JP5438095B2 - グルカゴン受容体アンタゴニスト - Google Patents

グルカゴン受容体アンタゴニスト Download PDF

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Description

本発明は、ホルモングルカゴンの受容体に対する結合を阻害するグルカゴン受容体ポリペプチドアンタゴニストに関する。より具体的には、本発明は、グルカゴンの受容体に対する結合を阻害する高親和性グルカゴン受容体抗体またはそのＦａｂフラグメント、ならびに哺乳動物種におけるＩＩ型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）および関連する疾患の処置または予防におけるそれらの使用に関する。
グルカゴンは、低血糖値に応答して膵臓のα細胞によって産生される２９のアミノ酸ペプチドホルモンである。グルカゴンは、Ｇタンパク質シグナル伝達カスケードを誘発する、肝細胞表面上の膜結合性グルカゴン受容体に結合し、細胞内の環状ＡＭＰを活性化し、新規合成（糖新生）およびグリコーゲン分解（グリコゲノリシス）によってグルコースの放出を導く。
Ｕｎｓｏｎらは、ラット受容体の２つの細胞外部分に対応する合成ペプチドに対して産生されるポリクローナル抗体を開示している。開示されたアッセイにおいて、アミノ酸残基１２６〜１３７および２０６〜２１９に対して産生されたポリクローナル抗体は、ラット肝膜において受容体に対するグルカゴンの結合を阻害することが見出された（非特許文献１）。
Ｂｕｇｇｙらは、インビトロアッセイにおいて受容体のホルモン結合部位についてグルカゴンと競合するといわれているモノクローナル抗体の調製を開示している（非特許文献２）。この開示されたアッセイにおいて、ＣＩＶ３９５．７Ａと指定されている抗体は、ヒトおよびラットグルカゴン受容体を認識するが、マウスは認識しない。ヒトの治療処置についての抗体を開発するために、検証したラットおよび／またはマウス動物モデルにおいて、臨床前効果および安全性の研究を実施することが一般的に必要である。従って、治療抗体の薬物開発を非常に容易にさせ、それによって、グルカゴン受容体のラット、マウスおよびヒト形態に結合できる臨床前治療抗体候補を提供することが非常に望まれている。
Ｗｒｉｇｈｔらは、ｈＧＲ−２ Ｆ６と指定されたモノクローナル抗体およびそのＦａｂフラグメントのアミノ酸配列を開示している。この抗体は、ヒトグルカゴン受容体に対してマウスにおいて産生され、この受容体における競合的アンタゴニストとして開示されたアッセイにおいて記載されている（非特許文献３）。出願人は、ｈＧＲ−２Ｆ６が、低親和性のみでグルカゴン受容体のラットおよびマウス形態に結合することを見出しており、高用量でのインビボモデルの糖尿病のラットにおいてｈＧＲ−２Ｆ６についての治療効果は見出されていない。特に、この抗体は、いずれの統計的有意性でもラットモデルにおいて血清グルコースを減少させることができなかった（公開されていない）。
Ｕｎｓｏｎら，ＰＮＡＳ，１９９６年１月，第９３巻，ｐ．３１０−３１５ Ｂｕｇｇｙら，Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．，１９９６年，第２８巻，ｐ．２１５−２１９ Ｗｒｉｇｈｔら，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．，２０００年，Ｄ５６，ｐ．５７３−５８０
出願人は、グルカゴン受容体に高親和性で結合し、それによってその受容体に対するグルカゴンの結合を阻害する治療的モノクローナル抗体を提供すること、糖尿病、好ましくはＩＩ型糖尿病および関連疾患の有効な処置を提供することの必要性を認識した。さらに、抗体の臨床前薬物開発を可能にするために、必須の臨床前安全性および効果の研究を受けることができるグルカゴン受容体のヒト、ラットおよびマウス形態に結合できるモノクローナル抗体を提供することが明確に望まれる。
本発明は、ヒト、ラットおよびマウス由来の天然グルカゴン受容体に高親和性で特異的に結合することができる新規モノクローナル抗体またはそれらのＦａｂフラグメントに関する。さらに、本発明者らは、複数の由来源のグルカゴン受容体に結合するだけでなく、血清血液グルコースを減少させる能力においてインビボでの有効性を示すモノクローナル抗体に結合するグルカゴン受容体を初めて提供する、モノクローナル抗体またはそれらのＦａｂフラグメントを提供する。
第１の態様において、本発明は、Ｆａｂフラグメントまたは当該Ｆａｂフラグメントを備えるヒト化モノクローナル抗体に関し、ここで、上記Ｆａｂフラグメントは、ヒト、ラットおよびマウスのグルカゴン受容体に結合可能で、かつ、５０ｎＭ未満のＫｉで各受容体に結合するグルカゴンを阻害する。
更なる予期せぬ発見において、本発明者らは、ＧＬＰ−１のインビボでの血清濃度を顕著に増加させることができるグルカゴン受容体に特異的に結合可能な抗体またはそれらのＦａｂフラグメントを初めて提供する。ＧＬＰ−１の血清レベルの増加は、β細胞機能を増進し、グルカゴン分泌を減少させ、胃内容排出を遅延させることが当該技術分野において知られており、また、ＩＩ型糖尿病および関連状態の治療において高度に有利であることが認識されている。
第２の態様において、本発明は、本発明にかかる有効量のＦａｂフラグメントまたはヒト化モノクローナル抗体および薬学的に受容可能な賦形剤を備える薬学的組成物に関する。
第３の態様において、本発明は、ヒトにおけるＩ型糖尿病またはＩＩ型糖尿病を治療および体重減少を達成するための方法を提供し、ここで、上記方法は、本発明にかかる有効量のＦａｂフラグメントまたはヒト化モノクローナル抗体を、それらを必要とする患者に投与することを含む。
第４の態様において、本発明は、薬剤として使用される、本発明にかかるＦａｂフラグメントまたはヒト化モノクローナル抗体を備える。
第５の態様において、本発明は、ヒトにおけるＩ型糖尿病またはＩＩ型糖尿病の治療または予防あるいは体重減少の達成のための薬剤の製造における、本発明にかかるＦａｂフラグメントまたはヒト化モノクローナル抗体の使用に関する。
本発明は、Ｆａｂフラグメントまたは当該Ｆａｂフラグメントを備えるヒト化モノクローナル抗体に関し、ここで、上記Ｆａｂフラグメントは、ヒト、ラットおよびマウスのグルカゴン受容体に結合可能で、かつ、５０ｎＭ未満のＫｉで各受容体に結合するグルカゴンを阻害する。
本発明はまた、ヒト、ラットおよびマウス由来のグルカゴン受容体に加えて、カニクイザルのグルカゴン受容体にも高親和性で結合可能なモノクローナル抗体を提供する。好ましくは、そのため、Ｆａｂフラグメントまたは当該Ｆａｂフラグメントを備えるヒト化モノクローナル抗体はまた、５０ｎＭ未満のＫｉでカニクイザルのグルカゴン受容体に結合するグルカゴンを阻害する。好ましくは、Ｆａｂフラグメントまたは当該Ｆａｂフラグメントを備えるヒト化モノクローナル抗体は、指定されたグルカゴン受容体の各々において、３０ｎＭ未満、より好ましくは２０ｎＭ未満、更に好ましくは１０ｎＭのＫｉを有する。更に好ましいＦａｂフラグメントは、ラット、マウスおよびカニクイザル（ｃｙｎｏ）の受容体においてインビトロで２０ｎＭ未満のＫｉ、ならびに、ヒトの受容体においてインビトロで５ｎＭ未満のＫｉを有する。より好ましくは、ＦａｂフラグメントのＫｉは、特にヒトのグルカゴン受容体において、０．１ｎＭ〜１５ｎＭ、最も好ましくは１〜１０ｎＭである。
