JP3515112B2 - グルカゴン・レセプタ - Google Patents

グルカゴン・レセプタ

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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、一般的に、細胞表面レセプタに、そしてよ
り特に、グルカゴン・レセプタ（glucagon receptors）
に関する。
発明の背景 グルカゴンは、膵臓の島のアルファ細胞により生産さ
れる29アミノ酸ホルモンである。グルカゴンは、インシ
ュリン反作用ホルモンとして作用することによる、ヒト
を含む多くの動物におけるグルコースの正常レベルの維
持の原因である。特に、インシュリンが、血中グルコー
ス・レベルを速く減少させることが知られているが、グ
ルカゴンは、その血中グルコース・レベルの上昇に寄与
することによりこれらの効果を逆にバランスさせる。
グルカゴン及びインシュリンの相互作用は、体内のグ
ルコース・レベルの維持に非常に重要である。グルカゴ
ン又はインシュリンの不均衡は、幾つかの疾患、例え
ば、真性糖尿病及び糖尿病性ケトアシドーシスにおいて
役割を演じると信じられている。ある理論に従えば、真
性糖尿病の高血糖状態は、（減少したインシュリンによ
る）グルコースの不十分利用によるだけではなく、グル
カゴンの上昇濃度によるグルコースの過剰生産によって
ももたらされることができる（"Diabetes and the alph
a cell,"Diabetes 25:136−151,1976;Under and Orci,"
The essential role of glucagon in the pathogenesis
of diabetes mellitus,"Lancet 1:14−16,1975を参照
のこと。）。
グルカゴンの研究における、並びに疾患、例えば、真
性糖尿病におけるグルカゴンの役割における重要な因子
は、グルカゴンとの結合の間にその細胞にシグナルを変
換し、これにより糖原分解（（glycogenolysis）グリコ
ーゲン加水分解）及び糖新生（（gluconeogenesis）グ
ルコース合成）の引き金を引くグルカゴン・レセプタで
ある。
グルカゴンの効果がサイクリック・アデノシン・モノ
ホスフェート（cAMP）の細胞内レベルの上昇により部分
的に仲介されるということが従来信じられている。特
に、その細胞レセプタへのグルカゴンの結合はアデニレ
ート・シクラーゼを活性化し、cAMPを作り出し、このよ
うに細胞内cAMPのレベルを上昇させる。cAMPの細胞内レ
ベルのこの上昇は、肝臓によるグルコース生産において
得られた上昇により糖原分解及び糖新生をもたらすと信
じられている（Unson et al.,"Biological Activities
of des−His1［Glu9］Glucagon Amide,a Glucagon Anta
gonist,"Peptides 10:1171−1177,1989を参照のこ
と。）。
しかしながら、追加の経路も、糖原分解及び糖新生の
刺激について示唆されている。特に、グルカゴンが、Ｇ
−プロテインを介してのホスホリパーゼＣに結合された
肝細胞膜内のレセプタに結合することが報告されてい
る。刺激の間、このタンパク質は、ホスファチジルイノ
シトール4,5ビホスフェートの分解を引き起こし、第二
のメッセンジャー・イノシトール及び1,2ジアシルグリ
セロールを作り出す（Wakelam et al.,"Activation of
two signal−transduction systems in hepatocytes by
glucagon,"Nature 323:68−71,1986:Unson et al.,Pep
tides 10:1171−1177,1989;及びPittner and Fain,Bioc
hem.J.277:371−378,1991を参照のこと。）。イノシト
ール・リン脂質代謝のグルカゴンによる刺激は、それに
よりグルカゴンが糖原分解及び糖新生を刺激することが
できる追加の経路であることができる。
本発明は、グルカゴン・レセプタ（単数又は複数）を
開示し、そしてさらに、他の関連の利点を提供する。
発明の要約 本発明の態様において、グルカゴン・レセプタをエン
コードしている単離されたDNA分子を提供する。用語”
単離されたDNA分子”とは、本明細書中で使用すると
き、別々であり、離れて且つ単独で置かれ、又は他の成
分から分離されたDNA分子又は配列をいう。例えば、DNA
分子は、それがそのゲノム内で自然に会合するところの
他の染色体配列を含み、そして特に他の構造遺伝子を含
まない他のDNA分子からそれが分離されるときに、単離
される。単離されたDNA分子は、それが自然に会合する
ところの5'及び3'未翻訳配列を含むことができる。本発
明の中の１つの態様においては、グルカゴン・レセプタ
は、ラット及びヒトのグルカゴン・レセプタから成る群
から選ばれる。他の態様においては、このDNA分子はヌ
クレオチド145からヌクレオチド1599までの配列番号14
の分子の配列を含んで成る。他の態様においては、この
DNA分子は、メチオニン、アミノ酸番号１からトレオニ
ン、アミノ酸番号485までの配列番号15のアミノ酸の配
列を含んで成るグルカゴン・レセプタをエンコードして
いる。他の態様においては、このDNA分子はヌクレオチ
ド53からヌクレオチド1486までの配列番号24の分子のヌ
クレオチドの配列を含んで成る。さらに他の態様におい
ては、このDNA分子は、メチオニン、アミノ酸番号１か
らフェニルアラニン、アミノ酸番号477までの配列番号2
5のアミノ酸の配列を含んで成るグルカゴン・レセプタ
をエンコードしている。第一DNAセグメントの発現に必
要な追加のDNAセグメントに作用可能な状態で結合され
たグルカゴン・レセプタをエンコードしている第一DNA
セグメントを含んで成るDNA構築物、このようなDNA構築
物を含む宿主細胞、並びにグルカゴン・レセプタをエン
コードしているDNAセグメントの発現を促進する条件下
で宿主細胞を培養する段階を含んで成るグルカゴン・レ
セプタの生産方法も提供される。
本発明の他の態様においては、単離されたグルカゴン
・レセプタが提供される。ある態様においては、グルタ
ミン、アミノ酸番号28からチロシン、アミノ酸番号142
までの配列番号15のヌクレオチドの配列を含んで成る単
離されたグルカゴン・レセプタが提供される。
本発明の他の態様においては、グルカゴン・レセプタ
に特異的に結合する単離された抗体が提供される。ある
態様においては、抗体はモノクローナル抗体である。追
加の態様においては、グルカゴン・レセプタへのグルカ
ゴンの結合をブロッキングすることができるモノクロー
ナル抗体が提供される。先に記載のモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマも提供される。
本発明のさらなる態様においては、グルカゴン拮抗物
質の存在の検出方法であって、（ａ）グルカゴン作用物
質（agonist）の存在中、化合物を、そのレセプタへの
その化合物の結合を許容するのに十分な条件下及び時間
にわたり、応答経路及びその経路を通しての関連応答に
結合した組換え体グルカゴン・レセプタに、晒し、そし
て（ｂ）グルカゴン作用物質単独による応答経路の刺激
に対して、グルカゴン・レセプタへの化合物の結合から
生じる応答経路の刺激における減少を検出して、そして
それからグルカゴン拮抗物質の存在を測定する、段階を
含んで成る方法が提供される。
本発明の様々な態様において、応答経路は、膜結合ア
デニレート・シクラーゼ応答経路であり、そしてその検
出段階は、その膜結合アデニレート・シクラーゼ応答経
路によるサイクリックAMP生産における減少の測定を含
んで成る。本発明の他の態様においては、その応答経路
は、ルシフェラーゼ・リポーター系を含む。
本発明のさらに他の態様においては、少なくとも12ヌ
クレオチドを有するプローブであって、グルカゴン・レ
セプタをエンコードしている核酸とハイブリダイズする
ことができるものが、提供される。
これらの及び本発明の他の態様は、以下の詳細な説明
及び添付図面を参照して明確になるであろう。さらに、
より詳細に特定の手順又は組成物物（例えば、プラスミ
ド等）を記載し、そしてそれ故にその全体として引用に
より取り込まれる様々な文献を以下に記載する。
図面の簡単な説明 図１は、代表的なグルカゴン・レセプタの構造を例示
している。使用される記号は、点線により囲われたEATD
（細胞外アミノ末端ドメイン）;CM（細胞膜）；ダッシ
ュ線により囲われたED（エフェクター・ドメイン）;1I
D,第一細胞内ループ・ドメイン;2ID,第二細胞内ループ
・ドメイン;3ID,第三細胞内ループ・ドメイン;C−ID,カ
ルボキシ末端細胞内ドメイン;1ELD,第一細胞ループ・ド
メイン;2ELD,第二細胞外ループ・ドメイン;3ELD,第三細
胞外ループ・ドメイン;TMD1,第一トランスメンブラン・
ドメイン;TMD2,第二トランスメンブラン・ドメイン;TMD
3,第三トランスメンブラン・ドメイン;TMD4,第四トラン
スメンブラン・ドメイン;TMD5,第五トランスメンブラン
・ドメイン;TMD6,第六トランスメンブラン・ドメイン；
及びTMD7,第七トランスメンブラン・ドメインである。
図２は、ラット・グルカゴン・レセプタの疎水性を図
示している。
図３は、グルカゴン・レセプタへの125I−グルカゴン
の結合を図示している。
図４は、グルカゴン・レセプタについての見かけKdの
Scatchard分析である。
図５は、ラット・グルカゴン・レセプタのアミノ酸配
列であり、そのトランスメンブラン・ドメインに下線を
引いてある。
発明の詳細な説明 先に述べたように、本発明は、グルカゴン・レセプタ
をエンコードしている単離されたDNA分子を提供する。
それらの生来の立体配置においては、グルカゴン・レセ
プタは、細胞外アミノ末端ドメイン並びに幾つかのより
小さい外部及び内部ドメインから成る膜結合タンパク質
として存在すると信じられている（図１参照）。本発明
の文脈中では、”グルカゴン・レセプタ”とは、このよ
うなタンパク質及び実質的に同様の誘導体をいう。誘導
体は、対立遺伝子変異体及び遺伝子操作された変異体で
あって保存的アミノ酸置換及び／又はアミノ酸の僅かな
付加、置換又は欠失を含むものを包含する。本発明に係
るグルカゴン・レセプタは、グルカゴンに結合し、そし
てグルカゴンにより提供されたシグナルを細胞に変換す
ることができる。好ましくは、本発明に係るグルカゴン
・レセプタは、100nm以下、より好ましくは50nM以下、
そして最も好ましくは33nM以下のKdをもつグルカゴンに
結合することができる。グルカゴン・レセプタによるグ
ルカゴン結合を測定するために使用されることができる
代表的な検定を、以下実施例３及び６中に、より詳細に
記載する。
シグナル変換は、典型的には、応答経路が常にではな
いが一般的に膜結合レセプタに直接的に結合される外部
刺激により活性化されるときに起きる。応答経路は、一
般的に、細胞応答、例えば、応答性細胞系からの細胞外
マトリックス分泌、ホルモン分泌、化学走性、分化、又
は応答性細胞の細胞分裂の開始若しくは阻害を引き起こ
す。本明細書中で使用するとき、応答経路へのレセプタ
の結合とは、応答経路の直接的活性化又は第二メッセン
ジャー、例えば、Ｇ−プロテインを介してシグナルを変
換しての細胞応答経路の活性化をいう。
様々な細胞応答経路が、その細胞にグルカゴン結合シ
グナルを変換するためにグルカゴン・レセプタにより利
用されることができ、それは、例えば、アデニレート・
シクラーゼ応答経路、及び細胞内カルシウム応答経路を
含む。アデニレート・シクラーゼ活性を測定するための
検定は、本分野においてよく知られており、そして例え
ば、Lin et al.（Biochemistry 14:1559−1563,1975）
により記載されたものを包含する。本発明は、細胞内カ
ルシウム濃度に基くグルカゴン・レセプタの生物学的活
性の測定（Grynkiewics et al.,J.Biol.Chem.260:3440
−3450,1985を参照のこと。）、並びに以下より詳細に
記載するルシフェラーゼ・リポーター系の使用を通して
の測定をも提供する。さらに、イノシトール３燐酸経路
を介して生じる生物学的応答を、Subers and Nathanson
（J.Mol.Cell.Cardiol.20:131−140,1988）又はPittner
and Fain（Biochem.J.277:371−378,1991）中に一般的
に記載されているようなイノシトール・ホスフェート代
謝を測定することにより、評価することができる。本発
明の文脈中では、すべての応答経路が必ずしもグルカゴ
ン・レセプタがシグナルを細胞に変換するために存在す
る必要はないということに注目すべきである。例えば、
ある細胞応答、例えば、細胞内カルシウム・レベルにお
ける増加は、cAMPの非存在中そのレセプタへのグルカゴ
ンの結合又はイノシトール・ホスフェート・シグナルに
より引き金を引かれることもできる。
グルカゴン・レセプタcDNAクローンの単離 先に述べたように、本発明は、グルカゴン・レセプタ
をエンコードしている単離DNA分子を提供する。簡単に
言えば、グルカゴン・レセプタをエンコードしているゲ
ノム又はcDNA分子を、以下にそして実施例中に記載する
ような手順に従って細胞及び組織から調製されたライブ
ラリーから得ることができる。本発明において使用する
ことができる細胞及び組織を、様々な哺乳動物であっ
て、例えば、ヒト、マカーク（ザル）、ウシ、ブタ、ウ
マ、イヌ、ラット、及びマウスを含むものから得ること
ができる。使用することができる好ましい細胞及び組織
は、脂肪、腎臓、膵臓、心臓、及び肝臓を含む。
本発明の１つの態様においては、ラット・グルカゴン
・レセプタを本明細書中に記載する手順を使用して単離
及びクローン化する。簡単に言えば、ポリ（Ａ）+RNA
を、Sprague Dawleyラットから単離し、そして完全長cD
NAsを生成するためにHouamed et al（Science 252:1318
−1321,1991）により本質的に記載されているようなcDN
A合成のための鋳型として使用した。次に約1x106クロー
ンを含むライブラリーを、800塩基対よりも大きなcDNAs
の指向性クローニングにより哺乳類細胞発現プラスミド
内で構築した。それぞれに5,000クローンを含むプール
から調製したプラスミドDNAsを次に、COS−７細胞内に
トランスフェクトし、選択し、そして顕微鏡スライド上
で増殖させた。このトランスフェクト細胞を72時間後
125I−グルカゴンとの結合、その後のエマルジョン・ラ
ジオグラフィー（McMahan et al.,EMBO J.10:2821−283
2,1991）により分析した。陽性プールを、単一クローン
が単離されるまで、順番に分類した。このクローンから
得られたプラスミド、pLJ4と命名したものは、54,962ダ
ルトンの予想分子量をもつ485アミノ酸タンパク質をエ
ンコードしている約2.0キロベースの挿入物を含む（配
列番号15参照）。
本発明の他の態様においては、ヒト・グルカゴン・レ
セプタを単離及びクローニングする方法を提供する。本
明細書中に提供する開示を与えられた様々な技術を使用
することができ、これは、例えば、次にヒト・グルカゴ
ン・レセプタをエンコードしている配列を含むライブラ
リーの同定においても使用されることができるグルカゴ
ン・レセプタをエンコードしている配列（実施例４）を
増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（"PCR"）の使
用、その後のレセプタのクローニング（実施例５）を含
む。ヒト・グルカゴン・レセプタのクローニングのため
に特に好ましい戦略を以下の実施例４及び５中に記す。
あるいは、ヒトcDNAsを含む発現ライブラリーを実施例
１中に本質的に記載するような好適なRNA源から調製
し、そして機能的なヒト・グルカゴン・レセプタを発現
するクローンについて実施例３中に記載されているよう
にスクリーンする。
組換えグルカゴン・レセプタの生産 本発明は、第一DNAセグメントの発現に必要な追加のD
NAセグメントに作用可能な状態で結合されたグルカゴン
・レセプタをエンコードしている第一DNAセグメントを
含んで成るDNA構築物を含む宿主細胞を培養することに
よる組換え体グルカゴン・レセプタの生産を提供する。
先に述べたように、本発明の文脈中では、”グルカゴン
・レセプタ”は、実質的に同様のそれらの誘導体を含む
と理解される。その上、グルカゴン・レセプタは、本明
細書中に開示するDNA配列に実質的に同様のDNA配列によ
りエンコードされることができる。本明細書中で使用す
るとき、DNA配列は、（ａ）そのDNA配列が（例えば、以
下に開示する配列の対立遺伝子変異体を含む）生来のグ
ルカゴン・レセプタ遺伝子のコーディング領域から得ら
れ；（ｂ）そのDNA配列が、高又は低ストリンジェンシ
ーの下本発明のDNA配列にハイブリダイズすることがで
きる（Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laborato
ry Manual,2d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss,NY,1989）；又はDNA配列がその遺伝子コードの結果
として（ａ）又は（ｂ）において定義したDNA配列に縮
重されている、の場合に”実質的に同様”であるとみな
される。
変異体グルカゴン・レセプタの発現のために構築され
たヌクレオチド配列における突然変異は、そのコーディ
ング配列の読み取り枠を保存するであろう。さらに、こ
の突然変異は、好ましくは、二次mRNA構造、例えば、ル
ープ又はヘアピンであってそのレセプタmRNAの翻訳に有
害に影響を及ぼすであろうものを作り出すためにハイブ
リダイズすることができる相補的な領域を創出しないで
あろう。突然変異部位は予測されることができるけれど
も、その突然変異自体の性質が予測されることは必要で
ない。例えば、所定の部位における突然変異の最適な特
徴について選択するために、ランダム突然変異をその標
的コドンにおいて行うことができ、そしてその発現グル
カゴン・レセプタ突然変異体を生物学的活性についてス
クリーンされる。
突然変異を、その生来の配列の断片へのライゲーショ
ンを可能にする制限部位に隣接する突然変異体配列を含
むオリゴヌクレオチドを合成することにより特定の座に
おいて導入することができる。ライゲーション後、得ら
れた再構築配列は所望のアミノ酸の挿入、置換、又は欠
失をもつ誘導体をエンコードしている。
あるいは、オリゴヌクレオチド−指定部位−特異的突
然変異誘発手順を、要求される置換、欠失、又は挿入に
従って変更された特定のコドンをもつ変更遺伝子を提供
するために、使用することができる。先に述べた変更を
作るための例示的な方法は、Walder et al.,（Gene 42:
133,1986）:Bauer et al.（Gene 37:73,1985）;Craik
（Bio Techniques,January 1985,12−19）;Smith et a
l.（Genetic Engineering:Principles and Methods,Ple
num Press,1981）；及びSambrook et al.（前記）によ
り開示されている。
グルカゴン・レセプタの一次アミノ酸構造を、他の化
学的部分、例えば、グリコシル基、脂質、ホスフェー
ト、アセチル基、又は他のタンパク質若しくはポリペプ
チドとの共有結合又は集合性の結合体を形成することに
より修飾することもできる。さらなる態様においては、
グルカゴン・レセプタをグルカゴン・レセプタの精製又
は同定を容易にする他のペプチドと融合させることがで
きる。例えば、グルカゴン・レセプタをFLAGポリペプチ
ド配列との融合タンパク質として調製することができる
（米国特許第4,851,341号；またHopp et al.,Bio/Thchn
ology 6:1204,1988を参照のこと。）。このFLAGポリペ
プチド配列は、高く抗原性であり、そして発現された組
換え体タンパク質の速い精製を可能にする特異的モノク
ローナル抗体による結合のためのエピトープを提供す
る。また、この配列は、Asp−Lys対直後の残基において
ウシ粘膜エンテロキナーゼにより特異的に解裂される。
先に討議したような生来又は変異体のグルカゴン・レ
セプタのヌクレオチド配列の全て又は部分を含む多数の
DNA構築物を便利なものとして調製することができる。
本発明の文脈中では、DNA構築物は、全体として天然に
おいて他の方法では存在しないであろうやり方で結合及
び並置されたDNAのセグメントを含むためにヒトの介入
を通して修飾されたDNA分子、又はこのような分子のク
ローン（一本−又は二本鎖のいずれか）をいう。本発明
のDNA構造は、第一DNAセグメントの発現に必要な追加の
DNAセグメントに作用可能な状態で結合されたグルカゴ
ン・レセプタをエンコードしている第一DNAセグメント
を含んで成る。本発明の文脈中では、追加のDNAセグメ
ントは一般的にプロモーター及び転写ターミネーターを
含むであろうし、そしてさらにエンハンサー及び他の要
素を含むことができる。
発現ベクターとしても知られるDNA構築物は、問題の
ポリペプチドの分泌を指示するのに必要なDNAセグメン
トを含むこともできる。このようなDNAセグメントは、
少なくとも１の分泌シグナル配列を含むことができる。
好ましい分泌シグナルは、グルカゴン分泌シグナル（プ
レ−プロ配列）、アルファ因子シグナル配列（プレ−プ
ロ配列;Kurjan and Herskowitz,Cell 30:933−943,198
2;Kurjan et al.,米国特許第4,546,082号;Brake,欧州特
許第116,201号）、PH05シグナル配列（Beck et al.,WO8
6/00637）、BAR1分泌シグナル配列（MacKay et al.,米
国特許第4,613,572号;MacKay,WO87/002670）、SUC2シグ
ナル配列（Carlson et al.,Mol.Cell.Biol.3:439−447,
1983）、α−１−アンチトリプシン・シグナル配列（Ku
rachi et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:6826−6830,
1981）、α−２プラスミン・インヒビター・シグナル配
列（Tone et al.,J.Biochem.（Tokyo）102:1033−1042,
1987）、組織プラスミノーゲン・アクチベーター・シグ
ナル配列（Yuan et al.,J.Biol.Chem.265:13528−1355
2,1990）又は例えば、Oliverによりレビューされたバク
テリアのシグナル配列のいずれか（Ann.Rev.Microbiol.
39:615−649,1985）を含む。あるいは、分泌シグナル配
列は、例えば、von Heinjeにより確立されたルールに従
って合成されることができる（Eur.J.Biochem.133:17−
21,1983:J.Mol.Biol.184:99−105,1985;Nuc.Acids Res.
