PL178685B1 - Cząsteczka DNA kodująca receptor glukagonu lub peptyd receptora glukagonu, konstrukty DNA, komórka gospodarza zawierająca konstrukty DNA, peptyd receptora glukagonu i sposoby wytwarzania receptora glukagonu lub peptydu receptora glukagonu - Google Patents

Abstract

1. Czasteczka DNA kodujaca receptor glukagonu lub peptyd receptora glukagonu, która obejmuje wyizolowana sekwencje nukleotydów wybrana z grupy skladajacej sie z (a) wyizolowanej sekwencji nukleotydów Identyfikatora Sekw Nr 14 od nukleotydu 145 do nukleotydu 1599 lub jej allelicznej odmiany lub sekwencji zdegenerowanej; (b) wyizolowanej sekwencji nukleotydów Identyfikatora Sekw Nr 14 od nukleotydu 226 do nukleotydu 570 lub jej allelicznej odmiany lub sekwencji zdegenerowanej; lub (c) wyizolowanych sekwencji nukleotydowych zdolnych do hybrydyzacji z wymie- nionymi wyizolowanymi sekwencjami nukleotydowymi (a) lub (b) w warunkach wysokiej lub niskiej ostrosci lub sekwencjami komplementarnymi do nich P L 178685 B 1 PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka DNA kodująca receptor glukagonu lub peptyd receptora glukagonu, konstrukt DNA, komórka gospodarza zawierająca ten konstrukt, peptyd receptora glukagonu i sposób wytwarzania receptora glukagonu lub peptydu receptora glukagonu.

Glukagonjest hormonem peptydowym zbudowanym z 29 aminokwasów, produkowanym przez komórki alfa wysepek trzustkowych. Glukagon odpowiedzialny jest za utrzymanie normalnego poziomu glukozy u zwierząt, w tym u człowieka, przez działanie jako hormon działający odwrotnie niz insulina. W szczególności, podczas gdy insulina znana jest ze swego działania gwałtownie zmniejszającego poziom glukozy we krwi, glukagon równoważy to działanie, przyczyniając się do podniesienia poziomu glukozy we krwi.

Współdziałanie glukagonu i insuliny jest bardzo ważne dla utrzymania poziomu glukozy w organizmie. Uważa się, ze zakłócenie równowagi glukagonu lub insuliny odgrywa rolę w kilku chorobach, jak cukrzyca czy cukrzycowa kwasica ketonowa. Zgodnie z tą teorią, stan hiperglikemii w cukrzycy może być spowodowany nie tylko słabą utylizacją glukozy (spowodowaną obniżeniem insuliny), ale także nadprodukcją glukozy spowodowaną podwyższonym stężeniem glukagonu (patrz: Unger, „Diabetes and alphacell”, Diabetes 25: 136-151, 1976; Unger i Orci, „The essential role of glucagon in the pathogenesis of diabetes mellitus”, Lancet 1:14-16,1975).

Ważnym czynnikiem w badaniu glukagonu i jego roli w chorobach, takich jak cukrzyca, jest receptor glukagonu, któiy po związaniu się z glukagonem przekazuje sygnał do komórki, w ten sposób wyzwalając glikogcnolizę (hydrolizę glikogenu) i glukoneogenezę (syntezę glukozy).

Uważa się obecnie, ze w efekcie działania glukagonu pośredniczy po części podwyższenie poziomów wewnątrzkomórkowego cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP). W szczególności związanie się glukagonu z jego receptorem komórkowym aktywuje cyklazę adenylową do produkcji cAMP, i w ten sposób podnosi poziom wewnątrzkomórkowego cAMP. Wzrost wewnątrzkomórkowego cAMP, jak się uważa, powoduje glikogcnolizę i glukoneogenezę, a w konsekwencji wzrost produkcji glukozy przez wątrobę (patrz, Unson i in , „Biological Activities ofdes-His¹ [Glu⁹] Glucagon Amidę, a Glucagon Antagonist”, Peptides 10:11171-1777,1989).

Sugeruje się, jednakże, obecność dodatkowych szlaków metabolicznych, stymulujących glikogenolizę i glukoneogenezę. W szczególności, istnieją doniesienia, ze glukagon wiąze się z receptorem w błonie komórkowej hepatocyta sprzężonym przez białko G z fosfolipazą C. Na skutek stymulacji białko to powoduje rozkład 4,5-bifosforanu fosfatydyloinozytolu do wtórnego przekaźnika jakim jest trifosforan inozytolu i 1,2-diacyloglicerol (patrz. Wakelam i in., Activation of two signal-transduction Systems in hepatocytes by glucagon”, Naturę 323;68-71, 1986; Unson i in., Peptides 10.1171-1177,1989; Pittneri Fain, Biochem. J. 277:371-378,1991). Pobudzenie metabolizmu fosfolipidu inozytolu przez glukagon może być dodatkowym szlakiem metabolicznym, na którym glukagon pobudza glikogenolizę i glukoneogenezę.

Przedmiotem wynalazku są wyizolowane cząsteczki DNA kodujące receptor glukagonu. Pojęcie „wyizolowane cząsteczki DNA” w znaczeniu tu użytym odnosi się do osobnych cząsteczek DNA lub sekwencji, które są same lub sąoddzielone od innych składników. Przykładowo, cząsteczka DNA jest wyizolowana, gdy jest oddzielona od innych cząsteczek DNA, włącznie z innymi sekwencjami chromosomalnymi, z którymi jest naturalnie połączona w genomie, oraz w szczególności gdy jest wolna od innych genów strukturalnych. Wyizolowana cząsteczka DNA może zawierać nie ulegające translacji sekwencje końca 3' i 5', z którymi jest połączona w stanie naturalnym. Receptor glukagonu, który jest kodowany przez DNA, według wynalazku, może być receptorem szczura lub człowieka. W jednym z wykonań niniejszego wynalazku cząsteczka DNA kodująca receptor glukagonu obejmuje sekwencję nukleotydowąo Identyfikatorze Sekw. Nr 14 od nukleotydu 145 do nukleotydu 1599 W innym wykonaniu mniejszego wynalazku cząsteczka DNA koduje receptor glukagonu obejmujący sekwencję aminokwasową o Identyfikatorze Sekw Nr. 15, od metioniny, aminokwasu nr 1, do treoniny, aminokwasu nr 485. W jeszcze innym wykonaniu cząsteczka DNA obejmuje sekwencję nukleotydową o Identyfikatorze Sekw Nr24, od nukleotydu 53 do nukleotydu 1486. W jeszcze innym wykonaniu, cząsteczka DNA koduje receptor glukagonu obejmujący sekwencję aminokwasowąo Identyfikatorze Sekw. Nr: 25, od metioniny, aminokwasu nr 1, do fenyloalaniny, aminokwasu nr 477. Przedmiotem wy

178 685 nalazku są również konstrukty DNA zawierające jako pierwszy segment DNA kodujący receptor glukagonu powiązany z dodatkowymi segmentami DNA potrzebnymi do ekspresji pierwszego segmentu DNA, komórki gospodarza zawierające takie konstrukty DNA, jak również sposoby wytwarzania receptora glukagonu obejmujące etap hodowli komórek-gospodarzy w warunkach powodujących ekspresję segmentu DNA kodującego receptor glukagonu.

Przedmiotem wynalazku są także izolowane peptydy receptora glukagonu. W jednym z wykonań dostarczono wyizolowanego peptydu receptora glukagonu obejmującego sekwencję o Identyfikatorze Sekw. Nr: 15 od glutaminy, aminokwasu nr 28, do tyrozyny, aminokwasu nr 142

Figura 1 przedstawia strukturę reprezentatywnego receptora glukagonu. Symbole użyte: EATD (N-końcowa domena zewnątrzkomórkowa), otoczona linią kropkowaną, CM (błona komórkowa); ED (domena efektorowa), otoczona linią przerywaną; 1ID, pierwsza pętla wewnątrzkomórkowa, 2ID, druga pętla wewnątrzkomórkowa; 3ID, trzecia pętla wewnątrzkomórkowa; C-ID, C-końcowa domena wewnątrzkomórkowa, 1ELD, pierwsza pętla zewnątrzkomórkowa; 2ELD, druga pętla zewnątrzkomórkowa; 3ELD, trzecia pętla zewnątrzkomórkowa, TMD1, pierwsza domena śródbłonowa; TMD2, druga domena śródbłonowa; TMD3, trzecia domena śródbłonowa; TMD4, czwarta domena śródbłonowa; TMD5, piąta domena śródbłonowa; TMD6, szósta domena śródbłonowa, TMD7, siódma domena śródbłonowa.

Figura 2 przedstawia graficznie hydrofobowość szczurzego receptora glukagonu.

Figura 3 przedstawia graficznie wiązanie ¹²⁵I-glukagonu z receptorem glukagonu.

Figura 4 jest analizą Scatcharda prawdopodobnego Kd dla receptorów glukagonu.

Figura 5 jest sekwencją aminokwasową szczurzego receptora glukagonu z zakreślonymi domenami śródbłonowymi.

Jak to wspomniano powyżej niniejszy wynalazek dostarcza wyizolowanych cząsteczek DNA, kodujących receptory glukagonu. W swej natywnej konfiguracji, receptory glukagonu, jak się uważa, występująjako białko związane z błoną, składające się z zewnątrzkomórkowej domeny N-końcowej, jak również z kilku mniejszych wewnętrznych i zewnętrznych domen (patrz, Figura 1) W kontekście niniejszego wynalazku, „receptor glukagonu” odnosi się do takiego białka i podobnych pochodnych. Pochodne obejmująwarianty alleliczne i warianty poddane inżynierii genetycznej, zawierające konserwatywne podstawieniaaminokwasowe i/lub mniej istotne addycje, substytucje czy delecje aminokwasów. Receptory glukagonu, będące przedmiotem mniejszego wynalazku, są zdolne do wiązania glukagonu i przekazywania sygnału dostarczonego przez glukagon komórce. Korzystnie, receptory glukagonu, będące przedmiotem niniejszego wynalazku, są zdolne do wiązania glukagonu z Kd 100 nm lub mniej, jeszcze korzystniej 50 nm lub mniej, i najkorzystniej 33 nm lub mniej. Reprezentatywne testy, które mogą być użyte w celu określenia wiązania glukagonu przez receptor glukagonu opisane sąszczegółowo w przykładach 3 i 6.

Przekazywanie sygnału zwykle zachodzi gdy szlak odpowiedzi aktywowany jest zewnętrznym bodźcem, zwykle choć nie zawsze, bezpośrednio sprzężonym z receptorem związanym z błoną. Szlak odpowiedzi zwykle wywołuje odpowiedzi komórkowe, takie jak wydzielenie macierzy wewnątrzkomórkowej przez zdolne do odpowiedzi linie komórkowe, wydzielenie hormonu, chemotaksję, różnicowanie czy zapoczątkowanie lub zahamowanie podziału komórek W znaczeniu tu użytym związek receptorów ze szlakiem odpowiedzi odnosi się do bezpośredniej aktywacji szlaku odpowiedzi lub przekazania sygnału przez wtórny przekaźnik, jak np. białko G, aktywujący szlak odpowiedzi komórkowej.

Receptory glukagonu mogą używać wielu komórkowych szlaków odpowiedzi, w celu przekazywania do komórki sygnału związania się glukagonu, w tym np. szlaku cyklazy adenylowej i szlaku wapnia wewnątrzkomórkowego. Testy badające aktywność cyklazy adenylowej dobrze znane sąspecjalistom, i obejmująnp. opisany przez Lin i in. (Biochemistry, 14:1559-1563,1975).

Aktywność biologiczną receptora glukagonu można mierzyć sposobem opartym na stężeniu wapnia wewnątrzkomórkowego (patrz, Grynkiewicz i in., J. Biol Chem 260: 3440-3450, 1985), jak również przez użycie systemu reporterowego lucyferazy, który opisano szczegółowo poniżej. Dodatkowo, odpowiedzi biologiczne zachodzące przez szlak trifosforanu inozytolu mogą być określane przez pomiar metabolizmu trifosforanu inozytolu, jak to opisano w publika

178 685 cji Subersa i Nathansona (J Mol. Celi. Cardiol., 20: 131-140, 1988) czy Pittnera i Fain'a (Blochem. J 277:371-378, 1991) Należy zauważyć, ze w kontekście niniejszego wynalazku nie wszystkie szlaki odpowiedzi muszą występować by receptor glukagonu przekazał sygnał do komórki. Przykładowo, niektóre odpowiedzi komórkowe, jak np. zwiększenie poziomów wapnia wewnątrzkomórkowego, mogąbyć wywołane przez związanie glukagonu z jego receptorem pod nieobecność sygnału cAMP czy fosforanu inozytolu.

Izolacja klonów cDNA receptora glukagonu

Jak to odnotowano powyżej, niniejszy wynalazek dostarcza wyizolowanych cząsteczek DNA kodujących receptory glukagonu. Pokrótce, cząsteczki genomowego lub cDNA kodujące receptory glukagonu mogą być uzyskane z bibliotek, które przygotowane zostały z komórek i tkanek zgodnie z procedurami jak ta opisana poniżej i w przykładach. Komórki i tkanki, które mogąbyć użyte w ramach niniejszego wynalazku, mogąbyć uzyskane od różnych ssaków na przykład: ludzi, makaków, bydła, świń, koni, psów, szczurów czy myszy. Najlepszymi komórkami i tkankami, które mogą być użyte są: tkanka tłuszczowa, nerka, trzustka, serce i wątroba

W jednym z aspektów niniejszego wynalazku, szczurzy receptor glukagonu może być wyizolowany i klonowany z wykorzystaniem procedur opisanych poniżej. Pokrótce, wyizolowano poli(A)⁺ RNA ze szczurów szczepu Sprague Dawley, i użyto jako matrycy do syntezy cDNA, jak to opisano przez Houamed i in. {Science 252:1318-1321, 1991), w celu wytworzenia cDNA o pełnej długości. Stworzono bibliotekę, zawierającą około 1 χ 10⁶ klonów, w plazmidzie ekspresyjnym ssaków, drogąklonowania kierowanego cDNA dłuższego niz 800 bp. DNA plazmidowe, przygotowane przez pulowanie z 5000 klonów każde, transfekowano do komórek COS-7, które wybierano i hodowano na szkiełkach mikroskopowych. Transfekowane komórki badano 72 godziny później przez wiązanie ¹²⁵I-glukagonu i radiografię w emulsji (McMachan i in., EMBOJ. 10:2821-2832,1991). Pule pozytywne rozdzielane były dopóki nie wyizolowano pojedynczego klonu. Plazmid uzyskany z pojedynczego klonu, oznaczony pLJ4, zawierający wstawkę o długości ok. 2.0 kb, która kodowała białko składające się z 485 aminokwasów o przewidzianej masie cząsteczkowej rzędu 54962 Da (patrz, Identyfikator Sekw. Nr: 15)

W innym aspekcie niniejszego wynalazku, dostarczono sposobów izolowania i klonowania ludzkiego receptora glukagonu Różnorodne techniki mogą być wykorzystywane włącznie np. z użyciem Reakcji Łańcuchowej Polimerazy („PCR”) w celu amplifikacji sekwencji kodujących receptor glukagonu (przykład 4), które mogąbyć użyte do identyfikacji bibliotek zawierających sekwencje kodujące ludzki receptor glukagonu, i następnie klonowaniem receptora (przykład 5). Szczególnie korzystne strategie klonowania ludzkiego receptora glukagonu zamieszczono poniżej w przykładach 4 i 5. Alternatywnie, można przygotować bibliotekę ekspresyjną zawierającą ludzkie cDNA, z odpowiednich źródeł RNA, jak to opisano w przykładzie 1 i przeglądać, jak to opisano w przykładzie 3, poszukując klonów, w których zachodzi ekspresja do funkcjonowania ludzkiego receptora glukagonu.

Wytwarzanie rekombinowanych receptorów glukagonu

Niniejszy wynalazek dostarcza sposobów wytwarzania rekombinowanych receptorów glukagonu w komórkach gospodarzy zawierających konstrukt DNA składający się z pierwszego segmentu DNA kodującego receptor glukagonu operacyjnie związanego z dodatkowymi segmentami DNA koniecznymi do ekspresj i pierwszego segmentu DNA. Jak to opisano poprzednio, w kontekście niniejszego wynalazku definicja „receptory glukagonu” obejmuje również jego pochodne, które są zasadniczo podobne. Ponadto, receptory glukagonu mogąbyć kodowane przez sekwencje DNA, które sązasadniczo podobne do ujawnionych tu sekwencji DNA W znaczeniu tu użytym, sekwencja DNA jest uznana za „zasadniczo podobną”, gdy: (a) sekwencja DNA uzyskana jest z regionu kodującego naty wnego genu receptora glukagonu (włącznie, przykładowo, z wariantami allelicznymi sekwencji ujawnionej poniżej); (b) sekwencja DNA jest zdolna do hybrydyzacji z sekwencjami DNA według wynalazku w warunkach wysokiej i niskiej swoistości (patrz, Sambrook i in., Molecular Clomng A Laboratory Manuał, wyd. 2., Cold Spring Harbor Laborotiry Press, NY, 1989); lub (c) sekwencja DNA jest zdegenerowana, jako wynik kodu genetycznego, w stosunku do sekwencji DNA zdefiniowanej w (a) lub (b).

178 685

Mutacje w sekwencjach nukleotydowych skonstruowanych w celu ekspresji wariantów receptorów glukagonu, powinny zachowywać ramkę odczytu sekwencji kodującej. Ponadto, mutacje korzystnie me powinny tworzyć regionów komplementarnych, które mogłyby hybrydyzować tworząc struktury drugorzędowe mRNA, jak pętle czy „spinki do włosów”, które mogłyby zakłócać translację mRNA dla receptora. Jakkolwiek, miejsce mutacji może być określone, nie jest konieczne by natura tych mutacji per se była określona. Przykładowo, w celu wyboru optymalnej charakterystyki mutanów w danym miejscu, można przeprowadzić losową mutagenezę określonego kodonu, i badać aktywność biologiczną powstałych mutantów receptora.

Mutacje mogą być wprowadzone w poszczególne loci przez syntetyzowanie oligonukleotydów zawierających sekwencję zmutowaną, otoczoną miejscami restrykcyjnymi, umożliwiającymi ligację do fragmentów natywnej sekwencji. W następstwie ligacji, powstała zrekonstruowana sekwencja koduje pochodną z żądaną insercją, substytucją lub delecją aminokwasów.

Alternatywnie, można użyć kierowanej miejscowo specyficznej mutagenezy, w celu uzyskania zmienionego genu posiadającego kodon zmieniony przez, w zależności od potrzeby, substytucję, delecję lub insercję. Przykładowe metody wprowadzające wspomniane zmiany zamieszczone są w następujących publikacjach: Walder i in. (Gene, 42. 133, 1986); Bauer i in., (Gene, 37 73,1985); Craik (Bio Techniąues, January 1985,12-19); Smith i in., (Genetic Engine ering, Pnnciples and Methods Plenum Press, 1981); Sambrook i in , (j.w.).

Pierwszorzędowa struktura aminokwasowa receptora glukagonu może być również zmieniana przez tworzenie kowalencyjnych lub agregacyjnych koniugatów z innymi ugrupowaniami chemicznymi, takimi jak grupy glikozylowe, lipidy, fosforany, grupy acetylowe lub z innymi białkami i polipeptydami. W kolejnym wykonaniu, receptory glukagonu mogąbyć poddane fuzji z innymi peptydami, co ułatwia oczyszczanie czy identyfikację receptorów glukagonu. Przykładowo, receptor glukagonu może być wytworzony jako białko fuzyjne z sekwencją polipeptydowąFLAG (patrz, U. S., Patent USA nr 4,851,341; patrz również Hopp i in., Bio/Technology 6: 1204, 1988). Sekwencja polipeptydowa FLAG jest wysoce antygenowa i dostarcza epitopu do wiązania ze specyficznym przeciwciałem monoklonalnym, co umożliwia szybkie oczyszczanie rekombmowanego białka. Sekwencja ta jest również specyficznie cięta wołową enterokinazą śluzówkową w miejscu następującym po parze Asp-Lys.

W zależności od potrzeby, mogąbyć wytworzone liczne konstrukty DNA zawierające całą bądź część sekwencji nukleotydowej natywnego receptora glukagonu i jego wariantów, jak omówiono powyżej. W kontekście niniejszego wynalazku, konstrukt DNA odnosi się do cząsteczki DNA lub klonu takiej cząsteczki (jedno-lub dwuniciowej), która została zmieniona przez interwencję człowieka tak, ze zawiera segmenty DNA połączone lub uporządkowane w sposób, w jaki w całości nie występuje w naturze. Konstrukt DNA według wynalazku składa się z pierwszego segmentu DNA kodującego receptor glukagonu operacyjnie związanego z dodatkowymi segmentami DNA koniecznymi do ekspresji pierwszego segmentu DNA. W kontekście niniejszego wynalazku, dodatkowe segmenty DNA obejmują promotory i terminatory transkrypcji i mogą jeszcze obejmować wzmacniacze i inne elementy.

Konstrukty DNA, znane również jako wektory ekspresyjne, mogą również zawierać segmenty DNA niezbędne do ukierunkowania sekrecji interesującego polipeptydu. Takie segmenty DNA mogą zawierać przynajmniej jedną sygnałową sekwencję wydzielniczą. Do korzystnych sekwencji sygnałowych należą: sekwencja sygnałowa glukagonu (sekwencja pre-pro), sekwencja sygnałowa czynnika alfa (sekwencja pre-pro; Kurjan i Herskowitz, Celi 30:933-943, 1982; Kurjani in ,U. S. Patent No. 4,546,082; Brake,EP 116,201); sekwencja sygnałowa PHO5 (Beck i in., WO 86/00637); sekwencja sygnałowa BARI (McKay i in., U S. Patent No 4,613,572; McKay WO87/002670); sekwencja sygnałowa SUC2 (Carlson i in., Mol Celi Biol, 3: 439-447, 1983), sekwencja sygnałowa α-1-antytrypsyny (Kurachi i in., Proc Natl Acad. Sci USA, 78: 6826-6830. 1981), sekwencja sygnałowa inhibitora a-2 plazminy (Tonę i in , J Blochem (Tokyo) 102:1033-1042,1987), sekwencja sygnałowa tkankowego aktywatora plazminogenu(Pennica i in., Naturę 301. 214-221, 1983), sekwencja sygnałowa PhoA E coli (Yuan i in., J Biol Chem , 265 13528-13552, 1990) lub jakakolwiek bakteryjna sekwencja sygnałowa opisana

178 685 przykładowo w publikacji Olivera (Ann. Rev. MicrobioL 39: 615-649, 1985). Alternatywnie, wydzielnicza sekwencja sygnałowa może być zsyntetyzowana zgodnie z zasadami określonymi, przykładowo, przez von Heinje (Eur. J Blochem 133. 17-21, 1983; J Mol Biol 184: 99-105, 1985; Nuc Acids Res 14:4683-4690, 1986).

Wydzielnicze sekwencje sygnałowe mogą być użyte pojedynczo lub w kombinacji. Przykładowo pierwsza wydzielnicza sekwencja sygnałowa może być użyta w kombinacji z sekwencją kodującą trzecią domenę Barriera (opisanąw patencie USA Nr 5,037,243 i umieszczoną tu w całości jako odnośnik). Sekwencja kodująca trzecią domenę Barriera może być ustawiona we właściwej ramce odczytu na końcu 3' interesującej sekwencji DNA lub na końcu 5' segmentu DNA, oraz we właściwej ramce odczytu zarówno z wydzielniczą sekwencją sygnałową i interesującym segmentem DNA.

By umożliwić ekspresję, cząsteczka DNA kodująca receptor glukagonu, wprowadzana) est do odpowiedniego konstruktu DNA, który z kolei użyty jest do transformacji bądź transfekcji komórek gospodarza nadających się do ekspresji Komórka-gospodarz do użycia w wykonaniu niniejszego wynalazku obejmuje komórki ssacze, ptasie, roślinne, owadzie, bakterii i grzybów. Korzystne komórki eukariotyczne obejmują hodowane linie komórek ssaków (np. linie komórkowe gryzoni lub ludzkie) komórki grzybów, włącznie z gatunkami drożdży (np Saccharomyces spp. a zwłaszcza S cerevisiae, Schizosaccharomyces spp czy Kluyveromyces spp.) lub pleśni (np Aspergillus spp Neurospora spp.). Szczepy Schizosaccharomyces cerevisiae są szczególnie użyteczne. Sposoby wytwarzania białek rekombinowanych, z wykorzystaniem różnych komórek prokanotycznych i eukariotycznych, są znane specjalistom (patrz, „Gene Expression Technology”, Methods in Enzymology, vol. 185, Goeddel (ed.) Academic Press, San Diego, Calif., 1990;patrz również, „Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology”, Methods in Enzymology, Gutrie i Fink (eds.) Academic Press, San Diego, Calif., 1991). Generalnie, komórka gospodarz wybrana jest na podstawie jej zdolności do produkowania interesującego białka w dużych ilościach czy zdolności do przeprowadzenia przynajmniej kilku etapów obróbki niezbędnej do aktywności biologicznej białka. W ten sposób zminimalizowana jest liczba sekwencji klonowanego DNA, które muszą być transfekowane do komórki-gospodarza, a maksymalizowany jest całkowity uzysk biologicznie aktywnego białka.

Odpowiednie wektory dla drożdży, do użycia w niniejszym wynalazku, obejmują: YRp7 (Struhl i in., Proc Natl Acad Sci USA, 76: 1035-1039, 1978), YEp 13 (Broach i in., Gene 8' 121-133,1979), wektory POT (Kawasaki i in., U. S. Patent No. 4,931,373, zmieszczony tu jako odnośnik), pJDB249 i pJDB219 (Beggs, Naturę 275: 104-108,1987) i ich pochodne. Wektory te powinny zawierać odpowiedni marker umożliwiający selekcję, który może być jednym z wielu genów o fenotypie dominującym, dlaktórych istniejąodpowiednie metody selekcji rekombinantów. Najkorzystniejsze markery umożliwiające selekcję należą do wspomagających wzrost komórki gospodarza, dostarczając oporności na antybiotyki lub umożliwiające komórce użytkowanie specyficznych źródeł węgla, i obejmuj ąEE772 (Broach i in., ibid) URA 3 (Botsteini in., Gene 8:17,1979), HIS3 (Struhl i in., ibid) czy POT 1 (Kawasaki i in., ibid). Innym odpowiednim markerem jest gen CAT, odpowiadający za oporność komórek drożdży na chloramfenikol.

Korzystne promotory do użycia w drożdżach obejmująpromotory genów glikohtycznych drożdży (Hitzeman i in.,J Biol Chem 255:12073-12080,1980; Alber i Kawasaki, J Mol Appl Genet 1: 419-434, 1982; Kawasaki, U. S. Patent No. 4,599,311) lub geny dehydrogenazy alkoholowej (Young i in., Genetic Engenering of Microorganisms for Chemicals, Hollaender i in. (eds.), str 355, Plenum, New York, 1982; Ammerer, Meth. Enzymol 101· 192-201,1983) Wtym względzie szczególnie korzystny jest promotor ΤΡΙ1 (Kawasaki, Patent USA nr 4,599,311,1986) i promotor ADH2-4^C (Russel i in., Naturę 304: 652-654; Irani i Kilgore, zgłoszenie patentowe USA nr 07/784,653, zamieszczony tu jako odnośnik). Jednostki ekspresji mogą również zawierać terminator transkrypcji. Korzystnym terminatorem transkrypcji jest terminator TPI1 (Alber i Kawasaki, ibid)

Oprócz drożdży białka według wynalazku mogą być wytwarzane w wyniku ekspresji w pleśniach, przykładowo w szczepach Aspergillus (McKnight i in., Patent USA nr 4,935,349, za

178 685 mieszczony tu jako odnośnik). Przykłady odpowiednich promotorów obejmująm. in. uzyskane z genów glikohtycznych Aspergillus nidulans, jak np. promotor ADH3 (McKnight i in., EMBO J. 4: 2093-2099, 1995) i promotor tpiA Przykładem odpowiedniego terminatora jest terminator ADH3 (McKnight i in , ibid, 1985). Jednostki ekspresji, w których stosuje się takie składniki, są sklonowane do wektorów zdolnych do integracji z chromosomalnym DNA Aspergillus'a.