本発明にかかるＦａｂフラグメントまたは当該Ｆａｂフラグメントを備えるヒト化モノクローナル抗体は、好ましくは、ヒトおよびラットのグルカゴン受容体において少なくとも１００ｎＭの機能的な結合親和性（Ｋｂ）を有する。更に好ましいＦａｂフラグメントまたは当該Ｆａｂフラグメントを備えるヒト化モノクローナル抗体は、それらの受容体において少なくとも５０ｎＭ、より好ましくは少なくとも１０ｎＭの機能的な結合親和性を有する。最も好ましい実施形態において、Ｆａｂフラグメントまたは当該Ｆａｂフラグメントを備えるヒト化モノクローナル抗体は、ヒトおよびラットのグルカゴン受容体において１〜１０ｎＭの機能的な結合親和性を有する。
特に予期せぬ発見において、本出願人は、本発明に従って特定された結合特性を有するＦａｂフラグメントまたは当該Ｆａｂフラグメントを備えるヒト化モノクローナル抗体をインビボで暴露する際、非常に急速に血清ＧＬＰ−１が増加し血清血液グルコースが減少することを指摘している。このような有利な効果を最大限に引き出すために、Ｆａｂフラグメントまたは当該Ｆａｂフラグメントを備えるヒト化モノクローナル抗体がＧＬＰ受容体にかなり多く（すなわち、５０００ｎＭを越えるほどのＫｉで）結合しないことが好ましい。
（配列の定義）
配列番号１〜２２は、表１の軽鎖および重鎖のＣＤＲを指す。
配列番号２３〜３０は、本明細書において記載された好ましいヒトのフレームワーク領域を指す。
配列番号３１および３２は、ヒトのＧｌｕＲのアミノ酸およびｃＤＮＡ配列である。
配列番号３３および３４は、ラットのＧｌｕＲのアミノ酸およびｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５および３６は、マウスのＧｌｕＲのアミノ酸およびｃＤＮＡ配列である。
配列番号３７および３８は、カニクイザルのＧｌｕＲのアミノ酸およびｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９および４０は、例１（Ａｂ１）の可変領域アミノ酸配列である。
配列番号４１および４２は、例２（Ａｂ２）の可変領域アミノ酸配列である。
配列番号４３および４４は、例３（Ａｂ３）の可変領域アミノ酸配列である。
配列番号４５および４６は、例４（Ａｂ４）の可変領域アミノ酸配列である。
配列番号４５および４７は、例５（Ａｂ５）の可変領域アミノ酸配列である。
配列番号４５および４８は、例６（Ａｂ６）の可変領域アミノ酸配列である。
配列番号４５および４９は、例７（Ａｂ７）の可変領域アミノ酸配列である。
配列番号５０は、好ましいカッパ軽鎖ＩｇＧ４定常領域を指す。
配列番号５１は、好ましい重鎖ＣＨ１定常領域を指す。
配列番号５２は、好ましい改変ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域を指す。
配列番号５３〜５５は、好ましい軽鎖ＣＤＲを指す。
配列番号５６〜６８は、好ましい重鎖ＣＤＲを指す。
配列番号５９および６０は、例１（Ａｂ１）の軽鎖および重鎖のタンパク質配列である。
配列番号６１および６２は、例２（Ａｂ２）の軽鎖および重鎖のタンパク質配列である。
配列番号６３および６４は、例３（Ａｂ３）の軽鎖および重鎖のタンパク質配列である。
配列番号６５および６６は、例４（Ａｂ４）の軽鎖および重鎖のタンパク質配列である。
配列番号６５および６７は、例５（Ａｂ５）の軽鎖および重鎖のタンパク質配列である。
配列番号６５および６８は、例６（Ａｂ６）の軽鎖および重鎖のタンパク質配列である。
配列番号６５および６９は、例７（Ａｂ７）の軽鎖および重鎖のタンパク質配列である。
配列番号７０および７１は、例１（Ａｂ１）の軽鎖および重鎖のＤＮＡ配列である。
配列番号７２および７３は、例２（Ａｂ２）の軽鎖および重鎖のＤＮＡ配列である。
配列番号７４および７５は、例３（Ａｂ３）の軽鎖および重鎖のＤＮＡ配列である。
配列番号７６および７７は、例４（Ａｂ４）の軽鎖および重鎖のＤＮＡ配列である。
配列番号７６および７８は、例５（Ａｂ５）の軽鎖および重鎖のＤＮＡ配列である。
配列番号７６および７９は、例６（Ａｂ６）の軽鎖および重鎖のＤＮＡ配列である。
配列番号７６および８０は、例７（Ａｂ７）の軽鎖および重鎖のＤＮＡ配列である。
（定義）
「グルカゴン受容体」はまた、本明細書において、長いアミノ末端細胞外ドメイン、７回膜貫通型セグメント、および、細胞内Ｃ末端ドメインから構成される、Ｇタンパク質結合受容体クラス２ファミリーに属する「ＧｌｕＲ」をいう。グルカゴン受容体は、肝細胞の表面上で特に発現され、ここで、グルカゴン受容体はグルカゴンに結合し、それによって細胞内に提供されるシグナルを変換する。ラットおよびヒト由来のグルカゴン受容体をコードするＤＮＡ配列は、単離され当該技術分野において開示されている（ＥＰ０６５８２００Ｂ１）。マウスおよびカニクイザルのホモログもまた、単離され配列決定されている（Ｂｕｒｃｅｌｉｎら、Ｇｅｎｅ １６４ （１９９５） ３０５−３１０）；ＭｃＮａｌｌｙら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ２５ （２００４） １１７１−１１７８）。
本発明の抗体またはそのＦａｂフラグメントの活性に関し、本明細書において用いられる「阻害する」との用語は、グルカゴン受容体の生物学的活性を実質的に拮抗する能力を意味する。この能力は、本明細書において記載された［１２５Ｉ］グルカゴン結合アッセイにより算出されたＫｉ値に反映される。
本発明のモノクローナル抗体に関して用いられる「ヒト化」との用語は、グルカゴン受容体結合抗体に由来する、少なくともヒトのフレームワークおよび定常領域（ＣＬドメイン、ＣＨドメイン（例えば、ＣＨ１，ＣＨ２，ＣＨ３）、および、ヒンジ）、ならびに、ＣＤＲを有する抗体をいう。ヒトのフレームワークは、ヒト生殖細胞系列配列ならびに体細胞変異を有する配列に相当するフレームワークを備える。ヒトのフレームワークおよび定常領域は完全にヒトであり得るか、または、１つ以上のアミノ酸の置換、末端および中間の付加および欠失などにより天然配列と異なり得る。ＣＤＲは、任意の抗体フレームワークにおいて、本出願におけるグルカゴン特異的受容体に結合する１つ以上のＣＤＲから生じ得る。例えば、本発明のヒト化抗体のＣＤＲは、マウスの抗体フレームワークにおいてグルカゴン受容体に結合するＣＤＲから生じ得、その後、ヒトのフレームワークにおいてグルカゴン受容体に結合するよう改変される。
「モノクローナル抗体」との用語は、単一のコピーまたはクローン（例えば、任意の真核、原核、またはファージのクローンを含む）に由来する抗体を指し、それを生成する方法を指すものではない。好ましくは、本発明のモノクローナル抗体は、ホモログまたは実質的にホモログな集団内に存在する。
本発明の抗体に関し、本明細書において用いられる「インビボでの有効性」との用語は、ヒトまたは動物モデルにおける肯定的な生物学的効果を与える抗体の能力を意味する。好ましくは、インビボでの有効性とは、コントロールの応答と比べ本発明の抗体の応答において血中グルコースの上昇を示す動物におけるグルコース正常化の効果をいう。糖尿病のＺｕｃｋｅｒ糖尿病肥満ラット（ＺＤＦ）モデル（Ｈｏｒｍ Ｍｅｔａｂ Ｒｅｓ． ２００５ Ｆｅｂ；３７（２）：７９−８３）は、インビボでの有効性を評価するために適切に用いられ得、ここで、インビボでの有効性は、好ましくは、動物を、本発明にかかるヒト化抗体の３０ｍｇ／ｋｇ未満の投与量で暴露する際、１００％の血中グルコース正常化の効果を示す。より好ましくは、インビボでの有効性は、動物を、１５ｍｇ／ｋｇ未満の抗体の投与量、更に好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ未満の投与量、より好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇの投与量で暴露する際、１００％の血中グルコース正常化の効果を示す。最も好ましい実施形態において、インビボでの有効性は、動物を、本発明にかかるヒト化抗体の１〜３ｍｇ／ｋｇの投与量で暴露する場合、糖尿病のＺＤＦラットモデルにおいて１００％の血中グルコース正常化を示すよう用いられ得る。
