEQ ID NO：12的CDRH1；SEQ IDNO：15的CDRH2；SEQ ID NO：22的CDRH3的重链；或者
(iv)具有SEQ ID NO：3的CDRL1；SEQ ID NO：5的CDRL2；SEQID NO：6的CDRL3的轻链；和具有SEQ ID NO：13的CDRH1；SEQ IDNO：18的CDRH2；SEQ ID NO：22的CDRH3的重链。
在另一个优选实施方案中，本发明涉及Fab片段或包含该Fab片段的人源化单克隆抗体，其中该Fab片段包含具有SEQ ID NO 3的CDRL1；SEQ ID NO：5的CDRL2；SEQ ID NO：6的CDRL3的轻链；以及具有SEQID NO：12的CDRH1；SEQ ID NO：17的CDRH2；SEQ ID NO：21的CDRH3的重链。已经发现，包含此实施方案的Fab片段的抗体与该类型中其他类似抗体相比，在长时期内保持体内效力中具有特别有利的性能。
本发明的Fab片段或包含该Fab片段的人源化单克隆抗体优选包含人来源的轻链和重链可变构架区。此外，多种不同的人构架序列可单独或组合用于本发明人源化免疫球蛋白的基础。优选地，本发明Fab片段或人源化单克隆抗体的构架区是人来源的或者基本上人来源的(至少95％、97％或99％人来源)。人来源构架区的序列可经由其网址http://imgt.cines.fr/textes/IMGTindex/FR.html获得自ImMunoGenetics(IMGT)或者得自Marie-Paule Lefranc，Gerard Lefranc，Academic Press2001，ISBN 012441351的The immunoglobulin Factsbook。例如种系轻链构架区可选自：Al1、A17、A18、A19、A20、A27、A30、LI、L1I、L12、L2、L5、L15L6、L8、O12、O2和O8，种系重链构架区可选自：VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-20、VH3-72、VHI-46、VH3-9、VH3-66、VH3-74、VH4-31、VH I-18、VH I-69、VI-13-7、VH3-11、VH3-15、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-48、VH4-39、VH4-59和VH5-5I。
本文公开的特异性抗体可用作模板或亲本抗体以制备其他本发明抗体。在一种方法中，亲本抗体CDR嫁接于与该亲本抗体构架具有高序列同一性的人构架。新构架的序列与亲本抗体对应构架的同一性一般为至少80％、至少85％或至少90％。此嫁接物可导致与亲本抗体相比结合亲和力降低。如果是这种情况，则根据Queen等人，[Queen，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，2869(1991)]公开的特定标准，在某些位置将该构架回复突变为亲本构架。可使用的其他方法包括，例如Jones等人，Nature，321：522(1986)；Riechmann等人，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science，239：1534(1988)。
最优选地，本发明的Fab片段或包含该Fab片段的人源化单克隆抗体包含下列轻链构架(FR)序列：FR1SEQ ID NO：23；FR2 SEQ ID NO：24；FR3SEQ ID NO：25；FR4SEQ ID NO：26；以及重链可变构架序列：FR5SEQ ID NO：27；FR6SEQ ID NO：28；FR7SEQ ID NO：29；FR8SEQ IDNO：30；其中轻链可变序列排列为FR1-CDRL1-FR2-CDRL2-FR3-CDRL3-FR4以及重链可变序列排列为FR5-CDRH1-FR6-CDRH2-FR7-CDRH3-FR8。