Techniki transformowania grzybów znane są w literaturze, i zostały opisane, przykładowo, przez Beggs (ibid), Hinnen i in., (Proc Natl Acad Sci USA 75: 1929-1933, 1978), Yelton i in , (Proc Natl AcadSci USA 81: 1740-1747, 1984) i Russel (Naturę 301: 167-169, 1983). Genotyp komórek gospodarzy powinien zawierać defekt genetyczny uzupełniany przez marker obecny w wektorze ekspresyjnym. Wybór konkretnego gospodarza i markera znajduje się w zakresie wiedzy specjalisty W celu polepszenia produkcji białka heterologicznego w drożdżach, przykładowo, korzystnie szczep gospodarza posiada mutację taką, jak np. mutacjapep4 (Jones, Genetics 85. 23-33, 1977), która powoduje zmniejszoną aktywność proteolityczną.

Oprócz komórek grzybów, w niniejszym wynalazku mogą być użyte komórki ssaków. Korzystne do zastosowania w niniejszym wynalazku komórki obejmują linie komórkowe COS-1 (ATCC Nr CRL 1650), COS-7 (ATCC Nr CRL 1651), BHK (ATCC Nr CRL 1632) i 293 (ATCC NrCRL 1573, Graham i in.,J. Gen ViroL, 36 59-72,1977) KorzystnąliniąBHKjest liniaBHK 570 (zdeponowana w American Type Culture Collection pod numerem CRL 10314). Dodatkowo, możliwe jest użycie szeregu linii komórkowych ssaków włącznie z komórkami szczura Hepl (ATCC Nr CRL 1600), HepII (ATCC Nr CRL 1548), TCMK (ATCC Nr CCL 139), ludzkiego płuca (ATCC Nr CCL 75.1), ludzkiego wątrobiaka (ATCC Nr HTB052), Hep G2 (ATCC Nr HB 8065), mysiej wątroby (ATCC Nr CCL 29.1), NCTC 1469 (ATCC Nr CCL 9.1), SP2/0-Ag 14 (ATCC Nr 1581), HIT-T15 (ATCC Nr CRL 1777) i RINm 5AHT₂B (Orskov i Nelson, FEBS 229(1): 175-178, 1988).

Wektory ekspresyjne ssaków, do użycia w niniejszym wynalazku, zawierają promotor zdolny do kierowania transkrypcją klonowanego genu lub cDNA. Korzystne promotory obejmują promotory wirusowe i komórkowe. Wirusowe promotory obejmują: bezpośredni wczesny promotor cytomegalowirusa (Boshart i in., Celi 41: 521-530, 1985) i promotor SV40 (Subramani i ΐη.,Λ/ο/ Celi Biol 1.854-864,1981). Komórkowe promotory obejmująmysi promotor metalotioneiny 1 (Palmiter i in.,PatentUSANr4,579,821), mysi promotor V_k (Bergman i in , ProcNatl AcadSci USA 81:7041-7045, 1983; Grant i in., Nuc Acids Res 15:5496, 1987) i mysi promotor V_H (Loh i in., Celi 33 85-93,1983). Szczególnie korzystnym jest główny późny promotor Adenowirusa 2 (Kaufman i Sharp, Mol Celi Biol 2:1304-13199,192) Wektory te mogą zawierać zestaw miejsc do składowania RNA położonych poniżej promotora i powyżej sekwencji DNA kodującej interesujący peptyd czy białko. Korzystne miejsca składania RNA mogą być uzyskane z adenowirusów i/lub genów immunoglobulin. W wektorze ekspresyjnym umiejscowiony jest również sygnał poliadenylacji, poniżej sekwencji kodującej. Odpowiednie sygnały poliadenylacji obejmują wczesny i późny sygnał poliadenylacji z SV40 (Kaufman i Sharp, ibid), sygnał poliadenylacji z regionu E1B Adenowirusa 5 i terminatora ludzkiego genu hormonu wzrostu (DeNoto i ϊά., Nuc Acids Res 9: 3719-3730,1981). Wektor ekspresyjny może zawierać wirusową niekodującąsekwencję liderową, jak np. trzyczęściowy lider adenowirusa 2, połozonąpomiędzy promotorem i miejscami składania RNA. Korzystne wektory mogą zawierać sekwencje wzmacniaczy, jaknp. wzmacniacz SV40 i mysi wzmacniacz μ(Gillies, Cell33: 717-728,1883). Wektory ekspresyjne mogą zawierać również sekwencje kodujące adenowirusowe VA RNA. Odpowiednie wektory mogą być uzyskane komercjalnie (np Stratagene, La Jolla, CA).

Klonowane sekwencje DNA mogą być wprowadzone do hodowanych komórek ssaków przez, przykładowo, transfekcję z użyciem fosforanu wapnia (Wigier i in , Celi 14· 725, 1978, Corsaro i Pearson, Somatic Celi Genetics 7: 609, 1981; Graham i Van der Eb, Yirology 52 456, 1973), elektroporację (Neumann i in., EMBO J 1: 841-845, 1982) czy transfekcję z użyciem DEAE-dekstranu (Ausubel i in., (eds), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987), które są zamieszczone tu jako odnośniki. W celu identyfikacji komórek, które na stałe zintegrowały klonowane DNA, wprowadza się wraz z interesującym genem lub

178 685 cDNA marker umożliwiający selekcję Korzystny marker do użycia w hodowanych komórkach ssaków obejmuje geny odpowiedzialne za oporność na leki jak neomycyna, higromycyna i metotreksat Marker umożliwiający selekcję, powinien być markerem zdolnym do amplifikacji. Korzystnym markerem zdolnym do amplifikacji jest gen DHFR i gen oporności na neomycynę. Markery umożliwiające selekcję opisane zostały przez Thilly (Mammalian Celi Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA, zamieszczone tu jako odnośnik). Wybór odpowiedniego markera leży w zakresie wiedzy specjalisty.

Markery umożliwiające selekcję mogą być wprowadzane do komórki w osobnym wektorze w tym samym czasie co sekwencje receptora glukagonu, lub mogą być wprowadzane na tym samym wektorze. W przypadku użycia tego samego wektora marker i sekwencja receptora glukagonu mogą znajdować się pod kontrolą różnych promotorów lub tego samego promotora, powodując powstanie transkryptu dicistronowego. Konstrukcje tego typu znane są specjalistom (przykładowo, Levinson i Simonsen, Patent USA Nr 4,713,339). Mozę być korzystne dodanie do mieszaniny wprowadzanej do komórki, dodatkowego DNA znanego jako „DNA nośnikowe”.

Transfekowanym komórkom ssaków należy umożliwić wzrost przez pewien okres, zwykle 1-2 dni, w celu rozpoczęcia ekspresji interesujących sekwencji DNA. Selekcja pod kątem leku dokony wanajest w celu umożliwienia dalszego wzrostu komórkom ekspresjonującym marker w sposób stały. W przypadku komórek transfekowanych markerem umożliwiającym selekcję zdolnym do amplifikacji, można zwiększać stężenie leku etapowo, w celu selekcji zwiększonej liczby kopii klonowanej sekwencji, a zatem zwiększonego poziomu ekspresji Komórki ekspresjonujące wprowadzone sekwencje są wybierane i badane na produkcję interesującego białka w pożądanej formie czy na pożądanym poziomie. Komórki, które spełniają te kryteria mogą być dalej klonowane i rozhodowywane do produkcji.

Korzystnymi prokariotycznymi gospodarzami, do użycia w celu wykonania niniejszego wynalazku, są szczepy Escherichia coli, jednakże Bacillus czy inne rodzaje są również użyteczne. Techniki transformowania tych gospodarzy i ekspresjonowania obcych sklonowanych sekwencji DNA, są dobrze znane specjalistom (patrz, np. Maniatis i in., Molecular Cloning A Laboratory Manuał, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, załączony tu jako odnośnik); czy Sambrook i ΐη.,γ.νν.) Wektory używane do ekspresji klonowanych sekwencji DNA w gospodarzach bakteryjnych zwykle zawierają marker umożliwiający selekcję, jak np. geny oporności na antybiotyki, i promotory działające w komórce gospodarza. Odpowiednie promotory obejmują systemy promotora trp (Nicholas i Yanofsky, Meth. Enzymol 101: 155-164, 1983), lac (Casadaban i in., J Bacteriol 143: 971-980,1980) i fagaX (Queen,J. Mol. Appl Genet 2:1-10,1983). Plazmidy użyteczne do transformowania bakterii obejmują pBR322 (Bolivar i in., Gene 2: 95-113, 1977), plazmidy pUC (Messing, Meth Enzymol 101: 20-78, 1983; Vieira i Messing, Gene 19’ 259-268, 1982), pCQV2 (Queen, ibid) oraz ich pochodne. Plazmidy mogą zawierać zarówno sekwencje bakteryjne jak i wirusowe.

Na podstawie danych tu wskazówek, promotory, terminatory i sposoby na wprowadzenie wektorów ekspresyjnych kodujących receptory glukagonu do komórek roślinnych, ptasich i owadów stająsię oczywiste dla specjalisty. Użycie bakulowirusów, przykładowo, jako wektorów do ekspresji heterologicznych sekwencji DNA w komórkach owadów opisane zostało przez Atkinsoni in. (Pestic Sci 28: 215-224,1990). Dodatkowo, użycie Agrobacterium rhizogenes jako wektora do ekspresji genów w komórkach roślinnych opisane zostało przez Sinkar i in. (J Biosc (Bangalore) 11: 47-58, 1987).

Komórki-gospodarze, zawierające konstrukt DNA, będący przedmiotem niniejszego wynalazku, sąhodowanc w celu ekspresji segmentu DNA kodującego receptor glukagonu. Komórki hodowane są zgodnie z metodami standardowymi w pożywkach hodowlanych zawierających substancje odżywcze potrzebne do wzrostu wybranych komórek. Liczne odpowiednie pożywki znane są specjalistom, i zawierają zwykle: źródło węgla, źródło azotu, niezbędne aminokwasy, witaminy i sole mineralne, jak również inne składniki np.\ czynniki wzrostowe czy surowicę, co może być niezbędne dla niektórych komórek. Pożywka powinna zwykle selekcj ono wać komórki zawierające konstrukt DNA, przez przykładowo, selekcję pod kątem leku lub braku niezbędnej

178 685 substancji, co jest zapewniane przez marker umożliwiający selekcję, znajdujący się na konstrukcie DNA lub kotransfekowany wraz z konstruktem DNA.

Odpowiednie warunki hodowli komórek drożdży obejmują hodowlę w pożywce o zdefiniowanym składzie, zawierającej źródło azotu, które może być źródłem nieaminokwasowym lub wyciągiem z drożdży, sole nieorganiczne, witaminy i niezbędne aminokwasy w temperaturze pomiędzy 4°C a 37°C, a zwłaszcza w temperaturze 30°C. pH pożywki, najkorzystniej, utrzymywane jest w granicach pomiędzy 2 a 8, a zwłaszcza w okolicy pH 5-6. Sposoby utrzymywania stałego pH obejmująbuforowanie i stałąkontrolę pH. Korzystnym czynnikiem do kontrolowania pH jest wodorotlenek sodu. Korzystnymi czynnikami buforującymi są kwas bursztynowy i BisTris (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Z powodu dążności drożdży do hiperglikozylacji białek heterologicznych korzystne jest by ekspresjonować receptor glukagonu, będący przedmiotem niniejszego wynalazku, w komórkach drożdży posiadających defekt genu niezbędnego doglikozylacji asparaginy. Komórki te rosną najchętniej w pożywce zawierającej stabilizator osmotyczny. Korzystnym stabilizatorem osmotycznymjest sorbitol dodany do pożywki w stężeniu pomiędzy 0 1 M a 1 5 M, zaś najkorzystniej w stężeniu między 0.5 a 1.0 M. Hodowane komórki ssaków zwykle hodowane są w dostępnych w handlu pożywkach zawierających surowicę lub bezsurowiczych. Wybór pożywki i warunków odpowiednich dla poszczególnej linii komórkowej leży w zakresie wiedzy specjalisty.

Receptory glukagonu mogą być również ekspresjonowane w niebędących człowiekiem zwierzętach transgenicznych a zwłaszcza transgenicznych zwierzętach ciepłokrwistych. Sposoby tworzenia zwierząt transgenicznych obejmujących myszy, szczury, króliki, owce i świnie znane są specjalistom i zamieszczone są, przykładowo, w Hammer i in {Naturę, 315: 680-683, 1985), Palmiter i in {Science, 222: 809-814, 1983), Brister i in. {Proc Natl Acad Sci USA 82: 4438-4442), Palmiter i Brister {Celi 41: 343-345,1985) i Patent USA Nr 4,736,866, zamieszczonym tu jako odnośnik. Pokrótce, jednostkę ekspresyjną, zawierającą sekwencję DNA, która ma ulec ekspresji, wraz z odpowiednio położonymi sekwencjami kontrolującymi ekspresję, wprowadza się do przedjądrzy zapłodnionych komórek jajowych. Zwykle wprowadzenia DNA dokonuje się przez mikroiniekcję. Integrację wstrzykniętego DNA bada się przez analizę DNA z fragmentów tkanki, zwykle przez próbkę pobraną z ogona. Jest zwykle korzystne wprowadzenie DNA do linii komórek macierzystych zwierzęcia tak by przeniósł się on na jego potomstwo.

W najkorzystniejszym wykonaniu niniejszego wynalazku, zwierzę transgeniczne, jak mysz tworzy się przez wprowadzenie mutacji mszczącej sekwencję receptora glukagonu {patrz, Mansour i in., „Disruption of the protooncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a generał strategy fo targeting mutations to non-selectable genes”. Naturę 336: 348-352,1988). Zwierzęta takie mogą być używane jako model do badania roli receptora glukagonu w metabolizmie.

Peptydy receptora glukagonu

Jak to wspomniano powyżej niniejszy wynalazek dostarcza również peptydów receptora glukagonu. W kontekście niniejszego wynalazku, przez peptydy receptora glukagonu rozumie się peptydy zawierające części receptora glukagonu lub jego pochodnych opisanych powyżej, nie zawierających domen śródbłonowych, i które są długości przynajmniej 10 aminokwasów. Pokrótce, struktura receptora glukagonu jak również domniemanych domen śródłonowych, może być przewidziana z pierwotnego produktu translacji przy użyciu, przykładowo, funkcji wykresu hydrofobowości oprogramowania jak P/C Gene czy Intelligenetics Suitę (Intelligenetics, Mt. View, CA), lub zgodnie z metodami opisanymi przez Kyte i Doolitle {J Mol Biol 157 105-132, 1982) Wykres hydrofobowości szczurzego receptora glukagonu przedstawiono graficznie na figurze 2. Abstrahując od graficznego przedstawienia, w oparciu o tę analizę hydrofobowości, uważa się, ze receptory glukagonu posiadają ogólną strukturę pokazaną na figurze 1. W szczególności, uważa się, ze receptory te zawierają zewnątrzkomórkową domenę N-końcową trzy zewnątrzkomórkowe pętle i cztery wewnątrzkomórkowe, wszystkie oddzielone od siebie domenami śródbłonowymi

Wjednym z aspektów mniejszego wynalazku, dostarczony jest izolowany peptyd receptora glukagonu obejmujący zewnątrzkomórkowądomenę N-końcowąreceptora glukagonu W ko

178 685 rzystnym wykonaniu, dostarczony jest izolowany peptyd receptora glukagonu obejmujący sekwencję aminokwasową Identyfikatora Sekw. Nr: 15 od glutaminy, aminokwasu 28, do tyrozyny, aminokwasu nr 142. Dostarczone są również inne izolowane peptydy receptora glukagonu które mogąbyć wybrane spośród domen pętli zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych receptora glukagonu (patrz, figury 11 5). W jednym z wykonań, peptydy receptora glukagonu wybrane są spośród grupy składającej się z 1ID (Identyfikator Sekw. Nr: 15, od lizyny, nr 169, do histydyny, nr 178), 1ELD (Identyfikator Sekw. Nr: 15, od tyrozyny, nr 203, do izoleucyny, nr 231), 2ID (Identyfikator Sekw. Nr: 15 od fenyloalaniny, nr 259, do seryny, nr 266), 2ELD (Identyfikator Sekw. Nr: 15, od waliny, nr 293, do izoleucyny, nr 307), 3ID (Identyfikator Sekw. Nr: 15 od leucyny, nr 334, do lizyny, nr 345), i 3ELD (Identyfikator Sekw. Nr: 15 kwasu asparaginowego, nr 371, do seryny nr 380).

Peptydy receptora glukagonu, będące przedmiotem niniejszego wynalazku, mogąbyć wytworzone z użyciem technik rekombinacji jak to opisano powyżej, lub metodami syntetycznymi oraz mogąbyć oczyszczane jak to opisano poniżej.

Oczyszczanie peptydów receptora glukagonu

Izolowane peptydy receptora glukagonu mogąbyć wytworzone, obok innych metod, przez hodowlę odpowiednich układów gospodarz/- wektor, w celu wytworzenia rekombinowanych produktów translacji według wynalazku. Nadsącza z tych linii komórkowych mogąbyć poddane różnym procedurom oczyszczania w celu izolacji peptydów receptora glukagonu. Przykładowo, nadsącz może być najpierw zagęszczony przy użyciu dostępnych w handlu filtrów do zagęszczania białek, jak np. jednostki do ultrafiltracji Amicon czy Millipore. W następstwie zagęszczenia, koncentrat może być nałożony na odpowiednie podłoże do oczyszczania, przykładowo glukagon lub przeciwciało przeciwko receptorowi glukagonu, związane z odpowiednim podłożem. Alternatywnie, można użyć żywic anionowych lub kationowych w celu oczyszczenia receptora lub peptydu. Na koniec, można użyć jednego lub więcej etapów wysokosprawnej chromatografii cieczowej (RP-HPLC) by dalej oczyścić peptydy receptora glukagonu.

Peptyd receptora glukagonu uważany jest za”wyizolowany” lub oczyszczony, w kontekście niniejszego wynalazku, jeżeli w wyniku analizy na żelu SDS-poliakrylamidowym a następnie barwienia błękitem Coomasie, widoczny jest wyłącznie jeden pojedynczy prążek.

Receptory glukagonu, włącznie z ich pochodnymi, jak również części i fragmenty tych białek, takie jak peptydy receptora glukagonu, opisane powyżej, mogąbyć użyte do wytworzenia przeciwciał, które wiąząsię specyficznie z receptorem glukagonu. W kontekście niniejszego wynalazku pojęcie „przeciwciała” obejmuje przeciwciała poliklonalne, przeciwciała monoklonalne, ich fragmenty, takie jak fragmenty F(ab')₂ i Fab, jak również partnerów wiązania wytworzonych drogą rekombinacji. Ci partnerzy wiązania obejmują regiony zmienne genu pochodzące od genu kodującego specyficzne przeciwciało monoklonalne. Przeciwciała określa się jako wiązące specyficznie, gdy wiązą receptor glukagonu z K_a większą lub równą 10⁷ M¹.

Powinowactwo przeciwciała monoklonalnego lub jednołańcuchowego białka wiązącego antygen może być określone jednym ze sposobów znanych specjalistom (patrz, Scatchard, Ann. N.Y., Acad. Sci. 51: 660-672, 1949).

Przeciwciała poliklonalne mogąbyć wywołane jednym ze znanych sposobów, u zwierząt ciepłokrwistych jak konie, krowy, osły, kurczęta, myszy czy szczury.

Pokrótce, receptora glukagonu używa się do immunizacji zwierzęcia przez wstrzyknięcia dootrzewnowe, domięśniowe, dooczne lub podskórne. Immunogenność receptora glukagonu lub peptydów receptora glukagonu może być zwiększona przez użycie adiuwantu, takiego jak kompletny lub niekompletny adiuwant Freunda. Po kilku immunizacjach przypominających, próbki surowicy są zbierane i badane na aktywność w stosunku do receptora glukagonu. W celu wykrycia przeciwciał wiązących się specyficznie z receptorem glukagonu, można użyć wielu różnych testów Przykładowe testy opisane są szczegółowo w Antibodies: A Laboratory Manuał, Harlow i Lane (eds.), Cold Sprring Harbor Laboratory Press, 1988. Reprezentatywnymi przykładami są: Immunoelektroforeza Przeciwprądowa (CIEP), Testy Radioimmunologiczne, Radioimmunoprecypitacje, Enzymatyczne Testy Immunosorpcyjne (ELISA), testy typu Dot

178 685

Biot, testy Zahamowania lub Współzawodnictwa i testy kanapkowe (patrz, Patent USA Nr4,376,11014,436,530;patrz również Antibodies A Laboratory Manuał). Szczególnie korzystne są surowice poliklonalne, dające sygnał przynajmniej trzykrotnie przewyższający tło. Gdy miana przeciwciał zwierzęcia osiągnąplateau, w sensie ich reaktywności z receptorem glukagonu, większe ilości surowicy poliklonalnej mogą być uzyskane drogą bądź cotygodniowego skrwawiama, bądź wykrwawienia zwierzęcia.

Przeciwciała monoklonalne mogą być wytworzone przy użyciu dobrze znanych technik (patrz, Patent USA Nr RE 32,001,4,902,614, 4,543,439 i 4,411,993;patrz również, Monoclonal Antibodies A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKeam i Bechtol (eds.), 1980, i Antibodies A Laboratory Manuał, Harlow i Lane (eds ), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Pokrótce, w jednym z wykonań zwierzęciu doświadczalnemu, takiemu jak szczur czy mysz wstrzykuje się postać receptora glukagonu odpowiednią do wywołania odpowiedzi odpornościowej przeciwko receptorowi glukagonu. Reprezentatywne przykłady odpowiednich postaci obejmują, m. in : komórki, w których zachodzi ekspresja receptora glukagonu, lub peptydy oparte na sekwencji receptora glukagonu Ponadto, jest wiele znanych technik zwiększających wynikłą odpowiedź odpornościową przykładowo, przez związanie receptora lub peptydów receptora z innym białkiem jak albumina jaja kurzego czy hemocyjanina (KLH), lub przez użycie adiuwantów, takich jak kompletny czy niekompletny adiuwant Freunda. Wstępna immunizacja może odbyć się drogą dootrzewnową domięśniową doocznączy podskórną.

Pomiędzy jednym a trzema tygodniami od wstępnej immunizacji, zwierzę może być powtórnie immunizowane następną dawką przypominającą. Zwierzę może zostać skrwawione a surowica zbadana na wiązanie z receptorem glukagonu przy użyciu testów opisanych powyżej. Mogą być wykonane dodatkowe immunizacje dopóki zwierzę nie ustabilizuje się pod względem reaktywności w stosunku do receptora glukagonu. Można wtedy podać zwierzęciu końcową immunizację przypominającą receptor glukagonu lub peptyd receptora glukagonu, po czym uśmiercić zwierzę trzy do czterech dni później. W tym czasie można pobrać śledzionę i węzły chłonne i rozdrobnić je do zawiesiny jednokomórkowej przez przepuszczenie narządów przez sito lub przez przerwanie osłonek śledziony i węzłów chłonnych, otaczających komórki. W jednym z wykonań krwinki czerwone poddaje się lizie przez dodanie roztworu hipotonicznego, po którym następuje natychmiastowe wyrównanie izotoniczności.

W innym wykonaniu, odpowiednie komórki do wytworzenia przeciwciał monoklonalnych są uzyskane przez użycie techniki immunizacji in vitro. Pokrótce, zwierzę zabija się i pobiera się śledzionę i węzły chłonne Przygotowuje się zawiesinę jednokomórkową! umieszcza komórki w hodowli zawierającej postać receptora glukagonu odpowiednią do wywołania odpowiedzi odpornościowej, jak to opisano powyżej. Następnie, limfocyty pobiera się i poddaje fuzji, jak to opisano poniżej.

Komórki uzyskane drogą immunizacji in vitro, lub od immunizowanych zwierząt, jak to opisano powyżej, mogą być unieśmiertelnione przez transfekcję odpowiednim wirusem, takim jak wirus Epsteina-Barr (EBV) (patrz, Glasky i Reading, Hybridoma 8(4). 377-389,1989). Alternatywnie, w korzystnym wykonaniu, zawiesiny zebranych komórek śledziony i/lub węzłów chłonnych poddaje się fuzji z odpowiednimi komórkami szpiczaka w celu wytworzenia „hybrydoma”, która wydziela przeciwciała monoklonalne. Odpowiednie linie szpiczaka korzystnie są defektywne pod względem konstrukcji lub ekspresji przeciwciał i są dodatkowo synergiczne z komórkami immunizowanego zwierzęcia. Wiele takich linii szpiczakajest znanych specjalistom i można je uzyskać z takich źródeł jak American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, (patrz, Catalogue ofCeli Lines 8cHybndomas, wydó ATCC, 1988). Reprezentatywne linie szpiczaka obejmują dla ludzi, UC 729-6 (ATCC Nr CRL 8061), MC/CAR-Z2 (ATCC Nr CRL 8147), i SKO-007 (ATCC Nr CRL 8033); dla myszy, SP2/0-Agl4 (ATCC Nr CRL 1581), i P3X63Ag8 (ATCC Nr TIB 9), oraz dla szczurów Y3-Agl 2 3. (ATCC Nr CRL 1631) i YB2/0 (ATCC Nr CRL 1662). Szczególnie korzystne linie to NS-1 (ATCC Nr TIB 18) i P3X63Ag8.653 (ATCC Nr CRL 1580), które mogą być użyte do fuzji z komórkami myszy, szczura czy człowieka. Fuzja pomiędzy linią komórek szpiczaka i komórkami od zwierzęcia immunizowanego może

178 685 być wykonana wieloma sposobami, włącznie z użyciem glikolu polietylenowego (PEG) (patrz, Antibodies A Laboratory Manuał, Harlow i Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988) czy elektrofuzję (patrz Zimmerman i Vienken, J Membranę Biol 67: 165-182, 1982).

Po fuzji komórki umieszcza się na płytkach hodowlanych zawierających odpowiedniąpozywkę, jak RPMI 1640 czy DMEM (Dulbecco's Modified Eagles Medium) (JHR Biosciences, Lenexa, Kan.). Pożywka może zawierać również dodatkowe składniki jak Surowica Płodowa Bydlęca (FBS, np. z HyClone, Logan, Utah, lub JRH Biosciences), tymocyty uzyskane od osesków zwierząt tego samego gatunku co użyty do immunizacji, lub agar w celu utwardzenia pożywki. Dodatkowo, pożywka powinna zawierać odczynnik, który w sposób selektywny umożliwia wzrost splenocytó w poddanych fuzji ze szpiczakiem. Szczególnie korzystne jest użycie HAT (hipoksantyna, aminopteryna i tymidyna) (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri). Po około siedmiu dniach powstałe po fuzji komórki czy hybrydomy, mogą być badane w celu stwierdzenia obecności przeciwciał rozpoznających receptor glukagonu. W następstwie kilkakrotnego rozcieńczania klonującego i powtórnego badania, można wyizolować hybrydoma produkującą przeciwciało monoklonalne, które wiąze receptor glukagonu.