14:4683−4690,1986）。
分泌シグナル配列は、単独で使用されることができ、
又は組み合わされることもできる。例えば、第一分泌配
列を（米国特許第5,037,243号（これを、その全体とし
て引用により本明細書中に取り込む。）中に記載され
た）Barrierの第三ドメインをエンコードしている配列
との組み合わせにおいて使用することができる。Barrie
rの第三ドメインをエンコードしている配列を、適当な
読み取り枠内に問題のDNA配列の3'又はそのDNAセグメン
トに対して5'に、そして適当な読み取り枠内にその分泌
シグナル配列と問題のDNAセグメントの両方をもつよう
に配置することができる。
発現のために、グルカゴン・レセプタをエンコードし
ているDNA分子は、好適なDNA構築物内に挿入され、これ
を次に発現のために適当な宿主細胞を形質転換又はトラ
ンスフェクトするために使用する。本発明の実施におけ
る使用のための宿主細胞は、哺乳類、鳥類植物、昆虫、
バクテリア及び真菌の細胞を含む。好ましい真核生物細
胞は、培養された哺乳類細胞系（例えば、げっ歯類又は
ヒト細胞系）及び真菌細胞であって酵母の種（例えば、
サッカロミセス種（Saccharomyces spp.）、特にサッカ
ロミセス・セレビシエ（S.cerevisiae）、シゾサッカロ
ミセス種（Schizosacchromyces spp.）、又はクルイベ
ロミセス種（Kluyveromyces spp.））又は糸状菌（例え
ば、アスペルギルス種（Aspergillus spp.）、ニューロ
スポラ種（Neurospora spp.））を含むものを含む。様
々な原核生物及び真核生物宿主細胞内で組換え体タンパ
ク質を生産する方法は一般的に本分野において公知であ
る（"Gene Expression Technology,"Methods in Enzymo
logy,Vol.185,Goeddel（ed.）,Academic Press,San Die
go,Calif.,1990;また、"Guide to Yeast Genetics and
Molecular Biology,"Methods in Enzymology,Guthrie a
nd Fink（eds.）Academic Press,San Diego,Calif.,199
1を参照のこと。）。一般的に、宿主細胞は、高レベル
において問題のタンパク質を生産するその能力又はその
タンパク質の生物学的活性に必要なプロセシング段階の
少なくとも幾つかを行うためのその能力の基づいて選択
されるであろう。この方法において、宿主細胞内にトラ
ンスフェクトされなければならないクローン化DNA配列
の数が最小化されることができ、そして生物学的に活性
なタンパク質の全体的な収率が最大化されることができ
る。
本発明における使用に好適なベクターは、YRp7（Stru
hl et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.76:1035−1039,197
8）、YEp13（Broach et al.,Gene 8:121−133,1979）、
POTベクター（Kawasaki et al.,米国特許第4,931,373号
（これを、引用により本明細書中に取り込む。））、pJ
DB249及びpJDB219（Beggs,Nature 275:104−108,1978）
及びそれらの誘導体を含む。このようなベクターは、一
般的に、形質転換体の選択を可能にするために表現型検
定が存在するところの優勢表現型を示すいずれかの数の
遺伝子の中の１つであることができる選択マーカーを含
むであろう。好ましい選択マーカーは、宿主細胞の独立
栄養性を補い、抗生物質耐性を提供し、又は細胞が特定
の炭素源を利用することができるようにするものであ
り、そしてLEU2（Broach et al.,ibid）、URA3（Botste
in et al.,Gene 8:17,1979）、HIS3（Struhl et al.,ib
id）又はPOT1（Kawasaki et al.,ibid.）を含む。他の
好適な選択マーカーは、酵母細胞に対してクロラムフェ
ニコール耐性を与えるCAT遺伝子である。
酵母内での使用に好ましいプロモーターは、酵母解糖
遺伝子（Hitzeman et al.,J.Biol.Chem.255:12073−120
80,1980;Alber and Kawasaki,J.Mol.Appl.Genet.1:419
−434,1982;Kawasaki,米国特許第4,599,311号）又はア
ルコール・デヒドロゲナーゼ遺伝子（Young et al.,in
Genetic Engineering of Microorganisms for Chemical
s,Hollaender et al.（eds.）,p.355,Plenum,New York,
1982;Ammerer,Meth.Enzymol.101:192−201,1983）を含
む。これに関して、特に好ましいプロモーターは、TPI1
プロモーター（Kawasaki,米国特許第4,599,311号,198
6）及びADH2−4Cプロモーター（Russell et al.,Nature
304:652−654,1983;Irani and Kilgore,米国特許出願
逐次番号第07/784,653号（これを、引用により本明細書
中に取り込む。））である。発現単位は、転写ターミネ
ーターを含むこともできる。好ましい転写ターミネータ
ーは、TPI1ターミネーター（Alber and Kawasaki,ibi
d.）である。
酵母に加え、本発明のタンパク質を糸状菌、例えば、
アスペルギルス菌の株内で発現させることができる（Mc
Knight et al.,米国特許第4,935,349号（これを、引用
により本明細書中に取り込む。））。有用なプロモータ
ーの例は、アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillu
s nidulans）解糖遺伝子から得られたもの、例えば、AD
H3プロモーター（McKnight et al.,EMBO J.4:2093−209
9,1985）及びtpiAプロモーターを含む。好適なターミネ
ーターの例は、ADH3ターミネーター（McKnight et al.,
ibid.,1985）である。このような成分を使用する発現単
位は、アスペルギルスの染色体DNA内に挿入されること
ができるベクター内にクローン化される。
真菌を形質転換するための技術は、文献中によく知ら
れており、そして例えば、Beggs（ibid.）、Hinnen et
al.（Proc.Natl.Acad.Sci.USA.75:1929−1933,197
8））、Yelton et al.（Proc.Natl.Acad.Sci.USA.81:17
40−1747,1984））、及びRussel（Nature 301:167−16
9,1983）により記載されている。宿主細胞の遺伝子型
は、一般的には、その発現ベクター上に存在する選択マ
ーカーにより補われる遺伝子欠陥を含むであろう。特定
の宿主及び選択マーカーの選択は、十分に当業者のレベ
ル内にある。酵母内での異種タンパク質の生産を最適化
するために、例えば、宿主株が突然変異、例えば、酵母
pep4突然変異（Jones,Genetics 85:23−33,1977）であ
って減少したタンパク質分解活性をもたらすものを担持
することが好ましい。
真菌細胞に加えて、培養哺乳類細胞を本発明における
宿主細胞として使用することができる。本発明における
使用に好ましい培養哺乳類細胞は、COS−１（ATCC No.C
RL 1650）、COS−７（ATCC No.CRL 1651）、BHK（ATCC
No.CRL 1632）、及び293（ATCC No.CRL 1573;Graham et
al.,J.Gen.Virol.36:59−72,1977）細胞系を含む。好
ましいBHK細胞系は、（寄託番号CRL 10314の下American
Type Culture Collectionにより寄託された）BHK570細
胞系である。さらに、Rat Hep I（ATCC No.CRL 160
0）、Rat Hep II（ATCC No.CRL 1548）、TCMK（ATCC N
o.CCL 139）、ヒト肺（ATCC No.CCL 75.1）、ヒト肝癌
（ATCC No.HTB−52）、Hep G2（ATCC No.HB 8065）、マ
ウス肝臓（ATCC No.CCL 29.1）、NCTC 1469（ATCC No.C
CL 9.1）、SP2/0−Ag14（ATCC No.1581）、HIT−T15（A
TCC No.CRL 1777）、及びRINm 5AHT2B（Orskov and Nie
lson,FEBS 299（１）:175−178,1988）を含む多数の他
の哺乳類細胞系を本発明において使用することができ
る。
本発明の実施における使用のための哺乳類発現ベクタ
ーは、クローン化遺伝子又はcDNAの転写を指定すること
ができるプロモーターを含むであろう。好ましいプロモ
ーターは、ウイルス・プロモーター及び細胞のプロモー
ターを含む。ウイルス・プロモーターは、直初期サイト
メガロウイルス・プロモーター（Boshart et al.,Cell
41:521−530,1985）及びSV40プロモーター（Subramani
et al.,Mol.Cell.Biol.1:854−864,1981）を含む。細胞
プロモーターは、マウス・メタロチオネイン−１プロモ
ーター（Palmiter et al.,米国特許第4,579,821号）、
マウスＶκプロモーター（Bergman et al.,Proc.Natl.A
cad.Sci.USA.81:7041−7045,1983;Grant et al.,Nuc.Ac
ids Res.15:5496,1987）及びマウスVHプロモーター（Lo
h et al.,cell 33:85−93,1983）を含む。特に好ましい
プロモーターは、アデノウイルス２からの主要な後期プ
ロモーターである（Kaufman and Sharp,Mol.Cell.Biol.
2:1304−13199,1982）。このような発現ベクターは、プ
ロモーターから下流に及びペプチド又は問題のタンパク
質をエンコードしているDNA配列から上流に位置する１
セットのRNAスプライス部位を含むこともできる。この
好ましいRNAスプライス部位は、アデノウイルス及び／
又は免疫グロブリン遺伝子から得られることができる。
またその発現ベクター内に問題のコーディング配列の下
流に位置するポリアデニレーション・シグナルも含まれ
る。好適なポリアデニレーション・シグナルは、SV40
（Kaufman and Sharp,ibid.）からの初期及び後期ポリ
アデニレーション・シグナル、アデノウイルス5 E1B領
域からのポリアデニレーション・シグナル及びヒト成長
ホルモン遺伝子ターミネーター（DeNoto et al.,Nuc.Ac
ids Res.9:3719−3730,1981）を含む。発現ベクター
は、非コーディング・ウイルス・リーダー配列、例え
ば、そのプロモーターとそのRNAスプライス部位との間
に位置するアデノウイルス２トリパルチット・リーダー
を含むことができる。好ましいベクターは、エンハンサ
ー配列、例えば、SV40エンハンサー及びマウスμエンハ
ンサー（Gillies,Cell 33:717−728,1983）を含むこと
もできる。発現ベクターは、アデノウイルスVA RNAsを
エンコードしている配列を含むこともできる。好適なベ
クターは、商業的な源（例えば、Stratagene,La Jolla,
CA）から得られることができる。
クローン化DNA配列を培養哺乳類細胞内に、例えば、
燐酸カルシウム仲介トランスフェクション（Wigler et
al.,Cell 14:725,1978;Corsaro and Pearson,Somatic C
ell Genetics 7:603,1981;Graham and van der Eb,Viro
logy 52:456,1973）、エレクトロポレーション（Neuman
n et al.,EMBO J.1:841−845,1982）、又はDEAE−デキ
ストラン仲介トランスフェクション（Ausubel et al.
（eds.）,Current Protocols in Molecular Biology,Jo
hn Wiley and Sons,Inc.,NY,1987）（これを、引用によ
り本明細書中に取り込む。）により導入することができ
る。クローン化DNAを安定して組み込んだ細胞を同定す
るために、選択マーカーが一般的にその遺伝子又は問題
のcDNAと一緒にその細胞内に導入される。培養哺乳類細
胞内での使用に好ましい選択マーカーは、薬物、例え
ば、ネオマイシン、ハイグロマイシン、及びメトトレキ
セートに対する耐性を付与する遺伝子を含む。この選択
マーカーは、増幅可能な選択マーカーであることができ
る。好ましい増幅可能な選択マーカーは、DHFR遺伝子及
びネオマイシン耐性遺伝子である。選択マーカーは、Th
illy（Mammalian Cell Technology,Butterworth Publis
hers,Stoneham,MA（これを、引用により本明細書中に取
り込む。））によりレビューされている。選択マーカー
の選択は、十分に当業者のレベル内にある。
選択マーカーをグルカゴン・レセプタ配列と同時に別
々のベクター上で細胞内に導入することができ、又はそ
れらを、同一ベクターに導入することもできる。同一ベ
クター上にある場合、選択マーカー及びグルカゴン・レ
セプタ配列は、異なるプロモーター又は同一プロモータ
ーの制御下にあることができ、後者の編成が２シストロ
ン・メッセージを作り出す。このタイプの構築物は本分
野において公知である（例えば、Levinson and Simonse
n,米国特許第4,713,339号）。また、”キャリアーDNA"
として知られる追加のDNAを細胞内に導入される混合物
に加えることが有利である。
トランスフェクト哺乳類細胞は、問題のDNA配列（単
数又は複数）の発現を開始させるために一定の時間、例
えば、１−２日間成長に供される。次に薬物選択を。安
定した融合において選択マーカーを発現している細胞の
成長について選択するために適用する。増幅可能な選択
マーカーによりトランスフェクトされた細胞について、
その薬物濃度を、そのクローン化配列の増加コピー数に
ついて選択するための段階的なやり方で増加させ、これ
により発現レベルを増加させる。導入された配列を発現
する細胞を、所望の形態での又は所望のレベルにおける
問題のタンパク質の生産について選択し、そしてスクリ
ーンする。これらの基準を満足する細胞を次にクローン
化し、生産のためにスケール・アップすることができ
る。
本発明の実施における使用に好ましい原核生物宿主細
胞は、バクテリア大腸菌（Escherichia coli）の株であ
る。但し、バチルス（Bacillus）及び他の属も有用であ
る。これらの宿主を形質転換し、そしてその中にクロー
ン化された外来DNA配列を発現させるための技術は、本
分野においてよく知られている（例えば、Maniatis et
al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spr
ing Harbor Laboratory,1982（これを、引用により本明
細書中に取り込む。）；又はSambrook et al.,前記を参
照のこと。）。バクテリア宿主内でのクローン化DNA配
列を発現するために使用されるベクターは、一般的に選
択マーカー、例えば、抗生物質耐性のための遺伝子、及
び宿主細胞内で機能するプロモーターを含むであろう。
適当なプロモーターはtrp（Nichols and Yanofsky,Met
h.Enzymol.101:155−164,1983）、lac（Casadaban et a
l.,J.Bacteriol.143:971−980,1980）、及びλファージ
（Queen.J.Mol.Appl.Genet.2:1−10,1983）プロモータ
ー系を含む。バクテリアを形質転換するのに有用なプラ
スミドは、pBR322（Bolivar et al.,Gene 2:95−113,19
77）、pUCプラスミド（Messing,Meth.Enzymol.101:20−
78,1983;Vieria and Messuing,Gene 19:259−268,198
2）、pCQV2（Queen,ibid.）及びそれらの誘導体を含
む。プラスミドは、ウイルス及びバクテリアの要素の両
方を含むことができる。
本明細書中に提供する教示与える場合、プロモータ
ー、ターミネーター及び本発明のグルカゴン・レセプタ
をエンコードしている発現ベクターを植物、鳥類及び昆
虫細胞内に導入する方法は、当業者には自明であろう。
例えば、昆虫細胞内での異種DNA配列の発現のためのベ
クターとしてのバキュロウイルスの使用は、Atkinson e
t al.（Pestic.Sci.28:215−224,1990）によりレビュー
されている。さらに、植物細胞内での遺伝子発現のため
のベクターとしてのアグロバクテリウム・リゾゲネス
（Agrobacterium rhizogenes）の使用は、Sinker et al
（J.Biosci.（Bangalore）11:47−58,1987）によりレビ
ューされている。
本発明のDNA構築物を含む宿主細胞を次にグルカゴン
・レセプタをエンコードしているDNAセグメントを発現
させるために培養する。この細胞を選ばれた宿主細胞の
成長に必要な栄養を含む培養基中で標準的な方法に従っ
て培養する。様々なな好適な培地が本分野において公知
であり、そして一般的に炭素源、窒素源、必須アミノ
酸、ビタミン及びミネラル、並びに他の成分、例えば、
成長因子又は結成であってその特定の宿主細胞により要
求されることができるものを含む。培養培地は、一般的
に、例えば、薬剤選択又はそのDNA構築物上の又はそのD
NA構築物と同時トランスフェクトされる選択マーカーに
より補われる必須栄養における欠陥により、そのDNA構
築物（単数又は複数）を含む細胞について選択されるで
あろう。
酵母細胞に好適な培養条件は、例えば、化学的に定め
られた培地であって非アミノ酸窒素源又は酵母エキスで
あることができる窒素源、無機塩、ビタミン及び必須ア
ミノ酸補給物を含んで成るものの中で４℃〜37℃の間の
温度において、特に好ましくは30℃において培養するこ
とを含む。培地のpHは、好ましくは２を超え、そして８
未満のpH、より好ましくはpH5−６において維持され
る。安定pHを維持する方法は、緩衝液化及び一定pH制御
を含む。pH制御のための好ましい剤は、水酸化ナトリウ
ムである。好ましい緩衝液化剤は、琥珀酸及びBis−Tri
s（Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO）を含む。酵母宿
主細胞が異種タンパク質を超糖添加する傾向のため、ア
スパラギン結合糖添加に必要な遺伝子内に欠陥をもつ酵
母細胞内で本発明のグルカゴン・レセプタを発現させる
ことが好ましくあるとができる。このような細胞は、好
ましくは、浸透圧安定剤を含む培地中で培養される。好
ましい浸透圧安定剤は、培地中に0.1M〜1.5Mの間の濃度
において、好ましくは0.5M又は1.0Mの濃度において補わ
れたソルビトールである。培養哺乳類細胞は、一般的に
商業的に入手可能な血清含有又は血清不含培地中で培養
される。使用する特定の細胞系に適当な培地及び培養条
件の選択は、当業者のレベル内にある。
グルカゴン・レセプタは、非ヒト−トランスジェニッ
ク動物、特にトランスジェニックな温血動物内で発現さ
れることもできる。マウス、ウサギ、ヒツジ及びブタを
含むトランスジェニック動物を産生する方法は、本分野
において公知であり、そして例えば、Hammer et al（Na
ture 315:680−683,1985）、Palmiter et al.（Science
222:809−814,1983）、Brinster et al.（Proc.Natl.A
cad.Sci.USA 82:4438−4442,1985）、Palmiter and Bri
nster（Cell 41:343−345,1985）及び米国特許第4,736,
866号（これを、引用により本明細書中に取り込む。）
により開示されている。簡単に言えば、適当に配置され
た発現調節配列と一緒に発現されるべきDNA配列を含む
発現単位を、受精卵の前核内に導入する。DNAの導入は
一般的にはマイクロインジェクションにより行われる。
インジェクトされたDNAの組み込みを組織サンプル、典
型的には尾組織のサンプルからのDNAのブロット分析に
より検出する。導入されたDNAが、その動物の子孫に受
け継がれるようにその動物の生殖系に取り込まれること
が一般的に好ましい。
本発明の好ましい態様においては、トランスジェニッ
ク動物、例えば、マウスを、グルカゴン・レセプタ配列
を破壊するための突然変異を標的とすることにより開発
する（Mansour et al.,"Disruption of the protooncog
ene int−2 in mouse embryo−derived stem cells:a g
eneral strategy for targeting mutations to non−se
lectable genes,"nature 336:348−352,1988）。このよ
うな動物を代謝におけるグルカゴン・レセプタの役割を
研究するためのモデルとして容易に使用することができ
る。
グルカゴン・レセプタ・ペプチド 先に述べたように、本発明は、グルカゴン・レセプタ
・ペプチドをも提供する。本発明の文脈中では、グルカ
ゴン・レセプタ・ペプチドは、トランスメンブラン・ド
メインを含まず、そして長さにおいて少なくとも10アミ
ノ酸である先に討議したグルカゴン・レセプタの部分又
はそれらの誘導体を含むと理解される。簡単に言えば、
グルカゴン・レセプタ並びに推定トランスメンブラン・
ドメインの構造は、例えば、P/C Gene or Intelligenet
ics Suite（Interigenetics,Mt.View,CA）の疎水性プロ
ット関数を使用して、又はKyte and Doolittle（J.Mol.
Biol.157:105−132,1982）により記載された方法に従っ
て、その一次翻訳生成物から予測されることができる。
ラット・グルカゴン・レセプタの疎水性プロットを図２
中に示した。図表により結合されるべきことを欲しない
けれども、この疎水性分析に基づき、グルカゴン・レセ
プタは図１中に示す一般構造をもつと信じられている。
特に、これらのレセプタは、それぞれがトランスメンブ
ラン・ドメインにより分けられている、１つの細胞外ア
ミノ末端ドメイン、３つの細胞外ループ・ドメイン及び
４つの細胞内ループ・ドメインを含んで成ると信じられ
ている。
本発明の１つの態様においては、グルカゴン・レセプ
タの細胞外アミノ末端ドメインを含んで成る単離グルカ
ゴン・レセプタ・ペプチドが提供される。好ましい態様
においては、配列番号15のアミノ酸配列、グルタミン、
アミノ酸番号28から、チロシン、アミノ酸番号142ま
で、を含んで成る単離グルカゴン・レセプタ・ペプチド
が提供される。また、そのグルカゴン・レセプタの細胞
外及び細胞内ループ・ドメインから選ばれることができ
る他の単離グルカゴン・レセプタ・ペプチドも提供され
る（図１及び５参照）。１つの態様においては、グルカ
ゴン・レセプタ・ペプチドは、1ID（配列番号15、リシ
ン、アミノ酸番号169から、ヒスチジン、アミノ酸番号1
78まで）、1ELD（配列番号15、チロシン、アミノ酸番号
203から、イソロイシン、アミノ酸番号231まで）、2ID
（配列番号15、フェニルアラニン、アミノ酸番号259か
ら、セリン、アミノ酸番号266まで）、2ELD（配列番号1
5、バリン、アミノ酸番号293から、イソロイシン、アミ
ノ酸番号307まで）、3ID（配列番号15、ロイシン、アミ
ノ酸番号334から、リシン、アミン酸番号345まで）、及
び3ELD（配列番号15、アスパラギン酸、アミノ酸番号37
1から、セリン、アミノ酸番号380まで）から成る群から
選ばれる。
本発明のグルカゴン・レセプタ・ペプチドを、先に討
議した組換え技術を使用して、又は合成法により、生産
することができ、そして以下に記載するようにさらに精
製することができる。
グルカゴン・レセプタ・ペプチドの精製 単離グルカゴン・レセプタ・ペプチドを、とりわけ、
好適な宿主／ベクター系を培養し、本発明の組換え翻訳
生成物を作り出すことにより生産することができる。こ
のような細胞系からの上清を次に、グルカゴン・レセプ
タ・ペプチドを単離するための様々な精製手順により処
理することができる。例えば、上清を最初に、商業的に
入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、Amicon
又はMillipore Pellicon限外濾過装置を使用して濃縮す
ることができる。濃縮後、その濃縮物を好適な精製マト
リックス、例えば、好適な支持体に結合されたグルカゴ
ン又は抗−グルカゴン抗体に適用することができる。あ
るいは、アニオン又はカチオン交換樹脂を、そのレセプ
タ又はペプチドを精製するために使用することができ
る。最後に、１以上の逆相高速液体クロマトグラフィー
（RP−HPLC）段階を、グルカゴン・レセプタ・ペプチド
をさらに精製するために使用することができる。
グルカゴン・レセプタ・ペプチドは、たった１つのバ
ンドがSDS−ポリアクリルアミド・ゲル分析、その後のC
oomassie Brilliant Blueによる染色の後に検出される
場合に本発明の文脈中で”単離”又は精製されたとみな
す。
グルカゴン・レセプタに対する抗体 本発明の１つの態様において、それらの誘導体、並び
にこれらのタンパク質の部分又は断片、例えば、先に討
議ひたグルカゴン・レセプタ・ペプチドを含むグルカゴ
ン・レセプタを、グルカゴン・レセプタに特異的に結合
する抗体を調製するために使用することができる。本発
明の文脈中、用語”抗体”は、ポリクローナル抗体、モ
ノクローナル抗体、それらの断片、例えば、Ｆ（ab'）
２及びFab断片、並びに組換えにより作られた結合パー
トナーを含む。これらの結合パートナーは、特異的に結
合するモノクローナル抗体をエンコードしている遺伝子
からの可変領域を取り込んでいる。抗体は、それらがグ
ルカゴン・レセプタに107M-1以上のKaをもって結合する
場合に特異的に結合すると定義される。モノクローナル
抗体又は結合パートナーのアフィニティーは、当業者に
より容易に測定されることができる（Scatchard,Ann.Ac
ad.Sci.51:660−672,1949を参照のこと。）。
ポリクローナル抗体は、様々な温血動物、例えば、ウ
マ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、チキン、ウサギ、マウ
ス、又はラットから当業者により容易に作り出されるこ
とができる。簡単に言えば、グルカゴン・レセプタは、
腹膜内、筋中、眼内、又は皮下注射を通して動物を免疫
感作させるために使用される。グルカゴン・レセプタ又
はグルカゴン・レセプタ・ペプチドの免疫原性をアジュ
バント、例えば、Freund's完全又は不完全アジュバント
を通して増加することができる。幾つかのブースター免
疫感作の後、血清の小サンプルを採取し、そのグルカゴ
ン・レセプタに対する反応性についてテストする。様々
な検定をグルカゴン・レセプタに特異的に結合する抗体
を検出するために使用することができる。例示的な検定
は、Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow and Lane
（eds.）,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988
中に詳細に記載されている。このような検定の代表的な
例は：向流免疫電気泳動（CIEP）、ラジオイムノアッセ
イ、放射免疫沈降、酵素−結合イムノ−ソルベント検定
（ELISA）、ドット・ブロット検定、阻害又は競合検
定、及びサンドイッチ検定（米国特許第4,376,110号及
び第4,486,530号；またAntibodies:A Laboratory Manua
l,前記を参照のこと。）。特に好ましいポリクローナル
抗血清は、背景よりも少なくとも３倍大きいシグナルを
与えるであろう。一旦、動物の力価がグルカゴン・レセ
プタに対するその反応性に関してプラトーに達すれば、
大量のポリクローナル抗血清をその動物の１週間に１回
の出血、又は全採血により容易に得ることができる。
モノクローナル抗体も、よく知られた技術を使用して
容易に作り出すことができる（米国特許第RE32,011号、
第4,902,614号、第4,543,439号、及び第4,411,993号；
またMonoclonal Antibodies,Hybridomas:A New Dimensi
on in Biological Analyses,Pleneum Press,Kennett,Mc
Kearn,and Bechtol（eds.）,1980,and Antibodies:A La
boratory Manual,Harlow and Lane（eds.）,Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press,1988）を参照こと。）。簡
単に言えば、１つの態様においては、被検動物、例え
ば、ラット又はマウスにグルカゴン・レセプタに対して
免疫応答を作り出すのに好適なグルカゴン・レセプタの
形態を注射する。好適な形態の代表的な例は、とりわ
け、そのグルカゴン・レセプタ、又はそのグルカゴン・
レセプタに基づくペプチドを発現する細胞を含む。さら
に、得られた免疫応答を、例えば、そのレセプタ又はレ
セプタ・ペプチドを他のタンパク質、卵白アルブミン又
はKeyhole limpetヘモシアニン（LLH）と結合させるこ
とにより、又はアジュバント、例えば、Freund's完全又
は不完全アジュバントの使用を通して増加させるための
多くの技術が公知である。最初の免疫感作を腹膜内、筋
中、眼内、又は皮下経路を通してのものであることがで
きる。
最初の免疫感作の１〜３週間の間の後動物を他のブー
スター免疫感作により再免疫感作させることができる。
次に動物をテスト採血し、そしてその血清を先に記載し
たような検定を使用してグルカゴン・レセプタへの結合
についてテストする。追加の免疫感作を、その動物がグ
ルカゴン・レセプタに対するその反応性においてプラト
ーとなるまで行うこともできる。次に動物にグルカゴン
・レセプタ又はグルカゴン・レセプタ・ペプチドの最後
のブーストを与え、そして３〜４日後に殺すことができ
る。このとき、その脾臓及びリンパ節を収穫し、そして
その臓器をメッシュ・スクリーンに通過させ、又はその
細胞を包み込む脾臓及びリンパ節膜を破砕することによ
り単一細胞懸濁液まで破壊する。１つの態様において
は、赤血球細胞をその後に低張液の添加、その後に高張
液への戻しにより、溶解する。
他の態様においては、モノクローナル抗体の調製に好
適な細胞をインビトロにおける免疫感作技術の使用を通
して獲得する。簡単に言えば、動物を殺し、そしてその
脾臓及びリンパ節細胞を先に記載したように取り出す。
単一細胞懸濁液を調製し、そして細胞を先に記載したよ
うな免疫応答を作り出すのに好適であるグルカゴン・レ
セプタの形態を含むカルチャー内に入れる。その後、リ
ンパ球を収穫し、そして以下に記載するように融合す
る。
先に記載したようなインビトロにおける免疫感作の使
用を通して又は免疫感作された動物から得られた細胞
を、ウイルス、例えば、Epstein−Barrウイルス（EBV）
によるトランスフェクションにより不死化することがで
きる（Glasky and Reading,Hybridoma 8（４）:377−38
9,1989）。あるいは、好ましい態様においては、収穫さ
れた脾臓及び／又はリンパ節細胞を、モノクローナル抗
体を分泌する”ハイブリドーマ”を作り出すために、好
適なミエローマ細胞と融合させる。好適なミエローマ系
は、好ましくは、抗体の構築又は発現において欠陥をも
ち、そしてさらに、その免疫感作された動物からの細胞
と同系である。多数のこのようなミエローマ細胞系は、
本分野においてよく知られており、そして源、例えば、
American Type Culture Collection（ATCC）,Rockvill
e,Maryland（Catalogue of Cell Lines ＆ Hybridomas,
6th ed.,ATCC,1988参照）から獲得されることができ
る。代表的なミエローマ系は：ヒトについての、UC 729
−６（ATCC No.CRL 8061）、MC/CAR−Z2（ATCC No.CRL
8147）、及びSKO−007（ATCC No.CRL 8033）；マウスに
ついての、SP2/0−Ag14（ATCC No.CRL 1581）及びP3X64
Ag8（ATCC No.TIB 18）；及びラットについての、Y3−A
g1.2.3（ATCC No.CRL 1631）及びYB2/0（ATCC No.CRL 1
662）を含む。特に好ましい融合系はNS−１（ATCC No.T
IB 18）およびP3X63−Ag8.653（ATCC No.CRL 1580）で
あってマウス、ラット、又はヒト細胞系のいずれかとの
融合のために使用されることができるものを含む。ッミ
エローマ細胞系と免疫感作動物からの細胞との間の融合
を、ポリエチレン・グリコール（PEG）（Antibodies:A
Laboratory Manual,Harlow and Lane（eds.）,Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press,1988参照）又はエレクト
ロフュージョン（Zimmerman and Vienken,J.Membrane B
iol.67:165−182,1982参照）を含む様々な方法により行
うことができる。
上記融合の後、細胞を好適な培地、例えば、RPMI 164
0又はDMEM（Dulbecco's Modified Eagles Medium）（JR
H Biosciences,Lenexa,Kan.）を含む培養プレート内に
置く。この培地は、追加の成分、例えば、Fetal Bovine
Serum（FBS、すなわち、Hyclone,Logan,Utah,又はJRH
Biosciences）からのもの）、免疫感作のために使用さ
れるものと同じ種の赤ちゃん動物から収穫された胸腺細
胞、又はその培地を固化するための寒天をも含むことが
できる。さらに、この培地は、融合脾臓及びミエローマ
細胞の成長を選択的に許容する試薬を含まなければなら
ない。特に好ましいのは、HAT（ヒポキサンチン、アミ
ノプテリン、及びチミジン）（Sigma Chemical Co.,St.