「グルコース正常化」との用語は、ＺＤＦラットモデルにおいて、１２０ｍｇ／ｄＬ未満、好ましくは１１０〜１２０ｍｇ／ｄＬの範囲の平均血漿グルコース値をいう。血漿グルコースは、Ｅｔｇｅｎら（Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ２０００； ４９（５）： ６８４−６８８）に従って決定され得、または、Ｄ’Ｏｒａｚｉｏら（Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｌａｂ． Ｍｅｄ． ２００６； ４４（１２）： １４８６−１４９０）に従って全血中グルコース濃度の変換から算出され得る。
本明細書において用いられる、「Ｆａｂフラグメント」は、ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインに加えて軽鎖および重鎖のＣＤＲおよびフレームワーク配列のアミノ酸残基を含む、可変領域内の抗体分子の部分をいう。
重鎖の３つのＣＤＲは、本明細書において「ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３」をいい、また、軽鎖の３つのＣＤＲは、「ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３」をいう。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、周知の慣習（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ）（Ｋａｂａｔら、Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １９０：３８２−９３ （１９７１）；Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ９１−３２４２ （１９９１））に従う。抗原結合ドメインまたは抗原結合ドメインのＣＤＲは、他の非ヒト種（例えば、限定されないが、ウサギ、マウス、ラット、または、ハムスター）由来であり得る。
本発明者らは、マウス、ラット、カニクイザルおよびヒト由来のグルカゴン受容体に対して特に高い親和性を示す抗体Ｆａｂフラグメントを調製するために組み合わせて使用され得る、重鎖および軽鎖のＣＤＲ配列を特定している。Ｆａｂフラグメントは、好ましくは以下を備え、
（ｉ） 軽鎖ＣＤＲＬ１： ＳＸＳＳＳＶＳＹＸ１Ｈ 配列番号５３
（ｉｉ） 軽鎖ＣＤＲＬ２： ＴＴＳＸ２ＬＡＨ 配列番号５４
（ｉｉｉ）軽鎖ＣＤＲＬ３： Ｘ３Ｘ４ＲＳＴＸ５ＰＰＴ 配列番号５５
（ｉｖ ）重鎖ＣＤＲＨ１： ＧＤＤＩＴＳＧＹＸ６Ｘ７ 配列番号５６
（ｖ） 重鎖ＣＤＲＨ２： ＹＩＳＹＳＧＳＴＸ８ＹＸ９ＰＳＬＫＳ 配列番号５７
（ｖｉ） 重鎖ＣＤＲＨ３： ＰＰＸ１０ＹＹＧＦＧＰＹＡＸ１１ＤＹ 配列番号５８
ここで、以下のとおりであり、
Ｘ＝ＹまたはＡ Ｘ６＝ＷまたはＨ
Ｘ１＝ＭまたはＩ Ｘ７＝Ｎ，ＤまたはＥ
Ｘ２＝ＮまたはＹ Ｘ８＝Ｙ，Ｑ，ＳまたはＶ
Ｘ３＝ＱまたはＬ Ｘ９＝Ｎ，ＳまたはＩ
Ｘ４＝ＱまたはＷ Ｘ１０＝ＧまたはＡ
Ｘ５＝ＬまたはＩ Ｘ１１＝ＭまたはＬ
より好ましくは、ＸはＹまたはＡであり；Ｘ１はＩであり；Ｘ２はＹであり；Ｘ３はＱまたはＬであり；Ｘ４はＱまたはＷであり；Ｘ５はＬまたはＩであり；Ｘ６はＷまたはＨであり；Ｘ７はＤまたはＥであり；Ｘ８はＹ，Ｑ，ＳまたはＶであり；Ｘ９はＳであり；Ｘ１０はＧまたはＡであり；Ｘ１１はＬである。更に好ましくは、ＸはＡであり；Ｘ１はＩであり；Ｘ２はＹであり；Ｘ３はＱであり；Ｘ４はＱであり；Ｘ５はＬ；Ｘ６はＨであり；Ｘ７はＤまたはＥであり；Ｘ８はＹ，ＱまたはＳであり；Ｘ９はＳであり；Ｘ１０はＧまたはＡであり；Ｘ１１はＬである。
好ましくは、本発明にかかるＦａｂフラグメントまたは当該Ｆａｂフラグメントを備えるヒト化モノクローナル抗体は、以下のＣＤＲ配列を備え、
ＣＤＲＬ１ １２３４５６７８９１０
ＳＡＳＳＳＶＳＹＩＨ
ＣＤＲＬ２ １２３４５６７
ＴＴＳＹＬＡＨ
ＣＤＲＬ３ １２３４５６７８９
ＱＱＲＳＴＬＰＰＴ
ＣＤＲＨ１ １２３４５６７８９１０
ＧＤＤＩＴＳＧＹＨＤ
ＣＤＲＨ２ １２３４５６７８９１０１１１２１３１４１５１６
ＹＩＳＹＳＧＳＴＹＹＳＰＳＬＫＳ
ＣＤＲＨ３ １２３４５６７８９１０１１１２１３１４
ＰＰＧＹＹＧＦＧＰＹＡＬＤＹ
ここで、上記Ｆａｂフラグメントは、以下から構成される群より選択された１つ、２つ、または、３つのアミノ酸置換を有し、
ＣＤＲＬ１： Ａ２Ｙ，Ｉ９Ｍ；
ＣＤＲＬ２： Ｙ４Ｎ；
ＣＤＲＬ３： Ｑ１Ｌ，Ｑ２Ｗ，Ｌ６Ｉ；
ＣＤＲＨ１： Ｈ９Ｗ，Ｄ１０Ｅ，Ｄ１０Ｎ；
ＣＤＲＨ２： Ｙ９Ｑ，Ｙ９Ｓ，Ｙ９Ｖ，Ｓ１１Ｎ，Ｓ１１Ｉ；
ＣＤＲＨ３： Ｇ３Ａ，Ｌ１２Ｍ
より好ましくは、上記Ｆａｂフラグメントは、ＣＤＲＨ１：Ｄ１０Ｅ；ＣＤＲＨ２：Ｙ９Ｑ，Ｙ９Ｓ；ＣＤＲＨ３：Ｇ３Ａより選択された１つ、２つ、または、３つのアミノ酸置換を有する。
本発明にかかるＦａｂフラグメントまたは当該Ｆａｂフラグメントを備えるヒト化モノクローナル抗体は、好ましくは、以下より選択されたＣＤＲ配列を備える。
（ｉ）配列番号２のＣＤＲＬ１；配列番号４のＣＤＲＬ２；配列番号７のＣＤＲＬ３を有する軽鎖；および配列番号１１のＣＤＲＨ１；配列番号１５のＣＤＲＨ２；配列番号２１のＣＤＲＨ３を有する重鎖；
（ｉｉ）配列番号１のＣＤＲＬ１；配列番号４のＣＤＲＬ２；配列番号６のＣＤＲＬ３を有する軽鎖；および配列番号１０のＣＤＲＨ１；配列番号１６のＣＤＲＨ２；配列番号２０のＣＤＲＨ３を有する重鎖；
（ｉｉｉ）配列番号３のＣＤＲＬ１；配列番号５のＣＤＲＬ２；配列番号８のＣＤＲＬ３を有する軽鎖；および配列番号１１のＣＤＲＨ１；配列番号１５のＣＤＲＨ２；配列番号２１のＣＤＲＨ３を有する重鎖；
（ｉｖ）配列番号３のＣＤＲＬ１；配列番号５のＣＤＲＬ２；配列番号６のＣＤＲＬ３を有する軽鎖；および配列番号１２のＣＤＲＨ１；配列番号１５のＣＤＲＨ２；配列番号２１のＣＤＲＨ３を有する重鎖；
（ｖ）配列番号３のＣＤＲＬ１；配列番号５のＣＤＲＬ２；配列番号６のＣＤＲＬ３を有する軽鎖；および配列番号１２のＣＤＲＨ１；配列番号１７のＣＤＲＨ２；配列番号２１のＣＤＲＨ３を有する重鎖；
（ｖｉ）配列番号３のＣＤＲＬ１；配列番号５のＣＤＲＬ２；配列番号６のＣＤＲＬ３を有する軽鎖；および配列番号１２のＣＤＲＨ１；配列番号１５のＣＤＲＨ２；配列番号２２のＣＤＲＨ３を有する重鎖；ならびに
（ｖｉｉ）配列番号３のＣＤＲＬ１；配列番号５のＣＤＲＬ２；配列番号６のＣＤＲＬ３を有する軽鎖；および配列番号１３のＣＤＲＨ１；配列番号１８のＣＤＲＨ２；配列番号２２のＣＤＲＨ３を有する重鎖。
本発明に従う抗体が低い血漿濃度においてインビボでの有効性を示すことが特に望ましい。インビボでの有効性は、ＺＤＦラットモデルにおいて３０ｍｇ／ｋｇの投与量、好ましくは１５ｍｇ／ｋｇ未満の投与量、より好ましくは５ｍｇ／ｋｇ未満の投与量、更に好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲において観察されるべきである。最も好ましくは、本発明に従う抗体は、約１〜３ｍｇ／ｋｇの投与量でＺＤＦラットモデルにおいて１００％のグルコース正常化を達成する。本発明に従う特に好ましい抗体が３ｍｇ／ｋｇの低い投与量でインビボでのＺＤＦラットモデルにおいて１００％のグルコース正常化を示すことができることが見出されている。したがって、本発明は、好ましくは、Ｆａｂフラグメントまたは当該Ｆａｂフラグメントを備えるヒト化モノクローナル抗体を備え、ここで、上記Ｆａｂフラグメントは、以下を備える。