Możliwe jest również zastosowanie innych technik w celu uzyskania przeciwciał monoklonalnych (patrz, William D. Huse i in., „Generation of Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lamda”, Science 246: 1275-1281, Grudzień 1989, patrz również, L. Sastry i in , „Cloning of the Immunological Repertoire in Eschenchia coli for Generation of Monoclonal Catalytic Antibodies: Construction of Heavy Chain Variable Region - Specific cDNA Library”, Proc Natl Acad Sci USA 86: 5728-5732, Sierpień 1989; patrz również, Michelle Alting-Mees i in., „Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Altemative to Hybridomas”, Strategies inMolecular Biology3:1-9, Styczeń 1990; odnośniki te opisujądostępny w handlu system firmy Stratacyte, La Jolla, Califomia, umożliwiający produkcję przeciwciał technikami rekombinacji.) Pokrótce, izoluje się mRNA z populacji limfocytów B i używa się do utworzenia bibliotek cDNA wyrażających ciężkie i lekkie łańcuchy immunoglobulin w wektorach ZIMMUNOZAP(H) i ZIMMUNOZAP(L). Wektory te mogą być przeglądane indywidualnie lub koekspresjonowane w celu wytworzenia fragmentów Fab lub przeciwciał (patrz, Huse i in.,/. w.; patrz również, Sastry i in.,j.w.). Pozytywne łysinki mogą być następnie zamieniane w plazmid nie wywołujący lizy, który umożliwia ekspresję na wysokim poziomie fragmentów przeciwciał monoklonalnych w E coli.

Podobnie, partnerów wiązących można także konstruować z użyciem technik rekombinacji DNA, w celu wbudowania regionów zmiennych genu kodującego specyficznie wiązące przeciwciało. Konstrukcja tych białek może być wykonana, zgodnie ze znanymi sposobami (patrz, James W. Larrick i in., „Polymerase Chain Reaction Using Mixed Primers: Cloning of Humań Monoclonal Antibody Variable Region Genes from Single Hybridoma Cells”, Biotechnology 7: 934-938, Wrzesień 1989, Riechmann i in., „Reshaping Humań Antibodies for Therapy”, Naturę 332:323-327,1988; Roberts i in., „Generation of an Antibody with Enhanced Affinity and Specificity for its Antigen by Protein Engineering”, Naturę 328. 731 -734,1987; Verhoeyen i in., „Reshaping Humań Antibodies: Grafting an Lysosyme Activity”, Science 239: 1534-1536, 1988; Chaudhary i in., „A Recombinant Immunotoxin Consisting of Two Antibody Variable Domains Fused to Pseudomonas Exotoxin”, Naturę, 339: 394-397, 1989; patrz także, U.S. Patent No. 5,132,405 zatytułowany „Biosynthetic Antibody Binding Sites”).

Segmenty DNA kodującego domeny wiązące swoiste wobec receptora glukagonu amplifikowano z hybrydoma produkującymi przeciwciało monoklonalne wiązące specyficznie, i wprowadzono bezpośrednio do genomu komórki produkującej ludzkie przeciwciała (patrz, Verhoeyen i in.j w; patrz również, Reichmann i in.,y w). Technika ta umożliwia przeniesienie miej sca wiązącego antygen mysiego lub szczurzego wiązącego specyficznie przeciwciała monoklonalnego, do przeciwciała ludzkiego. Przeciwciało takie jest korzystne do zastosowań leczniczych u ludzi ponieważ nie jest tak antygenowe jak przeciwciała szczurze czy mysie.

Alternatywnie, miejsce wiązące antygen (region zmienny) może być połączone z lub wprowadzone do innego całkiem odmiennego białka (patrz, Chaudhary i in.,j w), co daje nowe

178 685 białko z miejscem wiązącym antygen przeciwciała jak również aktywnością całkiem innego białka Jak wiadomo, miejsce wiązące antygen czy domena wiązącareceptor glukagonu znajduje się w regionie zmiennym przeciwciała. Mogąbyć także wykorzystane sekwencje DNA kodujące małe części przeciwciała czy regionów zmiennych, które wiązą się specyficznie z receptorem glukagonu ssaków Części te można łatwo badać na wiązanie się z receptorem glukagonu z wykorzystaniem testów opisanych poniżej.

Receptor glukagonu wytwarzany sposobem według wynalazku może być wykorzystany do wykrywania obecności antagonistów glukagonu sposobem, który obejmuje etapy (a) ekspozycji związku w obecności agonistów glukagonu na rekombinowany receptor glukagonu związany ze szlakiem odpowiedzi w warunkach i w czasie wystarczającym do związania się związku z receptorem i związanym z nim szlakiem odpowiedzi, (b) wykrycia zmniej szenia pobudzenia szlaku odpowiedzi wynikającego ze związania się związku z receptorem glukagonu, względem pobudzenia szlaku odpowiedzi przez samego agonistę glukagonu i stąd stwierdzenie obecności antagonisty glukagonu.

Agoniści glukagonu obejmują cząsteczki (włącznie z samym glukagonem) zdolne do związania się z receptorem glukagonu i które pobudzają szlak odpowiedzi w komórce.

Z użyciem tych sposobów można badać różnorodne związki Reprezentatywne przykłady obejmująprzeciwciała blokujące opisane powyżej, peptydy receptora glukagonu i analogi glukagonu (obejmujące zarówno hgandy peptydowe jak i nie peptydowe). Przykładowo opis patentowy USA nr 07/741,931 dostarcza sposobów produkcji znacznej liczby analogów glukagonu przy użyciu spulowanych sekwencji DNA kodujących te analogi. Pule te kodujące analogi glukagonu mogąbyć wytworzone przez mutagenezę wysycającą sekwencji DNA kodującej glukagon (n p Little Gene 88 113-115; Hambers i in., Gene 88: 143-151, 1989), przez ukierunkowaną na segment mutagenezę (np Shortle i in., Proc Natl AcadSci USA 77: 5375-5379, 1980) przez forsowane błędne wbudowywanie nukleotydów (n.p. Liao i Wise Gene 88: 107-111, 1990) lub przez użycie losowo mutagenizowanych oligonukleotydów (Hutchinson i in., Proc Natl AcadSci USA 83: 710-714, 1986) Pojedyncze transformanty ekspresjonujące analogi glukagonu mogąbyć klonowane jak to opisano powyżej lub pulowane.

Związki eksponowane są na rekombinowany receptor glukagonu w obecności agonistów glukagonu w warunkach i w czasie wystarczającym do związania się związku z receptorem i wywołania odpowiedzi przez ten szlak. Warunki i czas odpowiedni do związania się antagonisty glukagonu z receptorem mogą zmieniać się w zależności od źródła receptora, ale warunki odpowiednie do związania zwykle obejmują: temperaturę pomiędzy 4°C i 55°C w roztworze buforu pomiędzy 0 i 2 MNaCl, korzystnie pomiędzy 0 i 0,9 MNaCl, a szczególnie korzystnie w roztworze 0,1 M NaCl, przy pH w zakresie 5-9, a korzystnie 6,8-8. Czas odpowiedni do związania i wywołania odpowiedzi zwykle jest w zakresie 5-15 minut od ekspozycji.

Gdy związek eksponuje się na rekombinowany receptor glukagonu w obecności agonisty glukagonu, w warunkach i w czasie wystarczającym do związania się związku z receptorem, można wykryć zmniejszenie pobudzenia szlaku odpowiedzi jeżeli związek współzawodniczy z agonistami glukagonu o rekombinowany receptor glukagonu. Szlak odpowiedzi może być szlakiem odpowiedzi związanej z błoną cyklazy adenylowej, zaś etap wykrywania obejmuje pomiar zmniej szenia cAMP przez szlak związanej z błonącyklazy adenylowej, w stosunku do produkcji cyklicznego AMP w obecności samego glukagonu. Korzystnie zmniejszenie pobudzenia szlaku odpowiedzi jest równe lub większe od zmniejszenia związanego z des-His¹ -glukagonem. Testy aktywności cyklazy adenylowej mogąbyć wykonane, przykładowo, z użyciem sposobu opisanego przez Lin i in (Biochem. 14: 1559-1563,1975), i opisanego w przykładach Metody te mierzą poziom pobudzenia cAMP w stosunku do natywnego glukagonu, i obejmują zwykle ekspozycję preparatu komórek, które ekspresjonują aktywny biologicznie rekombinowany receptor glukagonu, na mieszaninę glukagonu i badanego związku w obecności znakowanego radioaktywnie ATP.

Alternatywnie, produkcję cAMP można mierzyć przy użyciu sposobów znanych specjalistom, obejmujących, przykładowo, metody opisane przez Salomon i in. (Anal. Biochem. 58 541-548, 1976) czy Krishna i in. (J Pharmacol. Exp. Ther 163: 379, 1986) lub korzystnie przy

178 685 użyciu dostępnych w handlu zestawów, takich jak Scintillation Proximity Assay Kit f-my Amersham Corporation. Scintillation Proximity Assay Kit mierzy produkcje cAMP przez współzawodnictwo jodowanego cAMP z przeciwciałem anty-cAMP. Szczególnie korzystne receptory glukagonu mają w tym teście aktywność biologiczną ED₅₀ (Dawka Efektywna wywołująca 50% odpowiedzi) mniejszą niz 1 nM, korzystniej ED₅₀ mniejszą niz 0.7 nM, zaś najkorzystniej mniejszą mz 0.25 nM.

Szlak odpowiedzi może tez obejmować system reporterowy lucyferazy. Pokrótce, lucyferaza jest enzymem katalizującym wydzielenie fotonu przez lucyferynę, i w ten sposób może być wykrywana po ekspresji w obecności lucyferyny (Alam i Cook, Anal. Blochem. 188, 245-254, 1990). Szczególnie korzystnie konstrukt DNA obejmuje element odpowiedzi na cAMP, taki jak np. element odpowiedzi proenkefaliny na cAMP, połączony operacyjnie z cDNA lucyferazy. Konstrukt DNA, zawierający cDNA lucyferazy transfekowany jest w w sposób stabilny do komórki-gospodarza. Komórka ta jest wtedy transfekowana drugim konstruktem DNA zawierającym pierwszy segment DNA kodujący receptor glukagonu powiązany operacyjnie z dodatkowymi segmentami DNA potrzebnymi do ekspresji receptora. Po związaniu agonisty receptora glukagonu, podwyższony poziom cAMP powoduje ekspresję lucyferazy. Lucyferaza poddana jest działaniu lucyferyny, zaś fotony uwolnione podczas utleniania lucyferyny przez lucyferazę są mierzone.

W innym wykonaniu aktywacja szlaku odpowiedzi powoduje wzrost stężenia wewnątrzkomórkowego wolnego wapnia Mogąbyć wykonywane różne testy w celu określenia stężenia wolnego wapnia wewnątrzkomórkowego, obejmujące, przykładowo, metodę z użyciem fluorochromu QuinZ opisanąprzez Charest i in. (J Biol Chem 259: 8769-8773,1983) czy metodę opartą na ekworynie, białku emitującym światło, opisanąprzez Nakajima-Shimada {Proc Natl AcadSci USA 88: 6878-6882, 1991). Szczególnie korzystną metodą jest metoda fotoobrazowania wapnia wewnątrzkomórkowego, opisana szczegółowo w przykładzie 6. Pokrótce, w jednym z wykonań, komórki transformowane sąplazmidem ekspresjonującym receptor glukagonu i hodowane przez trzy dni w normalnych warunkach hodowli. Pożywka jest usuwana i zastąpiona roztworem zawierającym 10 μΜ fura-2AM {patrz, Grynkiewicz i in., J Biol. Chem 260: 3440-3450, 1985). Komórki inkubowane są przez 30 minut w ciemności po czym odpłukiwane i ponownie inkubowane przez 30 do 120 minut. Fotoobrazowanie może być wykonane przy użyciu odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego Nikon Diaphot wyposażonego w lampę rtęciową. Komórki mogą być wpierw oglądane przez 60 minut w celu ustalenia poziomu zerowego, a następnie stymuluje się je buforem zawierającym glukagon. Obrazy zwykle są rejestrowane przez przynajmniej trzy minuty po pobudzeniu. Do obróbki i pomiaru obrazów można wykorzystać oprogramowanie jak Inovision (Research Triangle Park, N.C.).

Poniższe przykłady przedstawione są w celu zilustrowania wynalazku a nie jego ograniczenia.

Przykład 1

Synteza cDNA i wykonanie bibliotek cDNA

A. Synteza cDNA wątroby szczura

Pobrano wątroby od ważących 30 g samic szczura szczepu Sprague-Dawley (Simonsen Labs, Gilroy, CA) i bezzwłocznie umieszczono w ciekłym azocie. Wyizolowano całkowite RNA z tkanki wątroby przy użyciu izotiocyjanianu guanidyny (Chirwig i in., Biochemistry 18: 52-94, 1979) i wirowania na gradiencie CsCl. Poli(A)⁺ RNA wyizolowano przy użyciu chromatografii z użyciem oligo d(T) celulozy (Aviv i Leder, Proc Natl Acad Sci USA 69: 1408-1412, 1972), cDNA wytworzono na matrycy dwukrotnie oczyszczanego poli d(T) poli(A)⁺ RNA z wątroby. Dziesięć mikrolitrów roztworu zawierającego 10 pg poli(A)⁺ RNA wątroby zmieszano z 2 μΐ 20 pmol/pl startera pierwszej nici ZC3747 (Identyfikator Sekw. Nr: 7) i 4 μΐ wody poddanej działaniu pirowęglanu dietylu. Mieszaninę podgrzano w 65°C przez 4 minuty i schłodzono na lodzie.

Syntezę pierwszej mci cDNA rozpoczęto przez dodanie 8 μΐ 5 x bufora SUPERSCRIPT (GIBCO BRL, Gaithersburg, Md), 4 pl 100 mM ditiotreitolu i 2.0 pl roztworu dezoksytrifosforanów zawierającego 10 mM każdego z dATP, dGTP, dTTP oraz 5-metylo-dCTP (Pharmacia LKB

178 685

Biotechnology Inc., Piscataway, N J ) do mieszaniny RNA-starter. Mieszaninę inkubowano w 42°C przez 3 mm. Po inkubacji, dodano 6,0 μΐ 200U/pl odwrotnej transkryptazy SUPERSCRIPT (GIBCO BRL) Wydajność syntezy pierwszej nici badano w równoległej reakcji przez dodanie 10 pCi ³²P-adCTP do próbek po 10 μΐ mieszaniny reakcyjnej w celu znakowania produktów reakcji Mieszaniny reakcyjne do syntezy pierwszej nici inkubowano w temperaturze 45°C przez 45 minut, a następnie w temperaturze 50°C przez 15 minut. Reakcje przerywano przez dodame wody do objętości końcowej 100 pl, po czym poddano dwukrotnej ekstrakcji mieszaninąfenokchloroform (1:1) i jednej ekstrakcji mieszaniną chloroform/alkohol izoamylowy (24:1). Nie wbudowane nukleotydy usunięto przez dwukrotną precypitację cDNA w obecności 6 pg glikogenu, 2.5 M octanu amonu i 2.5 objętości etanolu. Niewyznakowane cDNA zawieszono w 50 μΐ wody i użyto do syntezy drugiej nici. Długość pierwszej nici cDNA określano przez zawieszenie znakowanego cDNA w 20 μΐ wody i określenie wielkości cDNA przez elektroforezę na żelu agarozowym.

Syntezę drugiej nici przeprowadzono na hybrydzie DNA-RNA pochodzącej z syntezy pierwszej nici w warunkach umożliwiających pierwszej nici zapoczątkowanie syntezy drugiej nici przez tworzenie „spinek” DNA Przygotowana została mieszanina reakcyjna zawierająca 20,0 pl 5x bufora polimerazy I (100 mM Tris, pH 7,4, 500 mM KC1,25 mM MgCl₂, 50 mM (NH₄)₂SO₄), 4,0 pl 100 mM ditiotreitolu, l ,0 μΐ roztworu zawierającego 10 mM każdego z trifosforanów dezoksynukleotydów, 3,0μ1 β-NAD, 15,0 pl 3 U/μΙ ligazy DNA E coli (NBL Enzymez Ltd , Cramhngton, Northumbia, England), 5,0 pl 10 U/pl polimerazy I DNA E coli (GIBCO BRL) i 50,0 pl nieznakowanej pierwszej nici DNA. Równoległe reakcje, w których próbki po 10 pl syntezy drugiej mci znakowano przez dodatek 10 miCi ³²P-adCTP, używano do monitorowania wydajności reakcji syntezy drugiej nici. Mieszaniny reakcyjne inkubowano w temperaturze pokojowej przez 4 minuty, a następnie dodawano 1,5μ12U/pl RNazy H (GIBCO BRL) do każdej z mieszanin. Reakcję inkubowano w temp. 15°C przez 2 godziny, a następnie przez 15 minut w temp, pokojowej. Reakcje przerywano przez dodanie 4 μΐ 500 mM EDTA, a następnie poddawano ekstrakcji mieszaninami fenol/chloroform i chloroform/alkohol izoamylowy, jak to opisano powyżej. DNA z każdej z reakcji precypitowano w obecności etanolu i 2,5 M octanu amonu. DNA z nieznakowanej reakcji zawieszono w 50 pl wody Znakowane DNA zawieszono i poddano elektroforezie jak to opisano powyżej.

Jednoniciowe DNA w „spinkach” przecięto używając nukleazy z fasoli mung. Mieszaniny reakcyjne zawierały 10 μΐ 10x Buforu Nukleazy Fasoli Mung (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, Calif.), 4 pil 200 mM ditiotreitolu, 34 μΐ wody, 50 μΐ drugiej nici cDNA i 2 μΐ rozcieńczenia 110 nukleazy Fasoli Mung (Promega Corp , Madison, Wis.) w Buforze do rozcieńczania MB f-my Stratagene (Stratagene Cloning Systems). Reakcję inkubowano w 37°C przez 15 minut, po czym przerywano przez dodanie 20 μΐ Tris-HCl, pH 8.0, a następnie poddawano ekstrakcji mieszaninami fenol/chloroform i chloroform/alkohol izoamylowy, jak to opisano powyżej. Po ekstrakcji, DNA precypitowano w etanolu i zawieszono w wodzie.

W zawieszonym DNA tworzono „tępe końce” przy użyciu polimerazy T4 DNA. cDNA rozpuszczone w objętości 192 μΐ wody, mieszano z 50 μΐ 5x bufora polimerazy T4 DNA (250 mM Tris-HCl, pH 8,0, 250 mM KC1,25 mM MgCl₂), 3 μΐ 100 mM ditiotreitolu, 3 pl roztworu zawierającego 10 mM każdego z trifosforanów dezoksynukleotydów i 2 pl 6,7 U/μΙ polimerazy T4 DNA (Pharmacia LKB Biotechnology Inc.). Po inkubacji w 15°C przez 30 minut, reakcję przerywano przez dodanie 2 μΐ 500 mM EDTA, a następnie poddawano serii ekstrakcji mieszaninami fenol/chloroform i chloroform/alkohol izoamylowy, jak to opisano powyżej. DNA precypitowano etanolem i rozpuszczono w 30 μΐ wody. W oparciu o wbudowywanie ³²P-dCTP, określono uzysk cDNA na 4 pg z 10 pg wyjściowego mRNA.

B. Przygotowanie biblioteki cDNA szczurzej wątroby

W celu ułatwienia klonowania cDNA do wektora ekspresyjnego ssaków, do cDNA przygotowanego, jak to opisano powyżej, dodano łączników EcoRI (Invitrogen, San Diego, Calif.) Porcje po 10 pl cDNA i 800 pmoh łącznika (12 pl) mieszano z 4,0 pl 10x bufora ligazy (Stratagene Cloning Systems), 4,0 pl 10 mM ATP, 6,0 pl wody i 16 jednostkami ligazy T4 DNA (4,0 pl;

178 685

Stratagene Cloning Systems) Reakcję inkubowano przez szesnaście godzin w gradiencie temperatur od 4°C do 15°C. Reakcję przerwano przez dodanie 185 μΐ wody, 25 μΐ buforu REACT 2 (GIBCO BRL), a następnie inkubowano przez 30 do 60 minut w temp. 65°C. Po inkubacji mieszaninę reakcyjną poddawano ekstrakcji mieszaninami fenol/chloroform i chloroform/alkohol izoamylowy i precypitowano etanolem, jak to opisano powyżej. Po odwirowaniu peletkę DNA przemyto 70% etanolem i wysuszono na powietrzu. Peletkę zawieszono w 18 μΐ wody.

W celu ułatwienia kierowanego wprowadzania cDNA do wektora ekspresyjnego ssaków, cDNA trawiono Xhol, co spowodowało powstanie cDNA o „lepkich” końcach: 5' EcoRI i 3' Xhol. Miejsce restrykcyjne Xhol na końcu 3' cDNA zostało wprowadzone przez starter ZC3747 (Identyfikator Sekw. Nr: 7). Trawienie restrykcyjne przerwano serią ekstrakcji mieszaninami fenol/chloroform i chloroform/alkohol izoamylowy. cDNA precypitowano etanolem, a wytworzoną peletkę przemyto 70% etanolem i wysuszono na powietrzu. Peletkę zawieszono w lx buforze (10 mM bufor fosforanowy, pH 8,8, 5% glicerol, 0,125% błękit bromofenolowy).

Zawieszony cDNA podgrzano do 65°C przez 10 minut, schłodzono na lodzie i poddano elektroforezie na 0,9% agarozie o niskiej temperaturze topnienia (Seaplaąue GTG Low Melt Agarose, FMC Corp., Rockland, Me.) z użyciem „drabinki” BRL 1 kb (GIBCO BRL) i 100 bp (Pharmacia LKB Biotechnology Inc.) jako standardu wielkości. Zanieczyszczające łączniki i fragmenty produktów ubocznych o wielkości poniżej 800 bp wycięto z żelu. Elektrody zostały odwrócone i cDNA poddawano elektroforezie dopóki nie zostało zagęszczone w pobliżu początku ścieżki. Fragment żelu zawierający zatęzony DNA wycięto, umieszczono w probówce i określono w przybliżeniu jego objętość. Dodano TE w ilości równej połowie objętości fragmentu żelu i stopiono agarozę przez podgrzanie do 65°C przez 15 minut. Po doprowadzeniu temperatury próbki do 42°C dodano ok. 5 jednostek β-Agarazy I (New England Biolabs, Beverly, Mass.). Próbkę inkubowano przez 90 minut w celu strawienia agarozy. Po inkubacji, dodano 0.1 objętości próbki 3 M octanu sodowego, i inkubowano mieszaninę przez 15 minut na lodzie. Po inkubacji, próbkę wirowano przy 14000xg przez 15 minut w temp. 4°C w celu usunięcia niestrawionej agarozy. cDNA w nadsączu precypitowano etanolem. Peletkę cDNA przemyto 70% etanolem, wysuszono na powietrzu i zawieszono w 10 μΐ wody.

Wytworzony cDNA klonowano do wektora E. coli pZCEP, pochodnej pCDNAl (Invitrogen), w której początek replikacji Ml 3 i marker umożliwiający selekcję SopF zastąpiono kasetą beta laktamazy z pUCl 8. Plazmid pZCEP, lineryzowano przez trawienie EcoRI i Xhol i poddawano ligacji z cDNA EcoRI-Xhol. Wytworzone plazmidy wprowadzano metodą elektroporacj i do komórek E. coli szczepu DH 10B ELECTROMAX (GIBCO BRL).

C. Synteza cDNA Ludzkich Komórek Wysepek

Wysepki z ludzkich trzustek pobrano od dawców przeszczepów, dla których nie udało się znaleźć biorcy. Po perfuzji in situ zimnym roztworem UW (DuPont, Boston, Mass.), każdą trzustkę starannie wycinano, kaniulowano przewód trzustkowy i wstrzykiwano, w sposób ciągły, roztwór 4 mg/ml kolagenazy (Type V, Sigma, St. Louis, MO.), początkowo w temp. 4°C, a następnie 39°C. Gruczoł rozdrobniono zaś uwolnione fragmenty przemywano przez odwirowanie, przepuszczano przez igły o zmniejszającej się średnicy i oczyszczano przez wirowanie na nieciągłym gradiencie Ficollu(Warnock, 35 (supl. 1): 136-139,1989). Materiał zbierany z górnej interfazy pulowano i liczono po oznaczeniu czystości wysepek przez barwienie ditiazonem. Wysepki użyte do tworzenia biblioteki były bardziej niż w 65% czyste, zaś użyte do analizy metodąNorthem biot bardziej niż w 40%. Średnia wysepki wynosiła 175 pm. Dodatkowo, izolowane wysepki wykazywały pierwszą i drugą fazę funkcji wydzielania insuliny po perfuzji bądź wysokim stężeniem glukozy, bądź izobutylo-metyloksantyną(IBMX).

Poli(A)⁺ RNA izolowano przy użyciu zestawu do izolacji mRNA FASTTRACK (Invitrogen), zgodnie z instrukcjąproducenta. Pokrótce, 30000 oczyszczonych wysepek poddano lizie w buforze do lizy, homogenizowano przy użyciu igieł o zmniejszającej się średnicy, i trawiono w obecności proteinazy K i RNasin, a następnie poli(A)⁺ RNA oczyszczano przez chromatografię z użyciem oligo d(T) celulozy. Stężenie i czystość wymywanych frakcji określano na podstawie gęstości optycznej OD_260/280

178 685

Około 2,5pg poli(A)⁺ RNA z ludzkich wysepek użyto do wykonania biblioteki przy użyciu systemu tworzenia bibliotek cDNA LIBRARIAN R II (Invitrogen) i komórek E coli DH10B ELECTROMAX (GIBCO BRL), zgodnie z instrukcjami producentów. Pokrótce, około 2.5 pg poli(A)⁺ RNA wyizolowano z ludzkich wysepek poddano konwersji do dwuniciowego cDNA, a następnie dodano niepalindromicznego łącznika BstXI (Invitrogen). cDNA frakcjonowano ze względu na wielkość, a nieprzereagowany łącznik usunięto przez elektroforezę na żelu agarozowym i elektroelucję Wybrano komplementarne nici DNA o wielkości powyżej 600 bp.

Przykład 2

Izolacja cDNA szczurzego receptora glukagonu przez amplifikację reakcją łańcuchową polimerazy cDNA szczurzej wątroby użyto jako matrycy do amplifikacji sekwencji receptora glukagonu, przy użyciu zdegenerowanych oligonukleotydów (ZC4715 i ZC4701; Identyfikatory Sekw. Nr: 9 i 8), odpowiadających regionom wysokiego zakonserwowania spośród członków rodziny genu sekretyny. Nastawiono 50 μΐ mieszaniny reakcyjnej zawierającej 5 ng matrycy cDNA (przykład 1A); 100 pmoli każdego z oligonukleotydów ZC4715 (Identyfikator Sekw. Nr: 9) i ZC4701 (Identyfikator Sekw Nr.8); 0,25 mM każdego z trifosforanów dezoksynukleotydów (Cetus, Emeryville, CA); lx bufora 10x Promega (Promega Corp.) i 12,5 jednostek polimerazy Taq (Promega) Przeprowadzono 40 cykli PCR (jedna minuta w 95°C; jedna minuta w 42°C i dwie minuty w 72°C), a następnie inkubowano przez 7 minut w 72°C.

Przez elektroforezę wyizolowano produkt PCR wielkości 650 bp i poddano ligacji z pCRIOOO (Stratagene Clomng Systems). Powstałego plazmidu użyto do transformowania komórek XL-1 E coli Wyizolowano DNA plazmidowy z wybranego transformanta, oznaczono go G13/pCRl 0001 sekwencjonowano (Identyfikator Sekw. Nr: 14). Analiza sekwencji klonu wykazała, ze wstawka koduje polipeptyd pokrewny receptorowi sekretyny.