Louis,Missouri）の使用である。約７日間の後、得られ
た融合細胞又はハイブリドーマを、グルカゴン・レセプ
タを認識する抗体の存在を決定するためにスクリーンす
ることができる。幾つかのクローンの希釈及び再検定の
後、グルカゴン・レセプタに結合する抗体を産生するハ
イブリドーマを単離することができる。
モノクローナル抗体を構築するために他の技術をも使
用することができる（William D.Huse et al.,"Generat
ion of a Large Combinational Library of the Immuno
globlin Repertoire in Phage Lambda,"Science 246:12
75−1281,December 1989参照；またL.Sastry et al."Cl
oning the Immunological Repertoire in Escherichia
coli for Generation of Monoclonal Catalytic Antibo
dies:Construction of a Heavy Chain Variable Region
−Specific cDNA Library,"Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
6:5728−5732,August 1989参照；またMichelle Alting
−Mees et al.,"Monoclonal Antibody Expression Libr
aries:A Rapid Alternative to Hybridomas,"Strategie
s in Molecular Biology 3:1−9,january 1990参照；こ
れらの文献は、抗体の産生を組換え技術を通して可能に
する、Stratacyte,La Jolla,Cliforniaから入手可能な
商業システムについて記載している。）。簡単に言え
ば、mRNAをＢ細胞集団から単離し、そしてλIMMUNOZAP
（Ｈ）及びλIMMUNOZAP（Ｌ）ベクター内で重鎖及び軽
鎖免疫グロブリンcDNA発現ライブラリーを創出するため
に使用する。これらのベクターを個別にスクリーンし、
又はFab断片又は抗体を作るために同時発現させること
ができる（Huse et al.,前記；またSastry et al.,前記
を参照のこと。）。陽性プラークを次に、大腸菌（E.co
li）からのモノクローナル抗体断片の高レベルの発現を
許容する非−溶解性プラスミドに変換することができ
る。
同様に、結合パートナーを、特異的結合性抗体をエン
コードしている遺伝子の可変領域を取り込むための組換
えDNA技術を使用して構築することもできる。これらの
タンパク質の構築は、当業者により容易に行われること
ができる（James W.Larrick et al.,"Polymerase Chain
Reaction Using Mixed Primers:Cloning of Human Mon
oclonal Antibody Variable Region Genes From Single
Hybridoma Cells,"Biotechnology 7:934−938,Septemb
er 1989;Riechmann et al.,"Reshaping Human Antibody
with Enhanced Affinity and Specificity for its An
tigen by Protein Enginerring,"Nature 328:731−734,
1987;Verhoeyen et al.,"Reshaping Human Antibodies:
Grafting an Antilysozyme Activity,"Science 239:153
4−1536,1988;Chaudhary et al.,"A Recombinant Immun
otoxin Consisting of Two Antibody Variable Domains
Fused to Pseudomonas Exotoxin,"Nature 339:394−39
7,1989参照；また、米国特許第5,132,405号名称"Biosyn
thetic Antibody Binding Sites"参照）。これらの開示
を本明細書中に提供する。簡単に言えば、１つの態様に
おいては、グルカゴン・レセプタ特異的結合ドメインを
エンコードしているDNAセグメントを、特異的結合性モ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから増幅
し、そしてヒト抗体を産生する細胞のゲノム中に直接的
に挿入する（Verhoeyen et al.,前記参照；またReichma
nn et al.,前記参照）。この技術は、特異的結合性マウ
ス又はラット・モノクローナル抗体の抗原結合部位がヒ
ト抗体内に転移されることを可能にする。このような抗
体は、好ましくは、ヒトにおける治療的用途のためのも
のである。なぜなら、それらがラット又はマウス抗体と
同様な抗原性をもたないからである。
あるいは、抗原結合部位（可変領域）は、他の完全に
異なるタンパク質に結合されるか又はその内に挿入され
るかのいずれかを行われることができ（Chaudhary et a
l.,前記参照）、抗体の抗原結合部位並びに完全に異な
るタンパク質の機能的活性をもつ新たなタンパク質をも
たらす。当業者が理解するであろうように、抗体の抗原
結合部位又はグルカゴン・レセプタ結合ドメインは、抗
体の可変領域内にあることができる。さらに、哺乳類グ
ルカゴン・レセプタに特異的に結合する抗体のより小さ
い部分又は可変領域をエンコードしているDNA配列も本
発明の文脈中で使用することができる。これらの部分
は、以下に記載する検定を使用してグルカゴン・レセプ
タへの特異的結合について容易にテストされることがで
きる。
好ましい態様においては、問題のモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマからの可変領域をエンコード
している遺伝子をその可変領域のためのオリゴヌクレオ
チド・プライマーを使用して増幅することができる。こ
れらのプライマーは当業者により合成されることがで
き、又は商業的に入手利用できる源から購入されること
ができる。Stratacyte（La Jolla,Calif.）は、とりわ
け、VHa、VHb、VHc、VHd、CH1、VL及びCL領域のための
プライマーを含むマウス及びヒト可変領域のためのプラ
イマーを販売している。これらのプライマーを、重鎖又
は軽鎖可変領域を増幅するために使用することができ、
これを次にベクター、例えば、IMMUNOZAP＊（Ｈ）又はI
MMUNOZAP＊（Ｌ）（Stratacyte）内にそれぞれ挿入する
ことができる。これらのベクターを次に発現のために大
腸菌（E.coli）内に導入することができる。これらの技
術を使用して、VH及びVLドメインの融合を含む大量の一
本鎖タンパク質を作り出すことができる（Bird et al.,
Science 242:423−426,1988参照）。
他の態様においては、結合パートナーをその発現ベク
ター内で他のタンパク質、例えば、毒素に融合させる。
この結合パートナーにより結合された細胞は、これ故、
その毒素の取り込みにより殺されることができる（Chau
dhary et al.,前記参照）。
一旦、好適な抗体又は結合パートナーが得られたなら
ば、それらは、当業者によく知られた多くの技術により
単離され又は精製されることができる（Antibodies:A L
aboratory Manual,前記参照）。好適な技術は、ペプチ
ド又はタンパク質のアフィニティー・カラム、HPLC又は
RP−HPLC、プロテインＡ又はプロテインＧカラム上での
精製、又はこれらの技術のいずれかの組み合わせを含
む。本発明の文脈中、抗体又は結合パートナーを定義す
るために使用するとき、用語”単離された”とは、”他
の血液成分を実質的に含まない”ことを意味する。
本発明に係る抗体及び結合パートナーは、多くの用途
をもつ。例えば、抗体をグルカゴン・レセプタ−担持細
胞を分けるためのフロー・サイトメトリーにおいて、又
はグルカゴン・レセプタ−担持組織を組織学的に染色す
るために、使用することができる。簡単に言えば、細胞
上のグルカゴン・レセプタを検出するために、細胞をグ
ルカゴン・レセプタに特異的に結合する標識付けされた
モノクロナール抗体とインキュベートし、その後結合し
た抗体の存在を検出することができる。これらの段階
は、追加の段階、例えば、非結合抗体を除去するための
洗浄により行われることもできる。本発明における使用
に好適な標識は、本分野においてよく知られており、と
りわけ、フルオレセイン・イソチオシアネート（FIT
C）、フィコエリトリン（PE）、ホス・ラディッシュ・
ペルオキシダーゼ（HRP）、及びコロイダル・ゴールド
（collidal gold）を含む。フロー・サイトメトリーに
おける使用に特に好ましいのは、FITCであり、これ
は、"Conjugation of Fluorescein Isothiocyanate to
Antibodies.I.Experiments on the Conditions of Conj
ugation,"Immunology 18:865−873,1970中のKeltkampの
方法に従って精製抗体に結合されることができる。（ま
た、Keltkamp,"Conjugation of Fluorescein Isothicya
nate to Antibodies,II.A Reproducible Methods,"Immu
nology 18:875−881,1970;及びGoding,"Conjugation of
Antibodies with Fluorochromes:Modification to the
Strandard Methods,"J.Immunol.Methods 13:215−226,
1970を参照のこと。）。好ましい組織学的染色、HRP
を、Nakane and Kawaoiの方法に従って精製抗体と結合
させることができる（"Peroxidase−Labeled Antibody:
A New method of Conjugation,"J.Histochem.Cytochem.
22:1084−1091,1974;またTijssen and Kurstak,"Highly
Efficient and Simple Methods for Preparation of P
eroxidase and Active Peroxidase Antibody Conjugate
s for Enzyme Immunoassays,"Anal.Biochem.136:451−4
57,1984参照）。
さらに、精製抗体又は結合パートナーを、インビトロ
又はインビボにおけるグルカゴン・レセプタへのグルカ
ゴンの結合をブロックするために治療的に使用すること
もできる。簡単に言えば、ブロッキング抗体は、グルカ
ゴンがそのレセプタに結合するのを防ぎ、又はそのグル
カゴンがシグナル変換に影響を及ぼすことを防ぐような
方法でグルカゴン・レセプタ・エピトープに結合するよ
うな抗体である。先に述べたように、様々な検定を、グ
ルカゴン・レセプタへのグルカゴンの結合をブロックし
又は阻害する抗体を検出するために使用することがで
き、これらは、とりわけ、先に記載したような阻害及び
競合検定を含む。１つの態様においては、（先に記載し
たように調製した）モノクローナル抗体を、グルカゴン
の非存在中、並びにグルカゴンの変動濃度の存在中での
グルカゴン・レセプタへの結合について検定する。ブロ
ッキング抗体又は結合パートナーは、例えば、グルカゴ
ン・レセプタに結合し、そしてグルカゴンの存在中、そ
のグルカゴン・レセプタへのグルカゴンの結合をブロッ
クし又は阻害するようなものとして同定される。
治療的に使用されるべき抗体又は結合パートナーは、
好ましくは、その抗体又は結合パートナー並びに生理学
的に許容される担体又は希釈剤を含んで成る治療的組成
物中において提供される。好適な担体又は希釈剤は、と
りわけ、中性緩衝化生理食塩水又は生理食塩水を含み、
そして追加の賦形剤又は安定剤、例えば、バッファー、
糖、例えば、グルコース、シュクロース、又はデキスト
ラーゼ、キレート化剤、例えば、EDTA、並びに様々な保
存剤を含む。
グルカゴン拮抗物質 先に述べたように、本発明は、グルカゴン拮抗物質を
検出するための方法を提供する。本発明の文脈中、拮抗
物質とは、レセプタに結合することができる分子である
が、細胞内の応答経路を刺激せず、又はその刺激を減少
させる分子をいうと理解される。特に、グルカゴン拮抗
物質は、一般的には、グルカゴン・レセプタに結合し、
そしてそれにより細胞内の応答経路の刺激を減少させる
それらの能力により同定される。
本発明の１つの態様においては、（ａ）化合物がレセ
プタに結合することを許容するのに十分な条件下及び時
間にわたり応答経路並びにその経路を通しての関連応答
に結合した組換えグルカゴン・レセプタに、グルカゴン
作用物質の存在中、その化合物を晒し、そして（ｂ）そ
のグルカゴン作用物質によるその応答経路の刺激に比較
して、そのグルカゴン・レセプタへのその化合物の結合
から生じるその応答経路の刺激における減少を検出し、
そしてそれからグルカゴン拮抗物質の存在を検出する、
段階を含んで成る方法を、グルカゴン拮抗物質の存在を
検出するために提供する。
本発明の文脈中、グルカゴン拮抗物質とは、グルカゴ
ン・レセプタに結合することができ（グルカゴンそれ自
体を含み）且つ細胞内の応答経路を刺激する分子を含
む。
様々な化合物を、このような方法を使用してスクリー
ンすることができる。代表的な例は、先に討議したよう
なブロッキング抗体、グルカゴン・レセプタ・ペプチ
ド、及び（ペプチド及び非ペプチド・リガンドの両方を
含む）グルカゴン・アナログ含む。米国逐次番号第07/7
41,931号は、例えば、このようなアナログをエンコード
しているDNA配列のプールを使用して多数のグルカゴン
・アナログを作り出す方法を提供している。グルカゴン
・アナログをエンコードしているDNA配列のこのような
プールは、グルカゴンをエンコードしているDNA配列の
飽和突然変異誘発（例えば、Little,Gene 88:113−115,
1990;Hambers et al.,Gene 88:143−151,1989）によ
り、セグメント−指定突然変異誘発（例えば、Shortle
et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:5375−5379,1980）
により、強制ヌクレオチド過誤取り込み（例えば、Liao
and Wise Gene 88:107−111,1990）により、又はラン
ダム突然変異誘発オリゴヌクレオチドの使用（Hutchiso
n et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.USA 83:710−714,19
86）により生成されることができる。グルカゴン・アナ
ログを発現する個々の形質転換体を次に先に討議したよ
うにクローン化し、又はプールすることができる。
化合物を、レセプタへのその化合物の結合を許容する
条件下及び時間にわたり、応答経路及びその経路を通し
ての関連応答に結合した組換えグルカゴン・レセプタ
に、グルカゴン作用物質の存在中で晒す。本発明におい
て使用されるとき、上記グルカゴン拮抗物質がそのレセ
プタへ結合するのに十分な条件及び時間は、そのレセプ
タの源により変化するであろうが、その結合に好適な条
件は、一般的には、０〜2M NaClの間の、好ましくは０
〜0.9M NaClの間の、特に好ましくは0.1M NaClにおける
バッファー溶液中、４℃〜55℃の間において、そして５
〜９の間の、好ましくは6.8〜８の間のpHレンジ内で生
じる。結合及び応答のために十分な時間は、一般的に
は、露出後５〜15分間の間であろう。
一旦、化合物が、グルカゴン作用物質の存在中、その
化合物がそのレセプタへ結合するのに十分な条件下及び
時間にわたり組換えグルカゴン・レセプタに晒される
と、その応答経路の刺激における減少を、その化合物が
その組換えグルカゴン・レセプタについてそのグルカゴ
ン作用物質と競合する場合に、検出することができる。
本発明の１つの態様においては、この応答経路は、膜結
合デニレート・シクラーゼ応答経路であり、そしてこの
検出段階は、グルカゴン作用物質単独の存在中サイクリ
ックAMP生産に比較しての、その膜結合アデニレート・
シクラーゼ応答経路によるcAMP生産における減少の測定
を含んで成る。本発明の目的のためには、その応答経路
の刺激における減少がデス−His1−グルカゴンに関連す
る減少に等しい化合物又はそれを上回ることが好まし
い。アデニレート・シクラーゼ活性検定を、例えば、Li
n et al.（Biochem.14:1559−1563,1975）により、そし
て本実施例中に記載された方法を使用して行うことがで
きる。これらの方法は、生来のグルカゴンに対してcAMP
の刺激のレベルを測定し、そして一般的には、生物学的
に活性な組換えグルカゴン・レセプタを発現する細胞の
調製物を、放射標識付けされたATPの存在中グルカゴン
とテスト化合物との混合物に、晒すことを含む。
あるいは、cAMP生産を、本分野においてよく知られた
方法であって、例えば、Salomon et al.（Anal.Bioche
m.58:541−548,1976）又はKrishna et al.（J.Pharmaco
l.Exp.Ther.163:379,1968）を含むもの、又は、好まし
くは、商業的に入手可能なキット、例えば、Amersham C
orporationからのScintillation Proximity Assay Kit
を使用して、容易に測定することもできる。このScinti
llation Proximity Assay Kitは、抗−cAMP抗体とのヨ
ウ素化−cAMPの競合によるcAMPの生産を測定する。特に
好ましいグルカゴン・レセプタは、1nM未満のED50（50
％応答のための有効投与量）の、より好ましくは0.7nM
未満のED50による、そして最も好ましくは0.25nM未満の
ED50による、上記検定における生物学的活性をもつ。
本発明のさらなる態様においては、応答経路は、ルシ
フェラーゼ・リポーター系を含む。簡単に言えば、ルシ
フェラーゼは、ルシフェリンによる光子の放出を触媒す
る酵素であり、そしてこれ故、ルシフェリンの存在中発
現について容易に検出されることができる（Alam and C
ook,Anal.Biochem.188:245−254,1990）。以下により詳
細に記載するように、本発明の特に好ましい態様におい
ては、サイクリックAMP応答要素、例えば、プロエンケ
ファリン・サイクリックAMP応答要素であって、ルシフ
ェラーゼcDNAに作用可能な状態で結合されているものを
含んで成るDNA構築物を提供する。ルシフェラーゼcDNA
を含んで成るDNA構築物は、安定して宿主細胞内にトラ
ンスフェクトされる。次に宿主細胞を、そのレセプタの
発現に必要な追加のDNAセグメントに作用可能な状態で
結合されたグルカゴン・レセプタをエンコードしている
第一DNAセグメントを含む第二DNA構築物により、トラン
スフェクトさせる。グルカゴン・レセプタ作用物質の結
合の間、上昇したcAMPレベルがルシフェラーゼの発現を
誘導する。ルシフェラーゼをルシフェリンに晒し、そし
てルシフェラーゼによるルシフェリンの酸化の間に放出
される光子を測定する。
本発明の他の態様においては、応答経路の活性化が、
遊離のカルシウムの細胞内濃度の増加をもたらす。様々
な検定を、細胞内カルシウムの濃度を測定するために行
うことができ、これらは、例えば、Charest et al.（J.
Biol.Chem.259:8769−8773,1983）により記載されたcal
cium flour QuinZ法、又はNakajima−Shimada（Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA 88:6878−6882,1991）により記載され
たエクオリン光タンパク質法（aequorin photoprotein
method）を含む。特に好ましい方法は、細胞内カルシウ
ム光画像形成法であって実施例６中により詳細に記載す
るものである。簡単に言えば、１つの態様においては、
細胞をグルカゴン・レセプタ発現プラスミドにより形質
転換させ、そして正常培養条件下で３日間成長させる。
この成長培地を次に除去し、そして10μM fura−2AMを
含む溶液により置き換える（Grynkiewicz et al.,J.Bio
l.Chem.260:3440−3450,1985参照）。次に細胞を30分間
暗所でインキュベートし、その後濯ぎ、そして30〜120
分間さらにインキュベートする。光画像形成を、水銀放
電ランプを備えたNikon Diaphot倒立蛍光顕微鏡により
行うことができる。細胞を最初に少なくとも60秒間モニ
ターし、ベース・ラインを確立し、その後グルカゴン含
有バッファーにより刺激することができる。画像を典型
的には刺激後少なくとも３分間記録する。ソフトウェ
ア、例えば、Inovision（Research Triangle Park,N.