（ｉ）配列番号３のＣＤＲＬ１；配列番号５のＣＤＲＬ２；配列番号６のＣＤＲＬ３を有する軽鎖；および配列番号１２のＣＤＲＨ１；配列番号１５のＣＤＲＨ２；配列番号２１のＣＤＲＨ３を有する重鎖；
（ｉｉ）配列番号３のＣＤＲＬ１；配列番号５のＣＤＲＬ２；配列番号６のＣＤＲＬ３を有する軽鎖；および配列番号１２のＣＤＲＨ１；配列番号１７のＣＤＲＨ２；配列番号２１のＣＤＲＨ３を有する重鎖；
（ｉｉｉ）配列番号３のＣＤＲＬ１；配列番号５のＣＤＲＬ２；配列番号６のＣＤＲＬ３を有する軽鎖；および配列番号１２のＣＤＲＨ１；配列番号１５のＣＤＲＨ２；配列番号２２のＣＤＲＨ３を有する重鎖；あるいは
（ｉｖ）配列番号３のＣＤＲＬ１；配列番号５のＣＤＲＬ２；配列番号６のＣＤＲＬ３を有する軽鎖；および配列番号１３のＣＤＲＨ１；配列番号１８のＣＤＲＨ２；配列番号２２のＣＤＲＨ３を有する重鎖。
更に好ましい実施形態において、本発明は、Ｆａｂフラグメントまたは当該Ｆａｂフラグメントを備えるヒト化モノクローナル抗体に関し、ここで、上記Ｆａｂフラグメントは、配列番号３のＣＤＲＬ１；配列番号５のＣＤＲＬ２；配列番号６のＣＤＲＬ３を有する軽鎖；および配列番号１２のＣＤＲＨ１；配列番号１７のＣＤＲＨ２；配列番号２１のＣＤＲＨ３を有する重鎖を備える。本実施形態に従うＦａｂフラグメントを備える抗体が、記載されている属内における他の類似の抗体と比べ長期にわたってインビボでの有効性を維持する特に有利な特性を有することが見出されている。
本発明のＦａｂフラグメントまたは当該Ｆａｂフラグメントを備えるヒト化モノクローナル抗体は、好ましくは、ヒト由来の軽鎖および重鎖の可変フレームワークを備える。更に、種々の異なるヒトのフレームワーク配列は、本発明のヒト化免疫グロブリンを基礎として単独でまたは組み合わせて用いられ得る。好ましくは、本発明のＦａｂフラグメントまたはヒト化モノクローナル抗体のフレームワーク領域は、ヒト由来または実質的にヒト由来（少なくとも、９５％、９７％または９９％はヒト由来）である。ヒト由来のフレームワーク領域の配列は、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅｔｉｃｓ（ＩＭＧＴ）からそのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／ｔｅｘｔｅｓ／ＩＭＧＴｉｎｄｅｘ／ＦＲ．ｈｔｍｌ）を介して、または、Ｍａｒｉｅ−Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｇｅｒａｒｄ Ｌｅｆｒａｎｃ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ２００１， ＩＳＢＮ ０１２４４１３５１によるＴｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆａｃｔｓｂｏｏｋから取得され得る。例えば、生殖細胞系列軽鎖フレームワークは、Ａｌ１、Ａ１７、Ａ１８、Ａ１９、Ａ２０、Ａ２７、Ａ３０、ＬＩ、Ｌ１Ｉ、Ｌ１２、Ｌ２、Ｌ５、Ｌ１５、Ｌ６、Ｌ８、Ｏ１２、Ｏ２、およびＯ８から構成される群から選択され得る。また、生殖細胞系列重鎖フレームワーク領域は、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−７２、ＶＨＩ−４６、ＶＨ３−９、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−３１、ＶＨＩ−１８、ＶＨＩ−６９、ＶＩ−１３−７、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−４８、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、およびＶＨ５−５Ｉから構成される群から選択され得る。
本明細書において開示された特定の抗体は、本発明の付加的な抗体を作るためのテンプレートまたは親抗体として用いられ得る。１つのアプローチにおいて、親抗体ＣＤＲは、親抗体フレームワークに対して高い配列同一性を有するヒトのフレームワークに移植される。新たなフレームワークの配列同一性は、親抗体における対応フレームワークに対して、一般的に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または、少なくとも９０％であろう。この移植は、親抗体に比べて結合親和性の低下をもたらし得る。この場合、フレームワークは、Ｑｕｅｅｎら［Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８， ２８６９ （１９９１）］により公開された特定の基準に基づいて、特定の位置において親フレームワークに復帰変異され得る。使用され得る更なる方法としては、例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ， ３２１：５２２ （１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ， ３３２：３２３−３２７ （１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３９：１５３４ （１９８８）が挙げられる。
最も好ましくは、本発明にかかるＦａｂフラグメントまたは当該Ｆａｂフラグメントを備えるヒト化モノクローナル抗体は、以下の軽鎖フレーム（ＦＲ）配列：ＦＲ１（配列番号２３）；ＦＲ２（配列番号２４）；ＦＲ３（配列番号２５）；ＦＲ４（配列番号２６）；および、以下の重鎖可変フレームワーク配列：ＦＲ５（配列番号２７）；ＦＲ６（配列番号２８）；ＦＲ７（配列番号２９）；ＦＲ８（配列番号３０）を備え、ここで、これらは、軽鎖可変配列ＦＲ１−ＣＤＲＬ１−ＦＲ２−ＣＤＲＬ２−ＦＲ３−ＣＤＲＬ３−ＦＲ４、および、重鎖可変配列ＦＲ５−ＣＤＲＨ１−ＦＲ６−ＣＤＲＨ２−ＦＲ７−ＣＤＲＨ３−ＦＲ８として配列される。
本出願人は、驚いたことに、インビトロ競合グルカゴン結合アッセイを用いてグルカゴン受容体拮抗抗体のインビボでの有効性を予想する際に、Ｆａｂフラグメントの親和性がインビボでの有効性に正の相関があることを決定している。反対に、完全抗体のグルカゴン受容体に対する結合親和性（Ｋｉ）は、必ずしもインビボでの有効性の有効な予測因子ではない。本明細書において探索された好ましい特性を有するモノクローナル抗体を調製するプロセスは、従って、好ましくは、異種発現グルカゴン受容体遺伝子を用いるインビトロ競合グルカゴン結合アッセイにおいて、５０ｎＭ未満のＫｉで各グルカゴン受容体に結合するＦａｂフラグメントを選択することを含む。より好ましくは、上記プロセスは、グルカゴン受容体の各々において３０ｎＭ未満、より好ましくは２０ｎＭ未満、更に好ましくは１０ｎＭ未満のインビボトロでのＫｉを有するＦａｂフラグメントを選択することを含む。より好ましくは、Ｆａｂフラグメントは、ラット、マウスおよびカニクイザルの受容体において２０ｎＭ未満のインビトロでのＫｉ、および、ヒトの受容体において５ｎＭ未満のインビトロでのＫｉにより選択される。より好ましくは、選択されたＦａｂフラグメントのＫｉは、特にヒトのグルカゴン受容体において、０．１ｎＭ〜１５ｎＭ、最も好ましくは１〜１０ｎＭである。このプロセスにより特定されたＦａｂフラグメントは、その後、当該分野において公知の技術により治療的使用のために完全抗体として適切に発現される。