Przykład 3

Klonowanie cDNA pełnej długości szczurzego receptora glukagonu cDNA pełnej długości szczurzego receptora glukagonu uzyskano przez przeglądanie biblioteki opisanej w przykładzie IB w teście wiązania glukagonu. Bibliotekę wysiano by uzyskać milion niezależnych klonów. Stransformowane kolonie z każdej płytki zeskrobywano do LB-Amp (Sambrook i in.,y w) Komórki odpłukano przez odwirowanie zaś pożywkę usunięto. Peletki komórek zawieszono w 4 ml LB-Amp, 15% glicerolu, po czym przechowywano cztery jednomililitrowe porcje w -80°C. Pierwsząz partii w glicerolu miareczkowano i wysiano 100 pul po 5000 kolonii na płytkę. Po wzroście kolonii, każdą płytkę zeskrobywano do 10 ml LB-Amp. Porcje komórek z każdej puli pobrano w celu przygotowania DNA plazmidowego. Pozostałe mieszaniny komórek doprowadzono do objętości końcowej 15% glicerolem, porcjowano i zamrażano w -80°C. DNA plazmidowe przygotowano z każdej z pul komórek, i trawiono RNazą (Boeringer Mannheim, Indianapolis, Ind.) zgodnie z instrukcjąproducenta. Reakcję RNazy przerywano przez ekstrakcję mieszaninąfenol/chloroform/alkohol izoamylowy (24:24:1), po czym DNA precypitowano etanolem

DNA plazmidowe z każdej z pul transfekowano do komórek COS-7 (ATCC CRL 1651), i badano transfektanty na obecność receptorów glukagonu w teście wiązania ^l25I-glukagonu. Pokrótce, dzień przed transfekcją wysiewano około 2X10⁵ komórek do sterylnych jednokomorowych płytek (Nunc AS, Roskilde, Denmark) pokrytych 10 pg/ml ludzkiej fibronektyny (Tabela 1.) przez 30 minut w temp, pokojowej i odpłukanych roztworem fizjologicznym soli z buforem fosforanowym (PBS, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo) Dwa mikrogramy DNA plazmidowego z każdej z pul użyto do transfekcji komórek w jednokomorowych płytkach przy użyciu metody opisanej przez McMahan i in., (EMBO J, 10:2821-2832, 1991; zmieszczonej tu jako odnośnik) Po transfekcji, komórki hodowano przez 72 godziny w 37°C w 5% CO₂.

178 685

Tabela 1

Fibronektyna Ludzka

4g	sproszkowana ludzka fibronektyna osocza liofilizowana (Alpha Therapeutics Corp , Los Angeles, Calif)
50 ml	1 mM NaPCL, pH 7,4 (mieszanina jedno-1 dwu Na), 300 mM NaCl

Liofilizowany proszek rozpuszczono w roztworze buforu. Dodano siarczanu amonu do stężenia 25%, i pozostawiono roztwór do precypitacji przez noc w temp 4°C. Fibronektynę zebrano przez odwirowanie w wirówce Bench Top (Beckman Instruments, Inc., Irvine, Califf.) przez piętnaście minut przy 1000 rpm. Supematant usunięto zaś peletkę rozpuszczono w 10 ml roztworu buforu NaPO₄ (powyżej).

Fibronektynę w objętości końcowej 16,9 ml dializowano przez noc do 11 roztworu buforu NaPO₄ (opisanego powyżej). Dializowany materiał rozcieńczono trzykrotnie 1 mM NaPO₄, pH 7.4, w celu uzyskania roztworu 1 mMNaP0₄, pH 7,4,100 mMNaCl. Fibronektynę rozcieńczono dwukrotnie wodą destylowaną. Nierozpuszczony precypitat usunięto przy pomocy pręta szklanego.

Fibronektynę poddano FPLC przez 50 ml kolumnę DEAE FF Sepharose (Pharmacia LKB Biotechnology Inc , Piscataway, N.J.), zrównoważoną trzema objętościami 18 mM Tris, pH 8,1, 50 mM NaCl. Po przemyciu kolumny 18 mM Tris, pH 8,1,50 mM NaCl, dopóki nie uzyskano próbki zerowej, fibronektynę eluowano gradientem soli do 18 mM Tris, pH 8,1, 300 mM NaCl. Frakcje zbierano, próbki frakcji poddawano elektroforezie na żelu połiakrylamidowym i analizowano przez barwienie Błękitem Coomasie i analizę Western biot. Frakcje szczytowe pulowano i dializowano w stosunku do 10 mM CAPS (kwas 3-(cykloheksyamino)-1 propanosulfbnowy, Sigma), pH 11,0, 10 mM CaCl₂, 150 mM NaCl. Roztwór przechowywano w temp. -80°C.

W celu wytworzenia transfektantów do testu wiązania ¹²⁵I-glukagonu, pożywkę aspirowano znad komórek, i płukano je trzykrotnie zimnym (4°C) PBS. Po ostatnim przemyciu, komórki pokrywano Medium do Testu Wiązania zawierającym 0,5 nM ^I25I-glukagon (Amersham receptor grade, aktywność właściwa 2000 Ci/mmol; Amersham). Komórki kołysano w temp. 30°C przez jedną godzinę. Medium aspirowano znad komórek, dodawano zimnego (4°C) Medium do Testu Wiązania bez glukagonu, po czym inkubowano komórki przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Medium aspirowano znad komórek i przepłukiwano je trzykrotnie zimnym (4°C) PBS. Po ostatnim płukaniu, komórki utrwalano 1 ml 2,5% glutaraldehydem w PBS w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Glutaraldehyd usuwano i przepłukiwano komórki trzykrotnie PBS. Szkiełka suszono na powietrzu przez godzinę w temp, pokojowej, zanurzano w ciekłej emulsji fotograficznej (Eastman Kodak Co., Rochester, Ν. Y.) zgodnie z zaleceniami producenta, i suszono w temperaturze pokojowej w ciemności przez co najmniej 30 minut. Szkiełka umieszczano w zaciemnionym pudełku na 72 godziny w temp. 4°C. Komórki zdolne do wiązania glukagonu wykrywano przy powiększeniu 2,5X w ciemnym polu widzenia. W jednej z pul, #57, stwierdzono obecność komórek zdolnych do wiązania glukagonu.

Tabela 2 Medium do Testu Wiązania
RPMI	1640 (Sigma) zawierający 20pg/ml bacytracyny (Sigma) 25 mM bufor HEPES, pH 7,4 1% roztworu penicylina/streptomycyna (Sigma) 2 mM glutamina 50 U/ml aprotymny (Sigma) 1% albuminy surowicy wołowej, frakcja V (Sigma)

178 685

1M wodorowęglan sodu

8,4 g stałego NaCO₃

Wodorowęglan sodu wlano do 100 ml naczynia miarowego, i dodano 80 cm³ wody destylowanej. Roztwór mieszano do pełnego rozpuszczenia. Dodano wody destylowanej do 100 ml Roztwór ponownie mieszano i przechowywano w 4°C w zamykanym naczyniu.

Medium

Do 1 litra destylowanej wody dodawano jeden mililitr IM wodorowęglanu sodu. Przygotowano cztery litry z użyciem roztworu chłodzonego przez noc, lub przygotowanego z zimnej wody destylowanej.

69% roztwór sacharozy g sacharozy

Sacharozę rozpuszczono w 31 ml wody destylowanej przez podgrzanie. Stężenie badano używając refraktometru. W zależności od potrzeby dodawano bądź sacharozy, bądź wody destylowanej doprowadzając stężenie do 69% ± 0,5%.

42.3% roztwór sacharozy g sacharozy

Sacharozę rozpuszczono w 57 ml wody destylowanej przez podgrzanie Stężenie mierzono przy użyciu refraktometru W zależności od potrzeby dodawano 69% roztworu sacharozy lub wody, doprowadzając stężenie do 42,3 ± 1%

BuforX2 do testu wiązania

100 mM HEPES, pH7,3

300 mM NaCl mM EDTA

2% albumina surowicy wołowej

1,6 mg/ml bacytracyny

Bufor do Obrazowania

140 mM NaCl lOmM HEPES 5,6 mM glukoza 5 mM KC1 mM MgSO₄ mM CaCl₂

Roztwór Fura-2 AM mg fura-2 AM (Molecular Probes) ml DMSO ml Buforu do Obrazowania

Pięćdziesiąt miligramów fura-2 AM rozpuszczono w 50 ml DMSO. Po rozpuszczeniu, roztwór zmieszano z 5 ml Buforu do Obrazowania.

Porcję DNA plazmidowego z puli #57 poddano amplifikacji PCR z użyciem oligonukleotydów ZC4701 i ZC4715 (Identyfikatory Sekw. Nr: 8 i 9). Przygotowano 50 μΐ mieszaniny reakcyjnej, zawierającej pomiędzy 200 ng a 400 ng DNA plazmidowego z puli #57; 100 pmoli każdego z oligonukleotydów ZC4701 i ZC4715 (Identyfikatory Sekw Nr: 8 i 9); 50 mM KC1; 10 mM Tns-HCl, pH 9,0 (w 20°C); 1,5 mM MgCl₂; 0.01 % żelatyny; 0,1 % Triton X-100; 0,2 mM każdego z trifosforanów dezoksynukleotydów (PharmaciaLKB Biotechnology Inc) i 1 Jednostki polimerazy Taq (Promega). Wykonano 30 cykli reakcji PCR (dwie minuty w 95°C, dwie minuty w 45°C i dwie minuty w 72°C) zakończonych 7-minutową inkubacją w 72°C. Mieszaninę reakcyjną przechowywano w 4°C. Analiza produktu PCRprzez elektroforezę na żelu, wykazała obecność prążka wielkości 700 bp, który był prawie tej samej wielkości co produkt opisany w przykładzie 2.

Próbkę glicerolowąpuli #57 miareczkowano i wysiano z niej 20 płytek po 500 kolonii każda Kolonie pulowano i wykonywano próbki glicerolowe i plazmidowe DNA, tak jak to opisano powyżej DNA plazmidowe transfekowano do komórki COS-7 i badano transfektanty w teście

178 685 wiązania glukagonu, jak to opisano powyżej. W jednej z pul, #57-18 stwierdzono obecność komórek zdolnych do wiązania glukagonu.

Próbkę DNA plazmidowego puli #57-18 poddano amplifikacji PCR z użyciem oligonukleotydów ZC4701 i ZC4715 (Identyfikatory Sekw. Nr 8 i 9) jak to opisano powyżej. Analiza produktu PCR elektroforezą na żelu wykazała obecność prążka wielkości 700 bp, potwierdzającego obecność sekwencji DNA receptora glukagonu.

Próbkę glicerolową puli #57-18 miareczkowano i wysiano 6 płytek po 50 kolonii i 47 płytek po 20 kolonii. Kolonie pulowano i wykonywano próbki glicerolowe i plazmidowe DNA, jak to opisano powyżej. Porcje z każdej z pul transfekowano do komórek COS-7, a transfektanty badano w teście wiązania glukagonu, jak to opisano powyżej. Dodatkowo, porcję plazmidowego DNA z każdej z pul poddano amplifikacji z użyciem oligonukleotydów ZC4701 i ZC4715 (Identyfikatory Sekw. Nr: 8 i 9), jak to opisano powyżej. Wykryto cztery pule (#57-18-16, #57-18-18, #57-18-36 i # 57-18-48) zawierające komórki zdolne do wiązania glukagonu, w których wykryć można było amplifikacjąPCR potwierdzający prążek 700 bp.

W celu wyizolowania cDNA wysiano na każdą z dwóch 150 mm płytek po 2500 kolonii puli #57-18. Odciski filtrów wykonano według metody opisanej przez Hanahan i Meselson (Gene 10: 63,1980) i Sambrook i in., (ibid), zamieszczone tu jako odnośniki. Sondę hybrydyzacyjną uzyskano przez amplifikację PCR DNA plazmidowego z puli #57-18, przy użyciu oligonukleotydów i metod opisanych powyżej. Produkt PCR oczyszczono z żelu agarozowego o niskiej temperaturze topnienia i startowano z użyciem zestawu MEGAPRIME (Amersham, Arlington Heights, III), zgodnie z zaleceniami producenta. Filtry hybrydyzowano w roztworze zawierającym 6XSSC, 5Xroztwór Denhardta, 5% SDS, 200 pg/ml DNA spermy łososia poddanego sonikacji i fragment PCR znakowany ³²P o aktywności właściwej 2x 10³ cpm/ml. Filtry hybrydyzowano przez noc w 65°C. Nadmiar znacznika usunięto przez trzy płukania 2XSSC, 1 % SDS w temperaturze 65°C. Film eksponowano na filtry przez cztery godziny w temperaturze -80°C. Zidentyfikowano i sekwencjonowano klony pozytywne, zawierające plazmid pLJ4. Plazmid pLJ4 zdeponowany j est w American Type Culture Collection (12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852) jak transformant K coli, pod numerem 69056 21 sierpnia 1992.

Analiza miejsc restrykcyjnych i analiza sekwencji wykazała, ze pLJ4 zawiera wstawkę długości około 2kb, kodującą białko o długości 485 aminokwasów o przewidywanej masie cząsteczkowej 54962 Da. Sekwencja kwasu nukleinowego i sekwencja aminokwasowa przedstawi ona jest w Identyfikatorach Sekw. Nr 14 i 15. Analiza hydropatii przy użyciu metody Kyte i Doolitlle (J Mol Biol 157: 105-132, 1982; zamieszczone tu jako odnośnik) wykazała osiem przedziałów aminokwasów hydrofobowych odpowiadających sekwencji sygnałowej końca N i siedmiu domenom śródbłonowym (figura 2). Dodatkowo, analiza przewidzianej sekwencji aminokwasowej, wykazała obecność czterech potencjonalnych miejsc N-glikozylacji, położonych w rozległych sekwencjach hydrofilowych i obecność sześciu cystein w tym samym regionie.

Przykład 4

Izolacja cDNA ludzkiego receptora glukagonu przez amplifikację reakcjąłańcuchowąpolimerazy cDNA ludzkich wysepek (przykład 1C) użyto jako matrycy do amplifikacji sekwencji ludzkiego receptora glukagonu, przy użyciu zdegenerowanych oligonukleotydów ZC4715 i ZC4701 (Identyfikatory Sekw Nr: 9 i 8). Nastawiono 50 μΐ mieszaniny reakcyjnej zawierającej 5 ng cDNA matrycowego (przykład 1C), 100 pmoh każdego z oligonukleotydów ZC4715 (Identyfikator Sekw. Nr: 9) i ZC4701 (Identyfikator Sekw. Nr: 8); 0,25 mM każdego z trifosforanów dezoksynukleotydów (Cetus Emeryville, Calif.,); IX buforu 10Χ Promega (Promega) Wykonano 40 cykli reakcji PCR (jedna minuta w 95°C, jedna minuta w 45°C i dwie minuty w 72°C) zakończonych inkubacją przez 7 minut w 72°C.

178 685

Metodą elektroforezy na żelu wyizolowano produkt PCR o długości około 750 bp Jedna dziesiąta izolowanego produktu PCR użyta została jako matryca dla dodatkowej reakcji PCR z uzyciemoligonukleotydówZC4758 i ZC 4778 (Identyfikatory Sekw Nr 10 111), które zaprojektowano tak, by wprowadzały miejsce restrykcyjne BamHI na końcu 3' i miejsce restrykcyjne EcoRI na końcu 5' produktu PCR, co miało służyć klonowaniu. Nastawiono 50 μΐ mieszaniny reakcyjnej jak to opisano powyżej Wykonano 40 cykli reakcji PCR (jedna minuta w 95°C, jedna minuta w 50°C i pół minuty w 72°C) zakończonych 7 minutową inkubacją w 72°C.

W celu badania transformantów na obecność sekwencji ludzkiego receptora glukagonu, wstawkę obecną w każdym z transformantów amplifikowano z użyciem oligonukleotydów ZC447 i ZC967 (Identyfikatory Sekw. Nr: 1 i 2), które zaprojektowano jako uniwersalne startery sekwencjonujące plazmid pUC i komplementarne do sekwencji pUC otaczających wstawkę produktu PCR. Czterdzieści osiem transformantów wprowadzono do 25 μΐ mieszaniny reakcyjnej zawierającej 20 pmoli każdego z oligonukleotydów; 0,125 mM każdego z trifosforanów oligonukleotydów (Cetus, Emeryville, Calif.,); IX bufora 10Χ Promega (Promega) i 1,25 jednostki polimerazy Taq (Promega). Wykonano 30 cykli reakcji PCR (jedna minuta w 95°C, jedna minuta w 45°C i pół minuty w 72°C) zakończonych 7 minutową inkubacją w 72°C.

Produkty PCR badane były następnie hybrydyzacją Southerna (Southern, J. Mel. Biol. 98: 503,1975; i Sambrooki in., ibid., które zamieszczono tu jako odnośniki) przy użyciu fragmentu pLJ4 EcoRI-Xhol wielkości 1,9 kb, znakowanego losowymi starterami, używając zestawu MEGAPRIME (Amersham) jako sondy. Jeden z klonów, G30, hybrydyzował z sondącDNA szczura pełnej długości Sekwencja nukleotydowa G30 pokazana jest w Identyfikatorze Sekw. Nr: 16.

Przykład 5

Klonowanie cDNA pełnej długości ludzkiego glukagonu

W celu zidentyfikowania biblioteki zawierającej sekwencje kodujące ludzki receptor glukagonu, badano serię bibliotek przy użyciu PCR z udziałem starterów oligonukleotydowych ZC5433 i ZC5432 (Identyfikatory Sekw. Nr: 13 i 12), zaprojektowanych tak by obejmowały sekwencję z klonu G30, opisanego powyżej. Badano nabyte i wykonane biblioteki ludzkiego genomowego i cDNA z ludzkiej wątroby, komórki, wysepek, mózgu i łożyska (tabela 3). Nastawiono oddzielne 50 μΐ reakcje z użyciem DNA z różnych bibliotek w objętościach wyszczególnionych wtabeli4,20pmoli/plkazdegozZC5433 iZC5432 (Identyfikatory Sekw 13 i 12), 0,25 mM każdego z trój fosforanów deoksynukleotydów, 5 μΐ 10X bufora Taq I (Promega), 15 mM MgCl_?, 19,5 μΐ wody destylowanej i 0,5 μΐ 5 U/μΙ polimerazy Taq I (Promega). Dodatkowo nastawiono reakcje zawierające pLJ4 jako kontrola pozytywna i bez DNA jako kontrola negatywna.

Tabela 3 Źródła Bibliotek i DNA

Biblioteka/DNA	Źródło
ludzkie cDNA wątroba, NIH	R. Bertolloti (NIH, Bethesda, Md)
ludzkie genomowe #946203	Stratagene
ludzkie genomowe #944201	Stratagene
ludzkie cDNA komórek wysepek	Przykład 1C
Agtl 1 HEPG2	Przygotowane jak opisano przez Hagen i m , (U S Patent 4,784,950, zamieszczone tu w całości jako odnośnik)
ludzkie cDNA pierw nić mózg	Clontech
ludzkie cDNA pierw nić łożysko	Clontech
ludzkie cDNA pierw nić wątroba	Clontech

178 685

Tabela 4 Objętości

Biblioteka/DNA	Objętość (rozcieńczona wodą do 15 μΐ)
ludzkie cDNA wątroba, NIH	1 μΐ z roztworu 400 ng/μΐ
ludzkie genomowe #946203	15 μΐ roztworu faga
ludzkie genomowe #944201	15 μΐ roztworu faga
ludzkie cDNA komórek wysepek	1 μΐ roztworu 1 2 μg/μl rozc. 1 3
Agtl 1 HEPG2	15 μΐ roztworu faga
ludzkie cDNA pierw nić mózg	1 μΐ roztworu 10 ng/μΐ
ludzkie cDNA pierw nić łożysko	1 μΐ roztworu 10 ng/μΐ
ludzkie cDNA pierw nić wątroba	1 μΐ roztworu 10 ng/μΐ

Wykonano 30 cykli reakcji PCR (jedna minuta w 94°C, jedna minuta w 50°C i pół minuty w 72°C) zakończone 10 minutową inkubacją w 72°C. Następnie analizowano produkt PCR elektroforezę na żelu agarozowym. Wyłącznie biblioteka z wątroby ludzkiej, pochodząca z NIH umożliwiła uzyskanie prążka wielkości 320-410 bp, podobnie jak to obserwowano z pLJ4 jako kontrolą pozytywna.

Biblioteki z ludzkiej wątroby, sklonowanej do plazmidu pcD2 (Chen i Okayama, Mol Celi Biol 7:2745-2752, 1987) uzyskanej od Dr Rogera Bertolloti (National Institutes of Health, Bethesda, Md ) użyto w celu uzyskania klonu cDNA pełnej długości, kodującego ludzki receptor glukagonu. Wysiano bibliotekę w celu uzyskania miliona indywidualnych klonów. Kolonie transformowane z każdej z płytek zdrapywano do 10 ml LB-Amp (Sambrook i in., ibid). Komórki odpłukano przez odwirowanie zaś pożywkę usunięto. Peletkę komórek zawieszono w 4 ml LB-Amp, 15% glicerolu i podzielono na cztery jedno mililitrowe porcje, które przechowywano w -80°C. Jednąz próbek glicerolowych zmiareczkowano i wysiano jako 100 pul po 5000 kolonii każda. Po wzroście kolonii każda płytka była zeskrobywana do 10 ml LB-Amp. Pobrano porcje komórek z każdej z pul w celu wykonania DNA plazmidowego. Pozostałe mieszaniny komórek doprowadzono do objętości końcowej 15% glicerolem, porcjowano i zmrożono w -80°C. DNA plazmidowe przygotowano z każdej zpul komórek, i trawiono DNA RNazą(Boeringer Mannheim, Indianapolis, Ind.) zgodnie z instrukcją producenta. Reakcje RNazy przerywano przez ekstrakcję mieszaninąfenol/chloroform/alkohol izoamylowy (24:24:1), po czym DNAprecypitowano etanolem.

Porcje rozpuszczonego DNA plazmidowego z każdej z pul połączono w grupy po 10 (tzn 1-10, 11-20, 21-30, 31-40 itd.). DNA plazmidowe rozcieńczono 1'20 i 1 pl DNA zkazdej z pul użyto do wykonania mieszaniny reakcyjnej do PCR, identycznej z mieszaninąopisanąpowyzej. Mieszaninę reakcyjną poddano amplifikacji w warunkach opisanych powyżej. Analiza produktu PCR przez elektroforezę na żelu agarozowym wykazała, ze pula 31-40 zawiera prążek wielkości 320-410 o wielkości identycznej z kontrolą pozytywną.

DNA plazmidowe przygotowane z oryginalnych pul od 31 do 40 rozcieńczono 1:20 i użyto 1 μΐ z każdej z pul do wykonania mieszaniny reakcyjnej identycznej z opisanąpowyzej. Amplifikacja PCR mieszanin reakcyjnych wykonana została w warunkach opisanych powyżej Analiza produktu PCR przez elektroforezę na żelu agarozowym wykazała, ze pula #40 daj e prążek o wielkości ok. 310-420 bp.

Stężenie DNA plazmidowego oceniono, w przybliżeniu, przez elektroforezę 1 pl rozcieńczenia 1Ί0 puli #40 na żelu agarozowym, na 70 ng/μΐ. Siedemdziesiąt nanogramów DNA plazmidowego puli #40 wprowadzono przez elektroporację do komórek© coli szczepuDH1 OB przy 2.3 kV, 400Ω. 25 pF po czym zawieszono je w 1 ml SOC (Sambrook i in., ibid) Przygotowano trzy rozcieńczenia komórek, rzędu 10’²,10'³ i 10'⁴. Sto mikrolitrów każdego z rozcieńczeń posia

178 685 no na cztery płytki. Liczba kolonu wynosiła około 10000 kolonii na płytkę dla czterech płytek zawierających komórki z rozcieńczenia 10'² i około 1000 kolonu na płytkę dla czterech płytek zawierających komórki z rozcieńczenia 10’³. Przygotowano odciski filtrów w powtórzeniach z każdej z czterech płytek 10'³ i jednej 10‘², oznaczonych jako pule od #1 do #5. Jeden z filtrów z każdego powtórzenia położono na pożywce stałej i pozwolono koloniom utworzyć się. Kolonie zdrapano i użyto do wykonania DNA plazmidowego do amplifikacjiPCR. Dodatkowo, zdrapano trzy pozostałe płytki 10'² i przygotowano z nich DNA plazmidowe.

Pozostałe filtry przepłukiwano wstępnie 3XSSC z dodatkiem 0.5% SDS w temp 65°C z wytrząsaniem przez 12 godzin w celu usunięcia osadu bakterii. Filtry prehybrydyzowano w buforze Ullricha (Ullnch, EMBOJ 3: 361-364,1984) z dodatkiem 50% formamidu, 1% SDS przez noc w temp. 37°C. DNA klonu G30, znakowane zestawem MEGAPRIME Amershama (Amersham) zgodnie z instrukcjąproducenta, gotowano i dodano do roztworu hybrydyzacyjnego (bufor Ullricha + 5-% formamid) w stężeniu końcowym 6X10⁵ cpm/ml. Filtry inkubowano przez noc w temp. 37°C z wytrząsaniem. Po inkubacji przez noc, roztwór sondy usuwano, zaś filtry były przemywane przez pięć minut w temp. 65°C w 2XSSC + 0.1% SDS. W następstwie pierwszego przemycia, filtry były przemywane w tym samym roztworze przez piętnaście minut w temp. 65°C a następnie przez pięć minut w temp, pokojowej z wytrząsaniem. Ostatnia kąpiel powtórzona jeszcze została dwukrotnie. Filtry eksponowano na film przez noc w temp, pokojowej. Pojedyncza kolonia na płytce #2, która odpowiadała puli #2, była pożyty wana po hybrydyzacji z G30. Kolonię tę pobrano i rozproszono w celu uzyskania pojedynczych kolonii. Przygotowano DNA plazmidowe z kilku pojedynczych kolonii, a następnie poddano je analizie sekwencji DNA Jeden z klonów, 40-2-2, poddano dalszej analizie sekwencji i zdeponowano w American Type Culture Collection (12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852) jako transformant E coli pod numerem 69055 21 sierpnia 1992. Częściowa sekwencja DNA klonu 40-2-2 i przewidywana sekwencja aminokwasowa przedstawiona jest jako Identyfikator Sekw. Nr: 17 i 18.

W celu potwierdzenia obecności sekwencji receptora glukagonu na filtrach hybrydyzacyjnych, przeprowadzono amplifikację PCR z użyciem każdego z preparatów DNA (plazmidowe DNA wykonane z każdego z powtórzonych filtrów i DNA plazmidowe wykonane z każdej z trzech płytek 10‘²) Pulowane DNA plazmidowe rozcieńczono 1:20 wodą i 1 μΐ każdego z DNA użyto jako matrycy do nastawienia reakcji PCR i przeprowadzenia jak to opisano powyżej Elektroforeza na żelu agarozowym produktu PCR wykazała, ze pula #2 i trzy spośród czterech puł po 10000 zawierają wytworzony przez PCR prążek pomiędzy 310 a 420 bp. Obecność prążka wytworzonego przez PCR w puli #2, która odpowiadała płytce #2, potwierdziło obecność sekwencj i DNA receptora glukagonu.