C.）をその画像を加工し、そして定量するために使用す
ることができる。
先に討議したように検出されたグルカゴン拮抗物質
を、例えば、Coy et al.（Peptides Structure and Fun
ction,Pierce Chemical Company,Rockford IL.,pp.369
−372,1983）により記載たイオン交換及び分配クロマト
グラフィーにより、逆相クロマトグラフィー（Andreu a
nd Merrifield.Eur.J.Biochem.164:585−590,1987）に
より又はHPLC（例えば、Kofod et al.,Int.J.Peptide P
rotein Res.32:436−440,1988）により、精製すること
ができる。追加の精製を慣用の化学的精製手段、とりわ
け、例えば、液体クロマトグラフィー、勾配遠心分離、
及びゲル電気泳動、により達成することができる。タン
パク質精製の方法は、本分野において公知であり（一般
的には、Scopes,R.,Protein Purification,Springer−V
erlag,NY,1982を参照のこと。）、そして本明細書中に
記載する組換えグルカゴン拮抗物質の精製に適用するこ
とができる。あるいは、グルカゴン拮抗物質を（The Pe
ptides,vol.2A,Gross and Meienhofer,eds.,Academic P
ress,NY,pp.1−284,1979中の）Barany及びMerrifieldの
固相法により、又は自動ペプチド合成装置の使用により
合成することができる。
少なくとも約50％の同質性を有する実質的に純粋な組
換えグルカゴン拮抗物質が好ましく、少なくとも約70％
−80％の同質性がより好ましく、そして特に医薬用途の
ためには少なくとも95％−99％以上の同質性が最も好ま
しい。一旦、又は希望の同質性まで、精製されると、グ
ルカゴン拮抗物質は、治療的に使用されることができ
る。一般的には、この拮抗物質は、非経口的に又は輸注
により投与されることができる。典型的には、この拮抗
物質は、遊離の温基又は酸塩として存在する。好適な塩
は、医薬として許容されなければならない。代表的な例
は、金属塩、アルカリ及びアルカリ土類金属塩、例え
ば、カリウム又はナトリウム塩を含む。他の医薬として
許容される塩は、クエン酸、琥珀酸、乳酸、塩化水素酸
及び臭化水素酸を含む。医薬組成物をpH5.6〜7.4間の水
性等張溶液中で配合することができる。好適な等張溶液
は、塩化ナトリウム、デキストロース、ホウ素酸ナトリ
ウム４酒石酸塩、及びポリエチレン・グリコール溶液を
含むことができる。拮抗物質の治療的投与量を、同一組
成物中又は別個の組成物中のいずれかにおいてインシュ
リンと同時に投与することができる。
グルカゴン・レセプタ・プローブの診断的使用 本発明の他の態様においては、プローブ及びプライマ
ーをグルカゴン・レセプタを検出するために提供する。
本発明の１つの態様においては、グルカゴン・レセプタ
DNA又はRNAにハイブリダイズすることができるプローブ
を提供する。本発明の目的のために、プローブは、それ
らが高又は低ストリンジェンシーの条件下でハイブリダ
イズする場合にグルカゴン・レセプタに”ハイブリダイ
ズすることができる”（Sambrook et al.,前記を参照の
こと。）。好ましくは、プローブを、好適なヌクレオチ
ド配列に、65℃において6x SCC、1x Denhardt's（Sambr
ook et al.,前記）、0.1％SDSの存在中、ハイブリダイ
ズするために使用し、そして65℃において2x SCC、1x D
enhardt's、0.1％SDSの存在中、過剰のプローブを少な
くとも１回洗浄する。プローブ配列は、好ましくは、グ
ルカゴン・レセプタ配列へのハイブリダイゼーションを
可能にするが、セクレチン、カルシトニン又は上皮小体
ホルモン・レセプタ配列にハイブリダイズしないように
設計される。
本発明のプローブは、デオキシリボ核酸（DNA）又は
リボ核酸（RNA）のいずれかから成ることができ、そし
て長さ約12ヌクレオチド程少なく、普通には長さ約14〜
18ヌクレオチドに、そして可能ならばグルカゴン・レセ
プタの完全配列と同様な大きさにあることができる。プ
ローブ・サイズの選択は、いくぶんそのプローブの用途
に依存する。例えば、個体内のグルカゴン・レセプタの
様々な多形態の形状の存在を測定するために、グルカゴ
ン・レセプタ・コーディング配列の完全長を実際に含ん
で成るプローブが好ましい。グルカゴン・レセプタ・プ
ローブを、グルカゴン・レセプタ遺伝子に結合された多
形態を同定するために使用することができる（例えば、
Weber,Genomics 7:524−530,1990;及びWeber and May,A
mer.J.Hum.Gen.44:388−396,1989を参照のこと。）。こ
のような多形態は遺伝的疾患、例えば、糖尿病と関連す
ることができる。
プローブを、本分野においてよく知られた技術を使用
して構築し、そして標識付けすることができる。例え
ば、12塩基のより短いプローブを合成により生成するこ
とができる。1.5kb未満の約75塩基のより長いプローブ
を、好ましくは、標識付けされた前駆体、例えば、32P
−dCTP、ジゴキシゲニン−dUTP、又はビオチン−dATPの
存在中PCR増幅により作り出す。1.5kbを上回るプローブ
は、一般的には、関連プローブを含むプラスミドにより
細胞をトランスフェクトし、そのトランスフェクトされ
た細胞を大量まで成長させ、そしてそのトランスフェク
トされた細胞からその関連配列を精製することにより容
易に増幅される（Sambrook et al.,前記参照）。
プローブを、例えば、放射マーカー、蛍光マーカー、
酵素マーカー、及び発色マーカーを含む様々なマーカー
により標識付けすることができる。32Pの使用が、特定
のプローブをマークし又は標識付けするために特に好ま
しい。
本発明のプローブを、サンプル中のグルカゴン・レセ
プタmRNA又はDNAの存在を検出するために使用すること
もできる。しかしながら、グルカゴン・レセプタが限定
された数だけで存在する場合、又は限定数だけにおいて
存在する選択突然変異体配列を検出することが望ましい
場合、又は選択された温血動物からのグルカゴン・レセ
プタをクローン化することが望ましい場合、それがより
容易に検出又は獲得されることができるような関連配列
を増幅することが有益であることができる。
例えば、RNA増幅（Lizardi et al.,Bio/Technology
6:1197−1202,1988;Kramer et al.,Nature 339:401−40
2,1989;Lomeli et al.,Clinical Chem.35（９）:1826−
1831,1989;米国特許第4,786,600号を参照のこと。）及
びポリメラーゼ連鎖反応（"PCR"）を使用するDNA増幅
（例えば、米国特許第4,683,195号、第4,683,202号及び
第4,800,159号参照）（また米国特許第4,876,187号及び
第5,011,769号であって切れやすい結合を含んで成る他
の検出／増幅系について記載したものを参照のこと。）
を含む様々な方法を、選択された配列を増幅するために
使用することができる。
特に好ましい態様においては、PCR増幅をグルカゴン
・レセプタDNAを検出又は獲得するために使用する。簡
単に言えば、以下により詳細に記載するように、DNAサ
ンプルを、一本鎖DNAを作り出すために95℃において変
性させる。以下に記載するような特異的プライマーを次
に、そのプライマー内のAT/GCの割合に依存して37℃〜7
0℃においてアニールする。このプライマーを、その鋳
型と反対のストランドを作り出すためにTaqポリメラー
ゼにより72℃において伸長させる。これらの段階は、１
サイクルから成り、これを、選択された配列を増幅する
ために繰り返すことができる。
選択配列の増幅のためのプライマーは、高く特異性で
あり、そしてその標的配列と安定した２本鎖を形成する
配列から選ばれなければならない。このプライマーは、
また特にその3'末端において非相補性であり、それ自体
又は他のプライマーとダイマーを形成してはならず、そ
してDNAの他の領域との二次構造又は２本鎖を形成して
はならない。一般的には、約18〜20ヌクレオチドのプラ
イマーが好ましく、そして本分野においてよく知られた
技術を使用して容易に合成されることができる。特に好
ましいプライマーを、以下に表１中に示し、そしてその
縮重オリゴヌクレオチドZC4715及びZC4701（それぞれ配
列番号９と８）並びにオリゴヌクレオチドZC4758及びZC
4778（それぞれ配列番号10と11）を含む。
グルカゴン・レセプタ・ヌクレオチド配列の追加の用途 本発明のさらに他の態様においては、グルカゴン・レ
セプタ（又は突然変異体グルカゴン・レセプタ）の過剰
発現されるか又はグルカゴン・レセプタが全く発現され
ない疾患を治療するために使用されることができるウイ
ルス・ベクターを提供する。簡単に言えば、本発明の１
つの態様においては、グルカゴン・レセプタの過剰発現
又は突然変異体グルカゴン・レセプタの発現を禁止する
ために、アンチセンス・グルカゴン・レセプタRNAの生
産に向けられるウイルス・ベクターを提供する。他の態
様においては、グルカゴン・レセプタcDNAの発現に向け
られるウイルス・ベクターを提供する。本発明における
使用に好適なウイルス・ベクターは、とりわけ、組換え
ワクシニア・ベクター（米国特許第4,603,112号及び第
4,769,330号）、組換え体水痘ウイルス・ベクター（PCT
出願番号WO89/01973）、及び好ましくは、組換え体レト
ロウイルス・ベクター（"Recombinant Retroviruses wi
th Amphotropic and Ecoptropic Host Ranges,"PCT公開
番号WO90/02806号;"Retroviral Packaging Cell Lines
and Processes of Using Same,"PCT公開番号WO89/07150
号；及び"Antisense RNA for Treatment of Retroviral
Disease States,"PCT公開番号WO/03451号）を含む。
先に述べたように、本発明のウイルス・ベクターは、
グルカゴン・レセプタが過剰発現され、突然変異体グル
カゴン・レセプタが発現され、又はグルカゴン・レセプ
タが全く発現されないかのいずれかの疾患状態の治療に
おいて使用されることができる。
以下の実施例を説明のにより、そして限定によらず提
供する。
実施例 実施例１ cDNAの合成及びcDNAライブラリーの調製 A. ラット肝cDNA合成 30グラムの雌Sprague−Dawleyラット（Simonsen Lab
s,Gilroy,CA）からの肝臓を取り出し、そして直ちに液
体窒素中に入れた。全RNAをグアニジン・イソチオシア
ネート（Chirgwin et al.,Biochemistry 18:52−94,197
9）及びCsCl遠心分離を使用してその肝組織から調製し
た。ポリ（Ａ）+RNAをオリゴｄ（Ｔ）セルロース・クロ
マトグラフィー（Aviv and Leder,Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 69:1408−1412,1972）を使用して単離した。
第一ストランドcDNAを２倍のポリｄ（Ｔ）−選択肝ポ
リ（Ａ）+RNAから合成した。10μｇの肝ポリ（Ａ）+RNA
を含む10マイクロタイターの溶液を20μｌの20pモル／
μｌ第一ストランド・プライマーZC3747（配列番号７）
及び４μｌのジエチルピロカーボネート−処理水と混合
した。混合液を４分間65℃において加熱し、そして氷上
での冷硬により冷却した。
第一ストンドcDNA合成を、８μｌの5X SUPERSCRIPTバ
ッファー（GIBCO BRL,Gaitthersburg,Md.）、４μｌの1
00mMジチオトレイトール及び2.0μｌのデオキシヌクレ
オチド３燐酸溶液であってそれぞれ10mMのdATP、dGTP、
dTTP及び５−メチル−dCTP（Pharmacia LKB Biotechnol
ogy Inc.,Piscataway,N.J.）を含むものを、そのRNA−
プライマー混合物に添加することにより、開始させた。
この反応混合物を３分間42℃においてインキュベートし
た。インキュベーションの後、6.0μｌの200U/μｌのSU
PERSCRIPT逆転写酵素（GIBCO BRL）を添加した。第一ス
トランド合成の効率を、その反応生成物を標識付けする
ために10μCiの32P−αdCTPをその反応溶液の10μｌア
リコットに添加することにより並列反応において分析し
た。第一ストランド合成反応混合物を45分間45℃におい
て、その後50℃において15分間インキュベートした。反
応を100μｌの最終容量までの水の添加により終了さ
せ、その後２回のフェノール／クロロホルム（1:1）抽
出及び１回のクロロホルム／イソアミルアルコール（2
4:1）抽出を行った。非取り込みヌクレオチドを、６μ
ｇのグリコーゲン担体、2.5M酢酸アンモニウム及び2.5
容量のエタノールの存在中cDNAを２回沈殿させることに
よりそれぞれの反応から取り出した。この非標識付けcD
NAを50μｌ水中に再懸濁させ、そして第二ストランド合
成のために使用した。第一ストランドcDNAの長さをその
標識付けcDNAを20μｌ水中に再懸濁させ、そしてアガロ
ース・ゲル電気泳動によりそのcDNAサイズを測定するこ
とにより評価した。
第二ストランド合成を、DNAヘアピン形式をもたらす
第二ストランド合成の第一ストランド・プライミングを
促進した条件下でその第一ストランド合成反応からのRN
A−DNAハイブリッド上で行った。反応混合物を20.0μｌ
の5XポリメラーゼＩバッファー（100mM Tris,pH7.4,500
mM KCl,25mM MgCl2,50mM（NH4）2SO4,4.0μｌの100mMジ
チオトレイトール,1.0μｌの溶液であってそれぞれの10
mMのデオキシヌクレオチド３燐酸を含むもの,3.0μｌの
β−NAD,15.0μｌの3U/μｌ大腸菌（E.coli）DNAリガー
ゼ（NBL Enzymes Ltd.,Cramlington,Northumbria,Engla
nd）,5.0μｌの10U/μｌ大腸菌（E.coli）DNAポリメラ
ーゼＩ（GIBCO BRL））及び50.0μｌの非標識第一スト
ランドDNAを含むように調製した。第二ストランド合成
の10μｌアリコットが10μCiの32P−αdCTPの添加によ
り標識付けされた平行反応を第二ストランド合成の効率
をモニターするために使用した。この反応混合物を室温
において４分間インキュベートし、その後、それぞれの
反応混合物に1.5μｌの2U/μl RNase H（GBCO BRL）を
添加した。この反応物を15℃において２時間、その後室
温において15分間インキュベートした。この反応をそれ
ぞれ、４μｌの500mM EDTAにより終了させ、その後、先
に記載したように、順番にフェノール／クロロホルム及
びクロロホルム／イソアミルアルコール抽出を行った。
それぞれの反応からのDNAをエタノール及び2.5酢酸アン
モニウムの存在中で沈殿させた。非標識反応物からのDN
Aを50μｌの水中に再懸濁させた。標識されたDNAを先に
記載したように再懸濁させ、そして電気泳動にかけた。
ヘアピン構造における一本鎖DNAを緑豆（mung bean）
ヌクレアーゼを使用して解裂させた。この反応混合物
は、10μｌの10X Mung Bean Nuclease Buffer（Stratag
ene Cloning Systems,La Jolla,Calif.）、４μｌの200
mMジチオトレイトール、34μｌの水、50μｌの第二スト
ランドcDNA及び２μｌの、Stratagene MB希釈バッファ
ー（Stratagene Cloning Systems）中のMung Beanヌク
レアーゼ（Promega Corp.,Madison.Wis.）1:10希釈物を
含んでいた。この反応を37℃において15分間インキュベ
ートし、そしてその反応を20μｌのTris−HCl,pH8.0の
添加により終了させ、その後先に記載したように、順番
にフェノール／クロロホルム及びクロロホルム／イソア
ミルアルコール抽出を行った。抽出の後、DNAをエタノ
ール中に沈殿させ、そして水中に再懸濁させた。
再懸濁したcDNAを192μｌの容量の水に再懸濁させ、5
0μｌの5X T4 DNAポリメラーゼ・バッファー（250mM Tr
is−HCl,pH8.0,250mM KCl,25mM MgCl2）、３μｌの100m
Mジチオトレイトール、10mMのそれぞれのデオキシヌク
レオチド３燐酸を含む３μｌの溶液、及び２μｌの6.7U
/μｌのT4 DNAポリメラーゼ（Pharmacia LKB Biotechno
logy Inc.）と混合した。15℃において30分間のインキ
ュベーションの後、反応を２μｌの500mM EDTAの添加に
より終了させ、その後先に記載したように順番にフェノ
ール／クロロホルム及びクロロホルム／イソアミルアル
コール抽出を行った。DNAをエタノール沈殿させ、そし
て30μｌの水に再懸濁させた。32P−dCTPの取り込みに
基づき、cDNAの収量を10μｇの出発mRNA鋳型から４μｇ
であると推定した。
B. ラット肝cDNAライブラリーの調製 Eco R Iアダプタ（Invitrogen,San Diego,Calif.）を
先に調製したcDNAに添加し、哺乳類発現ベクター中への
cDNAのクローニングを容易にした。このcDNAの10μｌア
リコット及び800pモルのアダプタ（12μｌ）を4.0μｌ
の10Xリガーゼ・バッファー（Stratagene Cloning Syst
ems）、4.0μｌの10mM ATP、6.0μｌの水、及び16ユニ
ットのT4 DNAリガーゼ（4.0μl;Stratagene Cloning Sy
stems）と混合した。この反応を16時間、４℃〜15℃の
温度グラジエントにおいてインキュベートした。この反
応を185μｌの水、25μｌのREACT 2バッファー（GIBCO
BRL）の添加により終了させ、その後65℃において30〜6
0分間の間においてインキュベートした。インキュベー
ション後、反応をフェノール／クロロホルム抽出し、そ
の後クロロホルム／イソアミルアルコール抽出し、そし
て先に記載したようにエタノール沈殿させた。遠心分離
後、DNAペレットを70％エタノールにより洗浄し、そし
て風乾した。ペレットを180μｌの水中に再懸濁させ
た。
哺乳類発現ベクターへのcDNAの指向性挿入を容易にす
るために、cDNAをXho Iにより消化し、5'Eco R I付着末
端及び3'Xho I付着末端をもつcDNAをもたらした。このc
DNAの3'末端におけるXho I制限部位をZC3747プライマー
（配列番号７）を通して導入した。制限消化を逐次的フ
ェノール／クロロホルム及びクロロホルム／イソアミル
アルコール抽出により終了させた。このcDNAをエタノー
ル沈殿させ、そして得られたペレットを1Xローディング
・バッファー（10mM燐酸塩バッファー,pH8.8,5％グリセ
ロール,0.125％ブロムフェノール・ブルー）中に再懸濁
させた。
再懸濁したcDNAを65℃まで10分間加熱し、氷上冷却
し、そしてサイズ・マーカーとしてBRL 1kbラダー（GIB
CO BRL）及びPharmacia100塩基対ラダー（Pharmacia LK
B Biotechnology Inc.）を使用して0.9％低融点アガロ
ース・ゲル（Seaplaque GTG Low Melt Agarose,FMC Cor
p.,Rockland,Me.）上で電気泳動にかけた。汚染アダプ
タ及びサイズ800塩基対未満の副生成物断片をそのゲル
から切除した。電極を反対にし、そしてcDNAをそのレー
ン元近くに濃縮されるまで電気泳動にかけた。濃縮DNA
を含むゲルの領域を切除し、マイクロフュージ管内に入
れ、そしてそのゲルスライスのだいたいの容量を測定し
た。そのゲル・スライスの容量の半分に等しいTEのアリ
コットをその管に添加し、そしてアガロースを15分間65
℃まで加熱することにより溶融させた。サンプルを42℃
に平衡化した後、約５ユニットのβ−Agarase I（New E
ngland Biolabs,Beverly,Mass）を添加した。サンプル
を90分間インキュベートし、アガロースを消化した。イ
ンキュベーション後、0.1x容量の3M酢酸ナトリウムをそ
のサンプルに添加し、そしてその混合物を氷上で15分間
インキュベートした。インキュベーション後、サンプル
を４℃において15分間14,000xgにおいて遠心分離し、未
消化アガロースを除去した。上清中のcDNAをエタノール
沈降させた。このcDNAペレットを70％エタノールにより
洗浄し、風乾し、そして10μｌの水中に再懸濁させた。
得られたcDNAを大腸菌（E.coli）ベクターpZCEP、そ
のM13複製起点及びそのSupF選択マーカーがpUC18由来の
ベータ・ラクタマーゼ・カセットにより置換されている
pCDNA1の誘導体（Invitorogen）中にクローン化した。
プラスミドpZCEPであってEco R I及びXho Iによる消化
により線状化されたものをEco R I−Xho I cDNAとライ
ゲートした。得られたプラスミドを大腸菌（E.coli）株
DH10B ELECTROMAX細胞（GIBCO BRL）内にエレクトロポ
レートした。
C. ヒト島細胞cDNAの合成 島細胞を、適合した受容体が入手できなかった臓器移
植ドナーから得られたヒト膵臓から単離した。冷UW溶液
（Du Pont,Boston,Mass）によるその場の灌流の後、そ
れぞれの膵臓を注意して切除し、膵臓管にカニューレ挿
入し、そして4mg/mlのコラゲナーゼ溶液（タイプV,Sigm
a,St.Louis,MO.）を一定速度で、最初は４℃、そして次
に39℃において注入した。腺を引き裂き、そして解放断
片を遠心分離により洗浄し、減少内径の針を通して粉砕
し、そして断続Ficoll密度遠心分離により精製した（Wa
rnock,Diabetes 35（Suppl.1）:136−139,1989）。上部
界面から収穫した材料をプールし、そしてジチアゾン染
色による島純度の測定の後に計数した。ライブラリー構
築において使用した島は65％純度を上回り、一方、ノー
ザン・ブロットにおいて使用した島は40％純度を上回っ
た。平均島直径は、175μｍであった。さらに、単離さ
れた島は、高グルコース又はイソブチルメチルキサンン
チン（IBMX）のいずれかによる灌流の後第一期及び第二
期の両方のインシュリン分泌機能を示した。
ポリ（Ａ）+RNAを、製造者の指示に従ってFASTTRACK
mRNA単離キット（Invitrogen）を使用して単離した。簡
単に言えば、30,000精製島を溶解バッファー中に速く溶
解させ、減少内径の針を使用して均質化し、そしてプロ
テイナーゼＫ及びRNasinの存在中消化し、次にポリ
（Ａ）+RNAをオリゴ−ｄ（Ｔ）セルロース・クロマトグ
ラフィーにより選択した。溶出画分の濃度及び純度を0D
260/280において測定した。
ヒト島からの約2.5μｇのポリ（Ａ）+RNAを、製造者
の指示に従ってLIBRARIAN II cDNAライブラリー構築シ
ステム（Invitrogen）及びDH10B ELECTROMAX大腸菌（E.