本発明の教示を適用して、当業者が、本明細書において開示された特定のＣＤＲおよびフレームワーク配列内の置換アミノ酸に対して一般的な技術（例えば、部位指定変異導入）を使用することができ、そうして、本明細書において提供された配列由来の更なる可変領域アミノ酸配列を生成することが望ましい。全２０個までの天然に生じる代替アミノ酸は、特定の置換部位にて導入され得る。本明細書において上記にて定義されたインビトロでの選択プロセスは、主張した交差反応性およびインビボでの有効性を示す本出願人により見出されたインビトロでのＫｉを有する、Ｆａｂフラグメントに関するこれらの付加的な可変領域アミノ酸配列をスクリーニングするために、適切に用いられ得る。このように、更なるＦａｂフラグメントが本発明に従うヒト化抗体を調製するのに適していることが認識される。好ましくは、フレームワーク内のアミノ酸置換は、本明細書において開示された１つまたは各フレームワーク配列内の１つ、２つ、または３つの位置に制限される。好ましくは、ＣＤＲ内のアミノ酸置換は、１つまたは各ＣＤＲ内の１〜３つのアミノ酸位置に制限され、より好ましくは、１つまたは各ＣＤＲ内の１つまたは２つのアミノ酸位置にて行われる。更に好ましくは、アミノ酸置換は、重鎖可変領域のＣＤＲ内の１つまたは２つのアミノ酸位置にて行われる。最も好ましくは、アミノ酸置換は、ＣＤＲＨ２内の１つまたは２つのアミノ酸位置にて行われる。
親抗体として本明細書において記載された抗体を用いて本発明にかかる代替抗体を調製するためにＣＤＲとフレームワーク代替物とを組み合わせる適切な方法は、Ｗｕら、Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９４：１５１−１６２において提供される。
本明細書において用いられるように、免疫グロブリンのＦｃ部分は、非共有相互作用およびジスルフィド結合を介して結合する両方の重鎖からの抗体の定常領域をいう。Ｆｃ部分としては、ヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３ドメインを通る抗体のＣ末端までの延長領域が挙げられ得る。Ｆｃ部分としてはさらに、１つ以上のグリコシル化部位が挙げられ得る。本発明のモノクローナル抗体は、免疫グロブリンクラス（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＥ）のうちのいずれかから選択された重鎖定常領域を有し得る。好ましくは、本発明の抗体は、他のＩｇＧサブタイプと比べて減少したＦｃγＲおよび補体因子に結合する能力のためヒトＩｇＧ４のＦｃ領域から生じるＦｃ部分を含む。より好ましくは、本発明の抗体のＩｇＧ４のＦｃ領域は、エフェクター機能を更に低下させる代替物を含む（Ｉｓｓａｃｓら、（１９９６） Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０６：４２７−４３３）。これらは、残基２３３におけるグルタミン酸のプロリン、残基２３４におけるフェニルアラニンのアラニンまたはバリン、および、残基２３５におけるロイシンのアラニンまたはグルタミン酸を含む１つ以上の群から選択され得る（ＥＵ番号付け，Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版．Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＮＩＨ 公開番号９１−３２４２）。これらの残基は、配列番号５２における位置１５、１６および１７、ならびに、配列番号６７における位置２３５、２３６および２３７対応する。更に、Ａｌａを配列番号５２の位置７９に対応する残基２９７（ＥＵ番号付け）におけるＡｓｎに置換することにより、ＩｇＧ４のＦｃ領域におけるＮ結合グリコシル化部位を除去することは、残基エフェクター活性をヒト化抗体において排除することを確実にする別の方法である。
加えて、本発明のヒト化モノクローナル抗体とともに使用するためのＩｇＧ４のＦｃ部分は、好ましくは、重鎖二量体形成を安定化し、かつ、ＩｇＧ４のＦｃ半鎖の形成を抑える代替物を含む。この構築物は、プロリン（配列番号５２におけるアミノ酸残基１０）により置換されている位置２２８（ＥＵ番号付け）におけるセリンから構成される。天然分子内に存在するＣ末端リシン残基はまた、本明細書において議論された抗体のＩｇＧ４派生Ｆｃ部分において削除され得る（配列番号５２の位置２２９；リシンが削除された部分をｄｅｓ−Ｋとして記載）。最も好ましくは、ＩｇＧ４のＦｃ部分は、配列番号６７のアミノ酸２２１〜４４８から提供される。
本発明は更に、本発明の抗体をコードする単離された核酸配列；ベクターで形質転換された宿主細胞により認識されたコントロール配列に必要に応じて作動可能に結合される核酸を含むベクター（ベクター群）；そのベクターを含む宿主細胞；核酸が発現され任意に宿主細胞培地から抗体を収容することができるよう宿主細胞を培養することを含む、本発明にかかる抗体またはそのＦａｂフラグメントを生成するためのプロセスに関する。
別の実施形態において、本発明は、本発明のＦａｂフラグメントまたはヒト化モノクローナル抗体を含む薬学的組成物を提供する。本発明の薬学的組成物は更に、薬学的に受容可能なキャリアを含む。上記薬学的組成物において、本発明のＦａｂフラグメントまたはヒト化モノクローナル抗体は、活性成分である。好ましくは、薬学的組成物は、本発明のＦａｂフラグメントまたはヒト化モノクローナル抗体のホモログまたは実質的にホモログな集団を含む。治療上の使用のための組成物は、無菌であり、凍結乾燥され得、任意に適切な希釈液が供給される。
本発明の更なる実施形態は、本発明のあらゆる単離されたポリヌクレオチド、または、ＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、本発明のモノクローナル抗体もしくはＦａｂフラグメントをコードする配列を含むあらゆる組換ベクターの受容体である宿主細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含み、この子孫は、天然、偶然、または意図的な変異および／または変更により、元の親細胞に対して、（形態学上または総ＤＮＡ相補性において）完全に同一である必要はなくてもよい。宿主細胞は、１つ以上の組換ベクターあるいは本発明のモノクローナル抗体またはそれの軽鎖もしくは重鎖を発現するポリヌクレオチドを用いて、インビボまたはインビトロで、形質転換、形質導入、または、感染された細胞を含む。本発明の組換ベクターを含む宿主細胞（宿主染色体に安定的に組み込まれたかまたは組み込まれていないのいずれか）はまた、「組換宿主細胞」として呼ばれ得る。本発明の使用のために好ましい宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＨｅＬａ、ＳＰ２／０細胞またはＣＯ細胞である。本発明の使用のための付加的な宿主細胞は、植物細胞、酵母細胞、他の哺乳動物細胞、および、原核細胞を含む。
本発明は、包装材料および上記包装材料内に含まれた本発明のＦａｂフラグメントまたはヒト化モノクローナル抗体を含む製造品を具体化し、ここで、包装材料は、Ｆａｂフラグメントまたはヒト化モノクローナル抗体がＧｌｕＲを無効にすることまたは患者におけるＧｌｕＲレベルを減少することを示す添付文書を含む。
（生物学的アッセイ）
（グルカゴン受容体（ＧｌｕｃＲ）膜調製物）
結合研究のための膜調製物を、クローン化したヒト、マウス、カニクイザル、またはラットのグルカゴン受容体を発現する２９３ＨＥＫ細胞から準備する。各クローン細胞株を、まず懸濁培養物として培養し、凍結した細胞ペレットを、２５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ ７．５）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害錠剤（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、および、２０Ｕ／ｍｌのＤＮａｓｅＩ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）から構成される膜調製バッファ内で４℃にて再懸濁する。細胞を、モータ駆動テフロン（登録商標）ガラスＰｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍホモジナイザーを２５ストローク用いて均質化し、その後、１８００×ｇで１５分間４℃にて遠心分離する。上清物を収集し、ペレットを膜調製バッファ内で再懸濁し、再均質化し、遠心分離する。第２の上清物を、第１の上清物と組み合わせ、再度１８００×ｇで１５分間、遠心分離して分ける。分けられた上清物を高速チューブに移し、２５０００×ｇで３０分間４℃にて遠心分離する。膜ペレット（Ｐ２）を膜調製バッファ内（ＤＮＡａｓｅを含まず）に再懸濁し、分割し、ドライアイス上で急速冷凍し、必要となるまで−８０℃にて保管する。
（シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）による［１２５Ｉ］グルカゴン結合）
競合受容体／リガンド結合実験を、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）フォーマットに適合させる。インキュベーションを、底が透明な、不透明９６ウェルマイクロプレート内で行う。化合物を、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４），２．５ｍＭのＣａＣｌ２，１ｍＭのＭｇＣｌ２，０．１％の脂肪酸フリーＢＳＡ，０．００３％のｔｗｅｅｎ−２０およびＣｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害錠剤から構成される結合バッファ内で連続的に３倍希釈する。Ｐ２膜（上で調製された）を、各受容体調製物から結合バッファ内で希釈し、次いで、希釈された化合物を加え、その後、１％の脂肪酸フリーＢＳＡおよび０．１５ｎＭの［１２５Ｉ］−グルカゴン（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）で事前にブロックされた０．１５ｍｇのコムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）ＳＰＡビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を追加する。プレートを粘着密閉テープで密封し、回転させて混合し、室温にて１２時間インキュベートする。（ＷＧＡ ＳＰＡビーズにごく接近している）レセプターに結合する放射能を、ＰＥ ＬｉｆｅおよびＡｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｔｒｉｌｕｘ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａプレートシンチレーションカウンター上で定量化し、カウント毎分（ＣＰＭ）で表す。結合の合計を、追加された化合物がない状態で決定し、非特異的結合を１ｕＭのグルカゴン（Ｌｉｌｌｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ）を追加することにより決定する。１ｕＭの非標識グルカゴンの最終濃度では、バックグラウンドのレベルまで、［１２５Ｉ］グルカゴン結合を完全に阻害することができる。
（［１２５Ｉ］グルカゴン結合データ分析）
化合物の濃度曲線に関するＣＰＭの生データを、個々のＣＰＭ値から非特異的結合を差し引き、非特異的結合もまた収集した結合シグナルの合計で割ることにより、阻害パーセントに変換する。データを、４つのパラメータ（最大曲線、最小曲線、ＩＣ５０、Ｈｉｌｌスロープ）非線形回帰ルーティン（ＸＬＦｉｔ バージョン３．０：Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｂａｓｅ，ＩＤＢＳ）を用いて分析する。放射性リガンド結合を阻害した競合物により決定された平衡解離定数（Ｋｉ）を、式「Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋Ｄ／Ｋｄ）」に基づいたＩＣ５０絶対値から算出し、ここで、Ｄは、実験に用いられた放射性リガンドの濃度に相当し、Ｋｄは、各個々の受容体種に関するアッセイにおける、［１２５Ｉ］グルカゴンの平衡結合親和性定数に相当する。
（グルカゴン誘導ｃＡＭＰ機能的アンタゴニストアッセイ）
機能的アンタゴニスト活性を、同じクローン化したラット、マウス、カニクイザル、およびヒトのグルカゴン受容体−２９３ＨＥＫ細胞株を用いて、グルカゴンの最大下投与量での細胞内ｃＡＭＰの増加における投与依存性阻害から決定する。細胞内ｃＡＭＰレベルの定量を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（６７６０６２５Ｒ）からの増幅ルミネセンス近接ホモジニアスアッセイ（Ａｌｐｈａ Ｓｃｒｅｅｎ）を用いて行う。つまり、細胞内で生成されたｃＡＭＰを、ビオチン化ｃＡＭＰストレプトアビジン被覆ドナービーズと、被覆抗ｃＡＭＰ抗体アセプタービーズとの結合について競争させる。細胞内のｃＡＭＰが増加すると、アセプタービーズ−ビオチン化ｃＡＭＰ−ドナービーズ複合体の崩壊が起こる。機能的アッセイを、Ｍｇ＋２およびＣａ＋２を含むＨＢＳＳ内の０．２５ｍＭのＩＢＭＸとともに、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）内で行う。クローン化したグルカゴン受容体−２９３ＨＥＫ細胞を、２０ｕｌｓの全容量においてキットから、１ウェル当り２５００細胞およびビオチン化ｃＡＭＰの１ユニット／ウェルにて懸濁する。細胞を、標準曲線として用いるために、３倍で連続的に希釈された化合物または３倍で連続的に希釈されたｃＡＭＰのうちいずれかの２０ｕｌｓを用いて、３０分間室温にてプレインキュベートする。最大細胞内ｃＡＭＰの９０％を生成するのに十分な投与量である、３００ｐＭグルカゴン（３×）の２０ｕｌｓを追加することで、反応を開始する。暗闇の中６０分間室温にて置いた後、１ウェル当りキットドナービーズおよびアセプタービーズを各々１ユニット含む、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）中の１％のＩＧＥＰＡＬ ＣＡ６３０（Ｓｉｇｍａ）および０．１％の脂肪酸フリーＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ）から構成される溶解バッファーの３０ｕｌｓを追加することで、反応を停止する。プレートを、光からドナービーズおよびアセプタービーズを保護するために、ホイルで包み、Ｔｉｔｅｒｔｅｋシェーカー上で中速にて３０秒間混合する。一晩室温にてインキュベーションした後、プレートを、Ｐａｃｋａｒｄ Ｆｕｓｉｏｎ（商標）−α Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ上で読み取る。
（機能的ｃＡＭＰ活性のデータ分析）
Ａｌｐｈａ Ｓｃｒｅｅｎの単位を、ｃＡＭＰ標準曲線に基づいて１ウェル当りに生成されたｃＡＭＰのｐＭｏｌに変換する。化合物の存在下で生成されたｃＡＭＰのｐＭｏｌを、グルカゴンのみの最大下投与量に対する最大応答パーセントに変更する。各実験内において、ｐＭｏｌのｃＡＭＰにおいて５０％の応答を生成するのに必要なグルカゴン濃度を決定する。このＥＣ５０濃度を、実行（ｒｕｎｓ）からＫｂまでの間の結果を標準化するために用いる。ここで、Ｋｂ＝（化合物のＥＣ５０）／［１＋（使用されたグルカゴンのｐＭ／グルカゴン投与応答に対するｐＭのＥＣ５０）］。データを、４つのパラメータ（最大曲線、最小曲線、ＩＣ５０、Ｈｉｌｌスロープ）非線形回帰ルーティン（ＸＬＦｉｔ バージョン３．０：Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｂａｓｅ，ＩＤＢＳ）を用いて分析する。