本申请人出人意料地发现，在通过使用体外竞争性胰高血糖素结合测定预测胰高血糖素受体拮抗性抗体体内效力时，Fab片段的亲和力的确与体内效力正相关。相反地，完全抗体与胰高血糖素受体的结合亲合力(Ki)不一定是体内效力的有效预测物。因此，制备具有本文所追求的有利性能的单克隆抗体的方法优选地包括选择在使用异源表达的胰高血糖素受体基因的体外竞争性胰高血糖素结合测定中，以低于50nM的Ki与每个胰高血糖素受体结合的Fab片段。更优选地，该方法包括选择具有低于30nM的对每种胰高血糖素受体的体外Ki的FAb片段，更优选低于20nM，更优选10nM。更优选地，通过低于20nM的针对大鼠、小鼠和食蟹猴受体的体外Ki以及低于5nM的针对人受体体外Ki选择该Fab片段。更优选地，所选Fab片段的Ki，尤其针对人胰高血糖素受体的，为0.1nM至15nM，最优选1至10nM。然后，可将此方法鉴定的Fab片段适当地表达为完整抗体，用以通过本领域中通常已知方法的治疗性用途。
应了解，应用本发明的教导，本领域技术人员可使用常规方法，例如位点定向诱变，以取代本文公开的特定CDR和构架序列中的氨基酸，在这种情况下产生来源于本文提供的序列的其他可变区氨基酸序列。可将最多全部20种可选天然氨基酸引入特定取代位点。然后，本文上述定义的体外选择方法可适当地用于筛选这些附加可变区氨基酸序列，以得到具有所要求保护的交叉反应性的Fab片段和指示体内效力的本申请人已发现的体外Ki。以这种方法，鉴定适于根据本发明制备人源化抗体的其他Fab片段。优选地，在本文公开的一个或每个骨架序列中，构架中的氨基酸取代限于一个、两个或三个位置。优选地，在一个或每个CDR中，CDR中的氨基酸取代限于一至三个位置，更优选进行一个或每个CDR中一个或两个氨基酸位置的取代。另外优选地，在重链可变区的CDR中的一个或两个氨基酸位置进行氨基酸取代。最优选地，在CDRH2中的一个或两个氨基酸位置进行氨基酸取代。
使用本文所示抗体作为亲本抗体，将CDR与构架取代相组合以制备本发明的可选抗体的合适方法由Wu等人，J.Mol.Biol.，294：151-162提供。
如本文所使用的，免疫球蛋白的Fc部分指两个重链的抗体恒定区，其通过非共价相互作用和二硫键相连。Fc部分可包含绞链区，并通过CH2和CH3结构域扩展到抗体的C端。Fc部分还可包含一个或多个糖基化位点。本发明的单克隆抗体可具有选自任意免疫球蛋白类型IgA、IgD、IgG、IgM和IgE的重链恒定区。优选地，本发明抗体含有来源于人IgG4Fc区域的Fc部分，因为与其他IgG亚类相比其结合和补体因子的能力降低。更优选地，本发明抗体的IgG4Fc区域含有进一步降低效应子功能的取代[Issacs等人，(1996)Clin.Exp.Immunol.106：427-433]。这些取代可选自233位残基的脯氨酸取代谷氨酸、234位残基的丙氨酸或缬氨酸取代苯丙氨酸、以及235位残基的丙氨酸或谷氨酸取代亮氨酸(EU编号，Kabat，E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版U.S.Dept.of Health and Human Services，Bethesda，MD，NIH Publication no.91-3242)。这些残基对应于SEQ ID NO：52的15、16和17位以及SEQ IDNO：67的235、236和237位。另外，通过在297位残基(EU编号)用Asn取代Ala去除IgG4Fc区域中的N连接糖基化位点，其对应于SEQ IDNO：52的79位，这是确保在人源化抗体背景中去除残余效应子活性的另一个方法。