coli）細胞（GIBCO BRL）を使用してcDNAライブラリー
構築のために使用した。要約すれば、ヒト島から単離し
た約2.5μｇのポリ（Ａ）+RNAを二本鎖cDNAに変換し、
その後Bst X I非パリンドローム・リンカー（Invitroge
n）を添加した。このcDNAをサイズ分画し、そして未反
応リンカーをアガロース・ゲル電気泳動及び電気溶出に
より除去した。600塩基対よりも大きな相補的DNAストラ
ンドを選択した。
実施例２ ポリメラーゼ連鎖反応増幅によるラット・グルカゴン・
レセプタcDNAの単離 ラット肝cDNAを、セエクレチン遺伝子ファミリーのメ
ンバー内の高保存の領域に対応する縮重オリゴヌクレオ
チド（ZC4715及びZC4701;それぞれ配列番号８と９）を
使用したグルカゴン・レセプタ配列の増幅のための鋳型
として使用した。5ngの鋳型cDNA（実施例1A）;100pモル
のそれぞれのオリゴヌクレオチドZC4715（配列番号９）
及びZC4701（配列番号８）;0.25mMのそれぞれのデオキ
シヌクレオチド３燐酸（Cetus,Emeryville,CA）;1xのPr
omega 10xバッファー（Promega Corp.）；及び1.25ユニ
ットのTaqポリメラーゼ（Promega）を含む、50μｌの反
応物を設定した。PCR配列を40サイクル（95℃において
１分間、42℃において１分間、そして72℃において２分
間）走らせ、その後72℃において７分間インキュベート
した。
650塩基対のPCR生成物をゲル電気泳動により単離し、
そしてpCR1000（Stratagene Cloning Systems）により
ライゲートした。得られたプラスミド大腸菌（E.coli）
XL−１細胞を形質転換させるために使用した。プラスミ
ドDNAを、選択された形質転換細胞から調製し、、G13/p
CR1000と命名し、そして配列決定した（配列番号14）。
このクローンの配列分析は、その挿入物がセクレチン・
レセプタに関連するポリペプチドをエンコードしていた
ことを示した。
実施例３ 完全長ラット・グルカゴン・レセプタcDNAのクローニン
グ 完全長ラット・グルカゴン・レセプタcDNAをグルカゴ
ン結合検定において実施例1B中に記載したライブラリー
をスクリーニングすることにより獲得した。このレイブ
ラリーをプレートし、百万の独立クローンを得た。それ
ぞれのプレートからの形質転換体クローンを10mlのLB−
Amp（Sambrook et al,前記）中にスクレープした。細胞
を遠心分離により沈降させ、そして培地を廃棄した。細
胞ペレットを4mlのLB−Amp、15％グリセロール中に再懸
濁させ、そして４つの1mlアリコットを−80℃において
保存した。最初のグリセロール・ストックを滴定し、そ
してプレート当たり5000コロニーの100プールっをプレ
ートした。コロニーを成長させた後、それぞれのプレー
トを10mlのLB−amp中にスクレープした。それぞれのプ
ールからの細胞のアリコットをプラスミドDNAの調製に
おける使用のために取り出した。残りの細胞混合物を15
％グリセロールの最終濃度にもっていき、等分し、そし
て−80℃において凍結させた。プラスミドDNAを細胞の
それぞれのプールから調製し、そしてそのDNAを製造者
の指示に従ってRNAse（Boehringer Mannheim,Indianapo
lis,Ind.）により消化した。このRNAse反応をフェノー
ル／クロロホルム／イソアミルアルコール（24:24:1）
抽出により終了させ、そしてそのDNAをエタノール沈降
させた。
それぞれのプールからのプラスミドDNAをCOS−７細胞
（ATCC CRL 1651）にトランスフェクトし、そしてその
トランスフェクト体を125I−グルカゴン結合検定により
グルカゴン・レセプタの存在についてスクリーンした。
要約すれば、トランスフェクションの１日前に、約2x10
5のCOS−７細胞を、室温において30分間10μg/mlのヒト
・フィブロネクチン（表１）によりコートされた滅菌単
一チャンバー・スライド（Nunc AS,Roskilde,Denmark）
上にプレートし、燐酸塩バッファー生理食塩水（PBS,Si
gma Chemical Co.,St.Louis,Mo.）により洗浄した。２
μｇの、それぞれのプールからのプラスミドDNAを、McM
ahan et al.により本質的に記載された方法（EMBO J.1
0:2821−2832,1991;（これを、全体として引用により本
明細書中に取り込む。））を使用して個々のチャンバー
・スライド上で培養された細胞をトランスフェクトする
ために使用した。トランスフェクション後、細胞を５％
CO2中37℃において72時間培養した。
上記凍結乾燥粉末を上記バッファー溶液中に溶解させ
る。次に硫酸アンモニウムを25％の濃度まで添加し、そ
してその溶液を４℃において２時間沈降に供させる。フ
ィブロネクチンをBench Top遠心分離機（Beckman Instr
uments,Inc.,Irvine,Calif.）内で1,000rpmにおいて15
分間遠心分離することによりペレット化する。上清を廃
棄し、そしてそのペレットを10mlのNaPO4バッファ溶液
（上記）中に溶解させる。
16.9mlの最終容量におけるフィブロネクチンを１リッ
ターの（先に記載した）NaPO4バッファー溶液に対して
一夜透析する。透析された材料を1mM NaPO4,pH7.4によ
り３倍に希釈し、1mM NaPO4,pH7.4,100mM NaClの溶液を
作る。次にフィブロネクチンを蒸留水により２倍に希釈
する。糸のような不溶性沈殿物をガラス棒により取り出
す。
フィブロネクチンを、３容量の10mM Tris,pH8.1,50mM
NaClにより平衡化した50ml DEAE FF Sepharoseカラム
（Pharmacia LKB Biotechnology Inc.,Piscataway,N.
J.）を横切るFPLCに供する。ベースライン・サンプルが
生成されるまでそのカラムを10mM Tris,pH8.1,50mM NaC
lにより洗浄した後、フィブロネクチンを10mM Tris,pH
8.1,300mM NaClまでの塩グラジエントにより溶出させ
る。画分を集め、その画分のアリコットをアクリルアミ
ド・ゲル上で電気泳動にかけ、そしてそのゲルをCoomas
ie Blue染色及びウェスタン分析により分析する。ピー
ク画分をプールし、そして10mM CAPS（３−（シクロヘ
キシルアミン）−１プロパン−スルホン酸,Sigma）,pH1
1.0、10mM CaCl2、150mM NaClに対して透析する。この
溶液を−80℃において保存する。
125I−グルカゴン結合検定のためのトランスフェクト
体を調製するために、消費培地を細胞から吸引し、そし
て細胞を冷（４℃）PBSにより３回洗浄した。最終洗浄
の後、細胞を結合培地（表２）によりカバーし、そして
室温において10分間インキュベートした。培地を、0.5m
lの、0.5nM125I−グルカゴン（Amershamレセプター・グ
レード、比活性2000Ci/mモル;Amersham）を含む結合培
地により置換した。次に細胞を１時間30℃において揺す
った。培地を細胞から吸引し、グルカゴンを含まない冷
（４℃）結合培地を添加し、そして細胞を室温において
５分間インキュベートした。培地を細胞から吸引し、そ
して細胞を冷（４℃）PBSにより３回洗浄した。最終洗
浄後、細胞を20分間室温において1mlの、PBS中の2.5％
グルタルアルデヒドにより固定した。グルタルアルデヒ
ドを除去し、そして細胞をPBSにより３回濯いだ。スラ
イドを室温において１時間風乾し、製造者の指示に従っ
て液体写真エマルジョン（eastman Kodak Co.,Rocheste
r,N.Y.）中に浸し、そして少なくとも30分間暗所におい
て室温で乾燥させた。グルカゴンに結合することができ
る細胞を、明視野照明下2.5X倍率において検出した。１
つのプール、＃57は、グルカゴンに結合することができ
る細胞を含むと同定された。
1M重炭酸ナトリウム 8.4グラムの固体NaCO3 重炭酸ナトリウムを100mlの栓付き度盛り器内に注
ぎ、そして80mlの蒸留水を添加した。溶液を固体が溶解
するまで混合する。蒸留水を100mlまで添加する。溶液
を再び混合し、そして栓付きボトル内に４℃において保
存する。
培地 １ミリリッターの1M重炭酸ナトリウムを蒸留水の１リ
ッター当たりに添加する。４リッターを、前もって且つ
一夜冷却した上記溶液により調製するか又は冷却した蒸
留水により調製するかのいずれかとする。
69％シュクロース溶液 69グラムのシュクロース シュクロースを31mlの蒸留水に加熱しながら溶解す
る。この溶液の濃度を屈折計により測定する。固体シュ
クロースを適宜添加し、69＋／−0.5％までの濃度に調
整する。
42.3％シュクロース 42グラムのシュクロース シュクロースを57mlの蒸留水に加熱しながら溶解す
る。この溶液の濃度を屈折計により測定する。69％シュ
クロース溶液又は水を適宜添加し、42.3＋／−１％まで
の濃度に調整する。
2x結合バッファー 100mM HEPES,pH7.3 300mM NaCl 2mM EDTA ２％ウシ血清アルブミン 1.6mg/mlバシトラシン 画像形成バッファー 140mM NaCl 10mM HEPES 5.6mMグルコース 5mM KCl 1mM MgSO4 1mM CaCl2 Fura−2 AM溶液 50mg fura−2 AM（Molecular Probes） 50ml DMSO 5ml画像形成バッファー 50mgのfura−2 AMを50mlのDMSOに溶解させる。固体が
溶解した後、溶液を5mlの画像形成バッファーと混合す
る。
＃57プールからのプラスミドDNAのアリコットをオリ
ゴヌクレオチドZC4701及びZC4715（それぞれ配列番号８
と９）を使用するPCR増幅に供した。＃57プールからの2
00ng〜400ngの間のプラスミドDNA;100pモルのそれぞれ
のオリゴヌクレオチドZC4701及びZC4715（それぞれ配列
番号８と９）;50mM KCl;10mM Tris−HCl,pH9.0（20
℃）;1.5mM MgCl2;0.01％ゼラチン;0.1％Triton X−10
0;0.2mMのそれぞれのデオキシヌクレオチド３燐酸（Pha
rmacia LKB Biotechnology Inc）及び１ユニットのTaq
ポリメラーゼ（Promega）を含む50μｌの反応混合物を
調製した。PCR反応を30サイクル（95℃において２分
間、45℃において２分間、そして72℃において２分間）
走らせ、その後72℃において７分間インキュベートし
た。反応混合物を４℃において保存した。ゲル電気泳動
によるPCR生成物の分析は、700塩基対バンドの存在を示
し、これは、実施例２中に記載した生成物とほとんど同
じサイズであった。
プール＃57からのグリセロール・ストックを滴定し、
そして500コロニーの20プレートをプレートした。コロ
ニーをプールし、そしてグリセロール・ストック及びプ
ラスミドDNAを先に記載したように調製した。プラスミ
ドDNAをCOS−７細胞内にトランスフェクトし、そしてト
ランスフェクト体を先に記載したようなグルカゴン結合
検定を使用してスクリーンした。１つのプール、＃57−
18は、グルカゴンに結合することができる細胞を含むと
同定された。
プール＃57−18からのプラスミドDNAのアリコットを
先に記載したようなオリゴヌクレオチドZC4701及びZC47
15（それぞれ配列番号８と９）を使用するPCR増幅に供
した。ゲル電気泳動によるPCR生成物の分析は、700塩基
対バンドの存在を示し、グルカゴン・レセプタDNA配列
の存在を確認させた。
プール＃57−18からのグリセロール・ストックを滴定
し、そして500コロニーの６プレート及び20コロニーの4
7プレートをプレートした。コロニーをプールし、そし
てグリセロール・ストック及びプラスミドDNAを先に記
載したように調製した。プラスミドDNAのそれぞれのプ
ールからのアリコットをCOS−７細胞内にトランスフェ
クトし、そしてトランスフェクト体を先に記載したよう
なグルカゴン結合検定を使用してスクリーンした。さら
に、プラスミドDNAのそれぞれのプールからのアリコッ
トを、先に記載したようなオリゴヌクレオチドZC4701及
びZC4715（それぞれ配列番号８と９）を使用するPCR増
幅に供した。４つの陽性プール（＃57−18−16,＃57−1
8−18,＃57−18−36及び＃57−18−48）は、グルカゴン
に結合することができる細胞を含むと同定され、そして
確証的な700塩基対バンドを含むことがPCR増幅により示
された。
このcDNAを単離するために、２つの150mmプレートを
＃57−18プールの2,500コロニーによりそれぞれプレー
トした。フィルター・リフトをHanahan and Meselson
（Gene 10:63,1980）及びSambrook et al.（ibid.）
（これらを、全体として引用により本明細書中に取り込
む。）により本質的に記載された方法を使用して調製し
た。ハイブリダイゼーション・プローブを先に記載した
ようなオリゴヌクレオチド及び方法を使用する＃57プー
ルからのプラスミドDNAのPCR増幅により獲得した。PCR
生成物を低融点アガロース・ゲルからゲル精製し、そし
て製造者の指示に従ってMEGAPRIMEキット（Amersham,Ar
lington Heights,Ill.）を使用してランダム−プライム
した。フィルターを6x SCC,5x Denhardt's,5％SDS,200
μg/mlの音波処理サケ精子DNA及び2x105cpm/mlの32P−
標識付けPCR断片を含む溶液中でハイブリダイズした。
フィルターを65℃において一夜ハイブリダイズした。過
剰の標識を2x SCC,1％SDSにより65℃における３回洗浄
により除去した。フィルターを２つのスクリーンにより
−80℃において４時間フィルムに露出させた。プラスミ
ドpLJ4を含む陽性クローンを同定し、そしてスクリーン
した。プラスミドpLJ4は、1992年８月21日に寄託番号69
056号の下大腸菌（E.coli）形質転換体としてAmerican
Type Culture Coollection（12301 Parklawn Dr.,Rockv
ille,MD 20852）により寄託されている。制限エンドヌ
クレアーゼ分析及び配列分析は、pLJ4が、54,962ダルト
ンの予想分子量をもつ485アミノ酸タンパク質をエンコ
ードしている約2kbの挿入物を含むことを、示した。こ
の核酸配列及び演繹アミノ酸配列を配列番号14と15中に
示す。Kyte and Doolittleの方法（J.Mol.Biol.157:105
−132,1982;（これを、引用により本明細書中に取り込
む。）を使用した水療法（Hydropathy）分析は、アミノ
−末端シグナル配列に対応する疎水性アミノ酸の８つの
クラスター及び７つのトランスメンブラン・ドメインを
現した（図２）。さらに、この演繹アミノ酸配列の分析
は、伸長親水性配列内に位置する４つの潜在的Ｎ−結合
糖添加部位の存在及び同一領域内の６つのシステインの
存在を示した。
実施例４ ポリメラーゼ連鎖反応増幅によるヒト・グルカゴン・レ
セプタcDNAの単離 ヒト島細胞cDNA（実施例1C）を、縮重オリゴヌクレオ
チドZC4715及びZC4701（それぞれ配列番号８と９）を使
用したヒト・グルカゴン・レセプタ配列の増幅のための
鋳型として使用した。5ngの鋳型cDNA（実施例1C）;100p
モルのそれぞれのオリゴヌクレオチドZC4715（配列番号
９）及びZC4701（配列番号８）;0.25mMのそれぞれのデ
オキシヌクレオチド３燐酸（Cetus,Emeryville,Cali
f.）;1xのPromega 10xバッファー（Promega Corp.）；
及び1.25ユニットのTaqポリメラーゼ（Promega）を含
む、50μｌの反応物を設定した。PCR反応を40サイクル
（95℃において１分間、42℃において１分間、そして72
℃において２分間）走らせ、その後72℃において７分間
インキュベートした。
約750塩基対のPCR生成物をゲル電気泳動により単離し
た。単離したPCR生成物の中の1/10を、オリゴヌクレオ
チドZC4758及びZC4778（配列番号10と11）を使用した他
のPCR反応のための鋳型として使用した。これを、サブ
クローニングのためにそのPCR生成物の、3'末端におい
てBamH I制限部位を挿入し、そしてその5'末端において
Eco R I制限部位を挿入するように設計した。50μｌの
反応混合物を先に記載したように設定した。PCR反応を4
0サイクル（95℃において１分間、50℃において１分
間、そして72℃において1.5分間）走らせ、その後72℃
において７分間インキュベートした。
ヒト・グルカゴン・レセプタ配列のための形質転換体
をスクリーンするために、それぞれの形質転換体内に存
在する挿入DNAを、汎用pUC配列決定プライマーとして設
計されたオリゴヌクレオチドZC447及びZC976（それぞれ
配列番号１と２）を使用して増幅し、そしてそのPCR生
成挿入物に隣接するpUC配列にプライムした。形質転換
体の48を、20pモルのそれぞれのオリゴヌクレオチド;0.
125mMのそれぞれのデオキシヌクレオチド３燐酸（Cetu
s,Emeryville,Calif.）;1xのPromega 10xバッファー（P
romega）；及び1.25ユニットのTaqポリメラーゼ（Prome
ga）を含む、25μｌの反応混合物中にそれぞれ拾い上げ
た。PCR反応を30サイクル（95℃において１分間、45℃
において１分間、そして72℃において1.5分間）走ら
せ、その後72℃において７分間インキュベートした。
このPCR生成物を、その後、プローブとしてAmersham
MEGAPRIMEキット（Amersham）を使用したランダム・プ
ライミングにより標識付けされたpLJ4の1.9kbのEco R I
−Xho I断片を使用したサザン・ハリブリダイゼーショ
ン（Southern,J.Mol.Biol.98:503,1975;及びSambrook e
t al,ibid.;（これらを、全体として引用により本明細
書中に取り込む。））により分析した。１つのクロー
ン、G30は、完全長ラットcDNAプローブとハイブリダイ
ズすることが示された。G30のヌクレオチド配列を配列
番号16中に示す。
実施例５ 完全長ヒト・グルカゴンcDNAのクローニング ヒト・グルカゴン・レセプタをエンコードしている配
列を含むライブラリーを同定するために、先に討議した
ようなクローンG30からの配列を含むように設計された
オリゴヌクレオチド・プライマーZC5433及びZC5432（そ
れぞれ配列番号13と12）を使用したPCRにより一連のラ
イプラリーをスクリーンした。購入及び調製したヒト肝
臓、島細胞、HepG2細胞、脳及び胎盤からのヒト・ゲノ
ム及びcDNAライブラリーをスクリーンした（表３）。個
々の50μｌのPCR反応を表４中に列記した容量において
それぞれのライブラリーからのDNAを使用して設定し
た。20pモルのそれぞれのZC5433及びZC5432（それぞれ
配列番号13と12）、0.25mMのそれぞれのデオキシヌクレ
オチド３燐酸、５μｌの10x Taq Iバッファー（Promeg
a）、15mM MgCl2、19.5μｌの蒸留水及び0.5μｌの5U/
μl Taq Iポリメラーゼ（Promega）。さらに、反応物
を、陽性対照としてpLJ4を含み、そして陰性対照として
DNAを含まないように設定した。
PCR反応を30サイクル（94℃において１分間、50℃に
おいて１分間、そして72℃において1.5分間）走らせ、
その後72℃において10分間インキュベートした。このPC
R生成物をその後アガロース・ゲル電気泳動により分析
した。NIH肝臓ライブラリーだけがpLJ4陽性対照により
見られたものに等しいサイズの320−410塩基対のバンド
を作り出した。
Dr.Roger Bertolloti（National Institute of Healt
h,Bethesda,Md.）から得たプラスミドpcD2（Chen and O
kayama,Mol.Cell.Biol.7:2745−2752,1987）内へクロー
ン化されたヒト肝臓ライブラリーを、ヒト・グルカゴン
・レセプタをエンコードしている完全長cDNAクローンを
得るために使用した。このライブラリーを１百万の独立
クローンを得るためにプレートした。それぞれのプレー
トからの形質転換体コロニーを10mlのLB−Amp（Sambroo
k et al.,ibid.）中にスクレープした。細胞を遠心分離
により沈降させ、そして培地を廃棄した。細胞ペレット
を4mlのLB−Amp、15％グリセロール中に再懸濁させ、そ
して４つの1mlアリコットを−80℃において保存した。
最初のグリセロール・ストックを滴定し、そしてプレー
ト当たり5000コロニーの100プールをプレートした。コ
ロニーを成長させた後、それぞれのプレートを10mlのLB
−amp中にスクレープした。それぞれのプールからの細
胞のアリコットをプラスミドDNAの調製における使用の
ために取り出した。残りの細胞混合物を15％グリセロー
ルの最終濃度にもっていき、等分し、そして−80℃にお
いて凍結させた。プラスミドDNAを細胞のそれぞれのプ
ールから調製し、そしてそのDNAを製造者の指示に従っ
てRNAse（Boehringer Mannheim,Indianapolis,In.）に
より消化した。このRNAse反応をフェノール／クロロホ
ルム／イソアミルアルコール（24:24:1）抽出により終
了させ、そしてそのDNAをエタノールを沈降させた。
それぞれのプールからの再懸濁プラスミドDNAのアリ
コットを10の群（すなわち、１−10、11−20、21−30、
31−40、等）に組み合わせた。プラスミドDNAを1:20に
希釈し、そしてそれぞれのプールからの１μｌのDNAを
先に記載した反応混合物と同一のPCR反応混合物中で使
用した。この反応混合物を先に述べた条件下で増幅に供
した。アガロース・ゲル電気泳動によるPCR生成物の分
析は、上記プール31−40が陽性対照と同じサイズの320
−410塩基対のバンドを含でいたことを示した。
元のプール31〜40から調製されたプラスミドDNAを1:2
0に希釈し、そして１μｌのそれぞれのプールを先に記
載したものと同一の反応混合物中で使用した。先に記載
した条件を使用した反応混合物のPCR増幅を行った。ア
ガロース・ゲル電気泳動によるPCR生成物の分析は、上
記プール＃40が約310−420塩基対のバンド・サイズを与
えたことを示した。
プラスミドDNAの濃度は、1:10に希釈されたプール＃4
0の１μｌのアガロース・ゲル電気泳動により約70ng/μ
ｌであると凡そ定量された。70ngのプール＃40プラスミ
ドDNAを2.3kV,400Ω,25μＦにおいて大腸菌（E.coli）
株DH10B内にエレクトロポレートし、そして1ml SOC（Sa
mbrook et al.,ibid.）中に再懸濁した。細胞の３つの
希釈物を10-2、10-3及び10-4において調製した。100μ
ｌのそれぞれの希釈物を４つのプレートにプレートし
た。コロニー数を、10-2希釈物からの細胞を含む４つの
プレートについて１プレート当たり約10,000コロニーで
あると、そして10-3希釈物からの細胞を含む４つのプレ
ートについて１プレート当たり約1000コロニーであると
推定した。２連のフィルター・リフトを、４つの10-3プ
レートのそれぞれから、そして10-2プレートの中の１つ
から調製し、プール＃１〜プール＃５と命名した。それ
ぞれの２連セットからの１フィルターを固体培地上に横
たえ、そしてコロニーが形成されるまで成長させた。次
にコロニーをスクレープし、そしてPCR増幅のためのプ
ラスミドDNAを調製するために使用した。さらに、10-2
プレートの３つの残りのプレートをスクレープし、そし
てプラスミドDNAを細胞から調製した。
残りのフィルターを12時間攪拌しながら65℃における
3x SSC＋0.5％SDSにより前洗浄した。次にフィルターを
Ullrich's Buffer（Ulllrich,EMBO J.3:361−364,198
4）＋50％ホルムアルデヒド、１％SDS中で一夜37℃にお
いて前ハイブリダイズした。製造者の示唆する条件に従
ってAmersham MEGAPRIMEキット（Amersham）を使用して
標識されたクローンG30 DNAを煮沸し、そして6x105cpm/
mlの最終濃度までハイブリダイゼーション溶液（Ullric
h's Buffer＋50％ホルムアミド）に添加した。一夜のイ
ンキュベーションの後、プローブ溶液を除去し、そして
フィルターを2x SSC＋0.1％SDS中で65℃において５分間
洗浄した。最初の洗浄後、フィルターを同一溶液中で15
分間65℃においてその後室温において振とうしながら５
分間洗浄した。最後の洗浄プロトコールをさらに２回繰
り返した。フィルターを室温において一夜フィルタに露
出させた。プール＃２に対応するプレート＃２上の単一
コロニーはG30へのハイブリダイゼーションにより陽性
であった。このコロニーを拾い上げ、そして独立コロニ
ーを得るために塗抹した。幾つかの独立コロニーから調
製されたプラスミドDNAをDNA配列分析に供した。１つの
クローン40−２−２をさらなる配列分析に供し、そして
1992年８月21日に寄託番号69055の下大腸菌（E.coli）
形質転換体としてAmerican Type Culture Collection
（12301 Parklawn Dr.,Rockville,MD 20852）により寄
託した。クローン40−２−２の部分的DNA配列及びその
演繹アミノ酸配列を配列番号17と18として示す。
フィルター・ハイブリダイゼーションにおけるグルカ
ゴン・レセプタ配列の存在を確認するために、PCR増幅
配列をそれぞれのプラスミドDNA調製物（それぞれの２
連フィルターから調製されたプラスミドDNA及び３つの1
0-2プレートのそれぞれから調製されたプラスミドDNA）
について行った。プールされたプラスミドDNAをそれぞ
れ1:20に希釈し、そして１μｌのそれぞれのDNAを、先
に記載したようなPCR設定及びランにおける鋳型として
使用した。得られたPCR生成物のアガロース・ゲル電気
泳動は、プール＃２及び10,000の４つのプールの中の３
つが310〜420塩基対間のためのPCR生成バンドを含んで
いたことを示した。プレート＃２に対応するプール＃２
内のPCR生成バンドの存在は、グルカゴン・レセプタDNA
配列の存在を確かなものとした。
F. ヒト・グルカゴン・レセプタの5'配列のクローニン
グのための戦略 クローン40−２−２の部分的cDNA配列及び完全長ラッ
ト・グルカゴン・レセプタcDNA配列の分析は、その40−
２−２クローンが約25アミノ酸に対応するアミノ末端配
列を欠いていることを示した。この5'ヒト・グルカゴン
・レセプタcDNA配列をFrohman et al.により記載された
方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:8988−9002,1988）
の適用を使用して得た。簡単に言えば、オリゴヌクレオ
チド・プライマーを、その配列が40−２−２コーディン
グ配列の5'末端近くの配列にハイブリダイズするように
設計した。プライマーをＧ−尾ヒト肝臓第一ストランド
cDNA鋳型にハイブリダイズさせ、そしてそのプライマー
をTaq I DNAポリメラーゼを使用してその5'末端の方向
に伸長させた。第二ポリｄ（Ｃ）プライマーをそのＧ−
尾cDNA鋳型にアニールし、ポリメラーゼ連鎖配列増幅、
その後のクローニング、配列決定及びクローン40−２−
２内に存在するコーディング配列へのスプライシングに
供した。
３つのcDNA鋳型を調製した。第一鋳型は商業的に入手
可能なヒト肝臓第一ストランドcDNAであった。第二及び
第三のcDNA鋳型を、ヒト・グルカゴン・レセプタに特異
的な配列を含むオリゴヌクレオチド又は伝統的なオリゴ
ｄ（Ｔ）プライミングのいずれかを使用して、商業的に
入手可能なヒト肝臓mRNA（Clontech）から第一ストラン
ドcDNAを合成することにより、それぞれ調製した。
第二cDNA鋳型を、ヒト・グルカゴン・レセプタ・コー
ディング配列に特異的であるオリゴヌクレオチドZC5433
（配列番号13）を使用してヒト肝臓mRNAから合成するこ
とにより調製した。２μｌの１μg/μｌのヒト肝臓mRN
A、８μg/mlの20pモル／μｌのZC5433（配列番号13）及
び0.5μｌの10mM Tris,pH7.4、0.1mM EDTAを含む反応混
合物を７分間68℃においてその後氷上で２分間インキュ
ベートした。インキュベーション後、その反応混合物
は、４μｌの5X SUPERSCRIPTバッファー（GIBCO−BR
L）、１μｌの200mMジチオトレイトール、10mMのそれぞ
れのdNTPを含む１μｌの溶液、１μｌの0.25μCi/μｌ
のα32P−dCTP及び５μｌのSUPERSCRIPT逆転写酵素を受
容した。インキュベーション後、反応物を45℃において
１時間インキュベートした。反応を80μｌのTEの添加に
より終了させた。RNAを１μｌの0.5M EDTA及び１μｌの
KOHの添加により加水分解した。この加水分解反応物を6
5℃において５分間インキュベートした。インキュベー
ション後、サンプルを50mM KOH,0.1mM EDTAにより1mlに
希釈し、そしてそのサンプルをCENTRICON 100濃縮装置
（Amicon,Danvers,Mass.）上を通過させた。このカラム
を1mlの50mM KOH,0.1mM EDTAにより洗浄した。濃縮され
たcDNAを集め、そして100mM HClの半分の容量により中
和した。中和したcDNAサンプルをエタノール沈降させ、
そしてその沈殿物を26μｌの蒸留水により再懸濁させ
た。
第三cDNA鋳型を購入したオリゴｄ（Ｔ）プライマーを
使用してヒト肝臓mRNAを合成することにより調製した。
反応混合物を２μｌの１μg/μｌのヒト肝臓mRNA、１μ
ｌの１μg/μｌオリゴｄ（Ｔ）18（New England Biolab
s,Beverly,Mass.）及び５μｌの10mM Tris,pH7.4,0.1mM
EDTAを含むように調製した。このcDNA合成を先に記載
した合成のために述べた条件を使用して行った。
次に第一ストランドcDNAをＧ−尾付加した。反応管を
４μｌのヒト肝臓第一ストランドcDNA（QUICK CLONE;Cl
ontech,Palo Alto,Calif.）、ZC5433（配列番号13）か
らの４μｌのヒト肝臓第一ストランドcDNA又はオリゴｄ
（Ｔ）プライマーからの４μｌのヒト肝臓第一ストラン
ドcDNAを含むように設定した。それぞれの反応混合物
は、22μｌの水、８μｌの5Xバッファー（Promega）、
４μｌの10mM dGTP及び２μｌの15U/μｌのターミナル
・トランスフェラーゼを受容し、そしてその反応物を37
℃において30分間インキュベートし、その後65℃におい
て10分間インキュベートした。次にこの反応物を10mM T
ris,pH7.4,1mM EDTAにより90μｌまで希釈し、そしてエ
タノール沈降させた。
すべてのＧ−尾cDNAの第二ストランド合成を同一に行
った。それぞれのcDNAを50μｌの蒸留水中に最初に懸濁
した。次にそれぞれのcDNAは、５μｌ中の100pモルのZC
4814（配列番号20）を受容した。このcDNAを、それぞれ
の混合物を５分間68℃まで加熱し、その後氷上で２分間
インキュベートすることによりアニールした。プライマ
ーをcDNAにアニールした後、それぞれの混合物は、20μ
ｌの5x Polymerase Iバッファアー（実施例１）、１μ
ｌの100mMジチオトレイトール、10mMのそれぞれのdNTP
を含む２μｌの溶液、２μｌの0.5μCi/μｌα32P−dCT
P、１μｌの3U/μｌ大腸菌（E.coli）DNAリガーゼ（New
England Biolabs）、５μｌの7U/μｌ大腸菌（E.col
i）DNAポリメラーゼＩ（Amersham）を受容した。この反
応物を22℃において５分間インキュベートし、その後1.