（実施例）
抗体の例（Ａｂ−１、Ａｂ−２、Ａｂ−３、Ａｂ−４、Ａｂ−５、Ａｂ−６およびＡｂ−７）を、当該技術分野に知られるように作製し精製する。適切な宿主細胞（例えば、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡまたはＣＨＯ）を、最適な所定の軽鎖を用いて抗体を、重鎖ベクター比または軽鎖（配列番号：７０，７２，７４，７６に提示）および重鎖（配列番号：７１，７３，７５，７７，７８，７９，８０に提示）の両方をコードする単一ベクター系に分泌するために、発現系を用いて一時的にまたは安定的にトランスフェクトする。抗体が分泌された精製培地を、多くの一般的な技術のうちのいずれかを用いて精製する。例えば、培地を、適合バッファ（例えば、リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４））で平衡化されたタンパク質ＡまたはＧセファロースＦＦカラムに都合良く適用し得る。カラムを洗浄して非特異的結合成分を除去する。結合された抗体を、例えば、ｐＨ勾配（例えば、０．１Ｍ リン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ６．８）〜０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ２．５））により溶出する。抗体の分画を、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出し、その後保存する。更なる精製を使用目的により任意に行う。抗体を一般的な技術を用いて濃縮および／または無菌濾過し得る。可溶性の凝集体および多量体を一般的な技術（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、または、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー）を用いて効果的に除去し得る。これらのクロマトグラフィー工程後における抗体の純度は、９９％より大きい。生成物を−７０℃にて迅速に凍結し得るか、または、凍結乾燥し得る。
Ｆａｂ発現を大腸菌において達成し、ここで、Ｆａｂ分子は、細胞膜周辺腔へ分泌される。細胞壁を浸透圧衝撃により破壊し、Ｈｉｓタグを含むＦａｂをＩＭＡＣカラム上で精製する。
表１は、本発明にかかる抗体の例において用いられたＣＤＲの組み合わせを提示する。完全抗体軽鎖は、３つの軽鎖ＣＤＲによって間の空間を占められた軽鎖フレームワーク配列（フレームワーク１（配列番号２３）−ＣＤＲＬ１−フレームワーク２（配列番号２４）−ＣＤＲＬ２−フレームワーク３（配列番号２５）−ＣＤＲＬ３−フレームワーク４（配列番号２６）および軽鎖定常領域（配列番号５３））と結合する。重鎖フレームワーク配列は３つの重鎖ＣＤＲによって間の空間を占められ(フレームワーク５（配列番号２７）−ＣＤＲＨ１−フレームワーク６（配列番号２８）−ＣＤＲＨ２−フレームワーク７（配列番号２９）−ＣＤＲＨ３−フレームワーク８（配列番号３０）)、次いで、重鎖ＣＨ１定常領域（配列番号５１）の後に、Ｆａｂフラグメントには見られないＡｂのＦｃドメインが続く（配列番号５２、ここで、Ｘ１０＝Ｐ；Ｘ１５＝Ｅ；Ｘ１６＝Ａ；Ｘ１７＝Ａ；Ｘ７９＝Ｎ；Ｘ２２９は見られない）。
（表１）
Figure 0005438095
例１から例７の抗体の例およびそのＦａｂフラグメントは全て、５０ｎＭ未満のＫｉでの上記グルカゴン受容体結合アッセイにおいて、ヒト、マウス、カニクイザルおよびラットのグルカゴン受容体に結合するグルカゴンを阻害する。
（例４（Ａｂ４）の抗体のインビトロでの活性）
（表２） 機能的ｃＡＭＰ拮抗
Figure 0005438095
このアッセイは、ナノモル濃度においてＧｌｕＲに結合するＡｂ４がラットまたはヒトのグルカゴン受容体細胞株の下流活性（ｄｏｗｎ ｓｔｒｅａｍ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ）をブロックでき、かつ、細胞によるｃＡＭＰ生成を減少させることができることを示す。
（表３） 例４の完全抗体および各Ｆａｂに関するインビトロでのＫｉ（ｎＭ）
Figure 0005438095
このアッセイは、インビトロでのグルカゴン競合結合アッセイにおいてＡｂ４が高い親和性（Ｋｉ）にてヒト、マウス、ラット、カニクイザル由来のグルカゴン受容体に結合し、ヒトのＧＬＰ−１受容体に対しては低い親和性であることを示す。
（例４（Ａｂ４）の抗体のインビボでの活性）
約８週齢および体重約４００ｇのＺＤＦラットに、例４（すなわち、Ａｂ４）にかかる抗体またはヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ４）コントロールを単回皮下注射により投与する。各治療群は、６つの動物からなる。血液サンプルは、３もしくは１５ｍｇ／ｋｇのＡｂ４または１５ｍｇ／ｋｇのｈＩｇＧコントロールの投与前、および、単回皮下投与後の１３日間毎日、グルコース測定を取得する。ＧＬＰ−１分析にための血液サンプルを、３もしくは１５ｍｇ／ｋｇのＡｂ４または１５ｍｇ／ｋｇのｈＩｇＧコントロールの投与前、および、皮下投与後の２、４、６、および、８日間において、取得する。
（表４） ＺＤＦラットに対する、３もしくは１５ｍｇ／ｋｇのＡｂ４、または、１５ｍｇ／ｋｇのネガティブコントロールの単回皮下投与後における血中グルコースレベル
Figure 0005438095
１つの値（＊）を除いて群当り６匹のラットがいた。ここで、１匹の動物のＡＱＬを測定した結果、ｎ＝５となった。
（表５） ＺＤＦラットに対する、３もしくは１５ｍｇ／ｋｇのＡｂ４、または、１５ｍｇ／ｋｇのネガティブコントロールの単回皮下投与後における血漿ＧＬＰ−１レベル
Figure 0005438095
平均および標準偏差を、定量化可能なＧＬＰ−１レベルを有したラットのみから決定し、数は、定量化可能なＧＬＰ−１レベルを有した群当りの動物数を示す。定量化可能なＧＬＰ−１レベルを有した動物がいない場合の結果を、６ｐＭより少ないとして列挙する。不検出は、値が検出されなかったことを表す。

Claims (13)

  1. Ｆａｂフラグメントがヒト、ラットおよびマウスのグルカゴン受容体に結合可能で、かつ、５０ｎＭ未満のＫｉで各受容体に結合するグルカゴンを阻害するか、あるいは、
    Ｆａｂフラグメントが５０ｎＭ未満のＫｉでカニクイザルのグルカゴン受容体に結合するグルカゴンを阻害し、
    Ｆａｂフラグメントが、以下：
    （ｉ） 軽鎖ＣＤＲＬ１：ＳＸＳＳＳＶＳＹＸ１Ｈ 配列番号５３
    （ｉｉ） 軽鎖ＣＤＲＬ２：ＴＴＳＸ２ＬＡＨ 配列番号５４
    （ｉｉｉ）軽鎖ＣＤＲＬ３：Ｘ３Ｘ４ＲＳＴＸ５ＰＰＴ 配列番号５５
    （ｉｖ） 重鎖ＣＤＲＨ１：ＧＤＤＩＴＳＧＹＸ６Ｘ７ 配列番号５６
    （ｖ） 重鎖ＣＤＲＨ２：ＹＩＳＹＳＧＳＴＸ８ＹＸ９ＰＳＬＫＳ 配列番号５７
    （ｖｉ） 重鎖ＣＤＲＨ３：ＰＰＸ１０ＹＹＧＦＧＰＹＡＸ１１ＤＹ 配列番号５８
    ここで、以下のとおりであること
    Ｘ＝ＹまたはＡ Ｘ６＝ＷまたはＨ
    Ｘ１＝ＭまたはＩ Ｘ７＝Ｎ，ＤまたはＥ
    Ｘ２＝ＮまたはＹ Ｘ８＝Ｙ，Ｑ，ＳまたはＶ
    Ｘ３＝ＱまたはＬ Ｘ９＝Ｎ，ＳまたはＩ
    Ｘ４＝ＱまたはＷ Ｘ１０＝ＧまたはＡ
    Ｘ５＝ＬまたはＩ Ｘ１１＝ＭまたはＬ
    を備えることを特徴とする、Ｆａｂフラグメントまたは当該Ｆａｂフラグメントを備えるヒト化モノクローナル抗体。
  2. Ｘ＝Ａ Ｘ６＝Ｈ
    Ｘ１＝Ｉ Ｘ７＝ＤまたはＥ
    Ｘ２＝Ｙ Ｘ８＝Ｙ，ＱまたはＳ