另外，用于本发明人源化单克隆抗体的IgG4Fc部分优选含有稳定重链二聚体形成并防止形成半-IgG4Fc链的取代。此构建物由下列组成：由脯氨酸取代的228位的丝氨酸(EU编号)(SEQ ID NO：52中的第10位氨基酸残基)。本文该抗体的IgG4衍生的Fc部分中还可缺失天然分子中存在的C端赖氨酸残基(SEQ ID NO：52的229位；缺失的赖氨酸称为des-K)。最优选的IgG4Fc部分由SEQ ID NO：67的221位至448位氨基酸提供。
本发明还涉及编码本发明抗体的分离核酸序列；包含该核酸的一个或多个载体，任选有效连接转化了该载体的宿主细胞识别的控制序列；包含该载体的宿主细胞；产生本发明抗体或Fab片段的方法，其包括培养宿主细胞使得该核酸表达，以及任选地从宿主细胞培养基回收抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含本发明Fab片段或人源化单克隆抗体的药物组合物。本发明的药物组合物还可包含可药用载体。在该药物组合物中，本发明的Fab片段或人源化单克隆抗体是活性成分。优选地，该药物组合物包含纯的或基本上纯的本发明Fab片段或人源化单克隆抗体的群体。用于治疗用途的组合物是无菌的，可以冻干，任选地与合适稀释剂一起提供。
本发明的另一个实施方案包括宿主细胞或细胞培养物，其为下列的接受者(receptor)：本发明任何分离多核苷酸或者包含编码本发明HCVR、LCVR、单克隆抗体或Fab片段的序列的任何一个或多个重组载体。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，由于天然、偶然或有意突变和/或变化，该后代不一定是与初始母细胞完全相同的(形态或总DNA补体)。宿主细胞包括用一个或多个重组载体或表达本发明单克隆抗体或其轻链或重链的多核苷酸体内或体外转化、转导或感染的细胞。包含本发明重组载体的宿主细胞(有或没有稳定引入宿主染色体)也可称为“重组宿主细胞”。用于本发明的优选宿主细胞是CHO细胞、NS0细胞、HeLa、SP2/0细胞或COS细胞。用于本发明的其他宿主细胞包括植物细胞、酵母细胞、其他哺乳动物细胞和原核细胞。
本发明涵盖产品，其包括包装材料和在该包装材料内包含的本发明Fab片段或人源化单克隆抗体，其中该包装材料包括包装说明书，其显示该Fab片段或人源化单克隆抗体在患者体内中和GluR或降低GluR活性水平。
生物学测定：
胰高血糖素受体(GlucR)膜制备
从表达克隆人、小鼠、食蟹猴或大鼠胰高血糖素受体的293HEK细胞制备用于结合研究的膜制备物。每个克隆细胞系首先以悬浮培养物形式培养，冷冻的细胞沉淀重悬于4℃下的膜制备物缓冲液，其由25mM Tris，pH7.5，1mM MgCl2，CompleteR无EDTA蛋白酶抑制剂片(Roche AppliedScience)和20U/ml DNase I(Sigma Chemical Company)组成。用电动特弗隆玻璃Potter-Elvehjem匀浆器，使用25个冲程(stroke)对细胞进行匀浆，然后以1800x g在4℃离心15分钟。收集上清，将沉淀重悬于膜制备缓冲液中，再次匀浆和离心。将第二次上清与第一次上清合并，以1800x g再次离心15分钟至澄清。将澄清的上清转移到高速离心管，以25000x g在4℃下离心30分钟。膜沉淀(P2)重悬于膜制备缓冲液(无DNA酶)，将其等分，在干冰上速冻并保存于-80℃待用。
使用闪烁亲近测定法(Scintillation Proximity Assay，SPA)的[
125
I]胰
高血糖素结合