F Strategia klonowania sekwencji 5' ludzkiego receptora glukagonu

Analiza części sekwencji cDNA klonu 40-2-2 i sekwencji cDNA pełnej długości szczurzego receptora glukagonu wykazała, ze klonowi 40-2-2 brakuje sekwencji końca N, odpowiadającego około 25 aminokwasom. Sekwencję cDNA końca 5' ludzkiego receptora glukagonu uzyskano przy użyciu adaptacji metody opisanej przez Frohman i in {Proc Natl AcadSci USA 85:8998-9002, 1988). Pokrótce, zaprojektowano starter oligonukleotydowy o sekwencji hybrydyzującej z sekwencją w pobliżu końca 5' sekwencji kodującej klonu 40-2-2 Starter hybrydyzowano ze znakowaną G matrycą z pierwszej nici cDNA ludzkiej wątroby po czym wydłużono starter w kierunku 5' przy użyciu polimerazy Taq I. Drugi starter poli d(C) „przyklejono” do matrycy cDNA znakowanej G, by umożliwić amplifikację reakcjąłańcuchowąpolimerazy, a następnie klonowanie, sekwencjonowanie i złożenie z regionem kodującym obecnym w klonie 40-2-2.

Przygotowano trzy matryce cDNA. Pierwsząmatrycąbyła dostępna w handlu pierwsza nić cDNA ludzkiej wątroby. Drugą i trzecią matrycę cDNA przygotowano przez syntetyzowanie pierwszej nici cDNA z dostępnych w handlu mRNA ludzkiej wątroby (Clontech) przy użyciu ohgonukleotydu zawierającego sekwencję specyficzną dla ludzkiego receptora glukagonu bądź przy użyciu tradycyjnego startera oligo d(T)

178 685

Drugą matrycę cDNA przygotowano przez syntezę z mRNA ludzkiej wątroby, przy użyciu oligonukleotydu ZC5433 (Identyfikator Sekw. Nr: 13), który jest specyficzny dla sekwencji kodującej ludzki receptor glukagonu Mieszaninę reakcyjną zawierającą 2 μΐ 1 pg/pl mRNA ludzkiej wątroby, 8μ1 20 pmol/μΐ ZC5433 (Identyfikator Sekw. Nr: 13) i 0,5 μΐ 10 mM Tris, pH7.4, 0.1 mM EDTA inkubowano przez 7 minut w temp. 68°C a następnie dwie minuty na lodzie. Po inkubacji do mieszaniny reakcyjnej dodano 4 μΐ 5X buforu SUPERSCRIPT (GIBCOBRL), 1 μ! 0,25 miCi/μΙ cc³²P-dCTP i 5 μΐ odwrotnej transkryptazy SUPERSCRIPT. Reakcję inkubowano przez godzinę w temp. 45°C. Reakcję przerwano przez dodatek 80 μΐ TE. RNA hydrolizowano przez dodanie 1 μΐ 0,5% EDTA i 1 μΐ KOH. Reakcję hydrolizy inkubowano w temp. 65°C przez 5 minut. Po inkubacji, próbkę rozcieńczono do I ml z użyciem 50 mM KOH, 0.1 mMEDTA i przepuszczono przez zagęszczacz CENTRICON 100 (Amicon, Danvers, Mass.). Kolumnę przemywano 1 ml 50 mM KOH, 0.1 mM EDTA. Stężone cDNA było zbierane i zobojętniane połową objętości 100 mM HC1. Zobojętnionąpróbkę cDNA precypitowano etanolem, po czym rozpuszczono w 26 μΐ wody destylowanej.

Trzecią matrycę cDNA przygotowano przez syntezę z mRNA ludzkiej wątroby przy użyciu nabytego startera oligo d(T). Przygotowano mieszaninę reakcyjną zawierającą 2 pg lpg/μΐ mRNA ludzkiej wątroby, 1 μΐ 1 pg/μΐ oligo d(T)18 (NewEngland Biolabs, Beverly, Mass) i 5 μΐ 10 mM TRIS, pH 7.4, 0.1 mM EDTA. Syntezę cDNA przeprowadzono w warunkach wyszczególnionych dla syntezy opisanej powyżej.

Pierwszą nić cDNA znakowano G. Nastawiono probówki zawierające 4 μΐ pierwszej nici cDNA ludzkiej wątroby (QUICK CLONE; Clontech, Pało Alto, Califf), 4 μΐ pierwszej nici cDNA ze startera ZC5433 (Identyfikator Sekw. Nr: 13), lub 4 μΐ pierwszej nici cDNA ze startera oligo d(T) Do każdej mieszaniny reakcyjnej dodano 22 μΐ wody, 8 μΐ buforu 5X (Promega), 4 pl 10 mM dGTP i 2 μΐ 15 U/μΙ transferazy terminalnej, po czym inkubowano reakcję przez 30 minut w temperaturze 37°C a następnie przez 10 minut w temp. 65°C. Reakcje rozcieńczono do 90 μΐ przy użyciu 10 mM Tris, pH 7 4, 1 mM EDTA i precypitowano etanolem.

Synteza drugiej nici wszystkich znakowanych G cDNA przeprowadzona została identycznie. Każde z cDNA rozpuszczono najpierw w 50 μΐ wody destylowanej. Do każdego z cDNA dodano lOOpmoli ZC4814 (Identyfikator Sekw. Nr: 20) w 5 μΐ. cDNA sklejono ze starterem przez podgrzanie mieszanin do 68°C przez pięć minut a następnie dwuminutową inkubację na lodzie. Po sklejeniu cDNA ze starterem, do każdej z mieszanin dodano 20 μΐ buforu polimerazy I X5 (przykład 1), 1 μΐ 100 mM ditiotreitolu, 2 μΐ roztworu zawierającego 10 mM każdego z dNTP, 2 μΐ 0.5 miCi/μΙ a³²P-dCTP, 1 μΐ 3 U/μΙ ligazy DNA E. coli (New England Biolabs), 5 μΐ 7 U/μΙ Polimerazy I DNA E. coli (Amersnam). Reakcje inkubowano przez pięć minut w temp. 22°C a następnie dodano po 1.5 μΐ 2U/pl RNazy H (GIBCO-BRL) po czym dalej inkubowano w temp. 16°C przez dwie godziny Reakcję przerywano przez dodanie 200 μΐ 10 mM Tris (pH 8 0), 1 mM EDTA, a następnie 150 μΐ wysyconego wodą fenolu i 150 μΐ chloroformu Mieszaninę mieszano energicznie i odwirowano przez trzy minuty w 22°C w celu rozdzielenia faz. Fazę wodnąpobrano i ponownie ekstrahowano fenolem i chloroformem jak to opisano powyżej Po drugiej ekstrakcji mieszaniną fenol-chloroform, warstwę wodną ekstrahowano chloroformem. cDNA w fazie wodnej precypitowano przez dodanie 5 pg glikogenu z mięśni, 100 μΐ 8 M octanu amonu i 300 μΐ izopropanolu w celu wybiórczej precypitacji dużych cząstek kwasu nukleinowego i pozostawieniu nie wbudowanych oligonukleotydowych starterów w nadsączu. cDNA żwirowano, zaś peletkę przemywano 70% etanolem a następnie wysuszono na powietrzu. Peletkę rozpuszczono w 15 μΐ wody redestylowanej.

Dwuniciowe cDNA amplifikowano w pięciu równoległych reakcjach z użyciem starterów oligonukleotydowych homologicznych do końca 5' ZC4814 (Identyfikator Sekw. Nr: 20) i zawierających miejsca restrykcyjne w celu polepszenia klonowania, i startera oligonukleotydowego specyficznego dla skrajnego końca 5' sekwencji kodującej obecnej w klonie 40-2-2 Każda z mieszanin reakcyjnych zawierała 5 μΐ 10X bufora Taq 1,3 μΐ 25 mM MgC12,5 μΐ roztworu zawierającego 2.5 mM każdego z dNTP, 1 μΐ dwuniciowego cDNA i 0.5 μΐ polimerazy Taq I (Promega). Dodano wody destylowanej do objętości końcowej 50 μΐ. Reakcję denaturowano przez pięć

178 685 minut w temperaturze 98°C przed dodaniem 1 μΐ każdego z 10 pmol/μΐ ZC5624 (Identyfikator Sekw Nr: 21) i 20 pmoli/μΐ ZC4812 (Identyfikator Sekw Nr: 19) Kazdąz próbek pokryto 70 μΐ oleju mineralnego, trzymanego w temp. 90°C Reakcje amplifikowano trzydziestoma cyklami (95°C przez 60 sekund, 57°C przez 40 sekund i 72°C przez 60 sekund) a następnie inkubowano przez 7 minut w temp 72°C.

Każdy z produktów PCR poddano elektroforezie na żelu agarozowym, zaś amplifikowany fragment wycinano i wklonowywano do pCRIOOO przy użyciu zestawu TA clonig kit (Invitrogen) Trzy klony z każdej z ligacji wybrano i badano na obecność wstawki przy użyciu starterów oligonukleotydowych ZC5624 (Identyfikator Sekw. Nr: 21) i ZC4812 (Identyfikator Sekw Nr: 19) w niezależnych mieszaninach reakcyjnych PCR z których każda zawierała próbkę z klonu jako źródło matrycy DNA. Reakcje PCR przeprowadzono jak to opisano powyżej, z wyjątkiem tego, że przeprowadzano wyłącznie 30 cykli reakcji. Pojedyncze klony posiadające wstawkę z oryginalnych reakcji PCRpoddano analizie sekwencji DNA. Spośród dwóch klonów, które jak wykazano, zawierały wolną od błędów sekwencję kodującą koniec 5' ludzkiego receptora glukagonu, wybrano jeden w celu dostarczenia sekwencji kodującej koniec 5' ludzkiego receptora glukagonu. Klon 9A trawiono EcoRI i KpnI w celu uzyskania fragmentu, wielkości 551 bp, zawierającego sekwencję kodującą koniec 5' ludzkiego receptora glukagonu Sekwencję kodującąkoniec 3' receptora glukagonu uzyskano jako fragment KpnI-BamHI, wielkości 561 bp, z klonu 40-2-2. Fragment EcoRI-KpnI i fragment KpnI-BamHI, wielkości 561 bp, ligowano w obecności EcoRI i BamHI, w celu zapobieżenia konkatameryzacji. Produkt ligacji, fragment wielkości 1112 bp, oczyszczono na żelu i nazwano 9A1. Dla wygody fragment 9A 1 ligowano do trawionego EcoRI-BamHI plazmidu pUC18. Mieszaniną ligacyjną transformowano komórki E coli szczepu DHlOb, zaś wybrane klony badano na obecność wstawki. Jeden z klonów posiadał wstawkę

Sekwencję kodującą receptor glukagonu wprowadzono do wektora ekspresyjnego ssaków przy użyciu plazmidu p9All i klonu 40-2-2 w celu uzyskania kompletnej sekwencji kodującej receptor glukagonu. Plazmid p9Alł trawiono pVull i BamHI w celu wyizolowania fragmentu wielkości 967 bp. Klon 40-2-2 trawiono BamHI i SacI w celu izolacji fragmentu wielkości 828 bp, zawierającego koniec 3' sekwencji kodującej ludzkiego receptora glukagonu. Wektor ekspresyjny ssaków pHZl linearyzowano przez trawienie EcoRI i wypełniano końce polimerazą DNA T4. Linearyzowany wektor o „tępych końcach” trawiono Sacl. Fragmenty Pvull-BamHI, wielkości 967 bp i BamHI-Sacl, wielkości 828 bp, ligowano z trawionym Sacl wektorem pHZ 1.

Plazmid pHZl jest wektorem ekspresyjnym, który może być użyty do ekspresji białka w komórkach ssaków lub systemie translacyjnym, opartym na oocytach żaby, z mRNA poddanym transkrypcji in vitro. Jednostka ekspresyjna pHZl składa się z promotora mysiej metalotioneiny-1, promotora bakteriofaga T7, otoczonego przez liczne miejsca klonowania, zawierające unikalne miejsca restrykcyjne do wprowadzania sekwencji kodujących, terminator ludzkiego hormonu wzrostu i terminator bakteriofaga T7. Dodatkowo, pHZl zawiera początek replikacji E coli, gen bakteryjny beta laktamazy, jednostkę ekspresyjną markera umożliwiającego selekcję zawierającą promotor i początek SV40, gen oporności na neomycynę i terminator transkrypcji SV40.

Plazmid pHZl zawierający sekwencję cDNA receptora glukagonu w poprawnej orientacji w stosunku do promotora, oznaczono jako pLJ6'. Wstawka i jej połączenia z wektorem zostały zsekwencjonowane w celu potwierdzenia obecności poprawnej sekwencji. Plazmid pLJ6' zdeponowano w American Type Culture Collection (12301 Parklawn Cr, Rockville, MD 20852) pod numerem 69183 15 stycznia 1993. Sekwencję DNA i przewidywaną sekwencję aminokwasową cDNA receptora glukagonu obecną w pLJ6' pokazano odpowiednio w Identyfikatorach Sekw. Nr 24 i25.

Przykład 6

Klonowanie cDNA receptora Glukagonu z ludzkich komórek wysepek

Dodatkowo do klonowania receptora glukagonu z komórek wątroby ludzkiej, uzyskano cDNA receptora glukagonu z biblioteki ludzkich komórek wysepek. Porcję biblioteki cDNA lu

178 685 dzkich komórek wysepek (przykład 1C) poddano amplifikacji PCR przy użyciu oligonukleotydu ZC5763 (Identyfikator Sekw Nr: 22), który jest ohgonukleotydem antysensownym zawierającym miejsce Xhol otoczone przez sekwencje z nie ulęgające translacji końca 3' cDNA ludzkiego receptora glukagonu. Obecność miejsc restrykcyjnych w starterach ohgonukleotydowych wspomaga ukierunkowane klonowanie powstałego produktu PCR do odpowiedniego wektora plazmidowego. Nastawiono mieszaninę reakcyjną PCR zawierającą 4 μΐ biblioteki cDNA komórek wysepek (przykład 1C), 8 μΐ Χ10 bufora PCR Promega (Promega), 20 pmoli ZC5763 (Identyfikator Sekw. Nr: 22), 20 pmoliZC5849 (Identyfikator Sekw. Nr: 23), 1 μΐ roztworu zawierającego 20 mM każdego z deoksyrybonukleotydów i 46.5 μΐ wody. Mieszaninę podgrzano do 95°C przez trzy minuty, następnie zmniejszono temperaturę do 80°C przez trzy minuty. Mieszaninę utrzymywano w temp. 80°C do czasu użycia. W celu rozpoczęcia reakcji dodano 20 μΐ mieszaniny enzymu zawierającej 2 μΐ 10Χ buforu PCR Promega (Promega), 2 pl 5U/pI polimerazy Taq I (Cetus) i 16 μΐ wody. Reakcję pokryto 50 μΐ oleju mineralnego (Sigma) i poddano trzydziestu cyklom (95°C przez minutę, 55°C przez minutę i 72°C przez dwie minuty i piętnaście sekund, która to inkubacj a w 72°C wydłużana była o trzy sekundy co każdy cykl) a następnie inkubowano przez dziesięć minut w 72°C. Po końcowej inkubacji w 72°C reakcja utrzymywana była w 4°C. Analiza przez elektroforezę na żelu agarozowym 10 μΐ porcji produktu PCR wykazała obecność fragmentu około 1 8 do 1.9 kb. W oparciu o cDNA ludzkiego receptora glukagonu obecnego w pLJ6'; oczekiwano fragmentu długości 1846 bp.

Reakcję PCR poddano ekstrakcji chloroformem, a następnie dwóm ekstrakcjom mieszaniną fenol: chloroform i końcowej ekstrakcji chloroformem. Po końcowej ekstrakcji dodano 5 μΐ 4 pg/pl nośnika glikogenowego (Boehringer Mannheim Corporation) i mieszaninę poddano precypitacji w obecności octanu amonu i etanolu. DNA zebrano przez odwirowanie a peletkę przemyto etanolem 70%. Peletkę DNA rozpuszczono w wodzie i trawiono Xhol i EcoRI. DNA oczyszczano na żelu i wklonowano do plazmidu pBLUESCRIPT SK⁺ (Stratagene Cloning Systems) linearyzowanego przez Xhol i EcoRI. Mieszaniną ligacyjną transformowano komórki E coli szczepu DH10B (GIBCO-BRL). DNA plazmidowe przygotowano z wybranych transformantów, i poddano je trawieniu enzymami restrykcyjnymi i analizie metodą Southern biot. Klony porównywano ze wstawka cDNA ludzkiego receptora glukagonu obecną w pLJ6'. Na podstawie diagnostycznego trawienia enzymami restrykcyjnymi, wybrane klony poddano analizie sekwencji. Wykazała ona, ze jeden z klonów pSLIGR-1, zawiera sekwencję kodującąreceptora glukagonu. Region kodujący pSLIGR-1 zawierał trzy zmiany nukleotydowe w porównaniu z cDNA wątroby obecnym w pLJ6'. Jedna ze zmian była cichą mutacją pozostałe dwie spowodowały zmiany w aminokwasach jak to pokazano w Tabeli 5. Analiza zmian wskazuje, ze mogąbyć one rezultatem odmian polimorficznych reprezentujących warianty alleliczne.

Tabela 5

Numer Aminokwasu	Aminokwas według sekwencji cDNA Wątroby	Aminokwas według sekwencji cDNA Komórek Wysepek
184 265	Phe Ser	Leu Gly

Przykład 7

Klonowanie genu ludzkiego receptora glukagonu

W celu uzyskania klonu genomowego ludzkiego receptora glukagonu, przeglądano dwie biblioteki przy użyciu cDNA ludzkiego receptora glukagonu jako sondy. Przeglądano amplifikowaną ludzką bibliotekę genomowąłożyska męzczyzny rasy kaukaskiej lambdaFIX II i amplifikowaną ludzką bibliotekę genomowąpłuca lambdaFIX (obie pochodzące ze Stratagene Cloning Systems, numery katalogowe 946203 i 944201) w poszukiwaniu genu ludzkiego receptora glukagonu.

178 685

Amplifikowaną ludzką bibliotekę genomową płuca miareczkowano i wysiano około 4X10⁴ jednostek tworzących kolonie (pfu) z komórkami E coli szczepu LE392 (Stratagene Clomng Systems) na każdej z trzydziestu płytek średnicy 150 mm. Wysiano dodatkowo dziesięć płytek po 6X10⁴ komórek E coli szczepu LE392 Płytki poddano inkubacji przez noc w 37°C wybrano trzydzieści płytek do przeglądania.

Wykonano filtry w powtórzeniach dlakazdej z trzydziestu płytek. Każdy z filtrów wykonano przez przykrycie płytki błoną nylonową HYBOND (Amersham) zgodnie z zaleceniami producenta Filtry zdejmowano z płytki, zaś komórki poddawano lizie w 1,5M NaCl i 0.5M NaOH przez pięć minut w temp, pokojowej. Filtry zobojętniano przez pięć minut w IM Tris-HCl (pH 7 5), 1.5 M NaCl i utrwalano za pomocą 1200 miJ energii UV w urządzeniu STRATALINKER (Stratagene Cloning Systems). Po utrwaleniu filtry przemywano trzykrotnie w 0.25XSSC, 0.25%SDS, 1 mMEDTA w temp. 65°C. Po przemyciu filtry rozdzielono na sześć partii po 10 filtrów i prehybrydyzowano w roztworze do prehybrydyzacji (5XSSC, 5X roztwór Denhardta, 0.2% SDS, 1 mM EDTA) filtrowanym przez filtr o średnicy porów 0.45 pm po czym dodawano bezpośrednio przed użyciem 100 pg/ml zdenaturowanego gorącym DNA spermy łososia Filtry prehybrydyzowano przez noc w temp. 65°C.

cDNA ludzkiego receptora glukagonu z klonu p40-2-2 znakowano starterami o losowej sekwencji zestawu MEGAPRIME (Amersham) przy użyciu protokołu producenta. Roztwór do prehybrydyzacji z każdej z partii filtrów był usunięty i zastąpiony przez świeży roztwór do prehybrydyzacji z dodatkiem 28 5Χ10⁶ cpm sondy. Filtry hybrydyzowano w 65°C przez dwadzieścia godzin Po hybrydyzacji roztwór hybrydyzacyjny był usuwany, filtry płukano cztero- lub pięciokrotnie w roztworze do płukania zawierającym 0.25XSSC, 0.2%SDS, 1 mM EDTA w temp pokojowej. Po płukaniu filtry przemywano w ośmiu kolejnych kąpielach w 65°C a następnie końcowym płukaniem w temp. 70°C. Po kąpieli w 70°C filmy poddawano autoradiografii na filmie (XAR-5, Eastman Kodak Co., Rochester, NY) przez cztery dni w -70°C z użyciem ekranu intensyfikującego.

Badanie autoradiogramów wykazało obecność czterech regionów hybrydyzacji z sondą znakowaną radioaktywnie. Pobrano fragment agaru z każdego z czterech regionów, do oczyszczania. Każdy z fragmentów agaru moczono przez noc w 1 ml SM (Maniatis in., Molecular Cloning· A Laboratory Manuał Cold Spring Harbor,NY, 1982; zamieszczone tu jako odnośnik), 1% chloroformu. Po inkubacji przez noc, faga z każdego z fragmentów agaru rozcieńczono 1 · 1000 SM. Porcje po 5,25 i 50 μΐ wysiano z komórkami E coli szczepu LE392. Płytki inkubowano po czym przygotowano pojedyncze odciski z płytek wysianych przy użyciu 5 i 25 μΐ Filtry wykonano, prehybrydyzowano i hybrydyzowano jak to opisano powyżej. Filtry eksponowano na film autoradiograficzny.

Badanie autoradiogramów wykazało regiony znakowane pozytywnie pochodzące z każdego z czterech klonów. Dziesięć fragmentów agaru pobrano z regionów wyznakowanych pozytywnie reprezentujących co najmniej dwa obszary pozytywne dla każdego z oryginalnych klonów. Fragmenty agaru traktowano jak to opisano powyżej. Faga z każdego z fragmentów agaru rozcieńczono 1:10000 w SM. Porcje 2.5 μΐ i 10 μΐ posiano z komórkami E coli szczepu LE392. Płytki inkubowano po czym przygotowano pojedyncze odciski z każdej z płytek posiadających odpowiednio izolowane kolonie. Filtry przygotowano i prehybrydyzowano jak to opisano powyżej. Autoradiogramy z filtrów wykazały obecność obszarów eksponowanych odpowiadających pojedynczym koloniom. Pobrano dwanaście pozytywnych kolonii reprezentujących co najmniej jeden klon z każdego z czterech oryginalnych pozytywów. Jedna kolonia z każdej płytki poddana została dalszej analizie.

Fragmenty agaru z klonów faga 2-2-1,3-1-1 i 14-2-1 i 11-2-1 badanojakto opisano powyżej. Fag został rozcieńczony 1:100 w SM i posiany na hodowlę komórek E coli szczepu LE392. Dwuniciowe DNA przygotowano tak jak to opisano w Grossberger (Nuc Acids Res 15:6737, 1987; zamieszczone tu jako odnośnik). Dwuniciowe DNA trawiono Xbal w celu uwolnienia wstawki genomowej Elektroforeza na żelu agarozowym wykazała, ze klony 2-2-1 i 11-2-1 zawierały wstawkę Xbal wielkości około 1 9 kb, klon 14-2-1 zawierał wstawkę 15 kb, zaś 3-3-1 za

178 685 wicrał wstawkę wielkości 13 kb Analiza metodą Southern biot, klonów trawionych Xbal i Xbal-BamHI wykazała, ze cDNA ludzkiego receptora glukagonu pokazana jest na figurze 6.

Tabel a 6

Numer Nowego Klonu	Oryginalny Numer klonu	Hybrydyzacja z fragmentem Xbal	Hybrydyzacja z fragmentem Xbal-BamHI
klon 1	2-2-1	~9kb	4 2 kb, 1 9 kb
klon 6	11-2-1	~9kb	4 2 kb, 1 9 kb
klon 2	14-2-1	~ 15 kb	4 2 kb, 1 9 kb
klon 5	3-3-1	~ 13 kb	1 6 kb

Klony 11-2-1 i 14-2-1 poddano dalszej analizie. Klon 2-2-1 wydawał się być identyczny z klonem 11-2-1 stąd zaniechano jego dalszej analizy. Dla wygody nazwy klonów zmieniono tak jak to opisano w tabeli 6. Dwuniciowe DNA przygotowano z każdej z kolonii faga do wklonowania do wektora plazmidowego według metody opisanej przez Maniatis. DNA trawiono Xbal, oczyszczano na żelu i wklonowy wano do plazmidu pBLUESCRIPT SK (Stratagene Clomng Systems) linearyzowanego trawieniem Xbal i poddanego działaniu fosfatazy alkalicznej cielęcej w celu zapobieżenia recyrkulacji. Mieszaniny ligacyjnc wprowadzano przez elektroporację do komórek DH1 OB ELECTROMAX (GIBCO-BRL) w urządzeniu GENEPULSER (Bio-rad Laboratories; Richmond; CA) przy 400 ohm, 25 mifaradów i 2.3 kV. Przygotowano DNA plazmidowe z wybranych transformantów. Klony zawierające genomową wstawkę z klonów 6 i 2 nazwano pSLHGRó i pSHLGR2. Klony pSLHGRó i pSHLGR2 poddano sekwencjonowaniu. Analiza i porównanie sekwencji z regionem kodującym ludzkiego receptora glukagonu wykazało obecność 12 egzonów obejmujących region kodujący. Analiza chromosomów, przeprowadzona na rozmazach chromosomów metafazalnych opisana przez Dumam i in (Mol Celi Biol 8: 1863-1867,1988; zamieszczona tu jak odnośnik) przy użyciu biotynowanej sondy genu receptora glukagonu i sondzie specyficznej dla rejonu centromerowego chromosomu 17 Denaturację chromosomów, hybrydyzację i wykrywanie pojedynczego koloru przeprowadzono jak to opisano przez Pinkel i in., (Proc Natl Acad SCI, 83: 2934-2938,1986, zamieszczona tu jako odnośnik) i modyfikacje Kievits i in. (Cytogenet Celi. Genet. 53:134-136,1990, zamieszczona tu jako odnośnik), z wyjątkiem tego, ze hybrydyzację przeprowadzono w 65% (obj/obj) mieszaninie formamid/siarczan dekstranu/2XSSC i płukanie po hybrydyzacji 65% mieszanina formamid/2XSSC w temp. 42°C po czym płukano w 0.1XSSC w temp. 55C jak to opisano przez Palmiter i in., (Proc Natl Acad Sci USA, 89: 6333-6337,1992, zamieszczona tu jako odnośnik). Potwierdzono translokację w położeniu q²⁵ przez barwienie DAPI niektórych z rozmazów metafazalnych jak to opisano przez TestA i in., (Cytogenet Celi Genet 60: 247-249,1992; zamieszczone tu jako odnośnik). Barwienie DAPI spowodowało powstanie wzoru przypominającego prążki Q.

Amplifikowana biblioteka ludzkiego łożyska (Stratagene) przeszukiwana była, bezskutecznie, w poszukiwaniu genu ludzkiego receptora glukagonu przy użyciu metody opisanej powyżej. Bibliotekę miareczkowano i wysiano około 5X10⁴ pfu z komórkami E coli szczepu LE392 (Stratagene Cloning Systems) na każdej z trzydziestu płytek średnicy 150 mm. Wysiano dodatkowo jedenaście płytek po 105 pfu i komórki E. coli szczepu LE392. Płytki poddano inkubacji przez noc w 37°Ć wybrano trzydzieści osiem płytek do przeglądania.