5μｌの2U/μｌのRNase H（GIBCO−BRL）を添加し、そ
の後インキュベーションを16℃において２時間再開し
た。反応を200μｌの10mM Tris（pH8.0）、1mM EDTAそ
の後150μｌの水飽和フェノール及び150μｌのクロロホ
ルムの添加により終了させた。混合物を回転させ、そし
て次に22℃において３分間遠心分離し、相分離させた。
水相を取り出し、そして先に記載したようにフェノール
及びクロロホルムにより再抽出した。２番目のフェノー
ル−クロロホルム抽出の後、水相をクロロホルムにより
抽出した。水相中のcDNAを５μｇのムラサキガイ（muss
el）グリコーゲン、100μｌの8M酢酸アンモニウム及び3
00μｌのイソプロパノールの添加により沈降させ、上清
中に非取り込みオリゴヌクレオチドを残しながらより大
きな核酸を選択的に沈降させた。このcDNAを遠心分離に
よりペレット化し、そしてこのペレットを70％エタノー
ルにより洗浄し、その後風乾した。このcDNAペレットを
15μｌの２回蒸留水中に再懸濁させた。
二本鎖cDNAを５並列反応において、ZC4814（配列番号
20）の5'末端に相同的であり且つサブクローニングを容
易にする制限エンドヌクレーゼ部位を含むオリゴヌクレ
オチド・プライマー、並びに40−２−２クローン内に存
在するコーディング配列のまさに5'末端に特異的なオリ
ゴヌクレオチド・プライマーを使用して増幅した。それ
ぞれの反応混合物は、５μｌの10X Taq Iバッファー、
３μｌの25mM MgCl2、2.5mMのそれぞれのdNTPを含む５
μｌの溶液、１μｌの二本鎖cDNA、及び0.5μｌのTaq I
ポリメラーゼ（Promega）を含んでいた。この反応物
を、10pモル／μｌのZC5624（配列番号21）及び20pモル
／μｌのZC4812（配列番号19）のそれぞれの１μｌの添
加前に98℃において５分間変性させた。それぞれのサン
プルを、90℃において保持した鉱物油の70μｌにより重
層した。この反応物を30サイクル（95℃60秒間、57℃40
秒間、72℃60秒間）にわたり増幅し、その後72℃におい
て７分間伸長させた。
それぞれのPCR生成物をアガロース・ゲル電気泳動に
供し、そして増幅された断片をそれぞれ切除し、そして
TAクローニング・キット（Invitrogen）を使用してpCR1
000内にサブクローン化した。それぞれのライゲーショ
ンからの３つのクローンを、その中のそれぞれが鋳型DN
Aの源としてクローンからの接種物を含む独立PCR反応混
合物中でオリゴヌクレオチド・プライマーZC5624（配列
番号21）及びZC4812（配列番号19）を使用することによ
り挿入物の存在について選択及び分析した。このPCR反
応を先に記載したように行った。但し、30サイクロの増
幅だけを行った。それぞれの元のPCR反応からの単一挿
入物−陽性クローンをDNA配列分析に供した。誤りのな
い5'ヒト・グルカゴン・レセプタ・コーディング配列を
含むことが示された２つのクローンの中で、１つのクロ
ーンを5'ヒト・グルカゴン・レセプタ・コーディング配
列を提供するために選択した。クローン9AをEco R I及
びKpn Iにより消化し、グルカゴン・レセプタの5'コー
ディング配列を含む551塩基対断片を得た。3'グルカゴ
ン・レセプタ・コーディング配列を40−２−２からの56
1塩基対のKpn I−Bam H I断片として得た。このEco R I
及びKpn I断片とこの561塩基対のKpn I−Bam H I断片と
を、コンカテマー化を防ぐためにEco R I及びBam H Iの
存在中でライゲートした。ライゲーションの生成物、11
12塩基対断片をゲル精製し、そして9A1と命名した。便
利には、断片9A1を、Eco R I及びBam H I消化pUC18内に
ライゲートした。このライゲーション混合物を大腸菌
（E.coli）株DH10b細胞に形質転換し、そして選択され
たクローンを挿入物の存在について分析した。１つのク
ローン9A11は、その挿入物を含んでいた。
グルカゴン・レセプタ・コーディング配列を、プラス
ミドp9A11及びクローン40−２−２を使用する哺乳類発
現ベクター内で構築し、完全なグルカゴン・レセプタ・
コディング配列を得た。プラスミドp9A11をPvu II及びB
am H Iにより消化し、967塩基対断片を単離した。クロ
ーン40−２−２をBam H I及びSac Iにより消化し、3'ヒ
ト・グルカゴン・レセプタ・コーディング配列を含む82
8塩基対断片を単離した。哺乳類発現ベクターpHZ1をEco
R Iによる消化により線状化し、そしてその末端を次に
T4 DNAポリメラーゼを使用してブラント末端にした。こ
のブラント末端線状ベクターを次にSac Iにより消化し
た。967塩基対のPvu II−Bam H I断片及び828塩基対のB
am H I−Sac I断片を、ブラント−Sac I消化pHZ1ベクタ
ーによりライゲートした。
プラスミドpHZ1は、インビトロにおいて転写されたmR
NAsから哺乳類細胞内で又はカエル卵母細胞翻訳系内で
タンパク質を発現させるために使用されることができる
発現ベクターである。このpHZ1発現系は、マウスのメタ
ロチオネイン−１プロモーター、バクテリオファージT7
プロモーターであってコーディング配列の挿入のための
ユニーク制限部位を含む多クローニング・バンクに隣接
するもの、ヒト成長ホルモン・ターミネーター及びバク
テリオファージT7ターミネーターを含んで成る。さら
に、pHZ1は、大腸菌（E.coli）の複製起点；バクテリア
のベータ・ラクタマーゼ遺伝子;SV40のプロモーター及
び起点、ネオマイシン耐性遺伝子並びにSV40転写ターミ
ネーターを含んで成る哺乳類選択マーカー発現ユニッ
ト、を含む。
そのプロモーターに対して正しい方向においてグルカ
ゴン・レセプタcDNA配列を含むpHZ1プラスミドをpLJ6'
と命名した。挿入物とベクターとの接合物を正しい配列
の存在を確認するために配列決定した。プラスミドpLJ
6'を1993年１月15日の寄託番号69183の下American Type
Culture Collection（12301 ParkLawn Drive,Rockvill
e,MD 20852）により寄託した。pLJ6'内に存在するグル
カゴン・レセプタcDNAのDNA配列及び演繹アミノ酸配列
を配列番号24と配列番号25中に示す。
実施例６ ヒト島細胞からのグルカゴン・レセプタcDNAのクローニ
ング ヒト肝臓細胞からのグルカゴン・レセプタのクローニ
ングに加え、グルカゴン・レセプタcDNAをヒト島細胞ラ
イブラリーから得た。ヒト島細胞cDNAライブラリー（実
施例1C）のアリコットを、ヒト・グルカゴン・レセプタ
cDNAの5'未翻訳配列からの配列に隣接するEco R I部位
を含むセンス・オリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレ
オチドZC5763（配列番号22）並びにヒト・グルカゴン・
レセプタcDNAの3'未翻訳配列からの配列に隣接するXho
I部位を含むアンチセンス・オリゴヌクレオチドである
オリゴヌクレオチドZC5849（配列番号23）を使用したPC
R増幅に供した。このオリゴヌクレオチド・プライマー
内に制限部位を含むことは、好適なプラスミド・ベクタ
ー内への得られたPCR生成物の指向性クローニングを容
易にする。PCR反応混合物を、４μｌの島細胞cDNAライ
ブラリー（実施例1C）、８μｌの10X Promega PCR Buff
er（Promega）、20pモルのZC5763（配列番号22）、20p
モルのZC5849（配列番号23）、20mMのそれぞれのデオキ
シリボヌクレオチドを含む１μｌの溶液、及び46.5μｌ
の水を含むように設定した。混合物を３分間95℃まで加
熱し、次に熱を３分間80℃まで減少させた。この混合物
を使用準備まで80℃において保った。反応を開始させる
ために、２μｌの10X Promega PCR Buffer（Promeg
a）、２μｌの5U/μl Taq Iポリメラーゼ（Cetus）及び
16μｌの水を含んで成る20μｌの酵素混合物を上記反応
混合物に添加した。この反応物を50μｌの鉱物油（Sigm
a）により重層し、そしてその反応を30サイクル（95℃
１分間、55℃１分間、72℃２分と15秒間、ここで72℃イ
ンキュベーションをサイクル毎に３秒間増加させた。）
に供し、その後72℃における10分間のインキュベーショ
ンを行った。最後の72℃のインキュベーションの後、こ
の反応物を４℃に保った。このPCR生成物の10μｌアリ
コットのアガロース・ゲル電気泳動は、約1.8〜1.9kb断
片の存在を証明した。pLJ6'内に存在するヒト・グルカ
ゴン・レセプタcDNAに基づき、約1846塩基対の断片を予
測した。
PCR反応物をクロロホルムにより抽出し、その後フェ
ノール：クロロホルム抽出及び最後のクロロホルム抽出
を行った。最後の抽出の後、５μｌの４μg/μｌのグリ
コーゲン担体（Boerhinger Mannheim Corporation）を
添加し、そしてその混合物を酢酸アンモニウム及びエタ
ノールの存在中で沈降させた。DNAを遠心分離によりペ
レット化し、そしてそのペレットを70％エタノールによ
り洗浄した。このDNAペレットを水中で再構築し、そし
てXho I及びEco R Iにより消化した。DNAをゲル精製
し、そしてXho I及びEco R Iにより線状化されたプラス
ミドpBLUESCRIPT SK+（Stratagene Cloning Systems）
内にサブクローン化した。ライゲーション混合物を大腸
菌（E.coli）株DH10B細胞（GIBCO−BRL）内に形質転換
した。プラスミドDNAを選択された形質転換体から調製
し、そしてそのDNAを制限酵素及びサザン・ブロット分
析に供した。これらのクローンをpLJ6'内に存在するヒ
ト・グルカゴン・レセプタcDNA挿入物と比較した。診断
的制限酵素消化に基づき、選択されたクローンを配列分
析に供した。配列分析は、１つのクローン、pSLIGR−１
がグルカゴン・レセプタ・コーディング配列を含んでい
たことを示した。pSLIGR−１のコーディング領域は、pL
J6'内に存在する肝臓cDNAと比べたときグルカゴン・レ
セプタ・コーディング領域内に３ヌクレオチドの変更を
含んでいた。これらのヌクレオチド変更の中の１つは、
無表現突然変異であり、残りの２つは、表５中に示すよ
うな保存的アミノ酸の変更をもたらした。これらの変更
の分析は、それらが対立遺伝子変動を提示する多形態的
差異の結果であることができるであろうということを示
唆している。
実施例７ ヒト・グルカゴン・レセプタ遺伝子のクローニング ヒト・グルカゴン・レセプタ・ゲノム・クローンを得
るために、ゲノムDNAの２つのライブラリーを、プロー
ブとしてヒト・グルカゴン・レセプタcDNAを使用してス
クリーンした。増幅されたヒトλFIX II白色人種男性胎
盤ゲノム・ライブラリー及び増幅されたヒト肺λFIXゲ
ノム・ライブラリー（両方のライブラリーをStratagene
Cloning Systemsから得た。それぞれCatalog番号94620
3及び944201。）をヒト・グルカゴン・レセプタ遺伝子
についてスクリーンした。
増幅されたヒト肺ゲノム・ライブラリーを滴定し、そ
して約4x104プラーク形成ユニット（pfu）を150mm直径
プレートのそれぞれの上の大腸菌（E.coli）株LE392細
胞（Stratagene Cloning Systems）と共にプレートし
た。追加の10プレートを大腸菌（E.coli）株LE392細胞
と共に、そしてプレート当たり約6x104pfuによりプレー
トした。これらのプレートを37℃において一夜インキュ
ベートに供し、そして30プレートをスクリーニングのた
めに選択した。
２連フィルターを30プレートのそれぞれのために調製
した。それぞれのフィルターを製造者により推奨された
手順に従ってHYBONDナイロン膜8Amersham）によりプレ
ートを重層することにより調製した。フィルターをプレ
ートから持ち上げ、そして細胞を室温において５分間1.
5M NaCl,0.5M NaOH中で溶解させた。フィルターを1M Tr
is−HCl（pH7.5）,1.5M NaCl中で５分間中和し、そして
そのフィルターをSTRATALINKER（Stratagene Cloning S
ystems）内の1200μジュールのUVエネルギーにより固定
した。前洗浄後、フィルターを、0.45μｍフィルターを
通して濾過され、そして使用直前に最終濃度100μg/ml
の熱変性サケ精子DNAを添加された前ハイブリダイゼー
ション溶液（5x SSC,5x Denhardt's溶液,0.2％SDS,1mM
EDTA）中で前ハイブリダイズされた10フィルターの中の
６バッチに分けた。これらのフィルターを65℃において
一夜前ハイブリダイズした。
p40−２−２からのヒト・グルカゴン・レセプタcDNA
を製造者により推奨された方法を使用してAmersham MEG
APRIMEキット（Amersham）を使用してランダム−プライ
ムした。フィルターのそれぞれのバッチからの前ハイブ
リダイゼーション溶液を28.5x106cpmのプローブを含む
新たな前ハイブリダイゼーション溶液により置換した。
これらのフィルターを24時間65℃においてハイブリダイ
ズさせた。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼ
ーション溶液を除去し、そしてこれらのフィルターを室
温において0.25x SSC,0.2％SDS,1mM EDTAを含む洗浄溶
液中でしれぞれ４又は５回濯いだ。濯ぎ後、これらのフ
ィルターを洗浄溶液中65℃における８連続洗浄において
洗浄し、この後70℃において最終洗浄を行った。この70
℃洗浄後、これらのフィルターを増感スクリーンを伴っ
て−70℃において４日間オートラジオグラフ・フィルム
（XAR−5;Eastman Kodak Co.;Rochester,NY）に露出さ
せた。
オートラジオグラフの検査は、放射標識付けされたプ
ローブとのハイブリダイゼーションの４つの領域の現在
を現した。この４つの領域のそれぞれからの寒天のプラ
グを精製のために拾い上げた。それぞれの寒天プラグを
1mlのSM（Maniatis et al.,eds.,Molecular Cloning:A
Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,NY,1982;（こ
れを、引用により本明細書中に取り込む。））,1％クロ
ロホルム中に一夜浸漬した。一夜のインキュベーション
後、それぞれのプラグからのファージを1:1,000SMに希
釈した。５、25及び50μｌのアリコットを大腸菌（E.co
li）株LE392細胞と共にプレートした。これらのプレー
トをインキュベートし、そして単一リフトを５及び25μ
ｌプレーティングからのプレートから調製した。これら
のフィルターを先に記載したように調製し、前ハイブリ
ダイズし、そして洗浄した。これらのフィルターをオー
トラジオグラフ・フィルムに露出させた。
オートラジオグラフの検査は、上記４つのクローンの
それぞれからの陽性に標識付けされた領域を現した。全
部で10寒天プラグを、その元のクローンのそれぞれにつ
いて少なくとも２つの陽性領域を提示する陽性領域から
拾い上げた。それぞれの寒天プラグを先に記載したよう
に処理した。それぞれのプラグからのファージをSM中1:
10,000に希釈した。2.5及び10μｌのアリコットを大腸
菌（E.coli）株LE392細胞と共にプレートした。これら
のプレートをインキュベートし、そして単一リフトを好
適に分離したプラークをもつプレートからのプレートか
ら調製した。これらのフィルターのオートラジオグラフ
は、別個のプラークに対応する露出の領域を現した。上
記４つの元の陽性のそれぞれからの少なくとも１のクロ
ーンを提示する12の陽性プラークを拾い上げた。それぞ
れのプレートからの１つのプラークをさらなる分析のた
めに選択した。
ファージ・クローン２−２−１、３−１−１、14−２
−１及び11−２−１からの寒天プラグを先に記載したよ
うに処理した。ファージをSM中1:1000に希釈し、大腸菌
（E.coli）株LE392細胞のカルチャー内に接種した。二
本鎖DNAをGrossberger（Nuc.Acids Res.15:6737,1987;
（これを、全体として引用により本明細書中に取り込
む。））により本質的に記載されたように調製した。こ
の二本鎖DNAをXba Iにより消化し、そのゲノム挿入物を
解放させた。アガロース・ゲル電気泳動は、クローン２
−２−１及び11−２−１が9kbのXba I挿入物を含み、ク
ローン14−２−１が15kbの挿入物を含み、そして３−３
−１が13kbの挿入物を含んでいたことを、証明した。Xb
a I消化及びXba I−Bam H I消化クローンのサザン・ブ
ロット分析は、ヒト・グルカゴン・レセプタcDNAが表６
中に示す断片にハイブリダイズしたことを示した。
クローン11−２−１及び14−２−１をさらなる分析の
ために選択した。クローン２−２−１はクロン11−２−
１と同一であるようであり、そしてさらなる分析に供さ
なかった。便利には、クローン名称を表６中に反映する
ように変更した。二本鎖DNAをManiatisにより本質的に
記載された方法を使用してプラスミド・ベクター内にサ
ブクローニングするためにそれぞれのファージ・クロー
ンから調製した。このDNAをXba Iにより消化し、ゲル精
製し、そしてXba Iによる消化により線状化され且つ再
環化を防ぐためにウシ・アルカリ性ホスファターゼによ
り処理されたプラスミドpBLUESCRIPT SK+（Stratagene
Cloning Systems）内にサブクローン化した。このライ
ゲーション混合物をBioRad GENEPULSER（Bio−Rad Labo
ratories;Richmond,CA）内のELECTROMAX DH10B細胞（GI
BCO−BRL）内に400オーム、25μファラッド及び2.3kボ
ルトにおいてエレクトロポレートした。プラスミドDNA
を選択された形質転換体から調製した。クローン６及び
２からあのゲノム挿入物を含むクローンをそれぞれpSLH
GR6及びpSLHGR2と名付けた。クローンpSLHGR6及びpSLHG
R2を配列決定した。配列分析及びヒト・グルカゴン・レ
セプタcDNAのコーディング領域との比較は、このコーデ
ィング領域を含む12エクソンの存在を現した。染色体位
置分析をDurnam et al.（Mol.Cell.Biol.8:1863−1867,
1988（これを全体として、引用により本明細書中に取り
込む。））により本質的に記載されているように、ビオ
チン化ヒト・グルカゴン・レセプタ遺伝子プローブ及び
染色体17−特異的セントロメア・プローブを使用して調
製した中期染色体スプレッド上で行った。染色体の変
性、ハイブリダイゼーション及び単一色検出をPinkel e
t al.（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:2934−2938,1986
（これを全体として、引用により本明細書中に取り込
む。））により本質的に記載されているように、行い、
そしてKievits et al.（Cytogenet.Cell Genet.53:134
−136,1990,（これを全体として、引用により本明細書
中に取り込む。））により修飾した。但し、ハイブリダ
イゼーションを、65％（vol/vol）ホルムアミド/10％硫
酸デキストラン/2x SCC中で行い、そしてハイブリダイ
ゼーション後洗浄はPalmiter et al.（Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 89:6333−6337,1992（これを全体として、引用
により本明細書中に取り込む。））により記載されてい
るように42℃における65％ホルムアミド/2x SSC及びそ
の後の55℃における0.1x SSCによった。q25位置をTesta
et al.（Cytogenet.Cell Genet.60:247−249,1992,
（これを全体として、引用により本明細書中に取り込
む。））により記載されているように幾つかのハイブリ
ダイズした中期スプレッドをDAPI染色することにより確
認した。このDAPI染色はＱ−バンド様パターンを作り出
した。
増幅されたヒト胎盤ゲノム・ライブラリー（Stratage
ne）を本質的に先に記載した方法を使用してグルカゴン
・レセプタ遺伝子について失敗してスクリーンした。簡
単に言えば、ライブラリーを滴定し、そして大腸菌（E.