调整竞争性受体/配体结合实验以适于闪烁亲近测定法(SPA)形式。在透明底的不透明96孔微板进行孵育。将化合物在结合缓冲液中连续稀释3倍，该缓冲液由下列组成：25mM Hepes，pH 7.4，2.5mM CaCl2，1mMMgCl2，0.1％无脂肪酸BSA，0.003％吐温-20和CompleteR无EDTA蛋白酶抑制剂片。在来自每种受体制备物的结合缓冲液中稀释P2膜(如上制备)，然后添加至稀释的化合物，之后添加0.15mg的麦胚凝集素(WGA)SPA珠(GE Healthcare)，其之前用1％无脂肪酸BSA封闭，以及0.15nM[125I]-胰高血糖素(Perkin-Elmer)。用粘合密封带密封平板，颠倒混合，在室温下孵育12小时。在PE Life and Analytical Sciences Trilux Microbeta平板闪烁计数器上对与受体结合的放射性(非常接近于WGA SPA珠)进行定量，表示为每分钟计数(CPM)。测定不加入化合物情况下的总结合，通过加入1uM胰高血糖素(Lilly Research Labs)测定非特异性结合。1uM终浓度的无标记胰高血糖素能够完全抑制[125I]-胰高血糖素结合至背景水平。
[
125
I]胰高血糖素结合数据分析
通过用各个CPM值减去非特异性结合并除以总结合信号将化合物浓度曲线的原始CPM数据转换为百分比抑制，也针对非特异性结合进行修正。使用四参数(曲线最大值、曲线最小值、IC50、峰斜率)非线性回归规则(XLFit版本3.0：Activity Base，IDBS)分析数据。在每个接受物种的测定中，根据方程[Ki＝IC50/(1+D/Kd)]从绝对IC50值计算由竞争剂抑制放射性配体结合确定的平衡解离常数Ki，其中D等于实验中所用放射性配体的浓度，Kd等于[125I]胰高血糖素平衡结合亲和常数。
胰高血糖素刺激cAMP功能性拮抗剂测定
使用相同克隆大鼠、小鼠、食蟹猴和人胰高血糖素接受者-293HEK细胞系，由亚最大剂量胰高血糖素对细胞内cAMP增加的剂量依赖性抑制确定功能性拮抗剂活性。用来自Perkin Elmer(6760625R)的扩增荧光接近匀浆测定(α筛选)(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay，Alpha Screen)进行细胞内cAMP水平的定量。简言之，细胞内产生的cAMP与生物素化cAMP-链霉亲和素涂布的供体珠竞争与涂布的抗cAMP抗体受体珠的结合。随着细胞内cAMP水平的增加，破坏受体珠-生物素化cAMP-供体珠复合物的出现。在含有Mg+2和Ca+2的HBSS中的10mMHepes，pH 7.4和0.25mM IBMX中进行功能性测定。以2500个细胞/孔和来自试剂盒的1单位/孔生物素化cAMP以20ul总体积悬浮克隆胰高血糖素接受者-293HEK细胞。在室温下将细胞与20ul 3倍连续稀释的化合物或用作标准曲线的3倍连续稀释的cAMP一起预孵育。通过添加20ul300pM胰高血糖素(3X)开始反应，此剂量足以产生90％的最大细胞内cAMP。室温下避光60分钟后，通过加入30ul裂解缓冲液停止反应，该缓冲液由含有每孔各1单位试剂盒供体和受体珠的10mM Hepes，pH7.4中的1％IGEPAL CA630(Sigma)和0.1％无脂肪酸BSA(Gibco)制成。将平板包在铝箔中，以使得供体和受体珠避光，在Titertek摇床上以中速混合30秒。在室温下孵育过夜后，在Packard FusionTM-α设备上读取平板。
功能性cAMP活性的数据分析
根据cAMP标准曲线将α筛选单位转换为每孔产生的皮摩尔cAMP。将化合物存在时产生的皮摩尔cAMP转换为单独使用亚最大剂量胰高血糖素的最大应答％。在每个实验中，确定产生皮摩尔cAMP的50％应答所需的胰高血糖素浓度。此EC50浓度用于将批次间结果归一化为Kb，其中Kb＝(EC50化合物)/[1+(所用的pM胰高血糖素/以pM计的胰高血糖素剂量应答的EC50)]。使用四参数(曲线最大值、曲线最小值、IC50、峰斜率)非线性回归规则(XLFit版本3.0：Activity Base，IDBS)分析数据。
实施例：