Wykonano odciski na filtrach nylonowych, płukano je i prehybrydyzowano jak to opisano powyżej. Fragment cDNA receptora glukagonu ludzkich komórek wysepek G30 (przykład 4) znakowano starterami o losowej sekwencji zestawu MEGAPRIME (Amersham) przy użyciu protokołu producenta. Roztwór do prehybrydyzacji z każdej z partii filtrów był usunięty i zastąpiony przez świeży roztwór do prehybrydyzacji z dodatkiem 1 1Χ10⁶ cpm sondy Filtry hybrydyzowano w 65°C przez noc. Po hybrydyzacji roztwór hybrydyzacyjny był usuwany, filtry płukano cztero- lub pięciokrotnie w roztworze do płukania zawierającym 0.25XSSC, 0 2%SDS,

178 685 mM EDTA w temp, pokojowej Po płukaniu filtry przemywano w ośmiu kolejnych kąpielach w 65°C a następnie końcowym płukaniem w temp 70°C Po kąpieli w 70°C filmy poddawano autoradiografii na filmie (XAR-5, Eastman Kodak Co.) przez cztery dni w -70°C z użyciem ekranu intensyfikującego.

Badanie autoradiogramów nie wykazało przekonywujących sygnałów pozytywnych; jednakże, wybrano siedem obszarów o słabym znakowaniu do dalszej analizy. Klony poddano ponownemu przeglądaniu, jak to opisano powyżej, ale ponownie wykonane autoradiogramy nie wykazały znakowania w ogóle. Nie poszukiwano więc tych klonów.

Przykład 8

Ekspresja cDNA receptora glukagonu w komórkach ssaków

A. Ekspresja Szczurzego Receptora Glukagonu w Komórkach BHK570

Plazmid pLJ4 kotransfekowano z plazmidem pLJ 1 do komórek BHK570 (zdeponowanych w American Type Celi Collection pod numerem 10314) przy użyciu metody fosforanu wapnia opisanej przez Graham i Van der Eb (Virology 52:456, 1973, zamieszczone tu jako odnośnik). Plazmid pLJ otrzymano z plazmidu p416 zawierającego ori Adenowirusa 5, wzmacniacz SV40, główny późny promotor Adenowirusa 2, potrójny lider Adenowirusa 5, miejsca składania 3' i 5', cDNA DHFR^r, sygnał poliadenylacji SV40 i sekwencje wektora pML-1 (Lusky i Botchan, Naturę 293: 79-81, 1981) Jednostkę ekspresyjną EcoRI-Xbal DNFR z plazmidu p416 ligowano do pUC 18 linearyzowanego przez trawienie EcoRI i Xbal, w celu stworzenia pL J1. Transfekowane komórki hodowano w pożywce (Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) zawierającego 10% surowicy płodowej cielęcej, mieszankę antybiotyków 1XPSN (GIBCO-BRL 600-5640), i 2 0 mM L-Glutaminę). Po kilku dniach w nie selekcjonującej pożywce, pożywkę zastępowano pozywkąselekcjonującą(pozywka zawierająca250 mM metotreksat (ΜΤΧ)). Komórki rozdzielano i rozcieńczano 1:20 i 1:50 w pożywce selekcjonującej w płytkach 10 cm. Po 7-10 dniach selekcji w 250 mM ΜΤΧ, pobierano kolonie przy pomocy cylindrów do klonowania, do płytek 24-studzienkowych. Powstałe klony badano na zdolność wiązania glukagonu jak to opisano powyżej (przykład 3). Wiązanie glukagonu przeprowadzano również ze wszystkimi komórkami przez posianie 2X10⁵ komórek każdego z klonów do studzienki płytki 24-studzienkowej. Płytki inkubowano przez 72 godziny w 37°C i 5% CO₂. Wiązanie glukagonu przeprowadzano w sposób opisany w przykładzie 3, z wyjątkiem tego, ze po ostatnim płukaniu w PB S, komórki usuwano ze studzienki przez trypsynizację do probówek. Probówki zliczane były w liczniku gamma. Komórki posiadające najwyższą liczbę zliczeń, a stąd zdolne do związania największej ilości glukagonu, wybierano do dalszych badań. Wybrane transformanty badano również na odpowiedź cAMP zaleznąod glukagonu jak to opisano w przykładzie 8D i odpowiedź wapnia wewnątrzkomórkowego zalezna od glukagonu jak to opisano w przykładzie 8E. Test wiązania glukagonu przeprowadzano również na preparatach błon komórkowych z transfektantów opisanych powyżej.

B. Wiązanie glukagonu przez preparat błon

Błony ztransfekowanychpLJ4 komórek BHK porównywano z preparatami błon szczurzej wątroby pod kątem ich zdolności wiązania ¹²⁵I-glukagonu Błony przygotowano jak to opisano przez Rodbell i m., (J Biol Chem 246:1861-1871,1971, zamieszczone tu jako odnośnik). Dwie partie błon z wątroby przygotowano z ok. 80 g wątrób pobranych od 12 do 16 zdekapitowanych młodych samic szczura. Wątroby szybko pobrano i umieszczono w chłodzonym lodem naczyniu. Wątroby podzielono na dziesięciogramowe porcje. Porcje były rozdrabniane nożyczkami, w trakcie czego usuwano tkankę łączną. Porcje były homogenizowane osobno w homogenizatorze Dounce. Do każdej rozdrabnianej w homogenizatorze porcji dodano 25 ml Mediumk (tabela 2), i każdą z porcji homogenizowano na lodzie ośmioma silnymi ruchami tłuczka homogenizatora Po homogenizacji, homogenaty zbierano w 450 ml zimnego Medium (tabela 2). Spulowane homogenaty mieszano przez trzy minuty i filtrowano przez dwie warstwy sukna a następnie przez cztery warstwy sukna. Homogenaty odwirowano przez 30 minut przy 1500Xg w temp. 4°C. Nadsącze usunięto a peletki pulowano do czystego homogenizatora Dounce. Peletki zawieszono trzema delikatnymi ruchami tłuczka. Zawieszone peletki strącano w naczyniu miarowym o poj

178 685

250 ml, zawierającym 62 ml 69% Roztworu Cukrozy (tabela 2) Dodawano wody destylowanej do objętości końcowej 110 ml, mieszano energicznie i trzymano w chłodzie. Stężenie roztworu dostrajano do 44% +/- 0,1% przy użyciu 69% cukrozy lub wody, co mierzono refraktometrem (Bausch & Lomb, Rochester, N Y). Zawiesinę z cukrozą rozdzielano po równo probówek do ultrawirowania 25X89 mm. Każdą z zawiesi ostrożnie pokrywano 20 ml 42.3% Roztworu Cukrozy (tabela 2), i wirowano zawiesiny przez 150 minut przy 24000 rpm w rotorze SW28 (Sorvall, DuPont Company, Wilmington, Del.) w temp. 4°C.

Po odwirowaniu, pływający materiał z każdej probówki usuwano przez aspirację do 10 ml strzykawki przez igłę 18G. Materiał z każdej z probówek był pulowany i zawieszany w ok. 10 ml Medium (tabela 2) przez wciąganie i wypychanie mieszaniny przez igłę do probówki wirowniczej. Probówkę napełniono Medium (tabela 2) i wirowano przez 15 minut przy 15000 rpm w wirniku SS-34 (Sorvall). Nadsącz ostrożnie zbierano i usuwano. Peletkę zawieszono w Medium (Tabela 2) i rozcieńczono 1:1000 wodą destylowaną. Odczytywano absorbancję w 1 cm kuwetach w celu określenia zawartości białka. Stężenie białka określano przy użyciu wzoru:

A x A ^224nm ^Λ^236ηπ r + · - r ii / ₇

------------- x krotność - rozcieńczenia - mg - białka / ml 6 45 ⁶

Preparat błon porcjowano, zamrażano w kąpieli suchy lód/metanol, i przechowywano w -80°C.

Błony były przygotowywane z transfekowanych komórek BHK rosnących zlewnie w 150 mm płytce w pożywce selekcjonującej. Dwie płytki transfektantów rosnących zlewnie przepłukiwano dwukrotnie zimnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS; sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), po czym dodawano do każdej płytki 10 ml PBS zawierającego 1 mM PMSF. Komórki z każdej płytki były zdrapywane do roztworu PBS, i przenoszone do świeżych probówek. Każda z płytek przemy wana była 5 ml PBS zawierającego 1 mM PMSF po czym płyn po płukaniu dodawany był do odpowiednich komórek. Komórki odwirowano przy 2000 rpm na wirówce stołowej w temp. 4°C. Nadsącza usuwano a komórki zawieszano w 30 ml 5 mM Hepes, 1 mM PMSF, pH 7.5. Komórki inkubowano na lodzie przez 15 minut a następnie odwirowane przy 47800Xg w temp. 4°C. Każdą peletkę zawieszano w roztworze PBS zawierającym 1 M PMSF, porcjowano i mrożono w -80°C.

Badanie współzawodnictwa z użyciem testu wiązania glukagonu przeprowadzano na preparatach błon wątroby szczurzej i komórek BHK transformowanych. Pokrótce, nastawiono probówki reakcyjne zawierające 20 μΐ glukagonu z od 10’¹¹ M do ΙΟ'⁶ M rozcieńczonego w 10 mM HO Ac lub 20 μΐ BSA. Do każdej z probówek dodano 100 μΐ Buforu do wiązania, 20 μΐ ¹²⁵I-glukagonu (Amersham); 20 μ/1 mM NaHCO₃; 20 μΐ 10 mMHOAc, 0.5% BSA (Novo Nordisk N/A, Bagsvaerd, Demnark) i 40 μΐ wody destylowanej. Reakcję wiązania zapoczątkowano przez dodanie 20 μΐ preparatu błon do każdej z probówek. Reakcję inkubowano przez 30 minut w 30°C. Błony zbierano przez odwirowanie w mikrowirówce na wysokich obrotach przez 10 minut w temp 4°C. Nadsącza z każdej z próbek aspirowano, i zliczano impulsy peletki. Współzawodnictwo z nieznakowanym glukagonem dało prawie identyczne krzywe sigmoidalne wiązania glukagonu (figura 3). Według analizy Scatcharda (Scatchard, Ann. N. K Acad Sci 51: 660-672, 1949; zamieszczona tu jako odnośnik), Kd wynosiła 50 nM dla klonowanego receptora i 49 nM szczurzych błon z wątroby (figura 4).

Specyficzność receptora kodowanego przez pLJ4 badano przez zdolność do współzawodniczenia o wiązanie pokrewnych hormonów peptydowych z ¹²⁵I-glukagonem. Do preparatów błon komórek transfekowanych pLJ4 dodawano mikromolame ilości glukagonu i pokrewnych peptydów (tabela 7), wraz z ¹²⁵I-glukagonem w teście wiązania opisanym powyżej. Wyłącznie natywny glukagon 1 antagonista, amid des-His^Glu⁹ ]-glukagonu były zdolne współzawodniczyć z ¹²⁵I-glukagonem o wiązanie z błoną.

178 685

Tabela 7

1 μΜ	ludzki glukagon (Sigma)
1 μΜ	1 9 amid des-His [Glu ] glukagonu (syntetyzowany na syntezatorze peptydów 431 A Applied Biosystems przy użyciu żywicy RTNK AMIDĘ MBHA (Bachem Bioscience Inc , Philadelphia, Penn ))
200 nM	ludzki peptyd podobny do glukagonu (GLP) (Sigma)
20 nm	świński jelitowy peptyd wazoaktywny (VIP) (Sigma)
1 μΜ	kalcytonina łososiowa (Sigma)
1 μΜ	świńska sekretyna (Sigma)
1 μΜ	wołowy hormon przytarczyc (PTH) (Sigma)

C. Ekspresja Szczurzego Receptora Glukagonu w Komórkach COS-7

Zdolność komórek COS-7 transfekowanych pLJ4 do bycia pobudzanym przez glukagon do zwiększenia poziomów cAMP, badana była przy użyciu Amersham SPA (Amersham) jak to opisano poniżej (przykład 8D) Test pokazał, ze stymulowane glukagonem transfektanty pLJ4 akumulują około pięć razy więcej cAMP w porównaniu z kontrolnymi komórkami COS-7 transfekowanymi samym wektorem. Pokrewne peptydy jak sekretyna, VIP, PTH, GLP i kalcytonina dodane były do transfektantów w stężeniach od 100 nM do 1000 nM i badane na ich zdolność do indukowania podwyższonych poziomów cAMP. Wyniki testu pokazały, ze żaden z pokrewnych peptydów nie jest zdolny do znaczącego podniesienia poziomów cAMP.

D. Badania z Użyciem Lucyferazy i Cyklazy Adenylowej na Całych Komórkach cDNA szczurzego receptora glukagonu ekspresjonowano w linii komórkowej BHK570, stabilnie transfekowanej ZK6, jednostce ekspresyjnej zawierającej promoter zawierający co najmniej jeden element odpowiedzi na cAMP, DNA lucyferazy i terminator hGH. Ta linia komórkowa pozwala mierzyć aktywność lucyferazy, aktywność cyklazy adenylowej i stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego w odpowiedzi na związanie glukagonu z jego receptorem.

Element odpowiedzi na cAMP proenkefaliny (CRE) w plazmidzie ZK6 uzyskano z Zem233. Zem233 uzyskano z plazmidów Zem67 i ZemlOó. Plazmid Zem 106 skonstruowano z prekursora Zem93. W celu skonstruowania Zem93, fragment Kpnl-BamHI zawierający promoter MT-1 wyizolowano zMThGHlll (Palmiter i in., Science 222: 809-814,1983) i wprowadzono do pUC18 Plazmid Zem93 trawiono Sstl i ponownie ligowano w celu stworzenia plazmidu ZemlOó, w którym wyeliminowano około 600 bp sekwencji 5' od promotora MT-1.

CRE proenkefaliny wprowadzono do końca 5' promotora SV40 Zem 109 przez, po pierwsze trawienie ZemlOó EcoRI i Sstl w celu wyizolowania fragmentu zawierającego wektor. Oligonukleotydy ZC982 i ZC983 (Identyfikatory Sekw. Nr: 3 i 4) zaprojektowano tak by kodowały, po sparowaniu, CRE proenkefaliny od nukleotydu-71 do-133 (Comb. i m., Naturę 323: 353-356, 1986) otoczony z końca 5'miejscem EcoRI a z końca 3'miejscem Sstl Oligonukleotydy ZC982 i ZC983 (Identyfikatory Sekw Nr· 3 i 4) kinazowano, sklejono i ligowano z linearyzowanymplazmidem ZemlOó w celu uzyskania plazmidu Zem224.

Plazmid Zam67 uzyskano przez trawienie pIC19R (Marsh i in., Gene 32: 481-486, 1984) trawieniem Smal i Hindlll. Region ori SV40 zpozycji 270 (Pvull) przeniesiono ligując w pozycję 5171 (Hindlll) do linearyzowanego pICI9R tworząc Zem67. Fragment Hindlll-BamHI, zawieraj ący gen oporności na neomycynę i terminator S V40 z plazmidu pSV2-neo (America Type Culture CollectionNr. 37149) wprowadzono do trawionego Hindlll-Bglll Zem67 w celu stworzenia Zem220.

Wyizolowano jednostkę ekspresyjną zawierającą promoter SV40-gen oporności na neomycynę-terminator SV40, jako fragment EcoRI. Plazmid Zem224 trawiono EcoRI i traktowano cielęcą fosfatazą alkaliczną w celu zapobieżenia ponownej cyrkularyzacji Ligowano jednostkę ekspresyjną neomycyny i linearyzowany Zem224. Plazmid zawierający promotor SV40 blizszy CRE oznaczono Zem233

178 685

Plazmid Zem233 zmodyfikowano przez wprowadzenie dodatkowej sekwencji CRE, kasety TATA i część kodującą LacZ i sekwencje poli(A) bezpośrednio 3' od sekwencji CRE proenkefaliny, tak by powstała jednostka ekspresyjna była w odwrotnej orientacji w stosunku do jednostki oporności na neomycynę obecnej w Zem233. Plazmid Zem233 linearyzowano przez trawienie BamHI i SstL Oligonukleotydy ZC3509 i ZC3510 (Identyfikatory Sekw. Nr: 5 i 6) zaprojektowano tak by po sparowaniu powstały dupleks kodował alfa glikoproteinę CRE (Delegeane i in , Celi Biol 7: 3994-4002,1987) z lepkim końcem 5'Sstl i lepkim końcem 3'EcoRI. Oligonukleotydy parowano zgodnie ze standardowymi metodami. Kasetę TATA otrzymano jako fragment EcoRI-Pstl obejmujący nukleotydy -79 do +18 genu kinazy tymidynowej (McKnight, Celi 31: 355-366,1982). Sekwencję 3' genu LacZ i związanej z nią sekwencji poli(A) otrzymano jako fragment Pstl-BamHI z plazmidu pLacF (otrzymanego od Jaąues Peschon, Immunex Corp., Seattle, Wash,) zawierającego region kodujący LacZ i mysi terminator protaminy wklonowano do pUC 18. Zem233 poddano linearyzowaniu Sstl-BamHI i ligowano sekwencje: fragment Sstl-EcoRI adaptora ZC3509/ZC3510, fragment EcoRI-Pstl zawierający kasetę TATA i sekwencja LacZ Pstl-BamHI. Plazmid zawierający jednostkę ekspresyjną w odpowiedniej orientacji w stosunku do jednostki ekspresyjnej genu oporności na neomycynę Zem233 oznaczono KZ5.

Gen lucyferazy i sekwencje terminatora ludzkiego hormonu wzrostu (hGH) użyto by zmienić sekwencję kodującą LacZ i sekwencje kodujące poli(A) obecne w KZ5. Gen lucyferazy otrzymano oryginalnie z plazmidu alfa-1681uc (Delcgeano i in., Mol Celi Biol., 7: 3994-4002, 1987) i deWet i in., Mol Celi Biol, 7 725-737, 1987) jako fragment Xhol-Xbal długości ok. 1.7 kb. Terminator hGH uzyskano jako fragment Xbał-Sall z Zem219b (zdeponowanego jako transformant E coli w American Typc Culture Collection (Rockville, Md) pod numerem ATCC 68979). Gen lucyferazy i sekwencje terminatora hGH wklonowano dla wygody do linearyzowanego trawieniem Xhol-Sall pICI9H (Marsh i in., ibid). Powstały plazmid KZ8, trawiono Xhol i Sali, w celu izolowania sekwencji lucyferaza-terminator hGH. Plazmid KZ5 trawiono Sali w celu izolacji fragmentu zawierającego wektor i traktowano cielęcąfosfataząalkalicznąw celu zapobieżenia ponownej cyrkularyzacji. Fragment Xhol-Sall zawierający lucyferazę-terminator hGH ligowano z trawionym Sali KZ5. Plazmid zawierający lucyferazę-terminator hGH w odpowiedniej orientacji w stosunku do promotora oznaczono KZ6.

Plazmid KZ6 transfekowano do komórek BHK570 (zdeponowanych w American Type Culture Collection pod numerem 10314) przy użyciu metody precypitacji na fosforanie wapnia opisanej przez Graham i Van der Eb (Eirology 52: 456, 1973, zamieszczone tu jako odnośnik). Transfekowane komórki hodowano w pożywce (Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) zawierającej 10% surowicy płodowej cielęcej, mieszaninę antybiotyków 1XPSN (GIBCO-BRL) i 2.0 mM L-glutaminę). Po kilku dniach w pożywce niesclcktywnej, pożywkę zmieniono na pożywkę selekcjonującą G418 (pożywka zawierająca 500 pg/ml G418). Komórkom umożliwiono wzrost do fazy zlewnej po czym trypsynizowano je i posiewano w rozcieńczeniach krańcowych do studzienek płytek 96-cio studzienkowych. Komórkom pozwolono rosnąć przez jeden do dwóch tygodni w pożywce selekcjonującej G418. Klony ze studzienek zawierających pojedyncze kolonie badano na zdolność do odpowiedzi na forskolin w teście lucyferazy opisanym poniżej. Forskolin podnosi komórkowy poziom cAMP i uruchamia szlaki odpowiedzi biologicznych związane z cAMP w sposób niezależny od receptora. Klon zdolny do odpowiedzi na forskolin oznaczono BHK/KZ6-19-46.

Komórki BHK/KZ6-19-46 były kotransfekowane pLJ4 i pLJl lub pZCEP i pLJl (transfektantów pZCEP używano jako kontroli negatywnej) jak to opisano powyżej przy użyciu transfekcji za pomocą fosforanu wapnia. Transfektanty selekcjonowano w 250 nM metotreksacie jak to opisano poprzednio.

Transfektanty badano w trzykrotnych powtórzeniach na wywoływanie odpowiedzi CRElucyferazy przez wybranych agonistów. Badano sześć losowo wybranych transfektantów pLJ4, i losowych transfektantów pZCEP (kontrola negatywna). Płytki testowe microtiter nastawiono w ten sposób, że każda ze studzienek zawierała2X10⁴ komórek w 100 μΐ pożywki selekcjonującej, i

178 685 hodowano komórki przez noc. Roztwory agonistów przygotowano w pożywce selekcjonującej, w X2 stężeniu docelowym tak jak to wyszczególniono:

μΜ glukagon

200 nM peptyd podobny do glukagonu (GLP) nM wazoaktywny peptyd jelitowy (VIP)

100 nM kalcytonina (CT) μΜ forskolin (CalBiochem, San Diego, Califf.)

Indukcję wywołano przez dodanie 100 μΐ każdego z X2 roztworów do powtórzonych trzykrotnie studzienek. Nieindukowany poziom oznaczono w potrójnym powtórzeniu w studzienkach do których dodano po 100 μΐ DMEM zawierającego 10% surowicy płodowej cielęcej. Płytki inkubowano przez cztery godziny w 37°C, 5% CO₂, w celu umożliwienia produkcji lucyferazy.

W następstwie indukcji, pożywkę usunięto i studzienki przemywano raz 200 μΐ/ studzienkę PBS. Po przemyciu do każdej ze studzienek dodano po 25 μΐ IX Celi Culture Lysis Reagent (Luciferase Assay System, Promega Corp., Madison, Wis.) po czym płytki inkubowano przez 15 minut w temp, pokojowej. Płytki przeniesiono do płytkowego czytnika lunescencji Labsystem Luminoscan (Labsystems Inc., Morton Grove, lii.), który dodał po 40 μΐ Luciferase Assay Substrate (Luciferase Assay System, Promega), mieszał reakcję przez trzy sekundy i odczytywał sygnał lucyferazy z każdej studzienki przez dwie sekundy. Krotność indukcji lucyferazy przez każdy z agonistów, obliczana była jak następuje:

, , , sygnał wywołany - sygnał nie wywołany krotność indukcji =--------------------------------------sygnał nie wywołany

Jeden z klonów transfektantów pLJ4, KZ6/rGR-DHFR-2, wykazywał 6-10 krotną indukcję lucyferazy przez glukagon, ale nie był indukowany przez GLP, VIP czy CT.

Odpowiedź cAMP klonu KZ6/rGR-DHFR-2 na glukagon i forskolin badana była również testem radioimmunologicznym z użyciem cAMP[^12sI] Scintillation Proximity Assay System (Amersham) zgodnie z instrukcją producenta. Pokrótce, 100 μΐ 2X10⁵ komórek KZ6/rGR-DHFR-2 na ml posiane zostało do studzienek wielostudzienkowej płytki hodowlanej i hodowane przez noc w pożywce selekcjonującej. Glukagon i forskolin przygotowano w DMEM, 10% surowicy płodowej cielęcej, 10 miM ΙΒΜΧ w stężeniach od 0.0001-1000 nM i 25 miM.

Pożywkę zmieniono na 50 μΐ/studzienkę agonisty (glukagonu bądź forskolinu). Komórki inkubowano z agonistąprzez 10 minut w 3 7°C, 5% CO₂. Następnie po inkubacj i, komórki poddano lizie przez dodanie do każdej studzienki 200 μΐ wrzącej wody. Po 15 minutach nadsącza zbierano i rozcieńczano L5 lub 1:40 w buforze octanowym (cAMP [¹²⁵I] Scintillation Proximity Assay System (Amersham)). Próbki poddawano acetylacji przy użyciu trietylaminy i bezwodnika octowego zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta.

Porcje po 100 μΐ acetylowanych próbek połączono z 75 μΐ ^l25I-cAMP, 75 μΐ surowicy anty-bursztyniano-cAMP i 75 μΐ oślich IgG przeciwkróliczych skoniugowanych z kulkami SPA (wszystkie roztwory dostarczono w cAMP [¹²⁵I] Scintillation Proximity Assay System (Amersham)) w studzience tacki T LKB. Tacki zamknięto i inkubowano przez noc z ciągłym wytrząsaniem na wytrząsarce ustawionej na 200 rpm. Próbki zliczano w liczniku scyntylacyjnym 1205 BETAPLATE (Pharmacia LKB Instruments Inc., Gaithersburg, Md.) Określono również krzywą standardową używając stężeń od 2 do 128 fmoli acetylowanego cAMP. Określono również całkowite związane ^l23I-cAMP i niespecyficzne wiązanie. KZ6/rGR-DHFR-2 wykazywał 140 krotną indukcję poziomu cAMP przy wysyceniu glukagonem (10-100 nM) i ED₅₀ równą 0.25 nM.

E. Oznaczanie Stężenia Wewnątrzkomórkowego Wapnia

Odpowiedzi wewnątrzkomórkowego wapnia transfektantów pLJ4 na glukagon badano metodą opisaną przez Grynkiewicz i in (J Biot Chem 260: 3440-3450, 1985, złączone tu jako odnośnik). Transfektanty pLJ4 posiewano do dwustudzienkowych komór (NUNC) w liczbie 5X10⁴ komórek na komorę Komórki hodowano przez jeden do trzech dni normalnych warun

178 685 kach hodowli w pożywce selekcjonującej zawierającej metotreksat. Pożywkę aspirowano zaś komory przemywano dwukrotnie 1 ml Buforu do Obrazowania (tabela 3). Komórki inkubowano przez 30 minut w ciemności w temp, pokojowej z 0.5 ml Roztworu Fura-2 AM (tabela 3) Po inkubacji, usuwano Roztwór Fura-2 AM, zaś komórki przemywano 1 ml Buforu do Obrazowania trzykrotnie. Po ostatnim przemyciu w komorze pozostawiano 0.5 ml buforu. Komórki trzymane byty w ciemności w temp pokojowej przez 30 do 120 minut.

Obrazowanie wykonywano na fluorescencyjnym mikroskopie odwróconym Nikon Diaphot wyposażonym w lampę rtęciową i objektywy Nikon Fluor dry 10Χ i 40Χ. Doświadczenia były kontrolowane i analizowane przy pomocy stacji Sun SPARCII i oprogramowania Inovision RATIOTOOL (Research Triangle Park, N.C.). Zmienne długości fali wzbudzenia kontrolowane były przez to oprogramowanie przez zautomatyzowany zestaw filtrów zawierający filtry o widmie 340 nm i 380 nm. Obrazy emisyjne kierowane były przez lustro półprzepuszczalne (380 nm) do kamery CCD Dage-MTI 72 wyposażonej we wzmacniacz obrazu Genesis II i zapisywane cyfrowo.

Wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia monitorowane było przez wyliczanie stosunku natężeń emisji przy każdej z obu długości fali (340/380) dla każdego z elementów cyfrowego obrazu pola widzenia (512X480 pikseli). Grynkiewicz i in., (ibid), wykazał, ze stosunek ten jest związany ze stężeniem wapnia oglądanym dzięki barwnikowi fura-2 znajdującemu się wewnątrz komórek, które pobrały i deestryfikowały pochodną acetoksy mety Iową (fura-2 AM) używaną do obładowania komórek. Oprogramowanie RATIOTOOL pokazuje tą informacje jako obraz pseudokolorowy, który może być kalibrowany na stężenie wapnia. Obrazy były wczytywane i obliczane co pięć sekund w trakcie każdego doświadczenia.