    Ｘ３＝Ｑ Ｘ９＝Ｓ
    Ｘ４＝Ｑ Ｘ１０＝ＧまたはＡ
    Ｘ５＝Ｌ Ｘ１１＝Ｌ
    を特徴する、請求項１に記載のＦａｂフラグメントまたは当該Ｆａｂフラグメントを備えるヒト化モノクローナル抗体。
  3. Ｆａｂフラグメントがヒト、ラットおよびマウスのグルカゴン受容体に結合可能で、かつ、５０ｎＭ未満のＫｉで各受容体に結合するグルカゴンを阻害するか、あるいは、
    Ｆａｂフラグメントが５０ｎＭ未満のＫｉでカニクイザルのグルカゴン受容体に結合するグルカゴンを阻害し、
    Ｆａｂフラグメントが、以下のＣＤＲ配列を備え、
    ＣＤＲＬ１ １２３４５６７８９１０
    ＳＡＳＳＳＶＳＹＩ Ｈ
    ＣＤＲＬ２ １２３４５６７
    ＴＴＳＹＬＡＨ
    ＣＤＲＬ３ １２３４５６７８９
    ＱＱＲＳＴＬＰＰＴ
    ＣＤＲＨ１ １２３４５６７８９１０
    ＧＤＤＩＴＳＧＹＨ Ｄ
    ＣＤＲＨ２ １２３４５６７８９１０１１１２１３１４１５１６
    ＹＩＳＹＳＧＳＴＹ Ｙ Ｓ Ｐ Ｓ Ｌ Ｋ Ｓ
    ＣＤＲＨ３ １２３４５６７８９１０１１１２１３１４
    ＰＰＧＹＹＧＦＧＰ Ｙ Ａ Ｌ Ｄ Ｙ
    ここで、上記Ｆａｂフラグメントは、以下からなる群より選択された１つ、２つ、または、３つのアミノ酸置換を有すること
    ＣＤＲＬ１： Ａ２Ｙ，Ｉ９Ｍ；
    ＣＤＲＬ２： Ｙ４Ｎ；
    ＣＤＲＬ３： Ｑ１Ｌ，Ｑ２Ｗ，Ｌ６Ｉ；
    ＣＤＲＨ１： Ｈ９Ｗ，Ｄ１０Ｅ，Ｄ１０Ｎ；
    ＣＤＲＨ２： Ｙ９Ｑ，Ｙ９Ｓ，Ｙ９Ｖ，Ｓ１１Ｎ，Ｓ１１Ｉ；
    ＣＤＲＨ３： Ｇ３Ａ，Ｌ１２Ｍ
    を特徴とする、Ｆａｂフラグメントまたは当該Ｆａｂフラグメントを備えるヒト化モノクローナル抗体。
  4. Ｆａｂフラグメントがヒト、ラットおよびマウスのグルカゴン受容体に結合可能で、かつ、５０ｎＭ未満のＫｉで各受容体に結合するグルカゴンを阻害するか、あるいは、
    Ｆａｂフラグメントが５０ｎＭ未満のＫｉでカニクイザルのグルカゴン受容体に結合するグルカゴンを阻害し、
    Ｆａｂフラグメントが、以下を備えること
    （ｉ） 軽鎖ＣＤＲＬ１：ＳＡＳＳＳＶＳＹＩＨ （配列番号３）
    （ｉｉ） 軽鎖ＣＤＲＬ２：ＴＴＳＹＬＡＨ （配列番号５）
    （ｉｉｉ）軽鎖ＣＤＲＬ３：ＱＱＲＳＴＬＰＰＴ （配列番号６）
    （ｉｖ） 重鎖ＣＤＲＨ１：ＧＤＤＩＴＳＧＹＨＤ （配列番号１２）
    （ｖ） 重鎖ＣＤＲＨ２：ＹＩＳＹＳＧＳＴＹＹＳＰＳＬＫＳ （配列番号１５）
    （ｖｉ） 重鎖ＣＤＲＨ３：ＰＰＧＹＹＧＦＧＰＹＡＬＤＹ （配列番号２１）
    を特徴とする、Ｆａｂフラグメントまたは当該Ｆａｂフラグメントを備えるヒト化モノクローナル抗体。
  5. Ｆａｂフラグメントがヒト、ラットおよびマウスのグルカゴン受容体に結合可能で、かつ、５０ｎＭ未満のＫｉで各受容体に結合するグルカゴンを阻害するか、あるいは、
    Ｆａｂフラグメントが５０ｎＭ未満のＫｉでカニクイザルのグルカゴン受容体に結合するグルカゴンを阻害し、
    Ｆａｂフラグメントが、以下を備えること
    （ｉ） 軽鎖ＣＤＲＬ１：ＳＡＳＳＳＶＳＹＩＨ （配列番号３）
    （ｉｉ） 軽鎖ＣＤＲＬ２：ＴＴＳＹＬＡＨ （配列番号５）
    （ｉｉｉ）軽鎖ＣＤＲＬ３：ＱＱＲＳＴＬＰＰＴ （配列番号６）
    （ｉｖ） 重鎖ＣＤＲＨ１：ＧＤＤＩＴＳＧＹＨＤ （配列番号１２）
    （ｖ） 重鎖ＣＤＲＨ２：ＹＩＳＹＳＧＳＴＱＹＳＰＳＬＫＳ （配列番号１７）
    （ｖｉ） 重鎖ＣＤＲＨ３：ＰＰＧＹＹＧＦＧＰＹＡＬＤＹ （配列番号２１）
    を特徴とする、Ｆａｂフラグメントまたは当該Ｆａｂフラグメントを備えるヒト化モノクローナル抗体。
  6. Ｆａｂフラグメントがヒト、ラットおよびマウスのグルカゴン受容体に結合可能で、かつ、５０ｎＭ未満のＫｉで各受容体に結合するグルカゴンを阻害するか、あるいは、
    Ｆａｂフラグメントが５０ｎＭ未満のＫｉでカニクイザルのグルカゴン受容体に結合するグルカゴンを阻害し、
    Ｆａｂフラグメントが、以下を備えること
    （ｉ） 軽鎖ＣＤＲＬ１：ＳＡＳＳＳＶＳＹＩＨ （配列番号３）
    （ｉｉ） 軽鎖ＣＤＲＬ２：ＴＴＳＹＬＡＨ （配列番号５）
    （ｉｉｉ）軽鎖ＣＤＲＬ３：ＱＱＲＳＴＬＰＰＴ （配列番号６）
    （ｉｖ） 重鎖ＣＤＲＨ１：ＧＤＤＩＴＳＧＹＨＤ （配列番号１２）
    （ｖ） 重鎖ＣＤＲＨ２：ＹＩＳＹＳＧＳＴＹＹＳＰＳＬＫＳ （配列番号１５）
    （ｖｉ） 重鎖ＣＤＲＨ３：ＰＰＡＹＹＧＦＧＰＹＡＬＤＹ （配列番号２２）
    を特徴とする、Ｆａｂフラグメントまたは当該Ｆａｂフラグメントを備えるヒト化モノクローナル抗体。
  7. Ｆａｂフラグメントがヒト、ラットおよびマウスのグルカゴン受容体に結合可能で、かつ、５０ｎＭ未満のＫｉで各受容体に結合するグルカゴンを阻害するか、あるいは、
    Ｆａｂフラグメントが５０ｎＭ未満のＫｉでカニクイザルのグルカゴン受容体に結合するグルカゴンを阻害し、
    Ｆａｂフラグメントが、以下を備えること
    （ｉ） 軽鎖ＣＤＲＬ１：ＳＡＳＳＳＶＳＹＩＨ （配列番号３）
    （ｉｉ） 軽鎖ＣＤＲＬ２：ＴＴＳＹＬＡＨ （配列番号５）
    （ｉｉｉ）軽鎖ＣＤＲＬ３：ＱＱＲＳＴＬＰＰＴ （配列番号６）
    （ｉｖ） 重鎖ＣＤＲＨ１：ＧＤＤＩＴＳＧＹＨＥ （配列番号１３）
    （ｖ） 重鎖ＣＤＲＨ２：ＹＩＳＹＳＧＳＴＳＹＳＰＳＬＫＳ （配列番号１８）
    （ｖｉ） 重鎖ＣＤＲＨ３：ＰＰＡＹＹＧＦＧＰＹＡＬＤＹ （配列番号２２）
    を特徴とする、Ｆａｂフラグメントまたは当該Ｆａｂフラグメントを備えるヒト化モノクローナル抗体。
  8. Ｆａｂフラグメントが、以下を備えること
    軽鎖可変フレームワーク領域：フレームワーク１（配列番号２３）；フレームワーク２（配列番号２４）；フレームワーク３（配列番号２５）；フレームワーク４（配列番号２６）；および
    重鎖可変フレームワーク領域：フレームワーク５（配列番号２７）；フレームワーク６（配列番号２８）；フレームワーク７（配列番号２９）；フレームワーク８（配列番号３０）
    を特徴とする、請求項１から７のうちいずれか一つに記載のＦａｂフラグメントまたは当該Ｆａｂフラグメントを備えるヒト化モノクローナル抗体。
  9. （ｉ） 配列番号６５の２つの軽鎖および配列番号６６の２つの重鎖；
    （ｉｉ） 配列番号６５の２つの軽鎖および配列番号６７の２つの重鎖；
    （ｉｉｉ）配列番号６５の２つの軽鎖および配列番号６８の２つの重鎖；または
    （ｉｖ） 配列番号６５の２つの軽鎖および配列番号６９の２つの重鎖
    を備えることを特徴とする、ヒト化モノクローナル抗体。
  10. 請求項１から９のうちいずれか一つに記載のＦａｂフラグメントまたは当該Ｆａｂフラグメントを備えるヒト化モノクローナル抗体をコードする核酸配列を備えることを特徴とする、ベクター。
  11. 有効量の請求項１から９のうちいずれか一つに記載のＦａｂフラグメントまたは当該Ｆａｂフラグメントを備えるヒト化モノクローナル抗体および薬学的に受容可能な賦形剤を含む、薬学的組成物。
  12. 請求項１から９のうちいずれか一つに記載のＦａｂフラグメントまたは当該Ｆａｂフラグメントを備えるヒト化モノクローナル抗体を含む、薬剤。
  13. 請求項１から９のうちいずれか一つに記載のＦａｂフラグメントまたは当該Ｆａｂフラグメントを備えるヒト化モノクローナル抗体を含む、ヒトにおけるＩ型糖尿病もしくはＩＩ型糖尿病の治療剤または体重減少の達成用薬剤。
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