coli）株LE392細胞及び約5x104pfuを30の150mmプレート
のそれぞれの上にプレートした。さらに、11の150mmプ
レートを約105pfu及び大腸菌（E.coli）株LE392細胞と
共にそれぞれプレートした。これらのプレートを37℃に
おいて一夜インキュベートし、そして38のプレートをス
クリーニングについて選択した。
ナイロン・フィルター・リフトを調製し、洗浄し、そ
して先に記載したように前ハイブリダイズした。ヒト島
グルカゴン・レセプタcDNA断片、G30（実施例４）を製
造者により推奨された方法を使用してAmersham MEGAPRI
MEキット（Amersham）を使用してランダム−プライムし
た。フィルターのそれぞれのバッチからの前ハイブリダ
イゼーション溶液を1.1x106cpmのプローブを含む新たな
前ハイブリダイゼーション溶液により置換した。フィル
ターを65℃において一夜ハイブリダイズした。ハイブリ
ダイゼーション後、ハイブリダイゼーション溶液を除去
し、そしてフィルターを0.25x SSC,0.25％SDSを含む洗
浄溶液中で65℃における８連続洗浄において洗浄した。
70℃洗浄後、フィルターを増感スクリーンを伴って−70
℃において４時間オートラジオグラフ・フィルム（XAR
−5;Eastman Kodak co.）に露出させた。
このオートラジオグラフの検査は、納得のゆく陽性シ
グナルを全く現さなかった；しかしなが、弱く標識付け
された領域に対応する７つの領域をさらなる分析のため
に拾い上げた。クローンを先に記載したような第二のス
クリーンに供したが、この第二のスクリーンのオートラ
ジオグラフは、標識付けされた領域を全く示さなかっ
た。これらのクローンを追跡しなかった。
実施例８ 哺乳類細胞内でのグルカゴン・レセプタcDNAの発現 A. BHK570細胞内でのラット・グルカゴン・レセプタの
発現 プラスミドpLJ4をプラスミドpLJ1により（寄託番号10
314下American Type Culture Collectionに寄託されて
いる）BHK570細胞中にGraham and Van der Eb（Virolog
y 52:456,1973（これを全体として、引用により本明細
書中に取り込む。））により本質的に記載されているよ
うな燐酸カルシウム法を使用して同時トランスフェクト
した。プラスミドpLJ1をプラスミドp416から誘導した。
これは、アデノウイルス5 ori、SV40エンハンサー、ア
デノウイルス２主要後期プロモーター、アデノウイルス
２トリパルチット・リーダー、5'及び3'スプライス部
位、DHFRr cDNA、SV40ポリアデニレーション・シグナル
及びpML−１ベクター配列（Lusky and Botchan,Nature
293:79−81,1981）を含んで成る。p416からのEco R I−
Xba I DHFR発現ユニットを、Eco R I及びXba Iによる消
化により線状化されたpUC18にライゲートし、プラスミ
ドpLJ1を構築した。トランスフェクトされた細胞を増殖
培地（10％ウシ胎児血清、1x PSN抗生物質混合物（GIBC
O BRL 600−5640）、及び2.0mM L−グルタミンを含むDu
lbecco's修飾Eagle's培地（DMEM））中で増殖させた。
非選択増殖培地中で数日間の後、その増殖培地を選択培
地（250mMメトトレキサート（MTX）を含む増殖培地）に
より置換した。細胞を分け、そして選択培地中で1:20及
び1:50に、10cmプレート内に希釈した。250mM MTX中で
の７−10日間の選択の後、コロニーをクローニング・シ
リンダーを使用して24−ウェル・プレートのウェル内に
拾い上げた。得られたコロニーを先に記載したような
（実施例３）グルカゴンに結合する能力についてテスト
した。また、グルカゴン結合を24−ウェル・プレートの
ウェル内にそれぞれのクローンの2x105細胞をプレーテ
ィングすることにより全部の細胞について行った。プレ
ートを５％CO2中37℃において72時間インキュベートし
た。グルカゴン結合を実施例３中に記載したように行っ
た。但し、最後のPBS洗浄の後、細胞を、トリプシン化
によりそのウェルから管内へ取り出した。管をガンマ・
カウンター内でカウントした。カウントの最高数をも
ち、そしてそれ故最もよくグルカゴンに結合することが
できるような細胞をさらなる特徴付けのために選択し
た。また、選択された形質転換体を実施例8D中に記載す
るようなグルカゴン−仲介cAMP応答及び実施例8E中に記
載するようなグルカゴン−仲介細胞内カルシウム応答に
ついて検定した。また、グルカゴン結合検定を以下に記
載するような形質転換体からの膜調製物上で行った。
B. 膜調製物を使用したグルカゴン結合 pLJ4 BHK形質転換体からの膜を125I−グルカゴンへの
結合能力についてラット肝臓膜調製物と比較した。膜を
Rodbell et al.（J.Biol.Chem.246:1861−1871,1971
（これを全体として、引用により本明細書中に取り込
む。））により本質的に記載されたように調製した。肝
臓膜の２バッチをそれぞれ、約80グラムの12〜16の断頭
幼弱雌ラットから調製した。肝臓を速く取り出し、そし
て氷を入れたビーカー内に置いた。肝臓を10グラム部分
に分けた。これらの部分をハサミでこまぎれにし、そし
て結合組織をこのこまぎれ手順の間に除去した。これら
の部分をDounceホモゲナイザー内で別々に均質化した。
それぞれの部分に、25mlの培地（表２）をそのホモゲナ
イザー内のこまぎれ組織に添加し、そしての組織を、ル
ース乳棒の８回の激しいストロークにより氷バケツ内で
均質化した。均質化の後、均質化物を450mlの冷培地
（表２）内にプールした。プールした均質化物を３分間
攪拌し、そしてチーズクロスの２層を通して濾過し、そ
の後チーズクロスの４層を通して濾過した。次に均質化
物を４℃において1500xgにおいて30分間遠心分離した。
上清を廃棄し、そしてペレットをきれいなDounceホモゲ
ナイザー内にプールした。ペレットを上記ルース乳棒の
３回の穏やかなストロークにより再懸濁させた。再懸濁
したペレットを62mlの69％シュクロース溶液（表２）を
含む250mlの勾配中にデカントした。蒸留水を110mlの最
終容量まで添加し、そしてその混合物を十分に混合し、
そして冷却維持した。溶液の濃度を屈折計（Bausch ＆
Lomb,Rochester,N.Y.）により測定するように69％シュ
クロース又は水を使用して44.0％＋／−0.1％に調整し
た。シュクロース懸濁液を25x 89mmの超遠心分離管内に
均等に分配した。それぞれの懸濁液を注意して20mlの4
2.3％シュクロース溶液（表２）により重層し、そして
その懸濁液をSW28ローター（Sorvall,Dupont Company,W
ilmington,Del.）内で４℃において24,000rpmにおいて1
50分間遠心分離した。
遠心分離後、それぞれの管からの浮遊物を18−ゲージ
針を通して10mlシリンジ内への吸引により除去した。そ
れぞれの管からの材料をプールし、そして遠心分離管へ
の上記針を通しての混合物の吸引及び除去により約10ml
の培地（表２）中へ再懸濁させた。この管を培地（表
２）により満たし、、そしてSS−34ローター（Sorval
l）内で15,000RPMにおいて15分間遠心分離した。
上清を注意してデカントし、そして廃棄した。ペレッ
トを培地（表２）中に再懸濁させ、そして蒸留水により
1:1000に希釈した。吸光度を、タンパク質濃度を測定す
るために1cmキュベット内で読んだ。タンパク質を以下
の式： を使用して測定した。
膜調製物を等分し、ドライ・アイス／エタノール浴内
で急速冷凍し、そして−80℃において保存した。
膜を、選択培地中で150mmプレート内の集密まで増殖
させたBHKトランスフェクト体から調製した。集密トラ
ンスフェクト体の２つのプレートを冷燐酸塩バッファー
生理食塩水（PBS:Sigma Chemical Co.,St.Louis,Mo.）
により２回濯ぎ、そして1mM PMSFを含む10mlのPBSをそ
れぞれのプレートに添加した。それぞれのプレートから
の細胞をPBS溶液中にスクレープし、そしてそれぞれの
プレートからの細胞を新たな管内にそれぞれ移した。そ
れぞれのプレートを1mM PMSFを含む5ml PBSにより濯
ぎ、そしてその濯ぎ液をそれらのそれぞれの細胞と共に
プールした。細胞を４℃において卓上遠心分離機内で2,
000rpmにおいて遠心分離した。上清を廃棄し、そしてそ
の細胞を30mlの5mM Hepes,1mM PMSF,pH7.5中に再懸濁さ
せた。細胞を15分間氷上でインキュベートし、その後４
℃において47,800xgにおいて遠心分離した。それぞれの
ペレットを1M PMSFを含むPBS中の溶液中に再懸濁させ、
等分し、そして−80℃において冷凍した。
グルカゴン結合検定を使用した競合分析をラット肝臓
及びBHK形質転換体膜調製物上で行った。簡単に言え
ば、10mM HOAc中に希釈された10-11M〜10-6Mの20μｌの
グルカゴン又は20μｌのBSAを含む反応管を設定した。
それぞれの管に、100μｌの2x結合バッファー;20μｌの
125I−グルカゴン（Amersham）;20μｌの1mM NaHCO3;20
μｌの10mM HOAc,0.5％BSA（Novo Nordisk N/A,Bagsvae
rd,Denmark）；及び40μｌの蒸留水を添加した。結合反
応をその反応管に20μｌの膜調製物を添加することによ
り開始させた。反応物を30℃において30分間インキュベ
ートした。膜を４℃において10分間高速におけるマイク
ロフュージ内で遠心分離した。それぞれのサンプルから
の上清を吸引し、そしてペレットをカウントした。非標
識付けグルカゴンとの競合は、グルカゴン結合について
の殆ど同一のシグモイド曲線（図３）を作り出した。Sc
atchard分析（Scatchard,Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660−67
2,1949（これを全体として、引用により本明細書中に取
り込む。））により、見かけのKdが、クローン化された
レセプタについて50nMであり、そしてラット肝臓膜につ
いて49nMである（図４）。
pLJ4によりエンコードされているレセプタの特異性
を、125I−グルカゴン結合について競合する関連ペプチ
ド・ホルモンの能力についてテストした。グルカゴン及
び関連ペプチドのマイクロモル量（表７）をそれぞれ
125I−グルカゴンと共に、先に記載した結合検定におけ
るpLJ4ランスフェクト体の膜調製物に添加した。生来の
グルカゴン及び拮抗物質des−His1［Glu9］グルカゴン
・アミドだけが、その膜への結合について125I−グルカ
ゴンと競合することができた。
C. COS−７細胞内でのラット・グルカゴン・レセプタ
の発現 グルカゴンにより刺激されるべきpLJ4によりトランス
フェクトされたCOS−７細胞がcAMPレベルを増加させる
能力を以下に記載するようなAmersham SPAキット（Amer
sham）を使用して評価した。この検定は、グルカゴン−
刺激pLJ4トランスフェクト体が対照ベクターだけでトラ
ンスフェクトされたCOS−７細胞よりも約５倍多くcAMP
を蓄積したことを示した。関連ペプチド・セクレチン、
VIP、PTH、GLP及びカルシトニンを100nM〜1000nMの濃度
において形質転換体にそれぞれ添加し、そしてcAMPレベ
ルを誘導するそれらの能力について検定した。検定の結
果は、関連ペプチドのいずれもcAMPレベルにおける有意
な増加を誘導することができなかったということを示し
た。
D. 全細胞についてのルシフェラーゼ及びアデニレート
・シクラーゼ活性検定 ラット・グルカゴン・レセプタcDNAを、ZK6、すなわ
ち、少なくとも１のサイクリックAMP応答要素を含むプ
ロモーター、ルシフェラーゼcDNA及びhGHターミネータ
ーを含んで成る発現ユニットにより安定したトランスフ
ェクトされたBHK570細胞系内で、発現させた。この細胞
系は、グルカゴンのそのレセプタへの結合に応答するル
シフェラーゼ活性、アデニレート・シクラーゼ活性及び
細胞内カルシウム濃度の測定を許容する。
プラスミドZK6内のプロエンケファリン・サイクリッ
クAMP応答要素（CRE）をZem233から得た。Zem233を、Ze
m67及びZem106から得た。プラスミドZem106を前駆体Zem
93から構築した。Zem93を構築するために、MT−１プロ
モーターを含んで成るKpn I−Bam H I断片をMThGH111
（Palmiter et al.,Science 222:809−814,1983）から
単離し、そしてpUC18中に挿入した。プラスミドZem93を
次にSst Iにより消化し、そして再ライゲートし、プラ
スミドZem106を作り出した。ここでは、MT−１プロモー
ターに対して5'側の600塩基対の配列が取り除かれてい
た。
プロエンケファリンCREを、Eco R I及びSst IによるZ
em106の最初の消化によりZem106内のSV40プロモーター
の5'末端に挿入し、ベクター含有断片を単離した。オリ
ゴヌクレオチドZC982及びZC983（それぞれ配列番号３と
４）を、アニールされるとき、5'Eco R I部位及び3'Sst
I部位に隣接するヌクレオチド−71〜−133（Comb et a
l.,Nature 323:353−356,1986）からのプロエンケファ
リンCREをエンコードするように設計した。オリゴヌク
レオチドZC982及びZC983（それぞれ配列番号３と４）を
ライゲートし、アニールし、そして線状化Zem106により
ライゲートし、プラスミドZem224を得た。
プラスミドZem67をSma I及びHind IIIによりpIC19R
（Marsh et al.,Gene 32:481−486,1984）を消化するこ
とにより得た。マップ位置270（Pvu II）から位置5171
（Hind III）までのSV40のori領域を次に線状pIC19Rに
ライゲートし、プラスミドZem67を作り出した。プラス
ミドpSV2−neo（American Type Culture Collection Ac
cession NO.37149）からのHind III−Bam H Iネオマイ
シン耐性遺伝子−SV40ターミネーター断片をHind III−
Bgl II消化Zem67にライゲートし、Zem220を得た。
プラスミドZem220からのSV40プロモーター−ネオマイ
シン耐性遺伝子SV40ターミネーター発現ユニットをEco
R I断片として単離した。プラスミドZem224をEco R Iに
より消化し、そして再環化を防ぐためにウシ・アルカリ
性ホスファターゼにより処理した。このネオマイシン発
現ユニット及び線状Zem224をライゲートした。CRE近傍
のSV40プローターを含むプラスミドをZem233と命名し
た。
プラスミドZem233を、得られた発現ユニットがZem233
内に存在するネオマイシン耐性ユニットに対して反対の
方向にあるように、追加のCRE配列、TATAボックス、並
びにそのプロエンケファリンCRE配列に対してまさに3'
側のlac Zコーディング及びポリ（Ａ）配列の一部を挿
入するように修飾した。プラスミドZem233をSst I及びB
am H Iによる消化により線状化した。オリゴヌクレオチ
ドZC3509及びZC3510（それぞれ配列番号５と６）を、ア
ニールされるとき、得られる二本鎖が5'Sst I付着末端
及び3'Eco R I付着末端をもつα糖タンパク質CRE（Dele
gean et al.,Mol.Cell.Biol.7:3994−4002,1987）をエ
ンコードするように、設計した。オリゴヌクレオチドを
標準的な手順に従ってアニールした。チミジン・キナー
ゼTATAボックスをチミジン・キナーゼ遺伝子のEco R I
−Pst I断片スパニング・ヌクレオチド−79〜＋18とし
て得た（McKnight,Cell 31:355−366,1982）。lac Z遺
伝子の3'配列及びその関連ポリ（Ａ）配列を（Jaques P
eschon,Immunex Corp.,Seattle,Wash.から得た）プラス
ミドpLacFからのPst I−Bam H I断片として得た。これ
は、lacZコーディング領域及びpUC18ベクター内にクロ
ーン化されたマウス・プロタミン・ターミネーター配列
を含む。Sst I−Bam H I線状化Zem233、Sst I−Eco R I
ZC3509/ZC3510アダプター、Eco R I−pst I TATAボッ
クス断片及びPst I−Bam H I lac Z配列をライゲートし
た。Zem233のネオマイシン耐性遺伝子発現ユニットに対
する正しい方向における発現ユニットを含むプラスミド
をKZ5と命名した。
ルシフェラーゼ遺伝子及びヒト成長ホルモン（hGH）
ターミネーター配列をKZ5内に存在するlac Zコーディン
グ及びポリ（Ａ）配列を置き換えるために使用した。こ
のルシフェラーゼ遺伝子はプラスミドα−168luc（Dele
gean et al.,Mol.Cell.Biol.7:3994−4002,1987;及びde
Wet et al.,Mol.Cell.Biol.7:725−737,1987）から1.7k
bのXho I−Xba I断片として最初に得られた。hGHターミ
ネーターを、（American Type Culture Collection（Ro
ckville,Md.）と大腸菌（E.coli）形質転換体として寄
託番号ATCC 68979下寄託された）Zem219bからのXba I−
Sal I断片として得た。ルシフェラーゼ遺伝子及びhGHタ
ーミネーター配列を便利のためにXho I−Sal I線状化pI
C19H（Marsh et al.,ibid.）内にサブクローンした。得
られたプラスミド、KZ8をXho I及びSal Iにより消化
し、ルシフェラーゼ−hGHターミネーター配列を単離し
た。プラスミドKZ5をSal Iにより消化し、ベクター含有
断片を単離し、そして再環化を防ぐためにウシ・アルカ
リ性ホスファターゼにより処理した。このXho I−Sal I
ルシフェラーゼ−hGHターミネーター断片を容器Sal I−
消化KZ5とライゲートした。上記プロモーターに対して
適切な方向におけるルシフェラーゼ−hGHターミネータ
ーを含むプラッスミドをKZ6と命名した。
プラスミドKZ6を、Graham and Van der Eb（Virology
52:456,1973,（これを全体として、引用により本明細
書中に取り込む。））により本質的に記載されているよ
うな燐酸カルシウム沈降法を使用して（寄託番号10314
の下American Type Culture Collectionに寄託された）
BHK570細胞内にトランスフェクトした。このトランスフ
ェクトされた細胞を増殖培地（10％ウシ胎児血清、1x P
SN抗生物質混合物（GIBCO−BRL）、及び2.0mM L−グル
タミンを含むDulbecco's修飾Eagle's培地（DEME））中
で増殖させた。非選択増殖培地中で数日間の後、その増
殖培地を選択培地（500μg/mlのG418を含む増殖培地）
により置換した。次に細胞を集密迄増殖に供し、その
後、それらをトリプシン化し、96−ウェル・プレートの
ウェル内に限界希釈においてプレートした。細胞を１〜
２週間G418選択培地中で増殖させた。単一コロニーを含
むウェルからのクローンを以下に記載するルシフェラー
ゼ検定においてフォルスコリン（forskolin）に応答す
る能力について検定した。フォルスコリンは、細胞内cA
MPレベルを上昇させ、そしてそれ故、レセプタ−非依存
性のやり方で関連cAMP−依存性生物学的応答経路を上昇
させる。フォルスキンに応答することができるクローン
をBHK/KZ6−19−46と命名した。
BHK/KZ6−19−46細胞をpLJ4及びpLJ1と又はpZCEP及び
pLJ1（pZCEPトランスフェクト体を陰性対照として使用
した。）と先に記載したように燐酸カルシウム−仲介ト
ランスフェクションを使用して同時トランスフェクトし
た。トランスフェクト体を先に記載したように250nMメ
トトレキサート中で選択した。
トランスフェクト体を選択された作用物質によるCRE
−ルシフェラーゼ応答の誘導について３連で検定した。
６つのランダムなpLJ4トランスフェクト体を検定し、そ
してランダムなpZCEPトランスフェクト体を検定した
（陰性対照）。マイクロタイター検定プレートをそれぞ
れのウェルが100μｌの選択培地中に2x104細胞を含むよ
うに設定し、そして細胞を一夜増殖させた。作用物質を
選択培地中で以下に列記する2x最終検定濃度において調
整した： １μｌグルカゴン 200nMグルカゴン様ペプチド（GLP） 20nM血管作用性腸内ペプチド（VIP） 100nMカルシトニン（CT） 20μＭフォルスコリン（CalBiochem,San Diego,Cali
f.） 誘導を、３連のサンプル・ウェル内のそれぞれの2x溶
液について100μｌを添加することにより開始させた。
非誘導レベルを３連ウェル内で測定し、これに10％ウシ
胎児血清を含む100μｌのDMEMを添加した。プレートを3
7℃,5％CO2において４時間インキュベートし、ルシフェ
ラーゼ生産の誘導を可能にさせた。
誘導後、培地を除去し、そして200μl/ウェルのPBSに
より１回洗浄した。洗浄後、25μｌの1X Cell Culture
Lysis Reagent（Luciferase Assay System,Promega Cor
p.,Madison,Wis.）をそれぞれのウェルに添加し、プレ
ートを室温において15分間インキュベートした。プレー
トをLabsystems Luminoskanマイクロタイター光度計（L
absystems Inc.,Morton Grove,Ill.）に移し、これに40
μｌのLuciferse Assay Substrate（Luciferase Assay
System,Promega）を添加し、その反応物を混合し、そし
てウェル当たり２秒間ルシフェラーゼ・シグナルを積分
した。それぞれの作用物質についてのルシフェラーゼの
倍誘導を以下のように計算した： １つのpLJ4トランスフェクト体クローン、KZ6/rGR−D
HFR−２は、グルカゴンによるルシフェラーゼの６−10
倍に誘導示すが、GLP、VIP又はCTにより誘導されなかっ
た。
トランスフェクト体クローンKZ6/rGR−DHFR−２のグ
ルカゴン及びフォルスコリンへのcAMP応答を製造者の指
示を使用してcAMP［125］シンチレーション近傍検定装
置（Amersham）を使用したラジオイムノアッセイによっ
ても検定した。簡単に言えば、1mlのKZ6/rGR−DHFR−２
細胞当たり2x105細胞の100μｌを多ウェル培養皿のウェ
ル内にプレートし、そして選択培地内で一夜増殖させ
た。グルカゴン及びフォルスコリンをDMEM,10％ウシ胎
児血清10μＭ、それぞれ0.0001−1000nM及び25μＭにお
けるIBMX中で調製した。
増殖培地を50μl/ウェルの作用物質（グルカゴン又は
フォルスコリンのいずれか）により置換した。細胞を37
℃,5％CO2において10分間作用物質と共にインキュベー
トした。インキュベーション後、細胞を、それぞれのウ
ェルへの200μｌの沸騰水の添加により溶解させた。15
分後、上清を集め、そしてアセテート・バッファー（cA
MP［125I］Scintillation Proximity Assay System（Am
ersham））中で1:5又は1:40に希釈した。サンプルを製
造者により提供されたプロトコールに従ってトリエチル
アミン及び無水酢酸を使用してアセチル化した。
それぞれのアセチル化サンプルの100μｌアリコット
を、LKB T−トレーのウェル内で75μｌの125I−cAMP、7
5μｌの抗−スクシニルcAMP抗血清及び75μｌのロバ抗
ウサギIgG結合SPAビーズ（すべてcAMP［125I］Scintill
ation Proximity Assay System（Amersham）内に提供さ
れる検定溶液）と組み合わせた。トレーをシールし、そ
して200rpmにおける回転プラット振とう機上での連続振
とうにより一夜インキュベートした。サンプルを1205 B
ETAPLATE液体シンチレーション・カウンター（Pharmaci
a LKB Instruments Inc.,Gaithersburg,Md.）内でカウ
ントした。２−128fモルのアセチル化cAMPの標準曲線を
も走らせた。全125I−cAMP結合及び非特異的結合をも測
定した。KZ6/rGR−DHFR−２は、飽和グルカゴン（10−1
00nM）におけるcAMPレベルの140倍の誘導、及び0.25nM
のED50を示した。
E. 細胞内カルシウム濃度の測定 グルカゴンに対するplJ4トランスフェクト体の細胞内
カルシウム応答をGrynkiewicz et al.（J.Biol.Chem.26
0:3440−3450,1985（これを全体として、引用により本
明細書中に取り込む。））により本質的に記載されてい
るような方法を使用して検定した。プラスミドpLJ4 BHK
トランスフェクト体をチャンバー当たり5x104細胞にお
いて２ウェルのカバーグラス・チャンバー（NUNC）内に
接種した。細胞を１〜３の間にわたり正常培養条件下メ
トトレキサート選択培地中で増殖させた。培地を吸引に
より除去し、そしてそのチャンバーを1mlの画像形成バ
ッファー（表３）により２回濯いだ。細胞を30分間室温
において暗所にて0.5mlのFura−2 AM溶液（表３）と共
にインキュベートした。インキュベーション後、Fura−
2 AM溶液を除去し、そして細胞を1mlの画像形成バッフ
ァーにより３回濯いだ。最後の濯ぎの後、0.5mlのバッ
ファーをそれぞれのチャンバー内に残した。細胞を室温
において30〜120分間暗所にて保持した。
画像形成を、水銀放電ランプ並びに10X及び40X Nikon
Flour乾燥対象レンズを装備したNikon Diaphot倒立蛍
光顕微鏡上で行った。実験を、Sun SPARC IIワークステ
ーション及びInovision（Research Triangle Park,N.