Komórki monitorowane były przez co najmniej 60 sekund (12 obrazów) w celu ustalenia poziomu podstawowego warunków przed stymulacją. Stymulację wykonywano przez dodanie 0 5 ml Buforu do obrazowania zawierającego 200 nM glukagonu do 0.5 ml Buforu do Obrazowania znajdującego się w komorze, przez co uzyskiwano stężenie końcowe 100 nM. Komórki monitorowano i zapisywano obrazy przez co najmniej trzy minuty po stymulacji.

Jak zaobserwowano, obrazy stosunków natężeń odpowiadające liczbie komórek w każdym polu widzenia zmieniały się dramatycznie krótko po dodaniu glukagonu. Mierzono to przez użycie oprogramowania RATIOTOOL w celu wyliczenia średniej wartości dla specyficznych regionów obrazu stosunków natężeń odpowiadających każdej z odpowiadających komórek. Komórki ze średnim stosunkiem spoczynkowym rzędu 1.4 raptownie wzrastały do wartości rzędu 3 do 6. Pozostawały w tych wysokich wartościach przez 40 do 50 sekund a następnie stopniowo zmniejszały wartości do poziomu podstawowego. Niezależne doświadczenia kahbracyjne wskazywały, ze odzwierciedla to zmiany w stężeniu wapnia wewnątrzkomórkowego od wartości spoczynkowych rzędu 150 nM do szczytowych wartości rzędu 400 nM.

F. Oznaczanie Fosforanu Inozytolu

Komórki BHK570 ekspresjonujące receptor glukagonu z pLJ4 lub transfekowane kontrolnie wysiewano do 24 studzienko wy ch płytek hodowlanych w gęstości około 200000 komórek na studzienkę. Po 24 godzinach, komórki w każdej ze studzienek znakowano przez inkubację w 0 5 ml pożywki selekcjonującej ΜΤΧ zawierającej 2.0 miCi mio-(2-³H) inozytolu (aktywność właściwa 20 Ci/mmol; Amersham). Pod koniec 24 godzinnej inkubacji komórki przemywano 1 ml podgrzanego DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium. JHR Biosciences, Lenexa, Kan.,) zbuforowanego 20 mM Hepes, pH 7.0 (Sigma Chemical Co.) zawierającego 10 mM LiCl. Pożywkę przepłukuj ącąusuwano przez aspirację i zastępowano przez 900 pil świeżej zbuforowancj pożywki. Komórki inkubowano przez pięć minut w 37°C. Po inkubacji dodawano każdego z agonistów lub antagonistów do studzienek w trzykrotnym powtórzeniu i inkubowano w objętościach i warunkach wyszczególnionych w tabeli 8.

178 685

Tabela 8

Objętość ligandu	Okres inkubacji
Transfektanty pLJ4 100 μΐ 1000 nM glukagon 100 μΐ 10 nM glukagon 100 μΐ 100 ?M forskolm	10 minut 10 minut 10 mmut
Transfektanty kontrolne 100 μΐ 1000 nM glukagon 100 μΐ 1000 nM izoproterenol	10 minut 10 mmut
Transektanty pLJ4 100 μΐ 50 nM glukagon 1 9 100 μΐ dcs-His [Glu ] glukagon	10 minut 10 minut

Reakcj ę przerywano przez umieszczenie komórek na lodzie. Po aspiracj i pożywki komórki poddawano lizie przez dodanie 1 ml zimnego DMEM i 1 ml lodowatego 10% kwasu nadchlorowego. Po dziesięciu minutach lizaty komórek przenoszono do probówek na lodzie, zawierających 500 μΐ 10 mM EDTA, pH 7.0. Próbki zobojętniano przez dodanie 900 μΐ 1.5 Μ KOH w 60 mM buforze Hepes a następnie dodawanie po kropli roztworu KOH-Hepes dopóki pFI nie osiągnęło wartości pomiędzy 7 a 7.5. Zobojętnione próbki zamrożono w -20°C przez noc. Zamrożone próbki roztopiono i pozwolono by precypitat osiadł na dnie próbek. Nadsącza nałożono na minikolumny AMPREP (Amicon) gdzie kolejno przemywano je 5 ml metanolu i 1 M KHCO₃ a następnie przemy wano 15 ml wody. Po nałożeniu próbek zbierano frakcję wypływającą Kolumny przemywano 1 ml wody czterokrotnie i po każdym przemyciu zbierano 1 ml próbkę. Fosforan inozytolu eluowano z kolumn przez cztery kolejne dodawania 1 ml 0.25 M KHCO₃ z 1 ml próbki zebranej po każdym podaniu. Dziesięć mililitrów OPTIFLUOR (Packard Instruments Co., Menden, Conn.) dodawano do każdej z próbek i zliczano. Stymulacja szlaku fosforanu inozytolu wskazywana była przez wzrost poziomu znakowanego fosforanu inozytolu. W żadnej z próbek nie stwierdzono wzrostu produkcji fosforanu inozytolu.

G. Ekspresja Ludzkiego Receptora Glukagonu w Komórkach COS-7

Plazmid pLJ6' transfekowano do komórek COS-7 metodąz użyciem DEAE-dekstranu opisanąpowyzej. Komórki hodowano w na szkiełkach podstawowych (jak to opisano w przykładzie 3) przez 72 godziny po transfekcji. Badanie in situ wiązania glukagonu z użyciem ¹²⁵I-glukagonu a następnie autoradiografii w emulsji wykonano tak jak to opisano w przykładzie 3. Więcej niz 50% komórek transfekowanych pLJ4 wiązała glukagon w sposób specyficzny.

H. Ekspresja Ludzkiego Receptora Glukagonu w Komórkach BHK570

Komórki BHK570 (zdeponowane w American Type Culture Collection pod numerem 10314) transfekowano plazmidem pLJ6' metodątransfekcji z użyciem fosforanu wapnia (przykład 8). Transfekowane komórki selekcjonowane były w obecności G418 dopóki nie były widoczne pojedyncze kolonie. Pojedyncze kolome klonowano używając szklanych cylindrów Wykazano zdolność klonów do wiązania glukagonu w teście in situ wiązania jodowanego glukagonu w sposób opisany powyżej.

Komórki transfekowane pLJ6' badane były na gromadzenie cAMP w sposób opisany w przykładzie 8.C. Transfektanty badane były po stymulacji glukagonem, sekretyną VIP czy GLP-I. Testy wykazały, ze komórki transfekowane pLJ6' gromadziły zwiększone stężenia cAMP w następstwie stymulacji glukagonem w porównaniu z komórkami kontrolnymi Stymulacja transfektantów sekretyną, VIP czy GLP-I nie wykazała zwiększonej akumulacji cAMP Wewnątrzkomórkowa odpowiedź wapnia badana była jak to opisano w przykładzie 8.E. Stymulowane glukagonem komórki transfekowane pLJ6' wykazywały wzrost wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia jak to wykazano przez gwałtowny wzrost fluorescencji wskaźnika wapnia Fura-2. Wyniki te pokazują ze pLJ6' koduje funkcjonalny ludzki receptor glukagonu zdolny do wiązania glukagonu i przekazywania sygnału

Jak wynika z powyższego, j akkolwiek opisane zostały specyficzne wykonania w celu zilustrowania wynalazku, możliwe sąrózne modyfikacje bez oddalania się od istoty i zakresu wynalazku. Zatem wynalazek jest ograniczony wyłącznie dołączonymi zastrzeżeniami.

178 685

1. INFORMACJE PODSTAWOWE (x) ZGŁASZAJĄCY: NAZWA: ZymoGenetics, Inc. ULICA: 4224 Roosevelt Way North East MIASTO: Seattle, Washington KRAJ: Stany Zjednoczone KOD POCZTOWY: 98105 TELEFON: (206) 547-80808 (li ) TYTUŁ WYNALAZKU: RECEPTORY GLUKAGONU (iii) LICZBA SEKWENCJI: 25 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI: (A) ADRESAT: SEED AND BERRY (B) ULICA: 6300 COLUMBIA CENTER (C) MIASTO: SEATLLE (D) STAN: WA (E) KRAJ: USA (F) KOD POCZTOWY: 99104-7092 (v) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:

(A) TYP NOŚNIKA: Dyskietka (B) KOMPUTER: Kompatybilny z IBM/PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release # 1.0, Version # 1,25 (vi) DANE AKTUALNEGO ZGŁOSZENIA: (A) NUMER ZGŁOSZENIA: 08/086,631 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 1 czerwca 1993 r. (C) KLASYFIKACJA:

(vii) DANE WCZEŚNIEJSZEGO ZGŁOSZENIA: (A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 07/938,331 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 28 sierpnia 1992 r.

(viii) DANE PEŁNOMOCNIKA/AGENTA: (A) NAZWISKO: McMaster, David D.

(B) NUMER REJESTRACYJNY: 33, 963 (C) NUMER SPRAWY: 990008. 424C1 (ix) INFORMACJA TELEKOMUNIKACYJNA: (A) TELEFON: 206-622-4900 (B) TELEFAX: 206-682-6031

178 685 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:

(B) KLON: ZC447 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:1: TAACAATTTC ACACAGG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: ZC976 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:2: CGTTGTAAAA CGACGGCC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 71 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: ZC982 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:3:

AATTCCCCTC CCGCGAAGGC GTCGGCGCGG GGCTGGCGTA GGGCCTGCGT CAGCTGCAGC CCGCCGGAGC T (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 63 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowey

178 685 (C) N1C1OWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: ZC983 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:4:

CCGGCGGGCT GCAGCTGACG CAGGCCCTAC GCCAGCCCCG CGCCGACGCC TTCGCGGGAG GGG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 38 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: ZC3509 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:5:

CAAATTGACG TCATGGTAAA AATTGACGTC ATGGTAAG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 46 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: ZC3510 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:6:

AATTCTTACC ATGACGTCAA I I I I IACCAT GACGTCAATT TGAGCT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 42 pary zasad (B) TYP: kwasy nukleinowe (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: ZC3747

178 685 (χί) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:7: GACAGAGCAC AGAATTCACT ACTCGAGTTT TTT1 I I I I I I TT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 25 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: ZC4701 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:8: ACTCTCCGGT TNARRAAGCA RTANA (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 26 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: ZC 4715 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:9: CATCCACGGT AYACNGTNGG NTAYWS (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 10:

(i) CHARAKTERYSYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 26 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedycza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: ZC4758 (xi) OPIS SEKWENCJLIDENTYFIKATOR SEKW. NR: 10: GCGGAATTCK MNAYNGTNGG NYAYWS (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:11:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 26 par zasad

178 685 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: ZC4778 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:11: CGCGGATCCY SRTTNMRRAA RCARTA (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 12:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: ZC5432 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:12: CAGGACCCGC TACAGCCAGA A (2)INFORMACJIA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 13:

(i)CHARAKTERTYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: ZC5433 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 13: CAACAGAAGC CCATGTTGTGC A (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 14:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1875 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:

178 685 (F) TYP TKANKI: Wątroba (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:

(B) KLON: pLJ4 (x) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) LOKALIZACJA: 145..1599 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 14

GAATTCGCGG CCGCCGCCGG GCCCCAGATC CCAGTGCGCG AGGAGCCCAG TCCTAGACCC60

AGCAACCTGA GGAGAGGTGC ACACACCCCC AAGGACCCAG GCACCCAACC TCTGCCAGAT120

GTGGGGGGGT GGCTACCCAG AGGC AT6 CTC CTC ACC CAG CTC CAC TGT CCC171

Met Leu Leu Thr Gin Leu His Cys Pro

TAC CTG CTG CTG CTG CTG GTG GTG CTG TCA TGT CTG CCA AAG GCA CCC 219

Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Leu Ser Cys Leu Pro Lys Ala Pro 10 15 2025

178 685

TCT GCC CAG GTA ATG GAC TTT HG TTT GAG AAG TGG AAG CTC TAT AGT267

Ser Ala Gin Val Met Asp Phe Leu Phe Glu Lys Trp Lys Leu TyrSer

3540

GAC CAG TGC CAC CAC AAC CTA AGC CTG CTG CCC CCA CCT ACT GAG CTG315

Asp Gin Cys His His Asn Leu Ser Leu Leu Pro Pro Pro Thr GluLeu

5055

GTC TGC AAC AGA ACT TTC GAC AAG TAC TCC TGC TGG CCT GAC ACC CCT363

Val Cys Asn Arg Thr Phe Asp Lys Tyr Ser Cys Trp Pro Asp ThrPro

6570

CCC AAC ACC ACT GCC AAC ATT TCC TGC CCC TGG TAC CTA CCT TGG TAC411

Pro Asn Thr Thr Ala Asn Ile Ser Cys Pro Trp Tyr Leu Pro TrpTyr

8085

CAC AAA GTG CAG CAC CGC CTA GTG TTC AAG AGG TGT GGG CCT GAT GGG459

His Lys Val Gin His Arg Leu Val Phe Lys Arg Cys Gly Pro AspGly

95 100105

CAG TGG GTT CGA GGG CCA CGG GGG CAG TCA TGG CGC GAC GCC TCC CAA507

Gin Trp Val Arg Gly Pro Arg Gly Gin Ser Trp Arg Asp Ala SerGin

110 115120

TGT CAG ATG GAT GAT GAC GAG ATC GAG GTC CAG AAG GGG GTA GCC AAG555

Cys Gin Met Asp Asp Asp Glu Ile Glu Val Gin Lys Gly Val AlaLys

125 130135

ATG TAT AGC AGC TAC CAG GTG ATG TAC ACT GTG GGC TAC AGT CTG TCC603

Ket Tyr Ser Ser Tyr Gin Val Met Tyr Thr Val Gly Tyr Ser LeuSer

140 145150

CTG GGG GCC TTG CTC CTG GCG CTG GTC ATC CTG CTG GGC CTC AGG AAG651

Leu Gly Ala Leu Leu Leu Ala Leu Val Ile Leu Leu Gly Leu ArgLys

155 160165

178 685

CTG CAC TGC ACC CGG AAC TAC ATC CAC GGG AAC CTG TTC GCG TCC TTC699

Leu His Cys Thr Arg Asn Tyr Ile His Gly Asn Leu Phe Ala SerPhe

170 175 180185

GTG CTC AAG GCT GGC TCT GTG CTG GTC ATT GAT TGG CTG CTC AAG ACA747

Val Leu Lys Ala Gly Ser Val Leu Val Ile Asp Trp Leu Leu LysThr

190 195200

CGC TAT AGC CAG AAG ATT GGA GAT GAC CTC AGT GTG AGC GTC TGG CTC795

Arg Tyr Ser Gin Lys Ile Gly Asp Asp Leu Ser Val Ser Val TrpLeu

205 210215

AGT GAT GGG GCG GTG GCT GGC TGC AGA GTG GCC ACA GTG ATC ATG CAG843

Ser Asp Gly Ala Val Ala Gly Cys Arg Val Ala Thr Val Ile MetGin

220 225230

TAC GGC ATC ATA GCC AAC TAC TGC TGG TTG CTG GTG GAG GGT GTG TAC891

Tyr Gly Ile Ile Ala Asn Tyr Cys Trp Leu Leu Val Glu Gly ValTyr

235 240245

CTG TAC AGC CTG CTG AGC ATC ACC ACC TTC TCG GAG AAG AGC TTC TTC939

Leu Tyr Ser Leu Leu Ser Ile Thr Thr Phe Ser Glu Lys Ser PhePhe

250 255 260265

TCC CTC TAT CTG TGC ATC GGC TGG GGA TCT CCC CTG CTG TTT GTC ATC987

Ser Leu Tyr Leu Cys Ile Gly Trp Gly Ser Pro Leu Leu Phe ValIle

270 275280

CCC TGG GTG GTG GTC AAG TGT CTG TTT GAG AAT GTC CAG TGC TGG ACC1035

Pro Trp Val Val Val Lys Cys Leu Phe Glu Asn Val Gin Cys TrpThr

285 290295

AGC AAT GAC AAT ATG GGA TTC TGG TGG ATC CTG CGT ATC CCT GTA CTC1083

Ser Asn Asp Asn Met Gly Phe Trp Trp Ile Leu Arg Ile Pro ValLeu

300 305310

178 685

CTG GCC ΑΤΑ CTG ATC AAT TTT TTC ΑΤΟ ΊΤΓ GTC CGC ATC ATT CAT CTT1131

Leu Ala Ile Leu Ile Asn Phe Phe Ile Phe Val Arg Ile Ile HisLeu

315 320325

CTT GTG GCC AAG CTG CGT GCC CAT CAG ATG CAC TAT GCT GAT TAC AAG1179

Leu Val Ala Lys Leu Arg Ala His Gin Met His Tyr Ala Asp TyrLys

330 335 340345

TTC CGG CTA GCC AGG TCC ACG CTG ACC CTC ATT CCT CTG CTG GGA GTC1227

Phe Arg Leu Ala Arg Ser Thr Leu Thr Leu Ile Pro Leu Leu GlyVal

350 355360

CAC GAA GTG GTC TTT GCC TTT GTG ACT GAT GAG CAT GCC CAG 6GC ACC1275

His Glu Val Val Phe Ala Phe Val Thr Asp Glu His Ala Gin GlyThr

365 370375

CTG CGC TCC ACC AAG CTC TTT TTT GAC CTG TTC TTC AGC TCC TTT CAG1323

Leu Arg Ser Thr Lys Leu Phe Phe Asp Leu Phe Phe Ser Ser PheGin

380 385390

GGT CTG CTG GTG GCT GTT CTC TAC TGT TTC CTC AAC AAG GAG GTG CAG1371

Gly Leu Leu Val Ala Val Leu Tyr Cys Phe Leu Asn Lys Glu ValGin

395 400405

GCA GAG CTA CTG CGG CGT TGG AGG CGA TGG CAA GAA GGC AAA GCT CTT1419

Ala Glu Leu Leu Arg Arg Trp Arg Arg Trp Gin Glu Gly Lys AlaLeu

410 415 420425

CAG GAG GAA AGG ATG GCC AGC AGC CAT GGC AGC CAC ATG GCC CCA GCA1467

Gin Glu Glu Arg Met Ala Ser Ser His Gly Ser His Met Ala ProAla

430 435440

GGG ACT TGT CAT GGT GAT CCC TGT GAG AAA CTT CAG CTT ATG AGT GCA1515

Gly Thr Cys His Gly Asp Pro Cys Glu Lys Leu Gin Leu Met SerAla

445 450455

178 685

GGC AGC AGC AGT GGG ACT GGC TGT GAG CCC TCT GCG AAG ACC TCA TTG 1563

Gly Ser Ser Ser Gly Thr Gly Cys Glu Pro Ser Ala Lys Thr Ser Leu

460 465 470

GCC AGT AGT CTC CCA AGG CTG GCT GAC AGC CCC ACC TGAATCTCCA 1609

Ala Ser Ser Leu Pro Arg Leu Ala Asp Ser Pro Thr

475	480	485
CTGGACTCCA	GCCAAGTTGG ATTCAGAAAG	GGCCTCACAA GACAACCCAG AAACAGATGC 1669
CTGGCCAAGG	CTGAAGAGGC AAAGCAGCAA	GACAGCAGCT TGTACTATCC ACACTCCCCT 1729
AACCTGTCCT	GGCCGGGTAC AGGCCACATT	GATGGAGTAG GGGCTGGATA TGATGGAGTA 1789
GCCATGCTAT	GAACTATGGG TGTTCCCATG	AGTGTTGCCA TGTTCCATGC ACACAGATAT 1849
GACCTTCAGT	AAAGAGCTCC CGTAGG	1875

178 685 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:15:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 485 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR :15:

Met Leu Leu Thr Gin Leu His Cys Pro Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Yal 15 1015

Yal Leu Ser Cys Leu Pro Lys Ala Pro Ser Ala Gin Val Met Asp Phe 20 2530

Leu Phe Glu Lys Trp Lys Leu Tyr Ser Asp Gin Cys His His Asn Leu 35 4045

Ser Leu Leu Pro Pro Pro Thr Glu Leu Val Cys Asn Arg Thr Phe Asp 50 5560

Lys Tyr Ser Cys Trp Pro Asp Thr Pro Pro Asn Thr Thr Ala Asn Ile 65 70 7580

Ser Cys Pro Trp Tyr Leu Pro Trp Tyr His Lys Val Gin His Arg Leu 85 9095

Yal Phe Lys Arg Cys Gly Pro Asp Gly Gin Trp Val Arg Gly Pro Arg 100 105110

Gly Gin Ser Trp Arg Asp Ala Ser Gin Cys Gin Met Asp Asp Asp Glu 115 120125

Ile Glu Yal Gin Lys Gly Yal Ala Lys Met Tyr Ser Ser Tyr Gin Yal 130 135140

Met Tyr Thr Yal Gly Tyr Ser Leu Ser Leu Gly Ala Leu Leu LeuAla

145 150 155160

Leu Yal Ile Leu Leu Gly Leu Arg Lys Leu His Cys Thr Arg AsnTyr

165 170175

178 685

Ile His Gly Asn Leu Phe Ala Ser Phe 180185

Leu Val Ile Asp Trp Leu Leu Lys Thr 195200

Asp Asp Leu Ser Val Ser Val Trp Leu 210215

Cys Arg Val Ala Thr Val Ile Met Gin 225230

Cys Trp Leu Leu Val Glu Gly Val Tyr 245

Thr Thr Phe Ser Glu Lys Ser Phe Phe 260265

Trp Gly Ser Pro Leu Leu Phe Val Ile 275280

Leu Phe Glu Asn Val Gin Cys Trp Thr 290295

Trp Trp Ile Leu Arg Ile Pro Val Leu 305310

Phe Ile Phe Val Arg Ile Ile His Leu 325

His Gin Met His Tyr Ala Asp Tyr Lys 340345

Leu Thr Leu Ile Pro Leu Leu Gly Val 355360

Leu Lys Ala Gly Ser Val 190

Tyr Ser Gin Lys Ile Gly 205

Asp Gly Ala Val Ala Gly 220

Gly Ile Ile Ala Asn Tyr 235 240

Tyr Ser Leu Leu Ser Ile 255

Leu Tyr Leu Cys Ile Gly 270

Trp Val Val Val Lys Cys 285

Asn Asp Asn Met Gly Phe 300

Ala Ile Leu Ile Asn Phe 315 320

Val Ala Lys Leu Arg Ala 33 R

Arg Leu Ala Arg Ser Thr 350

Glu Val Val Phe Ala Phe 365

Val Thr Asp Glu His Ala Gin Gly Thr Leu Arg Ser Thr Lys Leu Phe

370 375380

178 685

Phe Asp Leu Phe Phe Ser Ser Phe Gin Gly Leu Leu Val Ala Val Leu

385 390 395400

Tyr Cys Phe Leu Asn Lys Glu Val Gin Ala Glu Leu Leu Arg ArgTrp

405 410415

Arg Arg Trp Gin Glu Gly Lys Ala Leu Gin Glu Glu Arg Met Ala Ser 420 425430

Ser His Gly Ser His Met Ala Pro Ala Gly Thr Cys His Gly Asp Pro 435 440‘445

Cys Glu Lys Leu Gin Leu Met Ser Ala Gly Ser Ser Ser Gly Thr Gly 450 455460

Cys Glu Pro Ser Ala Lys Thr Ser Leu Ala Ser Ser Leu Pro Arg Leu 465 470 475480

Ala Asp Ser Pro Thr

485

178 685 (21INF0RMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 16:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A)DŁUGOŚĆ: 576 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:

(B) KLON: G30 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: intron (B) LOKALIZACJA: 225..314 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: egzon (B) lokalizacja: 1..225 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: egzon (B) LOKALIZACJA: 315..576 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 16:

GACATGGTAG GTCACAGCCT GTCCCTGGGG GCCCTGCTCC TCGCCTTGGC CATCCTGGGG60

GGCCTCAGCA AGCTGCACTG CACCCGCAAT GCCATCCACG CGAATCTGTT TGCGTCCTTC120

GTGCTGAAAG CCAGCTCCGT GCTGGTCATT GATGGGCTGC TCAGGACCCG CTACAGCCAG180

AAAATTGGCG ACGACCTCAG TGTCAGCACC TGGCTCAGTG ATGGAGTGAG CCCCCCTCGG240

CGGCCCCAGG CAGGTGGGIG GGTGGGCAGC CAGGCAGGTG GCCACGTAGC CGCGTCACAC300

TGCACCTGTA CCAGGCGGTG GCTGGCTGCC GTGTGGCCGC GGTGTTCATG CAATATGGCA360

TCGTGGCCAA CTACTGCTGG CTGCTGGTGG AGGGCCTGTA CCTGCACAAC CTGCTGGGCC420

TGGCCACCTT CCCCGAGAGG AGCTTCTTCA GCCTCTACCT GGGCATCGGC TGGGGTGCCC480

CCATGCTGTT CGTCGTCCCC TGGGCAGTGG TCAAGTGTCT GTTCGAGAAC GTCCAGTGCT540

GGACCAGCAA TGACAACATG GGCTTCTGGT GGATCC

576

178 685 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:17:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 487 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:

(B) KLON: 40-2-2 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ:CDS (B) LOKALIZACJA: 1..486 (xi) OPIS SEKWENCJI IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 17:

GAC ATG GTA GGT CAC AGC CTG TCC CTG GGG GCC CTG CTC CTC GCC TTG 48

Asp Met Val Gly His Ser Leu Ser Leu Gly Ala Leu Leu Leu Ala Leu 15 1015

GCC ATC CTG GGG GGC CTC AGC AAG CTG CAC TGC ACC CGC AAT GCC ATC96

Ala Ile Leu Gly Gly Leu Ser Lys Leu His Cys Thr Arg Asn AlaIle

2530

CAC GCG AAT CTG TTT GCG TCC TTC GTG CTG AAA GCC AGC TCC GTG CTG144

His Ala Asn Leu Phe Ala Ser Phe Val Leu Lys Ala Ser Ser ValLeu

4045

GTC ATT GAT GGG CTG CTC AGG ACC CGC TAC AGC CAG AAA ATT GGC GAC192

Val Ile Asp Gly Leu Leu Arg Thr Arg Tyr Ser Gin Lys Ile GlyAsp

5560

GAC CTC AGT GTC AGC ACC TGG CTC AGT GAT GGA GCG GTG GCT GGC TGC240

Asp Leu Ser Val Ser Thr Trp Leu Ser Asp Gly Ala Val Ala GlyCys

70 7580

CGT GTG GCC GCG GTG TTC ATG CAA TAT GGC ATC GTG GCC AAC TAC TGC288

Arg Val Ala Ala Val Phe Met Gin Tyr Gly Ile Val Ala Asn TyrCys

9095

TGG CTG CTG GTG GAG GGC CTG TAC CTG CAC AAC CTG CTG GGC CTG GCC336

Trp Leu Leu Val Glu Gly Leu Tyr Leu His Asn Leu Leu Gly LeuAla

100 105110

178 685

ACC TTC CCC GAG AGG AGC TTC TTC AGC CTC TAC CTG GGC ATC GGC TGG

Thr Phe Pro Glu Arg Ser Phe Phe Ser Leu Tyr Leu Gly Ile Gly Trp

115 120 125

384

GGT Gly	GCC CCC ATG Ala Pro Met 130	CTG TTC GTC	GTC CCC TGG GCA GTG GTC AAG TGT	CTG Leu
Leu	Phe	Val 135	Val Pro Trp	Ala	Val 140	Val	Lys	Cys
TTC	GAG AAC GTC	CAG	TGC	TGG	ACC AGC AAT	GAC	AAC	ATG	GGC	TTC	TGG
Phe 145	Glu Asn Val	Gin	Cys 150	Trp	Thr Ser Asn	Asp 155	Asn	Met	Gly	Phe	Trp 160

432

480

TGG ATC C

Trp Ile

487

178 685 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:18:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 162 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 18:

Asp Met Val Gly His Ser Leu Ser Leu Gly Ala Leu Leu Leu Ala Leu 15 1015

Ala Ile Leu Gly Gly Leu Ser Lys Leu His Cys Thr Arg Asn Ala Ile 20 2530

His Ala Asn Leu Phe Ala Ser Phe Val Leu Lys Ala Ser Ser Val Leu 35 4045

Val Ile Asp Gly Leu Leu Arg Thr Arg Tyr Ser Gin Lys Ile Gly Asp 50 5560

Asp Leu Ser Val Ser Thr Trp Leu Ser Asp Gly Ala Val Ala Gly Cys 65 70 7580

Arg Val Ala Ala Val Phe Met Gin Tyr Gly Ile Val Ala Asn Tyr Cys 85 9095

Trp Leu Leu Val Glu Gly Leu Tyr Leu His Asn Leu Leu Gly Leu Ala 100 105110

Thr Phe Pro Glu Arg Ser Phe Phe Ser Leu Tyr Leu Gly Ile Gly Trp 115 120125

Gly Ala Pro Met Leu Phe Val Val Pro Trp Ala Val Val Lys Cys Leu 130 135140

Phe Glu Asn Val Gin Cys Trp Thr Ser Asn Asp Asn Met Gly Phe Trp

145 150 155160

Trp Ile

178 685 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:19:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI.