如本领域已知的制备并纯化抗体实例Ab-1、Ab-2、Ab-3、Ab-4、Ab-5、Ab-6和Ab-7。用使用最佳预定轻链/重链载体比分泌抗体的表达系统或者编码轻链(在SEQ ID NO：70、72、74、76中显示)和重链(在SEQ ID NO：71、73、75、77、78、79、80中显示)的单一载体系统瞬时或稳定转染合适宿主细胞，例如HEK 293 EBNA或CHO。使用许多常用方法中的任意方法纯化抗体分泌入其中的澄清培养基。例如，可便利地将培养基应用到已用适合缓冲液例如磷酸缓冲盐水(pH7.4)平衡的A蛋白或G蛋白Sepharose FF柱。清洗该柱，以除去非特异性结合成分。洗脱所结合的抗体，例如，通过pH梯度(例如0.1M磷酸钠缓冲液，pH 6.8至0.1M柠檬酸钠缓冲液pH 2.5)。检测抗体级分，例如通过SDS-PAGE，然后汇集。根据预定用途，任选地进行进一步纯化。可使用常见方法浓缩和/或除菌过滤抗体。可通过常见方法有效除去可溶聚集体和多聚体，所述方法包括大小排阻层析、疏水性相互作用层析、离子交换层析或羟磷灰石层析。在这些层析步骤之后，抗体的纯度大于99％。可立即将产物冷冻于70℃，或者冻干。
在大肠杆菌中实现Fab表达，其中Fab分子分泌进周质空间。通过渗透休克破坏细胞壁，在IMAC柱上纯化含有His标签的Fab。
表1给出了本发明抗体实例中所用的CDR组合。完整抗体轻链将下述间隔三个轻链CDR的轻链构架序列和轻链恒定区(SEQ ID NO：53)相组合；构架1(SEQ ID NO：23)-CDRL1-构架2(SEQ ID NO：24)-CDRL2-构架3(SEQ ID NO：25)-CDRL3-构架4(SEQ ID NO：26)。重链构架序列间隔三个重链CDR，构架5(SEQ ID NO：27)-CDRH1-构架6(SEQ ID NO：28)-CDRH2-构架7(SEQ ID NO：29)-CDRH3-构架8(SEQ ID NO：30)，随后是重链CH1恒定区(SEQ ID NO：51)，之后是Ab的Fc结构域，在Fab片段中不含(SEQ ID NO：52，其中X10＝P；X15＝E；X16＝A；X17＝A；X79＝N；X229＝无)。
表1：
在上述胰高血糖素受体结合测定中，实例1至7的抗体及其Fab片段全部以低于50nM的Ki抑制胰高血糖素与人、小鼠、食蟹猴和大鼠胰高血糖素受体的结合。
实例4(Ab4)抗体的体外活性
表2、功能性cAMP拮抗
此测定证明，在纳摩尔浓度下，Ab4与GluR的结合可阻断大鼠或人胰高血糖素受体细胞系的下游活性，并降低该细胞的cAMP产生。
表3、实例4的完整抗体及各个Fab的体外Ki(nM)
此测定证明，在体外胰高血糖素竞争性结合测定中，Ab4以高亲和力(Ki)结合人、小鼠、大鼠、食蟹猴来源的胰高血糖素受体，以低亲和力结合人GLP-1受体。
实例4抗体(Ab4)的体内活性
用单次皮下注射实例4的抗体(即Ab4)或人IgG(hIgG4)对照对约8周龄，重量约400g的ZDF大鼠给药。每个处理组由6个动物组成。在给药前以及单次皮下给药3或15mg/kg的Ab4或15mg/kg hIgG对照后的13天的每天取血样用以葡萄糖测量。在给药前以及皮下给药3或15mg/kg的Ab4或15mg/kg hIgG对照后的第2、4、6和8天取血样用以GLP-1分析。
表4、在向ZDF大鼠单次皮下给药3或15mg/kg的Ab4或15mg/kg阴性对照后的血糖水平。
每组6只大鼠，一个值(＊)除外，其中一个动物测得AQL，因此n＝5。
表5、在向ZDF大鼠单次皮下给药3或15mg/kg的Ab4或15mg/kg阴性对照后的血浆GLP-1水平。
仅从具有可定量GLP-1水平的大鼠测定平均值和标准差(sd)，n表示具有可定量GLP-1水平的每组的动物数目。如果没有动物具有可定量GLP-1水平，则结果列为＜6pM。N.D.表示该值未测得。
Claims (18)
1.Fab片段或包含所述Fab片段的人源化单克隆抗体，其中所述Fab片段能够结合人、大鼠和小鼠胰高血糖素受体，并以低于50nM的Ki抑制胰高血糖素与各个受体的结合。
2.根据权利要求1的Fab片段或包含所述Fab片段的人源化单克隆抗体，其中所述Fab片段以低于50nM的Ki抑制胰高血糖素与食蟹猴胰高血糖素受体结合。