C.）PATIOTOOLソフトウェアを使用して制御し、そして
分析した。放射画像が、二色性の鏡（380nmカットオ
フ）によりGenesis II画像形成増感装置を装備したDage
−MTI 72 CCDカメラに投影され、そして上記ソフトウェ
アによりデジタル記録される。
細胞内カルシウム濃度を、デジタル顕微鏡画像視野
（512 x 480画素）のそれぞれの画素について２つの励
起波長（340/380）のそれぞれにおける放射強度の比を
計算することによりモニターする。Grynkiewicz et al.
（ibid.）は、この比が、細胞を負荷をかけるために使
用されるアセチルメトキシ誘導体（fura−2 AM）を取り
込み且つ脱エステル化した細胞内のfura−２染料により
見られるカルシウム濃度に関係することを、示してい
る。RATIOTOOLソフトウェアは、カルシウム濃度に換算
されることができる偽色画像として上記情報を示す。画
像を獲得し、そしてこの計算をそれぞれの実験の間に５
秒間隔において行った。
細胞を、刺激前のベースラインを確立するために少な
くとも60秒間（12画像）についてモニターし、刺激を、
カバーグラス・チャンバー内の0.5mlの画像形成バッフ
ァーに200nMグルカゴンを含む0.5mlの画像形成バッファ
ーを添加し、このように100nM最終濃度を達成すること
により行った。細胞をモニターし、そして画像を刺激後
少なくとも３分間記録した。
それぞれの視野内の細胞数に対応する比画像は、グル
カゴンの添加後短時間で劇的に変化することが観察され
た。これを、応答細胞のそれぞれに対応する比画像の特
定領域について平均値を計算するためのRATIOTOOLソフ
トウェアを使用して定量した。約1.4の平均休止比をも
つ細胞は速やかに３〜４の値に上昇した。それらは、40
〜50秒間高い値において残り、そしてその後段々にベー
スラインに減衰した。独立換算実験は、この反射が、細
胞内カルシウム濃度において約150nMの休止値から約400
nMのピークまで変化させたことを示した。
F. イノシトール・ホスフェート測定 pLJ4からのグルカゴン・レセプタを発現するBHK 570
細胞又は模擬−トランスフェクトBHK 570細胞を、ウェ
ル当たり約200,000細胞において24−ウェル組織培養皿
内にプレートした。24時間後、それぞれのウェル内の細
胞を2.0μCi myo−（２−3H）イノシトールを含む0.5ml
のMTX選択培地（比活性−20Ci/mモル;Amersham）中でイ
ンキュベーションすることにより標識付けした。24時間
のインキュベーションの後、細胞を、10mM LiClを含む2
0mM Hepes,pH7.0バッファー（Sigma Chemical Co.）に
より緩衝液化した1mlの予熱したDMEM（Dulbecco's Modi
fied Eagles Medium;JRH Biosciences,Lenexa,Kan.）に
より洗浄した。この洗浄培地を吸引により除去し、そし
て900μｌの新たな緩衝化培地により置換した。細胞を3
7℃において５分間インキュベートした。インキュベー
ション後、それぞれの作用物質又は拮抗物質を３連ウェ
ルに添加し、そして表８中に述べる容量及び条件に従っ
てインキュベートした。
反応を氷上に細胞を置くことにより終了させた。培地
の吸引後、細胞を1mlの冷DMEM及び1mlの氷冷10％ペルク
ロロ酸の添加により溶解させた。10分後、細胞溶解物を
氷上の管に移し、そのそれぞれが500μｌの10mM EDTA,p
H7.0を含んでいた。７〜7.5の間のpHが達成されるま
で、サンプルを900μｌの、60mM Hepes Buffer中の1.5M
KOHの添加及KOH−HEPES溶液の滴下により中和した。冷
凍サンプルを解凍し、そして沈殿をサンプルから静置さ
せた。上清を、それぞれ5mlのメタノール及び1M KHCO3
により順番に洗浄し、その後15mlの水により洗浄したAM
PREPミニカラム（Amicon）に適用した。サンプルを適用
した後、溶出液を集めた。カラムを1mlの水により４回
洗浄し、そして1mlのサンプルをそれぞれの洗浄後に集
めた。イノシトール・ホスフェートを４連続の0.25M KH
CO3の1ml適用によりカラムから溶離させ、1mlのサンプ
ルをそれぞれの適用後に集めた。10mlのOPTIFLUOR（Pac
kard Instrument Co.,Menden,Conn.）をそれぞれのサン
プルに添加し、そしてサンプルをカウントした。イノシ
トール・ホスフェート経路の刺激を放射標識付けしたイ
ノシトール・ホスフェート・レベルにおける増加により
示した。イノシトール・ホスフェート生産における刺激
はいずれのサンプルにおいても全く観察されなかった。
G. COS 7細胞内でのヒト・グルカゴン・レセプタの発
現 プラスミドpLJ6'を、先に記載したようなDEAE−デキ
ストラン手順を使用してCOS 7細胞中にトランスフェク
トした。細胞をトランスフェクション後72時間（実施例
３中に記載したような）ガラス・チャンバー・スライド
上で増殖させた。125I−グルカゴンを使用したその場の
グルカゴン結合検定その後のエマルジョン・オートラジ
オグラフィーを実施例３中に記載したように行った。pL
J6'によりトランスフェクトされた細胞の50％以上が特
異的なやり方でグルカゴンに結合した。
H. BHK570細胞内でのヒト・グルカゴン・レセプタの発
現 （寄託番号10314の下American Type Culture Collect
ionに寄託された）BHK570細胞を燐酸カルシウム・トラ
ンスフェクション法（実施例８）を使用してプラスミド
pLJ6'によりトランスフェクトした。トランスフェクト
された細胞を、単一コロニーが見えるようになるまでG4
18の存在中で選択した。好適なコロニーをクローニング
・シリンダーを使用してクローン化した。クローンは、
先に記載したように行われたヨウ素化グルカゴンへのそ
の場の結合を使用してグルカゴンに結合することが示さ
れた。
PLJ6'−トランスフェクト細胞を、実施例8.C中に本質
的に記載したようにcAMP蓄積について検定した。トラン
スフェクト体をグルカゴン、セクレチン、VIP又はGLP−
Ｉによる刺激に後に検定した。検定は、pLJ6'−トラン
スフェクト細胞が対照細胞よりもグルカゴン刺激後の増
加したcAMP濃度を蓄積したことを示した。セクレチン、
VIP又はGLP−Ｉによるトランスフェクト体の刺激は、増
加したcAMPの蓄積を全く示さなかった。細胞内カルシウ
ム応答を実施例8.E中に本質的に記載したように測定し
た。グルカゴン−刺激pLJ6'−トランスフェクト細胞
は、カルシウム指示薬Fura−２の蛍光における急速上昇
により示されるような細胞内カルシウム・レベルにおけ
る増加を証明した。これらの結果は、pLJ6'がグルカゴ
ンに結合し且つシグナル形質導入を容易にすることがで
きる機能的ヒト・グルカゴン・レセプタをエンコードし
ていることを、示している。
これまで述べてきたことから、本発明の特定の態様を
説明の目的のために本明細書中に記載してきたけれど
も、様々な変更を本発明の本質及び範囲から外れること
なく行うことができるということが、理解されるであろ
う。従って、本発明は、添付のクレーム以外によっては
限定されない。
配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人： 名称:ZymoGynetics,Inc. 番地:4225 Roosevelt Way North East 市:Seattle,Washington 国：アメリカ合衆国 郵便番号:98105 電話：（206）547−80808 （ii）発明の名称：グルカゴン・レセプタ （iii）配列数:25 （iv）通信先： （Ａ）名宛人:SEED AND BERRY （Ｂ）番地:6300 COLUMBIA CENTER （Ｃ）市:SEATTLE （Ｄ）州:WA （Ｅ）国:USA （Ｆ）郵便番号:99104−7092 （ｖ）コンピュータ読み込み形態： （Ａ）媒体型：プロッピー・ディスク （Ｂ）コンピュータ:IBM PC互換性 （Ｃ）オペレーティング・システム:PC−DOS/MS−D
OS （Ｄ）ソフトウェア:PatentIn Release ＃1.0,Vers
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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/566 5/00 Ｂ (72)発明者 シェパード，ポール オー. アメリカ合衆国，ワシントン 98053, レッドモンド，ノースイースト セカン ド 20717 (72)発明者 グラント，フランシス ジェイ. アメリカ合衆国，ワシントン 98115, シアトル，サーティーセブンス アベニ ュ ノースイースト 7714 (72)発明者 カイパー，ジョセフ エル. アメリカ合衆国，ワシントン 98011, ボセル，ノースイースト ワンハンドレ ッドフィフティーフォース 6640 (72)発明者 フォスター，ドナルド シー. アメリカ合衆国，ワシントン 98155, シアトル ノースイースト ワンハンド レッドエイティーファースト ストリー ト 3002 (72)発明者 ロク，シ アメリカ合衆国，ワシントン 98107, シアトル，ノースウエスト フィフティ ーセカンド ストリート 806 (72)発明者 オハラ，パトリック ジェイ. アメリカ合衆国，ワシントン 98103, シアトル，ノース シックスティーフォ ース ストリート 515 (56)参考文献 国際公開92／012998（ＷＯ，Ａ１) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 265，Ｎｏ．34（1990）ｐ．21302− 21308 Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ. 107，Ｎｏ．６，Ｐｔ．３（1988）ｐ. 65Ａ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 259，Ｎｏ．14（1984）ｐ．9285−9294 Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 30，Ｎｏ．８（1987）ｐ．1409−1415 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (29)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】以下の： （ａ）ヌクレオチド145からヌクレオチド1599までの配
    列番号14のヌクレオチド配列、又はヌクレオチド226か
    らヌクレオチド570までの配列番号14のヌクレオチド配
    列、又はヌクレオチド53からヌクレオチド1486までの配
    列番号24のヌクレオチド配列、又は配列番号17のヌクレ
    オチド配列；又は （ｂ）上記（ａ）に定める分子にストリンジェント条件
    下ハイブリダイズし、かつ、グルカゴン・レセプタをコ
    ードする分子； を含む、グルカゴン・レセプタをコードする単離DNA分
    子。
  2. 【請求項２】前記グルカゴン・レセプタが、ラットのグ
    ルカゴン・レセプタ及びヒトのグルカゴン・レセプタか
    ら成る群から選ばれる、請求項１に記載のDNA分子。
  3. 【請求項３】前記分子が、ヌクレオチド145からヌクレ
    オチド1599までの配列番号14のヌクレオチドの配列、又
    はヌクレオチド53からヌクレオチド1486までの配列番号
    24のヌクレオチドの配列を含んで成る、請求項１に記載
    のDNA分子。
  4. 【請求項４】前記グルカゴン・レセプタが、メチオニ
    ン、アミノ酸番号１から、トレオニン、アミノ酸番号48
    5までの配列番号15のアミノ酸配列、又はメチオニン、
    アミノ酸番号１から、フェニルアラニン、アミノ酸番号
    477までの配列番号25のアミノ酸配列を含んで成る、請
    求項１に記載のDNA分子。
  5. 【請求項５】第一DNAセグメントの発現に必要な追加のD
    NAセグメントに作用可能な状態で結合された、グルカゴ
    ン・レセプタをコードする上記第一DNAセグメントを含
    むDNA構築物であって、ここで上記第一DNAセグメント
    は、以下の： （ａ）ヌクレオチド145からヌクレオチド1599までの配
    列番号14のヌクレオチド配列、又はヌクレオチド226か
    らヌクレオチド570までの配列番号14のヌクレオチド配
    列、又はヌクレオチド53からヌクレオチド1486までの配
    列番号24のヌクレオチド配列、又は配列番号17のヌクレ
    オチド配列；又は （ｂ）上記（ａ）に定める分子にストリンジェント条件
    下ハイブリダイズし、かつ、グルカゴン・レセプタをコ
    ードする分子； を含む、前記DNA構築物。
  6. 【請求項６】前記グルカゴン・レセプタが、ラットのグ
    ルカゴン・レセプタ及びヒトのグルカゴン・レセプタか
    ら成る群から選ばれる、請求項５に記載のDNA構築物。
  7. 【請求項７】前記第一DNAセグメントが、ヌクレオチド1
    45からヌクレオチド1599までの配列番号14のヌクレオチ
    ドの配列、又はヌクレオチド53からヌクレオチド1486ま
    での配列番号24のヌクレオチドの配列を含んで成る、請
    求項５に記載のDNA構築物。
  8. 【請求項８】前記グルカゴン・レセプタが、メチオニ
    ン、アミノ酸番号１から、トレオニン、アミノ酸番号48
    5までの配列番号15のアミノ酸配列、又はメチオニン、
    アミノ酸番号１から、フェニルアラニン、アミノ酸番号
    477までの配列番号25のアミノ酸配列を含んで成る、請
    求項５に記載のDNA構築物。
  9. 【請求項９】請求項５〜８の中のいずれか１項に記載の
    DNA構築物を含む宿主細胞。
  10. 【請求項１０】グルカゴン・レセプタの製法であって、
    前記第一DNAセグメントの発現を促進する条件下で請求
    項９に記載の宿主細胞を培養することを含む、前記製
    法。
  11. 【請求項１１】以下の： （ａ）ヌクレオチド145からヌクレオチド1599までの配
    列番号14のヌクレオチド配列、又はヌクレオチド226か
    らヌクレオチド570までの配列番号14のヌクレオチド配
    列、又はヌクレオチド53からヌクレオチド1486までの配
    列番号24のヌクレオチド配列、又は配列番号17のヌクレ
    オチド配列；又は （ｂ）上記（ａ）に定める分子にストリンジェント条件
    下ハイブリダイズし、かつ、グルカゴン・レセプタをコ
    ードする分子； を含む、グルカゴン・レセプタ・ペプチドをコードする
    単離DNA分子。
  12. 【請求項１２】前記グルカゴン・レセプタ・ペプチド
    が、ラットのグルカゴン・レセプタ・ペプチド及びヒト
    のグルカゴン・レセプタ・ペプチドから成る群から選ば
    れる、請求項11に記載のDNA分子。
  13. 【請求項１３】前記分子が、ヌクレチド226からヌクレ
    オチド570までの配列番号14のヌクレオチドの配列を含
    んで成る、請求項11に記載のDNA分子。
  14. 【請求項１４】前記グルカゴン・レセプタ・ペプチド
    が、グルタミン、アミノ酸番号28から、チロシン、アミ
    ノ酸番号142までの配列番号15のアミノ酸配列を含んで
    成る、請求項11に記載のDNA分子。
  15. 【請求項１５】第一DNAセグメントの発現に必要な追加
    のDNAセグメントに作用可能な状態で結合された、グル
    カゴン・レセプタ・ペプチドをコードする第一DNAセグ
    メントを含むDNA構築物であって、ここで上記第一DNAセ
    グメントは、以下の： （ａ）ヌクレオチド145からヌクレオチド1599までの配
    列番号14のヌクレオチド配列、又はヌクレオチド226か
    らヌクレオチド570までの配列番号14のヌクレオチド配
    列、又はヌクレオチド53からヌクレオチド1486までの配
    列番号24のヌクレオチド配列、又は配列番号17のヌクレ
    オチド配列；又は （ｂ）上記（ａ）に定める分子にストリンジェント条件
    下ハイブリダイズし、かつ、グルカゴン・レセプタをコ
    ードする分子； を含む、前記DNA構築物。
  16. 【請求項１６】前記グルカゴン・レセプタ・ペプチド
    が、ラットのグルカゴン・レセプタ・ペプチド及びヒト
    のグルカゴン・レセプタ・ペプチドから成る群から選ば
    れる、請求項15に記載のDNA構築物。
  17. 【請求項１７】前記第一DNAセグメントが、ヌクレチド2
    26からヌクレオチド570までの配列番号14のヌクレオチ
    ドの配列を含んで成る、請求項15に記載のDNA構築物。
  18. 【請求項１８】前記グルカゴン・レセプタ・ペプチド
    が、グルタミン、アミノ酸番号28から、チロシン、アミ
    ノ酸番号142までの配列番号15のアミノ酸配列を含んで
    成る、請求項15に記載のDNA構築物。
  19. 【請求項１９】請求項15〜18の中のいずれか１項に記載
    のDNA構築物を含む宿主細胞。
  20. 【請求項２０】グルカゴン・レセプタ・ペプチドの製法
    であって、前記第一DNAセグメントの発現を促進する条
    件下で請求項19に記載の宿主細胞を培養することを含
    む、前記製法。
  21. 【請求項２１】以下の： （ａ）メチオニン（アミノ酸番号１）からトレオニン
    （アミノ酸番号485）までの又はグルタミン（アミノ酸
    番号28）からチロシン（アミノ酸番号42）までの配列番
    号15のアミノ酸配列、又はメチオニン（アミノ酸番号
    １）からフェニルアラニン（アミノ酸番号477）までの
    配列番号25のアミノ酸配列、又は配列番号18のアミノ酸
    配列；又は （ｂ）上記アミノ酸配列中１又は数個のアミノ酸の置
    換、欠失又は付加により、上記（ａ）のペプチドから誘
    導されたペプチド； を含む、単離されたグルカゴン・レセプタ・ペプチド。
  22. 【請求項２２】グルタミン、アミノ酸番号28から、チロ
    シン、アミノ酸番号150までの配列番号15のアミノ酸配
    列を含んで成る、請求項21に記載のグルカゴン・レセプ
    タ・ペプチド。
  23. 【請求項２３】グルカゴン・レセプタに特異的に結合す
    る単離された抗体であって、モノクローナル抗体であり
    且つグルカゴン・レセプタへのグルカゴンの結合をブロ
    ックする、前記抗体。
  24. 【請求項２４】請求項23に記載のモノクローナル抗体を
    産生するハイブリドーマ。
  25. 【請求項２５】ヌクレオチド145からヌクレオチド1599
    までの配列番号14のヌクレオチド配列、又はヌクレオチ
    ド226からヌクレオチド570までの配列番号14のヌクレオ
    チド配列、又はヌクレオチド53からヌクレオチド1486ま
    での配列番号24のヌクレオチド配列、又は配列番号17の
    ヌクレオチド配列；の中の少なくとも12のヌクレオチド
    から成るプローブであって、高ストリンジェント条件下
    グルカゴン・レセプタをコードする核酸とハイブリダイ
    ズすることができる、前記プローブ。
  26. 【請求項２６】グルカゴン拮抗物質の存在を検出する方
    法であって、以下の段階： （ａ）グルカゴン作用物質の存在下、化合物を、レセプ
    タへのその化合物の結合を許容するのに十分な条件下及
    び時間にわたり、応答経路に及びその経路を通しての関
    連応答に関連した、請求項21に記載の組換え体グルカゴ
    ン・レセプタ・ペプチドに、晒し；そして （ｂ）そのグルカゴン作用物質単独によるその応答経路
    の刺激に対して、そのグルカゴン・レセプタへのその化
    合物の結合から生じる応答経路の刺激における減少を検
    出し、そしてそれからグルカゴン拮抗物質の存在を検出
    する、を含む、前記方法。
  27. 【請求項２７】前記応答経路が膜結合アデニレート・シ
    クラーゼ応答経路である、請求項26に記載の方法。
  28. 【請求項２８】前記の検出段階が、膜結合アデニレート
    ・シクラーゼ応答経路によるサイクリックAMP生産にお
    ける減少を測定することを含む、請求項27に記載の方
    法。
  29. 【請求項２９】前記応答経路がルシフェラーゼ・リポー
    ター系を含む、請求項26に記載の方法。
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