(A) DLUGOŚĆ:21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:

(B) KLON: ZC4812 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 19: GTGAGTTCAC GAATTCCATG G (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:20:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 34 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE (B) KLON: ZC4814 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:20: AGTTCACGAA TTCCATGGCC CCCCCCCCCC CCCC (2) INFORMACJA DLEA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:21:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:

(B) KLON: ZC5624 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:21: CGCATCTCTT GAACACGAAG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:22:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 41 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa

178 685 (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:

(B) KLON: ZC5763 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:22: GAGAGAGAGA GAGAATTCGG AGGAGCGTAC ACACACACCA G (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:23:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 44 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:

(B) KLON: ZC5849 (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKW. NR:23: AGAGAGAGAGAGAGCTCGAG TTTATTGTTG GAGGACATTT CCAT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:24:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1809 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:

(A) ORGANIZM: Homo sapiens (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:

(B) KLON: pLJ6' (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) LOKALIZACJA: 53..1486 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:24:

GAATTCTGTG CAGCCCCTGC CAGATGTGGG AGGCAGCTAG CTGCCCAGAG GC ATG Met
	1
CCC CCC TGC CAG CCA CAG CGA	CCC CTG CTG CTG TTG CTG CTG CTG CTG
Pro Pro Cys Gin Pro Gin Arg	Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu
5	10 15
GCC TGC CAG CCA CAG GTC CCC	TCC GCT CAG GTG ATG GAC TTC CTG TTT
Ala Cys Gin Pro Gin Val Pro	Ser Ala Gin Val Met Asp Phe Leu Phe
20	25 30

103

151

178 685

GAG AAG TGG AAG CTC TAC GGT GAC CAG Glu Lys Trp Lys Leu Tyr Gly Asp Gin 3540

CTG CCC CCT CCC ACG GAG CTG GTGTGC

Leu Pro Pro Pro Thr Glu Leu ValCys

5055

TCC TGC TGG CCG GAC ACC CCC GCC AAT

Ser Cys Trp Pro Asp Thr Pro Ala Asn

CCC TGG TAC CTG CCT TGG CAC CAC AAA

Pro Trp Tyr Leu Pro Trp His HisLys

8590

AAG AGA TGC GGG CCC GAC GGT CAGTGG

Lys Arg Cys Gly Pro Asp Gly GinTrp

100105

CCT TGG CGT GAT GCC TCC CAG TGCCAG

Pro Trp Arg Asp Ala Ser Gin CysGin

115120

GTC CAG AAG GAG GTG GCC AAG ATGTAC

Val Gin Lys Glu Val Ala Lys MetTyr

130135

ACA GTG 6GC TAC AGC CTG TCC CTGGGG

Thr Val Gly Tyr Ser Leu Ser LeuGly

150

ATC CTG GGG GGC CTC AGC AAG CTGCAC

Ile Leu Gly Gly Leu Ser Lys LeuHis

165170

TGT CAC CAC AAC CTG AGC CTG 199

Cys His His Asn Leu Ser Leu 45

AAC AGA ACC TTC GAC AAG TAT 247

Asn Arg Thr Phe Asp Lys Tyr 60 65

ACC ACG GCC AAC ATC TCC TGC 295

Thr Thr Ala Asn Ile Ser Cys 75 80

GTG CAA CAC CGC TTC GTG TTC 343

Val Gin His Arg Phe Val Phe 95

GTG CGT GGA CCC CGG GGG CAG 391

Val Arg Gly Pro Arg Gly Gin 110

ATG GAT GGC GAG GAG ATT GAG 439

Met Asp Gly Glu Glu Ile Glu 125

AGC AGC TTC CAG GTG ATG TAC 487

Ser Ser Phe Gin Val Met Tyr 140 145

GCC CTG CTC CTC GCC TTG GCC 535

Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ala

155 160

TGC ACC CGC AAT GCC ATC CAC 583

Cys Thr Arg Asn Ala Ile His 175

178 685

GCG AAT CTG TTT GCG TCC TTC GTG CTG AAA GCC AGC TCC GTG CTG GTC631

Ala Asn Leu Phe Ala Ser Phe Val Leu Lys Ala Ser Ser Val LeuVal

180 185190

ATT GAT GGG CTG CTC AGG ACC CGC TAC AGC CAG AAA ATT GGC GAC GAC679

Ile Asp Gly Leu Leu Arg Thr Arg Tyr Ser Gin Lys Ile Gly AspAsp

195 200205

CTC AGT GTC AGC ACC TGG CTC AGT GAT GGA GCG GTG GCT GGC TGC CGT727

Leu Ser Val Ser Thr Trp Leu Ser Asp Gly Ala Val Ala Gly CysArg

210 215 220225

GTG GCC GCG GTG TTC ATG CAA TAT GGC ATC GTG GCC AAC TAC TGC TGG775

Val Ala Ala Val Phe Met Gin Tyr Gly Ile Val Ala Asn Tyr CysTrp

230 235240

CTG CTG GTG GAG GGC CTG TAC CTG CAC AAC CTG CTG GGC CTG GCC ACC823

Leu Leu Val Glu Gly Leu Tyr Leu His Asn Leu Leu Gly Leu AlaThr

245 250255

CTC CCC GAG AGG AGC TTC TTC AGC CTC TAC CTG GGC ATC GGC TGG GGT871

Leu Pro Glu Arg Ser Phe Phe Ser Leu Tyr Leu Gly Ile Gly TrpGly

260 265270

GCC CCC ATG CTG TTC GTC GTC CCC TGG GCA GTG GTC AAG TGT CTG TTC919

Ala Pro Met Leu Phe Val Val Pro Trp Ala Val Val Lys Cys LeuPhe

275 280285

GAG AAC GTC CAG TGC TGG ACC AGC AAT GAC AAC ATG GGC TTC TGG TGG967

Glu Asn Val Gin Cys Trp Thr Ser Asn Asp Asn Met Gly Phe TrpTrp

290 295 300305

ATC CTG CGG TTC CCC GTC TTC CTG GCC ATC CTG ATC AAC TTC TTC ATC1015

Ile Leu Arg Phe Pro Val Phe Leu Ala Ile Leu Ile Asn Phe PheIle

310 315320

178 685

TTC GTC CGC ATC Phe Yal Arg Ile 325

ATG CAC CAC ACA Met His His Thr 340

CTC ATC CCT CTG

Leu Ile Pro Leu 355

GAC GAG CAC GCC Asp Glu His Ala 370

CTC TTC CTC AGC Leu Phe Leu Ser

TTC CTC AAC AAG Phe Leu Asn Lys 405

GTT CAG CTG CTC GTG GCC AAG CTG CGG GCA CGG CAG

Yal Gin Leu Leu Yal Ala Lys Leu Arg Ala Arg Gin

330335

GAC TAC AAG TTC CGG CTG GCC AAG TCC ACG CTGACC

Asp Tyr Lys Phe Arg Leu Ala Lys Ser Thr LeuThr

345350

CTG 6GC GTC CAC GAA GTG GTC TTT GCC TTC GTGACG

Leu Gly Yal His Glu Val Yal Phe Ala Phe ValThr

360365

CAG GGC ACC CTG CGC TCC GCC AAG CTC TTC TTCGAC

Gin Gly Thr Leu Arg Ser Ala Lys Leu Phe PheAsp

375 380385

TCC TTC CAG GGC CTG CTG GTG GCT GTC CTC TACTGC

Ser Phe Gin Gly Leu Leu Val Ala Val Leu TyrCys

390 395400

GAG GTG CAG TCG GAG CTG CGG CGG CGT TGG CACCGC

Glu Yal Gin Ser Glu Leu Arg Arg Arg Trp HisArg

410415

1063 im

1159

1207

1255

1303

TGG CGC CTG GGC AAA GTG CTA TGG

Trp Arg Leu Gly Lys Yal Leu Trp

420425

AGG GCC TCA TCT TCG CCC GGCCAC

Arg Ala Ser Ser Ser Pro GlyHis

435440

TTT GGG AGG GGT GGT GGC AGCCAG

Phe Gly Arg Gly Gly Gly SerGin

450455

GAG GAG CGG AAC ACC AGC AAC CAC Glu Glu Arg Asn Thr Ser Asn His 430

GGC CCT CCC AGC AAG GAG CTG CAG Gly Pro Pro Ser Lys Glu Leu Gin 445

6AT TCA TCT 6CG GAG ACC CCC TTG Asp Ser Ser Ala Glu Thr Pro Leu 460 465

1351

1399

1447

178 685

GCT GGT GGC CTC CCT AGA TTG GCT GAG AGC CCC TTC TGAACCCTGC1493

Ala Gly Gly Leu Pro Arg Leu Ala Glu Ser Pro Phe 470475

TGGGACCCCA GCTAGGGCTG GACTCTGGCA CCCAGAGGCG TCGCTGGACA ACCCAGAACT1553

GGACGCCCAG CTGAGGCTGG GGGCGGGGGA GCCAACAGCA GCCCCCACCT ACCCCCCACC1613

CCCAGTGTGG CTGTCTGCGA GATTGGGCCT CCTCTCCCTG CACCTGCCTT GTCCCTGGTG1673

CAGAGGTGAG CAGAGGAGTC CAGGGCGGGA GTGGGGGCTG TGCCGTGAAC TGCGTGCCAG1733

TGTCCCCACG TATGTCGGCA CGTCCCATGT GCATGGAAAT GTCCTCCAAC AATAAAGAGC 1793

TCAAGTGGTC ACCGAG1809

178 685 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:25:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 477 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 25

Met Pro Pro Cys Gin Pro Gin Arg Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu ¹ 5 1015

Leu Ala Cys Gin Pro Gin Val Pro Ser Ala Gin Val Met Asp PheLeu

2530

Phe Glu Lys Trp Lys Leu Tyr Gly Asp Gin Cys His His Asn Leu Ser 35 4045

Leu Leu Pro Pro Pro Thr Glu Leu Val Cys Asn Arg Thr Phe Asp Lys 50 5560

Tyr Ser Cys Trp Pro Asp Thr Pro Ala Asn Thr Thr Ala Asn Ile Ser 65 70 7580

Cys Pro Trp Tyr Leu Pro Trp His His Lys Val Gin His Arg Phe Va1 85 9095

Phe Lys Arg Cys Gly Pro Asp Gly Gin Trp Val Arg Gly Pro Arg Gly

100 105110

Gin Pro Trp Arg Asp Ala Ser Gin Cys Gin Met Asp Gly Glu Glu Ile 115 120125

Glu Val Gin Lys Glu Val Ala Lys Met Tyr Ser Ser Phe Gin Val Met 130 135140

Tyr Thr Val Gly Tyr Ser Leu Ser Leu Gly Ala Leu Leu Leu AlaLeu

145 150 155160

Ala Ile Leu Gly Gly Leu Ser Lys Leu His Cys Thr Arg Asn AlaIle

165 170175

178 685

His Ala Asn Leu Phe Ala Ser Phe 180

Val Ile Asp Gly Leu Leu Arg Thr 195200

Asp Leu Ser Val Ser Thr Trp Leu 210215

Arg Val Ala Ala Val Phe Het Gin 225230

Trp Leu Leu Val Glu Gly Leu Tyr 245

Thr Leu Pro Glu Arg Ser Phe Phe 260

Gly Ala Pro Met Leu Phe Val Val 275280

Phe Glu Asn Val Gin Cys Trp Thr 290295

Trp Ile Leu Arg Phe Pro Val Phe 305310

Ile Phe Val Arg Ile Val Gin Leu 325

Gin Met His His Thr Asp Tyr Lys 340

Thr Leu Ile Pro Leu Leu Gly Val 355360

Thr Asp Glu His Ala Gin Gly Thr 370375

Leu Lys Ala Ser Ser Val Leu 190

Tyr Ser Gin Lys Ile Gly Asp 205

Asp Gly Ala Val Ala Gly Cys 220

Gly Ile Val Ala Asn Tyr Cys 235 240

His Asn Leu Leu Gly Leu Ala 250 255

Leu Tyr Leu Gly Ile Gly Trp 270

Trp Ala Val Val Lys Cys Leu 285

Asn Asp Asn Met Gly Phe Trp 300

Ala Ile Leu Ile Asn Phe Phe 315 320

Val Ala Lys Leu Arg Ala Arg 330 335

Arg Leu Ala Lys Ser Thr Leu 350

Glu Val Val Phe Ala Phe Val 365

Arg Ser Ala Lys Leu Phe Phe 380

Asp Leu Phe Leu Ser Ser Phe Gin Gly Leu Leu Val Ala Val Leu Tyr

385 390 395400

178 685

Cys

Phe

Leu Asn Lys Glu Val Gin Ser Glu Leu Arg Arg Arg Trp His

405

410

415

Arg

Trp

Arg

Leu 420

Gly

Lys

Val

Leu

Trp 425

Glu

Glu

Arg

Asn Thr 430

Ser

Asn

His

Arg

Ala 435

Ser

Ser

Ser

Pro

Gly 440

His

Gly

Pro

Pro

Ser Lys 445

Glu

Leu

Gin

Phe 450

Gly Arg Gly Gly Gly 455

Ser

Gin

Asp

Ser

Ser 460

Ala Glu

Thr

Pro

Leu

Ala

Gly Gly Leu Pro Arg

Leu

Ala

Glu

Ser

Pro

Phe

'65 470 475

178 685

HYDROFILOWOŚĆ

HYDROPHILICITY

178 685

SPECYFICZNE WIĄZANIE, SPECIFIC BOUND

FIG. 3

GLUCAGON, M

GLUKAGON, M

178 685 zw i ązany/wolny BOUND/FREE

BOUND związany

178 685

Figurę 5

Figura 5

Met Leu Leu Thr Gin Leu His Cys Pro Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Val 15 1015

Val Leu Ser Cys Leu Pro Lys Ala Pro Ser Ala Gin Val Met Asp Phe 20 2530

Leu Phe Glu Lys Trp Lys Leu Tyr Ser Asp Gin Cys His His Asn Leu 35 4045

Ser Leu Leu Pro Pro Pro Thr Glu Leu Val Cys Asn Arg Thr Phe Asp 50 5560

Lys Tyr Ser Cys Trp Pro Asp Thr Pro Pro Asn Thr Tnr Ala Asn Ile 65 70 7530

Ser Cys Pro Trp Tyr Leu Pro Trp Tyr His Lys Val Gin His Arg Leu 85 9095

Val Phe Lys Arg Cys Gly Pro Asp Gly Gin Trp Val Arg Gly Pro Arg 100 105110

Gly Gin Ser Trp Arg Asp Ala Ser Gin Cys Gin Met Aso Aso Asp Glu 115 120125

Ile 'Glu Val Gin Lys Gly Val Ala Lys Met Tyr Ser Ser Tyr Gin Val

130 135140

Met Tyr Thr Val Gly Tyr Ser Leu Ser Leu Gly Ala Leu Leu Leu Ala

145 150 155160

Leu Val Ile Leu Leu Gly Leu Arg Lys Leu His Cys Thr Arg Asn Tyr

165 170175

Ile His Gly Asn Leu Phe Ala Ser Phe Val Leu Lys Ala Gly Ser Val

180 185190

178 685

Leu Val	Ile 195	Asp Trp Leu	Leu	Lys 200	Thr	Arg Tyr Ser Gin 205	Lys	Ile	Gly
Asp Asp 210	Leu	Ser Val	Ser	Val 215	Trp	Leu	Ser Asp Gly Ala 220	Val	Ala Gly
Cys Arg 225	Val	Ala Thr	Val 230	Ile	Met	Gin	Tyr Gly Ile Ile 235	Ala Asn Tyr 240
Cys Trp Leu	Leu Val 245	Glu	Gly Val	Tyr	Leu Tyr Ser Leu 250	Leu	Ser 255	He

Thr Thr Phe Ser Glu Lys Ser Phe Phe Ser Leu Tyr Leu Cys Ile Gly

260 265270

Trp Gly Ser Pro Leu Leu Phe Val Ile Pro Trp Val Val Val Lys Cys 275 230235

Leu Phe Glu Asn Val Gin Cys Trp Thr Ser Asn Asp Asn Met Gly Phe 230 295300

Trp Trp Ile Leu 305	Arg He Pro Val Leu Leu Ala Ile	Leu	Ile Asn Phe 320
310	315
Phe Ile Phe Val	Arg Ile Ile His	Leu Leu Val Ala	Lys	Leu Arg Ala
	325	330		335
His Gin Met His	Tyr Ala Asp Tyr Lys Phe Arg Leu	Ala	Arg Ser Thr
340		345		350

Leu Thr Leu Ile Pro Leu Leu Gly Val His Glu Val Val Phe Ala Phe

355 360365

Val Thr Asp Glu His Ala Gin Gly Thr Leu Arg Ser Thr Lys Leu Phe

370 375380

Phe Asp Leu Phe Phe Ser Ser Phe Gin Gly Leu Leu Val Ala Val Leu

385 390 395400

178 685

Tyr Cys Phe Leu Asn Lys Glu Val Gin Ala Glu Leu Leu Arg Arg Trp 405 410415

Arg Arg Trp Gin Glu Gly Lys Ala Leu Gin Glu Glu Arg Met Ala Ser 420 425430

Ser His Gly Ser His Met Ala Pm Ala Gly Thr Cys His Gly Asp Pm 435 440445

Cys Glu Lys Leu Gin Leu Met Ser Ala Gly Ser Ser Ser Gly Thr Gly 450 455460

Cys Glu Pro Ser Ala Lys Thr Ser Leu Ala Ser Ser Leu Pm Arg Leu 465 470 475480

Ala Asp Ser Pro Thr

485

178 685

FIGURA

CYTOPLAZMA

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 70 egz Cena 6,00 zł.

Claims (12)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Cząsteczka DNA kodująca receptor glukagonu lub peptyd receptora glukagonu, która obejmuje wyizolowaną sekwencję nukleotydów wybraną z grupy składającej się z:

   (a) wyizolowanej sekwencjinukleotydówIdentyfikatora Sekw.Nr: 14odnukleotydu 145 do nukleotydu 1599 lub jej allelicznej odmiany lub sekwencji zdegenerowanej;

   (b) wyizolowanej sekwencji nukleotydów Identyfikatora Sekw. Nr: 14 od nukleotydu 226 do nukleotydu 570 lub jej allelicznej odmiany lub sekwencji zdegenerowanej; lub (c) wyizolowanych sekwencji nukleotydowychzdolnych do hybrydyzacji z wymienionymi wyizolowanymi sekwencjami nukleotydowymi (a) lub (b) w warunkach wysokiej lub niskiej ostrości lub sekwencjami komplementarnymi do nich.
2. 2. Cząsteczka DNA według zastrz. 1, znamienna tym, ze koduje receptor glukagonu lub peptyd receptora glukagonu wybrany z grupy składającej się z receptorów glukagonu lub peptydów receptora glukagonu szczura i człowieka.
3. 3. Cząsteczka DNA według zastrz. 1, znamienna tym, ze koduje receptor glukagonu lub peptyd receptora glukagonu, który obejmuje sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z:

   (a) sekwencji aminokwasów Identyfikatora Sekw. Nr: 15 od Met, aminokwasu nr 1, do Thr, aminokwasu nr 485;

   (b) sekwencji aminokwasów Identyfikatora Sekw. Nr: 15 od Gin, aminokwasu nr 28, do Tyr, aminokwasu nr 142, albo ich alłeliczne odmiany i modyfikacje z substytucją addycjąłub delecją aminokwasów.
4. 4. Wyizolowana cząsteczka DNA, kodująca receptor glukagonu, która obejmuje sekwencję nukleotydów Identyfikatora Sekw. Nr: 24 od nukleotydu 53 do nukleotydu 1486, albo jej alłeliczne odmiany, sekwencje zdegenerowane albo zdolne do hybrydyzacji z wymienioną sekwencją DNA w warunkach wysokiej lub niskiej ostrości albo sekwencje do nich komplementarne.
5. 5. Cząsteczka DNA według zastrz. 4, znamienna tym, ze receptor glukagonu obejmuje sekwencję aminokwasów Identyfikatora Sekw. Nr: 25 od Met, aminokwasu nr 1, do Phe, aminokwas nr 477, albo jej alłeliczne odmiany i modyfikacje z substytucją addycjąłub delecją aminokwasów.
6. 6. Konstrukt DNA składający się z pierwszego segmentu DNA kodującego receptor glukagonu lub peptyd receptora glukagonu o sekwencji nukleotydowej wybranej z grupy składającej się z.

   (a) wyizolowanej sekwencji nukleotydów Identyfikatora Sekw. Nr: 14 od nukleotydu 145 do nukleotydu 1599 lub jej allelicznej odmiany lub sekwencji zdegenerowanej;

   (b) wyizolowanej sekwencji nukleotydówIdentyfikatora Sekw.Nr: 14 odnukleotydu226 do nukleotydu 570 lub jej allelicznej odmiany lub sekwencji zdegenerowanej; lub (c) wyizolowanych sekwencji nukleotydowychzdolnych do hybrydyzacji z wymienionymi w (a) lub (b) wyizolowanymi sekwencjami nukleotydowymi w warunkach wysokiej lub niskiej ostrości lub sekwencjami komplementarnymi do nich, połączonego funkcjonalnie z dodatkowymi segmentami DNA niezbędnymi do ekspresji wymienionego pierwszego kodującego segmentu DNA.

   178 685
7. 7. Konstrukt DNA składający się z pierwszego segmentu DNA kodującego receptor glukagonu, który obejmuje sekwencję nukleotydów Identyfikatora Sekw. Nr- 24 od nukleotydu 53 do nukleotydu 1486, albo jej alleliczne odmiany, sekwencje /degenerowane albo zdolne do hybrydyzacji z wymienioną sekwencją DNA w warunkach wysokiej lub niskiej ostrości albo sekwencję do nich komplementarną, połączonego funkcjonalnie z dodatkowymi segmentami DNA niezbędnymi do ekspresji wymienionego pierwszego kodującego segmentu DNA.
8. 8. Komórka gospodarza zawierająca konstrukt DNA, który składa się z pierwszego segmentu DNA kodującego receptor glukagonu lub peptyd receptora glukagonu o sekwencji nukleotydowej wybranej z grupy składającej się z:

   (a) wyizolowanej sekwencji nukleotydów Identyfikatora Sekw. Nr: 14 od nukleotydu 145 do nukleotydu 1599 lub jej allelicznej odmiany lub sekwencji /degenerowanej;

   (b) wyizolowanej sekwencji nukleotydów Identyfikatora Sekw. Nr: 14 od nukleotydu 226 do nukleotydu 570 lub jej allelicznej odmiany lub sekwencji /degenerowanej; lub (c) wyizolowanych sekwencji nukleoty do wy ch zdolnych do hybrydyzacji z wymienionymi wyizolowanymi sekwencjami nukleotydowyrni (a) lub (b) w warunkach wysokiej lub niskiej ostrości lub sekwencjami komplementarnymi do nich, połączonego funkcjonalnie z dodatkowymi segmentami DNA niezbędnymi do ekspresji wymienionego pierwszego kodującego segmentu DNA.
9. 9. Komórka gospodarza zawierająca konstrukt DNA, który składa się z pierwszego segmentu DNA kodującego receptor glukagonu który obejmuje sekwencję nukleotydów Identyfikatora Sekw. Nr. 24 od nukleotydu 53 do nukleotydu 1486, albo jej alleliczne odmiany, sekwencje zdegenerowane albo zdolne do hybrydyzacji z wymienionąsekwencjąDNA w warunkach wysokiej lub niskiej ostrości albo sekwencję do nich komplementarną, połączonego funkcjonalnie z dodatkowymi segmentami DNA niezbędnymi do ekspresji wymienionego pierwszego kodującego segmentu DNA.
10. 10. Sposób wytwarzania receptora glukagonu lub peptydu receptora glukagonu, znamienny tym, ze prowadzi się hodowlę komórki gospodarza, zawierającej konstrukt DNA, który składa się z pierwszego segmentu DNA kodującego receptor glukagonu lub peptyd receptora glukagonu o sekwencji nukleotydowej wybranej z grupy składającej się z:

    (a) wyizolowanej sekwencji nukleotydów Identyfikatora Sekw. Nr: 14 od nukleotydu 145 do nukleotydu 1599 lub jej allelicznej odmiany lub sekwencji zdegenerowanej, (b) wyizolowanej sekwencji nukleotydów Identyfikatora Sekw. Nr: 14 od nukleotydu 226 do nukleotydu 570 lub jej allelicznej odmiany lub sekwencji zdegenerowanej; lub (c) wyizolowanych sekwencji nukleotydowych zdolnych do hybrydyzacji z wymienionymi wyizolowanymi sekwencjami nukleotydowymi (a) lub (b) w warunkach wysokiej lub niskiej ostrości lub sekwencjami komplementarnymi do nich, połączonego funkcjonalnie z dodatkowymi segmentami DNA niezbędnymi do ekspresji wymienionego pierwszego kodującego segmentu DNA, w warunkach umożliwiających ekspresję wspomnianego pierwszego segmentu DNA.
11. 11. Sposób wytwarzania receptora glukagonu, znamienny tym, ze obejmuje hodowlę komórki gospodarza, zawierającej konstrukt DNA, który składa się z pierwszego segmentu DNA kodującego receptor glukagonu który obejmuje sekwencję nukleotydów Identyfikatora Sekw. Nr· 24 od nukleotydu 53 do nukleotydu 1486, albo jej alleliczne odmiany, sekwencje zdegenerowane albo zdolne do hybrydyzacji z wymienionąsekwencjąDNA w warunkach wysokiej lub niskiej ostrości albo sekwencję do nich komplementarną połączonego funkcjonalnie z dodatkowymi segmentami DNA niezbędnymi do ekspresji wymienionego pierwszego kodującego segmentu DNA, w warunkach umożliwiających ekspresję wspomnianego pierwszego segmentu DNA.
12. 12. Peptyd receptora glukagonu obejmujący sekwencję aminokwasów Identyfikatora Sekw Nr 15 od Gin, aminokwasu 28, do Tyr, aminokwasu 150 * * *

    178 685