3.根据权利要求1或2的Fab片段或包含所述Fab片段的人源化单克隆抗体，其中所述Fab片段包含：
(i)轻链CDRL1：S X S S S V S Y X1 H SEQ ID NO：53
(ii)轻链CDRL2：T T S X2 L A H SEQ ID NO：54
(iii)轻链CDRL3：X3 X4 R S T X5 P P T SEQ ID NO：55
(iv)重链CDRH1：G D D I T S G Y X6X7 SEQ ID NO：56
(v)重链CDRH2：Y I S Y S G S T X8Y X9P S L K S SEQ ID NO：57
(vi)重链CDRH3：P P X10 Y Y G F G P Y A X11 D Y SEQ ID NO：58
其中：
X＝Y或A X6＝W或H
X1＝M或I X7＝N、D或E
X2＝N或Y X8＝Y、Q、S或V
X3＝Q或L X9＝N、S或I
X4＝Q或W X10＝G或A
X5＝L或I X11＝M或L。
4.根据权利要求3的Fab片段或包含所述Fab片段的人源化单克隆抗体，其中
X＝A X6＝H
X1＝I X7＝D或E
X2＝Y X8＝Y、Q或S
X3＝Q X9＝S
X4＝Q X10＝G或A
X5＝L X11＝L。
5.根据权利要求1或2的Fab片段或包含所述Fab片段的人源化单克隆抗体，其中所述Fab片段包含下列CDR序列：
CDRL1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
S A S S S V S Y I H
CDRL2 1 2 3 4 5 6 7
T T S Y L A H
CDRL3 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Q Q R S T L P P T
CDRH1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
G D D I T S G Y H D
CDRH2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Y I S Y S G S T Y Y S P S L K S
CDRH3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
P P G Y Y G F G P Y A L D Y
其中所述Fab片段具有选自下列的一个、两个或三个氨基酸取代：
CDRL1：A2Y、I9M；
CDRL2：Y4N；
CDRL3：Q1L、Q2W、L6I；
CDRH1：H9W、D10E、D10N；
CDRH2：Y9Q、Y9S、Y9V、S11N、S11I；
CDRH3：G3A、L12M。
6.根据权利要求1或2的Fab片段或包含所述Fab片段的人源化单克隆抗体，其中所述Fab片段包含
(i)轻链CDRL1：S A S S S V S Y I H (SEQ ID NO：3)
(ii)轻链CDRL2：T T S Y L A H (SEQ ID NO：5)
(iii)轻链CDRL3：Q Q R S T L P P T (SEQ ID NO：6)
(iv)重链CDRH1：G D D I T S G Y H D (SEQ ID NO：12)
(v)重链CDRH2：YISYSGSTYYSPSLKS (SEQ ID NO：15)
(vi)重链CDRH3：PPGYYGFGPYALDY (SEQ ID NO：21)。
7.根据权利要求1或2的Fab片段或包含所述Fab片段的人源化单克隆抗体，其中所述Fab片段包含：
(i)轻链CDRL1：S A S S S V S Y I H (SEQ ID NO：3)
(ii)轻链CDRL2：T T S Y L A H (SEQ ID NO：5)
(iii)轻链CDRL3：Q Q R S T L P P T (SEQ ID NO：6)
(iv)重链CDRH1：G D D I T S G Y H D (SEQ ID NO：12)
(v)重链CDRH2：YISYSGSTQYSPSLKS (SEQ ID NO：17)
(vi)重链CDRH3：PPGYYGFGPYALDY (SEQ ID NO：21)。
8.根据权利要求1或2的Fab片段或包含所述Fab片段的人源化单克隆抗体，其中所述Fab片段包含：
(i)轻链CDRL1：S A S S S V S Y I H (SEQ ID NO：3)
(ii)轻链CDRL2：T T S Y L A H (SEQ ID NO：5)
(iii)轻链CDRL3：Q Q R S T L P P T (SEQ ID NO：6)
(iv)重链CDRH1：G D D I T S G Y H D (SEQ ID NO：12)
(v)重链CDRH2：YISYSGSTYYSPSLKS (SEQ ID NO：15)
(vi)重链CDRH3：PPAYYGFGPYALDY (SEQ ID NO：22)。
9.根据权利要求1或2的Fab片段或包含所述Fab片段的人源化单克隆抗体，其中所述Fab片段包含：
(i)轻链CDRL1：S A S S S V S Y I H (SEQ ID NO：3)
(ii)轻链CDRL2：T T S Y L A H (SEQ ID NO：5)
(iii)轻链CDRL3：Q Q R S T L P P T (SEQ ID NO：6)
(iv)重链CDRH1：G D D I T S G Y H E (SEQ ID NO：13)
(v)重链CDRH2：YISYSGSTSYSPSLKS (SEQ ID NO：18)
(vi)重链CDRH3：PPAYYGFGPYALDY (SEQ ID NO：22)。
10.根据权利要求1至9中任一项的Fab片段或包含所述Fab片段的人源化单克隆抗体，其中所述Fab片段包含轻链可变构架区：构架1SEQID NO：23；构架2SEQ ID NO：24；构架3SEQ ID NO：25；构架4SEQID NO：26；和重链可变构架区：构架5SEQ ID NO：27；构架6SEQ IDNO：28；构架7SEQ ID NO：29；构架8SEQ ID NO：30。
11.人源化单克隆抗体，其包含：
(i)SEQ ID NO：65的两条轻链和SEQ ID NO：66的两条重链；
(ii)SEQ ID NO：65的两条轻链和SEQ ID NO：67的两条重链；
(iii)SEQ ID NO：65的两条轻链和SEQ ID NO：68的两条重链；或
(iv)SEQ ID NO：65的两条轻链和SEQ ID NO：69的两条重链。
12.包含核酸序列的载体，所述核酸序列编码权利要求1至11中任一项的Fab片段或包含所述Fab片段的人源化单克隆抗体。
13.包含异源多核苷酸序列的宿主细胞，所述异源多核苷酸序列编码权利要求1至11中任一项的Fab片段或包含所述Fab片段的人源化单克隆抗体。
14.药物组合物，其包含有效量的根据权利要求1至11中任一项的Fab片段或包含所述Fab片段的人源化单克隆抗体，以及可药用赋形剂。
15.治疗I型或II型糖尿病或在人体中实现重量减轻的方法，其中所述方法包括向有此需要的人患者施用有效量的根据权利要求1至11中任一项的Fab片段或包含所述Fab片段的人源化单克隆抗体。
16.根据权利要求1至11中任一项的Fab片段或包含所述Fab片段的人源化单克隆抗体，其用作药物。
17.根据权利要求1至11中任一项的Fab片段或包含Fab片段的人源化单克隆抗体，其用于治疗I型或II型糖尿病或者实现在人体中减轻重量。
18.根据权利要求1至11中任一项的Fab片段或包含Fab片段的人源化单克隆抗体在制备用于治疗I型或II型糖尿病，或者实现在人体中减轻重量的药物的用途。
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